KR20040018370A - Ｈｍｇ 단편의 항염증제로서의 용도 - Google Patents

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KR20040018370A
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케빈 제이. 트레이시
후안 양
홀랜드 쇼 주니어 워렌
미첼 피. 핑크
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노쓰 쇼어-롱 아일랜드 제위시 리서치 인스티튜트
더 제너럴 하스피탈 코포레이션
유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
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Abstract

척추 동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하고 환자의 염증성 시토카인 캐스캐이드를 억제하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 상기 조성물은 척추동물 HMG A 박스 및 척추동물 HMG B 박스에 특이적으로 결합하는 항체 제조물을 포함한다. 상기 방법은 세포 또는 환자를 충분한 양의 조성물로 처리하여 염증전 시토카인의 방출을 억제하거나 염증성 시토카인 캐스캐이드를 억제하는 것을 포함한다.

Description

ＨＭＧ 단편의 항염증제로서의 용도 {USE OF HMG FRAGMENT AS ANTI-INFLAMMATORY AGENTS}
정부 지원
본 발명은 전체 또는 일부가 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰의 승인 RO1 GM 57226-02에 의해 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
배경기술
염증은 종종 염증전 시토카인 예를 들어 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-1α, IL-1β, IL-6, 혈소판 활성 인자(PAF), 마크로파지 이동 억제 인자(MIF) 및 다른 화합물에 의해 유도된다. 이러한 염증전 시토카인은 수개의 상이한 세포 타입, 가장 중요하게는 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 마크로파지, 및 호중구) 및 비면역 세포 예를 들어, 섬유아세포, 골아세포, 평활근 세포, 상피 세포 및 신경세포에 의해 생성된다. 이러한 염증전 시토카인은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 초기 단계 동안 다양한 질병에 기여한다.
염증성 시토카인 캐스캐이드는 많은 질병의 염증 및 애팝토시스를 포함하여 해로운 특성을 제공한다. 국소적 반응 및 전신성 반응 둘 모두를 특징으로 하는 질환이 포함되는데, 이는 위장관 및 관련 조직과 관련되는 질병(예를 들어 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병); 전신성 또는 국소적 염증 질병 및 질환(예를 들어, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 초고열, 호산구성 육아종, 육아종증, 및 유육종증); 비뇨생식계 및 연관 조직에 관련된 질병(예를 들어, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 및 요도염); 효흡계 및 연관 조직에 관련된 질병(예를 들어, 기관지염, 기종, 비염, 낭성섬유증, 폐렴, 성인성 호흡곤란증후군, 뉴모울트라마이크로스코픽실리코볼카노코니오시스 (pneumoultramicroscopic silicovolcanoconiosis), 알베알리티스(alvealitis), 세기관지염, 인두염, 흉막염, 및 부비동염); 다양한 바이러스에 의한 감염으로 야기되는 질병(예를 들어, 인플루엔자, 호흡기 합포체, HIV, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스 및 헤르페스), 박테리아(예를 들어, 파종성 균혈증, 뎅기열), 곰팡이(칸디다증) 및 원충 및 다세포 기생충(말라리아, 사상충증, 아메바병, 및 포충낭); 피부병 및 피부 질환(예를 들어, 화상, 포진상, 피부근염, 일광화상, 어티카리아 워츠(urticaria warts), 및 팽진); 심혈관계 및 연관 조직에 관련된 질병(예를 들어, 바설리티스(vasulitis), 혈관염, 심내막염, 동맥염, 죽상경화증, 정맥염, 심막염, 울혈성 심부전, 심근염, 심근허혈, 결절성 동맥주위염, 및 류마티스열); 중추 또는 말초 신경계 및 연관 조직에 관련된 질병(예를 들어, 알츠하이머병, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길리엄-배어 증후군, 신경염, 신경통, 척수손상, 마비, 및 포도막염); 뼈, 관절, 근육 및 연결 조직에 관련된 질병(예를 들어, 다양한 관절염 및 관절통, 골수염, 근막염, 파제트병, 통풍, 치주병, 류마토이드 관절염, 및 활막염); 다른 자가면역 및 염증성 장애(예를 들어, 중증 근무력증, 드로이디티스(thryoiditis), 전신성 홍반성 루푸스, 구드패스츄어 증후군, 베셋 증후군, 동종이식 거부, 이식-대-숙주 질병, 타입 I 당뇨병, 강직성 척추염, 버거병, 및 레티어 증후군); 및 다양한 암, 종양, 및 증식성 장애(예를 들어, 호지킨병); 및, 임의의 경우에는 임의의 원발성 질병에 대한 염증성 또는 면역성 숙주 반응을 포함한다.
초기 염증전 시토카인(예를 들어 TNF, IL-1 등)은 염증을 매개하고, 혈청에 축적되어 사멸 지연 및 초기 염증전 시토카인의 추가 유도를 매개하는 HMG1(High Mobility Group-1)(HMG-1 및 HMGB1로도 알려짐)의 늦은 방출을 유도한다.
HMG1은 처음에 DNA 구조 및 안정성에 중요한 고이동성 그룹(HMG)이라 칭하는 DNA 결합 단백질의 군의 기초 원으로서 확인되었다. 이것은 거의 40년 전에 서열 특이성 없이 이중 나선 DNA와 결합하는, 편재되어 발현되는 핵 단백질로서 확인되었다.
HMG1 결합은 DNA를 구부려서 글루코코르티코이드 수용체 및 RAG 재조합효소의 유전자 전사를 촉진시키는 핵단백질 복합체의 형성 및 안정성을 증가시킨다. HMG1 분자는 HMG A 박스 및 HMG B 박스라 불리는 2개의 DNA 결합 모티브 및 산성 카르복실 말단의 3개 도메인을 가진다. 2개의 HMG 박스는 고보존성 80개 아미노산의 L형 도메인이다. HMG 박스는 또한 RNA 폴리머라아제 I 전사 인자 인간 업스트림-결합 인자 및 림프구 특이적 인자를 포함하는 다른 전사 인자로 발현된다.
최근 증거는 HMG1이 내독혈증에서 치사를 지연시키는 시토카인 매개체임을의미한다. 이러한 결과는 박테리아 내독소(리포폴리사카라이드, LPS)가 단핵구/마크로파지를 활성화시켜 활성화에 대한 후기 반응으로 HMG1을 방출시켜 독성인 혈청 HMG1 수준을 상승시킨다는 것을 증명한다. HMG1에 대한 항체는 항체 투여가 초기 시토카인 반응 후에까지 지연되는 경우에 조차 내독소의 치사를 방지한다. 다른 염증전 시토카인처럼, HMG1은 단핵구의 잠재적 활성제이다. HMG1의 기관내 적용은 급성 폐 손상을 유발하고, 항HMG1 항체는 내독소 유발 폐부종으로부터 보호한다. 혈청 HMG1 수준은 패혈증 또는 출혈성 쇼크로 심하게 아픈 환자에서 상승되고, 이 수준은 생존자에 비해 사망자에서 상당히 높다.
HMG1은 또한 면역글로블린 수퍼패밀리에 대한 다중리간드 수용체 RAGE에 대한 리간드로서 관련된다. RAGE는 내피 세포, 평활근 세포, 단핵구, 신경세포에서 발현되고 리간드 상호작용은 MAP 키나아제, P21 라스, 및 NF-kB를 통해 신호를 전달한다. 내독혈증 동안 HMG1 출현의 지연된 동력학은 이를 잠재적으로 우수한 치료 표적이 되게 하지만, HMG1 신호 및 독성의 분자적 배경에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
따라서, 염증전 활성, 특히 이러한 활성을 담당하는 활성 도메인, 및 다른 도메인에 대한 임의의 억제 효과의 HMG1의 특성을 확인하는 것이 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 (1) HMG A 박스가 HMG 염증전 작용의 경쟁정 억제제로서 작용한다는 것과 (2) HMG B가 HMG의 현저한 염증전 활성을 보인다는 발견에 기초한다.
따라서, 본 발명은 척추동물 HMG A 박스 또는 이의 생물학적 활성 단편, 또는 비천연 HMG A 박스 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. HMG A 박스 또는 이러한 구체예는 HMG로 치료된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있다. HMG A 박스는 바람직하게는 포유동물 HMG A 박스, 보다 바람직하게는 포유동물 HMG1 A 박스, 예를 들어 인간 HMG1 A 박스, 가장 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 22의 서열을 포함하거나 이로 구성된 HMG1 A 박스이다. 바람직한 구체예에서, 척추동물 세포는 포유동물 마크로파지이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 HMG A 박스 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 상기 조성물은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 억제할 수 있다. 상기 조성물은 초기 패혈증 매개체의 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 초기 패혈증 매개체의 작용제는 바람직하게는 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF, 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된 시토카인의 길항제이고, 보다 바람직하게는 TNF 또는 MIF, 또는 IL-1 수용체 길항제에 대한 항체이다.
이러한 구체예들에서, 상기 질환은 바람직하게는 다음의 군으로부터 선택된다: 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 초고열, 호산구성 육아종, 육아종증, 및 유육종증, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 및 요도염, 기관지염, 기종, 비염, 낭성섬유증, 폐렴, 성인성 호흡곤란증후군, 뉴모울트라마이크로스코픽실리코볼카노코니오시스 (pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis), 알베알리티스(alvealitis), 세기관지염, 인두염, 흉막염, 및 부비동염, 인플루엔자, 호흡기 합포체, HIV, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스 및 헤르페스, 파종성 균혈증, 뎅기열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바병, 및 포충낭, 화상, 포진상, 피부근염, 일광화상, 어티카리아 워츠(urticaria warts), 및 팽진, 바설리티스(vasulitis), 혈관염, 심내막염, 동맥염, 죽상경화증, 정맥염, 심막염, 울혈성 심부전, 심근염, 심근허혈, 결절성 동맥주위염, 및 류마티스열, 알츠하이머병, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길리엄-배어 증후군, 신경염, 신경통, 척수손상, 마비, 및 포도막염, 다양한 관절염 및 관절통, 골수염, 근막염, 파제트병, 통풍, 치주병, 류마토이드 관절염, 및 활막염, 중증 근무력증, 드로이디티스(thryoiditis), 전신성 홍반성 루푸스, 구드패스츄어 증후군, 베셋 증후군, 동종이식 거부, 이식-대-숙주 질병, 타입 I 당뇨병, 강직성 척추염, 버거병, 및 레티어 증후군, 호지킨병. 더욱 바람직하게는, 상기 질환은 다음의 군으로부터 선택된다: 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 화상, 알츠하이머병, 복강병, 울혈성 심부전, 성인성 호흡곤란증후군, 뇌경색, 뇌색전증,척수손상, 마비, 동종이식 거부 및 이식-대-숙주 질병; 더욱 바람직하게는, 상기 질환은 내독소성 쇼크 또는 동종이식 거부이다. 상기 질환이 동종이식 거부인 경우, 상기 조성물은 동종이식 거부를 억제하기 위해 사용되는 면역 억제제(바람직하게는, 사이클로스포린)를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 척추동물 고이동성 그룹 단백질(HMG) B 박스에 특이적으로 결합하고 HMG의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는 항체의 정제된 제조물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 항체는 HMG B 박스 폴리펩티드의 생물학적 활성 예를 들어, HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있다. 바람직한 구체예에서, HMG 박스는 포유동물 HMG B 박스 예를 들어 인간 HMG B 박스이고, 보다 바람직하게는 HMG1 B 박스, 가장 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 HMG1 B 박스이다. 다른 구체예에서, 항체는, 서열번호 20의 아미노산 1번 내지 20번(서열번호 16)을 포함하거나, 서열번호 5의 아미노산 1번 내지 20번(서열번호 23)을 포함하거나, 서열번호 5(서열번호 23)의 아미노산 1번 내지 20번으로 구성되는 HMG1 B 박스의 특이적 폴리펩티드 서열과 결합한다. 척추동물 세포는 또한 바람직하게는 포유동물 마크로파지이다. 일부 구체예에서, 항체는 바람직하게는 인체적합화된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제 중의 상기 설명된 항체 제조물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 상기 조성물은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 상태를 억제할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 앞서 기술된 바와 같이 초기 패혈증 매개체의 길항제를유용하게 포함할 수 있다. 이러한 조성물을 이용한 치료에 유용한 바람직한 질환 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화에 의해 매개되거나 이를 특징으로 하는 질환, 예를 들어, 앞서 기술된 바와 같은 A 박스 조성물과 함께 열거된 질환이다.
추가적으로, 본 발명은 척추동물 HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편을 포함하지만 전장 HMG 단백질을 포함하지 않는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발한다. 이러한 구체예의 폴리펩티드는 바람직하게는 HMG B 박스이고, 보다 바람직하게는 HMG1 B 박스, 가장 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 20으로 제시된 아미노산 서열을 갖는 HMG1 B 박스이다. 다른 구체예에서, HMG B 박스 단편은 서열번호 16 또는 서열번호 23의 서열을 포함하거나 서열번호 16 또는 서열번호 23의 서열로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 척추동물 세포는 포유동물 마크로파지이다. 본 발명은 또한 이러한 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 포유동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하기에 충분한 양으로, 상기에 기술된 A 박스 또는 A 박스 생물학적 활성 단편 폴리펩티드 조성물 또는 B 박스 또는 B 박스 생물학적 활성 단편 항체 조성물로 세포를 처리하는 것을 포함한다. 이러한 구체예에서, 세포는 바람직하게는 마크로파지이다. 또한, 염증전 시토카인은 바람직하게는 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 세포는 마크로파지이고, 염증전 시토카인은 바람직하게는 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법은 바람직하게는 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환에 걸렸거나 걸릴 위험에 있는 환자의 세포를 치료한다. 바람직한 질환은 앞서 열거하였다.
관련 구체예에서, 본 발명은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 염증성 시토카인 캐스캐이드를 억제하기에 충분한 양으로 상기 설명된 A 박스 또는 A 박스 생물학적 활성 단편 폴리펩티드 조성물 또는 B 박스 또는 B 박스 생물학적 활성 단편 항체 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 구체예는 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양으로 상기 기술된 B 박스 폴리펩티드 또는 이들의 생물학적 활성 단편, 또는 B 박스 폴리펩티드 또는 이들의 생물학적 활성 단편의 벡터로 세포를 처리하는 것을 포함한다. 관련된 구체예에서, 본 발명은 환자의 중량을 감소시키거나 비만을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자에게 유효량의 HMG B 박스 폴리펩티드 또는 이들의 생물학적 단편을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, HMG B 박스 폴리펩티드 또는 이들의 생물학적 활성 단편은 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 있다.
본 발명은 또한 화합물이 염증을 억제하는 지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 화합물을 (a) HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편에 노출된 경우에 염증전 시토카인을 방출하는 세포 및 (b) HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편과 혼합하고 난 후에, 상기 화합물이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정하는 것을 포함한다. 바람직하게는, HMG B 박스는 포유동물 HMG B 박스 예를 들어 HMG1 B 박스이다. 바람직한 염증전 시토카인은 앞서 설명된 바와 같다.
도면의 간단한 설명
도 1은 HMG1 돌연변이체 및 이들의 TNF 방출 활성(pg/㎖)의 개략도이다.
도 2A는 RAW 264.7 세포의 TNF 방출에 대한 B 박스 0㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 또는 10㎍/㎖의 효과를 도시하는 막대 그래프이다.
도 2B는 RAW 264.7 세포의 IL-1β 방출에 대한 B 박스 0㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 또는 10㎍/㎖의 효과를 도시하는 막대 그래프이다.
도 2C는 RAW 264.7 세포의 IL-6 방출에 대한 B 박스 0㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 또는 10㎍/㎖의 효과를 도시하는 막대 그래프이다.
도 2D는 RAW 264.7 세포에서 TNF mRNA 발현에 대한 B 박스(투여 후 0시간후, 4시간 후, 8시간 후, 또는 24시간 후) 또는 벡터 단독(투여 후 4시간 후)의 효과를 도시하는 RNAse 보호 검정의 블랏의 스캐닝된 이미지이다.
도 2E는 투여 후 0시간, 4시간, 8시간, 24시간, 32 시간 또는 48시간 후의 RAW 264.7 세포로부터의 TNF 단백질 방출에 대한 HMG1 B 박스의 효과(pg/㎖)의 막대 그래프이다.
도 2F는 투여 후 0시간, 4시간, 8시간, 24시간, 32 시간 또는 48시간 후의RAW 264.7 세포로부터의 TNF 단백질 방출에 대한 벡터의 효과(pg/㎖)의 막대 그래프이다.
도 3은 HMG 1 B 박스 돌연변이체 및 이들의 TNF 방출에 대한 활성(pg/㎖)의 개략도이다.
도 4A는 RAW 264.7 세포로부터 TNF 방출(HMG1 매개 TNF 방출 단독의 백분율)에 대한 HMG1 A 박스 단백질 0㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 또는 25㎍/㎖의 효과의 그래프이다.
도 4B는 RAW 264.7 세포로부터 TNF 방출(HMG1 매개 TNF 방출 단독의 백분율)에 대한 HMG1 (0 또는 1.5㎍/㎖), HMG1 A 박스 (0 또는 10㎍/㎖) 또는 벡터 (0 또는 10㎍/㎖) 단독 또는 이들의 조합물의 효과의 막대 그래프이다.
도 5A는 시간에 따른 RAW 264.7 세포에 결합하는125I-HMGB1의 결합 그래프이다.
도 5B는 총 CPM/웰의 백분율로서 측정된, 라벨링되지 않은 HMGB1 또는 HMG1 A 또는 HMG1 A 박스의 부재 하에 4℃에서 2시간 동안의125I-HMGB1의 결합(전체) 또는 5,000 몰 과량의 라벨링되지 않은 HMGB1의 존재 하의125I-HMGB1의 결합(HMGB1) 또는 A 박스(A 박스)의 존재 하의125I-HMGB1의 결합(A 박스)의 막대 그래프이다.
도 6은 RAW 264.7 세포로부터 TNF 방출에 대한 HMG-1(0㎍/㎖ 또는 1㎍/㎖) 또는 HMG1 B 박스(25㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖) 단독 또는 항-B 박스 항체(25㎍/㎖ 또는100㎍/㎖) 또는 IgG(25㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖)과의 조합물의 효과의 막대 그래프이다.
도 7A는 처리되지 않은 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 신장 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7B는 HMG1 B 박스가 투여된 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 신장 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7C는 처리되지 않은 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 심근 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7D는 HMG1 B 박스가 투여된 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 심근 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7E는 처리되지 않은 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 허파 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7F는 HMG1 B 박스가 투여된 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 허파 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7G는 처리되지 않은 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 간 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7H는 HMG1 B 박스가 투여된 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 간 절편의 스캐닝된 이미지이다.
도 7I는 처리되지 않은 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 간 절편(고배율)의 스캐닝된 이미지이다.
도 7J는 HMG1 B 박스가 투여된 마우스로부터 획득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 간 절편(고배율)의 스캐닝된 이미지이다.
도 8은 시간(시)에 따른 맹장 결찰 및 천공 (CLP)이 된 마우스의 HMGB1 수준(ng/㎖)의 그래프이다.
도 9는 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 후에 시간에 따른 마우스의 생존에 대한 A 박스(60㎍/마우스 또는 600㎍/마우스) 또는 비처리의 효과의 그래프이다.
도 10A는 맹장 결찰 및 천공 (CLP) 후에 시간에 따른 마우스의 생존에 대한 항-HMG1 항체(검은 원) 또는 비처리(흰 원)의 효과의 그래프이다.
도 10B는 리포폴리사카라이드(LPS)가 투여된 마우스의 생존(일)에 대한 항-HMG1 B 박스 항혈청(■) 또는 비처리(*)의 효과의 그래프이다.
도 11A는 HMG1(HMG-1), 폴리사카라이드(LPS), 또는 HMG1 B 박스 (B 박스)로 처리된 RAW 264.7 세포로부터 TNF 방출에 대한 항-RACE 항체 또는 비면역 IgG의 효과의 막대그래프이다.
도 11B는 쥐과의 MyD 88-우성 음성(+MyD 88 DN) 돌연변이체 또는 빈 벡터 (-MyD 88 DN)로 함께 트랜스펙션된 RAW 264.7 세포 중의 NFkB-의존성 ELAM 프로모터(루시퍼라아제 활성에 의해 측정)의 활성화에 대한 HMG1 또는 HMG1 B 박스 폴리펩티드 증강의 효과에 대한 막대 그래프이다. 데이터는 자극되지 않은 세포 및 자극된 세포으로부터의 평균 루시퍼라아제 값(폴드 활성화)의 비율(바탕을 위해 제거) + SD로서 표현된다.
도 11C는 CD25 발현에 대한 IL-1, HMG1, 또는 HMG1 B 박스로 인간 TRL2(흰색바) 또는 TLR4(음영 바)를 구성적으로 발현하는 CHO 리포터 세포주의 자극의 효과의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 FL1 형광물질에 기초하여 가장 낮은 5%의 세포를 제외한 집단의 자극되지 않은 세포 및 자극된 세포으로부터의 평균 루시퍼라아제 값(폴드 활성화)의 비율(바탕을 위해 제거) + SD로서 표현된다.
도 11D는 RAW 264.7 세포에서 HMG1-매개 TNF 방출(항체의 부재 하에 TNF 방출의 백분율로서 측정됨)에 대한 항-RAGE 항체, 항-TLR2 항체, 항-RAGE 항체, 및 항-TLR2 항체를 함께 투여한 경우의 효과의 막대 그래프이다.
도 12A는 인간 HMG1 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.
도 12B는 래트 및 마우스 HMG1의 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
도 12C는 인간 HMG2의 아미노산 서열(서열번호 3)이다.
도 12D는 인간, 마우스, 및 래트 HMG1 A 박스 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 4)이다.
도 12E는 인간, 마우스, 및 래트 HMG1 A 박스 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열번호 5)이다.
도 12F는 인간 HMG1의 순방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 6)이다.
도 12G는 인간 HMG1의 역방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 7)이다.
도 12H는 인간 HMG1의 카르복시 말단 돌연변이체에 대한 순방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 8)이다.
도 12I는 인간 HMG1의 카르복시 말단 돌연변이체에 대한 역방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 9)이다.
도 12J는 인간 HMG1의 아미노 말단 및 B 박스 돌연변이체에 대한 순방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 10)이다.
도 12K는 인간 HMG1의 아미노 말단 및 B 박스 돌연변이체에 대한 역방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 11)이다.
도 12L은 인간 HMG1의 아미노 말단 및 B 박스 돌연변이체에 대한 순방향 프라이머의 아미노산 서열(서열번호 12)이다.
도 12M은 인간 HMG1의 B 박스 돌연변이체에 대한 역방향 프라이머의 아미노산 서열(서열번호 13)이다.
도 12N은 인간 HMG1의 아미노 말단 및 A 박스 돌연변이체에 대한 순방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 14)이다.
도 12O는 인간 HMG1의 아미노 말단 및 A 박스 돌연변이체에 대한 역방향 프라이머의 핵산 서열(서열번호 15)이다.
도 13은 래트(서열번호 2), 마우스(서열번호 2) 및 인간(서열번호 18)로부터의 HMG1 폴리펩티드 서열의 서열 정렬이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 수행은 다르게 지시되지 않는 이상 당업자에게 공지된 세포 배양 기술, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press; Ausubel et al., (1995); "Short Protocols in Molecular Biology", John wiley and Sons, Methodsin Enzymology (several volumes); Method in Cell Biology (several volumes), and Methods in Molecular Biology (several volumes)]에 완전히 설명되어 있다.
본 발명은 염증전 시토카인 및 염증성 시토카인 캐스캐이드의 생성을 유도하는 HMG1의 능력을 특징으로 하는 다양한 특성을 추가로 밝히는 한 시리즈의 발견에 기초한다. 구체적으로, HMG1의 염증전 활성 도메인은 B 박스 (및 특히 B 박스의 처음 20개 아미노산)이라는 것과 상기 B 박스에 특이적인 항체는 염증성 시토카인 캐스캐이드를 억제하여 그 결과 염증성 시토카인 캐스캐이드에 의해 유발되는 유해한 증상을 완화할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, A 박스는 염증성 시토카인 방출의 약한 작용제이고 경쟁적으로 B 박스 및 HMG1의 염증전 활성을 억제한다는 것을 발견하였다.
본원에 사용된 "HMG 폴리펩티드" 또는 "HMG 단백질"은 천연적으로 이를 동반하는 화합물로부터 분리된, 실질적으로 순수하거나, 실질적으로 순수하고 단리된 폴리펩티드 또는 동일한 아미노산 서열을 가지는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드이고, 염증을 증가시키고/거나 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증가시키고/거나 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성을 증가시킨다. 일 구체예에서, HMG 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성 중 하나를 가진다. 다른 구체예에서, HMG 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성 중 둘을 가진다. 세번째 구체예에서, HMG 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성의 셋 모두를 가진다.
바람직하게는, HMG 폴리펩티드는 포유동물 HMG 폴리펩티드 예를 들어 인간 HMG1 폴리펩티드이다. 바람직하게는, HMG 폴리펩티드는 BLAST 프로그램 및 파라미터를 사용하여 결정된 바와 같이, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3,또는 서열번호 18로부터 선택된 서열에 대한 60% 이상, 보다 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가진다. 바람직하게는, HMG 폴리펩티드는 본원에 기술된 B 박스 DNA 결합 도메인 및/또는 A 박스 DNA 결합 도메인 및/또는 산성 카르복실 말단을 함유한다. HMG 폴리펩티드의 다른 예는 전체 교시 내용이 본원에 참고로 통합되는 진뱅크 승인 번호 AAA64970, AAB08987, P07155, AAA20509, S29857, P09429, NP_002119, CAA31110에 기술되어 있다. HMG 폴리펩티드의 추가 예는 포유동물 HMG1, HMG2, BMG-2A, HMG14, HMG17, HMGI 및 HMGY; 비포유동물 HMG T1 및 HMG T2(무지개 송어), HMG-X(제노푸스), HMG D/Z(드로소필라), 효모 폴리펩티드 NHP10 단백질(HMG 단백질 동족체 NPH 1) 및 비히스톤 염색체 단백질; HMG 1/2 유사 단백질(밀, 옥수수, 대두); 업스트림 결합 인자(UBF-1), 단일 가닥 인지 단백질(SSRP) 또는 구조-특이적 인지 단백질; HMG 동족체 TDP-1; 포유동물 성 결정 영역 Y 단백질 (SRY, 정소 결정 인자); 균류 단백질: mat-1, ste 11, 및 Mc 1; SOX 14( 뿐만 아니라 SOX 1-3, 6, 8, 10, 12, 및 21); 림프구 특이적 인자(LEF-1); T-세포 특이적 전사 인자(TCF-1); 및 SP 100-HMG 핵 자가항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "A 박스"로도 본원에 언급된 "HMG A 박스"는 천연적으로 이를 동반하는 성분으로부터 분리된, 실질적으로 순수하거나 실질적으로 순수하고 단리된 폴리펩티드이고, 하기 생물학적 활성 중 하나 또는 둘을 가지고 전장 미만의 HMG 폴리펩티드인 아미노산 서열로 구성된다: 염증 억제, 및/또는 세포로부터 염증전 시토카인의 방출 억제, 및/또는 세포로부터 염증전 시토카인의 방출 억제, 및/또는 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성의 감소. 일 구체예에서, HMG A 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성 중 하나를 가진다. 다른 구체예에서, HMG A 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성 중 둘을 가진다. 세번째 구체예에서, HMG A 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성 중 셋을 가진다. 바람직하게는, HMG A 박스 폴리펩티드는 전장 HMG의 생물학적 활성의 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이하를 가진다. 일 구체예에서, HMG A 박스 아미노산은 서열번호 4 또는 서열번호 22의 서열 또는 포유동물의 HMG 단백질의 상응하는 영역의 아미노산 서열로 구성된다. HMG A 박스는 또한 상기 기술된 바와 같은 A 박스 서열과 동일한 아미노산 서열을 가지는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드이다. 바람직하게는, HMG A 박스는 포유동물 HMG A 박스 예를 들어 인간 HMG1 A 박스이다. 본 발명의 HMG A 박스 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 22의 서열 또는 포유동물의 HMG 단백질의 상응하는 영역의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. HMG A 박스는 종종 85개 이하의 아미노산 및 약 4개 이상의 아미노산을 가진다. 내부에 A 박스 서열을 가지는 폴리펩티드의 예는 HMG1, HMG2, HMG4; 구조 특이적 인지 단백질(SSRP); PMS1 단백질 동족체 1; SOX-1, SOX-2, 및 SOX-14 단백질; 및 MTT1을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 서열의 A 박스 서열은 예를 들어 본원에 기술되고 생물학적 활성을 위해 시험된 A 박스와의 서열 비교에 의해 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정되고 단리될 수 있다.
본 발명은 또한 비천연 HMG A 박스를 특징으로 한다. 바람직하게는, 비천연HMG A 박스는, 본원에 설명된 BLAST 프로그램 및 파라미터 및 HMG A 박스의 생물학적 활성 중 하나를 사용하여 측정된 바, 서열번호 4 또는 서열번호 22의 서열에 대한 60% 이하, 보다 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 95% 이하, 가장 바람직하게는 95%의 서열 동일성을 가진다.
본 발명은 또한 A 박스 생물학적 활성 단편을 특징으로 한다. "A 박스 생물학적 활성을 가지는 A 박스 단편" 또는 "A 박스 생물할적 활성 단편"은 본원에 설명된 HMG A 박스의 활성을 가지는 HMG A 박스의 단편을 의미한다. 예를 들어, A 박스 단편은 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 감소시키고/거나 염증을 감소시키고/거나 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성을 감소시킬 수 있다. A 박스 단편은, 예를 들어 본원에 기술된 방법을 사용하고 상기 단편이 세포에 투여된 경우에 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정함에 의해 단편의 기능을 검정하여 생성된다. A 박스 생물학적 활성 단편은 이것이 예를 들어 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하거나 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 가지는 환자를 치료하는 데 사용되는 본원에 설명된 방법에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "B 박스"로서도 본원에 언급된 "HMG B 박스"는 천연적으로 이를 동반하는 성분으로부터 분리된 실질적으로 순수하거나, 실질적으로 순수하고 단리된 폴리펩티드이고, 이는 하기 생물학적 활성의 하나 이상을 가지고 전장 미만의 HMG 폴리펩티드인 아미노산 서열로 구성된다: 염증 증가, 세포로부터 염증전 시토카인의 방출의 증가, 및/또는 염증 시토카인 캐스캐이드의 활성의 증가. 일 구체예에서, HMG B 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성의 하나를 갖는다. 다른 구체예에서, HMG B 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성의 둘을 갖는다. 세번째 구체예에서, HMG B 박스 폴리펩티드는 상기 생물학적 활성의 셋을 갖는다. 바람직하게는, HMG B 박스는 전장 HMG의 생물학적 활성의 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상을 가진다. 다른 구체예에서, HMG B 박스는 HMG A 박스를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, HMG B 박스는 전장 HMG1 폴리펩티드의 길이의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20%인 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, HMG 박스는 서열번호 5 또는 서열번호 20의 서열 또는 포유동물의 HMG 단백질의 상응하는 영역의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. HMG B 박스 폴리펩티드는 또한 상기 설명된 HMG B 박스 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 가지는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드이다. 바람직하게는, HMG B 박스는 포유동물 HMG B 박스 예를 들어 인간 HMG1 B 박스이다. HMG B 박스는 종종 약 85개 이하의 아미노산 및 약 4개 이상의 아미노산을 가진다. 내부에 B 박스 서열을 가지는 폴리펩티드의 예는 본원에 설명된 HMG 폴리펩티드, 단일 가닥 인지 단백질(SSRP) 또는 구조 특이적 인지 단백질, 효코 NHP10 단백질(HMG 단백질 동족체 NHP1); HMG 동족체 TDP-1; 성 결정 영역 Y 단백질(정소 결정 인자); SOX 14( 뿐만 아니라 SOX 1-3, 6, 8, 10, 12, 및 21); 림프구 특이적 인자(LEF-1); 및 T-세포 특이적 전사 인자(TCF-1). 상기 폴리펩티드의 B 박스 서열은 예를 들어 본원에 기술된 B 박스와의 서열 비교 및 생물학적 활성 시험에 의해 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정되고 단리될 수 있다.
본 발명은 또한 비천연 HMG B 박스 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 비천연 HMG B 박스 폴리펩티드는 본원에 설명된 BLAST 프로그램 및 파라미터를 사용하여 결정된 바와 같이 서열번호 5 또는 서열번호 20의 서열과 60% 이상, 보다 바람직하게는 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 가진다. 바람직하게는, HMG B 박스는 서열번호 5 또는 서열번호 20의 서열 또는 포유동물의 HMG 단백질의 상응하는 영역의 아미노산 서열로 구성된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 B 박스 생물학적 활성 또는 비천연 HMG B 박스를 가지는 척추동물 HMG B 또는 이들의 단편을 포함하지만 전장 HMG는 포함하지 않는 폴리펩티드에 관한 것이다. "B 박스 생물학적 활성을 가지는 B 박스 단편" 또는 "B 박스 생물학적 활성 단편"은 HMG B 박스의 활성을 가지는 HMG B 박스의 단편을 의미한다. 예를 들어, B 박스 단편은 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발하거나 염증을 증가시키거나 염증성 시토카인 캐스캐이드를 유발할 수 있다. 이러한 B 박스 단편의 예는 본원에 설명된 HMG1 B 박스 (서열번호 16 또는 서열번호 23)의 처음 20개 아미노산을 포함하는 단편이다. B 박스 단편은 표준 분자 생물학 기술을 사용하고 이 단편이 세포에 투여된 경우에 예를 들어 본원에 설명된 방법을 사용하여 적합한 대조군과 비교하여 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증가시키는 지를 결정함에 의해 상기 단편의 기능을 검정하여 생성될 수 있다.
본원에 사용된, "시토카인"은 포유동물 세포에 의해 천연적으로 생성되고 체내에서 마이크로 내지 피코몰 농도에서 체액성 조절체로서 작용하는 가용성 단백질 또는 펩티드이다. 시토카인은 정상적 상태 또는 병변 상태 하에서 개별적인 세포 및 조직의 기능적 활성을 조절한다. 염증전 시토카인은 염증과 관련된 하기 생리학적 반응에 의해 유발될 수 있다: 혈관확장, 충혈, 관련 부종을 가진 혈관의 투과성 증가, 과립구의 축적 및 단핵구 대식작용, 또는 섬유소의 침전. 일부 경우에, 염증전 시토카인은 또한 TNF가 심장근 세포 애팝토시스를 자극하는 것으로 밝혀진 만성 심장병에서와 같은 애팝토시스를 유발할 수 있다[참고: Pulkki, Ann. Med. 29: 339-343, 1997, 및 Tsutsui et al., Immunol. Rev. 174: 192-209, 2000].
염증전 시토카인의 한정되지 않는 예는 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-18, 인터페론 γ, HMG-1, 혈소판 활성화 인자(PAF), 및 마크로파지 이동 억제 인자(MIF)이다.
염증전 시토카인은 염증의 매개체가 아닌 항염증성 시토카인 예를 들어 IL-4, IL-10, 및 IL-13으로부터 구별된다.
많은 경우에, 염증전 시토카인은 시토카인 방출이 포유동물의 생리학적 상태에 영향을 주는 포유동물의 하나 이상의 염증전 시토카인의 체내 방출로서 본원에 정의되는 염증성 시토카인 캐스캐이드에서 생성된다. 이와 같이, 염증성 시토카인 캐스캐이드는 염증전 시토카인 방출이 해로운 생리학적 상태를 유발하는 본 발명의 구체예에서 억제된다.
천연적으로 나타나거나 비천연 HMG A 박스 및 HMG B 박스는 상기 기술된 MHG A 박스 및 MHG B 박스와의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에사용된 바와 같이, 2개 폴리펩티드 (또는 이 폴리펩티드의 일부)는 아미노산 서열이 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상이거나 보다 더 상동성이거나 동일한 경우에 실질적으로 상동성이거나 동일하다. 2개 아미노산 서열 (또는 2개 핵산 서열)의 백분율 동일성은 최적의 비교 목적으로 상기 서열을 정렬시킴에 의해 결정될 수 있다. 상응하는 위치에서 아미노산 또는 누클레오티드가 다음에 비교되고, 2개 서열 간의 백분율 동일성은 상기 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다(예를 들어, % 동일성 = 동일한 위치의 개수 / 총 위치의 개수 ×100). 특정 구체예에서, 비교 목적으로 정렬된 HMG 폴리펩티드, HMG A 박스 폴리펩티드, 또는 HMG B 박스 폴리펩티드의 길이는 기준 서열 예를 들어 도 12A 내지 도 12E에 제공된 서열, 및 서열번호 18, 20, 및 22의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 보다 더 바람직하게는 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상이다. 2개 서열의 실제 비교는 널리 공지된 방법 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 바람직하고 한정되지 않는 예는 문헌[Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877(1993)]에 기술되어 있다. 이러한 알고리즘은 문헌[Schaffer et al., Nucleic Acid Res., 29: 2994-3005 (2001)]에 기술된 바와 같이 BLASTIN 및 BLASTX 프로그램(버전 2.2)에 통합된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 활용하는 경우에, 각가의 프로그램의 디폴트 파라미터(예: BLASTIN)이 사용될 수 있다. 2002년 4월 10일자로 입수가능한 http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 수 있다. 일 구체예에서, 서치된 데이터베이스는 비여분(NR) 데이터베이스이고 서열 비교를 위한 파라미터는 필터 없음; 기대값 10; 워드 크기 3; 매트릭스는 BLOSUM62; 및 갭 코스트는 이그지스턴스(Existence) 11 및 익스텐션(Extension) 1을 가진다.
서열 비교를 위하여 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직하고 한정되지 않는 예는 메이어(Myer) 및 밀러(Miller), CABIOS(1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG (Accelrys) 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램으로 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위한 ALIGN 프로그램을 활용하는 경우에, PAM120 중량 잔기 테이블, 갭 길이 페널티 12, 갭 패널티 4가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당분야에 공지되어 있고 문헌[Torellis and Robotti, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5 (1994)]에 기술된 ADVANCE 및 ADAM 및 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2448-8 (1998)]에 기술된 FASTA를 포함한다.
다른 구체예에서, 2개 아미노산 서열 간의 백분율 동일성은 Blossom 63 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 웨이트 및 2, 3, 또는 4의 랭쓰 웨이트를 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지의 GAP 프로그램(2001년 8월 31일자로 접근가능한 http://www.accerlrys.com에서 입수가능)을 사용하여 수행할 수 있다. 다른 구체예에서, 2개 핵산 서열 간의 백분율 동일성 은 갭 웨이트 50 및 랭쓰 웨이트 3을 사용하여 GCG 소프트웨어 팩키지(http://www.cgc.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
A 박스 폴리펩티드 및 이들의 생물학적 활성 단편
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있고 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있는 척추동물 HMG A 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드 조성물에 관한 것이다.
염증성 시토카인의 방출에 대한 본 발명의 조성물 또는 방법 중 어느 하나의 효과와 관련하여, 용어 "억제하다" 또는 "감소시키다"의 사용은 적어도 염증전 시토카인 방출의 적지만 측정가능한 감소를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 염증전 시토카인의 방출은 처리되지 않은 대조군에 비해 20% 이상 억제되고; 보다 바람직한 구체예에서, 억제는 50% 이상이고; 보다 더 바람직한 구체예에서, 억제는 70% 이상이고, 가장 바람직한 구체예에서, 억제는 80% 이상이다. 염증전 시토카인 방출의 이러한 축소는 체내 구체예에서 염증성 시토카인 캐스캐이드의 해로운 효과를 감소시킬 수 있다.
모든 척추동물 HMG A 박스는 높은 정도의 서열 보존성을 보이기 때문에(예를 들어, 래트, 마우스, 및 인간 HMG 폴리펩티드의 아미노산 서열 비교를 위하여 도 13을 참조), 어느 척추동물 HMG A 박스나 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있다고 생각한다. 따라서, 모든 척추동물 HMG A 박스는 본 발명의 범위 내이다. 바람직하게는, HMG A 박스는 포유동물 HMG A 박스, 예를 들어 서열번호 4 또는 서열번호 22로 본원에 제시된 인간 HMG1 A 박스와 같은 포유동물 HMG1 A 박스이다. 본원에 설명된 HMG A 박스 생물학적 활성을 가지는 HMG1 A 박스의 단편도 본 발명에 포함된다.
비천연 HMG A 박스 (또는 이들의 생물학적 활성 단편)이 과도한 실험 없이생성될 수 있고, 이것이 척추동물 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 것이라는 것은 당업자에 의해 인지될 것이다. 이러한 비천연 기능성 A 박스는 상이한 공급원으로부터의 HMG A 박스의 아미노산 서열을 정렬하고 A 박스가 상이한 아미노산 위치에서 서열의 하나의 하나 이상을 치환시킴에 의해 생성될 수 있다. 상기 치환은 바람직하게는 비교된 A 박스에서 나타나는 동일한 아미노산 잔기를 사용하여 수행될 수 있다.
보존적 아미노산 치환체는 유사한 측쇄를 가지는 잔기의 교환가능성에 관한 것이다. 보존적으로 치환되는 아미노산은 이들의 측쇄 잔기의 화학적 특성에 따라 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 아미노산의 한 그룹은 중성 및 소수성 측쇄을 가지는 아미노산(a, v, l, i, p, w, f, 및 m)을 포함하고; 다른 그룹은 중성 및 극성 측쇄를 가지는 아미노산(g, s, t, y, c, n, 및 q)을 포함하고; 다른 그룹은 염기성 측쇄를 가지는 아미노산(k, r, 및 h)이고; 다른 그룹은 산성 측쇄를 가지는 아미노산(d 및 e)이고; 다른 그룹은 지방성 측쇄를 가지는 아미노산(g, a, v, l, 및 i)이고; 다른 그룹은 지방성-히드록실 측쇄를 가지는 아미노산(s 및 t)이고; 다른 그룹은 아민 함유 측쇄를 가지는 아미노산(n, q, k, r, 및 h)이고; 다른 그룹은 방향족 측쇄를 가지는 아미노산(f, y, 및 w)이고; 다른 그룹은 황 함유 측쇄를 가지는 아미노산(c 및 m)이다. 바람직한 보존성 아미노산 치환 그룹은 r-k; e-d, y-f, l-m; v-i, 및 q-h이다.
보존성 아미노산 치환체는 HMG A 박스 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보존할 것으로 기대되는 반면, 하기는 비천연 A 박스 폴리펩티드가 인간 HMG1 A 박스(서열번호 4)와 인간 HMG2 A 박스(서열번호 7)의 서열번호 3의 32번 잔기 내지 85번 잔기와 비교함에 의해 제조되는 방법의 일례이다.
HMG1 pdasvnfsef skkcserwkt msakekgkfe dmakadkary eremktyipp kget
HMG2 pdssvnfaef skkcserwkt msakekskfe dmaksdkary dremknyvpp kgdk
비천연 HMG A 박스는 예를 들어 HMG1 A 박스의 제 3 위치의 알라닌(a) 잔기를 HMG2 A 박스의 제 3 위치에서 나타나는 세린(s) 잔기로 치환함에 의해 생성될 수 있다. 당업자는 s 잔기가 HMG2 A 박스의 그 위치에서 기능하기 때문에 상기 치환은 기능적인 비천연 A 박스를 제공할 것이라는 것을 알 것이다. 대안적으로, MGH1 A 박스의 제 3 위치는 글리신(g), 트레오닌(t), 발린(v), 또는 루신(l)과 같은 알라닌 또는 세린에 대해 보존적인 모든 아미노산으로 치환될 수 있다. 당업자는 A 박스가 제 3 위치에서 일정한 것이 아니기 때문에 이러한 치환이 기능적인 A 박스를 생성하여서, 보존적 치환은 그 위치에서 비천연 아미노산에 대한 적절한 구조적 치환체를 제공할 것이다.
상기 방법을 수행한 후에, 기능적일 것이라고 기대되는, 매우 많은 비천연 HMG A 박스는 과도한 실험 없이 생성될 수 있고 임의의 특정 비천연 HMG A 박스의 기능성을 알맞은 정확도로 예측될 수 있다. 어떤 경우에든, 모든 비천연 HMG A 박스의 기능성은 단순히 HMG와 함께 세포에 첨가함에 의해 과도한 실험 없이 결정될 수 있고, 이는 예를 들어 본원에 기술된 방법을 사용하여 세포에 의한 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정한다.
A 박스 또는 A 박스 생물학적 활성 단편이 HMG-유발된 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 세포는 염증전 시토카인을 생성하도록 유도될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 면역 세포, 예를 들어 마크로파지, 단핵구, 또는 호중구이다. 가장 바람직한 구체예에서, 세포는 마크로파지다.
현재 공지되었거나 최근에 발견된 임의의 단일 염증전 시토카인의 생성을 억제할 수 있는 A 박스 또는 A 박스 생물학적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드는 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직하게는, 항체는 TNF, IL-1β, 또는 IL-6의 생성을 억제할 수 있다. 가장 바람직하게는, 항체는 척추동물 세포에 의해 생성되는 임의의 염증전 시토카인의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제에서 임의의 상기 기술된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 상기 조성물은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 억제할 수 있다. 이러한 질환은 염증성 시토카인 캐스캐이드가 내독소 쇼크와 같은 전신성 반응을 유발한다. 대안적으로, 상기 질환은 류마티스성 관절염에서와 같은 국부적 염증성 시토카인 캐스캐이드에 의해 매개될 수 있다. 본 발명을 사용하여 유용하게 치료될 수 있는 질환들의 제한적이지 않은 예들은 본 명세서의 배경 기술에서 열거된 질환들을 포함한다. 바람직하게는, 상기 질환은 충수염, 펩신성, 위, 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 또는 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 초고열, 호산구성 육아종, 육아종증, 유육종증, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 기종, 비염, 낭성섬유증, 폐렴, 성인성 호흡곤란증후군, 뉴모울트라마이크로스코픽실리코볼카노코니오시스(pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis), 알베알리티스(alvealitis), 세기관지염, 인두염, 흉막염, 부비동염, 인플루엔자, 호흡기 합포체, HIV, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스 또는 헤르페스, 파종성 균혈증, 뎅기열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바병, 포충낭, 화상, 포진상, 피부근염, 일광화상, 어티카리아 워츠(urticaria warts), 팽진, 바설리티스(vasulitis), 혈관염, 심내막염, 동맥염, 죽상경화증, 정맥염, 심막염, 울혈성 심부전, 심근염, 심근허혈, 결절성 동맥주위염, 류마티스열, 알츠하이머병, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길리엄-배어 증후군, 신경염, 신경통, 척수손상, 마비, 포도막염, 다양한 관절염 또는 관절통, 골수염, 근막염, 파제트병, 통풍, 치주병, 류마토이드 관절염, 활막염, 중증 근무력증, 드로이디티스(thryoiditis), 전신성 홍반성 루푸스, 구드패스츄어 증후군, 베셋 증후군, 동종이식 거부, 이식-대-숙주 질병, 타입 I 당뇨병, 강직성 척추염, 버거병, 레티어 증후군, 또는 호지킨병이다. 보다 바람직한 구체예에서는, 상기 질환은 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 화상, 알츠하이머병, 복강병, 울혈성 심부전, 성인성 호흡곤란증후군, 뇌경색, 뇌색전증, 척수손상, 마비, 동종이식 거부 및 이식-대-숙주 질병이다. 가장 바람직한 구체예에서, 질환은 내독소 쇼크 또는 동종이식 거부이다. 상기 질환이 동종이식 거부인 경우에, 조성물은 또한 유리하게는 시클로스포린과 같은, 동종이식 거부를 억제하는 데 사용되는 면역억제제를 포함할 수 있다.
이러한 조성물에 폴리펩티드와 포함되는 부형제는 치료적 용법으로 기대되는 조성물의 투여 경로에 기초하여 선택된다. 조성물의 투여 경로는 치료될 질환에 따라 다르다. 예를 들어, 정맥내 주사는 내독소 쇼크와 같은 전신성 질병의 치료를 위해 바람직하고, 경구 투여는 위궤양과 같은 위장관 질병을 치료하는 데 바람직할 수 있다. 투여 경로는 표준 용량 반응 연구와 함께 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상기 결정을 수행하기 위하여 고려되는 적합한 상황은 치료될 질환 또는 다수의 질환, 투여될 조성물의 선택, 개개 환자의 연령, 체중, 및 반응 및 환자 증상의 경중을 포함한다. 따라서, 질환에 따라서, 항체 조성물은 경구, 비경구, 비내, 질내, 직장내, 혀, 설하, 협측, 협측내, 및 경피로 환자에게 투여될 수 있다.
이와 같이, 경구, 혀, 설하, 협측, 및 협측내 투여를 위하여 디자인된 조성물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 식용 담체와 함께 당업자에 공지된 수단에 의해 과도한 실험 없이 제조될 수 있다. 조성물은 젤라틴 캡슐로 포장되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위하여, 본 발명의 약제학적 조성물은 부형제와 혼입되어 정제, 구내정, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 형채로 사용될 수 있다.
정제, 알약, 캡슐, 구내정 등은 또한 결합제, 수용체, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제를 또한 함유할 수 있다. 결합제의 일부 예는 미결정성 셀룰로오스, 검 트래캔쓰 또는 젤라틴을 포함한다. 부형제의 예에는 전분 또는 락토오스가 포함된다. 붕해제의 예에는 알기닌산, 옥수수 전분 등이 포함된다. 윤활제의 예에는 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼륨이 포함된다. 글리던트(glidant)의 예는 콜로이드성 실리콘 디옥시드이다. 감미제의 예에는 수크로오스, 사카린 등이 포함된다. 풍미제의 예에는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 오렌지 향료 등이 포함된다. 이러한 다양한 조성물을 제조하는 데 사용되는 물질은 약제학적으로 순수하고 사용된 양으로 비독성이어야 한다.
본 발명의 조성물은 예를 들어 정맥내, 근내, 경막내, 또는 경피 주사와 같이 비경구적인 방법으로 용이하게 투여될 수 있다. 비경구 투여는 용액 또는 현탁액 중의 본 발명의 항체 조성물을 혼입시킴에 의해 수행될 수 있다. 이러한 용액 또는 현탁액은 또한 주사용수, 염수, 고정 오일, 폴리에티렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석수를 포함할 수 있다. 비경구 제형은 또한 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤, 아스코르브산, 또는 이황산나트륨과 같은 항산화제 및 EDTA와 같은 킬레이팅화제를 또한 포함할 수 있다. 아세트산염, 시트르산염, 또는 인산염과 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로오스와 같은 토닉성(tonicity)과 같은 조절제가 또한 첨가될 수 있다. 비경구 제조물은 앰플, 1회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이얼 중에 넣어질 수 있다. 직장 투여는 직장 또는 대장으로 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이는 좌약 또는 관장제를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 좌약 제형은 글리세린을 약 120℃로 가열하고, 상기 글리세린 중에 항체 조성물을 용해시키고, 가열된 글리세린을 혼합하고(이 후에 정제수를 첨가할 수 있음) 뜨거운 혼합물을 좌약 틀에 부어 제조될 수 있다.
경피 투여는 피부를 통하여 조성물의 피부 관통 흡수를 포함한다. 경피 투여는 패치, 연고, 크림, 겔, 고약 등이 포함된다.
본 발명은 치료적 유효량의 조성물을 포유동물에 비내 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 비내로 투여하는 것 또는 비내 투여는 조성물을 환자의 코 통로 또는 비강의 점막으로 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된, 조성물의 비강내 투여의 약제학적 조성물은 예를 들어 비내 스프레이, 비내 소적, 현탁액, 겔, 연고, 크림 또는 분말과 같이 공지된 투여 방법에 의해 제조된 치료적 유효량의 작용제를 포함한다. 조성물의 투여는 또한 비내 탐폰 또는 비내 스폰지를 사용하여 일어날 수 있다.
본원에 기술된 폴리펩티드 조성물은 초기 패혈증 매개체의 길항제를 또한 포함할 수 있다. 본원에 사용된 초기 패혈증 매개체는 염증성 시토카인 캐스캐이드의 유도 후에(예를 들어, LPS에 노출) 세포로부터 곧(예를 들어, 30 내지 60분 내) 방출되는 염증전 시토카인이다. 이러한 시토카인의 한정되지 않는 예는 TNF, IL-1α, IL-1β, IL-6, PAF, 및 MIF이다. 초기 패혈증으로서 상기 시토카인에 대한 수용체(예를 들어 종양 괴사 인자 수용체 타입 1) 및 상기 시토카인의 생성에 필요한 효소(예를 들어, 인터루킨-1β전환 효소)가 또한 포함된다. 현재 공지되었거나 최근에 발견된 모든 초기 패혈증의 길항제는 염증성 시토카인 캐스캐이드를 추가로 억제함에 의해 이러한 구체예를 위하여 유용할 수 있다.
초기 패혈증 매개체의 길항제의 제한되지 않는 예는 초기 패혈증 매개체의 mRNA에 결합하여 이의 발현을 막는 안티센스 화합물[참조: Ojwang et al., Biochemistry 36: 6033-6045, 1997; Parnpfer et al., Biol. Reprod. 52: 1316-1326, 1995; U.S. Patent No. 6,228,642; Yahata et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 55-61, 1995; 및 Taylor et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8: 199-205, 1998], 초기 패혈증 매개체의 mRNA를 특이적으로 절단하는 리보자임[참조: Leavitt et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10: 409-414, 2000; Kisich et al., 1999; 및 Hendrix et al., Biochem. J. 314 (Pt.2): 655-661, 1996], 및 초기 패혈증 매개체에 결합하고 이들의 작용을 억제하는 항체[참조: Kam and Targan, Expert Opin. Pharmacother. 1: 615-622, 2000; Nagahira et al., J. Immunol. Methods 222, 83-92, 1999; Lavine et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 52-58, 1998; 및 Holmes et al., Hybridoma 19: 363-367, 2000)이다. 현재 공지되었거나 최근 발견된 초기 패혈증 매개체의 모든 길항제는 본 발명의 범위에 포함되어 있다. 당업자는 통상적인 용량 반응 연구의 과도한 실험 없이 이러한 조성물에 사용되는 초기 패혈증 매개체의 양을 결정할 수 있다.
B 박스 폴리펩티드, 이들의 생물학적 활성 단편, 및 이에 대한 항체
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증가시킬 수 있는 척추동물 HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편을 포함하는 폴리펩티드 조성물에 관한 것이다.
염증전 시토카인의 방출에 대한 본 발명의 조성물 또는 방법의 효과와 관련하여, 용어 "증가"의 사용은 적어도 염증전 시토카인 방출의 작지만 측정가능한 상승을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 염증전 시토카인의 방출은 처리되지 않은 대조군에 비해 1.5배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 또는 10배 이상 증가한다. 염증전 시토카인 방출의 증가는 시험관내 구체예에서 염증성 시토카인 캐스캐이드의 효과를 증가시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 중량 손실을 유발하고/거나 비만을 치료하는 데 사용될 수 있다.
모든 HMG B 박스는 높은 정도의 서열 보존성을 보이기 때문에(예를 들어 래트, 마우스, 인간 HMG 폴리펩티드의 아미노산 서열 비교를 위하여 도 13을 참조할 수 있다), 기능성 비천연 HMG B 박스는 하나 또는 그 이상의 보존성 아미노산 치환체를 제조함에 의하거나, 상이한 공급원으로부터의 천연 척추동물 B 박스를 비교하고 기능성 비천연 A 박스의 생성과 관련하여 상기에 논의된 유사체 아미노산을 치환함에 의해 과도한 실험 없이 생성될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, B 박스는 서열번호 5 또는 서열번호 20을 포함하고 이들은 인간 HMG1 B 박스의 서열(2개의 상이한 길이)이거나 B 박스 생물학적 활성을 가지는 HMG B 박스의 단편이다. 예를 들어, 서열번호 20내에 함유된 20개 아미노산 서열은 B 박스의 기능에 기여한다. 이 20개 아미노산 B 박스 단편은 하기 아미노산 서열을 가진다: fkdpnapkrl psafflfcsc(서열번호 16). 다른 예 및 HMG B 박스 생물학적 활성 단편은 서열번호 5의 1개 내지 20개 아미노산(napkrppsaf flfcseyrpk; 서열번호 23)으로 구성된다.
본 발명은 또한 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 특이적으로 결합하지만 HMG1의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합하지 못하는 항체의 정제된 제조물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 항체는 B 박스 폴리펩티드의 생물학적 활성 예를 들어 HMG에 의해 유발되는 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있다.
HMG B 박스 또는 이들의 단편에 특이적인 항체를 제조하기 위하여 B 박스 또는 에피토프 함유 단편을 발현하는 세포가 면역원에 대해 면역특이적인 항체를 생성하는 면역원으로서 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "항체"는 다클론성 항체, 키메라, 단쇄, 유인원적합화된 항체 및 인체적합화된 항체 뿐만 아니라 Fab 면역글로블린 발현 라이브러리의 생성물을 포함하는 Fab 단편을 포함한다.
모든 척추동물 HMG B 박스가 높은 정도의 서열 보존성을 보이기 때문에, 모든 척추동물 HMG B 박스가 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발할 수 있다고 생각된다. 따라서, 모든 척추동물 HMG B 박스에 대한 항체는 본 발명의 범위 내이다. HMG B 박스는 바람직하게는 포유동물 HMG B 박스, 보다 바람직하게는 포유동물 HMG1 B 박스, 가장 바람직하게는 서열번호 5 또는 서열번호 20로서 본원에 제공된 인간 HMG1 B 박스이다.
B 박스 면역원에 대해 생성된 항체는 동물, 바람직하게는 비인간에게 통상적인 프로토콜을 사용하여 B 박스, B 박스 단편, 또는 B 박스 또는 B 박스 단편을 포하하는 세포를 투여함에 의해 수득될 수 있다. 항원적으로 또는 면역학적으로 등가물인 유도체 또는 이들의 융합 단백질과 같은 폴리펩티드는 마우스 또는 래트 또는 닭과 같은 다른 동물을 면역화하는 데 항원으로서 사용된다. B 박스 또는 단편 면역원은 안전성을 제공하거나 B 박스 또는 B 박스 단편의 면역원성을 증가시키기 위하여 융합 단백질로서 제공된다. 면역원은 예를 들어 면역원성 담체 단백질 예를 들어 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀림펫헤모시아민(KLH)와 컨주게이션에 의해 결합될 수 있다. 대안적으로, B 박스 또는 단편의 다중 복사체를 포함하는 다중 항원성 펩티드는 충분히 항원성이어서 담체의 사용을 회피하도록 면역원성을 증강시킬 수 있다. 각각이 상이한 B 박스 에피토프에 대해 발생된 2개의 항원 결합 도메인을 가지는 이특이적 항체는 또한 통상적인 방법에 의해 생성될 수 있다.
단클론성 항체의 제조를 위하여, 세포주 연속 배양에 의해 생성된 항체를 제공하는 당분야에 공지된 모든 기술이 사용될 수 있다. 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975; Kozbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; 및 Cole et al., pg 77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPHY, Alan R. Liss, Inc., 1995]을 참조할 수 있다.
단쇄 항체의 생성을 위한 기술(미국 특허 제 4,946,778호)는 B 박스 또는 단편에 대한 단쇄 항체를 제조하도록 적합화될 수 있다. 또한, 형질도입 마우스 또는 다른 포유동물과 같은 다른 생물체가 인체적합화된 항체를 발현하는데 사용될 수 있다.
항체는 체내 적용으로 치료적으로 사용된 경우에, 항체는 바람직하게는 개체에서 덜 면역원성이 되도록 개질될 수 있다. 예를 들어, 개체가 인간인 경우에, 항체는 바람직하게는 "인체적합화"되고; 여기서 항체의 상보적인 결정 영역은 인간항체로 이식된다[참조: Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; 및 Tempest et al., Biotechnology 9: 266-273, 1991].
파지 디스플레이 기술은 또한 항-B 박스 항체를 가지는 지에 대해 스크리닝된 인간의 PCR 증폭된 v-유전자의 레파토리 또는 미경험 라이브러리로부터의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 가지는 항체 유전자를 선택하는데 사용될 수 있다[참조: McCaffery et al., Nature 348: 552-554, 1990; 및 Marks et al., Biotechnology 10: 779-783, 1992]. 이러한 항체의 친화성은 또한 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의해 개선될 수 있다[참조: Clack et al., Nature 352: 624-628, 1991].
HMG B 박스 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 수득되는 경우에, 이들은 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 능력에 대해 과도한 실험 없이 스크리닝될 수 있다.
임의의 단일 염증전 시토카인의 생성을 억제할 수 있는 항-HMG B 박스 항체는 본 발명의 범위 내이다. 바람직하게는, 항체는 TNF, IL-1β, 또는 IL-6의 생성을 억제할 수 있다. 가장 바람직하게는, 항체는 척추동물 세포에 의해 생성된 염증전 시토카인의 생성을 억제할 수 있다.
HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편에 대한 항체를 사용하여 세포로부터의 염증전 시토카인의 방출을 억제하거나 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법을 위하여, 세포는 면역 세포 예를 들어 마크로파지, 단핵구 또는 호중구이다. 가장 바람직한 구체예에서, 세포는 마크로파지이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 부형제 중에 상기 설명된 항체 제조물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 조성물은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 억제할 수 있다. 이러한 조성물로 치료될 수 있는 질환은 앞서 나열되었다.
상기 기술된 항체 조성물은 앞서 기술된 초기 패혈증 매개체의 길항제를 또한 포함할 수 있다.
이러한 구체예에서 B 박스 폴리펩티드 및 이들의 생물학적 활성 단편은 시험관내 또는 생체외에서 적절히 단리된 세포의 염증성 시토카인을 유발하거나 생체내에서의 치료로 사용될 수 있다. 이러한 치료에서, 상기 폴리펩티드 또는 단편은 엔코딩된 B 박스 또는 B 박스 단편에 작동적으로 연결된 적절한 조절 서열을 가지는, B 박스 또는 B 박스 단편을 엔코딩하는 DNA 또는 RNA 벡터을 제공함에 의해 투여되어 B 박스 또는 B 박스 단편이 치료될 세포 또는 환자에서 합성될 수 있다. 생체내 용례는 B 박스 폴리펩티드 또는 B 박스 단편 폴리펩티드 또는 벡터의 중량 감소 치료의 용도를 포함한다. 국제출원 공개번호 WO 00/47174(전체 교시내용이 본원에 참조로 통합됨)를 참조할 수 있는데, 이는 HMG1을 이용한 치료가 중량 손실을 유발한다는 것을 증명한다. HMG B 박스가 HMG 단백질의 활성을 가지는 경우에, B 박스는 또한 중량 손질을 유도할 수 있다고 기대된다. B 박스의 기능을 가지는 HMG B 막스 단편은 또한 중량 손실을 유발하는 것으로 기대된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 포유동물 세포로부터 염증전 시토카인의방출을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 논의된, 임의의 HMG A 박스 조성물 또는 임의의 HMG B 박스 또는 HMG B 박스 생물학적 활성 단편으로 세포를 처리하는 것을 포함한다.
상기 방법은 염증전 시토카인을 생성하는 임의의 포유동물 세포로부터의 시토카인 방출을 억제하는데 유용할 것이라고 생각된다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 염증전 시토카인의 마크로파지 생성은 몇가지 중요한 질병과 관련되기 때문에 세포는 마크로파지이다.
상기 방법은 포유동물 세포에 의해 생성된 염증전 시토카인의 억제를 위하여 유용할 것이라고 생각된다. 바람직한 구체예에서, 염증전 시토카인은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF, 또는 IL-6이고, 이는 이러한 염증전 시토카인이 특이 중요한 질병의 매개체이기 때문이다.
이러한 구체예의 방법은 세포의 염증전 시토카인 생성의 생물학적 특성을 결정하기 위한 연구에서와 같이 시험관내 적용을 위하여 유용하다. 그러나, 바람직한 구체예는 생체내 치료적 적용인데, 여기서 세포는 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 환자 중에 있는 것이다.
이러한 생체 내 구체예들은 이전에 설명된 바 있는 것들 중 임의의 것을 포함하여, 염증성 시토카인 캐스케이드에 의해 매개된 임의의 질환에 유용한 것으로 믿어진다. 바람직한 질환들은 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병, 천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 화상, 알츠하이머병, 복강병, 울혈성 심부전, 성인성 호흡곤란증후군, 뇌경색, 뇌색전증, 척수손상, 마비, 동종이식 거부 및 이식-대-숙주 질병을 포함한다. 대부분의 바람직한 구체예에서, 질환은 내독소 쇼크 또는 동종이식 거부이다. 질환이 동종이식 거부인 경우에, 조성물은 유리하게는 시클로스포린과 같은 동종이식 거부를 억제하는 데 사용되는 면역억제제를 또한 포함한다.
이러한 방법은 유용하게는 초기 패혈증 매개체의 길항제의 투여를 포함한다. 이러한 길항제는 앞서 논의되었다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 환자의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 논의된, 임의의 HMG A 박스 조성물(비천연 A 박스 폴리펩티드 및 A 박스 생물학적 활성 단편을 포함) 또는 임의의 HMG B 박스 또는 B 박스 생물학적 활성 단편 항체 조성물(비천연 B 박스 폴리펩티드 또는 이들의 생물학적 활성 단편)을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 앞서 나열된 것들을 포함하여 염증성 시토카인 캐스캐이드에 의해 매개되는 임의의 질환에 유용한 것으로 기대될 것이다. 앞서 기술된 생체내 방법을 이용하는 것으로서, 바람직한 질환은 충수염, 펩신성, 위, 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 이완불능증, 담관염, 담낭염, 복강병, 간염, 크론병, 장염, 및 휘플병,천식, 알레르기, 아나필락시성 쇼크, 면역 복합체 질병, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 건초열, 패혈증, 셉티세미아, 내독소성 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 화상, 알츠하이머병, 복강병, 울혈성 심부전, 성인성 호흡곤란증후군, 뇌경색, 뇌색전증, 척수손상, 마비, 동종이식 거부 및 이식-대-숙주 질병을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 질환은 내독소 쇼크 또는 동종이식 거부이다. 질환이 동종이식 거부인 경우에, 조성물은 이롭게는 시클로스포린과 같은, 동종이식 거부를 억제하는 데 사용되는 면역억제제를 또한 포함할 수 있다.
이러한 방법은 유용하게는 또한 초기 패혈증 매개체의 길항제의 투여를 또한 포함할 수 있다. 이러한 길항제의 특성은 앞서 논의되었다.
다른 구체예에서, 본 발명은 세포로부터의 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 임의의 B 박스 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 B 박스 단편 폴리펩티드 예를 들어 (비천연 B 박스 폴리펩티드 및 단편을 포함하여) 본원에 기술된 서열번호 5, 서열번호 20, 서열번호 16, 또는 서열번호 23의 서열로 세포를 처리하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 적용 예를 들어 생성 세포의 생물학에 대한 염증전 시토카인 생성의 효과를 연구하기 위한 것으로 유용하다. 상기 방법은 생체내 적용 예를 들어 앞서 논의된 바와 같이 중량 손실을 유발하거나 비만을 치료하는 데 유용하다.
따라서, 추가의 구체예에서, 본 발명은 환자의 중량 손실을 유발하고 비만을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 약제학적으로 허용되는 부형제 중의 본원에 기술된 유효량의 B 박스 폴리펩티드 또는 B 박스 단편 폴리펩티드(비천연 B박스 폴리펩티드 및 단편)을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
세포로부터의 염증전 시토카인의 방출의 조절제 스크리닝
본 발명은 화합물(시험 화합물)이 염증 및/또는 염증성 반응을 억제하는 지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 화합물을 (a) 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편에 노출된 경우에 염증전 시토카인을 방출하는 세포 및 (b) HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편과 혼합하는 것을 포함하여 화합물이 염증을 억제하는 지를 결정하고 난 후에, 적절한 대조군과 비교하여 상기 화합물이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정하는 것을 포함한다. 상기 검정에서 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 화합물은 염증 및/또는 염증성 반응을 치료하는 데 사용될 수 있는 화합물이다. HMG B 박스 또는 생물학적 활성 HMG B 박스 단편은 세포에 내인성이거나 표준 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 세포에 도입될 수 있다.
시험 화합물의 부내 중에 척추동물 HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편으로의 노출에 반응하여 염증전 시토카인을 방출하는 임의의 세포는 본 발명에 유용할 것이라고 기대된다. 많은 질환을 위하여 바람직한 세포는 인간 마크로파지라고 기대된다.
화합물이 세포로부터의 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정하기 위한 임의의 방법은 이러한 구체예를 위하여 유용할 것이다. 바람직한 방법이 예를 들어 임의의 많은 구입가능한 ELISA 검정을 이용한 염증전 시토카인의 직접적인 측정이라고 생각된다. 그러나, 일부 구체예에서, 방출된 시토카인의 염증성 효과의 측정은 특히 시험 세포에 의해 생성된 몇가지 염증전 시토카인이 있는 경우에 바람직할 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, 많은 중요한 질병을 위하여, 우세한 염증전 시토카인은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF, 또는 IL-6이고, 특히 TNF이다.
본 발명은 또한 화합물이 염증 반응 및/또는 염증을 증가시키는 지를 결정하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 화합물을 (a) 척추동물 HMG A 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편에 노출된 경우에 염증전 시토카인을 방출하는 세포 및 (b) HMG A 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편과 혼합하는 것을 포함하여 화합물이 염증을 억제하는 지를 결정하고 난 후에, 적절한 대조군과 비교하여 상기 화합물이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증가시키는 지를 결정하는 것을 포함한다. 상기 검정에서 염증전 시토카인의 방출을 감소시키는 화합물은 염증성 반응 및/또는 염증을 증가시키는 데 사용될 수 있는 화합물이다. HMG A 박스 또는 HMG A 박스 생물학적 활성 단편은 세포에 내인성일 수 있거나 표준 재조합 분자 생물학 기술을 사용하여 세포로 도입될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이 염증의 억제제를 확인하는 데 유용한 세포 타입에 유사하게, 염증전 시토카인의 방출이 임의의 시험 화합물의 부재 하에 척추동물 HMG A 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편으로의 노출에 반응하여 정상적으로 억제되는 임의의 세포는 본 발명에 유용할 것이라고 기대된다. 선택된 세포는 시험되는 억제 화합물로 처리될 질환의 변인에 있어 중요할 것이라고 생각된다. 많은 질환을 위하여, 바람직한 세포는 인간 마크로파지라고 기대된다.
화합물이 세포로부터의 염증전 시토카인의 방출을 증가시키는 지를 결정하기위한 임의의 방법은 이러한 구체예를 위하여 유용할 것이다. 바람직한 방법은 예를 들어 임의의 많은 구입가능한 ELISA 검정으로 염증전 시토카인의 직접적인 측정법이라고 생각된다. 그러나 일부 구체예에서, 방출된 시토카인의 염증성 효과의 측정법이 특히 시험 세포에 의해 생성된 몇가지 염증전 시토카인이 있는 경우에 바람직할 수 있다. 앞서 논의된 바와 같이, 많은 중요한 질환을 위하여, 우세한 염증전 시토카인은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF, 또는 IL-6이고, 특히 TNF이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 하기 실시예에서 기술된다. 본 발명의 범위에 속하는 다른 구체예는 본원에 개시된 발명의 명세서 또는 실시를 참작하여 당업자에게 명확할 것이다. 실시예 및 청구범위와 함께 명세서는 일례로서만 고려될 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
HMG1의 클로닝 및 HMG1 돌연변이체의 생성
인간 HMG1의 클론 및 돌연변이체를 제조하기 위하여 하기 방법을 사용하였다. 재조합 전장 인간 HMG1(651개 염기쌍; 진뱅크 승인 번호 U51677)을 하기 프라이머를 사용하여 인간 뇌 퀵-클론 cDNA 제조물(클론텍, 팔로 알로, CA)로부터 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다; 순방향 프라이머: 5'GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3'(서열번호 6) 및 역방향 프라이머: 5'GCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTC3'(서열번호 7). 이간 HMG1 돌연변이를 클로닝하였고 하기와 같이 정제하였다. 인간 HMG1의 트렁케이션(truncation)된 형태는 인간 뇌 퀵-클론 cDNA 제조물(클론텍, 팔로 알로, CA)로부터 PCR 증폭에 의해 클로닝하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같았다(순방향 및역방향 각각):
정지 코돈을 각 돌연변이체에 첨가하여 단백질 크기의 정확도를 확실히 하였다. PCR 생성물은 제조자의 지시에 따라 TA 클로닝 방법(인비트로겐, 칼스버그, CA)를 사용하여 pCRII-TOPO 벡터 EcoRI 영역으로 서브클로닝하였다. 증폭 후에, PCT 생성물은 EcoRI으로 소화되고 GST 태그 pGEX(파마시아)를 가진 발현 벡터 상으로 서브클로닝하였고; 정확한 배향 및 양성 클로을 두 가닥 모두를 DNA 시퀀싱함에 의해 확인하였다. 제조합 플라스미드를 프로티아제 결핍E.Coli균주 BL21 또는 BL21(DE3)plysS(노바겐, 매디슨, WI)로 형질전환시키고, 융합 단백질을 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도하였다. 재조합 단백질을 글루타티온 세파로오스 수지 칼럼(파마시아)로 친화성 정제를 사용하여 수득하였다.
상기 기술한 바와 같이 생성된 HMG 돌연변이체는 하기 아미노산 서열을 가진다.
HMG1 단백질이 부족한 GST 벡터로부터 생성된 폴리펩티드는 대조군(GST 태그만을 함유)으로서 포함되었다. 야생형 HMG1 및 돌연변이체 일부(카르복시 말단 및 B 박스)에 결합하는 불활성 박테리아 DNA에, 카르복시 말단 및 B 박스 돌연변이체를 위하여 DNase I(라이프 테크놀로지)를, 또는 야생형 HMG1을 위하여 벤조나아제 누클리아제 (노바겐, 메디슨, WI)을 약 20 유닛/㎖ 박테리아 용해물의 속도로 첨가하였다. DNA의 분해를 처리 전 후에 HMG1 단백질을 함유하는 아가로스 겔의 에티디움 브로마이드에 의해 증명하였다. 단백질 용출물을 폴리믹신 B 칼럼(피어스,록포드, IL)을 거쳐 통과시켜, 임의의 오염 LPS를 제고하였고, 인산염 완충 염수에 대하여 집중적으로 투석하여 과량의 환원된 글루타티온을 제거하였다. 다음에, 제조물을 동결건조시키고 사용 전에 멸균 수중에서 재용해시켰다. LPS 수준은, 리물루스 아메보사이트 용해물 검정(Limulus amebocyte lysate assay: 바이오 휘탁커 인크., 워커스빌, MD)에 의해 측정되었을 때, 모든 돌연변이체에 대해 60pg/㎍ 단백질 미만이었고 야생형 MHG-1에 대해 300pg/㎍ 이었다. 단백질의 온전성을 SDS-PAGE에 의해 증명하였다. 재조합 래트 HMG1[참조: Wang et al., Science 285: 248-251, 1999]는 정제된 인간 HMG1에서 관찰된 단편을 분해시키지 않기 때문에 이를 일부 실험에서 사용하였다.
펩티드 합성
유타 주립 대학 생물공학 센터(로간, 유타)에서 펩티드를 합성하고 90% 순도로 HPLC 정제하였다. 내독소는 리물러스 검정에 의해 측정된 합성 펩티드 제조물에서 검출되지 않았다.
세포 배양
쥐과의 마크로파지 유사 RAW 264.7 세포(아메리칸 타입 컬처 콜렉션, 로크빌, MD)를 10% 우태아 혈청(제미니, 카타바사스, CA), 페니실린, 및 스트렙토마이신(라이프 테크놀로지)가 보강된 RPMI 1640 배지 중에서 배양하였고, 혈청 비함유 Opti-MEM I 배지(라이프 테크놀로지, 그랜드 아일랜드, NY) 중에 90% 컨플루언스로 사용하였다. 폴리믹신 B(시그마, 세인트 루이스, MO)를 100 내지 1,000 유닛/㎖로 통상적으로 첨가하여 앞서 기술된 바와 같은 임의의 오염 LPS의 활성을 중화시켰으며; 폴리믹신 B는 단독으로 트리판 블루로 검정된 세포 생존력에 영향을 주지 않았다(Wang et al., 상기와 같음). 폴리믹신 B는 합성 펩티드 연구의 실험에서 사용하지 않았다.
세포로부터의 TNF 방출의 측정
TNF 방출을 30pg/㎖의 최소 검출 농도를 보이는 표준 쥐과 섬유아세포 L929(ATCC, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 록크빌, MD) 세포독성 생검정(Bianchi et al., 상기와 같음)에 의해 측정하였다. 재조합 마우스 TNF를 R&D 시스템 인크.(미네아폴리스, MN)으로부터 수득하였다. 쥐과 섬유아세포 L929 세포(ATCC)를 5% CO2를 함유한 가습 인큐베이터 중에서 10% 우태아 혈청(제미니, 카타바사스, CA), 페니실린(50유닛/㎖) 및 스트렙토마이신(50㎍/㎖)(라이프 테크놀로지)가 보강된 DMEM(라이프 테크놀로지, 그랜드 아일랜드, NY)로 배양하였다.
항체 생성
HMG1 B 박스에 대한 다클론성 항체를 토끼(코칼리코 바이올로직스, 인크., 림스타운, PA) 중에서 발생시키고 면역블롯팅에 의해 역가를 결정하였다. IgG를 제조자의 지시에 따라 단백질 A 아가로스(피어스, 락크포드, IL)를 사용하여 항HMG1 항혈청으로부터 정제하였다. 항-면역 토끼 IgG를 시그마(세이트 루이스, MO)로부터 구입하였다. 항체는 면역검정에서 전장 HMG1 및 B 박스를 검출하였지만, TNF, IL-1, 및 IL-6와 교차반응하지 않았다.
Na- 125 I를 이용한 HMG1의 라벨링 및 세포 표면 결합
정제된 HMG1 단백질(10㎍)을 제조자의 지시에 따라 요오도-비드(피어스, 락크포드, IL)을 사용하여 담체 비함유125I의 0.2 mCi로 방사성라벨링시켰다.125I-HMG1 단백질을 미리 300mM 염화나트륨, 17.5mM 시트르산 나트륨, pH 7.0의 0.1% 우혈청 알부민(BSA)로 평형시킨 겔 크로마토그래피 칼럼(P6 마이크로 바이오-스핀 크로마토그래피 칼럼)에 의해 미반응125I으로부터 분리시켰다. 세포 표면 결합 연구를 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다[참조: Yang et al., Am. J. Physiol. 275: C675-C683, 1998]. RAW 264.7 세포를 24 웰 디쉬 중에 플레이팅하였다. 이 세포를 0.1% BSA를 함유하는 얼음으로 냉각된 PBS로 2회 세척하고 120mM 염화나트륨, 1.2mM 황산 마그네슘, 15mM 아세트산 나트륨, 5mM 염화칼륨, 10mM Tris.HCl, pH7.4, 0.2% BSA, 5mM 글루코오스, 및 25,000 cpm125I-HMG1을 함유하는 0.5㎖ 결합 완충액으로 2 시간 동안 4℃에서 결합을 수행하였다. 인큐베이션이 끝나면, 상청액을 재거하고 세포를 0.1% BSA를 함유하는 얼음으로 냉각된 PBS로 세척하고 0.5N NaOH 0.5㎖ 및 0.1% SDS로 실온에서 20분간 용해시켰다. 다음에, 용해물의 방사성활성을 감마 카운터를 사용하여 측정하였다. 특이적 결합은 총 결합에서 과량의 라벨링되지 않은 HMG1 또는 A 박스 단백질의 존재 하에 수득된 방사성활성을 빼서 결정하였다.
동물 실험
TNF 넉아웃 마우스를 앰젠(따우샌드 옥스, CA)로부터 입수하여 B6x129 바탕 상에 놓았다. 연령이 일치된 야생형 B6x129 마우스를 연구를 위한 대조군으로 사용하였다. 마우스를 플로리다 대학의 특정 병원균이 없는 형질전황 마우스 기지(게인스빌, FL)에서 내부적으로 기르고, 6 내지 8주령의 것을 사용하였다.
수컷 6 내지 8 주령된 Balb/c 및 C3H/HeJ 마우스를 할렌 스프라그-다우리(인디애나폴리스, IN)로부터 구입하여 실험에 사용하기 전에 7일 동안 순응시켰다. 모든 동물을 표준 온도, 명암 사이클 하에서 노쓰 소여 대학 병원 동물 기지에서 보관하였다.
맹장 결찰 및 천공
맹장 결찰 및 천공(CLP)을 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다[참조: Fink and Heard, J. Surg. Res. 49: 186-196, 1990; Wichmann et al., Crit. Care Med. 26: 2078-2086, 1998; 및 Remick et al., Shock 4: 89-95, 1995). 간략하게, Balb/c 마우스를 75 ㎎/kg 케타민(폴트 도지, 폴트 도지, 아이오와) 및 10 ㎎/kg 자일라진(뵈링거 인하임, 세인트 조세프, MO)로 근내로 마취시켰다. 중심선을 절개하고 맹장을 분리하였다. 6-0 프롤렌 봉합 결찰을 회맹부 밸브로부터 덜어진 맹장 팁으로부터 수평 5.0mm에서 수행하였다.
다음에 결찰된 맹장 절단단을 변을 직접적으로 밀어내지 않고 22 가우지 니들로 1회 천공하였다. 다음에 맹장을 정상적인 복부 내 위치로 다시 위치시켰다. 다음에 복부를 체액이 세지 않도록 각각 복막과 근막 2층에서의 6-1 프롤렌의 러닝 봉합으로 닫았다. 모든 동물을 피하로 20㎖/kg 체중으로 투여된 통상적인 염수 용액으로 소생시켰다. 수술 30분 후에 각 마우스에 이미페넴(0.5㎎/마우스)(프리맥심, 머크 & 코., 인크., 웨스트 포인트, PA)를 피하로 주사하였다. 다음에 상기동물들을 소생되도록 하였다. 상기 과정 후 1주일까지 사망률을 기록하였고, 생존동물을 2주 동안 후기 사망이 일어나지 않았음을 확인하였다.
D-갈락토사민 감작된 마우스
D-갈락토사민 감작된 모델은 종래 기술된 바 있다[참조: Galanos et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 76: 5939-5943; 및 Lehmann et al., J. Exp. Med. 165: 657-663, 1997]. 마우스에 20㎎ D-갈라토사민-HCL(시그마)/마우스(200㎕ PBS 중) 및 0.1 또는 1㎎의 HMG1 B 박스 또는 벡터 단백질(200㎕ PBS 중)로 복강내 주사하였다. 사망률을 주사 후 72 시간까지 매일 기록하였고; 생존동물을 2주 동안 놔 두었고, B 박스 독성에 의한 이후 사망을 관찰되지 않았다.
비장 박테리아 배양
14마리의 마우스에 본원에 기술된 CLP 후 24 및 30 시간에 항 HMG1-항체(n=7) 또는 대조군(n=7) 중 어느 하나를 투여하였다. 비장 박테리아를 앞서 기술한바와 같이 회수하였다[참조: Villa et al., Endotoxin Res. 4: 197-204, 1997]. 비장을 멸균 기술을 이용하여 제거하고 2㎖ PBS 중에서 균질화하였다. PBS로 계열희석시킨 후에, 균질화물을 트립신에 의한 콩 아가 플레이트 상(디프코, 디트로이트, MI)에 0.15㎖ 분취량으로 플레이팅하였고, CFU를 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후에 계수하였다.
통계 분석
데이터는 다르게 기술되지 않는 이상 평균±SEM으로 제시하였다. 그룹 간의 차이는 투-테일드 스튜던트 t-테스트(two-tailed Student's T test), 원-웨이ANOVA(one-way ANOVA)에 의해 결정하고, 최소유의차검정 또는 투-테일드 피셔 이그잭트 테스트(2 tailed Fisher's Exact Test)에 의해 결정하였다.
실시예 2: 시토카인 활성의 증강을 위한 HMG1 도메인 맵핑
HMG1은 2배 DNA 결합 도메인 (A 및 B 박스) 및 음전하를 띤 산성 카르복실 테일을 가진다. HMG1 시토카인 활성의 구조적 기초를 밝히고 염증성 단백질 도메인을 맵핑하기 위하여, 본 발명자들은 돌연변이에 의하여 HMG1의 전장 및 트렁케이션된 형태를 발현시키고 단핵구 배양액 중의 활성을 증강시키기 위한 정제된 단백질을 스크리닝하였다(도 1). 정장 HMG1, 카르복시 말단이 결실된 돌연변이, B 박스만을 함유하는 돌연변이체, 및 A 박스만을 함유하는 돌연변이체를 생성시켰다. 인간 HMG1의 이러한 돌연변이체를 본원에 기술된 특정 프라이머를 사용하여 중합체 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조하였고, 돌연변이 단백질을 제조자의 지시에 따라 S-트랜스퍼라아제 (GST) 유전자 융합 시스템(파마시아 바이오테크, 피스카타웨이, NJ)를 사용하여 발현시켰다. 간략하게, PCR 방법에 의해 제조된 DNA 단편을 GST 융합 벡터에 융합시키고E.coli에서 증폭시켰다. 다음에, 발현된 HMG1 단백질 및 HMG1 돌연변이체를 GST 친화성 칼럼을 사용하여 분리시켰다.
쥐과 마크로파지 유사 RAW 264.7 세포(ATCC)로부터 TNF 방출에 대한 돌연변이체의 효과를 하기와 같이 수행하였다. RAW 264.7 세포를 0% 우태아 혈청(제미니, 카타바사스, CA), 페니실린 및 스트렙토마이신(라이프 테크놀로지)이 보강된 RPMI 1640 배지(라이프 테크놀로지, 그랜드 아일랜드, NY) 중에서 배양시켰다. 임의의 오염 LPS의 활성을 억제하기 위하여 100 유닛/㎖로 폴리믹신(시그마, 세인트루이스, CA)을 첨가하였다. 세포를 8시간 동안 Opti-MEM I 배지 중에서 1㎍/㎖의 전장(야생형) HMG1 및 각 HMG1 돌연변이 단백질로 인큐베이션시켰고, 컨디셔닝된 상청액(세포로부터 방출된 TNF 함유)을 수집하였고, 세포를 30pg/㎖의 최소 검출 농도를 보이는 표준 쥐과 섬유아세포 L929(ATCC) 세포독성 생검정(Bianchi et al., 상기와 같음)에 의해 측정하였다. 재조합 마우스 TNF를 R & D 시스템 인크.(미네아폴리스, MN)으로부터 입수하여 상기 실험에서 대조군으로 사용하였다. 이러한 연구의 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1의 데이터는 다르게 지적되지 않는 한 평균+SEM(N=6 내지 10)으로 제시되었다.
도 1에 도시된 바와 같이, 야생형 HMG1 및 카르복실-트렁케이션된 HMG1은 단핵구 배양(쥐과 마크로파지 유사 RAW 264.7 세포)에 의해 TNF 방출을 상당히 증강시켰다. B 박스는 단핵구 TNF 방출의 잠재적인 활성화제였다. B 박스의 이러한 증강 효과는 A 박스 단독으로는 TNF 방출을 약하게 활성화시키기 때문에 특이적이었다.
실시예 3: HMG1 B 박스 단백질은 용량 의존 방식으로 시토카인 활성을 상승시킨다
HMG1 B 박스의 시토카인 생성에 대한 효과를 추가로 검사하기 위하여, 다양한 양의 HMG1 B 박스를 쥐과 마크로파지 유사 RAW 264.7 세포 중의 TNF, IL-1B, 및 IL-6 생성에 대한 효과를 위하여 평가하였다. RAW 264.7 세포를 8시간 동안 도 2A 내지 2C에 도시된 바와 같이 0 내지 10 ㎍/㎖로 B 박스 단백질로 증강시켰다. 컨디셔닝된 배지를 회수하고 TNF, IL-1β, 및 IL-6 수준에 대하여 측정하였다. TNF수준은 본원에 기술된 바와 같이 측정되었고 IL-1β 및 IL-6 수준은 마우스 IL-1β 및 IL-6 효소 연결된 면역흡착제 검정(ELISA) 키트(R&D 시스템 인크., 미네아폴리스, MN)을 사용하여 측정되었고, 모든 실험에 대해서 N>5였다. 이러한 연구의 결과를 도 2A 내지 2C에 도시하였다.
도 2A에 도시된 바와 같이, RAW 264.7 세포로부터의 TNF 방출은 세포에 투여된 B 박스의 증가된 양으로 증가되었다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 1㎍/㎖ 또는 10㎍/㎖의 B 박스의 첨가는 RAW 264.7 세포로부터의 IL-1β의 증가된 방출을 유발하였다. 또한, 도 2C에 도시된 바와 같이, RAW 264.7 세포로부터의 IL-6 방출은 세포에 투여된 B 박스의 증가된 양으로 증가되었다.
B 박스-유발된 TNF 방출의 속도론을 또한 검사하였다. TNF 방출 및 TNF mRNA 발현을 0 내지 48 시간 동안 대조군(벡터)(10㎍/㎖)로서 사용된 B 박스 폴리펩티드 또는 GST 태그 폴리펩티드만에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 측정하였다. 상청액을 본원에 기술된 L929 세포독성 검정(N=3-5)에 의해 TNF 단백질 수준에 대해여 분석하였다. mRNA 측정을 위하여 세포를 100mm 플레이트 중에 플레이팅하였고 도 2D에 도시된 바와 같이 0, 4, 8, 또는 24 시간 동안 B 박스 폴리펩티드 또는 벡터 만을 함유한 Opti-MEM I 배지증에서 처리되었다. 벡터 단독 샘플을 4시간 시점에서 검정하였다. 세포를 플레이트로부터 긁어내고 총 RNA를 제조자의 지시에 따라 RNAzol B 방법(텔-테스트 "B" 인크., 프렌즈우드, TX)에 의해 분리하였다. TNF(287bp)를 RNase 보호 검정(암비온, 오스틴, TX)에 의해 측정하였다. 동일한 로딩 및 RNA의 온전성을 아가로스-포름알데하이드 겔 상에서 RNA 샘플의 에티듐 브로마이드에 의해 증명하였다. RNase 보호 검정의 결과를 도 2D에 도시하였다. 도 2D에 도시된 바와 같이, 단핵구의 B 박스 활성화가 유전자 전사 수준에서 나타났는데, 이는 TNF mRNA를 B 박스 단백질(도 2B)에 노출된 단핵구에서 상당히 증가하였기 때문이다. TNF mRNA 발현은 4시간에 최고였고 8시간 및 24시간에서 감소하였다. 벡터 단독 대조군(GTS 태그)는 TNF mRNA 발현에 효과를 보이지 않았다. B 박스 또는 벡터 단독(GTS 태그) 투여 후 0, 4, 8, 24, 32, 또는 48 시간에 본원에 기술된 L929 세포독성 검정을 사용하여 RAW 264.7 세포으로부터 방출된 TNF 단백질을 측정하여 수행하였다. 대조군(배지만)에 비하여, B 박스 처리는 TNF 단백질 발현(도 2F)를 중강시켰으나 벡터 단독(도 2E)는 그렇지 않았다. 데이터는 3개의 분리된 실험을 나타난다. 이들 데이터는 함께 HMG1 B 박스 도메인이 시토카인 활성을 가지고 전장 HMG1의 시토카인 자극 활성을 담당한다는 것을 나타낸다.
요약하면, TNF, IL-1β및 IL-6의 HMG1 B 박스 용량-의존적으로 자극된 방출은 전장 HMG1의 염증성 활성과 일치하였다[참조: Anderson et al., J. Exp. Med. 192: 565-570, 2000]. 또한, 이러한 연구는 최대 TNF 단백질 방출이 8 시간내에 일어났다는 것을 나타낸다(도 2F). TNF 방출의 이러한 지연된 패턴은 HMG1 그 자체에 의해 유발된 TNF 방출과 유사하고 LPS에 의해 유발된 TNF의 속도론보다 상당히 늦었다(Anderson et al., 상기와 같음).
실시예 4. HMG1 B 박스의 처음 20개 아미노산이 TNF 활성을 자극한다
HMG1 B 박스의 TNF 자극 활성을 추가로 맵핑하였다. 이러한 연구를 하기와 같이 수행하였다. B 박스의 단편을 본원에 설명된 합성 펩티드 보호 기술을 사용하여 생성하였다. HMG1 B 박스의 아미노산 1번 내지 20번, 16번 내지 25번, 30번 내지 49번, 45번 내지 64번, 또는 60번 내지 74번을 함유하는 5개 HMG1 B 박스 단편(서열번호 20)을 도 3에 도시된 바와 같이 생성하였다. 도시된 데이터는 평균±SEM이었다(n=3 실험, 각각은 이중으로 수행되었고 합성 펩티드의 3개 분리된 로트를 사용하여 유효하게 하였다). 도 3에 도시된 바와 같이, TNF-자극 활성은 서열번호 20의 HMG1 B 박스의 아미노산 1번 내지 20번에 상응하는 합성 펩티드(fkdpnapkrlpsafflfcse; 서열번호 16)에 의해 보유될 수 있다. 1 내지 20 량체의 TNF 증강 활성은 전장 합성 B 박스(1 내지 74량체) 또는 전장 HMG1보다 덜 유효하고 자극 효과는 HMG1 B 박스의 16-25, 30-49, 45-64, 또는 60-74번을 함유하는 아미노산 단편을 위한 합성 20량체는 TNF 방출을 유도하지 않았다. 이러한 결과는 B 박스의 마크로파지 자극 활성이 서열번호 20의 HMG B 박스 도메인의 처음 20개 아미노산을 특이적으로 맵핑한다는 것에 대한 직접적인 증거이다. 이러한 B 박스 단편은 예를 들어 염증전 시토카인의 방출을 자극하거나 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 환자의 질환을 치료하기 위한, 전장 B 박스 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리펩티드로서 동일한 방식으로 사용될 수 있다.
실시예 5: HMG1 A 박스 단백질은 용량 의존 방식으로 HMG1 유도 시토카인 활성을 길항작용한다
약한 작용제는 정의상 길항제이다. HMG1 A 박스는 단독으로 도 1에 도시된 바와 같이 TNF 셍성을 약하게 유발하기 때문에, HMG1 A 박스의 HMG1 활성의 길항제로서 작용하는 활성을 평가하였다. 이러한 연구는 하기와 같이 수행되었다. 24웰 디쉬의 서브 컨플루언트 RAW 264.7 세포를 Opti-MEM I 배지 중에서 16시간 동안 폴리믹심 B(100 유닛/㎖의 존재 하에 HMG1(1㎍/㎖) 및 0, 5, 10, 또는 25 ㎍/㎖의 A 박스로 처리하였다. A 박스를 주입받지 않은 샘플 중의 TNF-자극 활성(본원에 기술된 L929 세포독성 검정을 사용하여 검정)을 100%로 표현하였고 A 박스에 의한 억제가 HMG1 단독의 백분율로 발현시켰다. RAW 264.7 세포로부터의 TNF 방출에 대한 A 박스의 효과의 결과를 도 4A에 도시하였다. 도 4A에 도시한 바와 같이, A 박스 용량-의존적으로 억제된 HMG1은 약 7.5㎍/㎖의 겉보기 EC50으로 TNF 방출을 유도하였다. 도 4A 중의 데이터는 평균±SD(n=2 내지 3 독립적인 실험)로서 제시하였다.
실시예 6: HMG1 A 박스 단백질은 전장 HMG1 및 HMG1 B 박스 시토카인 활성을 억제한다
HMG1 A 박스 또는 GST 태그 (벡터 대조군)에 의한 전장 HMG1 활성의 길항작용을 또한 전장 HMG1과 A 박스의 공동 첨가에 의헤 자극된 RAW 264.7 마크로파지 배양물로부터의 TNF 방출을 측정함에 의해 결정하였다. RAW 264.7 마크로파지 세포(ATCC)를 24 웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 90% 플루언스로 사용하였다. 세포를 폴리믹심 B의 존재 하에 옵티멈 I 배지(라이프 테크놀로지, 그랜드 아일랜드, NY) 중에서 16 시간 동안 지적된 HMG1 및/또는 A 박스로 처리하였고, 상청액을 TNF 측정을 위해 수집하였다(마우스 ELISA 키트, R&D 시스템 인크., 미네아폴리스, MN). TNF-유도 활성을 HMG-1 단독으로 달성된 활성의 백분율로 표현하였다. 이러한 연구의 결과는 도 4B에 도시된었다. 도 4B는 HMG1 단독, A 바그 단독, 벡터(대조군) 단독, A 박스와 조합된 HMG1, 및 벡터와 조합된 HMG1의 효과의 막대그래프이다. 도 4B에 도시된 바와 같이, HMG1 A 박스는 전장 HMG1의 TNF 증강 활성을 상당히 약화시켰다.
실시예 7: HMG1 박스 단백질은 이에 결합된 HMG1 시토카인 활성을 억제한다
HMG1 결합을 대체함에 의해 HMG1 A 박스가 길항제로 작용할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여,125I-라벨링된 HMG1을 마크로파지 배양물에 첨가하였고, 결합을 2시간 동안 4℃에서 측정하였다. RAW 264.7 세포 중에서의 결합 검정을 본원에 기술된 바와 같이 수행하였다.125I-HMG1 결합을 도 5A에 지시된 시간 동안 24 웰 디쉬에서 플레이팅된 RAW 264.7 세포에서 측정하였다. 관찰된 특이적 결합은 5,000배 몰 과량의 라벨링되지 않은 HMG1의 존재 하에 총 세포 관련된125I-HMG1(CPM/웰)에서 세포관련 CPM/웰을 뺀 것과 동일하였다. 도 5A는 시간에 따른125I-HMG1의 결합 그래프이다. 도 5A에 도시된 바와 같이, HMG1은 포화된 1차 결합 속도론을 보였다. 결합의 특이성은 실시예 1에 도시된 바와 같이 평가되었다.
또한,125I-HMG1 결합을 24 웰 디쉬 상에 플레이팅된 RAW 264.7 세포에서 측정하였고, 라벨링되지 않은 HMG1 또는 A 박스의 존재 하에서 또는125I-HMG1 단독으로 인큐베이션하였다. 이러한 결합 검정의 결과는 도 5B에 도시하였다. 데이터는1개의 분리된 실험으로부터 평균±SEM을 나타낸다. 도 5B는 총 CPM/웰의 백분율로서 측정된, 라벨링되지 않은 HMGB1 또는 HMGB1(MHG1) A 박스의 부재 하 또는 라벨링되지 않은 HMGB1 또는 HMGB1 A 박스의 5,000 몰 과량의 존재 하의125I-HMGB1의 세포 표면 결합의 막대 그래프이다. 도 5B에서, "총"은 4℃에서 2 시간 동안 라벨링되지 않은 HMGH1 또는 A 박스의 부재 하의 세포 결합125I-HMGB1의 분 당 계수(CPM)와 동일하다. "HMGB1" 또는 "A 박스"는 라벨링되지 않은 HMGH1 또는 A 박스의 5,000 몰 과량의 존재 하의 세포 결합125I-HMGB1의 CPM/웰과 동일하다. 데이터는 라벨링되지 않은 HMGB1 단백질(2,382,179 CPM/웰)의 부재 하에 얻어지는 총 계수의 백분율로서 표현된다. 이러한 결과는 HMG1 A 박스가 HMG1의 TNF-자극 활성을 억제하는 체외 HMG1 활성의 경쟁적 길항제임을 나타낸다.
실시예 8: 항 B 박스 다클론성 항체에 의한 전장 HMG1 및 HMG1 B 박스 시토카인 활성의 억제
전장 또는 HMG1 B 박스의 효과를 조절하는 HMG1 B 박스에 대한 항체의 활성을 또한 평가하였다. HMG1 B 박스(B 박스 항체)에 대하여 생성된 친화성 정제된 항체를 본원에 기술되 바와 같이 표준 기술을 사용하여 생성하였다. RAW 264.7 세포로부터 HMG1또는 HMG1 B 박스 유발된 TNF 방출에 대한 항체의 효과를 검정하기 위하여, 24 웰 디쉬에서 서브컨플루언스를 이룬 RAW 264.7 세포를 항 B 박스 항체(25㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖ 항원 친화성 정제됨, 코칼리코 바이올로직스, 인크., 림스타운, PA) 또는 비면역 IgG(25㎍/㎖ 또는 100㎍/㎖; 시그마) 첨가 없이 또는이를 첨가하여 10 시간 동안 HMG-1(1㎍/㎖) 또는 HMG1 B 박스(10㎍/㎖)로 처리하였다. RAW 264.7 세포로부터의 TNF 방출은 본원에 기술된 L929 세포독성 검정을 사용하여 측정하였다. 이러한 연구의 결과를 도 6에 도시하였으며, 이는 아무것도 투여되지 않거나, 1㎍/㎖ HMG1, 1㎍/㎖ HMG1 및 25㎍/㎖ 항-B 박스 항체, 1㎍/㎖ HMG1 및 25㎍/㎖ IgG(대조군), 10㎍/㎖ B-박스, 10 ㎍/㎖ B 박스 및 100㎍/㎖ 항-B 박스 항체, 또는 10㎍/㎖ B-박스 및 100㎍/㎖ IgG(대조군)이 투여된 RAW 264.7 세포에 의해 방출된 TNF의 막대그래프이다
실시예 9: HMG1 B 박스 단백질 은 D-갈락토사민 감작된 Balb/c 마우스에 독성이다
HMG1 B 박스가 체내에서 시토카인 활성을 가지는 지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은, 시토카인 독성을 연구하기 위하여 널리 사용되는 모델인(Galanos et al., 상기와 같음) HMG1 B 박스 단백질을 마취되지 않은 D-칼락토사민(D-gal)로 감작된 Balb/c 마우스에 투여하였다. 간략하게, 마우스(20 내지 25그램, 수컷, 할란 스프라그-도우리, 인디애나폴리스, IN)를 표 1에 도시된 바와 같이 D-gal(20㎎)(시그마) 및 B 박스(0.1㎎/㎖/마우스 또는 1 ㎎/㎖/마우스) 또는 GST 태그(벡터; 0.1㎎/㎖/마우스 또는 1㎎/㎖/마우스)로 복강내 주사하였다. 마우스의 생존력은 7일까지 모니터링되어 후에 사망하지 않았음을 확인하였다. 이러한 연구의 결과를 표 1에 도시하였다.
D-갈락토사민-감작된 Balb/c 마우스에 대한 HMG1 B 박스의 독성
처리 생존/전체
대조군 10/10
벡터 0.1 ㎎/마우스 2/2
1㎎/마우스 3/3
B 박스 0.1㎎/마우스 6/6
1㎎/마우스 2/8*
피셔 이그잭트 테스트에 의해 시험된 벡터 단독에 대한 p<0.01
이러한 연구의 결과는 HMG1 B 박스는 용량 의존 방식으로 D-갈락토사민 감작된 마우스에 치명적이었다. 사망이 발생한 모든 예에서, 사망은 12 시간 내였다. B 박스가 없는 정제된 GST 벡터 단백질의 상당한 제조물로 처리된 마우스에서 치사는 관찰되지 않았다.
실시예 10: HMG1 B 박스 단백질이 투여된, D-갈락도사민-감작된 Balb/c 마우스 또는 C3H/HeJ 마우스의 조직학
생체내에서 HMG1 B 박스 단백질의 치사율을 추가로 검사하기 위하여, HMG1 B 박스를 D 갈락토사민-감작된 Balb/c 마우스에 다시 투여하였다. 마우스(그룹 당 3마리)에 D Gal (20㎎/마우스) 및 B 박스 또는 벡터(1㎎/마우스)를 7시간 동안 복강내로 투여하였고, 다음에 단두술에 의해 희생시켰다. 혈액을 수집하고 기관(간, 심장, 신장, 및 폐)를 회수하여 10% 포름알데히드에 고정하였다. 조직 절편을 조직 평가를 위하 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 제조하였다(크리테리온 인크., 밴쿠버, 캐나다). 이러한 연구의 결과를 도 7A 내지 7J에 도시하였는데, 이는 처리되지 않은 마우스로부터 수득된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 신장 절편(도 7A), 심근 절편(도 7C), 폐 절편(도 7E) 및 간 절편(도 7G 내지 7I), 및 HMG1 B 박스로 처리된 마우스로부터 얻은 신장 절편(도 7B), 심근 절편(도 7D), 폐 절편(도 7F),및 간 절편(도 7H 및 7J)의 스캐닝된 이미지이다. 대조군 마우스와 비교하여, B 박스 처리는 신장(도 7A 및 7B) 및 폐(도 7E 및 7F)에서 비정상을 유발하지 않았다. 마우스는 일부의 허혈성 변화 및 심장의 심근 섬유의 가로 줄무의의 손실을 가졌다(도 7D에 화살표로 표시된 도 7C 및 7D). 간은 활성 간염에 의해 설명되는 바와 같이 B 박스에 의한 손상의 대부분을 가졌다(도 7G 내지 7J). 도 7J에서, 간세포 드롭아웃은 축적된 다형핵 백혈구에 의해 둘러싸여 있는 것으로 관찰된다. 도 7J의 화살표는 다형핵 축적(점선) 또는 애팝토틱 간세포(고형체)의 영역을 가리킨다. HMG1 B 박스의 생체내 투여는 또한 IL-6의 상당히 증가된 혈청 수준(315+93 대 20+7 pg/㎖, B 박스 대 대조군, p<0.05) 및 IL-1β의 상당히 증가된 혈청 수준(15+3 대 4+1 pg/㎖, B 박스 대 대조군, p<0.05).
C3H/HeJ 마우스(내독소에 반응하지 않음)에 B 박스 단백질을 투여하는 것을 또한 치명적이었고 이는 HMG1 B 박스가 LPS 시그날 트랜스덕션의 부재 하에 치명적임을 의미한다. B 박스의 투여 후 8시간 후에 수집된 헤마톡실린 및 에오신 염색된 폐 및 신장의 절편은 비정상적인 형태적 변화를 보이지 않았다. 그러나, 심장의 절편의 검사는 심근 섬유의 부정형 분홍 세포질과 관련된 가로 줄무의의 손실을 가지는 허혈의 증거를 나타낸다. 간 절편은 간세포 드랍아웃 및 애팝토시스와 함께 가벼운 급성 염증성 반응 및 수시의 다형핵 백혈구을 보였다. 이러한 특이적 병리학적 변화는 전장 HMG1의 투여 후에 관찰되는 것에 필적하고, B 박스가 단독으로 생체내 HMG1에 대한 치명적인 병리적 반응을 반복할 수 있다는 것을 확인시킨다.
HMG1의 TNF-자극 활성이 B 박스에 의한 사망율의 매개에 기여하는 지를 다루기 위하여 본 발명자들은 D-막락토사민(20㎎/마우스)로 감작되고 B 박스(1㎎/마우스, 복강내 주사)에 노출된 TNF-녹아웃 마우스(TNF-KO, Nowak et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 278: R1202-R1209, 2000) 및 야생형 대조군(B6×129균주)의 사망률을 측정하였다. B 박스는 야생형 마우스에 매우 치명적이었지만(노출된 마우스 중 6마리가 죽음), B 박스로 처리된 TNF-KO 마우스에서는 사망율이 관찰되지 않았다(노출되 9마리 중 1마리가 죽음, p<0.05 v. 야생형). 본원에 기술된 RAW 264.7 마크로파지로부터의 데이터와 함께, 이러한 데이터는 HMG1의 B 박스가 특이적 TNF-자극 시토카인 활성을 제공하는 것을 가리킨다.
실시예 11: HMG1 단백질 수준이 패혈증 마우스에서 증가한다
패혈증에서의 HMG1의 역활을 검사하기 위해, 본 발명자들은 마우스에서의 패혈증을 확립하였고 앞서 기술된 정량적 면역검정을 사용하여 혈헝 HMG1을 측정하였다(Wang et al., 상기와 같음). 마우스를, 외과적으로 생성된 맹장 맹낭을 천공함에 의해 유발되는 패혈증의 특성이 잘 규명된 모델인 맹장 결찰 및 천공(CLP)를 거치게 하였다(Fink and Heard, 상기와 같음; Wichmann et al., 상기와 같음;및 Remick et al., 상기와 같음). 다음에 HMG1의 혈청 수준을 측정하였다(Wang et al., 상기와 같음). 도 8은 CLP를 거친 후 0 시간, 8 시간, 18 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 마우스의 HMG1 수준을 도시하는 그래프로 이러한 연구의 결과를 도시하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 혈청 HMG1 수준은 맹장 천공 후 처음 8시간 동안은 그다지 증가하지 않았고, 18시간 후에 상당히 증가하였다(도 8). 증가된 혈청 HMG1는 앞서 기술된 엔도톡세미아의 지연된 HMG1 속도론과 꽤 유사한 속도론 프로파일로 CLP 후 적어도 72 시간 동안 상승된 상승 수준으로 유지되었다. 이러한 HMG1 방출의 일시적인 패턴은 마우스에서의 패혈증의 징후의 진전에 밀접하게 대응한다. 맹장 천공 후 처음 8시간 동안 동물들은 일부 감소된 활성 및 탐구 양상의 손실로 가볍게 아팠다. 그 후 18시간에 걸쳐 동물을 심하게 아팠고 입모를 가진 그룹으로 모였고, 물 또는 음식을 구하지 않았으며 외부 자극에 최소로 반응하거나 시험자에 의해 시험되었다.
실시예 12: HMG1 A 박스 단백질로 패혈증을 치료하는 것은 마우스의 새온을 증가시킨다
HMG1 A 박스가 패혈증 동안 HMG1의 사망을 억제할 수 있는 지를 결정하기 위해 마우스를 맹장 천공을 거치도록 하고 패혈증의 발병 후 24시간에 A 박스의 투여에 의해 치료하였다. CLP는 본원에 기술된 수컷 Balb/c에 수행하였다. 동물을 무작위적으로 15 내지 25 마리씩 그룹을 만들었다. HMG1 A 박스(매번 60 또는 600㎍/마우스) 또는 벡터(GST 태그, 600㎍/마우스)를 단독으로 CLP 후 24시간에 3일 동안 하루에 2회 복강내로 투여하였다. 생존률을 2주까지 매일 2회 모니터링하여 이후 사망이 일어나지 않았음을 확인하였다. 이러한 연구의 결과를 도 9에 도시하였는데 이는 시간에 따른 생존률에 대한 벡터(GST; 대조군) 60㎍/마우스 또는 600㎍/마우스의 효과의 그래프이다(*P<0.03 대 대조군, 피셔 이그잭트 테스트에 의해 시험됨). 도 9에 도시된 바와 같이 HMG1 A 박스의 투여는 마우스를 패혈증의 치사 효과로부터 구하였고 A 박스를 가지지 않은 벡터 단백질(GST)로부터 정제된단백질로 처리된 동물에서 28%로부터 A 박스를 주입 받은 동물에서 68%로 생존률을 개선시켰다(P<0.03, 피셔 이그잭트 테스트에 의함). 이러한 패혈증 모델의 HMG1 A 박스의 구제 효과는 벡터 유래 제조물로 처리된 대조군 또는 60㎍ 박스로 처리된 동물에 비하여 보다 상당히 경계적이고 활동적이고 음식물 섭취 양상을 재개하는 것으로 관찰되었다.
실시예 13: 항-HMG1 항체로 패혈증 마우스를 처리하는 것은 마우스의 생존률을 증가시킨다
항-HMG1 항체로 중증의 패혈증 마우스를 수동적으로 면역화하는 것을 또한 검사하였다. 이러한 연구에서, 수컷 Balb/c 마우스(20 내지 25 gm)에 본원에 기술된 바와 같이 CLP를 수행하였다. 친화성 정제된 항-HMG1 B 박스 다클론성 항체 또는 토끼 IgG(대조군)을 외과술 후에 3일 동안 매일 2회씩 24시간에 600㎍/마우스로 투여하였다. 생존률을 2주 동안 모니터링하였다. 이러한 연구의 결과는 도 10A에 도시되어 있고, 이는 대조군 항체 또는 항-HMG1 항체중 어느 하나로 처리된 패혈증 마우스의 생존률의 그래프이다. 결과는 패혈증 발병 후 24시간에 마우스에 투여된 항-HMG1 항체가 비면역 항체의 투여와 비교하여 동물을 상당히 구조함을 나타내었다(P<0.02 피셔 이그잭트 시험). 항-HMG1 항체의 투여 후 12 시간 내에, 시험된 동물은 비면역 세포를 받은 대조군에 비해 증가된 활성 및 반응성을 나타내었다. 비면역 항체로 시험된 동물은 웅크리고, 불량한 외형을 가지고 비활동적으로 남아 있었지만, 처리된 동물은 상당히 개선되었고 42시간 내에 정상적인 음식물 섭취 양상을 재개하였다. 항HMG1 항체는 이러한 모델에서 박테리아 증식을 억제하기 못했는데, 그 이유는 본 발명자들이 비적합한 항체를 받은 동물에 비하여 처리된 동물에서 CLP 후 31시간에 비장으로부터의 상당한 박테리아 수(GFU, 호기성 콜로니 형성 단위)를 관찰하였기 때문이다(대조군 박테리아 수 = 3.5±0.9×104CFU/g; n=7). 동물을 그 후 2주동안 모니터링하였고 이후 사망은 관찰되지 않았고, 이는 항HMG1으로의 치료가 치명적인 패혈증으로부터 완전한 구제를 제공하고 단순히 사망을 지연시키지 않았다.
본 발명자들이 알기로는, 다른 특정 시토카인 기재 치료제는 패혈증이 발명한 후 늦게 투여된 경우에 효과적이지 않다. 대조적으로, 항TNF의 투여는 실질적으로 이러한 모델에서 사망률을 증가시키고, 항 MIF 항체는 맹장 결찰 후 8시간 이후에 투여된 경우에 비효과적이었다(Remick et al., 상기와 같음; 및 Calandra et al., Nature Med. 6: 164-170, 2000). 이러한 데이터는 HMG1이 확립된 패혈증의 사망례를 구제하기 위하여 맹장 천공 후 24 시간과 같이 늦은 때에 표적화될 수 있다는 것을 증명한다.
항 B 박스 항체를 사용한 내독소 마우스의 구제의 다른 예에서, 항-HMG1 B 박스 항체는 LPS-유도 패혈증 마우스를 구제하는 능력에 대해 평가하였다. 수컷 Balb/c 마우스(20 내지 26gm, 그룹 당 26마리)를 복강내 주사(IP)된 LPS(15mg/㎏)의 LD75 용량으로 처리하였다. 항-HMG1 B 박스 또는 비면역 토끼 혈청(매번 IP로 마우스 당 0.3㎖)을 LPS 투여 후 0시간, +12시간, 및 +24시간에 투여하였다. 이러한 연구의 결과를 도 10B에 도시하였고, 이는 비면역 혈청 또는 항-HMG1 B 박스 항체가 투여된 패혈증 마우스의 생존률의 그래프이다. 도 10B에 도시된 바와 같이, 항-HMG1 B 박스 항체는 패혈증 마우스의 생존률을 개선시켰다.
실시예 14: 항 RAGE 항체를 사용하는 HMG1 시그날링 경로의 억제
종래 데이터는 상처 치료에서 평활근의 이동 및 뇌 발달 동안 신경돌기 성장을 매개할 수 있는 HMG1 수용체로서 RAGE를 관련시켰다(Hori et al. J. Biol. Chem. 270: 25752-25761, 1995; Merenmies et al., J. Biol. Chem. 266: 16722-16729, 1991; 및 Degryse et al., J. Cell. Biol. 152: 1197-1206, 2001). 본 발명자들은 항-RAGE 항체(25㎍/㎖) 또는 비면역 IgG(25㎍/㎖)의 존재 하의 HMG1(1㎍/㎖), LPS(0.1㎍/㎖), 또는 HMG1 B 박스(1㎍/㎖)로 자극된 RAW 264.7 배양물 중의 TNF 방출을 측정하였다. 간략하게, 세포를 24웰 조직 배양 플레이트로 시딩하고 90% 컨플루언스로 사용하였다. LPS(E.coli 0111: B4, 시그마, 세인트 루이스, MO)를 사용전에 20분 동안 소니케이션하였다. 세포를 도 11에 도시된 바와 같이 항-RAGE 항체(25㎍/㎖) 또는 비면역 IgG(25㎍/㎖)의 존재 하의 HMG1(1㎍/㎖), LPS(0.1㎍/㎖), 또는 HMG1 B 박스(1㎍/㎖)로 처리하였다. IgG 정제된 다클론성 항-RAGE 항체(카타로그 번호 sc-8230, N-16, 산타크루즈 바이오텍, 인크., 산타 크루즈, CA)를 사용전에 PBS에 대하여 과도하게 투석시켰다. 이러한 연구의 결과를 도 11A에 도시하였고, 이는 RAW 264.7 세포로부터의 TNF 방출에 대한 항-RAGE 항체 또는 비면역 IgG(대조군)의 존재 하의 HMG1, LPS, 또는 HMG1 B의 효과의 막대그래프이다. 도 11A에 도시된 바와 같이, 비면역 IgG에 비하여 항RAGE 항체는 HMG1 B 박스-유도된 TNF 방출을 상당히 억제하였다. 이러한 억제는 특이적이는데, 그 이유는 항 RAGE가 LPS-자극된 TNF 방출을 그다지 억제하지 않았다. 특히, 항-RAGE의 최대 억제 효과는 HMG-1 시그날링을 단지 40% 감소시켰고, 이는 다른 시그날 트랜스덕션 경로가 HMG1 시그날링에 참여할 수 있음을 제안한다.
HMG1 또는 HMG1 B 박스의 NF-kB-의존성 ELAM 프로모터에 대한 료과를 검사하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. RAW 264.7 마크로파지를 문헌(Means et al., J. Immunol. 166: 4074-4082, 2001)에 기술된 바와 같이 쥐과 MyD 88 의존성 음성(DN) 돌연변이체(아미노산 146번 내지 296번)를 엔코딩하는 발현 플라스미드 또는 빈 벡터, 및 NF-kB-의존성 ELAM 프로모터의 조절 하에 있는 루시퍼라아제 리포터 플라스미드로 함께 일시적으로 트랜스팩션시켰다. 다음에, 세포의 일부는 5시간 동안 전장 HMG1(100ng/㎖) 또는 정제된 HMG1 B 박스(10㎍/㎖)로 5시간 동안 자극시켰다. 다음에 세포를 수집하고 표준 방법을 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 모든 트랜스팩션을 3쌍으로 수행하였고 적어도 3회 반복하였고, 단일의 대표적인 실험을 도 11B에 도시하였다. 도 11B에 도시된 바와 같이, HMG1은 MyD 88 우성 음성으로 함께 트랜스펙션되지 않은 샘플 중의 루시퍼라아제 활성을 증강시켰고, 증강 수준은 MyD 88 우성 음성으로 함께 트랜스펙션된 샘플에서 감소하였다. 이러한 효과는 또한 HMG B 박스가 투여된 샘플에서 관찰되었다.
HF-kB 활성화에 대한 HMG1 또는 HMG1 B 박스의 효과를 또한 검사하였다. 인간 톨(Toll) 유사 수용체 2(TLR 2) 또는 톨 유사 수용체 4(TLR 4)를 구성적으로 발현하는 CHO 리포터 세포주는 종래 기술된 바 있다(Means et al., J. Immunology, 163: 3920-3927, 1999). 이러한 수용체 세포주는 또한 안정하게 트랜스팩션되는ELAM-CD25 수용체 유전자를 함유하고 NF-kB 활성화의 결과로서 이들의 표면상에 인간 CD25를 발현항다. CHO/TLR2 및 CHO/TLR4 세포를 18시간 동안 IL-1(10gm/㎖), 정제된 전장 HMG-1(100gm/㎖), 또는 정제된 B 박스(10㎍/㎖)로 자극시켰다. 자극 후에, 세포를 PE-라벨링된 항-CD25 단클론성 항체로 염색하고, CD25의 표면 발현을 유량 세포 측정기에 의해 측정하였다. 이러한 연구의 결과를 도 11C에 도시하였다. 데이터를 평균 FL1 형광물질에 기초하여 가장 낮은 5%의 세포를 배제하도록 되어 있는, 비자극된 세포 집단 및 자극된 세포 집단에서 CD25+세포의 백분율의 비율(폴드-활성화)로서 표현하였다. CHO/TLR4 세포에서, HMG1 및 HMG1 B 박스의 각각을 이용한 자극은 CHO/TLR2 샘플과 비교하여 감소된 CD25 발현을 유발하였다.
항-RAGE 항체, 항-TLR2 항체, 항-RAGE 항체 및 항-TLR2 항체의 조합의 RAW 264.7 세포에서 HMG1-매개 TNF 방출에 대한 효과를 또한 결정하였다. RAW 264.7 세포를 24 웰 조직 배양 플레이트로 시딩하고 90% 플루언스에서 사용하였다. 세포를 16시간 동안 폴리믹신 B (100유닛/㎖, 시그마, 세인트 루이스, MO)의 존재 하에 항-RAGE 항체(카타로그 번호 sc-8230, 산타크루즈 바이오텍 인크., 산타크루즈, CA), 항-TLR2 항체(친화성 정제된 다클로선 항체 카타로그 번호 sc-12504, D17, 산타 크루즈) 또는 IgG(비면역 IgG, 시그마, 세인트 루이스, MO)를 첨가하거나 첨가하지 않고 HMG-1으로 인큐베이션시켰다. 항체를 PBS에 대해 투석하고 사용 전에 아지드 나트륨을 제거하였다. 컨디셔닝된 배지를 수직하고 TNF ELISA를 표준 ELISA 방법을 사용하여 수행하였다. 데이터(n=3)을 HMG-1 단독으로 달성된 활성의백분율로 표현하였다. 이러한 연구 결과를 도 11D에 도시하였다. 항-RAGe 및 항-TLR2 항체 둘 모도는 유의하게 HMG-1 매개된 TNF 방출을 억제하였다(*P<0.05). IgG는 부적절한 반면, 2개 항체는 TNF 방출을 억제하는 데 추가적인 효과를 가졌다.
본 발명은 구체적으로 도시되고 이들의 바람직한 구체예를 참조하여 기술되었으나, 하기의 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 이탈되지 않고 형태와 세부사항에 있어 다양한 변경이 가능할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

Claims (24)

  1. 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 또는 비천연 HMG A 박스를 포함하는 폴리펩티드.
  2. 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG A 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드.
  3. 약제학적으로 허용되는 부형제 중의 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 또는 비천연 HMG A 박스를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  4. 약제학적으로 허용되는 부형제 중의 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG A 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  5. 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 특이적으로 결합할 수 있으나 HMG의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합할 수 없는 항체로서 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 항체의 정제된 제조물.
  6. 약제학적으로 허용되는 부형제 중의 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 특이적으로 결합할 수 있으나 HMG의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합할 수 없는 항체로서 HMG로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 항체의 정제 제조물을 포함하는 조성물.
  7. 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 비천연 HMG B 박스를 포함하지만 전장 HMG를 포함하지 않는 폴리펩티드로서 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발할 수 있는 폴리펩티드.
  8. 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드.
  9. 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 비천연 HMG B 박스를 포함하지만 전장 HMG를 포함하지 않는 폴리펩티드로서 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발할 수 있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터.
  10. 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드로서 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 유발할 수 있는 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터.
  11. 포유동물 세포를 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 특이적으로 결합하지만 HMG의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는 항체의 소정량의 정제 제조물로 처리하는 것을 포함하는 상기 포유동물로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 방법.
  12. 포유동물 세포를, 이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하기에 충분한 양의, 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질(HMG) A 박스 또는 비천연 HMG A 박스를 포함하는 폴리펩티드로 처리하는 것을 포함하는 상기 포유동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 방법.
  13. 포유동물 세포를, 이 세포로부터 염증 전 시토카인의 방출을 억제하기에 충분한 양의, 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG A 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드로 처리하는 것을 포함하는 상기 포유동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 방법.
  14. 염증성 시토카인 캐스캐이드를 억제하기에 충분한 양으로 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 특이적으로 결합하고 HMG의 비-B 박스 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는 항체의 정제 제조물을 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 가지는 환자에게 투여하는 것을 포함하여 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  15. 염증전 시토카인의 방출을 억제하기에 충분한 양의 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 또는 비천연 HMG A 박스를 포함하는 폴리펩티드를 염증전 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 가진 환자에게 투여하는 것을 포함하여 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  16. 염증전 시토카인의 방출을 억제하기에 충분한 양의 고이동성 그룹 (HMG) 단백질로 처리된 척추동물 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제할 수 있는 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) A 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG A 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드를 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 가진 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 시토카인 캐스캐이드의 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법.
  17. 세포를, 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양의, 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 비천연 HMG B 박스를 포함하는 폴리펩티드로 처리하는 것을 포함하여 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법.
  18. 세포를, 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양의, 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드로 처리하는 것을 포함하여 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법.
  19. 세포를, 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양의, 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 비천연 HMG B 박스를 포함하지만 전장 HMG를 포함하지 않는 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터로 처리하는 것을 포함하는 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법.
  20. 세포를, 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양의, 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터로 처리하는 것을 포함하는 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키는 방법.
  21. 유효량의 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 비천연 HMG B 박스를 포함하지만 전장 HMG 폴리펩티드를 포함하지 않는 폴리펩티드를 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자의 중량을 감소시키거나 비만을 치료하는 방법.
  22. 유효량의 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 생물학적 활성 단편 또는 비천연 HMG B 박스 생물학적 활성 단편인 폴리펩티드를 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 증강시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자의 중량을 감소시키거나 비만을 치료하는 방법.
  23. 화합물을 (a) 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스에 노출된 경우에 염증전 시토카인을 방출하는 세포 및 (b) HMG B 박스와 혼합하는 것을 포함하여 화합물이 염증을 억제하는 지를 결정하고 난 후에, 상기 화합물이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정하는 방법.
  24. 화합물을 (a) 척추동물 고이동성 그룹 단백질 (HMG) B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편에 노출된 경우에 염증전 시토카인을 방출하는 세포 및 (b) HMG B 박스 또는 이들의 생물학적 활성 단편과 혼합하는 것을 포함하여 화합물이 염증을 억제하는 지를 결정하고 한 후에, 상기 화합물이 세포로부터 염증전 시토카인의 방출을 억제하는 지를 결정하는 방법.
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