CN113549621B - 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子。本发明通过缺失突变的方式，筛选出增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672SspH1基因编码区上游的265个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示。本发明得到的增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子在大肠杆菌中依然保持活性，是一个有普遍活性的启动子，有潜力应用到其它不同种的原核细菌中，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。

Description

一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的 最小启动子。
背景技术
在科学研究和生物医药工业生产和抗传染病疫苗制备中，常常需要在原核 细菌中(包括但不限于大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，结核分枝杆菌等)表 达或者纯化有生物活性的蛋白。
但目前在细菌中表达外源蛋白经常遇到下列问题：
(1)无产量或低产量。目标蛋白无法通过敏感技术(例如Western印迹) 检测到或被检测到。含量很低(每升培养物低于微克)时，问题通常在于异源 蛋白发挥有害作用或者蛋白本身不稳定。
(2)蛋白质失活。获得大量的可溶性蛋白质并不是最终目标。这种蛋白质 可能仍然质量不佳，即，它没有应有的活力。
因此如何增强细菌中蛋白的活性和表达一直是一个需要解决的重要问题。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启 动子。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子，为沙门氏菌肠亚种肠 衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因编码区上游的265个核苷酸，其核苷酸 序列如SEQ.ID.NO：1所示。
一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子的鉴定方法，其特征在 于，包括以下步骤：
步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672染色体序 列中位于SspH1基因编码区上游615个核苷酸长度的序列，该序列包含SspH1 基因启动子；
步骤2，将步骤1克隆得到的序列通过XhoI/NotI限制酶酶切将SspH1基因 启动子连接到酶切位点修饰过的pGL3-Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到 重组质粒；
步骤3，在SspH1基因启动子序列上做不同的缺失突变，将突变后的启动子 利用步骤2所述方法来构建更多的重组质粒；
步骤4，将步骤2和步骤3得到的重组质粒分别转染到大肠杆菌E.coli C2566 中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细胞并裂解，使用发光计Lumat LB9507测量细胞裂解物中的相对萤光素酶活性，从而鉴定出增强细菌中外源蛋 白活性和表达的最小启动子。因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比， 测定荧光素酶的活性变化可以同时反应其表达量的变化。
进一步，所述步骤1中克隆所用的引物对序列如SEQ.ID.NO：2和 SEQ.ID.NO：3所示；PCR克隆的反应条件为：95℃ 2min；35个循环的95℃ 30 sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；72℃ 5min。
进一步，所述步骤3中克隆长度为375nt、265nt、135nt的启动子所用的引 物对分别为pSspH1-375-F/pSspH1-R1，pSspH1-265-F/pSspH1-R1， pSspH1-135-F/pSspH1-R1，其核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO：4/3、SEQ.ID.NO： 5/3、SEQ.ID.NO：6/3所示。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
1、本发明鉴定出了沙门氏菌SspH1基因的最小启动子，而且该最小启动子 在大肠杆菌中依然保持活性，是一个有普遍活性的启动子，有潜力应用到其它 不同种的原核细菌中。
2、本发明得到的最小启动子能显著增强外源蛋白(荧光素酶)在细菌中的 表达和活性，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的 工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。
附图说明
图1为实施例构建的不同重组质粒的示意图，图中箭头代表转录起始位点 和方向。
图2为实施例构建的不同重组质粒中荧光素酶的活性，图中*代表P<0.01。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、 详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原 理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范 围。
因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比，测定荧光素酶的活性变 化可以同时反应其表达量的变化，因此下列实施例通过测荧光素酶的活性来展 现其在大肠杆菌中的活性与表达。
实施例
一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子，为沙门氏菌肠亚种肠 衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因编码区上游的265个核苷酸，其核苷酸 序列如SEQ.ID.NO：1所示。
增强细菌中外源蛋白表达的最小启动子的鉴定：
1、克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因启动子；
根据沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672染色体序列(GenBank 序列号：CP047323.1)中的位于SspH1编码区上游615个核苷酸长度的序列设 计引物以克隆含有SspH1基因启动子的DNA片段。用引物对pSspH1-615-F/ pSspH1-R1，细菌基因组DNA和高保真Tag DNA聚合酶建立聚合酶链式反应 (PCR)，反应条件为：95℃ 2min，然后是35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec， 72℃ 1min；最后是72℃ 5min。PCR产生的0.6kb DNA条带用琼脂糖凝胶电 泳纯化。
所用引物序列如下：(下划线为酶切位点)
pSspH1-615-F(SEQ.ID.NO：2)：
5’-GGCCTCGAGCGCTATATCACCAAAACGCC-3’
pSspH1-R1(SEQ.ID.NO：3)：
5’-GGCGCGGCCGCCATATTCCACTGCCTAAT-3’
2、将步骤1纯化得到的PCR产物通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到限制酶 切位点修饰过的pGL3-Basic质粒(Promega Inc.)(图1)的荧光素酶编码区上 游，得到重组质粒pGL3-psspH1-615(图1)；在克隆得到的SspH1基因启动子 序列上做不同的缺失突变，使缺失突变后的启动子长度分别为375nt、265nt、 135nt，分别用引物对pSspH1-375-F/pSspH1-R1，pSspH1-265-F/pSspH1-R1， pSspH1-135-F/pSspH1-R1利用步骤1所述方法进行PCR反应，反应产物分别用 琼脂糖凝胶电泳纯化后，用步骤2获得重组质粒pGL3-psspH1-615的方法来分 别构建如下重组质粒：pGL3-psspH1-375、pGL3-psspH1-265、pGL3-psspH1-135 (图1)；
引物序列如下：(下划线为酶切位点)
pSspH1-375-F(SEQ.ID.NO：4)：
5’-GGCCTCGAGATACTGAACG AATTTTATCA-3’
pSspH1-265-F(SEQ.ID.NO：5)：
5’-GGCCTCGAGCCATCAGGGAAAAATGTGCT-3’
pSspH1-135-F(SEQ.ID.NO：6)：
5’-GGCCTCGAGAGATCAGGTCTGAGCTAATA-3’
3、将上述得到的重组质粒分别转染到大肠杆菌E.coli C2566(New EnglandBiolab Inc)中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细菌并裂解，使用发 光计LumatLB9507(EG&G Berthold，Bad Wildbad，德国)测量细胞裂解物中 的萤光素酶的活性。每个载体检测3次，计算3次重复的平均值±标准偏差。
从图2可以发现当控制荧光素酶活性表达的启动子序列长度从615个核苷 酸缩短为265个核苷酸时，萤光素酶的活性基本保持不变，当启动子序列进一 步缩短为135个核苷酸时，萤光素酶的活性显著降低，表明控制荧光素酶活性 表达的最小的完整的启动子为265个核苷酸长度。同时证明，来自沙门氏菌的 启动子在大肠杆菌中依然表现很强的活性(质粒pGL3-Basic中相对荧光素酶的 活性几乎为0)。
Figure BDA0003162877790000061
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatcaggga aaaatgtgct gtggccggac gccgatggaa acgttacttg atggaaaacg 60
catctggtct gagaagaatt taagccagat gtaatctgac agatacctgt ataaataacc 120
ggtaactgtc agatcaggtc tgagctaata caactaattg tatgttattt gtcgtttatt 180
gctaaatata tatcgttaat tgaaggcttg atgcgtgtgt ctgcgttaat ctcttttcat 240
tgtgctgtaa attaggcagt ggaat 265
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcctcgagc gctatatcac caaaacgcc 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgcggccg ccatattcca ctgcctaat 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcctcgaga tactgaacga attttatca 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcctcgagc catcagggaa aaatgtgct 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcctcgaga gatcaggtct gagctaata 29

Claims (4)

1.一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子，其特征在于：所述最小启动子为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株（Salmonella enterica subsp. enteric serovar Typhimurium）RM13672 SspH1基因编码区上游的265个核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672染色体序列中位于SspH1基因编码区上游615个核苷酸长度的序列，该序列包含SspH1基因启动子；
步骤2，将步骤1克隆得到的序列通过XhoI/NotI限制酶酶切将SspH1基因启动子连接到酶切位点修饰过的pGL3-Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到重组质粒；
步骤3，在SspH1基因启动子序列上做不同的缺失突变，使缺失突变后的启动子长度为分别为375nt、265nt、135nt，将突变后的启动子分别利用步骤2所述方法来构建重组质粒；
步骤4，将步骤2和步骤3得到的重组质粒分别转染到大肠杆菌E.coli C2566中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细胞并裂解，使用发光计Lumat LB9507测量细胞裂解物中的相对萤光素酶活性，从而鉴定出增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子。
3.根据权利要求2所述的一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1中克隆所用的引物对序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；PCR克隆的反应条件为：95℃ 2min；35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；72℃5min。
4.根据权利要求2所述的一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的最小启动子的鉴定方法，其特征在于：所述步骤3中克隆长度为375nt、265nt、135nt的启动子所用的引物对分别为pSspH1-375-F/pSspH1-R1，pSspH1-265-F/pSspH1-R1，pSspH1-135-F/pSspH1-R1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4/3、SEQ ID NO：5/3、SEQ ID NO：6/3所示。
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