JP2001224380A - サイクリンｅをユビキチン化分解するユビキチンリガーゼｓｃｆ複合体のｆ−ボックスタンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトを含む高等生物の生理機能にとって重要
な分子であるサイクリンＥで代表されるＧ₁サイクリン
のユビキチン化のメカニズムを解明し、該ユビキチン化
を特異的に司る酵素であるユビキチンリガーゼＳＣＦ複
合体、特にそのＦ−ボックスタンパクの提供。 【解決手段】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ1タンパク、
およびＦ−ボックスモチーフとＬＲＲモチーフを含むＦ
−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合体）から構成
され、サイクリンＥをユビキチン化し分解するユビキチ
ンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボックスモチーフタンパ
クであって、２種類の特定のアミノ酸配列のいずれかで
示されるタンパク並びにそれらのＦ−ボックスタンパク
をコードする遺伝子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、疾病の病態解析、
治療、予防または診断等に応用することができるタンパ
ク（タンパク質）に関し、特に、サイクリンＥを特異的
にユビキチン化し分解するユビキチンリガーゼ酵素に関
する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質の発現量は合成速度と分解速
度によって決定されている。特に迅速なレスボンスの求
められるタンパク質はユビキチン−プロテアソーム系と
いう分解システムを用いて破壊されることが知られてい
る。このシステムは分解すべき標的タンパク質にユビキ
チンという分子を多数結合させ（ポリユビキチン化また
は単にユビキチン化）、ユビキチン化されたタンパク質
はプロテアソームという巨大なタンパク質分解酵素複合
体によって破壊するというものである。つまりユビキチ
ン化とは分解すべきタンパク質にユビキチンという「荷
札」をつけて分解工場へ送るようなものである。このユ
ビキチン化はいろいろなタンパク質で行われていること
がわかっているが、高等生物において特に有名なのはＩ
κＢとβカテニンという２つの分子である。

【０００３】タンパク質のユビキチン化は、一般に、一
連の酵素群、すなわち、ユビキチン活性化酵素
（Ｅ_１）、ユビキチン複合化酵素（Ｅ_２）およびユビキ
チンリガーゼ（Ｅ_３）によって進み、これらの酵素によ
ってユビキチン化されたタンパク質が２６Ｓプロテアソ
ームにより分解されるものと解されている。このうち、
ユビキチンリガーゼ（Ｅ_３）が特定のタンパク質をユビ
キチン化する特異性に最も関与すると考えられている
が、高等生物におけるユビキチンリガーゼの構造や機能
の詳細は殆ど不明であるのが現状である。例えば、哺乳
動物におけるサイクリンＥで代表されるＧ₁サイクリン
とそれを特異的にユビキチン化して分解するユビキチン
リガーゼは未だ知られていない。

【０００４】最近、酵母のような下等生物における研究
を通じて、ＳＣＦと称される複合体から構成される新し
いタイプのユビキチンリガーゼ（Ｅ_３）が見出されてい
る。このＳＣＦ複合体タイプのユビキチンリガーゼ（以
下、ユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体と記すことがあ
る）は、３量体、すなわち、Ｓｋｐ１と称されるサブユ
ニットタンパク（質）、Ｃｕｌ１（または、その上位概
念のCullin）と称されるサブユニットタンパク（質）、
およびＦ−ボックス（Ｆ−box）と称されるサブユニッ
トタンパク（質）から構成される複合酵素であり、各サ
ブユニットタンパクの頭文字をとってＳＣＦと名づけら
れている。

【０００５】このうち、Ｓｋｐ１タンパクおよびＣｕｌ
１タンパクの機能は未だ完全には明らかでないが、その
アミノ酸配列は保存され、どのような基質に対しても一
定である。一方、Ｆ−ボックスタンパクは、基質によっ
て変化し得るものであり、ユビキチン化の対象となる標
的タンパク質に応じたＦ−ボックスタンパクが存在し、
基質特異性を決定するものと考えられている。

【０００６】このＦ−ボックスタンパクは、一般に、Ｆ
−ボックスと呼ばれる領域（モチーフ）と、40個程度の
アミノ酸配列の繰り返しから成るＷＤ４０リピートと呼
ばれる領域（モチーフ）またはロイシンの多いＬＲＲ
（Leucine rich repeat）と呼ばれる領域（モチーフ）
を含み、ＷＤ４０リピートモチーフまたはＬＲＲモチー
フがリン酸化された標的タンパク質を認識し結合すると
ともに、Ｆ−ボックスモチーフがＳｋｐ１およびＣｕｌ
１と結合して該タンパク質のユビキチン化に寄与するも
のと考えられている。

【０００７】酵母においては、Ｓｋｐ／Ｃｄｃ53／Ｇｒ
ｒｌ（ＬＲＲを含むＦ−ボックスタンパク）から成るユ
ビキチンリガーゼＳＣＦ複合体が、Ｃｄｃ34（Ｅ₂）と
もに、Ｃｌｎ１やＣｌｎ２のようなサイクリンをユビキ
チン化分解するのに機能することが見出されている〔EM
BO J, 16, 5629-5638 (1997)他〕。酵母については、こ
のような細胞周期に関与するタンパク質のみならず、そ
の他の生理機能に関与するタンパク質とそれに基質特異
的なＳＣＦ複合体が幾つか発見されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒトを
含む高等生物におけるユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体
の機能については、未だ充分に検討されていない。特
に、細胞周期の進行に関与する重要なタンパク質である
サイクリンを特異的にユビキチン化する反応のメカニズ
ム、および該反応を担う酵素の構造や機能が明らかにさ
れれば、新しい医薬の開発や癌の治療法等に対して極め
て有用な情報を提供し得るものと期待されるが、そのよ
うな目的に目指した研究は少ない。

【０００９】本発明の目的は、ヒトを含む高等生物の生
理機能にとって重要な分子であるサイクリン、特にサイ
クリンＥで代表されるＧ₁サイクリンのユビキチン化の
メカニズムを解明し、該ユビキチン化を特異的に司る酵
素であるユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体、特にそのＦ
−ボックスタンパクを提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ユビキチン
リガーゼＳＣＦ複合体について研究を重ねた結果、ヒト
由来およびマウス由来のＦ−ボックスタンパクには、サ
イクリンＥに対して特異的に相互作用しサイクリンＥを
特異的にユビキチン化分解するＳＣＦ複合体を形成する
ものがあることを発見し、本発明を導き出した。

【００１１】かくして、本発明は、Ｓｋｐ１タンパク、
Ｃｕｌ１タンパク、およびＦ−ボックスモチーフとＬＲ
Ｒモチーフを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣ
Ｆ複合体）から構成され、サイクリンＥをユビキチン化
し分解するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボッ
クスモチーフタンパクであって、配列番号：１のアミノ
酸配列で表わされるタンパク（タンパク質）を提供す
る。

【００１２】さらに、本発明は、Ｓｋｐ１タンパク、Ｃ
ｕｌ１タンパク、およびＦ−ボックスモチーフとＬＲＲ
モチーフを含むＦ−ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ
複合体）から構成され、サイクリンＥをユビキチン化し
分解するユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボック
スタンパクであって、配列番号：２のアミノ酸配列で表
わされるタンパク（タンパク質）を提供する。

【００１３】本発明は、さらに別の側面として、それら
の配列番号：１または配列番号：２のアミノ酸配列から
成るＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子も提供す
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】ヒトのユビキチンリガーゼＳＣＦ
複合体については、Ｓｋｐ２と命名され酵母のＧｒｒｌ
に類似したＦ−ボックスタンパクが存在することが見出
されていた〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11324-1
1329 (1998)他〕が、その特性や機能、特にサイクリン
Ｅとの相互作用に関しては未だ明らかにされていなかっ
た。本発明者は、このたび、このヒトのＳｋｐ２（本明
細書および図面においてはｈ−Ｓｋｐ２と称することが
ある）に類似するマウス由来のＳｋｐ２（本明細書およ
び図面においてはｍ−Ｓｋｐ２と称することがある）の
クローニングに成功し、これらのｍ−Ｓｋｐ２およびｈ
−Ｓｋｐ２がヒトのサイクリンＥに対して特異的に相互
作用し、これらのＳｋｐ２を含むＳｋｐ１／Ｃｕｌ１／
Ｓｋｐ複合体がサイクリンＥを特異的にユビキチン化し
分解するユビキチンリガーゼとなることを初めて見出し
たものである。

【００１５】図１は、これらのＦ−ボックスタンパクの
アミノ酸配列を対比して示すものである。図中、上段は
マウス由来のＦ−ボックスタンパク（ｍ−Ｓｋｐ２）の
アミノ酸配列（明細書末尾の配列表で配列番号：１とし
て示すもの）、また下段はヒト由来のＦ−ボックスタン
パク（ｈ−Ｓｋｐ２）のアミノ酸配列（配列表で配列番
号：２として示すもの）である。Ｆ−ボックス（Ｆ−ｂ
ｏｘ）モチーフおよびＬＲＲモチーフ（ＬＲＲ１〜ＬＲ
Ｒ７）を含む全体にわたって互いに高い類似性（相同
性）を有している。

【００１６】後の実施例に詳述するように、本発明者
は、これらのＦ−ボックスタンパクが発現されるように
したインビボおよびインビトロの実験系を用い、サイク
リンＥのユビキチン化のメカニズムを解明し、次のよう
に総括される知見を得た。

【００１７】（１）本発明者のＦ−ボックスタンパク
（ｍ−Ｓｋｐ２、ｈ−Ｓｋｐ２）は、サイクリンＥおよ
びサイクリンＡに特異的に相互作用するが、サイクリン
ＢやサイクリンＤ₁とは特異的に相互作用しない。

【００１８】（２）Ｓｋｐ２が切除されたノックアウト
マウス由来の胚線維芽細胞（ＭＥＦ）中でサイクリンＥ
は特異的に蓄積されるが、サイクリンＡにはそのような
蓄積は起こらない。

【００１９】（３）Ｓｋｐ２の発現によりサイクリンＥ
のユビキチン化と分解が促進される。

【００２０】（４）Ｓｋｐ２とサイクリンＥとの相互作
用は、Ｃｄｋ２やＣｄｋインヒビター（ｐ２１、ｐ２
７）によって阻害される。

【００２１】以上の知見から明らかなように、本発明者
によって見出されたＦ−ボックスタンパク（ｍ−Ｓｋｐ
２、ｈ−Ｓｋｐ２）は、サイクリンＥ（遊離のサイクリ
ンＥ）に対する細胞内レセプターとして機能し、このＦ
−ボックスを含むＳｋｐ１／Ｃｕｌ１／Ｓｋｐ２複合体
はサイクリンＥを特異的にユビキチン化分解するユビキ
チンリガーゼとして機能するので、この特性を利用し
て、新しい薬剤のスクリーニングや治療法などに関して
各種の有用な情報が得られるものと期待される。

【００２２】例えば、Ｓｋｐ２によるサイクリンＥのユ
ビキチン化を促進するような薬剤を開発すれば、多くの
癌において新たな抗癌剤になる可能性が高い。具体的に
はサイクリンＥの試験管内におけるユビキチン化系（既
に確立済み）において、Ｓｋｐ２はそのユビキチン化高
率を飛躍的に高める効果を発揮するが、この系に種々の
薬剤を加えることによって、その効果を一層高めるよう
な薬物又はＳｋｐ２の効果を代替しうる薬物をスクリー
ニングすることが可能である。またＳｋｐ２によってサ
イクリンＥが分解されることを利用して、Ｓｋｐ２遺伝
子をウイルスベクター等を用いて癌患者の病変部位に導
入し、サイクリンＥの分解を促すことによって癌治療を
目指す遺伝子導入療法に応用することも可能である。

【００２３】このような医薬や治療法の開発に当たって
採用される実験系への本発明のＦ−ボックスタンパク等
の導入は、後述の実施例によって示唆されているよう
に、従来から当業者に知られた各種の手法を用いて容易
に行うことができる。

【００２４】例えば、本発明のＦ−ボックスタンパク、
およびその他の必要物質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）
を組み込んだプラスミドまたはファージをリポフェクシ
ョンまたはリン酸カルシウム法のような方法で適当な細
胞系にトランスフェクションすることによってインビボ
の実験系が構築できる。

【００２５】また、例えば、本発明のＦ−ボックスタン
パク、およびその他の必要物質を予め合成するか、また
は適当な発現系（大腸菌発現系、バキュロウイルス発現
系など）を用いて発現させた後、Ｓｋｐ１タンパクやＣ
ｕｌ１タンパクの産生能のある細胞抽出液に混合すれば
インビトロの実験系が得られる。

【００２６】

【実施例】この実施例は、本発明のＦ−ボックスタンパ
クを含むユビキチンリガーゼＳＣＦ複合体がサイクリン
Ｅを特異的にユビキチン化し分解することを示すインビ
ボおよびインビトロの実験結果である。この実施例で
は、マウス由来のＦ−ボックスタンパク〔ｍ−Ｓｋｐ２
（配列番号：１）〕を用いているが、ヒト由来のＦ−ボ
ックスタンパク〔ｈ−Ｓｋｐ２（配列番号：２）〕を用
いた場合でも同様の結果が得られる。

【００２７】実施例で採用した各種の実験方法や材料は
以下のとおりである。ｍ−Ｓｋｐ２のｃＤＮＡのクローニング ：ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニング用プローブは、マウスのＥＳ
Ｔ（expressed sequence tag）クローン〔GenBank（米
国厚生省データベース）、アクセション番号ＡＡ５１１
８９７〕であり、ランダムプライミングにより³²Ｐをラ
ベルした。³²Ｐをラベルした該プローブを用いて、オリ
ゴ（ｄＴ）−プライムドλＺＡＰマウス胸腺ｃＤＮＡラ
イブラリー（Stratagene社製）についてスクリーニング
を行った。レプリカフィルターを緩衝液中で６８℃、２
４時間ハイブリダイズした後、０．１％のＳＤＳを含有
する０．２標準クエン酸塩溶液を用いて６８℃で洗浄し
た。陽性クローンをサブクリーニングベクターpBluescr
ipt SK（Stratagene社製）にサブクリーニングし、配列
分析を行った。得られたｍ−Ｓｋｐ２のｃＤＮＡの配列
は図２および図３に示している。

【００２８】インビボ実験系：リン酸カルシウム法で処
理した293Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓細胞由来細胞株）を、
ｍ−Ｓｋｐ２、標的タンパク（ヒトのサイクリンＡ、
Ｂ、Ｄ１、またはＥ）、ＦＷＤ１、ｐ21、ｐ27またはＣ
ｄｋ２をコードする各ｃＤＮＡ〔それぞれ、後の免疫沈
降法やウエスタンブロッティングに供するためＮ末端に
常用のタグ（tag）を付けた〕を含む発現プラスミド
〔ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社製）を用いてトランスフ
ェクションした。Ｓｋｐ２、ＦＷＤ１、ｐ21およびｐ27
用のタグとしてはＦｌａｇエピトープ、サイクリン用の
タグとしてはＭｙｃエピトープ、ならびにＣｄｋ２用の
タグとしてはＨＡエピトープをそれぞれ付けた。

【００２９】インビトロ実験系：サイクリンＥ、Ｓｋｐ
２、ＦＷＤ１、Ｓｋｐ１、またはＣｕｌ１とグルタチオ
ン・Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパ
ク質をコードする各ｃＤＮＡをバキュロウイルストラン
スファーベクターｐＢａｃＰＡＫ９に組み込み、Ｓｆ９
細胞（カイコ由来株化細胞）にトランスフェクションす
ることにより組換えバキュロウイルスを得た。得られた
ウイルスをＳｆ９細胞に感染させ、グルタチオンビーズ
を用いて細胞ライゼートからＧＳＴ融合タンパク質を精
製した。精製後の融合タンパク質からPreScissionプロ
テアーゼ（Amersham Pharmacia Biotech製）を用いてＧ
ＳＴ配列を切除した。得られた各組換えタンパク質を、
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２ｍＭのジ
チオスレイトール、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２．５ｍＭの
ＡＴＰ、１ｍＭのホスホクレアチン、ホスホクレアチン
キサーゼ（５００Ｕ／ｍｌ）、４ｍＭのＬＬｎＬ、ユビ
キチンアルデヒド（２５ｍｇ／ｍｌ）（Boston Bio
製）、およびプロテインインヒビター（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を含有する反応混合物４０ｍｌ中で３０℃、３０分
間インキュベートした後、さらに、ウサギＥ１酵素
（１．２５ｍｇ／ｍｌ）（BostonBiochem製）、ＮＩＨ
３Ｔ３細胞ライゼートのＳ１００フラクション（１ｍｇ
／ｍｌ）、およびウシユビキチン（１．９ｍｇ／ｍｌ）
（Sigma製）中で３０℃、６０分間インキュベートし
た。

【００３０】免疫沈降法およびウエスタンブロッティン
グ法：上記の本実施例におけるインビボおよびインビト
ロの実験系では、主として免疫沈降法（Immunoprecipit
ation、以下の説明および図中ではIPと略称する）およ
びウエスタンブロッティング法（Immunoblotting、以下
の説明および図中ではIBと略称する）を利用して各タン
パク質間の結合やユビキチン化反応を検討した。すなわ
ち、目的のタンパク質に対する抗体を用いて各タンパク
質を沈降させるとともに該タンパク質に結合している別
のタンパク質を共沈降させ（IP）、その後、沈降物を電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）させてそれぞれのタンパク
質に対する抗体を用いて各タンパク質の存否を検出（I
B）した。インビボ実験系では、目的のタンパク質につ
いたタグ（tag）に対する抗タグ抗体を用いた。

【００３１】IPおよびIBに用いた抗体は以下のとおりで
あり、括弧内にカタログ番号および入手先を示す：anti
-Myc (9E10 : Roche) , anti-Flag (M5 : Sigma) , ant
i-HA(HA 11/16B12 ; Babco) , anti-Cdk2（M2 ; Santa
Cruz）、anti-Ub（ユビキチン）(1B3 ; MBL)およびanti
-cyclin（サイクリン）E（c-19 ; Santa Cruz）。

【００３２】その他のｃＤＮＡ：ＳＣＦ複合体のその他
のタンパクをコードする遺伝子は下記のように寄託され
ているものを利用した：Ｓｋｐ１（GenBank、アクセシ
ョン番号ＡＦ083214）およびＣｕｌ１（GenBank、ＡＦ0
83216）。

【００３３】Ｓｋｐ２欠損マウス胚線維芽細胞の調製：
Ｓｋｐ２が存在しないマウス胚線維芽（ＭＥＦ）細胞
は、Ｓｋｐ２を切除したノックアウトマウス（Ｓｋｐ^/
マウス）から調製した。ノックアウトマウスの作成は、
大略、次のように行った。エクソン１〜４を含有するマ
ウスＳｋｐ２のＳｍａＩ−ＳａｃＩフラグメントをＰＧ
Ｋ−ｎｅｏ−ポリ（Ａ）カセットと置換することにより
標的ベクターを構築した。Ｅ１４胚幹細胞の維持、トラ
ンスフェクションおよび選択を行い、目的の突然変異に
対してヘテロ接合性の胚幹細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス
胚盤胞にマイクロインジェクションし、偽妊娠したメス
のＩＣＲマウスに移植した。得られたオスのキメラマウ
スをメスのＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させて、目的の
突然変異に対してヘテロ接合性のマウスを得た。Ｓｋｐ
^+/-マウスを相互交配し、Ｓｋｐ２^+/+、Ｓｋｐ２^+/-ま
たはＳｋｐ２^-/-の胚芽から１３．５日目に初代ＭＥＦ
細胞を得た。

【００３４】得られた細胞を３７℃、６％ＣＯ₂雰囲気
下にDulbeccoの変法イーグル培地（１０％のウシ胎児血
清、２ｍMのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのピルビン酸
ナトリウム、０．１ｍＭの最少必須培地・非必須アミノ
酸溶液、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレ
プトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、および５０ｍＭの
２−メルカプトエタノールを添加）中で培養した。。Ｍ
ＥＦにおけるサイクリンおよびその他のタンパク質の検
出は、等量の細胞ライゼートタンパク質（１００ｍｇ）
を以下の各抗体を用いるイムノブロッティングに供する
ことにより行った（カッコ内はカタログ番号および入手
先を示す）：cyclin（サイクリン）Ａ（H-432 ; Santa
Cruz）、cyclin（サイクリン）Ｂ（GNS-1 ; PharMinge
n）、cyclin（サイクリン）Ｄ１（MBL）、cyclin（サイ
クリン）Ｅ（M-20 ; Santa Cruz）、Ｃｄｋ２（M2 ; Sa
nta Cruz）、a-tubulin（チューブリン）（TU-01 ; Mon
osan）。

【００３５】上述したような方法や材料を用いて行った
実験結果の幾つかを図面に沿って以下に説明する。図４ ：図４は、本発明のＦ−ボックスタンパク（ｍ−Ｓ
ｋｐ２）とサイクリンＥの相互作用を検討したインビボ
実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図
である。ｍ−Ｓｋｐ２のｃＤＮＡのＮ末端にFlag-tagを
付けたもの（以下、Flag−Ｓｋｐ２と記す）、Ｃｄｋ２
のｃＤＮＡのＮ末端にＨＡ−ｔａｇを付けたもの（ＨＡ
−Ｃｄｋ２）、またはサイクリンＥのｃＤＮＡのＮ末端
にＭｙｃ−ｔａｇを付けたもの（Ｍｙｃ−cyclinＥ）の
種々の組み合わせを用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェ
クションを行った（図の上部に＋サインがあるのは、当
該タンパクをトランスフェクションしたことを示す）。
Ｃｄｋ２は野生型（ＷＴ：wild-type）およびキナーゼ
欠損型（KN：kinase-negative）の両方を用いた。

【００３６】トランスフェクションから48時間後に細胞
を回収して界面活性剤で溶解し、細胞抽出液を得た。こ
の細胞抽出液に抗Ｍｙｃ抗体（anti−Ｍｙｃ、本出願の
図中では、その他の抗体についてもこのように表記して
いる）を加え、さらにプロテインＧ−セファロースを加
えると、Ｍｙｃ−tagの付いたタンパク（ここではＭｙ
ｃ−cyclinＥ）が抗Ｍｙｃ抗体に結合し、それがさらに
プロテインＧ−セファロースと結合するので、Ｍｙｃ−
cyclinＥを沈殿させることができる。このＩＰによりＭ
ｙｃ−cyclinＥが沈降してくるが、Ｍｙｃ−cyclinＥに
結合しているタンパクもまた沈降（共沈降）してくる。
以下の実験の多くはこの共沈降という現象を通じてタン
パク質の結合を調べたものである。

【００３７】図４において、Anti‐Flag ＩＢと記して
いるのは抗Ｍｙｃ抗体でＩＰした後、沈降物を電気泳動
して、抗Flag抗体でＩＢを行ったものである。このとき
左から２番目のレーンのみにバンドが出ていることか
ら、抗Ｍｙｃ抗体でＩＰされるもの（つまりＭｙｃ−cy
clinＥ）にFlag−Ｓｋｐ２が結合していることを示す。
また、図４においてAnti−ＨＡ ＩＢと記しているの
は、上記のように抗Ｍｙｃ抗体でＩＰした後、沈降物を
電気泳動して、抗ＨＡ抗体でＩＢを行ったものである。
Flag−Ｓｋｐ２およびＭｙｃ−cyclinＥが存在する左か
ら３番目および４番目のレーンにＨＡ−tagの付いたＣ
ｄｋ２に対応するバンドのみが現われる。以上の結果か
らＳｋｐ２とサイクリンＥは特異的に相互作用し結合す
るが、Ｃｄｋ２はこの相互作用を阻害することが理解さ
れる。

【００３８】図４の下方に示す１０％inputとは、ＩＰ
をせずに細胞抽出液の１／１０をそのまま電気泳動して
各抗タグ抗体でＩＢすることにより、細胞抽出液中に各
タンパクが存在しているかを確認したものである。左端
のレーンでは抗Ｍｙｃ抗体のＩＢにより（Anti−Ｍｙｃ
ＩＢ）Ｍｙｃ−cyclinＥのみの存在が確認され、左か
ら二番目のレーンでは抗Flag抗体のＩＢによりFlag−Ｓ
ｋｐ２、抗Ｍｙｃ抗体のＩＢにより、Ｍｙｃ−cyclinＥ
の存在が確認され、また、左から３番目および右端のレ
ーンでは、抗Flag抗体のＩＢによりFlag−Ｓｋｐ２、抗
ＨＡ抗体のＩＢによりＨＡ−Ｃｄｋ２（ＷＴまたはＫ
Ｎ）、および抗Ｍｙｃ抗体のＩＢによりＭｙｃ−cyclin
Ｅの存在が確認された。

【００３９】以下の各図においても10％inputとは、同
様の手法により各タンパクの実在を確認した結果であ
る。なお、各電気泳動図において、右端に各タンパク質
の標準位置を示している。図５ ：図５は、サイクリンＥのユビキチン化に対する本
発明のＦ−ボックスタンパクの機能を検討したインビボ
実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図
である。図４の場合と同様に、それぞれの組合せのタン
パクで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、細胞抽
出液を抗Ｍｙｃ抗体でＩＰした後、沈降物を電気泳動し
て抗ユビキチン抗体（Anti−Ｕｂ）でＩＢを行った。図
の見方は、図４に関して上述したのと同様である。

【００４０】左から２番目のレーンの電気泳動図にのみ
ユビキチン−サイクリンＥ（Ｕｂ−cyclinＥ）のバンド
が認められることから、Ｃｄｋ２（ＷＴまたはＫＮ）が
存在しないときにサイクリンＥはＳｋｐ２と相互作用し
てユビキチン化されることが理解される。各レーンにつ
いて、抗Ｍｙｃ抗体（Anti−Ｍｙｃ）によるＩＢによっ
てＭｙｃ−サイクリンＥの存在が確認された。さらに、
図４に関して上述したように１０％inputにより細胞抽
出液中の各タンパクの存在を確認した。

【００４１】図６：図６は、サイクリンEのユビキチン
化に対する本発明のＦ−ボックスタンパクの機能を検討
したインビトロ実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果を
示す電気泳動図である。図６の上方に示すような各種の
組合せの組換えタンパクをＥ１酵素、ＮＩＨ３Ｔ３細胞
ライゼートおよびユビキチンとともにインキュベーショ
ンして得られた反応混合物（既述の「インビトロ実験
系」の項参照）を抗サイクリンＥ抗体（Anti−cyclin
Ｅ）でＩＰした後、得られた沈降物を電気泳動して抗ユ
ビキチン抗体（Anti−Ｕｂ）でＩＢした。なお、ＦＷＤ
１とは、Ｉκβおよびβカテニンのユビキチン化に関与
するものとして本発明者らが以前に見出したＷＤリピー
トモチーフを含むマウス由来のＦ−ボックスタンパクで
ある（特願平１０−３４３４３７）。

【００４２】左から２番目のレーンおよび３番目のレー
ンにのみユビキチン−サイクリンＥ（Ｕｂ−cyclinＥ）
のバンドが出現し、後者のバンドが強くなっていること
から、Ｓｋｐ２はサイクリンＥをユビキチン化し、そし
て、Ｓｋｐ１−Ｃｕｌ１はこのユビキチン化を更に促進
することが理解される。ＦＷＤ１にはそのようなサイク
リンＥを特異的にユビキチン化する機能は認められない
（右端のレーン）。

【００４３】図７：図７は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ｍ−Ｓｋｐ２）によるサイクリンＥのユビキチン
化がＣｄｋインヒビター（ｐ２１、ｐ２７）によって阻
害されることを示したインビボ実験系におけるＩＰおよ
びＩＢの結果を示す電気泳動図である。図7の上方に示
すように、Ｍｙｃ−cyclin（サイクリン）Ｅをコードす
る発現プラスミド、またはＭｙｃ−サイクリンＥとFlag
−Ｓｋｐ２、Flag−ｐ２１もしくはFlag−ｐ２７をコー
ドする発現プラスミドで２９３Ｔ細胞をトランスフェク
ションした後、細胞抽出液を抗Ｍｙｃ抗体（Anti−Ｍｙ
ｃ）でＩＰし、得られた沈降物を抗ユビキチン抗体（An
ti−Ｕｂ）または抗Ｍｙｃ抗体（Anti−Ｍｙｃ）でＩＢ
した。

【００４４】ｐ２１またはｐ２７が存在しない場合、Ｓ
ｋｐ２が発現しないとサイクリンＥのユビキチン化は起
こらない（左端のレーン）が、Ｓｋｐ２が発現するとサ
イクリンＥのユビキチン化が起こる（左から２番目のレ
ーン）ことが理解される。しかし、ｐ２１またはｐ２７
が発現すると（左から３番目〜右端のレーン）いずれも
サイクリンＥのユビキチン化は生じていない。このよう
に、ｐ２１およびｐ２７は、いずれもサイクリンＥのユ
ビキチン化を阻害することが分かる。既述の図４や図５
の場合と同様に１０％inputによりタンパク質の存在を
確認した。

【００４５】図８：図８は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ｍ−Ｓｋｐ２）によるサイクリンＥのユビキチン
化がＣｄｋ２によって阻害されることを示したインビボ
実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図
である。図８の上方に示すように、Ｍｙｃタグを付けた
野生型（WT）または突然変異型（R１３０A）のサイクリ
ンＥ（Ｍｙｃ−cyclinＥ）、Flag−Ｓｋｐ２およびＨＡ
−Ｃｄｋ２をコードする発現プラスミドで２９３Ｔ細胞
をトランスフェクションした後、細胞抽出液を抗Ｍｙｃ
抗体（Anti−Ｍｙｃ）でＩＰし、得られた沈降物を抗ユ
ビキチン抗体（Anti−Ｕｂ）または抗Ｍｙｃ抗体（Anti
−Ｍｙｃ）でＩＢした。Ｒ１３０Ａは、１３０位のアル
ギニン残基をアラニンに置換したものである。

【００４６】外来性のＳｋｐ２が非存在の場合でもサイ
クリンＥのユビキチン化は起こる（左端のレーン）とと
もにＳｋｐ２が存在するとサイクリンＥのユビキチン化
が促進される（左から２番目のレーン）が、Ｃｄｋ２が
存在するとサイクリンＥのユビキチン化は起こらなくな
る（左から３番目のレーン）。しかし、アルギニン残基
が置換されたサイクリンＥ変異体（Ｒ１３０Ａ）が発現
された場合には、Ｃｄｋ２が存在しない場合（左から４
番目および５番目のレーン）は勿論、Ｃｄｋ２が存在し
ても（右端のレーン）ユビキチン化が起こっている。こ
れらのことから、Ｃｋｄ２はサイクリンＥのアルギニン
残基を介して結合することによりサイクリンＥのユビキ
チン化を阻害するものと理解される。既述の場合と同様
に、抗Ｍｙｃ抗体によるＩＢによってサイクリンＥの発
現を確認するとともに、１０％inputのＩＢにより細胞
抽出液中の各タンパクの存在を確認した。

【００４７】図９：図９は、本発明のＦ−ボックスタン
パク（ｍ−Ｓｋｐ２）によるサイクリンＥを含む各種の
サイクリンとの相互作用を検討したインビボ実験系にお
けるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図である。図
９の上方に示すように、Ｍｙｃタグを付けたcyclin（サ
イクリン）Ａ、Ｂ、Ｄ１またはＥをコードする発現プラ
スミド、または、これらのＭｙｃ−サイクリンとFlag−
Sｋｐ２をコードする発現プラスミドで２９３Ｔ細胞を
トランスフェクションした後、細胞抽出液を抗Ｍｙｃ抗
体（Anti−Ｍｙｃ）でＩＰし、得られた沈降物を抗Flag
抗体（Anti−Flag）または抗Ｍｙｃ抗体（Anti−Ｍｙ
ｃ）でＩＢした。

【００４８】Ｓｋｐ２は、サイクリンＥと強く相互作用
し（右端のレーン）、サイクリンAとも僅かに相互作用
する（左から２番目のレーン）が、サイクリンBまたは
サイクリンＤ１とは相互作用せずそれらのサイクリンと
は結合しないことが理解される。既述の場合と同様に、
抗Ｍｙｃ抗体によるＩＢによって各サイクリンの発現を
確認するとともに、１０％inputのＩＢにより細胞抽出
液中の各タンパクの存在を確認した。

【００４９】図１０：図１０は、本発明のＦ−ボックス
タンパク（ｍ−Ｓｋｐ２）が各種サイクリンのうち、サ
イクリンＥおよびＡのユビキチン化を促進することを調
べたインビボ実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果を示
す電気泳動図である。図１０の上方に示すように、Ｍｙ
ｃタグを付けたcyclin（サイクリン）Ａ、Ｂをコードす
る発現プラスミド、または、これらのＭｙｃ−サイクリ
ンとFlag−Sｋｐ２をコードする発現プラスミドで２９
３Ｔ細胞をトランスフェクションした後、細胞抽出液を
抗Ｍｙｃ抗体（Anti−Ｍｙｃ）でＩＰし、得られた沈降
物を抗ユビキチン抗体（Anti−Ｕｂ）または抗Ｍｙｃ抗
体（Anti−Ｍｙｃ）でＩＢした。Ｓｋｐ２は、サイクリ
ンＡサイクリンＥのユビキチン化を促進する（左から２
番目のレーンおよび右端のレーン）ことが理解される。
サイクリンＢは、Ｓｋｐ２の存否に拘わらず構成的にユ
ビキチン化され、また、サイクリンＤ１は全くユビキチ
ン化されないことも理解される。図１０には、既述の場
合と同様に、抗Ｍｙｃ抗体によるＩＢによって各サイク
リンＥの発現を確認するとともに、１０％inputのＩＢ
により細胞抽出液中の各タンパクの存在を確認した結果
も示している。

【００５０】図１１：本発明のＦ−ボックスタンパク
（ｍ−Ｓｋｐ２）が欠損したマウス胚繊維芽細胞（ＭＥ
Ｆ）内における各種の細胞周期調節物質の蓄積状況を検
討したＩＢ分析の結果を示す電気泳動図である。Ｓｋｐ
２^+/+、Ｓｋｐ２^+/-またはＳｋｐ２^-/-由来のＭＥＦ中
の各細胞周期調節物質の量をそれらの物質に対する抗体
を用いるＩＢにより検出した（既述の「Ｓｋｐ２欠損マ
ウス胚線維芽細胞の調製」の項参照）。１２の独立した
胚芽由来のＭＥＦ（各遺伝子型について３）について分
析したが、それぞれ再現性のある結果が得られた。図１
１に示されるように、サイクリンＥのみがＳｋｐ２の欠
損したＭＥＦ中で特異的に増加、蓄積しているが、サイ
クリンＡ、サイクリンＢ、Ｃｄｋ２およびα‐チューブ
リン（tubulin）の量は、いずれの遺伝子型由来のＭＥ
Ｆ中内でも変わらない。

【００５１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> F-box protein of ubiquitin ligase SCF complex which promotes the ubiquitin-dependent degradation of cyclin E <130> P0065T <160> 2 <210> 1 <211> 424 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Arg Lys His Leu Gln Glu Ile Pro Asp Gln Ser Gly Asn 5 10 15 Val Thr Thr Ser Phe Thr Trp Gly Trp Asp Ser Ser Lys Thr Ser 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Glu 35 40 45 Val Asp Ser Glu Asn Ile Pro His Gly Leu Leu Ser Asn Leu Gly 50 55 60 His Pro Gln Ser Pro Pro Arg Lys Arg Val Lys Gly Lys Gly Ser 65 70 75 Asp Lys Asp Phe Val Ile Ile Arg Arg Pro Lys Leu Ser Arg Glu 80 85 90 Asn Phe Pro Gly Val Ser Trp Asp Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu 95 100 105 Leu Gly Ile Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Glu Leu Leu Arg Val 110 115 120 Ser Gly Val Cys Lys Arg Trp Tyr Arg Leu Ser Leu Asp Glu Ser 125 130 135 Leu Trp Gln Ser Leu Asp Leu Ala Gly Lys Asn Leu His Pro Asp 140 145 150 Val Thr Val Arg Leu Leu Ser Arg Gly Val Val Ala Phe Arg Cys 155 160 165 Pro Arg Ser Phe Met Glu Gln Pro Leu Gly Glu Ser Phe Ser Ser 170 175 180 Phe Arg Val Gln His Met Asp Leu Ser Asn Ser Val Ile Asn Val 185 190 195 Ser Asn Leu His Lys Ile Leu Ser Glu Cys Ser Lys Leu Gln Asn 200 205 210 Leu Ser Leu Glu Gly Leu Gln Leu Ser Asp Pro Ile Val Lys Thr 215 220 225 Leu Ala Gln Asn Glu Asn Leu Val Arg Leu Asn Leu Cys Gly Cys 230 235 240 Ser Gly Phe Ser Glu Ser Ala Val Ala Thr Leu Leu Ser Ser Cys 245 250 255 Ser Arg Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Trp Cys Phe Asp Phe Thr 260 265 270 Glu Lys His Val Gln Ala Ala Val Ala His Leu Pro Asn Thr Ile 275 280 285 Thr Gln Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Arg Lys Asn Leu Gln Lys Thr 290 295 300 Asp Leu Cys Thr Ile Ile Lys Arg Cys Pro Asn Leu Ile Arg Leu 305 310 315 Asp Leu Ser Asp Ser Ile Met Leu Lys Asn Asp Cys Phe Pro Glu 320 325 330 Phe Phe Gln Leu Asn Tyr Leu Gln His Leu Ser Leu Ser Arg Cys 335 340 345 Tyr Asp Ile Ile Pro Asp Thr Leu Leu Glu Leu Gly Glu Ile Pro 350 355 360 Thr Leu Lys Thr Leu Gln Val Phe Gly Ile Val Pro Glu Gly Thr 365 370 375 Leu Gln Leu Leu Arg Glu Ala Leu Pro Arg Leu Gln Ile Asn Cys 380 385 390 Ala Tyr Phe Thr Thr Ile Ala Arg Pro Thr Met Asp Ser Lys Lys 395 400 405 Asn Leu Glu Ile Trp Gly Ile Lys Cys Arg Leu Thr Leu Gln Lys 410 415 420 Pro Ser Cys Leu <210> 2 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Val Phe Lys Thr Pro Gly Pro Ala Asp Ala Met His Arg 5 10 15 Lys His Leu Gln Glu Ile Pro Asp Leu Ser Ser Asn Val Ala Thr 20 25 30 Ser Phe Thr Trp Gly Trp Asp Ser Ser Lys Thr Ser Glu Leu Leu 35 40 45 Ser Gly Met Gly Val Ser Ala Leu Glu Lys Glu Glu Pro Asp Ser 50 55 60 Glu Asn Ile Pro Gln Glu Leu Leu Ser Asn Leu Gly His Pro Glu 65 70 75 Ser Pro Pro Arg Lys Arg Leu Lys Ser Lys Gly Ser Asp Lys Asp 80 85 90 Phe Val Ile Val Arg Arg Pro Lys Leu Asn Arg Glu Asn Phe Pro 95 100 105 Gly Val Ser Trp Asp Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Leu Gly Ile 110 115 120 Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Val 125 130 135 Cys Lys Arg Trp Tyr Arg Leu Ala Ser Asp Glu Ser Leu Trp Gln 140 145 150 Thr Leu Asp Leu Thr Gly Lys Asn Leu His Pro Asp Val Thr Gly 155 160 165 Arg Leu Leu Ser Gln Gly Val Ile Ala Phe Arg Cys Pro Arg Ser 170 175 180 Phe Met Asp Gln Pro Leu Ala Glu His Phe Ser Pro Phe Arg Val 185 190 195 Gln Asp Met Asp Leu Ser Asn Ser Val Ile Glu Val Ser Thr Leu 200 205 210 His Gly Ile Leu Ser Gln Cys Ser Lys Leu Gln Asn Leu Ser Leu 215 220 225 Glu Leu Arg Leu Ser Asp Pro Ile Val Asn Thr Leu Ala Lys Asn 230 235 240 Ser Asn Leu Val Arg Leu Asn Leu Pro Gly Cys Pro Gly Phe Pro 245 250 255 Lys Phe Pro Leu Gln Thr Phe Leu Ser Ser Cys Pro Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Leu Asn Leu Ser Trp Cys Phe Asn Phe Thr Glu Lys His Val 275 280 285 Gln Val Ala Val Ala His Val Ser Glu Thr Met Thr Gln Leu Asn 290 295 300 Leu Ser Gly Tyr Arg Lys Asn Leu Gln Lys Ser Asp Leu Ser Thr 305 310 315 Leu Val Arg Arg Cys Pro Asn Leu Val His Leu Asp Leu Ser Asn 320 325 330 Ser Val Met Leu Lys Asn Asp Cys Phe Gln Glu Phe Ser Gln Leu 335 340 345 Asn Tyr Leu Gln His Leu Ser Leu Ser Arg Cys Tyr Asp Ile Ile 350 355 360 Pro Glu Thr Leu Leu Glu Leu Gly Glu Ile Pro Thr Leu Lys Thr 365 370 375 Leu Gln Val Phe Gly Ile Val Pro Asp Gly Thr Leu Gln Leu Leu 380 385 390 Lys Glu Ala Leu Pro His Leu Gln Ile Asn Cys Ser His Phe Thr 395 400 405 Thr Ile Ala Arg Pro Thr Ile Gly Asn Lys Lys Asn Gln Glu Ile 410 415 420 Trp Gly Ile Lys Cys Arg Leu Thr Leu Gln Lys Pro Ser Cys Leu 425 430 435

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に従うマウス由来のＦ−ボックスタンパ
クとヒト由来のＦ−ボックスタンパクのアミノ酸配列を
対比して示す。

【図２】本発明に従うマウス由来のＦ−ボックスタンパ
クのｃＤＮＡの塩基配列を示す。

【図３】本発明に従うマウス由来のＦ−ボックスタンパ
クのｃＤＮＡの塩基配列の図２の続きである。

【図４】本発明のＦ−ボックスタンパクとサイクリンＥ
の相互作用を検討したインビボ実験系におけるＩＰおよ
びＩＢの結果を示す電気泳動図である。

【図５】サイクリンＥのユビキチン化に対する本発明の
Ｆ−ボックスタンパクの機能を検討したインビボ実験系
におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図であ
る。

【図６】サイクリンＥのユビキチン化に対する本発明の
Ｆ−ボックスタンパクの機能を検討したインビトロ実験
系におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図であ
る。

【図７】本発明のＦ−ボックスタンパクによるサイクリ
ンＥのユビキチン化がＣｄｋインヒビターによって阻害
されることを示したインビボ実験系におけるＩＰおよび
ＩＢの結果を示す電気泳動図である。

【図８】本発明のＦ−ボックスタンパクによるサイクリ
ンＥのユビキチン化がＣｄｋ２によって阻害されること
を示したインビボ実験系におけるＩＰおよびＩＢの結果
を示す電気泳動図である。

【図９】本発明のＦ−ボックスタンパクによる各種のサ
イクリンとの相互作用を検討したインビボ実験系におけ
るＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動図である。

【図１０】本発明のＦ−ボックスタンパクがサイクリン
ＥおよびＡのユビキチン化を促進することを調べたイン
ビボ実験におけるＩＰおよびＩＢの結果を示す電気泳動
図である。

【図１１】本発明のＦ−ボックスタンパクが欠損したマ
ウス胚線維芽細胞内における各種の細胞周期調節物質の
蓄積状況を検討したＩＢ分析の結果を示す電気泳動図で
ある。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ１タンパク、
   およびＦ−ボックスモチーフとＬＲＲモチーフを含むＦ
   −ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合体）から構成
   され、サイクリンＥをユビキチン化し分解するユビキチ
   ンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボックスタンパクであっ
   て、配列番号：１のアミノ酸配列で表わされることを特
   徴とするタンパク。
2. 【請求項２】 Ｓｋｐ１タンパク、Ｃｕｌ１タンパク、
   およびＦ−ボックスモチーフとＬＲＲモチーフを含むＦ
   −ボックスタンパクの複合体（ＳＣＦ複合体）から構成
   され、サイクリンＥをユビキチン化し分解するユビキチ
   ンリガーゼＳＣＦ複合体のＦ−ボックスタンパクであっ
   て、配列番号：２のアミノ酸配列で表わされることを特
   徴とするタンパク。
3. 【請求項３】 配列番号：１のアミノ酸配列から成る請
   求項１のＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号：２のアミノ酸配列から成る請
   求項２のＦ−ボックスタンパクをコードする遺伝子。