CN112266404A - 选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用，本发明的选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法，基于硫盐中心的基团转移反应选高效择性地修饰靶标蛋白。以此为基础细胞免疫荧光成像实验，证明上述修饰方法所提供的转移反应选择性的在细胞膜表面能够进行，从而实现细胞膜图案的成像。

Description

选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白特定位点修饰方法及其应用。属于化学生物学与生物技术领域。
背景技术
生物分子的甲基化在细胞功能调控中起着重要作用。甲基化过程包括酶催化的甲基从S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转移到生物分子上，例如核酸，蛋白质，脂质和次级代谢产物。SAM有一个独特的甲基化硫盐中心，可以通过SAM依赖性甲基化酶进行基团转移反应。值得注意的是，在生物相关条件下，硫盐中心与谷胱甘肽具有合理的稳定性(数日)，不会与生物分子发生随机反应。在以往的研究中，通过酶工程能够将SAM衍生物上的甲基、乙基、丙基、烯丙基、炔丙基或酮基转移到生物分子上，但更复杂的基团转移还没有办法实现。
在过去的二十年中，科学家们已经开发了许多化学修饰靶蛋白的策略，包括位点选择性和化学选择性方法。无论是在体外还是在细胞中，由于蛋白质与细胞环境的复杂性，蛋白质修饰仍然存在选择性差、反应条件相对苛刻、反应速度慢、反应活性与选择性两难等问题。实现位点选择性的一种方法是利用生物正交反应对整合了非天然氨基酸的蛋白质进行标记，以及对整合特定多肽序列(标签)的蛋白进行空间识别。实现位点选择性的另一种方法是配体诱导的蛋白质偶联，这是由Meares率先提出的。最近，Hamachi课题组也提出了配体导向(LD)的化学方法来特异性标记活细胞中的目标蛋白(POI)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用。
本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种基于硫盐中心的高效选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法。
本发明还提供上述方法中基于多肽配体导向的基团转移方法在细胞荧光成像中的应用。
进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：所述多肽配体基于QSPANIYYKV，所述多肽配体中的甲硫氨酸位于C末端的3至10位，具体如下：
Figure BDA0002748163150000021
进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：所述多肽配体中的甲硫氨酸靠近C末端。
本发明还提供一种基于靶向药物配体导向的基团转移反应在共价PROTACs靶向诱导蛋白降解方面的用途。
进一步，基于靶向药物配体诱导的基团转移反应在抑制EGFR酶活活性、抑制EGFR高表达肿瘤干细胞的增殖的用途。
本发明还提供一种硫盐探针，其包含生物素富集基团和靶向EGFR的结合配体Osimertinib。用于ABPP(activity-based protein profiling)研究PPI(proton pumpinteraction)。
本发明还提供一种硫盐降解子，其包含招募E3连接酶的转移基团Thalidamide和靶向EGFR的结合配体Osimertinb。
本发明还提供含有甲硫氨酸的多肽配体-荧光标记分子在制备细胞膜表面成像试剂中的应用。
本发明还提供硫盐小分子11-X与11-VIII在制备抗A549肺癌细胞增殖的药物中的应用。
发明的有益效果：本发明的选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法，基于硫盐中心的基团转移反应选高效择性地修饰靶标蛋白。以此为基础细胞免疫荧光成像实验，证明上述修饰方法所提供的转移反应选择性的在细胞膜表面能够进行，从而实现细胞膜图案的成像。
本发明设计了药物小分子Osimertinib导向的基团转移反应，合成一系列带有不同转移基团的硫盐，通过SDS-PAGE、Western Blot、In-gel fluorescence scanning等实验可以证明转移反应可行性与选择性。Pull Down和Immunoprecipitation实验可以验证该反应在复杂的蛋白质组环境下的转移效率和选择性。MS/MS可以确定反应发生在目标蛋白的半胱氨酸具体位置。
本发明的硫盐降解子，包含了招募E3连接酶的转移基团Thalidamide和靶向EGFR的结合配体Osimertinb(奥希替尼)。通过基团转移反应以不可逆的方式将Thalidamide基团共价转移到EGFR上，以实现E3连接酶(CRBN)的高效募集。可以通过接头的进一步修饰来优化这种硫盐降解子的性能，而且还可以使用更容易合成的共价配体来选择性地靶向数千种致癌靶标。
本发明通过细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期阻滞实验证明通过该基团转移反应对靶向蛋白进行选择性修饰能够有效抑制肿瘤干细胞的增殖。
附图说明
图1是通过多肽配体进行蛋白的共价偶联反应，以及基团转移反应的示意图。
图2是多肽1-III和PDZ之间的转移反应ESI-MS结果。
图3是带有相同转移基团X的不同序列多肽(1-8)和PDZ之间转移反应的WesternBlot结果。
图4是带有相同转移基团X、不同接头的多肽1-X，1-XI，1-XII与PDZ反应的WesternBlot结果。
图5是多肽1-IX与不同的蛋白质的蛋白选择性实验SDS-PAGE结果。
图6是利用基团转移反应进行细胞膜表面成像实验原理示意图，
图7是搭载荧光基团FAM的两种配体9-XIII和10-XIII的结构。
图8是Miapaca-2细胞的共聚焦结果。从左到右显示合并、绿色荧光和红色荧光通道。
图9是293T细胞转染CD38-(CH6)2-tag后的共聚焦结果。从左到右显示合并，绿色荧光(来自FAM配体)和红色荧光(来自His-tag抗体)通道。比例尺5μm。
图10是带有不同转移基团的硫盐成功转移到EGFR上的原理示意图。
图11是EGFR与11-X的基团转移反应动力学以及化学计量研究。
图12是不同接头对基团转移效率的影响。
图13是11-XVI在复杂得细胞裂解液里选择性地转移到EGFR上。
图14是IP与Pull down实验证实了11-X与EGFR在细胞裂解液里的成功转移。
图15是以硫盐11-X为基础的ABPP鉴定出23个EGFR的信号蛋白组相互作用。
图16是IC50曲线证实酶活实验中硫盐小分子11-X对EGFR磷酸化多肽底物活性的抑制。
图17是IC50曲线证实了MTT实验中硫盐小分子11-X与11-VIII对A549肺癌细胞的抗增殖作用。
图18是PI染色的流式细胞实验(FACS)证实11-X和11-VIII调控A549肺癌细胞的细胞周期阻滞。
图19是PI和FITC-Annexin V染色的流式细胞实验结果证实11-X和11-VIII诱导细胞凋亡。
图20是基于基团转移反应的可安装PROTACs的作用机理。
图21是在EGFR高表达A549肺癌细胞中，EGFR的蛋白水平呈现出随11-VIII浓度增高时间增长而降低的现象。
图22是与单独使用MG-132处理的EGFR泛素化水平比用11-VIII和MG-132同时处理的EGFR泛素化水平。
图23是11-IX表现出与11-VIII一样的降解EGFR能力。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例一：利用多肽配体的基团转移。
基于半胱氨酸-甲硫氨酸关环的多肽可以在识别蛋白后与附近的半胱氨酸选择性和有效地共价偶联。用不同的基团将甲硫氨酸烷基化以模拟SAM(S-腺苷甲硫氨酸)，可通过邻近触发反应转移到蛋白上。PDZ结构域(来自PDZ-RGS3，蛋白信号调节因子3)在与其多肽配体相互作用界面附近半胱氨酸处，可以实现多肽对于蛋白的共价标记。因此，PDZ蛋白被用作研究基于锍盐基团转移反应的模型，如图1所示。
通过调整甲硫氨酸位置，本发明制备了基于文献报告中PDZ多肽配体QSPANIYYKV的一系列多肽，如表1所示，表1是设计用于基团转移反应的不同序列的一系列多肽的结构，表中R代表生物素。通过将序列中的非关键氨基酸位点突变为甲硫氨酸，可以使得基团转移方法顺利进行。在本实施例中，首先选择了生物素(R＝X)作为转移基团，由此通过WesternBlot方法可以监测反应动力学和化学计量。用不同序列的多肽与PDZ一起敷育(蛋白/多肽10/50μM，pH 7.4，37℃，4h)，然后通过Western Blot方法检测蛋白上生物素分子的连接情况。结果如图3所示，甲硫氨酸靠近C末端的多肽：多肽1、多肽2和多肽3，显示出比其他多肽：多肽4、多肽5和多肽6更好的转移程度，这与PDZ和多肽的结合位置更接近多肽的C端相一致。实际上，对于多肽1-X，在37℃时，反应在4小时和5当量内基本实现了饱和。而乱序的多肽7或单独的甲硫氨酸8无法进行有效转移。因此选择了多肽1用于后续研究。
表1:多肽序列
Figure BDA0002748163150000071
1、在室温下，在含有5％(v/v)甲酸的H2O/CH3CN溶液中反应12小时后，多肽1成功地用不同的基团烷基化。所有的苄基和烯丙基基团可以在温和的条件下被转移到蛋白质PDZ，而烷基基团很难实现转移。1-X的分子式如下：
Figure BDA0002748163150000081
虚线框内表示转移的基团。然后通过高效液相色谱HPLC纯化产物。
2、然后筛选不同的转移的基团，并通过电喷雾电离质谱法ESI-MS进行检测。简单的基团如烯丙基(I)，炔丙基(II)和苄基(III)，如图2所示，可以有效地实现转移，但是炔丙基(II)在较高的pH下(即pH>8)也可以直接与游离半胱氨酸键合，而不是转移。简单的烷基接头，例如甲基或羧甲基基团不能有效转移。因此，烯丙基和苄基更适合用作接头来转移不同的功能分子，例如酰胺(IV)，磷酸盐(V)，PEG(VI)和叠氮化物(VII)。这些修饰基团的转移可以充当翻译后修饰的模仿，或用作进一步修饰的处理。然后测试了更复杂分子的转移，包括金刚烷(VIII)，沙利度胺(IX)和生物素(X)，它们可以为不同的生物过程制备探针。
3、连接子linker对转移效率至关重要。用PDZ测试了不同的接头生物素转移效率，包括苄基生物素(X)，烯丙基生物素(XI)和烷基生物素(XII)，分子式分别如下。
Figure BDA0002748163150000091
如图4所示，Western Blot显示转移效率有明显差异。因此，对于一系列复杂转移基团的引入，苄基是更推荐的连接基。
4、为了进一步测试转移的选择性和特异性，使用多肽1-IX测试了含半胱氨酸的蛋白质，例如BFL1，MgrA和SarA。如图5所示，基团转移反应仅在肽1-IX和PDZ蛋白之间发生，这清楚地证明了在基团转移方法中，配体导向起到了重要的作用。
实例2：细胞膜表面荧光成像实验。
叶酸受体(FR，糖基磷脂酰肌醇连接蛋白的成员)是膜结合蛋白，在各种癌细胞中过表达。制备了选择性靶向叶酸受体的多肽9，并用荧光染料5-羧基荧光素(FAM，XIII，如图6和图7所示)进行甲硫氨酸的烷基化标记。用0.5mM TECP(PBS溶剂)处理已知具有高FR表达的Miapaca-2细胞10分钟，用PBS洗后，加入5μM的多肽9-XIII，并与细胞一起温育12小时。从图8可以清楚地看到来自FAM的绿色荧光和来自叶酸受体抗体的红色荧光之间的共定位。绿色荧光来自FAM配体和红色荧光来自FR抗体。在荧光成像实验中，细胞预处理、加药之后，再进行清洗、封闭，然后分别用叶酸受体的一抗，以及与之匹配的红色荧光二抗处理。最后制片、拍摄。
然后测试小分子配体。利用基因克隆的方法在CD38蛋白的质粒C末端引入(CH6)2-tag(具有蛋白质序列CHHHHHHGSGCHHHHHHH)，然后转染到293T细胞中，以确保His-tag在膜表面表达。转染24小时后，将转染的293T细胞用0.5mM TECP(PBS溶剂)处理10分钟，洗涤并与5μM(CH6)2-tag的配体10-XIII孵育12h。共聚焦可视化清楚地显示了FAM(绿色)和His-tag抗体(红色)的共定位，如图9所示。
实例3：利用小分子药物导向的基团转移。
合成以奥斯替尼为配体，生物素为转移基团的硫盐11-X，在奥斯替尼配体的导向下，11-X靠近EGFR的酶活口袋，在口袋周围的半胱氨酸亲核进攻下，生物素基团转移至EGFR，如图10所示。11-X的分子结构见下方。除了转移生物素，本发明还成功转移了用于点击化学反应的叠氮，标记蛋白的荧光团以及其他用途的功能团。其结构如下：
Figure BDA0002748163150000111
利用Western Blot分析基团转移的动力学和化学计量关系，反应在在37℃的PBS中进行，数分钟内开始，4小时后达到饱和。一倍当量的11-X在短时间内足以完成基团转移反应，如图11所示。随后在磷酸盐缓冲液(pH 6.6、7.4、8.2)中测试了pH对该反应的影响，结果表明碱性条件下反应效率更高。配体的存在至关重要，当使用GefitinibFmoc-Met-OH代替Osimertinib作为导向配体时，反应效率明显降低。此外，接头的筛选结果表明苄基作为接头的转移效率最高，如图12所示。具有长烷基接头生物素表现出较低的转移效率。这些结果与多肽配体导向的基团转移反应很好地吻合。通过SDS-PAGE和In-gel fluorescencescanning可以看到硫盐上荧光团的选择性转移。为了评估在复杂的蛋白质组环境中11-XVI上的Cy5基团转移至EGFR上的能力，将11-XVI(2μM)与GST-EGFR(5μg)在A549细胞裂解液(150μg)在25℃下孵育24小时，凝胶内荧光分析显示一条清晰的单一荧光带，表明细胞裂解液中11-XVI选择性识别并转移至EGFR，如图13。
如图14所示，通过免疫沉淀实验(IP)和Pull down实验进一步证实了基团的成功转移。IP实验中，将A549细胞裂解物(300μg)加入GST-EGFR(2.5μg)，然后与50μM 11-X在25℃下孵育2小时。用GST beads拉下后，Western blot分析显示一条清晰的单条带，表明11-X对EGFR的成功转移。为了进行Pull down分析，将EGFR过表达的A549细胞裂解液(300μg)与1μM 11-X在4℃下孵育12小时。SA beads拉下，进一步的Western blot分析清楚地显示了EGFR的选择性下拉。为了进一步确定修饰位点，将胰蛋白酶消化的EGFR片段送至ESI-Q-TOFMS/MS分析，MS/MS结果表明11-X可以位点选择性转移到EGFR Cys775(离子评分103分)。此外，MS/MS结果表明11-XV也可以选择性地转移至EGFR Cys775。为了进一步探索EGFR的信号蛋白组相互作用，利用11-X进行了ABPP实验，如图15所示。用11-X对整个A549细胞提取物进行孵育，结果显示23个蛋白参与了EGFR直接的物理和功能的相互作用。例如，CDC42被认为是Ras相关癌症的治疗靶点，并促进/激活EGFR和Ras信号。这使得sulfonium探针11-X成为即时捕获和定量分析整个EGFR信号蛋白组相互作用的理想探针，它可以阐明EGFR相关蛋白在自然生物系统中的蛋白功能。
实例4：硫盐11-X抑制EGFR的酶活性并对EGFR高表达的癌细胞具有选择性的抗肿瘤作用。
首先，使用Osimertinib(IC50＝0.61nM)和Gefitinib(IC50＝0.27nM)作为阳性对照，通过酶学活性分析确定11-X可以抑制EGFR对多肽底物的磷酸化(IC50＝0.121μM)，如图16所示。为了进一步研究11-X和11-VIII的治疗潜力，选择FDA批准的药物Osimertinib作为阳性对照，通过MTT实验分析了他们的细胞毒性，如图17所示，11-X在EGFR过表达的A549细胞中显示出显著的抗肿瘤作用(IC50＝8.3μM)，优于11-VIII(IC50＝14.3μM)。为了检查11-X是否通过诱导细胞周期停滞显示其抗增殖作用，进行了FACS分析，如图18所示。A549细胞经11-X处理后，G0/G1期细胞比例明显增加，而S期和G2期细胞比例明显降低。与11-X相比，11-VIII在G0/G1相中表现出的细胞周期停滞不明显。为了进一步研究11-X通过阻断EGFR驱动的抗凋亡途径对细胞凋亡的影响，分别用不同剂量的11-X和11-VIII处理A549细胞，用PI和FITC-Annexin V染色，并通过FACS分析得出11-X剂量依赖性地诱导A549细胞凋亡，而且11-VIII则比11-X在A549细胞中具有更大的诱导凋亡效应，如图19所示。
实例5：可安装的硫盐PROTACs通过蛋白泛素化-蛋白酶体途径诱导EGFR降解。
靶向蛋白质降解是药物开发领域中的新兴方向。具有异源双功能的小分子，通常称为“PROTAC”(针对嵌合体的蛋白水解)，可同时结合E3泛素连接酶和目标蛋白，通过蛋白泛素化-蛋白酶体途径导致后者泛素化并降解。与普通小分子抑制剂不同，PROTACs的配体设计只需要与靶蛋白结合即可，并不需要竞争抑制，因此针对EGFR各种突变体的PROTACs显得尤为必要。我们将通过基团转移反应将降解子转移至EGFR上实现EGFR的降解，与传统的PROTAC相比，这种可转移的PROTAC只需要与E3连接酶在动力学上更有利的二元相互作用即可确保靶标降解。
制备的降解剂包含三个部分，转移基团Thalidomide，连接子以及用于靶向EGFR的结合配体Osimertinib。如图20所示，Thalidomide以不可逆的方式共价转移至EGFR，以实现E3连接酶(CRBN)的有效募集将EGFR降解。而且可以通过进一步的连接子优化来调节此降解剂的性能，除此之外，还可以使用更多基于临床药物合成简单的共价配体来选择性靶向数千种致病蛋白质。
为此，合成了可转移的PROTACs 11-VIII，并通过Western blot评估11-VIII诱导EGFR的降解能力，结果证实11-VIII以剂量和时间依赖性方式诱导A549细胞中的EGFR降解(IC50＝14.3μM，见图21)。在A549细胞中，蛋白酶体抑制剂MG-132(10μM)可以阻止11-VIII诱导的EGFR下调，从而提供了降解依赖于蛋白酶体的证据。为了进一步确认11-VIII诱导了EGFR的泛素化(作为降解信号)，使用EGFR抗体从11-VIII/MG-132处理的A549细胞裂解物中免疫沉淀了EGFR，并用泛素化抗体检测EGFR的泛素化水平。与仅存在MG-132的水平相比，在11-VIII和MG-132的存在下EGFR泛素化水平增加，如图22。这种差异表明11-VIII诱导的EGFR降解是通过蛋白泛素化-蛋白酶体途径发生的。此外，还使用疏水标记HyT来模拟变性EGFR折叠状态，将伴侣蛋白引到EGFR，从而导致伴侣蛋白介导的蛋白酶体降解。在此基础上，合成了能够转移“金刚烷”基团到EGFR上的硫盐11-IX。如图23所示，金刚烷作为疏水标记以剂量和时间依赖的方式诱导EGFR降解。到目前为止，仅从600多种E3连接酶中发现少数能够支持靶向蛋白质降解。基于上述工作，接下来期望设计一种新型的硫盐降解剂，该硫盐降解剂通过ABPP共价结合至先前未靶向的E3连接酶，并将Osimertinib转移至其上以诱导EGFR降解。
Figure BDA0002748163150000161
Figure BDA0002748163150000171
序列表
<110> 北京大学深圳研究生院
深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心
<120> 选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ser Pro Ala Asn Met Tyr Tyr Lys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Ser Pro Ala Asn Ile Tyr Met Lys Val
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ser Pro Ala Met Ile Tyr Tyr Lys Val
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ser Pro Met Asn Ile Tyr Tyr Lys Val
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Met Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Val
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Pro Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Val
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Ala Ala Ala Ala Met Ala Gln Leu Leu Thr Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Cys His His His His His His Gly Ser Gly Cys His His His His His
1 5 10 15
His His

Claims (10)

1.一种基于硫盐中心的高效选择性修饰靶标蛋白的基团转移方法。
2.权利要求1所述的基于多肽配体导向的基团转移方法在细胞荧光成像中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述多肽配体基于QSPANIYYKV，所述多肽配体中的甲硫氨酸位于C末端的3至10位，具体如下：
Figure FDA0002748163140000011
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述多肽配体中的甲硫氨酸靠近C末端。
5.权利要求1所述的基于靶向药物配体导向的基团转移反应在共价PROTACs靶向诱导蛋白降解方面的用途。
6.如权利要求1所述的基于靶向药物配体诱导的基团转移反应在抑制EGFR酶活活性、抑制EGFR高表达肿瘤干细胞的增殖的用途。
7.药物小分子Osimertinib导向的基团转移反应。
8.一种硫盐降解子，其包含招募E3连接酶的转移基团Thalidamide和靶向EGFR的结合配体Osimertinb。
9.一种甲硫氨酸的配体-荧光标记分子在制备细胞膜表面成像试剂中的应用。
10.硫盐小分子11-X与11-VIII在制备抗A549肺癌细胞增殖的药物中的应用。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110621322A (zh) * 2017-02-08 2019-12-27 达纳-法伯癌症研究所有限公司 用异双功能性化合物进行的可调节的内源性蛋白质降解

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018237026A1 (en) * 2017-06-20 2018-12-27 C4 Therapeutics, Inc. N / O-LINKED DEGRONS AND DEGRONIMERS FOR DEGRADATION OF PROTEINS
GB201710620D0 (en) * 2017-07-03 2017-08-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Ltd Targeted protein degradation
WO2019099868A2 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 C4 Therapeutics, Inc. Degraders and degrons for targeted protein degradation
CN112189051A (zh) * 2018-03-16 2021-01-05 康奈尔大学 用工程化细菌泛素连接酶模拟物进行的广谱蛋白质组编辑

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110621322A (zh) * 2017-02-08 2019-12-27 达纳-法伯癌症研究所有限公司 用异双功能性化合物进行的可调节的内源性蛋白质降解

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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DONGYUAN WANG ET AL.: "A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity", 《CHEMICAL SCIENCE》 *

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