JP2021515582A - 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 - Google Patents

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ポーラ ティー． ハモンド
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Abstract

本願は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、該分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインとを含む単離されたキメラ分子に関し、ここで、標的指向ドメインは、分解ドメインに対して異種である。リンカーは、分解ドメインを標的指向ドメインに結合させる。また、組成物、ならびに疾患を治療する方法、基質サイレンシングの方法、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法、および疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法も開示される。

Description

本願は、２０１８年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６４４，０５５号の優先権の利益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
本願は、概して、操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集に関する。
背景
タンパク質機能は、従来、タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を破壊すること、および得られた表現型の結果を分析することによって調べられてきた。そのような機能喪失実験は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（「ＴＡＬＥＮ」）、およびクラスター化された、規則的に間隔をあけた、短い回文反復（「ＣＲＩＳＰＲ」）−Ｃａｓ系等の遺伝子サイレンシングおよびゲノム編集技術を使用して、日常的に実施されている。ＭｃＭａｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３（１０）：７３７−４７（２００２）；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（８）：９３７−５４（２０１２）；Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｊｏｂ：ＲＮＡｉ，ＴＡＬＥＮ，ｏｒ ＣＲＩＳＰＲ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５８（４）：５７５−８５（２０１５）；ａｎｄ Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５（２０１３）。これらの方法は、基礎研究において広く使用され、遺伝的障害を治療するために有望なものである。Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５（２０１３）；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１（２）：１２１−３１（２０１５）；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ ｂｙ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４３２（７０１４）１７３−７８（２００４）；Ｂｕｍｃｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｒｕｇｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１２）：７１１−１９（２００６）；ａｎｄ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ−Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（３）：１４４−５０（２０１７）。しかし、時間的制御の欠如、予測不可能なオフターゲット効果、ゲノム編集の場合において必須遺伝子を除去することが不可能であること、およびそのようなノックアウトの不可逆的な性質、ならびに遺伝子サイレンシングの場合には細胞内に既に存在するタンパク質のレベルを低下させることが不可能であり、それによって安定した長寿命のタンパク質は影響されないままであることを含む、いくつかの課題が残っている。
プロテオーム編集技術は、翻訳後レベルで作動する、タンパク質機能を研究するための直交的アプローチを表し、ＤＮＡまたはＲＮＡを標的とし、翻訳後精度を有する方法よりも高い分解能で複雑なタンパク質機能を詳細に分析する潜在能力がある。最も顕著な方法の１つは、「分解による阻害」を伴い、それによって、細胞ユビキチン−プロテアソーム経路（「ＵＰＰ」）の機構は、目的となるタンパク質を特異的に分解するためにハイジャックされる。古典的ユビキチン化カスケードは、３つの酵素−ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の活性を必要とし、これらは、エネルギー依存的な様式で、リジン残基へのポリユビキチン鎖の共有結合を通じて、分解のためにタンパク質に順次タグ付けするように作用する。
Ｅ３は、ＵＰＰにおいて最も不均一なクラスの酵素であり（ヒトにおいて＞６００種のＥ３が存在する）、特徴的ドメインの存在および基質タンパク質へのユビキチン転移の機構に依存して、ＨＥＣＴ（Ｅ６ＡＰ Ｃ末端と相同である）、ＲＩＮＧ（実に興味深い新しい遺伝子）、およびＲＢＲ（ＲＩＮＧ−ｂｅｔｗｅｅｎ−ＲＩＮＧ）として分類され得る。Ｂｕｅｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（１０）：６２６−４２（２０１６）。それらが基質特異性を媒介し、一般に顕著な柔軟性を示すため、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、これまでに記載されたプロテオーム編集戦略において最も頻繁に利用される成分である。例えば、化学的ノックダウンは、タンパク質分解標的指向キメラ、すなわちＰＲＯＴＡＣと呼ばれる小分子を使用して達成されており（Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：４１３８−１４４（２０１７）およびＤｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：（Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１（９）：６３４−３５（２０１５））、これらは、Ｅ３ユビキチンリガーゼのための１つのリガンド、分解されるタンパク質のための別のリガンド、および２つを接続するリンカーを含有するヘテロ二官能性分子である。これらの分子は、Ｅ３および標的の両方に結合し、標的ポリユビキチン化、続いてそのプロテアソーム分解を誘発する三元複合体の形成を促進する。細胞およびマウスにおいて化学的ノックアウトを可能にするペプチドベースおよび小分子ベースのＰＲＯＴＡＣが多数報告されている。Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ：Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６（１２）：３７４８−５４（２００４）；Ｈｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰｈｏｓｐｈｏＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（２２）：８９４２−４７（２０１３）；Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ：Ｅｎ Ｒｏｕｔｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８（２２）：５９０４−０８（２００８）；Ｂｏｎｄｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｂｙ Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（８）：６１１−１７（２０１５）、およびＳａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔａｃｓ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ Ｂｏｘ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８（１５）：８５５４−５９（２００１）。これらの化合物の魅力的な特徴は、細胞透過性を含む薬物様特性であるが、多くのペプチドおよび小分子ベースのＰＲＯＴＡＣは、十分な分解を誘導するためにしばしば最大２５μＭの濃度を必要とする、低い有効性に悩まされており（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３（９）：２３１２−３０（２０１４））、カスタムＰＲＯＴＡＣの生成は、Ｅ３ユビキチンリガーゼと所望のタンパク質標的の両方について利用可能なリガンドの相対的な欠如によって、ならびに、このようなリガンドを新たに作製することに関連する技術的課題によって制限されている（Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０−１１（２０１４））。
これらの問題を回避するために、タンパク質ベースのキメラが開発され、ここでは、Ｅ３ユビキチンリガーゼは、目的となる標的に結合するタンパク質に遺伝子融合される。細胞内での異所性発現の後、操作されたタンパク質キメラは、Ｅ３を標的タンパク質に動員し、そのポリユビキチン化およびその後のプロテアソームによる分解をもたらす。最も初期の例では、タンパク質ノックアウトは、網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲＢと相互作用することが知られているヒトパピローマウイルス１６型によってコードされるＥ７タンパク質に由来するペプチドに、β−ＴｒＣＰが融合された、Ｆボックスキメラを作製することによって達成された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（３）：７５１−５６（２０００）ａｎｄ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７−３２（２００３））。異所性発現後、操作されたＦボックスは、ユビキチン化および破壊のために、ｃｕｌｌｉｎ−ＲＩＮＧリガーゼ（「ＣＲＬ」）スーパーファミリーからの多タンパク質Ｅ３複合体であるＳｋｐ１−Ｃｕｌ１−Ｆボックス（「ＳＣＦ」）機構にｐＲＢを動員した。少数の他の研究は、同様に天然タンパク質−タンパク質相互作用を活用しており、それにより、１つの相互作用タンパク質をＥ３に融合させることにより、細胞およびマウスにおける発現後に対応する結合パートナーをサイレンシングするキメラを産生した。Ｈａｔａｋｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ−Ｍｙｃ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１７）：７８７４−７９（２００５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１２（３）：２８６−９４（２０１３）；ａｎｄ Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥｒｂＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３（８）：９８６−９５（２０１４）。
より最近、ユニバーサルプロテオーム編集技術が、天然に存在する結合パートナーを超えて拡張され得ることが示された。このアプローチは、Ｅ３を、一本鎖抗体フラグメント（「ｓｃＦｖ」）、設計されたアンキリン反復タンパク質（「ＤＡＲＰｉｎ」）、またはフィブロネクチンＩＩＩ型（「ＦＮ３」）モノボディ等の合成結合タンパク質に融合することを伴った。Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４−５５（２０１４）。「ユビキボディ」（「ｕＡｂ」）と呼ばれるこれらの二官能性キメラは、ヒトＲＩＮＧ／Ｕボックス型Ｅ３−ＣＨＩＰ（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のカルボキシル末端）のフレキシブルなユビキチンタグ付け能力を、合成結合タンパク質の操作可能な親和性および特異性と組み合わせた。結果は、生物学的機能または相互作用に依存しない分解のために、そうでなければ安定しているタンパク質をＵＰＰへと効率的に方向付けるための、カスタマイズ可能な技術である。確かに、ｕＡｂの最大の利点の１つは、それらの高度なモジュラー構造であり、単に合成結合タンパク質を交換することによって、異なる基質タンパク質を特異的に標的とする新しいｕＡｂを生成することができ（Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７−２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）；およびＫａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７））、一方、Ｅ３ドメインを交換することで、ユビキチン転移の動態または機構を変更することができる。さらに、特定のタンパク質状態（例えば、活性コンフォメーション対不活性コンフォメーション、変異体対野生型、翻訳後修飾）を認識する合成結合タンパク質を組み込むことによって、他のタンパク質を残しながら、特定のタンパク質亜集団を枯渇させることが可能になる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７−３２（２００３）およびＢａｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，“ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ，”Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０（１）：７２−９０（２０１８）。しかし、現在、ｕＡｂの開発は、比較的限られたセットの哺乳動物Ｅ３、最も顕著には、多タンパク質Ｅ３リガーゼ複合体の「単独」Ｅ３ ＣＨＩＰまたはＣＲＬスーパーファミリーのメンバーを中心としている。
本願は、タンパク質ベースのキメラにおける専門知識を統合し、それによって、新規のＥ３ユビキチンリガーゼモチーフは、上記の課題に対処しかつ当該技術分野におけるこれらおよび他の欠陥を克服すべく、目的となる標的に結合するタンパク質に遺伝子融合される。
概要
本願の第１の態様は、単離されたキメラ分子に関する。単離されたキメラ分子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、上記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む。
本願の第２の態様は、リボヌクレオタンパク質を形成する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、１つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、上記ｍＲＮＡおよび上記１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることとを含む。
本願の第３の態様は、本明細書に記載されるキメラ分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
本願の第４の態様は、疾患を治療する方法に関する。本方法は、疾患を有する対象を選択することと、本明細書に記載の組成物を上記対象に投与して、上記対象に、疾患に罹患していない対象と比較して、基質の増加した発現レベルを与えることとを含む。
本願の第５の態様は、基質サイレンシングのための方法に関する。本方法は、サイレンシングさせる基質を選択することと、本明細書に記載のキメラ分子を提供することと、基質−分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で上記基質をキメラ分子と接触させることとを含み、上記複合体は、サイレンシングさせる基質の分解を媒介する。
本願の第６の態様は、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法に関する。本方法は、その存在が疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、試験剤が生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、生体分子を試験剤と接触させることと、接触の結果としての生体分子のレベルを決定することと、決定に基づいて、生体分子のレベルを低下させる試験剤を、疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することとを含む。
本願の第７の態様は、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法に関する。本方法は、１つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、上記疾患細胞がキメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、上記試料を複数のキメラ分子と接触させることと、上記キメラ分子のうちのどれが上記疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、決定に基づいて、上記キメラ分子に結合しかつ上記疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、上記疾患のバイオマーカーとして同定することとを含む。
細胞タンパク質の標的サイレンシングを達成するためのユビキチンプロテアソーム経路の操作は、哺乳動物プロテオームを再構築するための信頼性が高くかつカスタマイズ可能な戦略として現れてきている。１つのこのようなアプローチは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに融合した合成結合タンパク質から構成されるユビキボディと呼ばれる二官能性タンパク質を操作することを伴い、したがって、翻訳後のユビキチン化およびその機能に依存しない標的タンパク質の分解を可能にする。ここでは、目的となるタンパク質の選択的除去のために哺乳動物プロテアソーム分解機構と効果的に整合させることが可能な細菌病原体由来のＥ３ユビキチンリガーゼ模倣物に基づいて、新しいユビキボディのパネルを設計した。これらのうちの１つ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を特異的に認識するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）モノボディに融合したシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）エフェクタータンパク質ＩｐａＨ９．８は、ＧＦＰおよびそのスペクトル誘導体、ならびにサイズ（２７〜１７９ｋＤａ）および細胞下局在（細胞質、核、膜結合、および膜貫通）が変化した１５種の異なるＦＰタグ付き哺乳動物タンパク質を強力に排除することが観察された。治療に関連するユビキボディの送達を実証するために、ＧＦＰ特異的ユビキボディをコードする合成ｍＲＮＡをポリＡ結合タンパク質と共アセンブルし、カチオン性アミン側基を保有する生体適合性の構造的に定義されたポリポリペプチドを使用してナノサイズの複合体にパッケージングする、バイオインスパイアード分子アセンブリ法が利用された。得られたナノプレックスは、ＧＦＰを安定的に発現する培養哺乳動物細胞、ならびにＧＦＰを普遍的に発現するトランスジェニックマウスにおいて効率的な標的枯渇を引き起こす様式で、ユビキボディｍＲＮＡを送達した。全体として、ここで提示される結果は、ＩｐａＨ９．８ベースのユビキボディが、疾患を引き起こすタンパク質を薬理学的に調節する可能性がある高度にモジュール化されたプロテオーム編集技術であることを示唆している。
したがって、本願は、キメラ分子、組成物、治療、医薬組成物、タンパク質サイレンシング技術、治療剤の解明、および新規クラスのキメラ分子に基づく標的スクリーニング技術に関する。本明細書で「ユビキボディ」と称されるこのようなキメラは、Ｅ３ユビキチン酵素のリガーゼ機能をインポートして、標的特異性を保有する分子を生成する。このような操作されたキメラは、さもなければプロテアソームに結合しないかもしれない特定の基質標的の再方向付けおよびタンパク質分解を容易にする。
この点において、このような特定の基質、例えば、細胞内タンパク質の、標的とされた排除は、広範な科学的および臨床的適応症を、本明細書に提供されるキメラ分子、組成物、治療、薬学的組成物、タンパク質サイレンシング技術、治療剤の解明、およびスクリーニング技術に帰属させる。したがって、本願は、ユビキチン化を介した、異常発現遺伝子のタンパク質分解に基づいて、特定の予後予測用途および治療用途を採用および開発するための様々な貴重なツールを付与する。
ここでは、二官能性ｕＡｂキメラとして機能的に再プログラムすることができるＥ３の範囲を広げることを追求した。しかし、哺乳動物Ｅ３を伴う以前の取り組みからの顕著な逸脱においては、代わりに、宿主Ｅ３ユビキチンリガーゼを模倣し、感染中に先天性免疫応答を減衰させるためにＵＰＰ機構をハイジャックする微生物病原体由来のエフェクタータンパク質のセットに焦点を当てた。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）ａｎｄ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５−９６（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素の固有の柔軟性により、細菌性Ｅ３は、哺乳動物の対応物と同様に、標的タンパク質分解のために操作可能であるという仮説が生じた。実際に、堅牢な標的サイレンシングは、シゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼＩｐａＨ９．８からなるｕＡｂで達成され、これは、真核ＨＥＣＴ型Ｅ３と類似性を示すが、任意の真核Ｅ３との配列および構造的相同性の非存在のために、新規のＥ３リガーゼ（「ＮＥＬ」）として分類される。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５−９６（２０１７）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１２）：１３０２−０８（２００８）；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９（１）：ｅ１００３１２１（２０１３）；ａｎｄ Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １（１）：７７−８３（２００７）、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨ９．８のＣ末端触媒ＮＥＬドメインが、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を特異的に認識するＧＦＰ特異的ＦＮ３モノボディＧＳ２に融合されたとき、培養哺乳動物細胞における一過性発現および安定発現の両方の後のＥＧＦＰの強力な分解が観察された。さらに、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８キメラはまた、エメラルド、ビーナス、およびセルリアンを含むＥＧＦＰ、ならびにサイズが２７〜１７９ｋＤａまでの範囲であり、細胞質、核、および細胞膜を含む異なる細胞下区画に局在する１５種の異なるＦＰタグ付き哺乳動物タンパク質のスペクトル誘導体の分解を加速させることができた。これらの標的のうちの２つであるＳＨＰ２およびＲａｓについて、ＩｐａＨ９．８がＳＨＰ２特異的またはＲａｓ特異的ＦＮ３ドメインに融合されたときに、効率的なサイレンシングもまた達成され、これは、ＩｐａＨベースのｕＡｂが再構成され得る容易さを強調する。
先に述べたように、ｕＡｂの治療的開発のための主要な障壁は、細胞内送達である。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０−１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞透過性のために設計することができるより小さいＰＲＯＴＡＣとは異なり（Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５３（９）：２３１２−３０（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｕＡｂは、細胞膜を効果的に貫通しない比較的嵩高いタンパク質である。この問題を修正するために、バイオインスパイアードｍＲＮＡ送達戦略を実施し、それによって、追加の３’末端ポリアデノシン（「ポリＡ」）テールを伴うＧＳ２−ＩｐａＨをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ安定性を改善しかつ真核細胞内でｍＲＮＡ翻訳を刺激するように働くポリＡ結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）と化学量論的に複合体化された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９−１２（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。得られたリボヌクレオタンパク質（「ＲＮＰ」）をカチオン性ポリペプチドで安定化して、ｍＲＮＡを分解から保護し、細胞によるその取り込みを可能にし、そのエンドソームエスケープを促進した。重要なことに、これらの共アセンブルしたナノプレックスは、ＧＦＰを安定的に発現する培養哺乳動物細胞への導入後、およびＧＦＰを普遍的に発現するトランスジェニックマウスへの投与後に効率的なＧＦＰサイレンシングを引き起こす様式で、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡを送達した。まとめると、本明細書に記載される結果は、ｕＡｂ媒介性プロテオーム編集が、細胞およびマウスにおけるタンパク質の標的分解のための効果的な戦略であることを実証し、それによって、ｕＡｂのステージを、薬物発見のためのツールとして、およびいわゆる「新薬の開発につながらない（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」標的を薬理学的にヒットする可能性を有する治療候補として設定する。
図１Ａ〜図１Ｃは、ＧＦＰ特異的ユビキボディとしての細菌性Ｅ３リガーゼＩｐａＨ９．８の操作を示す。図１Ａは、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲ、およびＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の直線状表現を示す。数値は、Ｎ末端（「Ｎ」）からＣ末端（「Ｃ」）までのアミノ酸位置を指す。タンパク質は、ＩｐａＨ９．８のＬＲＲドメインおよびＮＥＬドメインと垂直方向に整列される。ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲは、ＬＲＲドメインを欠くＩｐａＨ９．８の切断型バージョンである。図１Ｂは、示されるように、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰおよび細菌性Ｅ３ベースのｕＡｂのうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析を示す。図１Ｃは、１Ｃと同じであるが、示されるように哺乳動物Ｅ３ベースのｕＡｂを用いている。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）である。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。 図２Ａ〜図２Ｄは、ＩｐａＨ９．８の触媒ドメインがユビキボディ機能に不可欠であることを例証する。図２Ａは、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析によって得られた代表的な蛍光ヒストグラムを示す：ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８、またはＧＳ２−ＩｐａＨ９．８。図２Ｂは、図２Ａに記載の細胞のＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示し、データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂと同様にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物のウェスタンブロット分析を示す。ブロットは、示されるように、ＧＦＰ、６×Ｈｉｓ（各ｕＡｂ上でタグを検出）、およびＧＡＰＤＨに特異的な抗体でプローブされた。抗ＧＡＰＤＨで免疫ブロットすることによって確認されるように、等量の全タンパク質を各レーンに充填した。分子量（ＭＷ）マーカーは左に示されている。図２Ｄは、示されるように、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰおよびＩｐａＨ９．８ホモログのうちの１つと融合したＧＳ２をコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞についてのＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。 図３Ａおよび図３Ｂは、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８が構造的に多様な蛍光タンパク質融合物を分解することを示す。図３Ａは、示されるＦＰ融合物単独（濃い灰色）をコードするプラスミドをトランスフェクトした、またはＦＰ融合物プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）もしくはｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８（薄い灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、対応するＦＰ融合タンパク質を単独で発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定したＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図３Ｂは、図３Ａに記載されるようにトランスフェクト／共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現されるＦＰ標的を選択するための対応する共焦点顕微鏡画像を示す。Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（青色）は細胞核を示し、ＥＧＦＰシグナル（緑色）は蛍光タンパク質を示す。ＥＧＦＲ−ｍＥｍｅｒａｌｄ融合物については、ＥＧＦＲ特異的抗体（赤色）による免疫染色も示される。 図４Ａ〜図４Ｃは、疾患関連標的に対して方向付けられるＩｐａＨ９．８ユビキボディを示す。図４Ａは、ｐｃＤＮＡ３−ＳＨＰ２−ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトした、またはｐｃＤＮＡ３−ＳＨＰ２−ＥＧＦＰおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を例証する。ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＮＳａ５−ＩｐａＨ９．８、またはＮＳａ５−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ。図４Ｂは、図４Ａと同じであるが、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ単独を、またはｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖおよび以下のうちの１つをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたものである。ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ＲａｓＩｎＩＩ−ＩｐａＨ９．８、またはＲａｓＩｎＩＩ−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ。データは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）を表す。図４Ｃは、ｐｃＤＮＡ３−ＲａｓＩｎＩＩ−ＩｐａＨ９．８および以下のうちの１つを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＫＲａｓ、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＫＲａｓＧ１２Ｃ、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＫＲａｓＧ１２Ｄ、またはｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＫＲａｓＧ１２Ｖ。ＭＦＩ比は、ＫＲａｓ変異体を発現する細胞の幾何学的ＭＦＩを、野生型（ｗｔ）ＫＲａｓを発現する細胞の幾何学的ＭＦＩに対して正規化することによって決定した。データは、生物学的三連実験の平均であり、エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。 図５Ａ〜図５Ｄは、ユビキボディｍＲＮＡのナノプレックス送達を介したマウスにおけるプロテオーム編集を示す。図５Ａは、強化されたｍＲＮＡ送達のためのｍＲＮＡ／ＰＡＢＰリボヌクレオタンパク質のポリアミン（ＴＥＰ（Ｎ４））媒介化学量論的アセンブリの概略図である。細胞（灰色の円）内移行後、ナノプレックスの脱アセンブリにより、分解または翻訳のいずれかを受けてｕＡｂタンパク質を産生するｍＲＮＡ／ＰＡＢＰが放出される。図５Ｂは、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、もしくはＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８をコードするｍＲＮＡ、またはＰＡＢＰおよびＴＥＰ（Ｎ４）ポリアミン（ｍＲＮＡ：ＰＡＢＰ重量比＝１：５）で製剤化された同じｍＲＮＡから構成されるナノプレックスと共にインキュベートされた、ＨＥＫ２９３Ｔｄ２ＥＧＦＰ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。送達から２４、４８、および７２時間後に測定を行った。データは、生物学的三連実験の平均±ＳＤとして表される。図５Ｃは、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８（白色の実線の円）、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色の破線の円、上）、またはＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８（白色の破線の円、下）をコードするｍＲＮＡを含有するナノプレックスの耳注射の０時間（上）および２４時間（下）後のＵＢＣ−ＧＦＰマウスの落射蛍光画像を示す。ヒートバーの数字は、放射効率（ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）／（μＷ／ｃｍ２）を表す。図５Ｄは、図５ＣにおけるＵｂｉ−ＧＦＰマウスの耳におけるＧＦＰ蛍光の定量化を示す。データは、各個々の耳領域（黒丸）の平均放射効率および各試料群の平均放射効率（赤色棒）として報告される（ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８についてｎ＝６、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａについてｎ＝３、およびＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８についてｎ＝３）。ｐ値は、対応のある試料ｔ検定によって決定した。 図６Ａおよび図６Ｂは、細菌および哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼドメインを内部に有するｕＡｂによるＧＦＰサイレンシングを示す。示されるように、ｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ単独をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰと（図６Ａに示すように）細菌もしくは（図６Ｂに示すように）哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼのうちの１つに融合したＧＳ２から構成されるｕＡｂをコードするプラスミドとを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー分析によって得られる代表的な蛍光ヒストグラム。幾何平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）の値を示す。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８結合活性および発現の特徴付けを示す。図７Ａにおいて、示されるように、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の結合活性が、ＧＳ２単独、ＬＲＲドメインを欠くＩｐａＨ９．８（「ＩｐａＨ９．８ ＬＲＲ」）、または触媒不活性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａと比較して示される。活性は、固定化抗原としてＧＦＰ、およびウェル当たり適用される１５ｍｇ／ｍＬの各タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合された抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出を行った。クエンチしたプレートを４５０ｎｍで読み取った（Ａｂｓ４５０）。データは、３回の生物学的反復実験の平均であり、エラーバーは、平均値の標準偏差（「ＳＤ」）である。図７Ｂは、示されるように、ＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした、またはＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡおよびｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡまたはｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対応する共焦点顕微鏡画像を示す。非トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ対照細胞も示される。Ｈｏｅｓｃｈｔ染色（青色）は細胞核を示し、ＥＧＦＰシグナル（緑色）はＦＰ標的発現を示し、−Ｈｉｓシグナル（赤色）は、透過処理細胞における発現したｕＡｂの免疫標識に対応する。 図８Ａおよび図８Ｂは、ＦＰ変異体および追加のＦＰ融合タンパク質標的のｕＡｂ媒介サイレンシングを示す。図８Ａは、ＦＰ変異体をコードするプラスミド、および示されるようにｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８（灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。ｍＣｈｅｒｒｙは陰性対照として機能した。データは、対応するＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。図８Ｂは、示されるＦＰ融合物単独（濃い灰色）をコードするプラスミドをトランスフェクトした、またはＦＰ融合物プラスミドおよびｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８（薄い灰色）のいずれかを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。データは、対応するＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。 図９Ａ〜図９Ｃは、ｕＡｂプラットフォームのモジュール性を例証する。図９Ａは、示されるように、ＥＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした、または異なるＧＦＰ指向性結合タンパク質に融合したＩｐａＨ９．８から構成されるｕＡｂキメラをコードするプラスミドを共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。図９Ｂは、示されるように、ＥＧＦＰ、ＥＲＫ２−ＥＧＦＰ、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰ、またはＥＧＦＰＨＲａｓＧ１２Ｖを一過性または安定的に発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。全ての場合において、細胞には、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ（白色）またはｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８（灰色）のいずれかをコードするプラスミドＤＮＡを一過性にトランスフェクトした。図９Ｃは、ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖのみ、ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２ＶおよびＧＳ２−ＩｐａＨ９．８、ＥＧＦＰＨＲａｓＧ１２ＶおよびＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、またはＧＳ２−ＩｐａＨ９．８単独をコードするＤＮＡが安定的に組み込まれたＭＣＦ１０ａ細胞におけるＥＧＦＰ蛍光活性のフローサイトメトリー定量を示す。全てのデータは、ＥＧＦＰ単独を発現するＨＥＫ２８３Ｔ細胞について測定されたＭＦＩに対して正規化された、生物学的三連実験の幾何学的ＭＦＩである。エラーバーは、平均値の標準偏差（ＳＤ）を表す。
詳細な説明
本発明の技術の実質的な理解を提供するために、本願の特定の態様、様式、バリエーションおよび特徴が様々な詳細なレベルで以下に記載されることが理解されるべきである。本明細書で使用される特定の用語の定義を以下に提供する。別段の定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本願が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本願の主題を実施する際に、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの従来の技法が使用される。これらの技術は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＩＩ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｅｄ．（１９９７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇａｉｔ，Ｅｄ．（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８４）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ，Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））；ａｎｄ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５，Ｗｕ＆Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ａｎｄ Ｗｕ，Ｅｄｓ．において記載されており、これらのすべては、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ポリペプチド遺伝子発現産物のレベル、すなわち遺伝子翻訳レベルを検出および測定する方法は、当該技術分野において周知であり、抗体検出および定量化技術等のポリペプチド検出方法の使用を含む。Ｓｔｒａｃｈａｎ＆Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）もまた参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本願の第１の態様は、単離されたキメラ分子に関する。単離されたキメラ分子は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、上記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることが可能な標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合するリンカーとを含む。
本明細書で使用される場合、「キメラ分子」、「キメラポリペプチド」、および「キメラタンパク質」という用語は、第１のタンパク質またはポリペプチド配列の全長配列の少なくとも一部、ならびに第２のタンパク質またはポリペプチド配列の全長配列の少なくとも一部を含む配列を有する分子を包含し、ここで、第１および第２のタンパク質またはポリペプチドは、異なるタンパク質またはポリペプチドである。キメラ分子はまた、同じタンパク質またはポリペプチドに由来する２つ以上の非連続部分を含むタンパク質またはポリペプチドを包含する。キメラ分子はまた、少なくとも１つの置換を有するタンパク質またはポリペプチドも包含し、このキメラ分子は、第１のタンパク質またはポリペプチド配列の一部が第２のタンパク質またはポリペプチド配列の一部によって置換された第１のタンパク質またはポリペプチド配列を含む。本明細書で使用される場合、「キメラ分子」という用語は、本明細書で例示されるように、分解ドメインおよび標的領域を保有する分子をさらに指す。分解ドメインおよび標的領域は、当該技術分野で既知の方法で結合され得る。例えば、それらは、本明細書に例示されるリンカー分子を介して連結されてもよく、融合されてもよく、共有結合されてもよく、共有結合以外で結合されてもよい等である。さらに、分解ドメインおよび標的領域は、直接的に結合されていなくてもよく、および／または結合は一過性であってもよく、例えば、リンカーが使用される場合、リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。
本明細書で使用される場合、「ユビキチン化」という用語は、タンパク質ユビキチンの、他の分子のリジン残基への結合を指す。ペプチドまたはタンパク質等の分子のユビキチン化は、その急速な細胞分解、およびプロテアソーム複合体への標的指向化のためのシグナルとして作用し得る。
本明細書で使用される場合、「ユビキボディ」および「キメラ分子」という用語は、互換的に使用され、本明細書に例示されるように、リンカー領域によって連結された、少なくとも分解ドメインおよび標的領域を有する分子を指す。
本明細書で使用される場合、「標的ドメイン」または「標的指向ドメイン」または「標的指向部分」という用語は、キメラ分子内の第２の領域に共有結合したかまたは共有結合以外で結合したポリペプチド領域を意味し、これは、周囲の位置、細胞、および／または組織と比較して、標的の細胞下位置、細胞、または組織におけるキメラ分子または組成物の濃度を増強させる。
したがって、本願のキメラ分子は、基質結合のためにアクセス可能である、標的指向ドメインに結合した新規のＥ３リガーゼモチーフ（本明細書では、例えば、「Ｅ３リガーゼ（ＥＬ）」として参照される）ユビキチン領域を保有する。いくつかの実施形態において、基質は細胞内基質である。しかし、汎用性を容易にするために、標的指向ドメインは、モノボディ（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（「ＦＮ３」））、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、ＰＲＯＴＡＣ、アプタマードメイン、ユビキチン結合ドメイン配列、Ｅ３結合ドメイン、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体（例えば、ＶＨＨ）、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、および／またはＳｓｏ７ｄに由来する。
当業者は、いくつかの実施形態において、このような標的指向ドメインが、本明細書に記載される新規のＥ３リガーゼモチーフ領域に従って細胞／組織特異性を保有することを容易に理解する。一実施形態において、標的指向ドメインは非天然基質に結合する。
本明細書で使用される場合、モノボディという用語は、例えば、ＦＮ３およびＤＡＲＰｉｎ、または、基質等に特異的に結合するか、もしくはそれと反応する結合部位を含有するポリペプチドを含む、非免疫グロブリン分子の任意の結合部分を含み得る。本願によるモノボディには、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（「ＦＮ３」）を分子骨格として使用して構築される合成結合タンパク質が含まれる。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の単純かつ堅牢な代替物である。モノボディは、天然抗体分子の欠点を克服することを目的とする抗体模倣物（ｍｉｍｉｃｓ）（または抗体模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ））および代替骨格と総称される分子のクラスに属する。従来の抗体を超えたモノボディの主な利点は、モノボディが、遺伝子コードされた細胞内阻害物質として容易に使用することができ、すなわち、モノボディ阻害物質は、細胞にモノボディ発現ベクターをトランスフェクションすることによって選択される細胞において発現され得ることである。これは、ＦＮ３骨格の基礎となる特徴、小さな（約９０個の残基）、安定した、産生しやすい、および細胞質および核の還元環境を含む細胞環境の酸化還元電位にかかわらず機能的モノボディを産生することを可能にするジスルフィド結合の欠如に起因する。一実施形態において、標的指向ドメインはモノボディである。モノボディは、ＧＳ２、Ｎｓａ５、およびＲａｓＩｎＩＩからなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディであり得る。ＧＳ２モノボディは、例えば、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を認識することができる。ＮＳａ５モノボディは、例えば、ＳＨＰ２のＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメイン（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＲ−ＡＢＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＨＰ２ ＳＨ２ Ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（３７）：１４９２４−２９（２０１３）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびにＨＲａｓ、ＫＲａｓ、およびＧ１２Ｖ変異体に特異的なＲａｓＩｎＩＩの各々（Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２−５７３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に特異的であり得る。
モノボディである標的指向ドメインは、例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディであってもよい。ＦＮ３モノボディの例としては、限定されないが以下（括弧内に標的抗原を示す）が挙げられる：ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ−７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４−３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ−３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ−５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０−３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ−ＩκＢα）、Ｆｎ−Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ−Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ−Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）。
本明細書で使用される場合、抗体という用語は、免疫グロブリン、および免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥの任意の抗原結合部分、または抗原結合部位を含有するポリペプチドを含み得、これは、免疫原、抗原、基質等に特異的にまたは「免疫特異的に結合する」、または「免疫反応する」。抗体は、少なくとも１つの重（Ｈ）鎖および少なくとも１つのジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも１つの軽（Ｌ）鎖を含むことができる。用語「ＶＨ」は、抗体の重鎖可変領域を指す。用語「ＶＬ」は、抗体の軽鎖可変領域を指す。いくつかの実施形態において、用語「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を特異的に包含する。「ポリクローナル抗体」は、抗原（単数または複数）で免疫化された動物の血清に由来する抗体を指す。「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ細胞の単一クローンによって産生される抗体を指す。
本願の標的指向ドメインとして有用な抗体関連分子、ドメイン、フラグメント、部分等としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−４６（１９８９）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびに（ｖｉ）単離された相補的決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。そのような「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、概してその抗原結合または可変領域を含むことができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子、例えば、二量体、三量体、または他のポリマーを有するポリマーを含んでもよい。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を含んでもよく、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。しかし、本願に従って使用されるモノクローナル抗体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｙ−Ｐａｓｓｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｖ−Ｇｅｎｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７（１９９１）に記載された技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離することができる。
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、例えば、少なくとも２つの異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を含む。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域に特異的に結合する抗体を含有する少なくとも２つの抗体の調製物を含む。
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖフラグメント、ＶＬおよびＶＨの２つのドメインの抗体融合分子を指し得る。Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって結合することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６（１９８８）ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３（１９８８）を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。このような一本鎖抗体は、「抗体」フラグメントという用語への参照によって含まれ、組換え技法またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「可変」という用語は、例えば、可変ドメインの特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なるという事実を指し得る。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインのアミノ酸スパンにわたって均等に分布しているわけではない。代わりに、Ｖ領域は、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長からなり、これは、それぞれ９〜１２個のアミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性の短い領域によって分離されている。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、βシート構造を接続し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主に採用した４つのＦＲを含む。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって密接に一緒に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（「ＡＤＣＣ」）への関与等の様々なエフェクター機能を示す。
本願の標的指向ドメインは、例えば、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性であり得る。多重特異性標的指向ドメインは、基質の異なるエピトープに特異的であり得、または本願の基質ポリペプチドおよび異種組成物、例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体材料の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ Ｔｈａｔ Ｕｓｅ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ Ｒｅｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第５，５７３，９２０号、第４，４７４，８９３号、第５，６０１，８１９号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第６，１０６，８３５号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。本願の標的指向ドメインは、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来することができる。例えば、標的指向ドメインは、ヒト、海洋動物、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来であってもよい。
標的基質へと方向付けられる標的指向ドメインを生成するための技術は、当業者には周知である。そのような技術の例は、限定されないが、例えば、ディスプレイライブラリ、ゼノ（ｘｅｎｏ）マウスまたはｈｕｍａｂマウス、ハイブリドーマ等を伴うものを含む。本願の範囲内において標的指向ドメインが誘導される標的ポリペプチドとしては、抗原性を示すことができる任意のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体が挙げられる。例として、限定されないが、基質およびそのフラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは一本鎖抗体である。
一本鎖抗体（「ｓｃＦｖ」）は、フレキシブル領域によって軽鎖の可変ドメインに結合した、アミノ末端にある重鎖の可変ドメインからなる遺伝子操作抗体である。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、既知の標的特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現するハイブリドーマ細胞株からＰＣＲによって生成されるか、またはそれらは、脾臓細胞もしくはリンパ球から単離されたライブラリからファージディスプレイによって選択され、親抗体の親和性を保持する。細胞内基質を同定するためのプロトコルを利用して、酵母２ハイブリッド技術は候補ｓｃＦｖ−タンパク質相互作用を同定する役割を果たす。そのようなシステムは、インビボでｓｃＦｖがその標的基質を認識することができるかどうかを予測するのに有用である。Ｐｏｒｔｎｅｒ−Ｔａａｌｉａｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｕｓｉｎｇ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４（（著作権）２００２）を参照のこと。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
典型的には、ディスプレイベクターにクローニングされているｓｃＦｖ、ハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体フラグメントは、抗体または抗体フラグメントがファージまたはファージミド粒子の表面に存在するため、良好な結合活性を維持した変異体を同定するために適切な抗原に対して選択することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照のこと。しかし、選択および／またはスクリーニングのために抗体フラグメントライブラリを溶解ファージベクター（修飾Ｔ７またはＬａｍｂｄａ Ｚａｐ系）にクローニングする等の、他のベクターフォーマットを、このプロセスのために使用することができる。
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。しかし、本願は、等価な機能を果たすウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス等の技術的にプラスミドではないそのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。このようなウイルスベクターは、対象の感染および化合物のその対象における発現を可能にする。発現制御配列は、典型的には、真核宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションが可能なベクターにおける真核プロモーター系である。一旦ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、標的指向ドメインをコードするヌクレオチド配列の高レベル発現のために、ならびに基質結合物質、例えば、交差反応抗基質抗体の収集および精製のために好適な条件下で、維持される。一般に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００２／０１９９２１３号を参照のこと。ベクターはまた、細胞外抗体フラグメントの分泌を方向付けるのに有用なシグナルペプチド、例えば、ペクチン酸リアーゼをコードすることができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５７６，１９５号を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「分解ドメイン」または「分解領域」という用語は、基質のユビキチン化を促進することができるキメラ分子の一部を含む。分解ドメインは、天然結合タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）との相互作用のための第２の「結合」領域を有し得る。結合領域は、１つ以上の変異、置換、欠失を保有するように修飾され得るか、または完全に欠失され得る。
分解ドメインは、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧまたはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックスドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物、ならびにＮＥＬ、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを有する非従来的なＥ３を含んでもよい。分解ドメインは、１つ以上のユビキチン分子および／またはユビキチン様分子を基質に結合させることによって基質を修飾することができるポリペプチドまたはポリペプチド領域に関する。この点において、このような領域は、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３酵素の協調作用を伴う周知のユビキチン化カスケードに適合し、これは、ユビキチンを活性化し、それに付随して基質にユビキチンを結合させるように機能する。いくつかの実施形態において、モチーフは新規のＥ３リガーゼまたはそのフラグメントからなるユビキチン領域であり、これは基質特異的な様式でユビキチンの転移を触媒する。Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３９）：２６７９７−８０２（２００９）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチド、タンパク質、領域、ドメイン等の「修飾（複数可）」または「アミノ酸修飾」という用語は、所望の残基の欠失、付加または変異等の天然配列の変化を指す。このような修飾ポリペプチドは、抗体核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。目的の抗体を得るために、得られる抗体が所望の特性を保有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが行なわれる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化パターンの変化も含む。突然変異誘発のための好ましい位置の特定のための有用な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，“Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈＧＨ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｌａｎｉｎｅ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−８５（１９８９）によって記載されたように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。次いで、変異抗体が所望の活性についてスクリーニングされる。
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、アミノ酸残基がペプチド結合または修飾ペプチド結合によって連結されているアミノ酸鎖を指すために本明細書において互換的に使用される。アミノ酸鎖は、２個のアミノ酸を超える任意の長さであり得る。別途指定されない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、その様々な修飾型も包含する。このような修飾型は、天然に存在する修飾型または化学的に修飾された型であり得る。修飾型の例として、限定されないが、グリコシル化型、リン酸化型、ミリストイル化型、パルミトイル化型、リボシル化型、アセチル化型、ユビキチン化型等が挙げられる。修飾はまた、脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコールまたはその誘導体等の様々な部分への分子内架橋および共有結合を含み、加えて、修飾はまた、環化、分岐および架橋を含んでもよい。さらに、遺伝子によってコードされる従来の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸もまたポリペプチドに含まれてもよい。一実施形態において、本明細書においてＥＬまたはＮＥＬとも称されるＥ３ユビキチンリガーゼモチーフ（Ｅ３）は、修飾結合領域を有しない上記Ｅ３モチーフと比較して、上記基質への結合を阻害または減少させる修飾結合領域を含む。別の実施形態において、修飾は、結合領域における変異または欠失である。
本明細書で使用される場合、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」という用語は、天然に存在するタンパク質またはペプチドへの修飾によって、天然に存在するタンパク質またはペプチド、すなわち「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質とは異なるが、天然に存在する型の塩基性タンパク質および側鎖構造を維持するタンパク質またはペプチドを指すために使用される。このような変化としては、限定されないが、１つ、少数、またはいくつかのアミノ酸側鎖における変化；欠失、例えば、タンパク質またはペプチドの切断型バージョン、挿入および／または置換を含む、１つ、少数、またはいくつかのアミノ酸における変化；１つまたはいくつかの原子の立体化学における変化；ならびに／またはメチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの添加を含むが、これらに限定されない軽微な誘導体化が挙げられる。「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」または「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して、増強された、減少された、変化した、または実質的に類似した特性を有することができる。
いくつかの実施形態において、キメラ分子の分解ドメインは内因性基質認識領域、すなわち天然（ｎａｔｕｒａｌ）または天然結合（ｎａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）パートナーと相互作用するポリペプチドの一部を欠く。分解ドメインのＥ３モチーフは、修飾結合領域を有しないＥ３モチーフと比較して、基質への結合を阻害または減少させる修飾結合ドメインを保有し得る。それにもかかわらず、Ｅ３モチーフは、いくつかの実施形態において基質のタンパク質分解を可能にする。いくつかの実施形態において、修飾は、結合領域の変異、置換、または欠失である。置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換等のアミノ酸置換であり得る。
Ｅ３モチーフの非保存的アミノ酸置換は、アルキルアミノ酸が配列中のアルキルアミノ酸以外のアミノ酸に置換され、芳香族アミノ酸がＥ３モチーフ中の芳香族アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、硫黄含有アミノ酸がＥ３モチーフ中の硫黄含有アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸がＥ３モチーフ中のヒドロキシ含有アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、酸性アミノ酸がＥ３モチーフ中の酸性アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、塩基性アミノ酸がＥ３モチーフ中の塩基性アミノ酸以外のアミノ酸に置換され、または二塩基性モノカルボキシルアミノ酸がＥ３モチーフ中の二塩基性モノカルボキシルアミノ酸以外のアミノ酸に置換される置換である。
一般的なアミノ酸のうち、例えば、「非保存的アミノ酸置換」は、以下の群のうちの１つからのアミノ酸を、以下のように、同じ群ではないアミノ酸で置換することによって例証される。（１）グリシン、アラニン、（２）バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（３）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（４）システインおよびメチオニン、（５）セリンおよびトレオニン、（６）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（７）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（８）リジン、アルギニン、およびヒスチジン。
例えば、Ｅ３モチーフにおける保存的または非保存的アミノ酸変化は、そのような領域をコードするヌクレオチドに対して適切なヌクレオチドを置換することによって導入することができる。これらの修飾は、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、リンカースキャニング突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する突然変異誘発等によって得ることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、概して、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（ｅｄ．），Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照されたい、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。配列バリエーションのための位置を同定するための有用な方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ “Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔｉ−Ｄｉｇｏｘｉｎ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ Ｆｖ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−８５（１９８９）によって記述された「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。
ユビキチンリガーゼファミリーには、Ｅ２コンジュガーゼから基質へのユビキチンの転移に関するＥ６関連タンパク質Ｃ末端（「ＨＥＣＴ」）ドメインリガーゼ、Ｅ２に結合し、Ｅ２−Ｅ３複合体における酵素活性を媒介し得る、実に興味深い新たな遺伝子（「ＲＩＮＧ」）ドメインリガーゼ、およびＺｎ２＋結合リガンドの完全な相補体を有しない修飾ＲＩＮＧモチーフリガーゼファミリーを構成するＵボックスユビキチンリガーゼファミリー（「ＵＵＬ」）が含まれるが、これらに限定されない。Ｃｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（２５）：１３７２０−２５（２００５）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｕボックスユビキチンリガーゼ（「ＵＬＬ」）は、多くの他のユビキチンリガーゼに典型的なタンパク質ドメインである、ＲＩＮＧフィンガーに構造的に関連するＵボックスを有するとして特徴付けられる。ヒトにおいては、ＵＵＬコード遺伝子としては、限定されないが、ＵＢＥ４ＡおよびＵＢＥ４Ｂ遺伝子（それぞれ、ＵＦＤ２ｂおよびＵＦＤ２ａとも称される）、ＣＨＩＰ（ＳＴＵＢ１とも称される）、ＵＩＰ５（Ｕボックス５とも称される）、ＰＲＰ１９（ＰＲＰＦ１９またはＳＮＥＶとも称される）、ＣＹＣ４（ＰＰＩＬ２またはＣｙｐ−６０とも称される）、ＷＤＳＵＢ１、およびＡＣＴ１（ＴＲＡＦ３ＩＰ２とも称される）が挙げられる。Ｍａｒｉｎ，Ｉ．，“Ａｎｃｉｅｎｔ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｕ−ｂｏｘ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．”ＢＭＣ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：３３１，ｐｐ．１−１５（２０１０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＨＥＣＴ Ｅ３リガーゼは、ユビキチン化中の触媒作用に直接的な役割を有するが、ＲＩＮＧおよびＵボックスＥ３タンパク質は、基質ユビキチン化を促進するためにＥ２および基質分子を動員するアダプター分子として作用することによって、タンパク質ユビキチン化を容易にする。ＭＤＭ２（マウスダブル微小クローン２腫瘍性タンパク質）およびｃ−Ｃｂｌ等の多くのＲＩＮＧ型Ｅ３リガーゼは、単独で作用し得るが、他のリガーゼは、アナフェーズ促進複合体（「ＡＰＣ」）等のはるかに大きな多タンパク質複合体の成分として見出される。まとめると、これらの多面的な特性および相互作用により、Ｅ３酵素は、真核生物の全ての細胞内のタンパク質クリアランスのための強力かつ特異的な機構を提供することが可能になる。Ａｒｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．”Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：１５−３０（２００５）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
それでも、Ｅ３遺伝子産物に関する機能情報は変化しやすい。Ｕボックスタンパク質ＣＨＩＰは、コ−シャペロンとして、例えば、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０等のシャペロンと共に、ユビキチンリガーゼとして、単独で、または他のＥ３タンパク質を含み得る複合体の一部としての両方として作用する。同文献を参照のこと。しかし、特定の基質に対するユビキチンプロテアソームシステムの選択性は、ユビキチン結合酵素、例えば、Ｅ２とユビキチンタンパク質リガーゼとの間の相互作用に依存する。タンパク質基質の翻訳後修飾、例えば、リン酸化またはヒドロキシル化等は、ユビキチン化の前にしばしば必要とされる。このようにして、特定の基質に対する正確な空間時間的標的指向化および分解を達成することができる。
本明細書に開示される分解ドメインのＥ３モチーフは、天然結合パートナーからの立体破壊なしに基質をユビキチン化することができる機能性Ｅ３リガーゼを保有する。Ｅ３モチーフに加えて、いくつかの実施形態において、分解ドメインは、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型またはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックス型ドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物であるリガーゼ、ならびにＮＥＬ、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを保有する非従来的なＥ３を有する。このようなドメインは、細胞または組織特異性を保有し得る。
一実施形態では、キメラ分子のＥ３モチーフは、限定されないが、皮膚細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、臍帯血管細胞、角膜細胞、心筋細胞、大動脈細胞、角膜上皮細胞、体細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、気道細胞、微小血管細胞、乳房細胞、血管細胞、軟骨細胞、胎盤細胞、肝細胞、膠細胞、表皮細胞、角膜輪部幹細胞、歯周幹細胞、骨髄間質細胞、ハイブリドーマ細胞、腎臓細胞、膵島、関節軟骨細胞、神経芽細胞、リンパ球、および赤血球、ならびに／またはそれらの任意の組み合わせに関する細胞型特異的または組織特異的リガーゼ機能を保有し得る。
一実施形態において、分解ドメインは細菌病原体由来であり、この病原体は、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から任意に選択される。より具体的には、別の実施形態において、細菌病原体はシゲラ・フレックスネリである。任意の細菌に由来し得る分解ドメインは、例えば、シゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮＬｅＧ５−１、ＮｌｅＧ５−１、ＮｌｅＧ２−３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、および／またはＳｉｄＥに由来し得る。
一実施形態において、分解ドメインは、シゲラＩｐａＨタンパク質ファミリーのメンバーであり、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、および／またはＩｐａＨ０７２２であり得る。シゲラ属の種は、細菌性赤痢（シゲローシス）を引き起こす高度に適応されたヒト病原体である。ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を介して、シゲラは、発熱、上皮細胞の侵入、細胞内生存、および宿主免疫応答の回避を含む機能を有する、病原性を担う毒性タンパク質（エフェクター）のサブセットを送達する。
シゲラは、大きなプラスミドと染色体の両方に存在する１２個のｉｐａＨ遺伝子を保有している。例えば、Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨファミリータンパク質は、Ｎ末端ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を含有し、それらの保存されたＣ末端領域にＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有する（Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ．１：７７−８３（２００７）およびＡｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：３９９−４１３（２０１４）、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ユビキチン化は、多酵素カスケード、Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）、Ｅ２（ユビキチン結合酵素）、およびＥ３（ユビキチンリガーゼ）によって触媒される一連の反応を介して達成される。Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ユビキチン化カスケードは、ユビキチンのカルボキシル末端ＧｌｙとＥ１のＣｙｓとの間のチオエステル結合の形成を介したユビキチンのＡＴＰ依存的活性化から開始する。同文献。活性化ユビキチンは、Ｅ２の活性部位Ｃｙｓに移され、最終的にはＥ３リガーゼは、Ｅ２から特定の基質タンパク質へのユビキチンの転移を媒介する（主に基質Ｌｙｓ残基を介して）。同文献。Ｅ３リガーゼは、それらの構造および機能に基づいて、２つの群に分類することができる。ＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシル末端に相同）型およびＲＩＮＧ（実に興味深い新しい遺伝子）／ Ｕボックス型。同文献。ＨＥＣＴ型Ｅ３リガーゼは、その触媒システイン残基とのチオエステル結合の形成を介してＥ２からユビキチンを受け入れ、次いでそれらの標的基質にユビキチンを移すことによって、ユビキチン転移を触媒する。同文献。一方、ＲＩＮＧ／Ｕボックス型Ｅ３リガーゼは、骨格分子として作用してＥ２−ユビキチン複合体に結合し、動員し、次いでＥ２からＥ３結合基質にユビキチンを直接転移させることによって、直接ユビキチン転移を触媒する。同文献。
ＩｐａＨファミリータンパク質は、シゲラ（ＩｐａＨ）、サルモネラ（ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、およびＳｌｒＰ）、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびいくつかのシュードモナス属の種を含む動物および植物病原体の間で広く保存され、細菌感染におけるこれらのエフェクターの重要性を例証する。同文献。ＩｐａＨファミリータンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有し、それらのＣ末端ドメインは、ＨＥＣＴ型リガーゼのそれと同様のＣｙｓ−ユビキチン中間体を形成する単一の保存Ｃｙｓを含有するが、ＩｐａＨファミリーメンバーの触媒ドメインは、配列および構造レベルが真核Ｅ３ユビキチンリガーゼと異なる。同文献。したがって、ＩｐａＨファミリータンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼの典型的なＲＩＮＧ型およびＨＥＣＴ型とは異なる新しいクラスのＥ３ユビキチンリガーゼ、ＮＥＬ（新規なＥ３リガーゼ）を構成すると考えられる（Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＩｐａＨ Ｄｅｆｉｎｅｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１２９３−１３０１（２００８）；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１３０２−０８（２００８）；Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：４８６４−６９（２００９）、これらのすべてが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＩｐａＨファミリータンパク質は互いに高度に類似しているが、基質認識部位とみなされるそれらのＬＲＲ領域の配列、および細胞下局在（例えば、核、細胞質、または形質膜）は異なる。Ａｓｈｉｄａ＆Ｓａｓａｋａｗａ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１６）に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ユビキチンリガーゼファミリーには、Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ１−Ｆボックス（「ＳＣＦ」）タンパク質複合体にあるような「Ｆボックス」リガーゼも含まれ、このリガーゼは、ユビキチン化基質、例えば、Ｃｄｃ４に結合し、これはその後、Ｃｌｎに結合するＳｉｃ１またはＧｒｒ１等の標的タンパク質と相互作用する。Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，“ＳＫＰ １ Ｃｏｎｎｅｃｔｓ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｔｉｆ，ｔｈｅ Ｆ−Ｂｏｘ”Ｃｅｌｌ ８６（２）：２６３−７４（１９９７）を参照のこと。これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｆボックスは、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として機能する約５０個のアミノ酸のタンパク質モチーフである。例えば、Ｋｉｐｒｅｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｆ−ｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ．”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１（５）（２０００）を参照のこと。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｆボックスタンパク質は、最初に、ＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体の成分として特徴付けられたものであり、これらは、ユビキチン媒介タンパク質分解のために基質に結合する。Ｆボックスモチーフは、コアＳＣＦ成分Ｓｋｐ Ｉに結合することによって、Ｆボックスタンパク質をＳＣＦ複合体の他の成分に連結する。Ｆボックスタンパク質は、様々な細胞機能において非ＳＣＦタンパク質複合体を介して機能することがごく最近発見されている。同文献を参照のこと。Ｆボックスタンパク質は、多くの場合、タンパク質−タンパク質相互作用が可能な追加のカルボキシ末端モチーフを含み、酵母およびヒトＦボックスタンパク質において最も一般的な二次モチーフは、ＷＤ反復およびロイシンリッチ反復であり、これらの両方は、ＳＣＦ複合体にリン酸化基質を結合することが見出されている。同文献を参照のこと。Ｆボックスタンパク質の大部分は、他の関連するモチーフを有し、これらのタンパク質の大部分の機能はまだ定義されていない。同文献を参照のこと。
Ｆボックスモチーフ内の最小変異体位置は、８位（コンセンサスのために使用される２３４個のＦボックスタンパク質の９２％がロイシンまたはメチオニンを有する）、９位（９２％プロリン）、１６位（８６％イソロイシンまたはバリン）、２０位（８１％ロイシンまたはメチオニン）、および３２位（９２％セリンまたはシステイン）を含む。同文献。この厳密なコンセンサスの欠如は、当業者がＦボックス配列を検出するために複数の検索アルゴリズムを用いることの指針となる。例えば、２つのアルゴリズムは、ＰｒｏｓｉｔｅデータベースおよびＰｆａｍデータベースに見出すことができる。時折、あるデータベースが所与のタンパク質中のＦボックスに有意なスコアを与えることがあるため、他のデータベースがそれを検出しない場合は、両方のデータベースを検索する必要がある。同文献。
原核生物における本願のキメラ分子の発現は、融合ポリペプチドまたは非融合ポリペプチドのいずれかの発現を方向付ける構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて大腸菌において最も多く行われる。融合ベクターは、その中においてコードされるポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に、一定の数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には、３つの目的、（ｉ）発現を増加させるため、（ｉｉ）溶解度を増加させるため、および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして作用することによって精製を補助するために働く。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合部分と組換えポリペプチドとの接合部にタンパク質分解切断部位が導入され、融合ポリペプチドの精製後に融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にする。このような酵素、およびそれらの内因性認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｅｐ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ Ｆｕｓｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，”Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８），これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、標的組換えポリペプチドにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、マルトースＥ結合ポリペプチド、またはポリペプチドＡを融合させる。
好適な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｉｇｈｔｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔａｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｆｕｓｅｄ ａｎｄ Ｆｕｓｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｇｅｎｅ ６９：３０１−１５（１９８８）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．６０−８９（１９９０））が挙げられ、これらは、それらの全体が本明細書に組み込まれる。ポリペプチド融合を介して多官能性ポリペプチドを得るための異なる活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的アセンブリのための方法は、Ｐａｃｋら、米国特許第６，２９４，３５３号、同第６，６９２，９３５号によって記載されており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。大腸菌における組換えポリペプチド、例えば、本願のキメラ分子の発現を最大化するための１つの戦略は、組換えキメラをタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１１９−１２８（１９９０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、分解ドメインおよび標的領域を含む本願のキメラ分子をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、例えば、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，“Ａｎ ＬＦＡ−３ ｃＤＮＡ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２，”Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７），これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。キメラ分子の標的指向ドメイン、分解ドメインの発現に有用な原核細胞と真核細胞の両方のための他の好適な発現系について。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）の第１６章および第１７章を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キメラ分子Ｅ３分解ドメインおよび標的指向ドメイン発現にもかかわらず、このようなドメイン／領域の機能は、本願の特異性を付与する。既知または未知の基質は、分解ドメインを介した後続のユビキチン化のために標的指向ドメインによって結合される。いくつかの実施形態において、基質は、限定されないが、細胞内基質、細胞外基質、修飾基質、グリコシル化基質、ファルネシル化基質、翻訳後修飾基質、リン酸化基質、および当該技術分野で既知の他の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、基質としては、限定されないが、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ−Ｒａｓタンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β−ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ−ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質等が挙げられる。一実施形態において、基質は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を含む。天然アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基、例えば、ノルロイシン、または修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を指す。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学的命名委員会によって推奨される１文字記号のいずれかによって言及され得る。
本願による分解ドメインとして有用な例示的なＥ３リガーゼとしては、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）由来の、ＵボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＡｖｒＰｔｏＢが挙げられ、これは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
Figure 2021515582
シュードモナス・シリンゲ由来のＥ３ユビキチンリガーゼＡｖｒＰｔｏＢは、以下のように、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、配列番号３のアミノ酸配列を有するシゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼ（本明細書においてＮＥＬまたはＥＬとも称される）であるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ０７２２が挙げられる。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ０７２２は、以下のように、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３リガーゼとしては、シゲラ・フレックスネリ由来の新規Ｅ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ１．４が挙げられ、これは、以下のように配列番号５のアミノ酸配列を有する。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ１．４は、以下のように、配列番号６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、配列番号７のアミノ酸配列を有するシゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ２．５が挙げられる。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ２．５は、以下のように、配列番号８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用な更なる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号９のアミノ酸配列を有する、新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ４．５が挙げられる。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ４．５は、以下のように、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ７．８（シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する）が挙げられる。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３ユビキチンリガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ７．８は、以下のように、配列番号１２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規のＥ３リガーゼであり、シゲラ・フレックスネリ由来であり、配列番号１３のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ９．８が挙げられる。
Figure 2021515582
シゲラ・フレックスネリ由来の新規のＥ３リガーゼであるＥ３ユビキチンリガーゼＩｐａＨ９．８は、以下のように配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｆボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）由来であり、配列番号１５のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＡＵ１３が挙げられる。
Figure 2021515582
レジオネラ・ニューモフィラ由来のＦボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＡＵ１３は、以下のように、配列番号１６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｆボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であり、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＵ１が挙げられる。
Figure 2021515582
レジオネラ・ニューモフィラ由来のＦボックスモチーフであるＥ３ユビキチンリガーゼＬｅｇＵ１は、以下のように、配列番号１８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であり、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＬｕｂＸが挙げられる。
Figure 2021515582
Ｕボックスモチーフであり、レジオネラ・ニューモフィラ由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＬｕｂＸは、以下のような配列番号２０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）Ｏ１５７：Ｈ７であり、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ２−３が挙げられる。
Figure 2021515582
Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来のＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ２−３は、以下のように、配列番号２２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２３のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ５−１が挙げられる。
Figure 2021515582
Ｕボックスモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来である、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＧ５−１は、以下のような配列番号２４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２５のアミノ酸配列を有する、Ｅ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＬが挙げられる。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、腸管出血性大腸菌（「ＥＨＥＣ」）Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２６のヌクレオチド配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＮｌｅＬが挙げられる。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、非従来的なモチーフであり、Ｌ．ニューモフィラ由来であり、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｉｄＣが挙げられる。
Figure 2021515582
非従来的なモチーフであり、Ｌ．ニューモフィラ由来のＥ３ユビキチンリガーゼＳｉｄＣは、以下のような配列番号２８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＮＥＬモチーフであり、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７由来であり、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｌｒＰが挙げられる。
Figure 2021515582
ＮＥＬモチーフであり、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｌｒＰは、以下のような配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、ＨＥＣＴモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来であり、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｏｐＡが挙げられる。
Figure 2021515582
ＨＥＣＴモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｏｐＡは、以下のような配列番号３２のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であり、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ１が挙げられる。
Figure 2021515582
新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ１は、以下のような配列番号３４のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来であり、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ２が挙げられる。
Figure 2021515582
新規なＥ３リガーゼモチーフであり、サルモネラ・ティフィムリウム由来のＥ３ユビキチンリガーゼＳｓｐＨ２は、配列番号３６のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
本願による分解ドメインとして有用なさらなる例示的なＥ３ユビキチンリガーゼとしては、非従来的なモチーフであり、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）由来であり、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＥ３ユビキチンリガーゼＸｏｐＬが挙げられる。
Figure 2021515582
非従来的なモチーフであり、キサントモナス・カンペストリス由来であるＥ３ユビキチンリガーゼＸｏｐＬは、以下のような配列番号３８のヌクレオチド配列を有する。
Figure 2021515582
標的指向ドメインは、固有の結合相互作用、例えば、二次、三次、または四次フレキシビリティを保有するが、Ｅ３モチーフユビキチン領域との会合に関して依然としてフレキシビリティが存在しなければならない。この点に関して、適切な間隔がない場合、Ｅ３モチーフが基質−標的指向ドメイン相互作用を立体的に妨げることがあり得る。したがって、本願は、いくつかの実施形態において、標的指向ドメインと基質との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを用いる。
いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは、生理学的条件下で切断可能であっても切断不可能であってもよいリンカーを介してユビキチン領域に共有結合する。リンカーは、ユビキチン領域剤への標的指向ドメインへの共有結合を可能にする求核性または求電子性反応基を含む有機部分を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーはエノールエーテル、ケタール、イミン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、アシルイミド、またはメチレンラジカルである。いくつかの実施形態において、リンカーは、酸切断可能リンカー、加水分解可能リンカー、または酵素切断可能リンカーであってもよい。
ペプチドベースの連結基は、細胞におけるペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、オリゴペプチド、例えば、ジペプチド、トリペプチド、およびポリペプチドを得るためにアミノ酸間で形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間に形成することができる。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成され、ペプチドおよびタンパク質を得るための特別なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されるペプチド結合、すなわちアミド結合に限定され、ペプチドおよびタンパク質が得られ、アミド官能基全体が含まれない。ペプチド切断可能な連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ２Ｃ（Ｏ）−を有し、式中、Ｒ１およびＲ２は、２つの隣接アミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述のものと類似の方法を使用して評価することができる。
インビトロ用途のために、ポリペプチドを固体支持体に結合させるための使用のための架橋剤であり得る適切なリンカーには、支持体の表面上に存在する官能基と反応することができるか、またはポリペプチドと反応することができるか、またはその両方である様々な薬剤が含まれる。架橋剤として有用な試薬としては、ホモ二官能性試薬、および特にヘテロ二官能性試薬が挙げられる。有用な二官能性架橋剤としては、限定されないが、Ｎ−ＳＩＡＢ、ジマレイミド、ＤＴＮＢ、Ｎ−ＳＡＴＡ、Ｎ−ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、および６−ＨＹＮＩＣが挙げられる。架橋剤を選択して、ポリペプチドと固体支持体との間で選択的に切断可能な結合を提供することができる。例えば、ポリペプチドを固体支持体から切断するための手段として、３−アミノ−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸等の光不安定性架橋剤を用いることができる。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｂｅａｄ Ｄｅｃｏｄｅ Ｓｔｒａｔｅｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ａ Ｎｅｗ Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ｌｉｎｋｅｒ：３−ａｍｉｎｏ−３−（２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ，”Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ ４−１２（１９９５）および米国特許第５，６４３，７２２号を参照のこと。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
抗体、ポリペプチド、またはそのフラグメント、例えば標的指向ドメインは、カルボキシル基官能化ビーズとポリペプチドのアミノ末端との間に形成される共有アミド結合を介して、または逆に、アミノ基官能化ビーズとポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成される共有アミド結合を介して、ビーズ等の固体支持体上に固定化され得る。さらに、二官能性トリチルリンカーは、アミノ樹脂を介して樹脂上のアミノ基またはカルボキシル基を通して、支持体に、例えば、Ｗａｎｇ樹脂等の樹脂上の４−ニトロフェニル活性エステルに結合することができる。二官能性トリチルアプローチを使用して、固体支持体は、ポリペプチドが切断され、除去され得ることを確実にするために、ギ酸またはトリフルオロ酢酸等の揮発性酸を用いる処理を必要とすることができる。そのような場合、ポリペプチドは、固体支持体のウェルの底部または固体支持体の平坦な表面上にビーズレスパッチとして堆積することができる。マトリックス溶液を添加した後、ポリペプチドはＭＳに堆積することができる。
当業者には、上述の方法および技術が、上記のように、その構成部分、例えば、分解ドメイン、ユビキチン領域、標的領域、およびそれらの修飾、ならびにリンカー分子を含む、本願のキメラ分子のために利用され得ることが容易に明らかになる。
本願の第２の態様は、リボヌクレオタンパク質を形成する方法に関する。本方法は、本明細書に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、１つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、ｍＲＮＡおよび１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることとを含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは３’末端ポリアデノシン（ポリＡ）テールを含む。
本態様に記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書に記載のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）（ポリ（Ａ）結合タンパク質とも称される）は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに結合するＲＮＡ結合タンパク質を指す。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの３’末端に位置し、２００〜２５０ヌクレオチド長である。結合タンパク質はまた、ポリアデニル酸ポリメラーゼが翻訳の前にポリ（Ａ）ヌクレオチドテールをプレｍＲＮＡに付加することを補助することによって、ｍＲＮＡ前駆体にも関与する。核アイソフォームは、約５０個のヌクレオチドに選択的に結合し、ＲＮＡに対するその親和性を増加させることによってポリアデニル酸ポリメラーゼの活性を刺激する。ポリ（Ａ）結合タンパク質はまた、ナンセンス媒介性分解および核細胞質トラフィッキングを含むｍＲＮＡ代謝の段階の間に存在する。ポリ（Ａ）結合タンパク質はまた、テールを分解から保護し、ｍＲＮＡ産生を調節し得る。
本明細書においてナノプレックスとも称されるリボヌクレオタンパク質は、一実施形態において、ナノ粒子であり得る。好ましい実施形態において、ナノプレックスは、ナノ粒子を含む。リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、反対に荷電したポリ電解質を有する薬物ナノ粒子によって形成される複合体である。カチオン性薬物およびアニオン性薬物の両方は、反対に荷電したポリ電解質と複合体を形成する。他のナノ構造と比較して、ナノプレックスの収率は概して高く、錯体形成効率は概して良好である。ナノプレックスは、他のナノ構造と比較して調製することも容易である。本願によるリボヌクレオタンパク質またはナノプレックス製剤は、走査型電子顕微鏡、示差走査熱量測定、Ｘ線回折および透析研究を使用した、生成収率、錯体化効率、薬物負荷、粒径およびゼータ電位によって特徴付けられる。ナノプレックスは、癌治療、遺伝子薬物送達、脳への薬物送達、ならびにタンパク質およびペプチド薬物送達等の様々な分野において幅広い用途を有する。
リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、任意の好適なサイズを有することができる。少なくとも１つの実施形態において、リボヌクレオタンパク質またはナノプレックスは、直径が約２００ｎｍ未満、直径が約１００ｎｍ未満、直径が約９５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約９ｎｍ未満、約８ｎｍ未満、約７ｎｍ未満、約６ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約４ｎｍ、約３ｎｍ未満、約２ｎｍ未満、または約１ｎｍ未満である。約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍ、約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、または約２ｎｍの上限、および約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、約５０ｎｍ、約４５ｎｍ、約４０ｎｍ、約３５ｎｍ、約３０ｎｍ、約２５ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍ、約９ｎｍ、約８ｎｍ、約７ｎｍ、約６ｎｍ、約５ｎｍ、約４ｎｍ、約３ｎｍ、約２ｎｍ、または約１ｎｍの下限、およびこれらの任意の組み合わせ、を有する範囲の直径を有するナノ粒子もまた企図される。本願は、ある特定の実施形態において、ナノプレックスのサイズが約５０ｎｍ〜約２００ｎｍまたは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲であることをさらに提供する。ある特定の実施形態において、ナノプレックスのサイズは、約５０ｎｍ 〜約１５０ｎｍである。他の実施形態において、ナノプレックスのサイズは、約５０ｎｍ、約７５ｎｍ、または約１００ｎｍであり得る。
リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスのサイズは、対象内の特定の位置に局在化するように最適化され得る。例えば、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、対象の様々な器官に移動することができるように最適化されてもよい。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは有機ゲルを含有する。
本願のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、任意の適切な形状を有することができる。例えば、本発明のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、メッシュ、球体、正方形、長方形、三角形、円形ディスク、立方体様形状、立方体、直方体（立方体状）、円錐、円筒、プリズム、多面体、ピラミッド型、直角円筒、ロッド、分岐円筒形、ならびに他の規則的または不規則な形状の形状を有し得る。リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスのポリマーマトリックスは、一実施形態において、絡まった共有結合ポリマーを含有し得る。一実施形態において、マトリックスはヒドロゲルである。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスマトリックス中のポリマー単位の数は、ポリマー単位から形成される各粒子について１０〜５０００、例えば２０〜４００の範囲である。別の実施形態において、ポリマー単位の数は、１０，０００〜２００，０００、例えば１５，０００〜２００，０００のポリマー単位の範囲である。
本願によるリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、官能基化表面を含み得る。一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは負に官能基化される。代替として、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、正に官能基化されてもよい。他の実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、電荷を有しないか、または中性である。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは生分解性である。別の実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは非毒性である。
一実施形態において、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、少なくとも１つの安定剤をさらに含み得る。安定剤は、リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの表面上に吸着され得る。リボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスは、液体培地中に分散され得、安定剤は、分散プロセス中の個々のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの分離を補助するためのアジュバントとして使用され得る。個々のリボヌクレオタンパク質および／またはナノプレックスの分離を補助する安定剤の能力は、安定剤を含有する組成物と、安定剤を含まない対照組成物の分散プロセスを比較することによって決定され得る。個々のナノ粒子の分離を補助する安定剤の能力は、より短い分散時間によって示され得る。あるいは、安定剤は、液体培地、好ましくは水性培地中の分散されたナノプレックスの安定性を促進するために使用され得る。
本願の第３の態様は、本明細書に記載されるキメラ分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
本願の方法によれば、キメラ分子は、投与のために好適な薬学的組成物に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合する任意のおよびすべての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌化合物、等張および吸収遅延化合物等を含むことが意図される。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
薬学的組成物は、一般に、組換えまたは実質的に精製されたキメラ分子、および対象への投与に好適な形態の薬学的に許容される担体を伴う。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、タンパク質組成物を投与するための医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照のこと。薬学的組成物は、一般に、無菌で実質的に等張性であり、米国食品医薬品局のすべての良好な製造慣行（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
本明細書で使用される場合、薬学的に許容される担体という用語は、例えば、任意のタイプの非毒性、不活性固体、半固体または液体充填剤、希釈剤、封入材料または製剤補助剤を含む。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｄ．ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５は、薬学的組成物の製剤化に使用される様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として機能することができる材料のいくつかの例としては、限定されないが、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等のデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；ＴＷＥＥＮ（商標）８０等の洗剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性適合性潤滑剤が挙げられる。着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料剤、防腐剤、および／または抗酸化剤もまた、製剤者の判断に従って組成物中に存在することができる。
本願の化合物は、経口、非経口、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内滴下によって、または鼻、のど、および気管支等の粘膜への適用によって投与することができる。それらは、単独で、または好適な薬学的担体と共に投与され得、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルション等の固体形態または液体形態であり得る。
本願の組成物は、例えば、不活性希釈剤と共に、または同化可能な食用担体と共に経口投与されてもよく、またはそれらは、硬質もしくは軟質シェルカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、またはそれらは、食事の食物と直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、これらの組成物には、賦形剤が組み込まれ、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ等の形態で使用され得る。このような組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。これらの組成物中の組成物の割合は、もちろん変化してもよく、好都合には、単位の重量の約２％〜約６０％であり得る。経口投与単位が約１〜２５０ｍｇの活性化合物を含有するように、本願による好ましい組成物が調製される。
錠剤、カプセル等はまた、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、およびスクロース、ラクトース、またはサッカリン等の甘味剤を含んでもよい。投薬単位形態がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて、脂肪油等の液体担体を含有してもよい。
これらの組成物は、非経口投与することもできる。本組成物の溶液または懸濁液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。分散体はまた、油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で調製することができる。例示的な油は、石油、動物、植物、または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、または鉱物油である。一般に、水、食塩水、デキストロース水溶液および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコールは、特に注射用溶液のための好ましい液体担体である。通常の保存および使用のための条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。
注射液のために適した薬学的形態は、無菌水溶液、または無菌注射液もしくは分散液の即時調製のための分散液および無菌粉末を含む。すべての場合、剤型は無菌である必要があり、易注射性が存在する程度まで流体でなくてはならない。これは、製造および保存条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。
本願の組成物はまた、エアゾール形態で気道に直接投与されてもよい。エアゾールとしての使用のために、溶液または懸濁液中の本願の組成物は、従来のアジュバントと共に、好適な推進剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタン等の炭化水素推進剤と共に加圧エアゾール容器にパッケージングされてもよい。本願の材料はまた、吸入器または噴霧器等の非加圧形態で投与されてもよい。
本願の組成物は、いくつかの実施形態において、任意に、全不活性生物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはそれらの組み合わせの形態で、抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤（ｈｐｙｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、有機栄養標的指向剤、免疫学的薬剤、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物等の病原体由来の抗原の非限定的な群から選択される第２の薬剤または薬学的組成物、上記のカテゴリに該当し、公開文献に見い出され得るヒト使用のために承認されている薬理学的または免疫学的薬剤の任意の例、任意の他の生物活性成分、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含有する。
いくつかの実施形態において、第２の薬剤または薬学的組成物は、抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤（ｈｐｙｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、有機栄養標的指向剤の非限定的な群から選択される。
Ｅ３ユビキチンリガーゼおよびその機能ドメインの重要性は、それらが調節する正常な細胞プロセスの数によって強調され、機能喪失または不適切な標的指向化に関連する付随する疾患の根底にある。Ａｒｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ．Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．”４１：１５−３０（２００５）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本願の第４の態様は、疾患を治療する方法に関する。方法は、疾患を有する対象を選択することと、本明細書に記載の組成物を対象に投与して、該対象に、疾患に罹患していない対象と比較して、基質の増加した発現レベルを与えることとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト等の哺乳動物を指すが、家畜（例えば、イヌ、ネコ等）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）または実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）等の別の動物であり得る。用語「患者」は、疾患または状態に罹患しているか、または罹患している疑いのある「対象」を指す。
この方法は、対象に組成物を投与することを含み得、疾患は測定可能な表現型を保有する。疾患の表現型は、いくつかの実施形態において、疾患に罹患していない対象からの表現型と比較して、基質の発現レベルの増加を伴う。この点において、本願の医薬組成物に含まれるキメラ分子は、疾患に罹患していない対象からの表現型と比較して、１つ以上の基質の発現レベルの表現型増加を特徴とする疾患からの症状を治療または緩和するのに有効である。
本願の文脈で治療または予防することができる疾患の非限定的な例としては、癌、転移性癌、固形癌、浸潤性癌、播種性癌、乳癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ癌、肝臓癌、前立腺癌、脳癌、膵臓癌、リンパ癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、および当該技術分野で既知の他の固形癌、血液細胞悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、脳卒中、虚血、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、うっ血性心不全、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、糖尿病、癌、関節炎、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、敗血症性ショック、多臓器機能不全症候群、関節リウマチ、外傷、脳卒中、心筋梗塞（ｈｅａｒｔ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）、全身性自己免疫疾患、慢性肝炎、体重過多、および／または肥満、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、疾患は、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多または肥満、およびそれらの任意の組み合わせである。
治療のためにインビボで使用される場合、組成物は、有効量、すなわち、所望の治療効果を有する量で対象に投与される。用量および投薬量レジメンは、対象における疾患の程度、使用される特定のペプチドの特徴、例えば、その治療指標、対象、および対象の病歴に依存する。有効量は、医師および臨床医によく知られている方法によって、前臨床試験および臨床試験中に決定することができる。これらの方法において有用な有効量のペプチドは、薬学的化合物を投与するための多くの周知の方法のいずれかによってそれを必要とする哺乳動物に投与され得る。
組成物の投薬量、毒性、および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比率は、治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指標を示す化合物が望ましい場合がある。毒性の副作用を示す組成物が使用され得るが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、このような組成物を罹患した組織の部位に標的指向させる送達システムを設計するための注意が必要である。
いくつかの実施形態において、本願の組成物は、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、移植により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病変内に、経皮的に、または粘膜への適用により投与される。
本願の第５の態様は、基質サイレンシングのための方法に関する。この方法は、サイレンシングさせる基質を選択することと、本明細書に記載のキメラ分子を提供することと、基質−分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で基質をキメラ分子と接触させることとを含み、この複合体は、サイレンシングさせる基質の分解を媒介する。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本願の第６の態様は、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法に関する。本方法は、疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、試験剤が生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、生体分子を試験剤と接触させることと、接触の結果としての生体分子のレベルを決定することと、上記決定に基づいて、生体分子のレベルを低下させる試験剤を、疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」または「対照レベル」という用語は、比較目的で関心がある場合があるバイオマーカー（または生体分子、リガンド、基質等）の量または濃度を指す。いくつかの実施形態において、参照レベルは、健康な対象の対照集団またはタンパク質もしくは基質の異常発現を保有する疾患集団から採取された少なくとも１つのバイオマーカーのレベルの平均として発現される少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであってもよい。別の実施形態において、参照レベルは、より早い時期、すなわち、本アッセイの前の同じ対象における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであってもよい。さらに別の実施形態において、参照レベルは、治療レジメンを受ける前の対象における少なくとも１つのバイオマーカーのレベルであり得る。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、限定されないが、血液（または血漿もしくは血清等の血液の画分）、リンパ液、粘液、涙液、唾液、痰、尿、精液、便、ＣＳＦ、腹水、または全血等の身体組織または体液を含み得、体内組織の生検試料を含む。試料は、対象からの試料から増殖させた微生物のインビトロ培養も含み得る。試料は、任意の対象、例えば、疾患または疾患を特徴とする状態を有するか、または有する疑いのある対象／患者から得ることができる。
本明細書で使用される場合、「スクリーニング」という用語は、キメラ分子または組成物が、本明細書に記載される標的病理学的状態、すなわち、特定の疾患における欠損によって特徴付けられる疾患または状態を予防または減速させる（減少させる）能力または特徴を有するかどうかを決定することを意味する。
本明細書で使用される場合、キメラ分子または組成物の「有効量」または「治療有効量」という用語は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、治療されている疾患に関連する症状の予防または軽減をもたらす量である。対象に投与される化合物の量は、疾患の種類および重症度、ならびに一般的な健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する耐性等の個体の特徴に依存する。これはまた、疾患の程度、重症度、または段階にも依存する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な用量を決定することができる。
本明細書で使用される「酵素結合免疫吸着アッセイ」（ＥＬＩＳＡ）という用語は、検出可能なシグナルを産生する酵素反応を介して目的の抗原の検出が達成される抗体ベースのアッセイを含む。ＥＬＩＳＡは、競合形式または非競合形式で実行することができる。ＥＬＩＳＡはまた、抗原を捕捉するための１つの抗体、および捕捉された抗体−抗原複合体を検出するための酵素または他の検出可能な標識で標識された１つの抗体である、抗原に対する２つの抗体が使用される２部位または「サンドイッチ」アッセイも含む。典型的な２部位ＥＬＩＳＡにおいて、抗原は、非標識抗体および酵素結合抗体が高親和性で結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する。したがって、抗原は、親和性捕捉され、酵素結合抗体を使用して検出することができる。選択される典型的な酵素としては、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられ、これらの両方は、適切な基質と接触すると検出可能な産物を生成する。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を含む。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合が失われないという点で区別される。典型的には、エピトープは、１つ以上の標的指向ドメインによって認識され得る基質を形成する決定基領域である。
エピトープを保有する標的指向ドメインまたは基質についてスクリーニングするために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるもの等の日常的な交差ブロッキングアッセイを実行することができる。このアッセイを使用して、標的指向ドメインが、異なる標的指向ドメイン、抗体、抗体フラグメント等と同じ基質の部位またはエピトープに結合するかどうかを決定することができる。代替的または追加的に、エピトープマッピングは、当該技術分野で既知の方法によって実行することができる。例えば、抗体配列は、接触残基を同定するために、例えば、アラニンスキャニングによって変異誘発することができる。異なる方法では、基質の異なる領域に対応するペプチドは、試験標的指向ドメインとの競合アッセイ、または試験抗体および標的指向ドメインまたは特徴付けられたエピトープを有する抗体との競合アッセイにおいて使用することができる。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、例えば、ＶＬ中の約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）残基の周り、ならびにＶＨ中の約３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）残基の周り（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶＬにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおける２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３））（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７（１９８７））を含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」ポリペプチド、ペプチド、分子、またはキメラ分子という用語は、薬剤が由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料または他の汚染ポリペプチドを実質的に含まないか、または化学合成されたときに化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。例えば、キメラ分子は、そのような分子の意図される機能、診断または治療用途と干渉する材料を含まない。このような干渉物質は、キメラ分子、酵素、ホルモン、ならびに他のタンパク質性および非タンパク質性溶質に包含される物質以外のタンパク質またはフラグメントを含み得る。
一実施形態において、同定は、疾患に罹患していない対象における標準生体分子レベルに関して行われる。同定は、いくつかの実施形態において、接触がない生体分子レベルに関してもまた行われ得る。この点において、対照レベルを用いて、試料中の生体分子のレベルと比較することができる。いくつかの実施形態において、対照レベルは、疾患に罹患していない対象由来の生体分子のレベルである。基質レベルに影響を及ぼす疾患または状態を有すると疑われる対象から得られる試料中の生体分子の過剰存在は、健康な対象から得られる試料と比較して、試験される対象における生体分子関連の疾患または状態を示す。
ある特定の基質生体分子の過剰存在の程度によって、対象が疾患に罹患しているか、または疾患を発症する可能性があるかが示されることが知られている、無数の疾患が存在する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ Ｒｏｂｕｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓａｌｓ ｉｎ ２−Ｄ ＤＩＧＥ Ｄａｔａ，”Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ７：１１９７−１２０７（２００７）を参照のこと。対照対象と比較して生体分子が増加する状態の例としては、上述の疾患が挙げられる。
したがって、本願のキメラ分子および組成物は、治療を必要とする対象に投与される。Ｅ３モチーフをコードするＥ３遺伝子産物等のＥ３ユビキチンリガーゼは、上述され、本明細書に開示されるキメラ分子の有効性を決定するための本スクリーニング方法において使用することができる。いくつかの実施形態において、好適なインビトロアッセイまたはインビボアッセイを実施して、本願のキメラ分子および組成物の効果、ならびに投与が治療のために適応されるかどうかを決定する。治療における使用のための組成物は、限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む好適な動物モデル系において、ヒト対象における試験の前に試験することができる。同様に、インビボ試験のために、当該技術分野で既知の動物モデル系のいずれも、ヒト対象への投与の前に使用することができる。
細胞、臓器、または組織を組成物と接触させるための当業者に既知の任意の方法が用いられ得る。インビボ方法は、典型的には、哺乳動物、好適には、上記のもの等のヒトへのキメラ分子または組成物の投与を含む。治療のためにインビボで使用される場合、キメラ分子または組成物は、本明細書に記載されるように、対象に有効量で投与される。結果は、本明細書に記載の方法の開始時に示される経験的変数に従って確認することができる。
インビトロ方法は、典型的には、試料または抽出物に対する、上記のもの等のキメラ分子または組成物の効果をアッセイすることを含む。いくつかの実施形態において、キメラ分子の有効性は、基質分解に対する影響、すなわち、キメラ分子および組成物が試料中の表現型変化をもたらす能力を評価することによって決定することができる。そのような方法には、限定されないが、免疫組織化学、免疫蛍光、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、またはＲＩＡが含まれる。種々の有用な免疫検出方法の工程は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７．１−２７．２０（１９８６）などの科学文献に記載され、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、具体的には免疫検出方法に関するその教示のために組み込まれる。
イムノアッセイは、それらの最も単純かつ直接的な意味において、抗体と抗原との間の結合を伴う結合アッセイである。多くの種類および形式のイムノアッセイが既知であり、全てが開示されたバイオマーカーの検出に適している。イムノアッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）、免疫ビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、蛍光顕微鏡、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、および光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）である。
一般に、イムノアッセイは、目的となる分子（開示される生体分子）を含有する疑いのある試料を、目的となる分子に対する抗体と接触させるか、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、目的となる分子に対する抗体（開示される生体分子に対する抗体等）を、抗体によって結合することができる分子と接触させることを含む。この点において、当業者は、所与の試料中の特定の生体分子の存在およびまたはレベルを評価することができる。続いて、本願のキメラ分子組成物をアッセイに添加する。その後、本明細書に記載のイムノアッセイを使用して、治療後の表現型効果を決定するために、生体分子のレベル、すなわち、その存在またはレベルを評価することができる。
イムノアッセイは、試料中の目的となる生体分子の量を検出または定量するための方法を含み得、この方法は、一般に、結合プロセス中に形成される任意の免疫複合体の検出または定量を伴う。一般に、免疫複合体形成の検出は当該技術分野で周知であり、多数のアプローチの適用によって達成され得る。これらの方法は、概して、任意の放射性、蛍光性、生物学的もしくは酵素的タグ、または任意の他の既知の標識等の標識またはマーカーの検出に基づく。例えば、各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、具体的には免疫検出方法および標識に関する教示のために組み込まれる、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号を参照されたい。
本願の治療方法は、上述のように、標的指向ドメインに結合したユビキチン領域を保有する。いくつかの実施形態において、標的指向ドメインは、上述の細胞内生体分子に結合する。同様に、本願の治療方法は、標的指向ドメインと基質との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを使用する。いくつかの実施形態において、生体分子は上述の疾患と関連付けられる。
一実施形態において、この方法は複数の試験剤を用いて行われる。
本願の第７の態様は、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法に関する。本方法は、１つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）上記分解ドメインを１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、上記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）上記分解ドメインを上記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、疾患細胞がキメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、試料を複数のキメラ分子と接触させることと、キメラ分子のうちのどれが疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、決定に基づいて、キメラ分子に結合しかつ疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、疾患のバイオマーカーとして同定することとを含む。
本態様において記載されるキメラ分子は、本願の前述の態様に従って行われる。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「生体分子」または「分子」という用語は、対照対象または対照対象集団から採取された同等の試料と比較して、疾患を有する患者から採取された試料中に示差的に存在するポリペプチド（特定の発現レベルのもの）を指す。
本明細書で使用される場合、「リガンド」または「基質」という用語は、タンパク質、分子、キメラ分子、リガンド（二量体）、基質（二量体）、第２の基質、第２のリガンド、標的ドメイン、領域、部分、およびそれらのフラグメント、ユビキチンまたはＥ３モチーフ領域、ドメイン、またはそれらの部分、生体分子、バイオマーカー等に結合し、それらと一過性または安定な複合体を形成し、生物学的目的、例えば、酵素反応のプロセスで酵素と相互作用する基質を供給することができる物質を指す。リガンドはまた、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス力等の分子間力によって標的タンパク質上の部位に結合するシグナル誘発分子を含む。いくつかの実施形態において、基質はリガンドに結合する、および／またはリガンドは基質に結合する。
すべての疾患ではないにしても、多くは複雑で多因子である。例えば、神経変性を考慮する場合、実質的な神経細胞損失は、病理学的提示の前に生じる。神経変性疾患を治療するためのこのような薬物のスクリーニングおよび開発は、症状を改善する補助療法によってさらに妨害される。したがって、標的検出は、事前の治療投与によって曖昧にされ、これは、次いで、疾患の進行を遅くし、治療レジメンをさらに混乱させ得る。このようにして、本願は、表現型スクリーニング分析を用いることによる疾患バイオマーカーの解明のための新しい発明的スクリーニング方法を提供する。例えば、Ｐｒｕｓｓ，Ｒ．Ｍ．，“Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．”ＣＮＳ＆Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，９，６９３−７００（２０１０）を参照のこと。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
表現型スクリーニングは、疾患に罹患している患者からの適切な試料、例えば、細胞のクラス、細胞抽出物、ニューロン、組織等を使用し、試料を本明細書に記載の１つ以上のキメラ分子に供することを伴う。その後、試料は、疾患細胞の生存率、増殖、細胞プロセスおよび／または表現型特徴、例えば、収縮、膜電位の喪失、形態変化等についてスクリーニングされる。画像解析ソフトウェアを使用すると、細胞体または他のオブジェクトが結果を経験的に評価することができる。スクリーニングからのヒットは、生存経路を刺激すること、栄養因子を模倣すること、またはデスシグナル伝達を阻害することによって細胞生存を維持することができる。次いで、標的指向性二次アッセイにおけるより高いコンテンツスクリーニングおよびプロファイリングを使用して、有望なヒットの標的および作用機序を特定することができる。
バイオマーカースクリーニング分析を実行することができる疾患状態の例としては、上記の疾患が挙げられる。いくつかの実施形態において、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法は複数の分子を含み、分子は上述のＥ３モチーフを保有する。いくつかの実施形態において、バイオマーカースクリーニング方法は、上述の標的指向ドメインを保有する分子を含む。本願のスクリーニング方法は、標的指向ドメインと生体分子および／またはリガンドとの間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーを使用する。
キメラ分子が治療指標を提供すると決定されると、バイオマーカーは、標的指向ドメイン領域（またはキメラ分子全体）を使用して単離され、試料からバイオマーカーを免疫沈降させ、これは、その後、当該技術分野で周知の方法を使用して同定される。バイオマーカー単離および精製方法には、限定されないが、例えば、サイズ排除または親和性ベースのカラム樹脂を使用したＨＰＬＣまたはＦＰＬＣクロマトグラフィーが含まれる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
本願のポリペプチドの活性フラグメント、誘導体、または変異体は、例えば、ポリペプチドの特性、二次構造、および生物学的活性に最小限の影響を与えるアミノ酸の欠失または付加によって認識され得る。例えば、ポリペプチドは、タンパク質の細胞下または細胞外局在化を翻訳と同時にまたは翻訳後に方向付けるタンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列に連結され得る。
次いで、バイオマーカーは、当該技術分野で既知の技法を使用して解明され得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの同一性の決定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、質量分析、質量スペクトロスコピー、タンパク質配列決定、抗体相互作用、ウェスタンブロット、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、クロマトグラフィー技術、逆プロテオミクス、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光、またはこれらの任意の組み合わせを使用して行われる。
タンパク質の研究および同定のための好適な質量分析技術としては、レーザー脱離イオン化質量分析およびエレクトロスプレーイオン化質量分析が挙げられる。レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）のカテゴリ内では、マトリックス補助ＬＤＩ（ＭＡＬＤＩ）と表面補助ＬＤＩ（ＳＥＬＤＩ）飛行時間（ＴＯＦ）ＭＳの両方が用いられ得る。ＳＥＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳは、アトモル感度の分析、低豊富タンパク質（ｐｇ−ｎｇ／ｍｌ）の定量化、および高度に再現可能な結果を提供するため、本方法における使用のために特に適している。
本明細書に記載の方法は、例えば、過剰発現基質、生体分子、またはバイオマーカーを伴う疾患または病気の症状を呈する対象を治療するために、例えば臨床環境において好都合に使用することができる、少なくとも１つの試薬、例えば、本明細書に記載のキメラ分子または組成物を含む予めパッケージングされたキットを利用することによって実行することができる。さらに、本願のキメラ分子を発現させることができる任意の細胞型または組織は、本明細書に記載のキットにおける使用のために好適である。
本願の別の態様において、本願のキメラ分子および組成物を使用するためのキットまたは試薬システム。このようなキットは、本明細書に開示される方法に従ってアッセイを行うために必要な特定の要素を含む試薬の組み合わせを含有する。試薬システムは、試薬の適合性が、試験デバイス構成において、またはより典型的には、試験キットとして、すなわち、必要な試薬を保持する１つ以上の容器、デバイス等のパッケージングされた組み合わせを可能にする組成物または混合物として、市販のパッケージングされた形態で提示され、好ましくは、アッセイの実施のための書面による説明書を含む。このキットは、アッセイの任意の構成に適合され得、本明細書に記載の様々なアッセイ形式のいずれかを実行するための組成物を含み得る。
開示される方法に有用な試薬は、溶液中に貯蔵することができるか、または凍結乾燥することができる。凍結乾燥されると、試薬の一部または全ては、溶解後に容易に使用するために、マイクロタイタープレートウェルに容易に貯蔵することができる。当該技術分野で既知の試薬を凍結乾燥させるための任意の方法が、開示される方法に有用な乾燥試薬を調製するために好適であることが企図される。
また、本願の範囲内には、本願のキメラ分子／組成物および第２の薬剤、ならびに使用説明書を含むキットがある。キットは、例えば、限定されないが、血清、血漿、リンパ液、嚢胞性流体、尿、便、脳脊髄液、腹水（ａｃｉｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、または血液を含む任意の体液、および体内組織の生検試料を含む、生物学的試料中、基質の存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生体試料中の基質に結合することができる標的指向ドメインに連結されたＥ３モチーフユビキチン領域から構成される１つ以上のキメラ分子を含むことができる。
以下の実施例は、本願の実施形態を例証するために提供されるが、それらはその範囲を限定することを決して意図するものではない。
以下の実施例は、本願の例示的な実施形態を実証するために含まれる。当業者には、以下の実施例に開示される技法は、本願の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると見なすことができることが理解されるべきである。しかし、当業者は、本願に照らして、本願の技術思想および範囲から逸脱することなく、開示され、依然として同様のまたは類似の結果を得る特定の実施形態において多くの変更が行われ得ることを理解すべきである。
実験方法
プラスミド。本研究で使用されるすべてのプラスミドが、表１に提供される。
（表１）本研究で使用した細菌株（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎ）、細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、およびプラスミド
Figure 2021515582
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大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを、すべてのプラスミドの構築および増殖に使用した。ＰｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰを構築するために、５’Ｋｏｚａｋ配列を導入したプライマーを使用してＥＧＦＰをＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３にライゲーションした。５’Ｋｏｚａｋ配列を導入したプライマーによるオーバーラップエクステンションＰＣＲを使用したＥＲＫ２およびＥＧＦＰの遺伝子アセンブリ、続いて、ｐＣＤＨ１へのライゲーションによって、プラスミドｐＣＤＨ１−ＥＲＫ２−ＥＧＦＰを作製した。５’Ｋｏｚａｋ配列および３’ＳＶ４０ ＮＬＳ配列を付加したプライマーを用いたＥＧＦＰのＰＣＲ増幅、次いでｐｃＤＮＡ３中へのＰＣＲ産物のライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＮＬＳを作製した。５’Ｋｏｚａｋ配列によるＳＨＰ２のＰＣＲ増幅、続いてｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰへのライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＳＨＰ２−ＥＧＦＰを作製した。プラスミドｍＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２ＶからのＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２ＶのＰＣＲ増幅、その後、ｐＣＤＨ１へのＰＣＲ産物のライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖを生成した。
Figure 2021515582
ＧＦＰ指向性ｕＡｂの作製のために、上流Ｋｏｚａｋ、６×Ｈｉｓ、およびＦＬＡＧ配列を導入したプライマーを使用したｐＨＦＴ２−ＧＳ２からのＧＳ２のＰＣＲ増幅（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３−４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、続いてｐｃＤＮＡ３へのライゲーションによって、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＨＦ−ＧＳ２を構築し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が、Ｎ末端融合物を生成するためにＧＳ２の上流で利用可能であるようにした。Ｃ末端融合物については、上流Ｋｏｚａｋ配列ならびに下流ＮｈｅＩおよびＳｂｆＩ制限部位を導入したプライマーを用いてＧＳ２をＰＣＲ増幅することによって、続いて、ｐｃＤＮＡ３へのライゲーションを行って、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＦＨを作製した。ＡｖｒＰｔｏＢ、ＩｐａＨ９．８、ＮｌｅＧ２−３、ＮｌｅＧ５−１、ＮｌｅＬ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳＰＯＰ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、およびＸｏｐＬをコードする遺伝子を、ＮｈｅＩおよびＳｂｆＩ部位を導入するプライマーでＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＦＨ中にライゲーションした。ＬｅｇＡＵ１３、ＬｅｇＵ１、およびＳｉｄＣをコードする遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を導入するプライマーでＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３−ＨＦ−ＧＳ２中にライゲーションした。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＣＨＩＰは、上流ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｏｚａｋ配列ならびに下流ＮｈｅＩ部位を導入したプライマーを使用してｐＨＦＴ２−ＧＳ２からＧＳ２をＰＣＲ増幅し、続いてｓｃＦｖＲ４の代わりにｐｃＤＮＡ３−Ｒ４−ＣＨＩＰΔＴＰＲ中にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＶＨＬ−ＧＳ２およびｐｃＤＮＡ３−βＴｒＣＰ−ＧＳ２は、ＨｉｎｄＩＩおよびＸｈｏＩ（ＶＨＬ）またはＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ（βＴｒＣＰ）部位を導入したプライマーを用いてＶＨＬおよびβＴｒＣＰをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物を、ＮＳｌｍｂの代わりにｐｃＤＮＡ３−ＮＳｌｍｂ−ＧＳ２中にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ０７２２、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ１．４、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ２．５、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ４．５、およびｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ７．８は、ｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の部位特異的変異誘発によって作製した。以下の遺伝子を購入した：ＳｓｐＨ１（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｐａＨ９．８（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＶＨＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｏｈｕ２３２９７Ｄ）、ＬｕｂＸ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬｅｇＵ１（ＩＤＴ）およびＬｅｇＡＵ１３（ＩＤＴ）。他の全ては、実験室在庫中の既存のプラスミドまたはゲノムＤＮＡから増幅した。
プラスミドｐＥＴ２４ｄ−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８およびｐＥＴ２４ｄ−ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲは、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ（ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８）またはＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ（ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲ）部位を導入したプライマーを用いて、全長ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８および切断型ＩｐａＨ９．８ΔＬＲＲをそれぞれＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２４ｄ（＋）にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＧＳ２は、上流ＮｃｏＩ部位ならびに下流ＦＬＡＧ、６×Ｈｉｓ、およびＨｉｎｄＩＩＩ配列を導入したプライマーを使用してｐＨＦＴ２−ＧＳ２からＧＳ２をＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＴｒｉＥｘ−３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａは、ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入したプライマーを用いてｐｃＤＮＡ３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡからＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７ＡをＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＴｒｉＥｘ−３にライゲーションすることによって作製した。プラスミドｐＥＴ２８ａ−ＥＧＦＰは、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを付加するプライマーを用いてＧＦＰをＰＣＲ増幅し、その後、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ａ（＋）中にライゲーションすることによって作製した。すべてのプラスミドを、コーネルバイオテクノロジーリソースセンター（ＢＲＣ）でのＤＮＡ配列決定によって検証した。
細胞株、培養およびトランスフェクション。本研究で使用されるすべての細胞株が、表１に提供される。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞はＡＴＣＣから得、ＨｅＬａ Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰ細胞はＥｌｅｎａ Ｎｉｇｇにより恵与され、ＭＣＦ１０Ａ ｒｔＴＡ細胞はＭａｔｔｈｅｗ Ｐａｓｚｅｋにより恵与された。ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、およびＨｅＬａ Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰ細胞は、１０％ＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩ（ＶＷＲ）および１％ペニシリンストレプトマイシン−アンフォテリシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が補充された４．５ｇ／ＬグルコースおよびＬ−グルタミン（ＶＷＲ）を有するＤＭＥＭ中で培養し、ＭＣＦ−１０ａ細胞は、５％ウマ血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｇ／ｍＬコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）、および１％ペニシリンストレプトマイシン−アンフォテリシン Ｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ １２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。全ての細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、および９０％の相対湿度（ＲＨ）で維持した。
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの高活性バージョンの発現プラスミドであるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ）およびＨｙＰＢａｓｅを使用して、安定したＭＣＦ１０Ａ ｒｔＴＡ細胞株を生成した。ＭＣＦ１０ Ａ ｒｔＴＡ細胞の転位を行って、以下の安定した株を生成した：ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ：ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８、ＭＣＦ１０Ａ ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ：ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ、およびＭＣＦ１０Ａ ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８。２００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、安定した細胞株を選択した。
ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ＥＲＫ２−ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰを発現する安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株をレンチウイルス形質転換によって作製した。具体的には、ｐＬＶ ＩＲＥＳ ｅＧＦＰ、ｐｃＤＨ１ ｅＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ、ｐｃＤＨ １ＥＲＫ２−ＥＧＦＰ、またはｐＨＩＶ−ｄ２ＥＧＦＰを、ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリン酸カルシウムトランスフェクトによってトランスフェクトした。培地を約１６時間後に置き換え、続いてウイルス産生を可能にするために４８時間のインキュベーションを行った。ウイルス上清を除去し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を８μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、続いて、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって細胞デブリを除去した。得られた上清を細胞培地で１：６で希釈し、安定した組み込みのために、事前にプレーティングされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＥＧＦおよびＨＥＫ２９３Ｔ ＥＲＫ２−ＥＧＦＰ細胞株を蛍光活性化細胞選別（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ）によって選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖ細胞株を、１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して選択した。
ウェスタンブロット分析。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、上述のようにトランスフェクトした後、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で溶解した。ＭＣＦ１０Ａ細胞を２０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、０．２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで２４時間誘導した後、細胞溶解緩衝液で溶解した。溶解物を任意のｋＤのポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。α−ＨＩＳ−ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）、α−ＧＦＰ（Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ）およびα−ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を１：５，０００で、ＴＢＳＴ＋１％ミルクに希釈し、室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ結合（Ｐｒｏｍｅｇａ）を有する二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧを１：２，５００で希釈し、必要に応じて使用した。
フローサイトメトリー分析。細胞を１２ウェルプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２で播いた。播種から１６〜２４時間後、ＤＮＡ：ｊｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）比１：２で１μｇの総ＤＮＡを細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞に０．０５μｇの標的、０．２５μｇのユビキボディまたは対照をトランスフェクトし、空のｐｃＤＮＡ３ベクターでバランスを取った。トランスフェクションの４〜６時間後に培養培地を交換した。次いで、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収し、ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒまたはＦＡＣＳＡｒｉａ融合物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析するためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して、１０，０００の事象から決定された幾何平均蛍光によって試料を分析した。
顕微鏡検査。細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で前処理したガラス底１２ウェルプレート上に１０，０００細胞／ｃｍ２で播種した。播種から１６〜２４時間後、ＤＮＡ：ｊｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）比１：２で１μｇの総ＤＮＡを細胞にトランスフェクトした。細胞に０．０５μｇの標的、０．２５μｇのユビキボディまたは対照をトランスフェクトし、空のｐｃＤＮＡ３ベクターでバランスを取った。トランスフェクションの４〜６時間後に培養培地を交換した。次いで、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＥＧＦＲ−ＥＧＦＰ試料について、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清で２時間細胞をブロックした。抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ＃４２６７）をＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清中で１：２００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％正常ヤギ血清中で１：２００に希釈された抗ウサギ−ＡＦ６４７と共に室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。細胞核を、ＰＢＳ中で１：１０，０００で希釈したＨｏｅｓｃｈｔで１０分間染色し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄した。４０倍水中浸漬対物レンズを用いて、試料を反転Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８８焦点／マルチフォトン顕微鏡（ｉ８８０）上で撮像した。画像をＦＩＪＩで分析した。
タンパク質発現および精製。精製タンパク質は、所望のタンパク質をコードするｐＥＴ２８ａベースのプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、またはｐＴｒｉＥｘ−３ベースのプラスミドを含有するＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞を、ルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地２００ｍＬ中で３７℃で増殖させることによって得た。培養密度（Ａｂｓ６００）が０．６〜０．８に達したとき、発現を０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃で６時間成長を続けさせた。培養物を４℃で３０分間、４，０００×ｇで遠心分離することによって回収した。細胞ペレットを−２０℃で一晩保存した。解凍したペレットを１０ｍＬ平衡緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾール）中に再懸濁し、高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｅｍｕｌｓｉ−Ｆｌｅｘ Ｃ５）で溶解した。不溶性画分を、４℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離することによって除去した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、５００μＬのＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して重力流によって精製した。可溶性画分を樹脂に通し、その後、樹脂を３ｍＬの洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、および５０ｍＭのイミダゾール）で洗浄した。タンパク質を１．５ｍＬの溶出緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、および２５０ｍＭのイミダゾール）で溶出した。精製画分を脱塩し、濃縮した（Ｐｉｅｒｃｅ ＰＥＳタンパク質濃縮器）。
ＥＬＩＳＡ。９６ウェル酵素イムノアッセイプレートを、０．０５ＭのＮａＣＯ３緩衝液（ｐＨ ９．６）中、１０μｇ／ｍＬのＥＧＦＰ １００μＬで、４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをウェル当たり２００μＬのＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、ウェル当たり２５０μＬの３％ミルクを含むＰＢＳで、室温で３時間ブロックし、ゆっくりと混合した。プレートをさらに３回洗浄し、ウェル当たり６０μＬのブロッキング緩衝液中の精製タンパク質の連続希釈物の添加を行った。プレートを室温でインキュベートし、１時間ゆっくりと混合した。プレートを３回洗浄して、結合していないタンパク質を除去し、次いで、ＰＢＳＴ＋１％ミルク中で１：１０，０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ＦＬＡＧ（ＤＤＤＹＫ）抗体（５０μＬ／ウェル）とともに１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄してから、５０μＬ／ウェルのワンステップウルトラＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。反応物をゆっくりと混合しながらインキュベートし、次いで、５０μＬ／ウェルの３ＮＨ２ＳＯ４でクエンチした。次いで、クエンチしたプレートを４５０ｎｍで読み取った。
カチオン性ポリペプチドの合成および特徴付け。Ｎ４（ＴＥＰ）ポリアミンを、Ｕｃｈｉｄａおよび共同研究者らの修正された手順に従って、最近記載された本群の研究者として合成した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９−１２（２０１７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｒｅｐｅａｔｓ ｉｎ Ｎ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｍｉｄｅｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６（３５）：１２３９６−４０５（２０１４）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（Ｓｉｇｍａ）（２ｍＬ）中のポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸塩）の冷却溶液に、ＮＭＰで２倍に希釈した５０当量のテトラエチレンペンタミン（Ｓｉｇｍａ）を撹拌しながら滴下した。０℃で２時間撹拌した後、ｐＨを冷却６Ｎ ＨＣｌを撹拌しながら滴下添加して１に調節した。得られた溶液を、再生セルロース膜バッグ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１ｋＤａ ＭＷＣＯ）から０．０１Ｎ ＨＣｌに対して、続いて蒸留水に対して透析し、凍結乾燥させて白色の粉末を得た。本研究で使用したポリアミンを、２５℃でＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を用いて、重水素酸化物中の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって特徴付けた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ４．７２（ｓ，１Ｈ），３．６４−３．３９（ｍ，９Ｈ），３．３７−３．０５（ｍ，５Ｈ），３．００−２．６２（ｍ，４Ｈ）。
インビトロ転写によるｍＲＮＡの調製。ｕＡｂをコードするｃＤＮＡは、ＧＦＰフラグメントをＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位に置き換えることによってｐＧＥＭ４Ｚ／ＧＦＰ／Ａ６４にクローニングした。加えて、ヒトα−グロビン３’ＵＴＲ配列を、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩを使用してｃＤＮＡとポリＡテールとの間に配置してｍＲＮＡ翻訳を改善した。ＳｐｅＩによる直線化、続いてＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７高収率ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ）によるインビトロ転写（ＩＶＴ）により、６４ヌクレオチドのベクター由来配列、コード配列、α−グロビン３’ＵＴＲ、および６４Ａ残基を含有する転写産物を得た。典型的な２０μｌ反応において、以下のヌクレオチドを調製した：ＡＴＰ（１０ｍＭ）、プソイド−ＵＴＰ（１０ｍＭ）、メチル−ＣＴＰ（１０ｍＭ）、ＧＴＰ（２ｍＭ）、抗逆方向Ｃａｐ類似体（８ｍＭ，ＮＥＢ）。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。１％アガロースゲルに供することによってＲＮＡの品質を確認した。濃度は、Ａｂｓ２６０によって決定した。
ナノプレックストランスフェクション。ポリアミンを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた。９６ウェルプレートの各ウェルについて、５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で希釈した２００ｎｇ ｍＲＮＡを、５μｌのＰＡＢＰを含有するＯｐｔｉＭＥＭ（ｍＲＮＡ：ＰＡＢＰ重量比＝１：５）と室温で１０分間混合した。その後、５μＬのＯｐｔｉＭＥＭ含有ポリアミンを添加し、室温で１５分間インキュベートした後、ＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクションし、ｄ２ＥＧＦＰを安定的に発現させた。ポリアミンを調整して、トランスフェクションのための５０対１（Ｎ／Ｐ）比を達成した。ＥＧＦＰ発現を、トランスフェクション後の異なる時点でＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって測定した。
動物実験。マウスの管理および実験手順は、確立された施設ガイドラインおよびＭＩＴ学科（ＭＩＴ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の比較医学部門から承認されたプロトコルに従って、病原体のない条件下で実施した。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０Ｓｃｈａ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。８〜１０週齢のマウスに、２５μｌの体積のＯｐｔｉＭＥＭ中、Ｎ４（ＴＥＰ）ポリアミンとともにパッケージングされた５μｇのｍＲＮＡおよび２５μｇのＰＡＢＰを、麻酔下で耳に皮下注射した。蛍光撮像は、軽量標本箱（Ｘｅｎｏｇｅｎ）に取り付けられたＣＣＤカメラを用いて行った。曝露時間は１秒であった。シグナルのイメージングおよび定量化は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ取得および分析ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）によって制御された。
実施例１−操作されたＩｐａＨ９．８は、哺乳動物細胞においてＧＦＰを潜在的にサイレンシングする。
非天然標的のサイレンシングのために病原性細菌由来のＥ３ユビキチンリガーゼ模倣物を再設計することができるかどうかを決定するために、これまでの細菌において見出されたＥ３の主要クラスを表す１４種の候補酵素のパネルに焦点を当てた（以下、表２）。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５−９６（２０１７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（表２）本研究で評価した細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼ
Figure 2021515582
１表２に列挙される参照文献は、各Ｅ３ユビキチンリガーゼの触媒ドメインの明確な証明または注釈を提供する。
表２中の略語：ＮＥＬ、新規Ｅ３リガーゼ；ＨＥＣＴ、Ｅ６ＡＰ Ｃ末端に相同；ＳＣＦ、Ｓｋｐ１／Ｃｄｃ５３またはＣｕｌｌｅｎ−１／Ｆボックスタンパク質；ＳＰＯＰ、スペックル型ＰＯＺタンパク質；ＶＨＬ、フォンヒッペル・リンダウ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ）；ＥＣＶ、Ｅｌｏｎｇｉｎ Ｂ／Ｃ、Ｃｕｌｌｅｎ−２、ＶＨＬ
Figure 2021515582
Figure 2021515582
このパネルには、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型またはＵボックス（ＲＩＮＧ／Ｕボックス）型、およびＦボックスドメイン等の真核生物Ｅ３に類似した折り畳みを有するＥ３模倣物、ならびに新規のＥ３リガーゼ（ＮＥＬ）、ＸＬボックス含有、およびＳｉｄＣ等の任意の他の真核生物Ｅ３とは異なる折り畳みを有する非従来的なＥ３が含まれた。一般に、ｕＡｂは、各Ｅ３模倣物から天然基質結合ドメインを除去することと、それをヒトＣＨＩＰに基づいて以前に設計されたｕＡｂと同様の合成結合タンパク質（図１Ａ）で置き換えることによって操作された。Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４−５５（２０１４）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｓ．フレックスネリＩｐａＨ９．８は、ＮＦ−κＢ必須調節物質（ＮＥＭＯ）等の天然基質タンパク質への結合および特異性を媒介する８つの２０残基のロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）を有するＮ末端ドメイン（Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ＩｐａＨ９．８ Ｔａｒｇｅｔｓ ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇａｍｍａ ｔｏ Ｄａｍｐｅｎ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ ＮＦ−ＫａｐＰａｂ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１）：６６−７３，ｓｕｐ．ｐｐ．１−９（２０１０）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびグアニル酸結合タンパク質（ＧＢＰ）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＢＰｓ ｂｙ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ｈｏｓｔ Ｄｅｆｅｎｃｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ５５１（７６８０）：３７８−８３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）からなり、一方、Ｃ末端ドメインは新規のＥ３ユビキチンリガーゼアーキテクチャを採用する。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５（１２）：１３０２−０８（２００８）およびＳｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｗｉｔｈ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９（１）：ｅ１００３１２１（２０１３）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ＩｐａＨ９．８のＮ末端ＬＲＲドメインを、ＧＦＰにナノモルの親和性（Ｋｄ＝３１ｎＭ）で結合するＦＮ３モノボディであるＧＳ２に置き換えた。Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３−４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素の天然基質認識機能をＧＳ２モノボディと交換することにより、ＧＦＰを標的とし、そのプロテアソーム分解を促進すると仮定した合成Ｅ３リガーゼを作製した。この仮説を試験するために、異なるＧＳ２−Ｅ３キメラを哺乳動物細胞において増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）と共に一過性に共発現させ、蛍光活性をフローサイトメトリー分析によってモニタリングした。これまでに、ＥＧＦＰの最も顕著な枯渇は、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８で達成され、これは、ＥＧＦＰの蛍光をほぼバックグラウンドレベルに低下させた（図１Ｂおよび図６Ａ〜６Ｂ）。ここで試験した条件下で、他の全てのｕＡｂは比較的弱いサイレンシング活性を示した。ＧＳ２−ＮｌｅＧ５−１、ＧＳ２−ＳｓｐＨ１、ＳｉｄＣ−ＧＳ２、およびＧＳ２−ＳｏｐＡがこれらの中で最も活性であり、ＥＧＦＰ蛍光を約２０〜４０％低減させた（図１Ｂおよび図６Ａ〜６Ｂ）。
この堅牢なサイレンシング活動に照らして、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８に注目を向けた。このキメラを発現する細胞において、ＥＧＦＰの除去は効率的であり、最大９０％の蛍光活性を除去し（図２Ａおよび２Ｂ）、細胞溶解物中に検出可能なＥＧＦＰタンパク質はなかった（図２Ｃ）。重要なことに、ＩｐａＨ９．８の触媒システイン（Ｒｏｈｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ ａｒｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １（１）：７７−８３（２００７）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をアラニンに変異させ（ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ）たとき、およびＡｂｌＳＨ２ドメインに特異的である非同種のＦＮ３モノボディＡＳ１５（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ａ Ｂｉｎａｒｙ−Ｃｏｄｅ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４（１６）：６６３２−３７（２００７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）でＧＳ２を置換したときに、サイレンシング活性が完全に無効にされ（図２Ａ〜２Ｃ）、これは、標的分解が両方のｕＡｂドメインの協同作用に依存していたことを示した。ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａの場合、哺乳動物細胞における発現およびインビトロでのＥＧＦＰ結合活性はアラニン置換の影響を受けず（図７Ａ〜７Ｂ）、サイレンシング活性の喪失が、触媒不活性化に起因していたことを確認した。また、切断されていない全長ＩｐａＨ９．８へのＧＳ２の直接融合が、測定可能なサイレンシング活性をもたらさなかったことから、ＬＲＲドメインの除去はノックダウン活性に不可欠であったことに留意するべきである。興味深いことに、Ｓ．フレックスネリ株のゲノム配列は、いくつかのＩｐａＨファミリーメンバー、すなわち、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、およびＩｐａＨ９．８が、２２０−ｋｂの毒性プラスミドｐＷＲ１００上にコードされている一方で、７つの追加のｉｐａＨ同族遺伝子が染色体上に存在することを示す。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらのファミリーメンバーが、ｕＡｂの文脈におけるＥＧＦＰの分解についてＩｐａＨ９．８と同様に優れていたかどうかを判断するために、ＧＳ２と、ｐＷＲ１００にコードされたＩｐａＨファミリーメンバーの各々に由来する、ならびに染色体にコードされた1メンバー、ＩｐａＨ０７２２に由来する触媒ドメインとの間でキメラを生成した。培養細胞において異所的に発現させた場合、全てのＩｐａＨベースのｕＡｂは、哺乳動物細胞において効率的な（約９０％以上）ＥＧＦＰノックダウンが可能であった（図２Ｄ）。この結果は、異なる触媒ドメインによって共有される高い相同性を考慮すると、必ずしも驚くべきものではなかった。実際、異なるＩｐａＨファミリーメンバーは、ＩｐａＨ９．８と全体では約７０％しか類似していなかったが、触媒ドメインでは、はるかに類似しており（＞９９％）、１〜３個のアミノ酸置換だけ、ならびにＩｐａＨ１．４およびＩｐａＨ４．５の場合、わずかなＣ末端の切断だけであった（表２）。
本発明の操作細菌リガーゼの効力をベンチマークするために、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８によって触媒されるＧＦＰサイレンシング活性を、標的タンパク質分解のために以前に再構成された真核Ｅ３機構に基づく他の合成リガーゼのものと比較した。Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ６（３）：７５１−５６（２０００）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００（２４）：１４１２７−３２（２００３）；Ｈａｔａｋｅｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ−Ｍｙｃ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１７）：７８７４−７９（２００５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＫＲＡＳ ｂｙ ａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１２（３）：２８６−９４（２０１３）；Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇｌｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＥｒｂＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ，”Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３３（８）：９８６−９５（２０１４）；Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７−２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）；ａｎｄ Ｋａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、ヒト由来のいくつかの真核生物Ｅ３ユビキチンリガーゼの天然基質結合ドメイン（Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質（ＣＨＩＰ）、スペックル型ＰＯＺタンパク質（ＳＰＯＰ）、βトランスデューシング（Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）リピート含有タンパク質（βＴｒＣＰ）、およびフォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ）のカルボキシル末端を含む）、ならびにキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）過剰肢（Ｓｌｍｂ）タンパク質を、ＧＳ２モノボディで置き換え、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８に類似した合成リガーゼのパネルを得た。得られたＧＦＰ特異的ｕＡｂのパネルが哺乳動物細胞においてＥＧＦＰと一過性に共発現したとき、全てが、ある程度ＥＧＦＰレベルを低下させることができたが、ここで試験した条件下では、それぞれのサイレンシング活性は比較的非効率的であり（約２５〜４５％）（図１Ｃおよび図６Ａ〜６Ｂ）、未融合ＧＦＰレベルを低下させることにおいて同様に無効であったＳｌｍｂ−ナノボディキメラを用いた以前の結果を連想させる。Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７−２１（２０１１）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｌｍｂ−ＧＳ２についてここで観察された弱いＥＧＦＰノックダウンは、実際には、Ｓｌｍｂと、未融合ＧＦＰの分解を促進することができなかったＧＦＰ特異的ＶＨＨナノボディｃＡｂＧＦＰ４との間のキメラで得られた以前の結果と比較して改善された。Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７−２１（２０１１）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかし、Ｓｌｍｂ−ｃＡｂＧＦＰ４融合物は、より大きなＧＦＰ融合タンパク質に関連する蛍光を排除し、本明細書に報告されるデータが必ずしもｕＡｂ機能障害を示すとは限らないが、代わりに、基質選好性／適合性またはユビキチン装飾の程度の違いを反映し得ることを示唆することに留意されたい。それにもかかわらず、真核生物Ｅ３を伴う操作キメラのいずれもが、細胞蛍光の９０〜９５％を再現可能に分解したＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の有効性および頑健性を示さなかった。
実施例２−広範囲の基質タンパク質が、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８によって分解される。
基質適合性の問題をより深く探究するために、様々な範囲の基質を分解するＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の能力を試験した。多数のＧＦＰ由来蛍光タンパク質（ＦＰ）が、長年にわたって開発および最適化され、生物学的イメージングのための新しいツールの多様なコレクションを提供している。Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．，“Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９−４４（１９９８）ａｎｄ Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｏｏｓｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２（１２）：９０５−０９（２００５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。異なるＦＰ標的がどの程度分解され得るかを決定するために、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８を、エメラルド、ビーナス、およびセルリアンの単量体バージョン、ならびに強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）とともに哺乳動物細胞において一過性に共発現させた。ＦＰの各々に関連する細胞蛍光活性のおよそ６５〜８５％がＧＳ２−ＩｐａＨ９．８によって除去されたが、構造的に無関係なｍＣｈｅｒｒｙタンパク質はＧＳ２−ＩｐａＨ９．８によって標的とされず、ＧＦＰの折り畳みに対するＧＳ２の特異性を与えたことが予想された（図８Ａ）。興味深いことに、急速な折り畳みおよび堅牢に安定なＥＧＦＰの変異体であるスーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）の蛍光活性は、ｓｆＧＦＰがプロテアソーム分解に耐性であるという最近の発見と一致して、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の影響を受けなかった。Ｋｈｍｅｌｉｎｓｋｉｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ Ｔａｎｄｅｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｉｍｅｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ２７（２）：３６０−７０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
異なるＦＰを分解するＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の能力による後押しを受けて、次に、構造的に多様な、ＦＰタグ付き基質タンパク質を分解するＧＳ２−ＩｐａＨ９．８の能力を評価した。ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８は、それらの分子量（２７〜１７９ｋＤａ）および細胞下局在（すなわち、細胞質、核、膜結合、および膜貫通）に関して変化した１５種の独自の標的タンパク質をうまく分解した（図３Ａおよび図８Ｂ）。例えば、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８は、フローサイトメトリー分析によって決定されるように、細胞質タンパク質α−アクチニン、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）、細胞外シグナル制御キナーゼ２（ＥＲＫ２）、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）、Ｆ−トラクチン、パキシリン（ＰＸＮ）、およびビンキュリン（ＶＣＬ）を含むＦＰ融合物に関連する蛍光活性の８０〜９２％の分解を誘発した（図３Ａおよび図８Ｂ）。同様に、ヒストンＨ２Ｂ、およびＳＶ４０ＬａｒｇｅＴ抗原に由来する核局在化シグナル（ＮＬＳ）を伴う、核標的ＦＰ融合物；発癌性Ｇ１２Ｖ変異を有するＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲａｓＧ１２Ｖ）、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、およびＨＲａｓに由来するファルネシル配列を伴う、膜結合ＦＰ融合物；ならびに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、トリ赤血球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２（ＥｒｂＢ２）、およびムチン１（ＭＵＣ１）を伴う、膜貫通ＦＰ融合物についても同様に堅牢なサイレンシングが観察された（図３Ａおよび図８Ｂ）。代表的な基質タンパク質α−アクチニン−ｍＥｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ−ＮＬＳ、ファルネシル−ｍＥｍｅｒａｌｄ、およびＥＧＦＲ−ｍＥｍｅｒａｌｄの顕微鏡分析により、各融合物の予想細胞下局在化が確認され、フローサイトメトリー分析によって測定された効率的な分解活性が裏付けられた（図３Ｂ）。膜貫通タンパク質ＥＧＦＲ−ｍＥｍｅｒａｌｄを、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的な抗体でイムノラベリングすることによって検査した。重要なことに、α−ＥＧＦＲシグナルは、ＧＦＰ消失と同時に減少し（図３Ｂ）、膜貫通タンパク質全体の分解が達成されたことを示す。まとめると、これらの結果により、いくつかの異なる細胞下位置にまたがる広範囲の基質をサイレンシングすることができる堅牢なプロテオーム編集ツールとしてのＧＳ２−ＩｐａＨ９．８が確証される。
実施例３−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８媒介性プロテオーム編集は、フレキシブルであり、モジュラー性である。
ＵＡｂの魅力的な特徴は、それらの高度なモジュラーアーキテクチャであり、Ｅ３触媒ドメインおよび合成結合タンパク質ドメインは、活性および特異性を再プログラムするために交換することができる。実際、上記の結果は、異なる細菌および真核Ｅ３ドメインをキメラ化して機能性ｕＡｂを形成することができる容易さを明らかにした。ＩｐａＨ９．８ベースのｕＡｂにおける合成結合タンパク質ドメインの互換性を調査するために、ＧＳ２をまず、ＦＮ３モノボディＧＳ５（Ｋｄ＝６２ｎＭ）（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３−４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）またはｃＡｂＧＦＰ４（Ｋｄ＝０．３２ｎＭ）（Ｓａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＶＨＨ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｔｏ Ｇｒａｆｔ Ｎｏｎ−Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｌｏｏｐｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２（３）：５９７−６０７（２００５）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）等の他の高親和性ＧＦＰ結合タンパク質と置き換えた。これらの構築物について、ＧＳ２モノボディに見られるものに匹敵する効率的なＥＧＦＰサイレンシング活性が観察された（図９Ａ）。興味深いことに、より低い親和性（約２００〜５００ｎＭ）のＦＮ３モノボディの導入（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｅａｃｈｉｎｇ ａｎ Ｏｌｄ Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎｅｗ Ｔｒｉｃｋｓ：Ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｕｓｉｎｇ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＦＮ３ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１５（２）：３９３−４０５（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、効率的ではないＥＧＦＰ排除をもたらし（図９Ａ）、サイレンシング活性が標的タンパク質に対する親和性の関数であり得ることを示唆している。しかし、空間配置および表面相補性は、ユビキチン化のためのリジン部位を優先するため（Ｂｕｅｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（１０）：６２６−４２（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これらの所見のための同様に合理的な説明としては、様々なＦＮ３ドメインは、基質がユビキチン化される様式に影響を及ぼすように、ＧＦＰに関してｕＡｂを差異的に指向させ得るというものである。
次に、ＩｐａＨ９．８触媒ドメインと２つの異なるＦＮ３モノボディとの適合性を調査した：ＳＨＰ２のＳｒｃ相同２（ＳＨ２）ドメインに特異的なＮＳａ５（Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＣＲ−ＡＢＬ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｕｓｉｎｇ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｎｏｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ＳＨＰ２ ＳＨ２ Ｄｏｍａｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０（３７）：１４９２４−２９（２０１３）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）および、それぞれＨＲａｓ、ＫＲａｓ、およびそれらのＧ１２Ｖ変異体に特異的なＲａｓＩｎＩＩ（Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２−５７３（２０１７）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。得られたＮＳａ５−ＩｐａＨ９．８およびＲａｓＩｎＩＩ−ＩｐａＨ９．８キメラを、フローサイトメトリー分析によって、ＳＨＰ２−ＥＧＦＰおよびＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖをそれぞれサイレンシングする能力について試験した。どちらも強力なサイレンシング活性を示し、ＧＦＰ指向性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８とほぼ同等の効率でそれらのＥＧＦＰタグ標的を分解した（図４Ａおよび４Ｂ）。興味深いことに、ＲａｓＩｎＩＩ−ＩｐａＨ９．８は、野生型ＲａｓアイソフォームよりもＧ１２Ｖ変異体に対するその選択性に沿って、ＥＧＦＰ−ＫＲａｓＧ１２Ｃおよび他のＫＲａｓ変異体（例えば、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ）をＥＧＦＰ−ＫＲａｓ（図４Ｃ）よりも効率的に分解し（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｅｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲａｓＩｎｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５６２−５７３（２０１７））、それにより、Ｒａｓの変異体選択的サイレンシングのための潜在的な経路が提供される。まとめて、これらの結果は、ＩｐａＨ９．８に対する顕著な柔軟性を明らかにし、一過性かつ安定的にトランスフェクトされた細胞株における多様な標的タンパク質の「全てに適合する」分解性物質（ｄｅｇｒａｄｅｒ）としてのその使用を可能にする。
上記の全ての実験において、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８およびその対応する標的を一過性に発現させたときに、効率的なノックダウンが達成された。しかしながら、実験的な時間尺度、正確な発現プロファイルの必要性、または不応性哺乳動物細胞株の使用のために、一過性発現は必ずしも選択肢ではない。したがって、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８媒介サイレンシングのフレキシビリティを実証するために、分解活性を、安定的に組み込まれた導入遺伝子として発現された標的タンパク質に対して評価した。具体的には、ＥＧＦＰを安定して共発現させた細胞においてＧＳ２−ＩｐａＨ９．８を一過性に発現させた場合、蛍光活性の低下は、ＥＧＦＰを一過性に発現させた場合に観察されたものと実質的に同一であった（図９Ｂ）。ＥＲＫ２−ＥＧＦＰ、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰ、およびＥＧＦＰ−ＨＲａｓＧ１２Ｖについても、それらの発現様式にかかわらず、堅牢な分解が観察された（図９Ｂ）。ｕＡｂおよび標的の両方が安定した導入遺伝子として発現し、それによってトランスフェクションの必要性を完全に排除したとき、強力なサイレンシング活性は、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８について再び観察されたが、その不活性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ対応物については観察されなかった（図９Ｃ）。
実施例４−ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８をコードするｍＲＮＡの送達は、マウスにおけるプロテオーム編集を可能にする。
治療の観点から、ｕＡｂ等のタンパク質ベースの技術に直面する最大の課題の１つは、細胞内送達である。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０−１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本群の研究者らは、ポリＡテール、ＰＡＢＰ、および生体適合性カチオン性ポリペプチド（図５Ａ）を含有する合成ｍＲＮＡからなる共アセンブルしたナノプレックスが、インビトロおよびマウスにおけるｍＲＮＡ発現を大幅に向上させたことを以前に示した。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９−１２（２０１７）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスの哺乳動物細胞への送達は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における同じポリアミンによるｍＲＮＡトランスフェクション単独と比較して有意に大きなｕＡｂ発現をもたらし、それによって強力なタンパク質分解をもたらすと仮定した。この仮説を試験するために、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス送達を、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において安定導入遺伝子として発現された不安定化ＧＦＰ変異体であるｄ２ＥＧＦＰの分解を定量化することによってインビトロで評価した。予想通り、カチオン性ナノプレックスが活性標的特異的ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡおよびＰＡＢＰを含有した場合にのみ、堅牢なｄ２ＥＧＦＰ分解が達成された（図５Ｂ）。触媒不活性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス、非特異的ＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８ナノプレックス、およびＰＡＢＰなしで送達された裸のＧＳ２−ＩｐａＨ ９．８ ｍＲＮＡを含む全ての他の対照は、ほとんどまたは全くサイレンシング活性を示さなかった（図５Ｂ）。処理後２４時間で、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスを受けたＨＥＫ２９３Ｔｄ２ＥＧＦＰ細胞は、蛍光活性の８５％の減少を示し、これは、上述のＤＮＡトランスフェクション後に達成されたノックダウン活性と直接的に同等であった。
これらの結果による後押しを受けて、次に、インビボでのｕＡｂナノプレックス媒介送達およびサイレンシング活性を評価した。全ての組織においてＥＧＦＰを構成的に発現するトランスジェニックＵＢＩ−ＧＦＰ／ＢＬ６マウス（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＤ８＋ Ｔ−Ｃｅｌｌ／ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１４（２）：１１０−２２（２００１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の耳内に、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックスの皮下注射を与えた。このマウス系統は、ＥＧＦＰを普遍的に発現するが、蛍光は、毛で覆われた領域においては吸収され、検出されないことに留意されたい。注射後２４時間における蛍光撮像は、ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８ ｍＲＮＡ／ＰＡＢＰナノプレックス注射を受けた左耳のＥＧＦＰ蛍光が、耳蛍光の７０％の低下で強力に除去されたことを明らかにした（図５Ｃおよび５Ｄ）。対照的に、触媒不活性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８Ｃ３３７Ａまたは非特異的ＡＳ１５−ＩｐａＨ９．８ナノプレックス注射のいずれかを受けた右耳の蛍光は影響を受けなかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。重要なことに、これらの結果は、癌および他のヒト疾患における異常発現タンパク質を翻訳後にサイレンシングするための実行可能な戦略として、ｕＡｂの治療的送達のステージを設定した。
実施例５−実施例１〜４の考察
ユビキボディは、体細胞内の、そうでなければ安定しているタンパク質の選択的除去を可能にする比較的新しいプロテオーム編集モダリティであり（Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４−５５（２０１４）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、基礎研究、薬物の発見、および治療における潜在的な用途を有する。本研究では、細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼを特徴とする新しいクラスのｕＡｂを作製し、それによって、ｕＡｂの開発のための、これまで利用されていないユビキチン化活性源への扉を開いた。具体的には、宿主細胞Ｅ３リガーゼを模倣してユビキチン化経路を利用する、発展しているクラスのエフェクタータンパク質に属する１４種の細菌性Ｅ３リガーゼを評価した。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５−９６（２０１７）、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの中で最も顕著なのは、Ｓ．フレックスネリ由来のＩｐａＨ９．８であり、これは、遺伝子融合合成結合ドメインを介して標的基質に向けられたときに、タンパク質のターンオーバーの顕著な触媒であることが証明された。このサイレンシング活性は、基質の細胞下局在（すなわち、細胞質、核、形質膜）または発現様式（すなわち、一過性対安定）とは独立していることが見出された。同等に機能した他のＥ３リガーゼは、Ｓ．フレックスネリのｐＷＲ１００毒性プラスミド上または染色体上のいずれかに見られるＩｐａＨ９．８のホモログのみであった。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの酵素のＮ末端触媒ＮＥＬドメインは、顕著な相同性（９９〜１００％）を共有し、これは、ｕＡｂの文脈におけるそれらの類似の性能を説明する。したがって、次に機能する最良の細菌性Ｅ３ユビキチンリガーゼは、Ｓ．ティフィムリウムＳｓｐＨ１であり、これもまた、ＮＥＬドメイン内のＩｐａＨ９．８全体に対する３８％の同一性および４２％の同一性を有するＮＥＬ型酵素である。Ｎｏｒｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ−Ｓｐａｎｎｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＬＰＸ−Ｍｏｔｉｆ Ｈａｒｂｏｕｒｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０（１１）：ｅ１２９４５（２０１８）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、ここで試験した条件下で、ＥＧＦＰレベルを６０％未満に低下させることができた哺乳動物Ｅ３ユビキチンリガーゼはなかったことにも注目されたい。その理由は完全には明確ではないが、これらの異なるＥ３リガーゼについて以前にｕＡｂフォーマットで報告された成功したノックダウン結果を考えると（Ｐｏｒｔｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｂｉｑｕｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ Ｅｎｄｏｗｅｄ Ｗｉｔｈ Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（１１）：７８４４−５５（２０１４）；Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｎｔｉ−ＧＦＰ Ｎａｎｏｂｏｄｙ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（１）：１１７−２１（２０１１）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｏｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．７（５）：１７００６６（２０１７）；Ｆｕｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｓｓｉｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，”Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ６（１０）：１６０２５５（２０１６）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｂｏｄｙ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｅ３−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｄｅｇｒａｄｅｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４２６９（２０１５）、およびＫａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ，”Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２９７４４（２０１７）、それらの全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、ＥＧＦＰが、これらの操作されたキメラにとっての不良な基質を意味し得ることが疑われる。
ここでの作業は、主にＦＰおよびＦＰタグ付き基質のサイレンシングに焦点を当てたが、ＨＲａｓを含む疾患関連標的を強力に分解したＩｐａＨ９．８ベースのｕＡｂが設計され、これは、ＫＲａｓおよびＮＲａｓと共に、癌において最も一般的に変異した癌タンパク質、ならびにＲａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路の調節因子であるＳＨＰ２を含む。重要なことに、これらの臨床的に重要な標的を他の全てのＦＰ融合物と一緒に枯渇させる能力は、ｕＡｂ技術の驚くべきモジュラリティを強調する役割を果たす。Ｅ３ユビキチンリガーゼの天然基質結合ドメインを単純に交換することで、異なる基質タンパク質に対する特異性を有するオーダーメイドｕＡｂを生成することができる。興味深いことに、シゲラは、感染中に宿主防御を破壊するための同様の戦略を進化させ、それによって、プラスミドおよび染色体にコードされたＩｐａＨタンパク質は、ＮＦ−κＢ関連タンパク質のプロテアソーム分解を媒介することによって宿主の炎症応答を抑制する上で重要な役割を果たす。Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ＩｐａＨ９．８ Ｔａｒｇｅｔｓ ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇａｍｍａ ｔｏ Ｄａｍｐｅｎ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ ＮＦ−ＫａｐＰａｂ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，”Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（１）：６６−７３，ｓｕｐ．ｐｐ．１−９（２０１０）ａｎｄ Ａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、約５０％の類似性のみを共有する異なるＬＲＲドメインを用いることによって（Ｎｏｒｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ−Ｓｐａｎｎｉｎｇ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＬＰＸ−Ｍｏｔｉｆ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ｅ１２９４５（２０１８）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、シゲラは、実質的に同一の触媒ＮＥＬドメインを、宿主タンパク質のアレイに再方向付けすることができる（例えば、ＩｐａＨ９．８についてはＮＥＭＯ、Ｕ２ＡＦ５３；ＩｐａＨ７．８についてはグロムリン；ＩｐａＨ４．５についてはｐ６５；ＩｐａＨ２．５およびＩｐａＨ１．４についてはＨＯＩＰ；ＩｐａＨ０７２２についてはＴＲＡＦ２）。Ｍａｃｕｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｈｏｓｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ：Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｓ Ｗｅａｐｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２６（４）：４９９−５１０（２０１６）；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１３０（１２）：１９８５−９６（２０１７）；およびＡｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＩｐａＨ Ｆａｍｉｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１００（２０１５）、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの構造的に多様な基質をユビキチン化するために必要な固有の立体構造上のフレキシビリティは、カスタマイズ可能な標的分解に対するＮＥＬモチーフの顕著な能力を説明するために役立つと考えられる。また、ここでの作業は、以前に確認されたＥ３ユビキチンリガーゼを活用したが、新規のＥ３リガーゼを同定するためのＧＳ２ベースのｕＡｂを作製するために類似のスワッピング戦略を使用することができることも注目されるべきである。このようなアプローチは、Ｅ３リガーゼの体系的な同定を可能にし得るものであり、ヒトゲノムが６００を超える推定Ｅ３リガーゼをコードすること（Ｍｅｔｚｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＨＥＣＴ ａｎｄ ＲＩＮＧ Ｆｉｎｇｅｒ Ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｔ ａ Ｇｌａｎｃｅ，”Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２５（Ｐｔ ３）：５３１−３７（２０１２）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、および細菌ゲノムが他の数百個をコードする可能性が高く、これらの多くがユビキチン転移の触媒として検証されるべきものとして残っていることを考慮すると、これは重要な目標である。
薬剤開発の観点から、遺伝子産物の薬理学的制御は、従来、小分子が密接に結合している明確に定義された疎水性ポケットを有する酵素および受容体を標的とする小分子阻害剤を使用して達成されてきた。残念ながら、ヒトプロテオームの大部分（約８０〜８５％）は、薬理学的に阻害され得ず、したがって「新薬の開発につながらない」と見なされている転写因子、骨格タンパク質、および非酵素タンパク質等の扱いにくい標的から構成される。Ｃｒｅｗｓ，Ｃ．Ｍ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ：Ｔｈｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ Ｍｙ Ｄｒｅａｍｓ，”Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１７（６）：５５１−５５（２０１０）ａｎｄ Ａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ Ｔｏｗａｒｄｓ Ｔｈｅ Ｄｒｅａｍ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．３（４）：３０１−１７（２００４）に記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。代替として、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルでタンパク質をサイレンシングするためのいくつかの技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、およびＺＦＮが現在利用可能であり、第１のＲＮＡｉ療法であるパチスランは、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスについて２０１８年に承認を得ている。Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｔｉｓｉｒａｎ，Ａｎ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ，Ｆｏｒ Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，”Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７９（１）：１１−２１（２０１８）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、タンパク質サイレンシングに対する時間的および翻訳後制御を提供するｕＡｂおよび関連するＰＲＯＴＡＣ技術等の新しい適応可能な技術は、特に、不可逆性、時間的制御の欠如、およびオフターゲット効果等の核酸標的指向化ベースのアプローチに関連するいくつかの制限を克服する可能性があるため、望ましい。Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（８）：９３７−５４（２０１２）；Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，“ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（７）：３９７−４０５（２０１３）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（９）：８２２−２６（２０１３）、およびＦｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ｓｉＲＮＡ Ｃａｎ Ｉｎｄｕｃｅ Ｔｏｘｉｃ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，”ＲＮＡ １２（７）：１１８８−９６（２００６）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。原則として、ｕＡｂおよびＰＲＯＴＡＣの両方は、タンパク質の機能にかかわらず、現在新薬の開発につながっていないプロテオームを含むタンパク質を分解することができる。さらに、従来の「占有ベース」の治療薬とは異なり、ｕＡｂおよびＰＲＯＴＡＣは触媒的に作用し、それらが構築される標的結合抗体模倣物および小分子阻害剤よりもそれぞれ実質的に強力になる。
ｕＡｂの主な利点は、合成結合タンパク質の大規模な既存のレパートリー、ならびにヒトプロテオームに対してタンパク質結合剤を新たに生成および検証するための系統的なゲノムワイドな取り組みを活用する、それらの組換えモジュラー設計に起因して、それらが様々な細胞内標的にヒットするように迅速に適合することができることである。Ｃｏｌｗｉｌｌ ｅｔ ａｔ．，“Ａ Ｒｏａｄｍａｐ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｎｄｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（７）：５５１−５８（２０１１）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。標的に対して高い特異性および親和性で結合する抗体模倣物を得ることは、同じ特性を有する小分子を得るよりも容易であるべきであるため、カスタム設計されたＰＲＯＴＡＣを作製することは、はるかに困難な作業である可能性が高い。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０−１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。それにもかかわらず、ＰＲＯＴＡＣは、細胞に入る確率が高い小分子に基づくため、治療アプローチとして非常に有望である。実際、印象的な前臨床インビトロデータおよびインビボデータは、２０１３年にＡｒｖｉｎａｓ、２０１６年にＣ４ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが設立されたことによって証明されるように、臨床的に実行可能なＰＲＯＴＡＣの開発を進ませている。しかしながら、ＰＲＯＴＡＣの経口バイオアベイラビリティ、薬物動態学、ならびに吸収、分布、代謝、排泄および毒性（ＡＤＭＥＴ）特性を改善するためには、従来の薬学的アプローチが必要であることが指摘されるべきである。Ｎｅｋｌｅｓａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：４１３８−１４４（２０１７）およびＤｅｓｈａｉｅｓ，Ｒ．Ｊ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｍｅ Ｔｉｍｅ ｆｏｒ ＰＲＯＴＡＣｓ，”Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（９）：６３４−３５（２０１５）、これは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＰＲＯＴＡＣと比較して、ｕＡｂベースの治療薬の細胞内送達は、比較的大きなサイズおよび生化学的特性のために、ほとんどの球状タンパク質薬物が自発的に形質膜を横切らないため、はるかに大きなハードルである。Ｏｓｈｅｒｏｖｉｃｈ，Ｌ．，“Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｗｉｔｈｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ−Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ７：１０−１１（２０１４）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で調査される１つの考えられる解決策は、インビボでの治療用遺伝子産物の供給源としてのｍＲＮＡの使用である。近年、その不安定性および免疫原性を含むｍＲＮＡの使用に対する障害は、構造修飾によって大きく克服されている一方で、送達およびタンパク質発現プロファイルに関連する問題は、ナノテクノロジーおよび材料科学の進歩によって対処されている。Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２４（３）：１３３−４３（２０１７）に記載され、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここでは、第一種の治療用ｕＡｂ送達戦略を作製するためのこの独自のアプローチが利用され、この方法は、送達のために事前に形成されたタンパク質−ＲＮＡ複合体を安定化するための静電学の最近実証された戦略を伴った。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５６（４４）：１３７０９−１２（２０１７）に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ここで、ＧＦＰ指向性ＧＳ２−ＩｐａＨ９．８キメラをコードする合成ｍＲＮＡをＰＡＢＰと共アセンブルし、アセンブルしたリボヌクレオタンパク質を、カチオン性アミノ化側基を有する構造的に定義されたポリペプチドを使用してナノサイズの複合体にパッケージングした。得られたナノプレックスは、インビトロおよびインビボでＧＦＰの非常に効率的なサイレンシングを達成し、それによって、新しいプロテオーム編集パラダイムを実証し、ｕＡｂベースの治療薬の臨床移行への扉を開く。
好ましい実施形態は、本明細書に詳細に示され、説明されてきたが、様々な修正、追加、置換等が、本願の趣旨から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明白である。したがって、これらは、添付の特許請求の範囲に定義されるように、本願の範囲内にあると見なされる。

Claims (53)

  1. Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、
    前記分解ドメインを基質へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、
    前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーと
    を含む、単離されたキメラ分子。
  2. 前記Ｅ３モチーフが、修飾結合領域を有しない前記Ｅ３モチーフと比較して前記基質への結合を阻害するまたは減少させる修飾結合領域を含む、請求項１に記載のキメラ分子。
  3. 前記修飾が、前記結合領域における変異または欠失である、請求項２に記載のキメラ分子。
  4. 前記Ｅ３モチーフが、前記基質のタンパク質分解を可能にする、請求項１に記載のキメラ分子。
  5. 前記Ｅ３モチーフが、細胞型特異的または組織特異的リガーゼ機能を保有する、請求項１に記載のキメラ分子。
  6. 前記リガーゼ機能が、細胞型特異的であり、前記細胞型は、皮膚細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞、臍帯血管細胞、角膜細胞、心筋細胞、大動脈細胞、角膜上皮細胞、体細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨細胞、骨芽細胞、気道細胞、微小血管細胞、乳房細胞、血管細胞、軟骨細胞、胎盤細胞、肝細胞、膠細胞、表皮細胞、角膜輪部幹細胞、歯周幹細胞、骨髄間質細胞、ハイブリドーマ細胞、腎臓細胞、膵島、関節軟骨細胞、神経芽細胞、リンパ球、および赤血球からなる群から選択される、請求項５に記載のキメラ分子。
  7. 前記分解ドメインが細菌病原体由来である、請求項１に記載のキメラ分子。
  8. 前記細菌病原体が、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ならびにエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）からなる群から選択される、請求項７に記載のキメラ分子。
  9. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）Ｅ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５−１、ＮｌｅＧ２−３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項７に記載のキメラ分子。
  10. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項１に記載のキメラ分子。
  11. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項１０に記載のキメラ分子。
  12. 前記細菌病原体がシゲラ・フレックスネリである場合である、請求項７に記載のキメラ分子。
  13. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ７ｄである、請求項１に記載のキメラ分子。
  14. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ−７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４−３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ−３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ−５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０−３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ−ＩκＢα）、Ｆｎ−Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ−Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ−Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項１３に記載のキメラ分子。
  15. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ−Ｒａｓタンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β−ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ−ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ分子。
  16. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項１に記載のキメラ分子。
  17. 前記標的指向ドメインが、非天然基質に結合する、請求項１に記載のキメラ分子。
  18. 請求項１に記載の単離されたキメラ分子をコードするｍＲＮＡを提供することと、
    １つ以上のポリアデノシン結合タンパク質（「ＰＡＢＰ」）を提供することと、
    前記ｍＲＮＡおよび前記１つ以上のＰＡＢＰからリボヌクレオタンパク質複合体をアセンブルすることと
    を含む、リボヌクレオタンパク質を形成する方法。
  19. 前記ｍＲＮＡが、３’末端ポリアデノシン（ポリＡ）テールを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１に記載のキメラ分子と、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、組成物。
  21. 抗炎症剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤、化学療法剤、抗ウイルス剤、抗生物質、代謝剤、小分子阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、アジュバント、アポトーシス剤、増殖剤、および臓器親和性標的指向剤、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される第２の薬剤をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 疾患を有する対象を選択することと、
    請求項２０に記載の組成物を前記対象に投与して、前記対象に、前記疾患に罹患していない対象と比較して、前記基質の増加した発現レベルを与えることと
    を含む、疾患を治療する方法。
  23. 前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記投与が、経口的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、移植により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病変内に、経皮的に、または粘膜への適用により行われる、請求項２２に記載の方法。
  25. サイレンシングさせる基質を選択することと、
    請求項１に記載のキメラ分子を提供することと、
    基質−分子複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、前記基質を前記キメラ分子と接触させることであって、前記複合体が、前記サイレンシングさせる基質の分解を媒介する、接触させることと
    を含む、基質サイレンシングのための方法。
  26. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ−Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ２タンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β−ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、ＳｒｃＳＨ３、リゾチーム、ホスホ−ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項２５に記載の方法。
  28. その存在が疾患状態を媒介する生体分子を提供することと、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記生体分子へと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む試験剤を提供することと、
    前記試験剤が前記生体分子の分解を促進するのに有効な条件下で、前記生体分子を前記試験剤と接触させることと、
    前記接触の結果としての前記生体分子のレベルを決定することと、
    前記決定に基づいて、前記生体分子のレベルを低下させる前記試験剤を、前記疾患に対する治療有効性の候補であるとして同定することと
    を含む、疾患に対する治療有効性について薬剤をスクリーニングする方法。
  29. 前記同定が、前記疾患に罹患していない対象における標準生体分子レベルに関して行われる、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記同定が、前記接触がない前記生体分子レベルに関して行われる、請求項２８に記載の方法。
  31. 複数の試験剤を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
  32. 前記分解ドメインが細菌病原体である、請求項２８に記載の方法。
  33. 前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５−１、ＮｌｅＧ２−３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  36. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏ７ｄである、請求項２８に記載の方法。
  39. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ−７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４−３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ−３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ−５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０−３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ−ＩκＢα）、Ｆｎ−Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ−Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ−Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記基質が、蛍光タンパク質、ヒストンタンパク質、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、Ｈ−Ｒａｓタンパク質、ＳＨＰ２タンパク質、Ｓｒｃ相同２ドメイン含有ホスファターゼ２（ＳＨＰ２）、β−ガラクトシダーゼ、ｇｐＤ、Ｈｓｐ７０、ＭＢＰ、ＣＤＣ３４、ＣＯＰＳ５、ＭＡＰ２Ｋ５、ＳＦ３Ａ１、ＵＳＰ１１、ユビキチン、ＥＧＦＲ、ＣＥＡ、ＦｃγＩＩａ、ＦｃγＩＩＩａ、ｈＡ３３、ｍＡ３３、ｈＡｌｂ、ｍＩｇＧ、ＡｂｌＳＨ２、ｖＥＧＦＲ、ＭＳＬＮ、ＥＲα／ＥＦ、ｈＳＵＭＯ４、ｙＳＵＭＯ、ＴＮＦα、ａｖβ３インテグリン、Ｓｒｃ ＳＨ３、リゾチーム、ホスホ−ＩκＢα、ＳＡＲＳ Ｎ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、翻訳後修飾タンパク質、フィブリン、ハンチンチン、腫瘍形成タンパク質、ｐ５３、Ｒｂ、接着タンパク質、受容体、細胞周期タンパク質、チェックポイントタンパク質、ＨＦＥ、ＡＴＰ７Ｂ、プリオンタンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生生物タンパク質、真菌タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、代謝タンパク質、調節タンパク質、構造タンパク質、酵素、免疫原性タンパク質、自己免疫原性タンパク質、免疫原、抗原、および病原性タンパク質からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  41. 前記基質が、緑色蛍光タンパク質、エメラルド蛍光タンパク質、ビーナス蛍光タンパク質、セルリアン蛍光タンパク質、および増強シアン蛍光タンパク質からなる群から選択される蛍光タンパク質である、請求項２８に記載の方法。
  42. 前記リンカーが、前記標的指向ドメインと前記生体分子との間の結合の立体破壊を防止するのに十分な長さのポリペプチドリンカーである、請求項２８に記載の方法。
  43. 前記生体分子が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、または肥満、ならびにこれらの任意の組み合わせに関連する、請求項２８に記載の方法。
  44. １つ以上のリガンドを発現する疾患細胞の試料を提供することと、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）モチーフを含む分解ドメインと、（ｉｉ）前記分解ドメインを前記１つ以上のリガンドへと特異的に方向付けることができる標的指向ドメインであって、前記分解ドメインに対して異種である、標的指向ドメインと、（ｉｉｉ）前記分解ドメインを前記標的指向ドメインに結合させるリンカーとを含む複数のキメラ分子を提供することと、
    前記疾患細胞が前記キメラ分子の非存在下で増殖することに失敗するのに有効な条件下で、前記試料を前記複数のキメラ分子と接触させることと、
    前記キメラ分子のうちのどれが前記疾患細胞の増殖を可能にするかを決定することと、
    前記決定に基づいて、前記キメラ分子に結合しかつ前記疾患細胞の増殖を可能にするリガンドを、前記疾患のバイオマーカーとして同定することと
    を含む、疾患バイオマーカーについてスクリーニングする方法。
  45. 前記疾患が、癌、転移性癌、脳卒中、虚血、末梢血管疾患、アルコール性肝疾患、肝炎、肝硬変、パーキンソン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症糖尿病、ＡＬＳ、病原性疾患、特発性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、プリオン性疾患、真菌性疾患、寄生生物性疾患、関節炎、創傷治癒、免疫不全、炎症性疾患、再生不良性貧血、貧血、遺伝性障害、先天性障害、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、高血糖症、代謝症候群、リポジストロフィー症候群、脂質異常症、インスリン抵抗性、レプチン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、非アルコール性脂肪性肝疾患、体重過多、および肥満からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記分解ドメインが、細菌病原体である、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記細菌病原体が、シゲラ、サルモネラ、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジアおよびクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオ、ならびにエルシニアからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記分解ドメインが、細菌病原体由来であり、かつシゲラ・フレックスネリＥ３リガーゼ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｌｒＰ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＬｕｂＸ、ＮｌｅＧ５−１、ＮｌｅＧ２−３、ＬｅｇＵ１、ＬｅｇＡＵ１３、ＮＩｅＬ、ＳｏｐＡ、ＳｉｄＣ、ＸｏｐＬ、ＧｏｂＸ、ＶｉｒＦ、ＧＡＬＡ、ＡｎｋＢ、またはＳｉｄＥを含む、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記分解ドメインが、シゲラＩｐａＨタンパク質である、請求項４４に記載の方法。
  50. 前記シゲラＩｐａＨタンパク質が、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ１．４、ＩｐａＨ２．５、ＩｐａＨ４．５、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ０８８７、ＩｐａＨ１３８９、ＩｐａＨ２０２２、ＩｐａＨ２２０２、ＩｐａＨ２６１０、およびＩｐａＨ０７２２からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記細菌病原体が、シゲラ・フレックスネリである場合である、請求項４６に記載の方法。
  52. 前記標的指向ドメインが、モノボディ、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖｎａｒ、ｓｃＦｖＤ１０、ｓｃＦｖ１３Ｒ４、ｓｃＦｖＤ１０、ヒト化抗体、キメラ抗体、相補決定領域（ＣＤＲ）、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ナノボディ、イントラボディ、ユニボディ、ミニボディ、非抗体タンパク質骨格、アドネクチン、アフィボディおよびそれらの２ヘリックス変異体、アンチカリン、ラクダ科抗体、ＶＨＨ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、またはＳｓｏｄ７ｄである、請求項４４に記載の方法。
  53. 前記標的指向ドメインがモノボディであり、前記モノボディが、以下（括弧内に標的抗原を示す）：
    ＧＳ２（ＧＦＰ）、Ｎｓａ５（ＳＨＰ２）、ＲａｓＩｎＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、およびＲａｓＩｎＩＩ（ＨＲａｓ／ＫＲａｓ）、１Ｄ１０（ＣＤＣ３４）、１Ｄ７（ＣＯＰＳ５）、１Ｃ４（ＭＡＰ２Ｋ５）、２Ｃ１２（ＭＡＰ２Ｋ５）、１Ｅ２（ＳＦ３Ａ１）、１Ｃ２（ＵＳＰ１１）、１Ａ９（ＵＳＰ１１）、Ｕｂｉ４（ユビキチン）、ＥＩ１．４．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ２．４．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ３．４．３（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．２．１（ＥＧＦＲ）、ＥＩ４．４．２（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．６（ＥＧＦＲ）、ＥＩ６．２．１０（ＥＧＦＲ）、Ｅ２４６（ＥＧＦＲ）、Ｃ７４３（ＣＥＡ）、ＩＩＩａ８．２．６（ＦｃγＩＩａ）、ＩＩＩａ６．２．６（ＦｃγＩＩＩａ）、ｈＡ２．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ２．２．２（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．１（ｈＡ３３）、ｈＡ３．２．３（ｈＡ３３）、ｍＡ３．２．１（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．２（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．３（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．４（ｍＡ３３）、ｍＡ３．２．５（ｍＡ３３）、Ａｌｂ３．２．１（ｈＡｌｂ）、ｍＩ２．２．１（ｍＩｇＧ）、ＨＡ４（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１０（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１６（ＡｂｌＳＨ２）、ＨＡ１８（ＡｂｌＳＨ２）、１５９（ｖＥＧＦＲ）、ＭＵＣ１６（ＭＳＬＮ）、Ｅ２＃３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃４（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃５（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃６（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃７（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃８（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃９（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１０（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃１１（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ２＃２３（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃２（ＥＲα／ＥＦ）、Ｅ３＃６（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３１（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３２（ＥＲα／ＥＦ）、ＯＨＴ＃３３（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ａ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＡＢ７−Ｂ１（ＥＲα／ＥＦ）、ＭＢＰ−７４（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７６（ＭＢＰ）、ＭＢＰ−７９（ＭＢＰ）、ｈＳＵＭＯ４−３３（ｈＳＵＭＯ４）、ｈＳＵＭＯ−３９（ｈＳＵＭＯ４）、ｙＳＵＭＯ−５３（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５６（ｙＳＵＭＯ）、ｙＳＵＭＯ−５７（ｙＳＵＭＯ）、Ｔ１４．２５（ＴＮＦα）、Ｔ１４．２０（ＴＮＦα）、ＦＮｆｎ１０−３ＪＣＬ１４（ａｖβ３インテグリン）、１Ｃ９（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１１（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｆ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｇ１０（Ｓｒｃ ＳＨ３）、２Ｂ２（Ｓｒｃ ＳＨ３）、１Ｅ３（Ｓｒｃ ＳＨ３）、Ｅ１８（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ１９（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２６（ＶＥＧＦＲ２）、Ｅ２９（ＶＥＧＦＲ２）、ＦＧ４．２（リゾチーム）、ＦＧ４．１（リゾチーム）、２Ｌ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．１（リゾチーム）、ＢＦ４．９（リゾチーム）、ＢＦ４．４（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０１（リゾチーム）、ＢＦｓ１ｃ４．０７（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０２（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿４．０６（リゾチーム）、ＢＦｓ３＿８．０１（リゾチーム）、１０Ｃ１７Ｃ２５（ホスホ−ＩκＢα）、Ｆｎ−Ｎ２２（ＳＡＲＳ Ｎ）、Ｆｎ−Ｎ１７（ＳＡＲＳ Ｎ）、ＦＮ−Ｎ１０（ＳＡＲＳ Ｎ）、ｇＩ２．５．３Ｔ８８Ｉ（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．２（ヤギＩｇＧ）、ｇＩ２．５．４（ヤギＩｇＧ）、ｒＩ４．５．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．１（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．６（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ４．３．４（ウサギＩｇＧ）、ｒＩ３．６．４（ウサギＩｇＧ）、およびｒＩ４．３．３（ウサギＩｇＧ）
    からなる群から選択されるフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディである、請求項５０に記載の方法。
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