JP2003169673A - タンパク質分解排除酵素とその用途 - Google Patents
タンパク質分解排除酵素とその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 各種ヒト疾患の原因となる不要タンパク質を
選択的に分解排除することのできるタンパク質分解排除
酵素とその用途を提供する。 【解決手段】 ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結
合分子との複合体であるタンパク質分解排除酵素、この
酵素をコードする融合ポリヌクレオチド、この融合ポリ
ヌクレオチドを保有する組換えベクター、およびタンパ
ク質分解排除酵素または組換えベクターが細胞内に導入
可能な形態である治療用製剤。
選択的に分解排除することのできるタンパク質分解排除
酵素とその用途を提供する。 【解決手段】 ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結
合分子との複合体であるタンパク質分解排除酵素、この
酵素をコードする融合ポリヌクレオチド、この融合ポリ
ヌクレオチドを保有する組換えベクター、およびタンパ
ク質分解排除酵素または組換えベクターが細胞内に導入
可能な形態である治療用製剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、生細胞内
の標的タンパク質を分解排除する酵素と、その用途に関
するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、
生体内の不要タンパク質排除機構であるユビキチンシス
テムにおいて中心的な役割を担うユビキチンリガーゼ
（別名E3酵素）の活性を利用して、病因タンパク質その
ものを生体内から取り除いて正常化（復活）させること
のできるタンパク質分解排除酵素と、病因タンパク質の
蓄積を原因とする各種疾患に対する治療のためにこのタ
ンパク質分解排除酵素を利用する発明に関するものであ
る。
の標的タンパク質を分解排除する酵素と、その用途に関
するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、
生体内の不要タンパク質排除機構であるユビキチンシス
テムにおいて中心的な役割を担うユビキチンリガーゼ
（別名E3酵素）の活性を利用して、病因タンパク質その
ものを生体内から取り除いて正常化（復活）させること
のできるタンパク質分解排除酵素と、病因タンパク質の
蓄積を原因とする各種疾患に対する治療のためにこのタ
ンパク質分解排除酵素を利用する発明に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術とその課題】近年、大きな社会問題となっ
ている神経変性疾患の多く（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病）は、
脳神経系細胞内に不要タンパク質が蓄積して発症するこ
とが明らかにされている。また同様に問題となっている
ウイルス感染症（例えば、AIDS、C型肝炎、B型肝炎）
は、感染細胞内にウイルス由来タンパク質が蓄積するこ
とにより炎症等を引き起こして発症することが知られて
いる。しかしながら、現在のところ、これらの疾患に対
しては対症療法しかなく、根治療法は開発されていな
い。
ている神経変性疾患の多く（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病）は、
脳神経系細胞内に不要タンパク質が蓄積して発症するこ
とが明らかにされている。また同様に問題となっている
ウイルス感染症（例えば、AIDS、C型肝炎、B型肝炎）
は、感染細胞内にウイルス由来タンパク質が蓄積するこ
とにより炎症等を引き起こして発症することが知られて
いる。しかしながら、現在のところ、これらの疾患に対
しては対症療法しかなく、根治療法は開発されていな
い。
【０００３】具体的には、アルツハイマー病はアミロイ
ド繊維がニューロン内部に蓄積し、ニューロンのアポト
ーシス（プログラム化された細胞死）を誘導することが
病態である。しかし、ダメージを受けたニューロンから
アミロイド繊維を排除してニューロンを正常化させる手
段は存在しない。また、パーキンソン病はドーパミン作
動性ニューロンに不要タンパク質（α-シヌクレインお
よびパエル受容体に由来するタンパク質）が蓄積して、
アポトーシスを誘導することが病態である。現在では、
ドーパミンもしくはドーパミン誘導体を補充し、残存し
ている正常ニューロンを賦活化する対症療法が主に行わ
れている。しかし、ダメージを受けたニューロンから不
要タンパク質を排除してニューロンを正常化させる手段
は存在しない。
ド繊維がニューロン内部に蓄積し、ニューロンのアポト
ーシス（プログラム化された細胞死）を誘導することが
病態である。しかし、ダメージを受けたニューロンから
アミロイド繊維を排除してニューロンを正常化させる手
段は存在しない。また、パーキンソン病はドーパミン作
動性ニューロンに不要タンパク質（α-シヌクレインお
よびパエル受容体に由来するタンパク質）が蓄積して、
アポトーシスを誘導することが病態である。現在では、
ドーパミンもしくはドーパミン誘導体を補充し、残存し
ている正常ニューロンを賦活化する対症療法が主に行わ
れている。しかし、ダメージを受けたニューロンから不
要タンパク質を排除してニューロンを正常化させる手段
は存在しない。
【０００４】一方、ウイルス感染症においても状況は類
似している。AIDSはヘルパーT細胞内でHIVウイルスが増
殖して、同細胞の機能と増殖を阻害していることが病態
である。現在、細胞内でHIV複製を阻害する薬剤（逆転
写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤）がAIDSの発症と進
行を妨げるのに有効であると分かっているが、これらの
薬剤だけでHIVを体内から完全に排除できない。また、C
型およびB型肝炎は我国の全人口の数％が罹患している
が、これらはCおよびB型肝炎ウイルスが肝臓で増殖して
肝細胞を破壊するのが病態である。最近、一部の感染者
ではインターフェロンの投与により感染細胞を免疫的に
排除できることが判明したが、過半数の感染者はインタ
ーフェロン非応答者である。従って、これらのウイルス
性疾患に対して、感染細胞からウイルスを積極的に排除
して細胞を正常化させる新たな手段が待たれている。
似している。AIDSはヘルパーT細胞内でHIVウイルスが増
殖して、同細胞の機能と増殖を阻害していることが病態
である。現在、細胞内でHIV複製を阻害する薬剤（逆転
写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤）がAIDSの発症と進
行を妨げるのに有効であると分かっているが、これらの
薬剤だけでHIVを体内から完全に排除できない。また、C
型およびB型肝炎は我国の全人口の数％が罹患している
が、これらはCおよびB型肝炎ウイルスが肝臓で増殖して
肝細胞を破壊するのが病態である。最近、一部の感染者
ではインターフェロンの投与により感染細胞を免疫的に
排除できることが判明したが、過半数の感染者はインタ
ーフェロン非応答者である。従って、これらのウイルス
性疾患に対して、感染細胞からウイルスを積極的に排除
して細胞を正常化させる新たな手段が待たれている。
【０００５】なお、生体内のタンパク質等を分解排除す
る機構として、ユビキチンシステムが知られており、そ
の中心的役割を果たす酵素としてユビキチンリガーゼが
知られている。特開2001-316290号公報は、このユビキ
チンリガーゼとしてパーキンタンパク質またはその変異
型タンパク質を利用し、若年性パーキンソン病を診断す
る方法が開示されている。また、特開2001-224380号公
報には、サイクリンEをユビキチン化分解するユビキチ
ンリガーゼSCF複合体のF-ボックスタンパク質が開示さ
れている。しかしながら、様々な病因タンパク質を個々
に分解排除するための汎用的なユビキチンリガーゼの使
用は全く知られていない。
る機構として、ユビキチンシステムが知られており、そ
の中心的役割を果たす酵素としてユビキチンリガーゼが
知られている。特開2001-316290号公報は、このユビキ
チンリガーゼとしてパーキンタンパク質またはその変異
型タンパク質を利用し、若年性パーキンソン病を診断す
る方法が開示されている。また、特開2001-224380号公
報には、サイクリンEをユビキチン化分解するユビキチ
ンリガーゼSCF複合体のF-ボックスタンパク質が開示さ
れている。しかしながら、様々な病因タンパク質を個々
に分解排除するための汎用的なユビキチンリガーゼの使
用は全く知られていない。
【０００６】この出願の発明は、以上のとおりの状況を
鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消す
るとともに、細胞内に蓄積している病因タンパク質やウ
イルス構造タンパク質等の標的タンパク質を選択的に分
解排除し、細胞を正常化するための汎用的な方法を提供
することを課題としている。
鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消す
るとともに、細胞内に蓄積している病因タンパク質やウ
イルス構造タンパク質等の標的タンパク質を選択的に分
解排除し、細胞を正常化するための汎用的な方法を提供
することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この出願は、第１の発明
として、ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子
との複合体であるタンパク質分解排除酵素を提供する。
として、ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子
との複合体であるタンパク質分解排除酵素を提供する。
【０００８】この第１発明においては、ユビキチンリガ
ーゼが、ユビキチンリガーゼそれ自体の基質結合部位を
欠失または変異させた改変型ユビキチンリガーゼである
ことを好ましい態様としている。
ーゼが、ユビキチンリガーゼそれ自体の基質結合部位を
欠失または変異させた改変型ユビキチンリガーゼである
ことを好ましい態様としている。
【０００９】また第１発明においては、ユビキチンリガ
ーゼが、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレオ
チドが発現する組換えユビキチンリガーゼであることを
好ましい態様としている。
ーゼが、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレオ
チドが発現する組換えユビキチンリガーゼであることを
好ましい態様としている。
【００１０】さらにこの第１発明における前記態様にお
いては、ポリヌクレオチドが、ユビキチンリガーゼの基
質結合部位をコードする領域を欠失または変異させた改
変型ポリヌクレオチドであることを別の好ましい態様と
している。
いては、ポリヌクレオチドが、ユビキチンリガーゼの基
質結合部位をコードする領域を欠失または変異させた改
変型ポリヌクレオチドであることを別の好ましい態様と
している。
【００１１】この第１発明においては、また、標的タン
パク質結合分子が、抗体分子またはリガンド分子である
ことを好ましい態様としている。この出願は、第２の発
明として、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレ
オチドと、標的タンパク質結合分子をコードするポリヌ
クレオチドとが連結した融合ポリヌクレオチドを提供す
る。
パク質結合分子が、抗体分子またはリガンド分子である
ことを好ましい態様としている。この出願は、第２の発
明として、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレ
オチドと、標的タンパク質結合分子をコードするポリヌ
クレオチドとが連結した融合ポリヌクレオチドを提供す
る。
【００１２】この出願は、第３の発明として、前記第２
発明の融合ポリヌクレオチドを保有する組換えベクター
を提供する。この出願は、第４の発明として、前記第１
発明のタンパク質分解排除酵素、または第３発明の組換
えベクターが生細胞内に導入可能な形態を有する治療用
製剤を提供する。
発明の融合ポリヌクレオチドを保有する組換えベクター
を提供する。この出願は、第４の発明として、前記第１
発明のタンパク質分解排除酵素、または第３発明の組換
えベクターが生細胞内に導入可能な形態を有する治療用
製剤を提供する。
【００１３】以下、この出願の発明について実施形態を
詳しく説明する。
詳しく説明する。
【００１４】
【発明の実施の形態】第１発明のタンパク質分解排除酵
素は、ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子と
の複合体であり、生細胞内の標的タンパク質を特異的に
認識し、生体自身のタンパク質分解系（ユビキチンシス
テム）よってその標的タンパク質を分解排除する。
素は、ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子と
の複合体であり、生細胞内の標的タンパク質を特異的に
認識し、生体自身のタンパク質分解系（ユビキチンシス
テム）よってその標的タンパク質を分解排除する。
【００１５】この発明のタンパク質分解排除酵素を構成
するユビキチンリガーゼは、各種哺乳動物から単離精製
されたユビキチンリガーゼ（E3酵素）それ自体であって
もよく、またはそれらユビキチンリガーゼを構成するア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成
ポリペプチドであってもよい。あるいは、ユビキチンリ
ガーゼの活性領域を構成するタンパク質断片またはそれ
と実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成ペプチドで
あってもよい。さらにこのユビキチンリガーゼは、その
全領域または一部領域をコードするポリヌクレオチドか
らの発現産物である組換えタンパク質であってもよい。
なお、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、ユビキチ
ンリガーゼの活性を損なわない範囲で、１以上のアミノ
酸残基が欠失、付加、または他のアミノ酸残基に置換さ
れているアミノ酸配列を意味する。
するユビキチンリガーゼは、各種哺乳動物から単離精製
されたユビキチンリガーゼ（E3酵素）それ自体であって
もよく、またはそれらユビキチンリガーゼを構成するア
ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成
ポリペプチドであってもよい。あるいは、ユビキチンリ
ガーゼの活性領域を構成するタンパク質断片またはそれ
と実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成ペプチドで
あってもよい。さらにこのユビキチンリガーゼは、その
全領域または一部領域をコードするポリヌクレオチドか
らの発現産物である組換えタンパク質であってもよい。
なお、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、ユビキチ
ンリガーゼの活性を損なわない範囲で、１以上のアミノ
酸残基が欠失、付加、または他のアミノ酸残基に置換さ
れているアミノ酸配列を意味する。
【００１６】ユビキチンリガーゼ（E3酵素）としては、
活性化ユビキチンを提示するE2酵素と相互作用する亜鉛
フィンガーRINGドメインを含むタンパク質（RINGタンパ
ク質）を適用することができる。具体的には、RBCK1（R
BCC protein interacting with protein kinase C 1；
Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:353-359, 199
8）、Apc11（Mol. Biol. Cell 11:2315-2325, 2000）、
BRCA1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369,
1999）、c-cbl（Science 286:309-312, 1999）、c-IAP
1（Science 288:874-877, 2000）、E6AP（J. Biol. Che
m. 273:6439-6445,1998）、IPCO/vmw110（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 98:8815-8820, 2001）、KIAA10（J. B
iol. Chem. 276:1981-1988, 2001）、Mdm2（FEBS Lett.
420:25-27, 1997）、NEDD4（Genes Cells. 3:751-763,
1998）、Parkin（Nat. Genet. 25:302-305, 2000）、P
rajal（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369,
1999）、RNF2（FEBS Lett. 503:61-64, 2001）、Rbx1/
Roc1/Hrt1（Genes Dev. 13:1614-1626, 1999）、Siah-1
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369, 199
9）、Smurf2（J. Biol. Chem. 275:3618-3622, 200
0）、Ubr1p（EMBO J. 18:6832-6844, 1999）、XIAP（Sc
ience 288:874-877, 2000）、AO7（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 96:11364-11369, 1999）、Ttch（J. Biol. C
hem. 275:35734-35737, 2000）等が例示できる。さら
に、HECTドメイン(Trends Cell Biol 10:429-439, 200
0)やUボックス（Curr. Biol. 10:R132-34, 2000）を含
むタンパク質もE3酵素として使用することができる。
活性化ユビキチンを提示するE2酵素と相互作用する亜鉛
フィンガーRINGドメインを含むタンパク質（RINGタンパ
ク質）を適用することができる。具体的には、RBCK1（R
BCC protein interacting with protein kinase C 1；
Biochem. Biophys. Res. Commun. 244:353-359, 199
8）、Apc11（Mol. Biol. Cell 11:2315-2325, 2000）、
BRCA1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369,
1999）、c-cbl（Science 286:309-312, 1999）、c-IAP
1（Science 288:874-877, 2000）、E6AP（J. Biol. Che
m. 273:6439-6445,1998）、IPCO/vmw110（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 98:8815-8820, 2001）、KIAA10（J. B
iol. Chem. 276:1981-1988, 2001）、Mdm2（FEBS Lett.
420:25-27, 1997）、NEDD4（Genes Cells. 3:751-763,
1998）、Parkin（Nat. Genet. 25:302-305, 2000）、P
rajal（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369,
1999）、RNF2（FEBS Lett. 503:61-64, 2001）、Rbx1/
Roc1/Hrt1（Genes Dev. 13:1614-1626, 1999）、Siah-1
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:11364-11369, 199
9）、Smurf2（J. Biol. Chem. 275:3618-3622, 200
0）、Ubr1p（EMBO J. 18:6832-6844, 1999）、XIAP（Sc
ience 288:874-877, 2000）、AO7（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 96:11364-11369, 1999）、Ttch（J. Biol. C
hem. 275:35734-35737, 2000）等が例示できる。さら
に、HECTドメイン(Trends Cell Biol 10:429-439, 200
0)やUボックス（Curr. Biol. 10:R132-34, 2000）を含
むタンパク質もE3酵素として使用することができる。
【００１７】なお、前記のRINGドメイン、HECTドメイ
ン、またはUボックスを有するE3酵素は、基質特異的な
ユビキチン化を可能とするために分子内部に基質結合部
位を備えている。しかし、RINGドメインを有するE3酵素
の一種Parkinなどは変性タンパク質のユビキチン化に関
わっているが、標的タンパク質に対する特異性が低い事
が示唆されている(J Biol Chem. 75:5661-5664, 200
0)。従って、この発明の対象となるユビキチンリガーゼ
は、それ自体の基質結合部位を備えたままであっても、
任意の標的タンパク質結合分子を連結一体化させること
によって、ユビキチンリガーゼが基質とするタンパク質
ではなく、標的タンパク質を細胞内で特異的にユビキチ
ン化する事が可能となる。そして、このユビキチン化さ
れた標的タンパク質は、速やかに細胞内のプロテアソー
ムシステムに認識されて分解排除される。
ン、またはUボックスを有するE3酵素は、基質特異的な
ユビキチン化を可能とするために分子内部に基質結合部
位を備えている。しかし、RINGドメインを有するE3酵素
の一種Parkinなどは変性タンパク質のユビキチン化に関
わっているが、標的タンパク質に対する特異性が低い事
が示唆されている(J Biol Chem. 75:5661-5664, 200
0)。従って、この発明の対象となるユビキチンリガーゼ
は、それ自体の基質結合部位を備えたままであっても、
任意の標的タンパク質結合分子を連結一体化させること
によって、ユビキチンリガーゼが基質とするタンパク質
ではなく、標的タンパク質を細胞内で特異的にユビキチ
ン化する事が可能となる。そして、このユビキチン化さ
れた標的タンパク質は、速やかに細胞内のプロテアソー
ムシステムに認識されて分解排除される。
【００１８】ただし、標的タンパク質に対する特異的結
合性をさらに確実なものとするためには、ユビキチンリ
ガーゼに本来備わっている基質結合部位を欠失または変
異させ、E2酵素との相互作用部位のみを有する改変型ユ
ビキチンリガーゼ分子とすることが好ましい。
合性をさらに確実なものとするためには、ユビキチンリ
ガーゼに本来備わっている基質結合部位を欠失または変
異させ、E2酵素との相互作用部位のみを有する改変型ユ
ビキチンリガーゼ分子とすることが好ましい。
【００１９】この発明のタンパク質分解排除酵素が特異
的に分解排除する標的タンパク質は、生細胞内に存在す
る病因タンパク質である。具体的には、アミロイド繊維
の主成分であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）、
α-シヌクレインおよびパエル受容体由来のタンパク
質、HIV構造タンパク質、CおよびB型肝炎ウイルスの構
造タンパク質、癌遺伝子産物等である。
的に分解排除する標的タンパク質は、生細胞内に存在す
る病因タンパク質である。具体的には、アミロイド繊維
の主成分であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）、
α-シヌクレインおよびパエル受容体由来のタンパク
質、HIV構造タンパク質、CおよびB型肝炎ウイルスの構
造タンパク質、癌遺伝子産物等である。
【００２０】これらの標的タンパク質に対する結合分子
としては、抗体分子やリガンド分子等が好ましい。抗体
分子としては、その全長もしくは一部分（Fab断片、一
本鎖抗体）と抗原認識能を有するそれらの誘導体であ
り、具体的には、アミロイド繊維の主成分であるAPPに
対する一本鎖型モノクローナル抗体、α-シヌクレイン
およびパエル受容体に対する一本鎖型モノクローナル抗
体、HIV構造タンパク質に対する一本鎖型モノクローナ
ル抗体、CおよびB型肝炎ウイルスの構造タンパク質に対
する一本鎖型モノクローナル抗体等が例示される。ま
た、リガンド分子としては、例えば癌関連遺伝子産物
（例えばRET、PDGFα、Ras、c-Jun、c-Fos、c-Myb）を
標的タンパク質とする場合には、以下のタンパク質また
は標的との結合に関与する領域部分を用いることができ
る。すなわち、RETにはGrb2、PDGFαにはp85-PI3Kおよ
びSrc、RasにはRaf、c-JunにはJNK、c-Fosにはc-Jun、c
-Mybにはp160、p100、Cyp40、ATBF1等である。これらの
リガンド分子を結合したユビキチンリガーゼを用いるこ
とによって、標的である癌遺伝子産物を細胞内で特異的
に排除して癌細胞を正常化することができる。さらに、
ウイルスの複製機構に必須のタンパク質（例えばアデノ
ウイルスE1A、エプスタインバーウイルスEBNA-3C、B型
肝炎ウイルスHBX）を標的とする場合には、以下のタン
パク質または標的との結合に関与する領域部分を用いる
ことができる。すなわち、E1AにはRB、p107、p130およ
びp300、EBNA-3CにはNm23-H1、HBXにはPSMA7、PSMC1等
である。これらのリガンド分子を結合したユビキチンリ
ガーゼを用いることによって、ウイルスを細胞内で複製
不可能とすることができ、感染細胞を正常化することが
できる。
としては、抗体分子やリガンド分子等が好ましい。抗体
分子としては、その全長もしくは一部分（Fab断片、一
本鎖抗体）と抗原認識能を有するそれらの誘導体であ
り、具体的には、アミロイド繊維の主成分であるAPPに
対する一本鎖型モノクローナル抗体、α-シヌクレイン
およびパエル受容体に対する一本鎖型モノクローナル抗
体、HIV構造タンパク質に対する一本鎖型モノクローナ
ル抗体、CおよびB型肝炎ウイルスの構造タンパク質に対
する一本鎖型モノクローナル抗体等が例示される。ま
た、リガンド分子としては、例えば癌関連遺伝子産物
（例えばRET、PDGFα、Ras、c-Jun、c-Fos、c-Myb）を
標的タンパク質とする場合には、以下のタンパク質また
は標的との結合に関与する領域部分を用いることができ
る。すなわち、RETにはGrb2、PDGFαにはp85-PI3Kおよ
びSrc、RasにはRaf、c-JunにはJNK、c-Fosにはc-Jun、c
-Mybにはp160、p100、Cyp40、ATBF1等である。これらの
リガンド分子を結合したユビキチンリガーゼを用いるこ
とによって、標的である癌遺伝子産物を細胞内で特異的
に排除して癌細胞を正常化することができる。さらに、
ウイルスの複製機構に必須のタンパク質（例えばアデノ
ウイルスE1A、エプスタインバーウイルスEBNA-3C、B型
肝炎ウイルスHBX）を標的とする場合には、以下のタン
パク質または標的との結合に関与する領域部分を用いる
ことができる。すなわち、E1AにはRB、p107、p130およ
びp300、EBNA-3CにはNm23-H1、HBXにはPSMA7、PSMC1等
である。これらのリガンド分子を結合したユビキチンリ
ガーゼを用いることによって、ウイルスを細胞内で複製
不可能とすることができ、感染細胞を正常化することが
できる。
【００２１】これらの標的タンパク質結合分子は、自然
界に存在するタンパク質、その標的結合領域を構成する
タンパク質断片、またはそのタンパク質もしくは断片と
実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成ペプチド等で
あってもよい。さらに、それらのタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドからの発現産物である組換えタンパ
ク質であってもよい。また、リガンド分子は化合物を利
用することもできる。
界に存在するタンパク質、その標的結合領域を構成する
タンパク質断片、またはそのタンパク質もしくは断片と
実質的に同一のアミノ酸配列からなる合成ペプチド等で
あってもよい。さらに、それらのタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドからの発現産物である組換えタンパ
ク質であってもよい。また、リガンド分子は化合物を利
用することもできる。
【００２２】この発明のタンパク質分解排除酵素は、前
記のユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子とを
公知の方法で共有結合させることによって連結一体化す
ることできる。あるいは、ユビキチンリガーゼにビオチ
ンを連結し、標的タンパク質結合分子にはアビジンを共
有結合させるなどして、それぞれのアビジン−ビオチン
結合を介して両者を連結一体化する方法も採用できる。
標的タンパク質結合分子を直接連結した場合には、ユビ
キチンリガーゼ活性の触媒部位が修飾されてしまう危険
性があるが、このビオチン−アビジン結合を利用するこ
とによって、そのような危険性を回避することができ
る。
記のユビキチンリガーゼと標的タンパク質結合分子とを
公知の方法で共有結合させることによって連結一体化す
ることできる。あるいは、ユビキチンリガーゼにビオチ
ンを連結し、標的タンパク質結合分子にはアビジンを共
有結合させるなどして、それぞれのアビジン−ビオチン
結合を介して両者を連結一体化する方法も採用できる。
標的タンパク質結合分子を直接連結した場合には、ユビ
キチンリガーゼ活性の触媒部位が修飾されてしまう危険
性があるが、このビオチン−アビジン結合を利用するこ
とによって、そのような危険性を回避することができ
る。
【００２３】さらにまた、標的タンパク質結合分子がタ
ンパク質の場合には、ユビキチンリガーゼと標的タンパ
ク質結合分子をそれぞれにコードするポリヌクレオチド
を融合させ、この融合ポリヌクレオチド（第２発明）を
適当な発現ベクターに組み込んで組換えベクター（第３
発明）を構築し、この組換えベクターを宿主細胞で発現
させた融合タンパク質として両者を結合一体化させる方
法も好ましく採用される。
ンパク質の場合には、ユビキチンリガーゼと標的タンパ
ク質結合分子をそれぞれにコードするポリヌクレオチド
を融合させ、この融合ポリヌクレオチド（第２発明）を
適当な発現ベクターに組み込んで組換えベクター（第３
発明）を構築し、この組換えベクターを宿主細胞で発現
させた融合タンパク質として両者を結合一体化させる方
法も好ましく採用される。
【００２４】すなわち、第２発明の融合ポリヌクレオチ
ドは、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレオチ
ドと、標的タンパク質結合分子をコードするポリヌクレ
オチドとを、翻訳枠を一致させて連結することによって
作製することができる。ユビキチンリガーゼをコードす
るポリヌクレオチドは、前記の各ユビキチンリガーゼに
ついてデータベースに登録されているヌクレオチド配列
（例えば、RBCK1：GenBank Accession No. U48248、c-c
bl：GenBank Accession No. NM#005188、AO7：GenBank
Accession No. AF171060等）に基づいて合成したプロー
ブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングする方法
や、合成プライマーを用いたRT-PCR法によって取得する
ことができる。また、入手可能なユビキチンリガーゼcD
NAクローンを利用することもできる。また、標的タンパ
ク質結合分子をコードするポリヌクレオチドも、前記の
抗体やリガンドタンパク質それぞれの公知の配列に基づ
いてcDNAライブラリーをスクリーニングする方法、RT-P
CRによって合成する方法、入手可能なcDNAクローンを利
用する方法等によって取得することができる。
ドは、ユビキチンリガーゼをコードするポリヌクレオチ
ドと、標的タンパク質結合分子をコードするポリヌクレ
オチドとを、翻訳枠を一致させて連結することによって
作製することができる。ユビキチンリガーゼをコードす
るポリヌクレオチドは、前記の各ユビキチンリガーゼに
ついてデータベースに登録されているヌクレオチド配列
（例えば、RBCK1：GenBank Accession No. U48248、c-c
bl：GenBank Accession No. NM#005188、AO7：GenBank
Accession No. AF171060等）に基づいて合成したプロー
ブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングする方法
や、合成プライマーを用いたRT-PCR法によって取得する
ことができる。また、入手可能なユビキチンリガーゼcD
NAクローンを利用することもできる。また、標的タンパ
ク質結合分子をコードするポリヌクレオチドも、前記の
抗体やリガンドタンパク質それぞれの公知の配列に基づ
いてcDNAライブラリーをスクリーニングする方法、RT-P
CRによって合成する方法、入手可能なcDNAクローンを利
用する方法等によって取得することができる。
【００２５】このようにして作製した融合ポリヌクレオ
チドを適当な発現ベクターに挿入結合することによっ
て、第３発明の組換えベクターを構築することができ
る。発現ベクターとしては、インビトロ転写用の発現ベ
クターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細
胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現
ベクターを使用することができる。
チドを適当な発現ベクターに挿入結合することによっ
て、第３発明の組換えベクターを構築することができ
る。発現ベクターとしては、インビトロ転写用の発現ベ
クターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細
胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現
ベクターを使用することができる。
【００２６】そして、このようにして構築した組換えベ
クターからのインビトロ転写や、組換えベクターによる
形質転換細胞の培養物から、融合タンパク質の形態でこ
の発明のタンパク質分解排除酵素を作製することができ
る。
クターからのインビトロ転写や、組換えベクターによる
形質転換細胞の培養物から、融合タンパク質の形態でこ
の発明のタンパク質分解排除酵素を作製することができ
る。
【００２７】すなわち、タンパク質分解排除酵素をイン
ビトロ翻訳で発現させる場合には、前記の有望ポリヌク
レオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベ
クターに挿入して組換えベクターを作製する。このベク
ターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含
むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのイン
ビトロ翻訳系に添加すれば、タンパク質分解排除酵素を
インビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼ
プロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示でき
る。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベク
ターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pB
luescript IIなどが例示できる。
ビトロ翻訳で発現させる場合には、前記の有望ポリヌク
レオチドを、RNAポリメラーゼプロモーターを有するベ
クターに挿入して組換えベクターを作製する。このベク
ターを、プロモーターに対応するRNAポリメラーゼを含
むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのイン
ビトロ翻訳系に添加すれば、タンパク質分解排除酵素を
インビトロで生産することができる。RNAポリメラーゼ
プロモーターとしては、T7、T3、SP6などが例示でき
る。これらのRNAポリメラーゼプロモーターを含むベク
ターとしては、pKA1、pCDM8、pT3/T7 18、pT7/3 19、pB
luescript IIなどが例示できる。
【００２８】タンパク質分解排除酵素を、大腸菌などの
微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオ
リジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクロ
ーニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクター
に前記の融合ポリヌクレオチドを組換えて発現ベクター
を作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換す
れば、タンパク質分解排除酵素を発現する形質転換体細
胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、そ
の培養物からこの発明のタンパク質分解排除酵素を大量
生産することができる。大腸菌用発現ベクターとして
は、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発
現システムなどが例示できる。
微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオ
リジン、プロモーター、リボソーム結合部位、DNAクロ
ーニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクター
に前記の融合ポリヌクレオチドを組換えて発現ベクター
を作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換す
れば、タンパク質分解排除酵素を発現する形質転換体細
胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、そ
の培養物からこの発明のタンパク質分解排除酵素を大量
生産することができる。大腸菌用発現ベクターとして
は、pUC系、pBluescript II、pET発現システム、pGEX発
現システムなどが例示できる。
【００２９】さらに、タンパク質分解排除酵素を真核細
胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチド
を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加
部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換
えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導
入すれば、この発明のタンパク質分解排除酵素を発現す
る形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクター
としては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CM
V、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示でき
る。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル
腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOな
どの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した
初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、
カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用でき
る。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、
リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン
法など公知の方法を用いることができる。
胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチド
を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加
部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換
えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導
入すれば、この発明のタンパク質分解排除酵素を発現す
る形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクター
としては、pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CM
V、pBK-RSV、EBVベクター、pRS、pYES2などが例示でき
る。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞HEK293、サル
腎臓細胞COS7、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOな
どの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した
初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、
カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用でき
る。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、
リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン
法など公知の方法を用いることができる。
【００３０】形質転換細胞で発現させた融合タンパク質
（タンパク質分解排除酵素）を単離精製するためには、
公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例え
ば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波
処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
（タンパク質分解排除酵素）を単離精製するためには、
公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例え
ば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波
処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィーなどが挙げられる。
【００３１】なお、細胞で発現したタンパク質は、翻訳
された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。した
がって、修飾されたタンパク質もこの発明のタンパク質
分解排除酵素の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾
としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル
化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミ
リストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。した
がって、修飾されたタンパク質もこの発明のタンパク質
分解排除酵素の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾
としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル
化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミ
リストイル化、イソプレニル化、リン酸化などである。
【００３２】第４発明の治療用製剤は、前記のタンパク
質分解排除酵素、または前記の組換えベクターが生細胞
内に導入可能な形態を有する治療用製剤である。この薬
剤の治療対象は、神経細胞内への不要タンパク質の蓄積
を原因とするアルツハイマー病、パーキンソン病、クロ
イツフェルトヤコブ病、あるいはAIDS、C型肝炎、B型肝
炎等のウイルス感染症、癌等である。
質分解排除酵素、または前記の組換えベクターが生細胞
内に導入可能な形態を有する治療用製剤である。この薬
剤の治療対象は、神経細胞内への不要タンパク質の蓄積
を原因とするアルツハイマー病、パーキンソン病、クロ
イツフェルトヤコブ病、あるいはAIDS、C型肝炎、B型肝
炎等のウイルス感染症、癌等である。
【００３３】タンパク質分解排除酵素を生細胞内に導入
する場合には、この酵素の構造や機能を変更することな
く、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのタンパク
質分解排除酵素を混合し、例えばマイクロインジェクシ
ョン法により細胞内に導入する。あるいは、最近開発さ
れた脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Therap
y Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米
国）等）を採用することもできる。
する場合には、この酵素の構造や機能を変更することな
く、かつ薬理学的に許容される担体溶液にこのタンパク
質分解排除酵素を混合し、例えばマイクロインジェクシ
ョン法により細胞内に導入する。あるいは、最近開発さ
れた脂質による細胞内導入法（BioPORTER（Gene Therap
y Systems社、米国）、Chariot（Active Motif社、米
国）等）を採用することもできる。
【００３４】また、組換えベクターを生細胞内に導入し
て、このベクターからタンパク質分解排除酵素を発現さ
せる場合には、ベクターを、生体認識分子を提示した中
空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス等に組み込み、遺伝子治療の手法により生
体内に導入発現させることもできる。
て、このベクターからタンパク質分解排除酵素を発現さ
せる場合には、ベクターを、生体認識分子を提示した中
空ナノ粒子、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス等に組み込み、遺伝子治療の手法により生
体内に導入発現させることもできる。
【００３５】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３６】
【実施例】実施例１：RBCK1のユビキチンリガーゼ活性
（RBCK1はE3酵素であることの動物細胞内での証明）両
端にEcoRI切断部位を有するプライマーセットを用い
て、ラット脳cDNAライブラリーを鋳型とするPCRによ
り、RBCK1遺伝子全長をコードするDNA断片を増幅した。
遺伝子断片はpGEM-T Easy vector(Promega社、米国)に
サブクローニングした後、塩基配列をDNA Sequencer Mo
del377A（PE Applied Biosytems社、米国）を用いて確
認した。次に、プラスミドをEcoRIで切断して、RBCK1遺
伝子断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。一
方、動物細胞用汎用発現ベクターpTB701FL（J. Biol. C
hem. 271:31029-31032, 1996）をEcoRIで開裂させたも
のを用意し、上記遺伝子断片と閉環結合させた。その結
果、得られたプラスミドはアミノ末端側にFLAG（以下F
L）エピトープタグを融合したRBCK1（以下FL-RBCK1と
略）を動物細胞内で発現することが出来るもので、pTB7
01-FL-RBCK1と命名した。
（RBCK1はE3酵素であることの動物細胞内での証明）両
端にEcoRI切断部位を有するプライマーセットを用い
て、ラット脳cDNAライブラリーを鋳型とするPCRによ
り、RBCK1遺伝子全長をコードするDNA断片を増幅した。
遺伝子断片はpGEM-T Easy vector(Promega社、米国)に
サブクローニングした後、塩基配列をDNA Sequencer Mo
del377A（PE Applied Biosytems社、米国）を用いて確
認した。次に、プラスミドをEcoRIで切断して、RBCK1遺
伝子断片をアガロースゲル電気泳動により回収した。一
方、動物細胞用汎用発現ベクターpTB701FL（J. Biol. C
hem. 271:31029-31032, 1996）をEcoRIで開裂させたも
のを用意し、上記遺伝子断片と閉環結合させた。その結
果、得られたプラスミドはアミノ末端側にFLAG（以下F
L）エピトープタグを融合したRBCK1（以下FL-RBCK1と
略）を動物細胞内で発現することが出来るもので、pTB7
01-FL-RBCK1と命名した。
【００３７】10%ウシ胎児血清（FBS）を含むD-MEM（Dul
becco改変型Eagle培地）を入れた10cm径プラスチックシ
ャーレ（Corning社、米国）に、対数増殖期のHEK293細
胞を約1×106 cells/dishになるように播種し、37℃、5
% CO2存在下で静置した。翌日、常法に従い細胞を回収
し、0.5mlのPBS（リン酸バッファー）で懸濁した後、10
gのpTB701-FL-RBCK1と共に４mm間隔のキュベット（Bio-
Rad社）に入れ、GenePulser II（Bio-Rad社、米国）を
用いて220V, 950Fの条件でエレクトロポレーションを行
った。この細胞浮遊液の1/3ずつを、10mlの10% FBSを含
むD-MEM培地を入れた10 cm径プラスチックシャーレ3枚
へ分注した。37℃、5% CO2存在下で48時間培養後、セル
スクレーパーを用いて細胞を剥ぎ取り、細胞溶解液（50
mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5mM DTT, 150mM NaCl, 0.5% N
onidet P-40, Completeプロテアーゼインヒビターカク
テル（Roche社、ドイツ）１錠/50ml）を1ml加えて、細
胞を溶解した。この溶解液を15,000×gで10分間遠心
し、上清を細胞粗抽出液とした。この細胞粗抽出液を用
いてSDS-PAGE電気泳動を行い、抗FLAG M2抗体（Sigma
社、米国）を用いたウェスタンブロット法により、約58
kDaのFL-RBCK1タンパク質の発現を確認した。
becco改変型Eagle培地）を入れた10cm径プラスチックシ
ャーレ（Corning社、米国）に、対数増殖期のHEK293細
胞を約1×106 cells/dishになるように播種し、37℃、5
% CO2存在下で静置した。翌日、常法に従い細胞を回収
し、0.5mlのPBS（リン酸バッファー）で懸濁した後、10
gのpTB701-FL-RBCK1と共に４mm間隔のキュベット（Bio-
Rad社）に入れ、GenePulser II（Bio-Rad社、米国）を
用いて220V, 950Fの条件でエレクトロポレーションを行
った。この細胞浮遊液の1/3ずつを、10mlの10% FBSを含
むD-MEM培地を入れた10 cm径プラスチックシャーレ3枚
へ分注した。37℃、5% CO2存在下で48時間培養後、セル
スクレーパーを用いて細胞を剥ぎ取り、細胞溶解液（50
mM Tris-HCl (pH7.5), 0.5mM DTT, 150mM NaCl, 0.5% N
onidet P-40, Completeプロテアーゼインヒビターカク
テル（Roche社、ドイツ）１錠/50ml）を1ml加えて、細
胞を溶解した。この溶解液を15,000×gで10分間遠心
し、上清を細胞粗抽出液とした。この細胞粗抽出液を用
いてSDS-PAGE電気泳動を行い、抗FLAG M2抗体（Sigma
社、米国）を用いたウェスタンブロット法により、約58
kDaのFL-RBCK1タンパク質の発現を確認した。
【００３８】上記プラスミドpTB701-FL-RBCK1(10mg)と
アミノ末端側にHAエピトープタグを付加したユビキチン
(HA-Ubiquitin)を発現させるプラスミドpcDNA(+)-HA-Ub
iquitin (5g)をエレクトロポレーションにより、約1×1
06個のHEK293細胞へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40
時間培養後、プロテアソーム阻害剤MG132 (Peptide研、
日本)のDMSO溶液（50mM）を最終濃度50Mになるように培
地に添加した。MG132添加後3-8時間、上記の方法に従い
細胞粗抽出液を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗F
LAG M2抗体10mgを加えた後、4℃で１時間静置した。次
に、50%スラリーのProtein G Sepharose 4 Fastflow
（Amersham-Pharmacia社、スウェーデン）を30l加え、4
℃で1時間混合した。300×gで遠心後、Protein G Sepha
rose画分を回収し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作
を３回繰り返した。Protein G SepharoseにSDS-PAGE用
ローディングバッファー30lを加えて、100℃、10分間煮
沸した後、上清20lを用いてSDS-PAGE電気泳動を行った
後、抗HA(12C5)抗体（Roche社、ドイツ）を用いたウェ
スタンブロット法によりFL-RBCK1に結合したユビキチン
化タンパク質を確認した（図１）。 実施例２：精製RBCK1の取得 実施例１で作成したFL-RBCK1遺伝子断片（両端はEcoR
I）を、GST（グルタチオンS転移酵素）融合タンパク質
発現ベクターpGEX-6P-1（Amersham-Pharmacia社、スウ
ェーデン）のEcoRI切断部位に導入し、プラスミドpGEX-
6P-1-RBCK1を得て、大腸菌BL21-CodonPlus-RP株(Strata
gene社、米国)に導入した。この形質転換体を400mLの1m
M塩化亜鉛を含むLB液体培地（トリプトン 10g/L, 酵母
抽出物 5g/L,NaCl 5g/L）を用いて37℃で培養し、OD600
=0.5に達した時に最終濃度50mMになるようにIPTGを加え
た。その後、さらに17℃で15時間培養し、菌体を遠心に
より回収した。菌体を1% Tween20を含むPBSバッファー6
mLで菌体を懸濁した後、超音波破砕機Auto Chaser 300
（海上電気、日本）を用いて破砕し、10,000×gで15分
間遠心を行った。得られた上清に50%スラリーのGlutath
ion Sepharose 4B （Amersham-Pharmacia社、スウェー
デン）200μLを加えた。４℃で１時間振盪した後、500
×gで遠心して樹脂を回収し、1% Tween20を含むPBSで３
回洗浄操作を繰り返した。さらに、50mM Tris-HCl (pH
8.0)で洗浄した後、GSTタンパク溶出液（50mM Tris-HCl
(pH8.0), 10mM 還元型グルタチオン）400μLを加えて2
5℃で５分間静置した。次に500×gで遠心して、上清を
回収して精製GST-RBCK1（アミノ末端側にGSTを融合した
RBCK1）を得た。GST-RBCK1の純度は、SDS-PAGEで分画し
た後、CBB染色にて確認した。 実施例３：精製RBCK1を用いた試験管内ユビキチン化反応（RBCK1は
E3であることの試験管内での証明） GST融合タンパク質発現ベクター（Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）に、プロテインキナーゼA（cAMP依
存性プロテインキナーゼ）のリン酸化部位をGSTとUbiqu
itinの間のリンカー部位にコードするGST-Ubiquitin遺
伝子を導入し、プラスミドpGEX-2TK-Ubiquitinを得た。
同プラスミドを大腸菌BL21-CodonPlus-RP株に導入し
た。この形質転換体を400mLのLB液体培地を用いて37℃
で培養し、OD6 00=0.5に達した時に最終濃度100mMになる
ようにIPTGを加えた。さらにその後、17℃で15時間培養
し、菌体を遠心により回収し、1% Tween20を含むPBSバ
ッファー6mLで菌体を懸濁した。超音波破砕機Auto Chas
er 300（海上電気、日本）を用いて菌体を破砕し、10,0
00×gで15分間遠心を行った。得られた上清に50%スラリ
ーのGlutathion Sepharose 4B （Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）200μLを加えた。４℃で１時間振盪
した後、500×gで遠心して樹脂を回収し、1% Tween20を
含むPBSで３回洗浄操作を繰り返した。さらに、HMK緩衝
溶液（20mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 12mM 塩化
マグネシウム）200μLで洗浄した後、タンパク質リン酸
化酵素溶液（20mM Tris-HCl (pH7.5), 100mM NaCl, 12m
M 塩化マグネシウム、50 unit プロテインキナーゼA (S
igma社、米国)、0.2mM [g-32P]ATP (2500 cpm/pmol)）1
20μLを加えて、4℃で30分間静置し、500×gで遠心した
後、沈殿を回収した。次に、PBS 500μLの洗浄を３回繰
り返した後、GSTタンパク溶出液（50mM Tris-HCl (pH8.
0), 10mM 還元型グルタチオン）400μLを加えて25℃で
５分間静置した。遠心500×gによって上清を回収し、精
製32P標識GST-Ubiquitinを得た。この画分を１μl取
り、液体シンチレーションカウンターLS6500（Beckmann
社、米国）で20,000cpm以上の放射活性を有することを
確認した。
アミノ末端側にHAエピトープタグを付加したユビキチン
(HA-Ubiquitin)を発現させるプラスミドpcDNA(+)-HA-Ub
iquitin (5g)をエレクトロポレーションにより、約1×1
06個のHEK293細胞へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40
時間培養後、プロテアソーム阻害剤MG132 (Peptide研、
日本)のDMSO溶液（50mM）を最終濃度50Mになるように培
地に添加した。MG132添加後3-8時間、上記の方法に従い
細胞粗抽出液を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗F
LAG M2抗体10mgを加えた後、4℃で１時間静置した。次
に、50%スラリーのProtein G Sepharose 4 Fastflow
（Amersham-Pharmacia社、スウェーデン）を30l加え、4
℃で1時間混合した。300×gで遠心後、Protein G Sepha
rose画分を回収し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作
を３回繰り返した。Protein G SepharoseにSDS-PAGE用
ローディングバッファー30lを加えて、100℃、10分間煮
沸した後、上清20lを用いてSDS-PAGE電気泳動を行った
後、抗HA(12C5)抗体（Roche社、ドイツ）を用いたウェ
スタンブロット法によりFL-RBCK1に結合したユビキチン
化タンパク質を確認した（図１）。 実施例２：精製RBCK1の取得 実施例１で作成したFL-RBCK1遺伝子断片（両端はEcoR
I）を、GST（グルタチオンS転移酵素）融合タンパク質
発現ベクターpGEX-6P-1（Amersham-Pharmacia社、スウ
ェーデン）のEcoRI切断部位に導入し、プラスミドpGEX-
6P-1-RBCK1を得て、大腸菌BL21-CodonPlus-RP株(Strata
gene社、米国)に導入した。この形質転換体を400mLの1m
M塩化亜鉛を含むLB液体培地（トリプトン 10g/L, 酵母
抽出物 5g/L,NaCl 5g/L）を用いて37℃で培養し、OD600
=0.5に達した時に最終濃度50mMになるようにIPTGを加え
た。その後、さらに17℃で15時間培養し、菌体を遠心に
より回収した。菌体を1% Tween20を含むPBSバッファー6
mLで菌体を懸濁した後、超音波破砕機Auto Chaser 300
（海上電気、日本）を用いて破砕し、10,000×gで15分
間遠心を行った。得られた上清に50%スラリーのGlutath
ion Sepharose 4B （Amersham-Pharmacia社、スウェー
デン）200μLを加えた。４℃で１時間振盪した後、500
×gで遠心して樹脂を回収し、1% Tween20を含むPBSで３
回洗浄操作を繰り返した。さらに、50mM Tris-HCl (pH
8.0)で洗浄した後、GSTタンパク溶出液（50mM Tris-HCl
(pH8.0), 10mM 還元型グルタチオン）400μLを加えて2
5℃で５分間静置した。次に500×gで遠心して、上清を
回収して精製GST-RBCK1（アミノ末端側にGSTを融合した
RBCK1）を得た。GST-RBCK1の純度は、SDS-PAGEで分画し
た後、CBB染色にて確認した。 実施例３：精製RBCK1を用いた試験管内ユビキチン化反応（RBCK1は
E3であることの試験管内での証明） GST融合タンパク質発現ベクター（Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）に、プロテインキナーゼA（cAMP依
存性プロテインキナーゼ）のリン酸化部位をGSTとUbiqu
itinの間のリンカー部位にコードするGST-Ubiquitin遺
伝子を導入し、プラスミドpGEX-2TK-Ubiquitinを得た。
同プラスミドを大腸菌BL21-CodonPlus-RP株に導入し
た。この形質転換体を400mLのLB液体培地を用いて37℃
で培養し、OD6 00=0.5に達した時に最終濃度100mMになる
ようにIPTGを加えた。さらにその後、17℃で15時間培養
し、菌体を遠心により回収し、1% Tween20を含むPBSバ
ッファー6mLで菌体を懸濁した。超音波破砕機Auto Chas
er 300（海上電気、日本）を用いて菌体を破砕し、10,0
00×gで15分間遠心を行った。得られた上清に50%スラリ
ーのGlutathion Sepharose 4B （Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）200μLを加えた。４℃で１時間振盪
した後、500×gで遠心して樹脂を回収し、1% Tween20を
含むPBSで３回洗浄操作を繰り返した。さらに、HMK緩衝
溶液（20mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 12mM 塩化
マグネシウム）200μLで洗浄した後、タンパク質リン酸
化酵素溶液（20mM Tris-HCl (pH7.5), 100mM NaCl, 12m
M 塩化マグネシウム、50 unit プロテインキナーゼA (S
igma社、米国)、0.2mM [g-32P]ATP (2500 cpm/pmol)）1
20μLを加えて、4℃で30分間静置し、500×gで遠心した
後、沈殿を回収した。次に、PBS 500μLの洗浄を３回繰
り返した後、GSTタンパク溶出液（50mM Tris-HCl (pH8.
0), 10mM 還元型グルタチオン）400μLを加えて25℃で
５分間静置した。遠心500×gによって上清を回収し、精
製32P標識GST-Ubiquitinを得た。この画分を１μl取
り、液体シンチレーションカウンターLS6500（Beckmann
社、米国）で20,000cpm以上の放射活性を有することを
確認した。
【００３９】上記精製32P標識GST-Ubiquitin 60,000cp
m、精製ユビキチン活性化酵素E１（Boston Biochem社、
米国）100ng、精製ユビキチン転移酵素UbcH7（Boston B
iochem社、米国） 400ng、精製GST-RBCK1 3μgをユビキ
チン化反応溶液（50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM 塩化マ
グネシウム、2mM ATP）に混合し、30℃で1.5時間反応さ
せた。次に、反応液全量をSDS-PAGEで分画し、ホスホイ
メージャーCyclone（Packard社、米国）でオートラジオ
グラフを測定し、GST-RBCK1によりRBCK1へisopeptide結
合されたUbiquitin多量体の存在を検出した（図２）。 実施例４：一本鎖抗体融合によるRBCK1特異性の改変（１） (E3のユビキチン化反応の特異性を抗体付加により変更
できることの試験管内での証明) 抗ヒト血清アルブミン一本鎖抗体（以後ScFv（HSA））
遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB5E-TZA22を鋳型とし
て、SalI切断部位を有するプライマーとEcoRV/XhoI切断
部位を有するプライマーを使用するPCRにより、ScFv(HS
A)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy vectorにサブクローニ
ングしてpGEM-T-ScFv(HSA)を得た。一方、pTB701-FL-RB
CK1（前出）を鋳型として、EcoRV切断部位を有するプラ
イマーとXhoI切断部位を有するプライマーを用いたPCR
により、RBCK1遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy vectorに
サブクローニングしてpGEM-T-RBCK1を得た。次に、pGEM
-T-RBCK1をEcoRVおよびXhoIで開裂して、RBCK1遺伝子断
片を取り出し、EcoRVおよびXhoIで開裂したpGEM-T-ScFv
(HSA)に導入して、プラスミドpGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1
を得た。最後に、pGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1をSalIおよび
XｈoIで開裂して、ScFv(HSA)-RBCK1遺伝子断片を取り出
し、同じ制限酵素で開裂させたpGEX-6P-1に導入してプ
ラスミドpGEX-6P-1- ScFv(HSA)-RBCK1を得た。このプラ
スミドを大腸菌BL21-CodonPlus-RP株(Stratagene社、
国)に導入し、400mLの1mM塩化亜鉛 を含む LB液体培地
（トリプトン 10g/L, 酵母抽出物 5g/L, NaCl 5g/L）を
用いて37℃で培養し、実施例２記載の方法に従い、精製
GST-ScFv(HSA)-RBCK1（アミノ末端にGSTおよび抗HSA一
本鎖抗体を融合したRBCK1）を得た。GST-ScFv(HSA)-RBC
K1の純度は、SDS-PAGEで分画した後、CBB染色によって
確認した。
m、精製ユビキチン活性化酵素E１（Boston Biochem社、
米国）100ng、精製ユビキチン転移酵素UbcH7（Boston B
iochem社、米国） 400ng、精製GST-RBCK1 3μgをユビキ
チン化反応溶液（50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM 塩化マ
グネシウム、2mM ATP）に混合し、30℃で1.5時間反応さ
せた。次に、反応液全量をSDS-PAGEで分画し、ホスホイ
メージャーCyclone（Packard社、米国）でオートラジオ
グラフを測定し、GST-RBCK1によりRBCK1へisopeptide結
合されたUbiquitin多量体の存在を検出した（図２）。 実施例４：一本鎖抗体融合によるRBCK1特異性の改変（１） (E3のユビキチン化反応の特異性を抗体付加により変更
できることの試験管内での証明) 抗ヒト血清アルブミン一本鎖抗体（以後ScFv（HSA））
遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB5E-TZA22を鋳型とし
て、SalI切断部位を有するプライマーとEcoRV/XhoI切断
部位を有するプライマーを使用するPCRにより、ScFv(HS
A)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy vectorにサブクローニ
ングしてpGEM-T-ScFv(HSA)を得た。一方、pTB701-FL-RB
CK1（前出）を鋳型として、EcoRV切断部位を有するプラ
イマーとXhoI切断部位を有するプライマーを用いたPCR
により、RBCK1遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy vectorに
サブクローニングしてpGEM-T-RBCK1を得た。次に、pGEM
-T-RBCK1をEcoRVおよびXhoIで開裂して、RBCK1遺伝子断
片を取り出し、EcoRVおよびXhoIで開裂したpGEM-T-ScFv
(HSA)に導入して、プラスミドpGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1
を得た。最後に、pGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1をSalIおよび
XｈoIで開裂して、ScFv(HSA)-RBCK1遺伝子断片を取り出
し、同じ制限酵素で開裂させたpGEX-6P-1に導入してプ
ラスミドpGEX-6P-1- ScFv(HSA)-RBCK1を得た。このプラ
スミドを大腸菌BL21-CodonPlus-RP株(Stratagene社、
国)に導入し、400mLの1mM塩化亜鉛 を含む LB液体培地
（トリプトン 10g/L, 酵母抽出物 5g/L, NaCl 5g/L）を
用いて37℃で培養し、実施例２記載の方法に従い、精製
GST-ScFv(HSA)-RBCK1（アミノ末端にGSTおよび抗HSA一
本鎖抗体を融合したRBCK1）を得た。GST-ScFv(HSA)-RBC
K1の純度は、SDS-PAGEで分画した後、CBB染色によって
確認した。
【００４０】上記精製32P標識GST-Ubiquitin 60000cp
m、精製ユビキチン活性化酵素E１（Boston Biochem社、
米国）100ng、精製ユビキチン転移酵素UbcH7（Boston B
iochem社、米国）400ng、精製GST-ScFv(HSA)-RBCK1 3μ
g、HSA（Calbiochem社、米国）1μgをユビキチン化反応
溶液（50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM 塩化マグネシウ
ム、2mM ATP）に混合し、30℃で1.5時間反応させた。次
に、抗HSA抗体(CedarlaneLaboratories社、カナダ) 5l
を加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリ
ーのProtein G Sepharose 4 Fastflowを30l加え、４℃
で１時間混合した。300×gで遠心後、Protein G Sephar
ose画分を回収し、細胞溶解液を0.5 ml加える洗浄操作
を３回繰り返した。Protein G Sepharose画分にSDS-PAG
E用ローディングバーファー30lを加えて、100℃、10分
間煮沸した後、上清20lを用いてSDS-PAGE電気泳動を行
い、ホスホイメージャーCyclone（Packard社、米国）で
オートラジオグラフを取り、GST-ScFv(HSA)-RBCK1によ
りHSAへisopeptide結合されたUbiquitin多量体の存在を
検出した。陰性対照としてGST-RBCK1を用いたが、HSAに
対する顕著なUbiquitin多量体の生成は観察されなかっ
た。 実施例５：一本鎖抗体融合によるRBCK1特異性の改変（２） (E3のユビキチン化反応の特異性を抗体付加により変更
できることの動物細胞内での証明) pGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1を鋳型にして、EcoRI切断部位
を有するプライマーとBglII切断部位を有するプライマ
ーを用いたPCRにより、ScFv(HSA)-RBCK1遺伝子を増幅
し、実施例１の方法に従ってpTB701-FLのEcoRIおよびBg
lII切断部位に導入した。次に、得られたプラスミドpTB
701-FL -ScFv(HSA)-RBCK1をヒト肝癌由来細胞HepG2細胞
に導入し、同細胞内でScFv(HSA)-RBCK1を発現させた
（分子マス86ｋDa）。
m、精製ユビキチン活性化酵素E１（Boston Biochem社、
米国）100ng、精製ユビキチン転移酵素UbcH7（Boston B
iochem社、米国）400ng、精製GST-ScFv(HSA)-RBCK1 3μ
g、HSA（Calbiochem社、米国）1μgをユビキチン化反応
溶液（50mM Tris-HCl (pH7.5)、5mM 塩化マグネシウ
ム、2mM ATP）に混合し、30℃で1.5時間反応させた。次
に、抗HSA抗体(CedarlaneLaboratories社、カナダ) 5l
を加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリ
ーのProtein G Sepharose 4 Fastflowを30l加え、４℃
で１時間混合した。300×gで遠心後、Protein G Sephar
ose画分を回収し、細胞溶解液を0.5 ml加える洗浄操作
を３回繰り返した。Protein G Sepharose画分にSDS-PAG
E用ローディングバーファー30lを加えて、100℃、10分
間煮沸した後、上清20lを用いてSDS-PAGE電気泳動を行
い、ホスホイメージャーCyclone（Packard社、米国）で
オートラジオグラフを取り、GST-ScFv(HSA)-RBCK1によ
りHSAへisopeptide結合されたUbiquitin多量体の存在を
検出した。陰性対照としてGST-RBCK1を用いたが、HSAに
対する顕著なUbiquitin多量体の生成は観察されなかっ
た。 実施例５：一本鎖抗体融合によるRBCK1特異性の改変（２） (E3のユビキチン化反応の特異性を抗体付加により変更
できることの動物細胞内での証明) pGEM-T-ScFv(HSA)-RBCK1を鋳型にして、EcoRI切断部位
を有するプライマーとBglII切断部位を有するプライマ
ーを用いたPCRにより、ScFv(HSA)-RBCK1遺伝子を増幅
し、実施例１の方法に従ってpTB701-FLのEcoRIおよびBg
lII切断部位に導入した。次に、得られたプラスミドpTB
701-FL -ScFv(HSA)-RBCK1をヒト肝癌由来細胞HepG2細胞
に導入し、同細胞内でScFv(HSA)-RBCK1を発現させた
（分子マス86ｋDa）。
【００４１】実施例１の方法に従い、pTB701-FL-ScFv(H
SA)-RBCK1をエレクトロポレーション法によりHepG2細胞
へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40時間培養後、プロ
テアソーム阻害剤MG132 (Peptide研) のDMSO溶液（50m
M）を最終濃度50Mになるように培地に添加した。MG132
添加後8時間、上記の方法に従い細胞粗抽出液を作成し
た。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2抗体10gを加え
た後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリーのPro
tein G Sepharose 4 Fastflow （Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）を30l加え、４℃で１時間混合し
た。300×gで遠心後、Protein G Sepharose画分を回収
し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰り返し
た。Protein G Sepharose画分にSDS-PAGE用ローディン
グバッファー30mlを加えて、100℃、10分間煮沸した
後、上清20lを用いてSDS-PAGEを行った。抗HSA抗体(Ced
arlane Laboratories社、カナダ)を用いたウェスタンブ
ロット法によりFL-ScFv(HSA)-RBCK1に結合したユビキチ
ン化HSAを確認した。陰性対照としてpTB701-FL-RBCK1に
より発現させたFL-RBCK1を用いたが、HSAに対する顕著
なUbiquitin多量体の生成は観察されなかった。 実施例６：一本鎖抗体を融合したRBCK1による細胞内タンパク質の
選択的除去 抗オワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質(GFP)一本鎖抗
体（以後ScFv（GFP））遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB
5E-TZ-GFPを鋳型として、SalI切断部位を有するプライ
マーとEcoRV/XhoI切断部位を有するプライマーを使用す
るPCRにより、ScFv(GFP)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy
vectorにサブクローニングしてpGEM-T-ScFv(GFP)を得
た。次に、pGEM-T-RBCK1(前出)をEcoRVおよびXhoIで開
裂して、RBCK1遺伝子断片を取り出し、EcoRVおよびXhoI
で開裂したpGEM-T-ScFv(GFP)に導入して、プラスミドpG
EM-T-ScFv(GFP)-RBCK1を得た。pGEM-T-ScFv(GFP)-RBCK1
を鋳型にして、EcoRI切断部位を有するプライマーとBgl
II切断部位を有するプライマーを用いたPCRにより、ScF
v(GFP)-RBCK1遺伝子を増幅し、実施例１の方法に従って
pTB701-FLのEcoRIおよびBglII切断部位に導入した。次
に、得られたプラスミドpTB701-FL -ScFv(GFP)-RBCK1を
HEK293細胞に導入し、同細胞内でScFv(GFP)-RBCK1を発
現させた（分子マス86ｋDa）。
SA)-RBCK1をエレクトロポレーション法によりHepG2細胞
へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40時間培養後、プロ
テアソーム阻害剤MG132 (Peptide研) のDMSO溶液（50m
M）を最終濃度50Mになるように培地に添加した。MG132
添加後8時間、上記の方法に従い細胞粗抽出液を作成し
た。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2抗体10gを加え
た後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリーのPro
tein G Sepharose 4 Fastflow （Amersham-Pharmacia
社、スウェーデン）を30l加え、４℃で１時間混合し
た。300×gで遠心後、Protein G Sepharose画分を回収
し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰り返し
た。Protein G Sepharose画分にSDS-PAGE用ローディン
グバッファー30mlを加えて、100℃、10分間煮沸した
後、上清20lを用いてSDS-PAGEを行った。抗HSA抗体(Ced
arlane Laboratories社、カナダ)を用いたウェスタンブ
ロット法によりFL-ScFv(HSA)-RBCK1に結合したユビキチ
ン化HSAを確認した。陰性対照としてpTB701-FL-RBCK1に
より発現させたFL-RBCK1を用いたが、HSAに対する顕著
なUbiquitin多量体の生成は観察されなかった。 実施例６：一本鎖抗体を融合したRBCK1による細胞内タンパク質の
選択的除去 抗オワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質(GFP)一本鎖抗
体（以後ScFv（GFP））遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB
5E-TZ-GFPを鋳型として、SalI切断部位を有するプライ
マーとEcoRV/XhoI切断部位を有するプライマーを使用す
るPCRにより、ScFv(GFP)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy
vectorにサブクローニングしてpGEM-T-ScFv(GFP)を得
た。次に、pGEM-T-RBCK1(前出)をEcoRVおよびXhoIで開
裂して、RBCK1遺伝子断片を取り出し、EcoRVおよびXhoI
で開裂したpGEM-T-ScFv(GFP)に導入して、プラスミドpG
EM-T-ScFv(GFP)-RBCK1を得た。pGEM-T-ScFv(GFP)-RBCK1
を鋳型にして、EcoRI切断部位を有するプライマーとBgl
II切断部位を有するプライマーを用いたPCRにより、ScF
v(GFP)-RBCK1遺伝子を増幅し、実施例１の方法に従って
pTB701-FLのEcoRIおよびBglII切断部位に導入した。次
に、得られたプラスミドpTB701-FL -ScFv(GFP)-RBCK1を
HEK293細胞に導入し、同細胞内でScFv(GFP)-RBCK1を発
現させた（分子マス86ｋDa）。
【００４２】実施例１の方法に従い、pTB701-FL-ScFv(G
FP)-RBCK1と動物細胞用GFP発現ベクターｐTB701-GFPを
エレクトロポレーション法によりHEK293細胞へ導入し
た。37℃、5% CO2存在下で40時間培養した後、プロテア
ソーム阻害剤MG132(Peptide研、日本)のDMSO溶液（50m
M）を最終濃度50Mになるように培地に添加した。MG132
添加後、さらに8時間培養し、上記の方法に従い細胞粗
抽出液を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2
抗体10gを加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%
スラリーのProtein G Sepharose 4 Fastflow（Amersham
-Pharmacia社、スウェーデン）を30l加え、４℃で１時
間混合した。300×gで遠心後、Protein GSepharose画分
を回収し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰
り返した。Protein G Sepharose画分にSDS-PAGE用ロー
ディングバッファー30mlを加えて、100℃、10分間煮沸
した後、上清20lを用いてSDS-PAGEを行い、抗GFP抗体(C
lontech社、米国)を用いたウェスタンブロット法により
FL-ScFv(GFP)-RBCK1に結合したユビキチン化GFPを確認
した。陰性対照としてpTB701-FL-RBCK1によるFL-RBCK1
を用いたが、GFPに対する顕著なUbiquitin多量体の生成
は観察されなかった。また、MG132添加前に共焦点レー
ザー顕微鏡（PASCAL5、Carl Zeiss社、ドイツ）で、FL-
ScFv(GFP)-RBCK1とGFPを共発現する細胞の蛍光を測定し
たところ、陰性対照のFL-RBCK1とGFPを共発現する細胞
よりも著しく蛍光量が減少していた。これは、改変型RB
CK1によりGFPがポリユビキチン化を受けて、細胞内で積
極的に排除されたことを示している。 実施例７：一本鎖抗体を融合したRBCK1によるウイルスタンパク質
の選択的除去 抗B型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）一本鎖抗体（以後
ScFv（HBsAg））遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB5E-TZ-
HBsAgを鋳型として、SalI切断部位を有するプライマー
とEcoRV/XhoI切断部位を有するプライマーを使用するPC
Rにより、ScFv(HBsAg)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy ve
ctorにサブクローニングしてpGEM-T-ScFv(HBsAg)を得
た。次に、pGEM-T-RBCK1(前出)をEcoRVおよびXhoIで開
裂して、RBCK1遺伝子断片を取り出し、EcoRVおよびXhoI
で開裂したpGEM-T-ScFv(HBsAg)に導入して、プラスミド
pGEM-T-ScFv(HBsAg)-RBCK1を得た。
FP)-RBCK1と動物細胞用GFP発現ベクターｐTB701-GFPを
エレクトロポレーション法によりHEK293細胞へ導入し
た。37℃、5% CO2存在下で40時間培養した後、プロテア
ソーム阻害剤MG132(Peptide研、日本)のDMSO溶液（50m
M）を最終濃度50Mになるように培地に添加した。MG132
添加後、さらに8時間培養し、上記の方法に従い細胞粗
抽出液を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2
抗体10gを加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%
スラリーのProtein G Sepharose 4 Fastflow（Amersham
-Pharmacia社、スウェーデン）を30l加え、４℃で１時
間混合した。300×gで遠心後、Protein GSepharose画分
を回収し、細胞溶解液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰
り返した。Protein G Sepharose画分にSDS-PAGE用ロー
ディングバッファー30mlを加えて、100℃、10分間煮沸
した後、上清20lを用いてSDS-PAGEを行い、抗GFP抗体(C
lontech社、米国)を用いたウェスタンブロット法により
FL-ScFv(GFP)-RBCK1に結合したユビキチン化GFPを確認
した。陰性対照としてpTB701-FL-RBCK1によるFL-RBCK1
を用いたが、GFPに対する顕著なUbiquitin多量体の生成
は観察されなかった。また、MG132添加前に共焦点レー
ザー顕微鏡（PASCAL5、Carl Zeiss社、ドイツ）で、FL-
ScFv(GFP)-RBCK1とGFPを共発現する細胞の蛍光を測定し
たところ、陰性対照のFL-RBCK1とGFPを共発現する細胞
よりも著しく蛍光量が減少していた。これは、改変型RB
CK1によりGFPがポリユビキチン化を受けて、細胞内で積
極的に排除されたことを示している。 実施例７：一本鎖抗体を融合したRBCK1によるウイルスタンパク質
の選択的除去 抗B型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）一本鎖抗体（以後
ScFv（HBsAg））遺伝子を持つプラスミドpCAMTAB5E-TZ-
HBsAgを鋳型として、SalI切断部位を有するプライマー
とEcoRV/XhoI切断部位を有するプライマーを使用するPC
Rにより、ScFv(HBsAg)遺伝子を増幅し、pGEM-T Easy ve
ctorにサブクローニングしてpGEM-T-ScFv(HBsAg)を得
た。次に、pGEM-T-RBCK1(前出)をEcoRVおよびXhoIで開
裂して、RBCK1遺伝子断片を取り出し、EcoRVおよびXhoI
で開裂したpGEM-T-ScFv(HBsAg)に導入して、プラスミド
pGEM-T-ScFv(HBsAg)-RBCK1を得た。
【００４３】さらにpGEM-T-ScFv(HBsAg)-RBCK1を鋳型に
して、EcoRI切断部位を有するプライマーとBglII切断部
位を有するプライマーを用いたPCRにより、ScFv(HBsAg)
-RBCK1遺伝子を増幅し、実施例１の方法に従ってpTB701
-FLのEcoRIおよびBglII切断部位に導入した。次に、得
られたプラスミドpTB701-FL -ScFv(HBsAg)-RBCK1をB型
肝炎ウイルスに持続感染しているHBsAg産生ヒト肝癌由
来細胞PLC/PRF/5細胞に導入し、同細胞内でScFv(HBsAg)
-RBCK1を発現させた（分子マス86ｋDa）。
して、EcoRI切断部位を有するプライマーとBglII切断部
位を有するプライマーを用いたPCRにより、ScFv(HBsAg)
-RBCK1遺伝子を増幅し、実施例１の方法に従ってpTB701
-FLのEcoRIおよびBglII切断部位に導入した。次に、得
られたプラスミドpTB701-FL -ScFv(HBsAg)-RBCK1をB型
肝炎ウイルスに持続感染しているHBsAg産生ヒト肝癌由
来細胞PLC/PRF/5細胞に導入し、同細胞内でScFv(HBsAg)
-RBCK1を発現させた（分子マス86ｋDa）。
【００４４】実施例１の方法に従い、pTB701-FL-ScFv(H
BsAg)-RBCK1をエレクトロポレーション法によりPLC/PRF
/5細胞へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40間培養した
後、プロテアソーム阻害剤MG132 (Peptide研) のDMSO溶
液（50mM）を最終濃度50Mになるように培地に添加し
た。MG132添加後8時間、上記の方法に従い細胞粗抽出液
を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2抗体10
gを加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリ
ーのProtein G Sepharose 4 Fastflow （Amersham-Phar
macia社）を30l加え、４℃で１時間混合した。300×gで
遠心後、Protein G Sepharose画分を回収し、細胞溶解
液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰り返した。Protein
G Sepharose画分にSDS-PAGE用ローディングバッファー3
0lを加えて、100℃、10分間煮沸した後、上清20lを用い
てSDS-PAGE電気泳動を行い、抗HBsAg抗体(MBL社、日本)
を用いたウェスタンブロット法によりFL-ScFv(HBsAg)-R
BCK1に結合したユビキチン化HBsAgを確認した。陰性対
照としてpTB701-FL-RBCK1によるFL-RBCK1を用いたが、H
BsAgに対する顕著なUbiquitin多量体の生成は観察され
なかった。また、血中HBsAg検出用キット（IMX HBsAg・
ダイナパック、ダイナボット社、米国）で、MG132添加
前の細胞培養液中のHBsAg量を測定したところ、FL-ScFv
(HBsAg)-RBCK1を発現する細胞のHBsAg量は、陰性対照の
FL-RBCK1を発現する細胞のHBsAg量よりも著しく少なか
った。これは、改変型RBCK1によりHBsAgがポリユビキチ
ン化を受けて、細胞内で積極的に排除されたことを示し
ており、この改変型RBCK1は生体内のB型肝炎ウイルス排
除に有効であることを示している。
BsAg)-RBCK1をエレクトロポレーション法によりPLC/PRF
/5細胞へ導入した。37℃、5% CO2存在下で40間培養した
後、プロテアソーム阻害剤MG132 (Peptide研) のDMSO溶
液（50mM）を最終濃度50Mになるように培地に添加し
た。MG132添加後8時間、上記の方法に従い細胞粗抽出液
を作成した。この細胞粗抽出液0.6mlへ抗FLAG M2抗体10
gを加えた後、４℃で１時間静置した。次に、50%スラリ
ーのProtein G Sepharose 4 Fastflow （Amersham-Phar
macia社）を30l加え、４℃で１時間混合した。300×gで
遠心後、Protein G Sepharose画分を回収し、細胞溶解
液を0.5 mlによる洗浄操作を３回繰り返した。Protein
G Sepharose画分にSDS-PAGE用ローディングバッファー3
0lを加えて、100℃、10分間煮沸した後、上清20lを用い
てSDS-PAGE電気泳動を行い、抗HBsAg抗体(MBL社、日本)
を用いたウェスタンブロット法によりFL-ScFv(HBsAg)-R
BCK1に結合したユビキチン化HBsAgを確認した。陰性対
照としてpTB701-FL-RBCK1によるFL-RBCK1を用いたが、H
BsAgに対する顕著なUbiquitin多量体の生成は観察され
なかった。また、血中HBsAg検出用キット（IMX HBsAg・
ダイナパック、ダイナボット社、米国）で、MG132添加
前の細胞培養液中のHBsAg量を測定したところ、FL-ScFv
(HBsAg)-RBCK1を発現する細胞のHBsAg量は、陰性対照の
FL-RBCK1を発現する細胞のHBsAg量よりも著しく少なか
った。これは、改変型RBCK1によりHBsAgがポリユビキチ
ン化を受けて、細胞内で積極的に排除されたことを示し
ており、この改変型RBCK1は生体内のB型肝炎ウイルス排
除に有効であることを示している。
【００４５】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、各種ヒト疾患の原因となる不要タンパク
質を選択的に分解排除することのできる酵素が提供され
る。これによって、不要タンパク質を原因とする各種ヒ
ト疾患の根治療法が可能となる。
発明によって、各種ヒト疾患の原因となる不要タンパク
質を選択的に分解排除することのできる酵素が提供され
る。これによって、不要タンパク質を原因とする各種ヒ
ト疾患の根治療法が可能となる。
【図１】この発明のタンパク質分解排除酵素の一実施例
であるFL-RBCK1とユビキチン化タンパク質との結合を調
べたウエスタンブロット分析の結果である。
であるFL-RBCK1とユビキチン化タンパク質との結合を調
べたウエスタンブロット分析の結果である。
【図２】この発明のタンパク質分解排除酵素の別の実施
例であるGST-RBCK1とユビキチン化タンパク質との結合
を調べたウエスタンブロット分析の結果である。
例であるGST-RBCK1とユビキチン化タンパク質との結合
を調べたウエスタンブロット分析の結果である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 25/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Ｃ１２Ｎ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/60
(72)発明者 岡島 俊英
大阪府池田市井口堂３丁目３−１−301
(72)発明者 谷澤 克行
大阪府豊能郡豊能町希望ヶ丘２丁目30−２
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 BA61 CA04 CA07
DA02 DA06 EA04 GA11 HA08
HA11
4B050 CC05 DD11 EE10 LL01
4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 BA41
BA44 DC28 NA05 NA06 ZA162
4C085 AA21 BB22 DD62 GG10
Claims (9)
- 【請求項１】 ユビキチンリガーゼと標的タンパク質結
合分子との複合体であるタンパク質分解排除酵素。 - 【請求項２】 ユビキチンリガーゼが、ユビキチンリガ
ーゼそれ自体の基質結合部位を欠失または変異させた改
変型ユビキチンリガーゼである請求項１のタンパク質分
解排除酵素。 - 【請求項３】 ユビキチンリガーゼが、ユビキチンリガ
ーゼをコードするポリヌクレオチドが発現する組換えユ
ビキチンリガーゼである請求項１のタンパク質分解解除
酵素。 - 【請求項４】 ポリヌクレオチドが、ユビキチンリガー
ゼそれ自体の基質結合部位をコードする領域を欠失また
は変異させた改変型ポリヌクレオチドである請求項３の
タンパク質分解排除酵素。 - 【請求項５】 標的タンパク質結合分子が、抗体分子ま
たはリガンド分子である請求項１のタンパク質分解排除
酵素。 - 【請求項６】 ユビキチンリガーゼをコードするポリヌ
クレオチドと、標的タンパク質結合分子をコードするポ
リヌクレオチドとが連結した融合ポリヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項６の融合ポリヌクレオチドを保有
する組換えベクター。 - 【請求項８】 請求項１から５のいずれかのタンパク質
分解排除酵素が生細胞内に導入可能な形態を有する治療
用製剤。 - 【請求項９】 請求項７の組換えベクターが生細胞内に
導入可能な形態を有する医療用製剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001374247A JP4107836B2 (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | タンパク質分解排除酵素とその用途 |
| PCT/JP2002/012767 WO2003048354A1 (fr) | 2001-12-07 | 2002-12-05 | Enzyme de decomposition/suppression d'une proteine et utilisation de cette enzyme |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001374247A JP4107836B2 (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | タンパク質分解排除酵素とその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003169673A true JP2003169673A (ja) | 2003-06-17 |
| JP4107836B2 JP4107836B2 (ja) | 2008-06-25 |
Family
ID=19182838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001374247A Expired - Fee Related JP4107836B2 (ja) | 2001-12-07 | 2001-12-07 | タンパク質分解排除酵素とその用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4107836B2 (ja) |
| WO (1) | WO2003048354A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010088444A (ja) * | 2009-12-07 | 2010-04-22 | National Institute Of Agrobiological Sciences | ユビキチン依存型タンパク質分解系を利用した生体内タンパク質分解システム，及びそのシステムを利用したタンパク質の機能解明方法 |
| JP2021515582A (ja) * | 2018-03-16 | 2021-06-24 | コーネル・ユニバーシティーＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001224380A (ja) * | 2000-02-15 | 2001-08-21 | Japan Science & Technology Corp | サイクリンｅをユビキチン化分解するユビキチンリガーゼｓｃｆ複合体のｆ−ボックスタンパク |
-
2001
- 2001-12-07 JP JP2001374247A patent/JP4107836B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-12-05 WO PCT/JP2002/012767 patent/WO2003048354A1/ja active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010088444A (ja) * | 2009-12-07 | 2010-04-22 | National Institute Of Agrobiological Sciences | ユビキチン依存型タンパク質分解系を利用した生体内タンパク質分解システム，及びそのシステムを利用したタンパク質の機能解明方法 |
| JP2021515582A (ja) * | 2018-03-16 | 2021-06-24 | コーネル・ユニバーシティーＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 操作された細菌ユビキチンリガーゼ模倣物を用いる、幅広い範囲にわたるプロテオーム編集 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4107836B2 (ja) | 2008-06-25 |
| WO2003048354A1 (fr) | 2003-06-12 |
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