JPH1198984A - セリン／スレオニンキナーゼをコードするｄｎａ - Google Patents
セリン／スレオニンキナーゼをコードするｄｎａInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 セリン／スレオニンキナーゼをコードするＤ
ＮＡの提供。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質
ＮＡの提供。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、セリン／スレオニ
ンキナーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼの製造
方法に関する。
ンキナーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡ
を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼの製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞外からの様々なシグナルは細胞表面
の受容体を介して細胞内へ伝えられ、最終的に核内に伝
達される。核内に伝達されたシグナルは転写因子を活性
化し、その結果、一群の遺伝子の発現が誘導又は抑制さ
れ、細胞増殖、分化、さらには細胞死といった表現形が
現れる。これまでに多くの転写因子がクローニングさ
れ、機能ドメインの構造等が明らかにされている（MOLE
CULAR BIOLOGY OF THE CELL THIRD EDITION, pp401-46
9）。これらの機能ドメインの構造としては、ロイシン
ジッパー構造、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造、
亜鉛フィンガー構造等が知られている。その中でもロイ
シンジッパー構造はJun / Fos、ATF / CREB、又はC/EBP
ファミリー等の転写因子に共通してみられるモチーフで
あり、これら転写因子は互いのロイシンジッパー構造を
介してホモ又はヘテロ二量体を形成し、特異的遺伝子の
転写を制御することが多数報告されている（Hai, T. et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，88:3720-3724,199
1）。
の受容体を介して細胞内へ伝えられ、最終的に核内に伝
達される。核内に伝達されたシグナルは転写因子を活性
化し、その結果、一群の遺伝子の発現が誘導又は抑制さ
れ、細胞増殖、分化、さらには細胞死といった表現形が
現れる。これまでに多くの転写因子がクローニングさ
れ、機能ドメインの構造等が明らかにされている（MOLE
CULAR BIOLOGY OF THE CELL THIRD EDITION, pp401-46
9）。これらの機能ドメインの構造としては、ロイシン
ジッパー構造、ヘリックス・ループ・ヘリックス構造、
亜鉛フィンガー構造等が知られている。その中でもロイ
シンジッパー構造はJun / Fos、ATF / CREB、又はC/EBP
ファミリー等の転写因子に共通してみられるモチーフで
あり、これら転写因子は互いのロイシンジッパー構造を
介してホモ又はヘテロ二量体を形成し、特異的遺伝子の
転写を制御することが多数報告されている（Hai, T. et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，88:3720-3724,199
1）。
【０００３】さらに、最近ではロイシンジッパー構造が
転写因子以外の機能分子にも認められることが報告され
（Holzman, L.B. et al., J. Biol. Chem. 269: 30808-
30817, 1994）、ロイシンジッパー構造が転写因子同士
の結合のみならず、広くタンパク-タンパク間相互作用
ドメインとして細胞内で機能していることが示唆されて
いる。したがって、ロイシンジッパードメインと相互作
用する分子の同定は転写因子のもつ新たな機能のみなら
ず、転写因子以外の分子におけるロイシンジッパー構造
の機能を解析する上で有用であると考えられる。
転写因子以外の機能分子にも認められることが報告され
（Holzman, L.B. et al., J. Biol. Chem. 269: 30808-
30817, 1994）、ロイシンジッパー構造が転写因子同士
の結合のみならず、広くタンパク-タンパク間相互作用
ドメインとして細胞内で機能していることが示唆されて
いる。したがって、ロイシンジッパードメインと相互作
用する分子の同定は転写因子のもつ新たな機能のみなら
ず、転写因子以外の分子におけるロイシンジッパー構造
の機能を解析する上で有用であると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、セリン／ス
レオニンキナーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターによって形質
転換された形質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼ
の製造方法を提供することを目的とする。
レオニンキナーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターによって形質
転換された形質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼ
の製造方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト胎盤及びマウス脳
から調製したcDNAライブラリーからセリン／スレオニン
キナーゼをコードするDNAを単離することに成功し、本
発明を完成するに至った。
基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト胎盤及びマウス脳
から調製したcDNAライブラリーからセリン／スレオニン
キナーゼをコードするDNAを単離することに成功し、本
発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）の組換えタンパク質である。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタ
ンパク質である。 （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 さらに、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ
である。該ＤＮＡとしては、例えば配列番号３又は４で
表わされる塩基配列を含むものが挙げられる。さらに、
本発明は、前記ＤＮＡを含む組換えベクターである。
（ｂ）の組換えタンパク質である。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 さらに、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタ
ンパク質である。 （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 さらに、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ
である。該ＤＮＡとしては、例えば配列番号３又は４で
表わされる塩基配列を含むものが挙げられる。さらに、
本発明は、前記ＤＮＡを含む組換えベクターである。
【０００７】さらに、本発明は、組換えベクターによっ
て形質転換された形質転換体である。さらに、本発明
は、請求項８記載の形質転換体を培地に培養し、得られ
る培養物からセリン／スレオニンキナーゼを採取するこ
とを特徴とするセリン／スレオニンキナーゼの製造方法
である。以下、本発明を詳細に説明する。
て形質転換された形質転換体である。さらに、本発明
は、請求項８記載の形質転換体を培地に培養し、得られ
る培養物からセリン／スレオニンキナーゼを採取するこ
とを特徴とするセリン／スレオニンキナーゼの製造方法
である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の組換えタンパク質（以下
「ZIP-キナーゼ」ともいう）は、ATF4と呼ばれる転写因
子のロイシンジッパードメインと結合するタンパク質分
子であり、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するも
のである。また、ZIP-キナーゼはロイシンジッパー構造
を有する新規の核内セリン/スレオニンキナーゼであ
り、アポトーシスを誘導する活性を有する。なお、ATF4
とは、cAMP反応要素（cAMP response element ）(CRE)
に結合し、ATF/CREBファミリーに属するロイシンジッパ
ー型転写因子である。
「ZIP-キナーゼ」ともいう）は、ATF4と呼ばれる転写因
子のロイシンジッパードメインと結合するタンパク質分
子であり、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するも
のである。また、ZIP-キナーゼはロイシンジッパー構造
を有する新規の核内セリン/スレオニンキナーゼであ
り、アポトーシスを誘導する活性を有する。なお、ATF4
とは、cAMP反応要素（cAMP response element ）(CRE)
に結合し、ATF/CREBファミリーに属するロイシンジッパ
ー型転写因子である。
【０００９】一方、本発明のDNAは、ヒト胎盤及びマウ
ス脳から調製されたcDNAライブラリーから、いわゆる酵
母2-ハイブリッドシステム（酵母 two-hybrid system）
を用いたスクリーニングを行うことにより得られるもの
であり、ZIP-キナーゼをコードするものである（以下
「ZIP-キナーゼDNA」ともいう）。本発明のDNAは、以下
のようにしてクローニングすることができる。
ス脳から調製されたcDNAライブラリーから、いわゆる酵
母2-ハイブリッドシステム（酵母 two-hybrid system）
を用いたスクリーニングを行うことにより得られるもの
であり、ZIP-キナーゼをコードするものである（以下
「ZIP-キナーゼDNA」ともいう）。本発明のDNAは、以下
のようにしてクローニングすることができる。
【００１０】１．ZIP-キナーゼDNAのクローニング (1) ヒト胎盤及びマウス脳のcDNAライブラリーの作製 mRNAの供給源としては、ヒト胎盤又はマウス脳などの組
織が挙げられる。また、これらの組織由来の樹立した細
胞株を供給源としてもよい。mRNAの調製は、通常行われ
る手法により行うことができる。例えば、上記組織又は
細胞を、グアジニン試薬を用いて処理することにより全
RNAを得、次いでオリゴdT-セルロースやセファロース2B
を担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニテ
ィーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mR
NA)を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポ
リ(A+)RNAをさらに分画することもできる。
織が挙げられる。また、これらの組織由来の樹立した細
胞株を供給源としてもよい。mRNAの調製は、通常行われ
る手法により行うことができる。例えば、上記組織又は
細胞を、グアジニン試薬を用いて処理することにより全
RNAを得、次いでオリゴdT-セルロースやセファロース2B
を担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニテ
ィーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A+)RNA(mR
NA)を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポ
リ(A+)RNAをさらに分画することもできる。
【００１１】このようにして得られたmRNAを鋳型として
一本鎖cDNAを合成した後、この一本鎖cDNAから二本鎖cD
NAを合成し、適当なベクターDNAとの組換えプラスミド
を作製する。これを用いて大腸菌等を形質転換すること
により、cDNAのライブラリーを得る。あるいは、cDNAの
ライブラリーとして市販のもの(CLONETCH社)を用いても
よい。
一本鎖cDNAを合成した後、この一本鎖cDNAから二本鎖cD
NAを合成し、適当なベクターDNAとの組換えプラスミド
を作製する。これを用いて大腸菌等を形質転換すること
により、cDNAのライブラリーを得る。あるいは、cDNAの
ライブラリーとして市販のもの(CLONETCH社)を用いても
よい。
【００１２】(2)プラスミドpAS2-1の構築 前記(1) のようにして得られたcDNAライブラリーから目
的のクローンをスクリーニングするためのプラスミドを
調製する。プラスミドは、マウスATF4のロイシンジッパ
ードメイン（ATF4のアミノ酸配列の第298-349番目）を
コードするDNAを、GAL4 DNA結合ドメインをコードするD
NAに連結することによりキメラDNAを作製し、このキメ
ラDNAをバイトプラスミド(bait plasmid)pAS2-1に連結
することにより得ることができる。
的のクローンをスクリーニングするためのプラスミドを
調製する。プラスミドは、マウスATF4のロイシンジッパ
ードメイン（ATF4のアミノ酸配列の第298-349番目）を
コードするDNAを、GAL4 DNA結合ドメインをコードするD
NAに連結することによりキメラDNAを作製し、このキメ
ラDNAをバイトプラスミド(bait plasmid)pAS2-1に連結
することにより得ることができる。
【００１３】(3)スクリーニング 続いて上記プラスミドを用いてcDNAライブラリーをスク
リーニングする。スクリーニングには、酵母2-ハイブリ
ッドシステム (酵母 two-hybrid system)を用いること
ができる。酵母2-ハイブリッドシステムとは、タンパク
質間相互作用を酵母内で検出できる実験系であり、目的
のタンパク質（バイト）に相互作用するタンパク質のｃ
ＤＮＡをライブラリーよりスクリーニングすることが可
能である。陽性クローンは、ヒスチジン、トリプトファ
ン及びロイシンを含まない選択培地における増殖及びβ
-ガラクトシダーゼの活性を指標として選出することが
できる。
リーニングする。スクリーニングには、酵母2-ハイブリ
ッドシステム (酵母 two-hybrid system)を用いること
ができる。酵母2-ハイブリッドシステムとは、タンパク
質間相互作用を酵母内で検出できる実験系であり、目的
のタンパク質（バイト）に相互作用するタンパク質のｃ
ＤＮＡをライブラリーよりスクリーニングすることが可
能である。陽性クローンは、ヒスチジン、トリプトファ
ン及びロイシンを含まない選択培地における増殖及びβ
-ガラクトシダーゼの活性を指標として選出することが
できる。
【００１４】(4)塩基配列の決定 得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基
配列の決定はマキサム-ギルバート法、ジデオキシ法等
の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基
配列決定装置を用いて配列決定が行われる。配列番号２
に本発明のZIP-キナーゼDNAの塩基配列を、配列番号１
に本発明のZIP-キナーゼのアミノ酸配列を例示するが、
このアミノ酸配列からなるタンパク質がセリン／スレオ
ニンキナーゼとしての活性を有する限り、当該アミノ酸
配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、
付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１で表
わされるアミノ酸配列の第1番目のメチオニンが欠失し
た配列を有するものなども、本発明のタンパク質に含ま
れる。
配列の決定はマキサム-ギルバート法、ジデオキシ法等
の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基
配列決定装置を用いて配列決定が行われる。配列番号２
に本発明のZIP-キナーゼDNAの塩基配列を、配列番号１
に本発明のZIP-キナーゼのアミノ酸配列を例示するが、
このアミノ酸配列からなるタンパク質がセリン／スレオ
ニンキナーゼとしての活性を有する限り、当該アミノ酸
配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、
付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号１で表
わされるアミノ酸配列の第1番目のメチオニンが欠失し
た配列を有するものなども、本発明のタンパク質に含ま
れる。
【００１５】ここで、セリン／スレオニンキナーゼ活性
とは、ATPの末端リン酸基をタンパク質の特定のアミノ
酸（セリン又はスレオニン）に移す活性を意味する。な
お、変異の導入は、公知の手法により(Deng,W.P. et a
l., Anal. Biochem. 200: 81,1992)、あるいは市販のキ
ット（CLONETECH社のSite-Directed Mutagenesis Kit）
を用いて行うことができる。
とは、ATPの末端リン酸基をタンパク質の特定のアミノ
酸（セリン又はスレオニン）に移す活性を意味する。な
お、変異の導入は、公知の手法により(Deng,W.P. et a
l., Anal. Biochem. 200: 81,1992)、あるいは市販のキ
ット（CLONETECH社のSite-Directed Mutagenesis Kit）
を用いて行うことができる。
【００１６】一旦本発明のZIP-キナーゼDNAの塩基配列
が確定されると、その後は化学合成によって、又は種々
の組織由来のcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは
該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることにより、本発明のZIP-キナーゼDNAを
得ることができる。
が確定されると、その後は化学合成によって、又は種々
の組織由来のcDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは
該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることにより、本発明のZIP-キナーゼDNAを
得ることができる。
【００１７】２．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1)組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
ZIP-キナーゼDNAを連結(挿入)することにより得ること
ができる。本発明のZIP-キナーゼDNAを挿入するための
ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定
されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙
げられる。プラスミド DNAは、大腸菌やアグロバクテリ
ウムからアルカリ抽出法(Birnboim,H.C. & Doly,J.(197
9) Nucleic acid Res 7: 1513)又はその変法等により調
製することができる。また、市販のプラスミドとして例
えばpUC118（宝酒造社製）、pUC119 (宝酒造社製）、pB
luescript SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega
社製)、pT7Blue（Novagen社）、pBR322(宝酒造社)等を
用いてもよい。
ZIP-キナーゼDNAを連結(挿入)することにより得ること
ができる。本発明のZIP-キナーゼDNAを挿入するための
ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定
されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙
げられる。プラスミド DNAは、大腸菌やアグロバクテリ
ウムからアルカリ抽出法(Birnboim,H.C. & Doly,J.(197
9) Nucleic acid Res 7: 1513)又はその変法等により調
製することができる。また、市販のプラスミドとして例
えばpUC118（宝酒造社製）、pUC119 (宝酒造社製）、pB
luescript SK+ (Stratagene 社製）、pGEM-T (Promega
社製)、pT7Blue（Novagen社）、pBR322(宝酒造社)等を
用いてもよい。
【００１８】ファージ DNAとしては、例えば M13mp18、
M13mp19 、λgt10、λgt11等が挙げられる。ベクターに
本発明のDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適
当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素
部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクター
に連結する方法などが採用される。
M13mp19 、λgt10、λgt11等が挙げられる。ベクターに
本発明のDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適
当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素
部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクター
に連結する方法などが採用される。
【００１９】本発明のDNAは、そのDNAの機能が発揮され
るようにベクターに組み込まれることが必要である。そ
こで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の
DNAのほか、ターミネーター、リボソーム結合配列等を
組み込んでもよい。この場合、ターミネーターとしては
ストップコドン（TGA、TAG、TAA）が挙げられ、リボソ
ーム結合配列としてはリーダー配列が挙げられる。
るようにベクターに組み込まれることが必要である。そ
こで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の
DNAのほか、ターミネーター、リボソーム結合配列等を
組み込んでもよい。この場合、ターミネーターとしては
ストップコドン（TGA、TAG、TAA）が挙げられ、リボソ
ーム結合配列としてはリーダー配列が挙げられる。
【００２０】(3)形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の発現用組換えベクター
を、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入するこ
とにより得ることができる。ここで、宿主としては、本
発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるも
のではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）、バ
チルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のエッシェ
リヒア属、バチルス属に属する細菌、サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセ
ス・ポンベ(Saccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、
CHO細胞等の動物細胞、あるいは昆虫細胞(Sf9)等が挙げ
られる。
を、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入するこ
とにより得ることができる。ここで、宿主としては、本
発明のDNAを発現できるものであれば特に限定されるも
のではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）、バ
チルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のエッシェ
リヒア属、バチルス属に属する細菌、サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセ
ス・ポンベ(Saccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、
CHO細胞等の動物細胞、あるいは昆虫細胞(Sf9)等が挙げ
られる。
【００２１】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
DNA、転写終結配列により構成されていることが好まし
い。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
てもよい。発現ベクターとしては、例えばpET、pGEX(Ph
armacia社製)等が用いられる。
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
DNA、転写終結配列により構成されていることが好まし
い。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれてい
てもよい。発現ベクターとしては、例えばpET、pGEX(Ph
armacia社製)等が用いられる。
【００２２】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中
で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例え
ばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモータ
ー、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来す
るプロモーターが用いられる。T7、T3などのように、人
為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例え
ばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモータ
ー、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来す
るプロモーターが用いられる。T7、T3などのように、人
為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００２３】細菌への組換えベクターの導入方法として
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されな
い。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA,69,2110-2114(1972))、エレクトロポレー
ション法等が挙げられる。酵母を宿主として用いる場合
は、発現ベクターとして例えばYEp13、YEp24、YCp50等
が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母
中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばga
l1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック
タンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、SV40プ
ロモーター等が挙げられる。
は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されな
い。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA,69,2110-2114(1972))、エレクトロポレー
ション法等が挙げられる。酵母を宿主として用いる場合
は、発現ベクターとして例えばYEp13、YEp24、YCp50等
が用いられる。この場合のプロモーターとしては、酵母
中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばga
l1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック
タンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、SV40プ
ロモーター等が挙げられる。
【００２４】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法(Methods.Enzymo
l.,194,182-187(1990))、スフェロプラスト法(Proc. Na
tl.Acad.Sci.,USA,84,1929-1933(1978)、酢酸リチウム
法(J. Bacteriol., 153,163-168(1983))等が挙げられ
る。
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法(Methods.Enzymo
l.,194,182-187(1990))、スフェロプラスト法(Proc. Na
tl.Acad.Sci.,USA,84,1929-1933(1978)、酢酸リチウム
法(J. Bacteriol., 153,163-168(1983))等が挙げられ
る。
【００２５】動物細胞を宿主として用いる場合は、発現
ベクターとして例えばpcDNAI/Amp、pcDNAI(いずれもInv
itrogen社)等が用いられる。この場合、プロモーターと
してヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータ
ー等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導
入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リ
ン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられ
る。
ベクターとして例えばpcDNAI/Amp、pcDNAI(いずれもInv
itrogen社)等が用いられる。この場合、プロモーターと
してヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータ
ー等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導
入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リ
ン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられ
る。
【００２６】なお、本発明の組換えベクター（ヒト胎盤
からのZIP-キナーゼDNAを含むベクター及びマウス脳か
らのZIP-キナーゼDNAを含むベクター）は、それぞれ大
腸菌DH5に導入され（それぞれE.coli(hZIP-kinase)DH
5、E.coli(mZIP-kinase)DH5）、工業技術院生命工学工
業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平
成9年9月25日に、E.coli(hZIP-kinase)DH5についてはFE
RM P-16446、E.coli (mZIP-kinase)DH5についてはFERM
P-16447として寄託されている。
からのZIP-キナーゼDNAを含むベクター及びマウス脳か
らのZIP-キナーゼDNAを含むベクター）は、それぞれ大
腸菌DH5に導入され（それぞれE.coli(hZIP-kinase)DH
5、E.coli(mZIP-kinase)DH5）、工業技術院生命工学工
業技術研究所（茨城県つくば市東1丁目1番3号）に、平
成9年9月25日に、E.coli(hZIP-kinase)DH5についてはFE
RM P-16446、E.coli (mZIP-kinase)DH5についてはFERM
P-16447として寄託されている。
【００２７】３．ZIP-キナーゼの生産 本発明のZIP-キナーゼは、前記形質転換体を培地に培養
し、その培養物から採取することにより得ることができ
る。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主
の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
し、その培養物から採取することにより得ることができ
る。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主
の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００２８】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転
換体の培養効率的に行える培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グル
コース、フラクトース、スクロース、デンプン、デキス
トロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用い
られる。
られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転
換体の培養効率的に行える培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グル
コース、フラクトース、スクロース、デンプン、デキス
トロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機
酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用い
られる。
【００２９】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー、酵母エキス等が用いられ
る。
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー、酵母エキス等が用いられ
る。
【００３０】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸第二ナ
トリウム等が用いられる。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、リン酸第二ナ
トリウム等が用いられる。
【００３１】培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養
などの好気的条件下、37℃で12〜18時間行う。培養期間
中、ｐＨは7.0〜7.5に保持する。ｐＨの調整は、無機又
は有機の酸、アルカリ溶液、炭酸ガス等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。
などの好気的条件下、37℃で12〜18時間行う。培養期間
中、ｐＨは7.0〜7.5に保持する。ｐＨの調整は、無機又
は有機の酸、アルカリ溶液、炭酸ガス等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３２】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地
に添加してもよい。
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地
に添加してもよい。
【００３３】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO2存
在下、37℃で１〜３日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO2存
在下、37℃で１〜３日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。
【００３４】培養後、本発明のZIP-キナーゼが菌体内又
は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕等に
よりZIP-キナーゼを抽出する。また、本発明のZIP-キナ
ーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には培養液を
そのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を
除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的
な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組
み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のZI
P-キナーゼを単離精製することができる。
は細胞内に生産される場合には菌体又は細胞を破砕等に
よりZIP-キナーゼを抽出する。また、本発明のZIP-キナ
ーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には培養液を
そのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を
除去した後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的
な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組
み合わせて用いることにより、培養物中から本発明のZI
P-キナーゼを単離精製することができる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕ZIP-キナーゼDNAのクローニング (1)cDNAライブラリーの作製 本発明では、cDNAとして市販のもの(CLONETECH社)を用
いた。 (2) プラスミドの調製 マウスATFのロイシンジッパードメインをコードするDNA
をPCR法により得た。
説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕ZIP-キナーゼDNAのクローニング (1)cDNAライブラリーの作製 本発明では、cDNAとして市販のもの(CLONETECH社)を用
いた。 (2) プラスミドの調製 マウスATFのロイシンジッパードメインをコードするDNA
をPCR法により得た。
【００３６】
【００３７】プライマーとして以下のものを用いた。 センスプライマー：5'-GGGAATTCGCGGAGCAGGAGGCT-3'(配
列番号５) アンチセンスプライマー：5'-GGGGATCCCTAGGGGACCCTTTT
CTA-3'(配列番号６) PCRは、まず94℃で1分反応を行い、次に、94℃で20秒、
56℃で20秒及び72℃で30秒の反応を1サイクルとしてこ
れを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行っ
た。
列番号５) アンチセンスプライマー：5'-GGGGATCCCTAGGGGACCCTTTT
CTA-3'(配列番号６) PCRは、まず94℃で1分反応を行い、次に、94℃で20秒、
56℃で20秒及び72℃で30秒の反応を1サイクルとしてこ
れを25サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行っ
た。
【００３８】PCR産物をEcoRI/BamHIで切断し、pAS2-1ベ
クターのEcoRI/BamHIサイトへ挿入した。プラスミドを
大腸菌DH5αへ形質転換し、これよりアルカリ-SDS法に
基づいた市販のキット（Wizard miniprep：プロメガ
社）により精製を行った。このプラスミドは酵母内でGA
L4 DNA結合ドメインの融合タンパク質を発現することが
でき、バイトとして使用した。
クターのEcoRI/BamHIサイトへ挿入した。プラスミドを
大腸菌DH5αへ形質転換し、これよりアルカリ-SDS法に
基づいた市販のキット（Wizard miniprep：プロメガ
社）により精製を行った。このプラスミドは酵母内でGA
L4 DNA結合ドメインの融合タンパク質を発現することが
でき、バイトとして使用した。
【００３９】(3)スクリーニング バイトとなるプラスミドを酵母Y190株に形質転換した。
形質転換は、CLONETCH社のMATCHMAKER Two-Hybrid Syst
em kitを用いて行った。形質転換体は、トリプトファン
(-)の培地での生育が可能となるため、これを指標に選
別した。さらにGAL4転写活性化ドメインとの融合タンパ
ク質として発現が可能なcDNAライブラリー（CLONETECH
社のマウス脳及びヒト胎盤MATCHMAKER cDNAライブラリ
ー）を形質転換した。形質転換体はトリプトファン
(-)、ロイシン(-)の培地で生育可能となる。また、バイ
トと、ライブラリー由来のタンパク質をコードするDNA
とが結合すればレポーター遺伝子のHIS3遺伝子及びLacZ
遺伝子が転写されるため、陽性クローンは、トリプトフ
ァン(-)、ロイシン(-)、ヒスチジン(-)の培地で生育可
能になり、さらにβ-ガラクトシダーゼ活性を有するた
め、X-gal存在下で青色を呈する。陽性クローンよりプ
ラスミドを精製し(CLONETCH社のMATCHMAKER Two-Hybrid
System kitを用いて行った)、大腸菌へ形質転換し、こ
れよりプラスミドを精製し、塩基配列を決定した(ABI m
odel 377)。得られた塩基配列を、GenBank、EMBL、DDBJ
データベースを利用してホモロジー検索を行った。
形質転換は、CLONETCH社のMATCHMAKER Two-Hybrid Syst
em kitを用いて行った。形質転換体は、トリプトファン
(-)の培地での生育が可能となるため、これを指標に選
別した。さらにGAL4転写活性化ドメインとの融合タンパ
ク質として発現が可能なcDNAライブラリー（CLONETECH
社のマウス脳及びヒト胎盤MATCHMAKER cDNAライブラリ
ー）を形質転換した。形質転換体はトリプトファン
(-)、ロイシン(-)の培地で生育可能となる。また、バイ
トと、ライブラリー由来のタンパク質をコードするDNA
とが結合すればレポーター遺伝子のHIS3遺伝子及びLacZ
遺伝子が転写されるため、陽性クローンは、トリプトフ
ァン(-)、ロイシン(-)、ヒスチジン(-)の培地で生育可
能になり、さらにβ-ガラクトシダーゼ活性を有するた
め、X-gal存在下で青色を呈する。陽性クローンよりプ
ラスミドを精製し(CLONETCH社のMATCHMAKER Two-Hybrid
System kitを用いて行った)、大腸菌へ形質転換し、こ
れよりプラスミドを精製し、塩基配列を決定した(ABI m
odel 377)。得られた塩基配列を、GenBank、EMBL、DDBJ
データベースを利用してホモロジー検索を行った。
【００４０】その結果、既に報告されているC/EBPファ
ミリーやAP-1ファミリーの他にロイシンジッパー構造を
有する遺伝子とホモロジーの高いもの（ホモロジー20％
以上）を新規遺伝子とした。この新規遺伝子は、マウス
脳cDNAライブラリーより7クローン、ヒト胎盤からは2ク
ローン得られた。これらクローンはすべて同一遺伝子由
来であった。
ミリーやAP-1ファミリーの他にロイシンジッパー構造を
有する遺伝子とホモロジーの高いもの（ホモロジー20％
以上）を新規遺伝子とした。この新規遺伝子は、マウス
脳cDNAライブラリーより7クローン、ヒト胎盤からは2ク
ローン得られた。これらクローンはすべて同一遺伝子由
来であった。
【００４１】(4)塩基配列の決定 前記のようにして得られた遺伝子はキナーゼをコードす
るものと考えられ、本発明者はこの新規キナーゼをコー
ドするDNAをZIP-キナーゼDNA (Zipper Interacting Pro
tein Kinase DNA)と名付けた。そして、ZIP-キナーゼDN
Aについて、全長の塩基配列を決定した。
るものと考えられ、本発明者はこの新規キナーゼをコー
ドするDNAをZIP-キナーゼDNA (Zipper Interacting Pro
tein Kinase DNA)と名付けた。そして、ZIP-キナーゼDN
Aについて、全長の塩基配列を決定した。
【００４２】ヒト胎盤から得られたZIP-キナーゼDNAの
塩基配列を配列番号３に、マウス脳から得られたZIP-キ
ナーゼDNAの塩基配列を配列番号４に示す。また、配列
番号３、４で表わされる塩基配列によりコードされるア
ミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、２に示す。
塩基配列を配列番号３に、マウス脳から得られたZIP-キ
ナーゼDNAの塩基配列を配列番号４に示す。また、配列
番号３、４で表わされる塩基配列によりコードされるア
ミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、２に示す。
【００４３】ヒト胎盤から得られたZIP-キナーゼDNAに
よりコードされるアミノ酸配列(ヒトZIP-キナーゼ)とマ
ウス脳から得られたZIP-キナーゼDNAによりコードされ
るアミノ酸配列(マウスZIP-キナーゼ)との間でホモロジ
ー検索を行ったところ、それぞれのアミノ酸配列のC末
端にはロイシンジッパードメインが、N末端側にはセリ
ン/スレオニンキナーゼドメインが認められた（図1）。
また、マウス及びヒトZIP-キナーゼはそれぞれ448およ
び454アミノ酸からなっており、マウス−ヒト間の相同
性はアミノ酸レベルで84.9％であった。
よりコードされるアミノ酸配列(ヒトZIP-キナーゼ)とマ
ウス脳から得られたZIP-キナーゼDNAによりコードされ
るアミノ酸配列(マウスZIP-キナーゼ)との間でホモロジ
ー検索を行ったところ、それぞれのアミノ酸配列のC末
端にはロイシンジッパードメインが、N末端側にはセリ
ン/スレオニンキナーゼドメインが認められた（図1）。
また、マウス及びヒトZIP-キナーゼはそれぞれ448およ
び454アミノ酸からなっており、マウス−ヒト間の相同
性はアミノ酸レベルで84.9％であった。
【００４４】さらに、ZIP-キナーゼのキナーゼドメイン
は、IFN-γによるアポトーシスを正に制御するDAP-キナ
ーゼと高い相同性を示し、これらキナーゼが新たなファ
ミリーを形成していることが示唆された（図2）。
は、IFN-γによるアポトーシスを正に制御するDAP-キナ
ーゼと高い相同性を示し、これらキナーゼが新たなファ
ミリーを形成していることが示唆された（図2）。
【００４５】〔実施例２〕組換えベクターの構築及び形
質転換体の作製 ZIP-キナーゼDNAの組換えベクターを作製するため、ZIP
-キナーゼをコードするcDNAをPCR法により合成した。PC
R反応液及びプライマーは下記のものを用いた。
質転換体の作製 ZIP-キナーゼDNAの組換えベクターを作製するため、ZIP
-キナーゼをコードするcDNAをPCR法により合成した。PC
R反応液及びプライマーは下記のものを用いた。
【００４６】
【００４７】センスプライマー： 5'-GGGTCGACCAC CATG
GCTTAC CCATACGATG TTCCAGATTA CGCTATGTCC ACATTCAGGC
AA-3'（配列番号７） アンチセンスプライマー：5'-GGGTCGACTA GCGCACGCCG C
ACTCAGCCT GC-3'（配列番号８） PCRは、まず96℃で1分反応を行い、次に、96℃で30秒、
56℃で30秒及び72℃で1分の反応を1サイクルとしてこれ
を30サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。
得られたPCR産物をSalIで切断し、発現ベクターpEF-BOS
へ挿入した(TaKaRa社のLigationキット)。さらに、大腸
菌DH5(TOYOBO社)へ形質転換を行った。この大腸菌より
プラスミドを精製し(Promega社のWizard miniprep)、DN
Aシーケンス（ABI社model 377）で確認を行った。
GCTTAC CCATACGATG TTCCAGATTA CGCTATGTCC ACATTCAGGC
AA-3'（配列番号７） アンチセンスプライマー：5'-GGGTCGACTA GCGCACGCCG C
ACTCAGCCT GC-3'（配列番号８） PCRは、まず96℃で1分反応を行い、次に、96℃で30秒、
56℃で30秒及び72℃で1分の反応を1サイクルとしてこれ
を30サイクル行い、最後に72℃で10分の反応を行った。
得られたPCR産物をSalIで切断し、発現ベクターpEF-BOS
へ挿入した(TaKaRa社のLigationキット)。さらに、大腸
菌DH5(TOYOBO社)へ形質転換を行った。この大腸菌より
プラスミドを精製し(Promega社のWizard miniprep)、DN
Aシーケンス（ABI社model 377）で確認を行った。
【００４８】なお、ZIP-キナーゼの変異体（配列番号２
で表わされるアミノ酸配列の第42番目のアミノ酸リジン
をアラニンに変異させたもの；以下、「ZIP-キナーゼK4
2A」という）をコードするDNAを、CLONETECH社のSite-D
irected Mutagenesis Kitを用いて作製した。また、配
列番号２で表わされるアミノ酸配列の第422及び429番目
のアミノ酸バリン並びに第436番目のロイシンをそれぞ
れアラニンに変異させたもの；以下、「ZIP-キナーゼL
A」という）をコードするDNAも同様に作製した。
で表わされるアミノ酸配列の第42番目のアミノ酸リジン
をアラニンに変異させたもの；以下、「ZIP-キナーゼK4
2A」という）をコードするDNAを、CLONETECH社のSite-D
irected Mutagenesis Kitを用いて作製した。また、配
列番号２で表わされるアミノ酸配列の第422及び429番目
のアミノ酸バリン並びに第436番目のロイシンをそれぞ
れアラニンに変異させたもの；以下、「ZIP-キナーゼL
A」という）をコードするDNAも同様に作製した。
【００４９】〔実施例３〕本発明のDNAの機能 (1)細胞内におけるZIP-キナーゼとATF4の結合 ZIP-キナーゼとATF4が細胞内においても結合しているか
どうかを調べた。まず、マウスZIP-キナーゼ（配列番号
２で表わされるアミノ酸配列の第309-448番目）をコー
ドするDNAを発現ベクターpEF-BOSへ挿入した。このと
き、ZIP-キナーゼのN末端側に転写因子Mycのタグを施し
て、これがエピトープとなるようにしたMyc-ZIP-キナー
ゼ複合体をコードするDNAを設計し、ベクターを構築し
た（pEF-BOS-Myc-ZIP-キナーゼ）。また、ヒトATF４のN
末端にFLAGエピトープが付加されたヒトATF４（全長）-
FLAG複合体をコードするDNAを含む発現ベクターも作成
した（pEF-BOS-FLAG-ATF4）。
どうかを調べた。まず、マウスZIP-キナーゼ（配列番号
２で表わされるアミノ酸配列の第309-448番目）をコー
ドするDNAを発現ベクターpEF-BOSへ挿入した。このと
き、ZIP-キナーゼのN末端側に転写因子Mycのタグを施し
て、これがエピトープとなるようにしたMyc-ZIP-キナー
ゼ複合体をコードするDNAを設計し、ベクターを構築し
た（pEF-BOS-Myc-ZIP-キナーゼ）。また、ヒトATF４のN
末端にFLAGエピトープが付加されたヒトATF４（全長）-
FLAG複合体をコードするDNAを含む発現ベクターも作成
した（pEF-BOS-FLAG-ATF4）。
【００５０】これらを、COS-7細胞株へリポフェクショ
ン法を用いて一過性に導入し、発現させた（図3 レーン
1、4、7、10；FLAG-ATF4、レーン2、5、8、11；Myc-ZIP
-キナーゼ、レーン3、6、9、12；FLAG-ATF4とMyc-ZIP-
キナーゼ)。導入後36時間で細胞を回収し、0.5 % Nonid
et P-40溶解バッファーで可溶化し、細胞可溶化物（WCE
; whole cell extract)を得た。WCEをSDS-PAGEで展開
後、ニトロセルロース膜へ転写し、抗FLAGモノクローナ
ル抗体（図3 レーン1、2、3）及び抗Mycモノクローナル
抗体（レーン7、8、9）を用いてウェスタンブロット解
析を行い、Myc-ZIP-キナーゼ及びFLAG-ATF4の発現を確
認した。
ン法を用いて一過性に導入し、発現させた（図3 レーン
1、4、7、10；FLAG-ATF4、レーン2、5、8、11；Myc-ZIP
-キナーゼ、レーン3、6、9、12；FLAG-ATF4とMyc-ZIP-
キナーゼ)。導入後36時間で細胞を回収し、0.5 % Nonid
et P-40溶解バッファーで可溶化し、細胞可溶化物（WCE
; whole cell extract)を得た。WCEをSDS-PAGEで展開
後、ニトロセルロース膜へ転写し、抗FLAGモノクローナ
ル抗体（図3 レーン1、2、3）及び抗Mycモノクローナル
抗体（レーン7、8、9）を用いてウェスタンブロット解
析を行い、Myc-ZIP-キナーゼ及びFLAG-ATF4の発現を確
認した。
【００５１】続いて同WCEを抗Mycモノクローナル抗体で
免疫沈降し、沈降物を抗FLAGモノクローナル抗体でウェ
スタンブロット解析を行い、Myc-ZIP-キナーゼとFLAG-A
TF4との共免疫沈降の検出を試みた(図３、レーン４〜
６)。その結果、レーン6においてFLAG-ATF4のバンドが
検出された（図３）。さらに確信を得るため、次に同WC
Eを抗FLAGモノクローナル抗体で免疫沈降し、沈降物を
抗Mycモノクローナル抗体でウェスタンブロット解析を
行った（レーン10、11、12）。このときレーン12におい
てのみFLAG-ATF4と共免疫沈降しているMyc-ZIP-キナー
ゼのバンドが認められた。
免疫沈降し、沈降物を抗FLAGモノクローナル抗体でウェ
スタンブロット解析を行い、Myc-ZIP-キナーゼとFLAG-A
TF4との共免疫沈降の検出を試みた(図３、レーン４〜
６)。その結果、レーン6においてFLAG-ATF4のバンドが
検出された（図３）。さらに確信を得るため、次に同WC
Eを抗FLAGモノクローナル抗体で免疫沈降し、沈降物を
抗Mycモノクローナル抗体でウェスタンブロット解析を
行った（レーン10、11、12）。このときレーン12におい
てのみFLAG-ATF4と共免疫沈降しているMyc-ZIP-キナー
ゼのバンドが認められた。
【００５２】したがって、細胞内においてもZIP-キナー
ゼとATF4は相互に結合していることが示された。このこ
とから、ZIP-キナーゼとATF4とが相互に結合しているこ
とは、ZIP-キナーゼの活性をATF4が制御している可能性
があることが考えられる。
ゼとATF4は相互に結合していることが示された。このこ
とから、ZIP-キナーゼとATF4とが相互に結合しているこ
とは、ZIP-キナーゼの活性をATF4が制御している可能性
があることが考えられる。
【００５３】(2)ZIP-キナーゼとATF4との結合に必要な
ドメインの決定 ZIP-キナーゼとATF4が結合する部位を酵母 two-hybrid
systemを用いて決定した。まず、マウスZIP-キナーゼの
変異体として、1）ZIP-キナーゼアミノ酸278-448番目
（ZIP-キナーゼ 278-448）、2）ZIP-キナーゼロイシン
ジッパードメイン（アミノ酸398-448番目）（ZIP-キナ
ーゼ LZ）、3）ZIP-キナーゼのロイシンジッパードメイ
ンのバリン及びロイシンをアラニンに置換した変異体
（ZIP-キナーゼ LA）、を作成した。これらをGAL4トラ
ンス活性化ドメインとのキメラタンパクになるように
し、該キメラタンパク質をコードするDNAをpACT2へ挿入
し、pAS2-1-ATF4 LZと共に酵母細胞株であるY190へ導入
した。導入株をヒスチジン+、トリプトファン-、ロイシ
ン-、及びヒスチジン-、トリプトファン-、ロイシン-の
選択培地上で培養を行った。
ドメインの決定 ZIP-キナーゼとATF4が結合する部位を酵母 two-hybrid
systemを用いて決定した。まず、マウスZIP-キナーゼの
変異体として、1）ZIP-キナーゼアミノ酸278-448番目
（ZIP-キナーゼ 278-448）、2）ZIP-キナーゼロイシン
ジッパードメイン（アミノ酸398-448番目）（ZIP-キナ
ーゼ LZ）、3）ZIP-キナーゼのロイシンジッパードメイ
ンのバリン及びロイシンをアラニンに置換した変異体
（ZIP-キナーゼ LA）、を作成した。これらをGAL4トラ
ンス活性化ドメインとのキメラタンパクになるように
し、該キメラタンパク質をコードするDNAをpACT2へ挿入
し、pAS2-1-ATF4 LZと共に酵母細胞株であるY190へ導入
した。導入株をヒスチジン+、トリプトファン-、ロイシ
ン-、及びヒスチジン-、トリプトファン-、ロイシン-の
選択培地上で培養を行った。
【００５４】ZIP-キナーゼ 278-448をコードするDNAを
含む酵母、及びZIP-キナーゼ LZをコードするDNAを含む
酵母は、ヒスチジン-、トリプトファン-、ロイシン-の
培地上でコロニーを形成できることから、ZIP-キナーゼ
はC末端に存在するロイシンジッパードメインを介してA
TF4と結合することが示された（図4）。さらに、このと
きロイシンジッパー構造内のバリン、ロイシンをアラニ
ンに置換すると、もはやATF4との結合は認められなくな
る。以上のことからZIP-キナーゼとATF4とは、互いのロ
イシンジッパードメインを介して結合することが明らか
となった。
含む酵母、及びZIP-キナーゼ LZをコードするDNAを含む
酵母は、ヒスチジン-、トリプトファン-、ロイシン-の
培地上でコロニーを形成できることから、ZIP-キナーゼ
はC末端に存在するロイシンジッパードメインを介してA
TF4と結合することが示された（図4）。さらに、このと
きロイシンジッパー構造内のバリン、ロイシンをアラニ
ンに置換すると、もはやATF4との結合は認められなくな
る。以上のことからZIP-キナーゼとATF4とは、互いのロ
イシンジッパードメインを介して結合することが明らか
となった。
【００５５】(3)ZIP-キナーゼの各組織における発現 ZIP-キナーゼの各組織での発現を調べるためにノーザン
ブロット解析を行った。図5に示すように、ZIP-キナー
ゼのmRNAは約1.4 kbであり、調べた限りのほぼ全ての組
織に分布していた。ただし、脾臓においては少量の発現
を示すのみであった。
ブロット解析を行った。図5に示すように、ZIP-キナー
ゼのmRNAは約1.4 kbであり、調べた限りのほぼ全ての組
織に分布していた。ただし、脾臓においては少量の発現
を示すのみであった。
【００５６】(4)ZIP-キナーゼのホモ二量体形成の確認 ZIP-キナーゼのC末端に存在するロイシンジッパードメ
インはタンパク質同士が結合するドメインと考えられ
る。そこで、ZIP-キナーゼがホモ二量体を形成するかど
うか検討を行った。ZIP-キナーゼのロイシン・ジッパー
ドメインをコードするDNAをpAS2-1へ挿入したプラスミ
ドと、ZIP-キナーゼのロイシンジッパードメイン及び同
ドメイン内のバリン、ロイシンをアラニンに置換した変
異体をコードするDNAをpACT2に挿入したプラスミドとを
酵母に共導入し、選択培地でのコロニー形成を観察し
た。
インはタンパク質同士が結合するドメインと考えられ
る。そこで、ZIP-キナーゼがホモ二量体を形成するかど
うか検討を行った。ZIP-キナーゼのロイシン・ジッパー
ドメインをコードするDNAをpAS2-1へ挿入したプラスミ
ドと、ZIP-キナーゼのロイシンジッパードメイン及び同
ドメイン内のバリン、ロイシンをアラニンに置換した変
異体をコードするDNAをpACT2に挿入したプラスミドとを
酵母に共導入し、選択培地でのコロニー形成を観察し
た。
【００５７】図6に示すようにZIP-キナーゼのロイシン
ジッパードメインを共発現させた酵母のみ、ヒスチジン
-、トリプトファン-、ロイシン-の培地で生育可能であ
った。したがって、ZIP-キナーゼはそのロイシンジッパ
ー構造を介して互いにホモ二量体を形成することが明ら
かとなった。
ジッパードメインを共発現させた酵母のみ、ヒスチジン
-、トリプトファン-、ロイシン-の培地で生育可能であ
った。したがって、ZIP-キナーゼはそのロイシンジッパ
ー構造を介して互いにホモ二量体を形成することが明ら
かとなった。
【００５８】(5)ZIP-キナーゼによるアポトーシスの誘
導 ZIP-キナーゼのキナーゼ・ドメインと高い相同性を示す
DAP-キナーゼはHeLa細胞においてアポトーシスを誘導す
ることが示されている。そこでZIP-キナーゼがアポトー
シス活性を有するか検討した。HAでタグを施したRNA野
生型 ZIP-キナーゼ（pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ）、ZIP-
キナーゼサブドメインII内に存在し、他のキナーゼにお
いても保存されているリジン（アミノ酸42番目）をアラ
ニンに置換した変異体（pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ K42
A）及びロイシンジッパードメイン内のバリン、ロイシ
ンをアラニンに置換した変異体（pEF-BOS-HA-ZIP-キナ
ーゼ LA）を作成し、これらの各タンパク質をコードす
るDNAを、LacZ発現ベクター（pEF-BOS-LacZ）とともにN
IH 3T3細胞に一過性に導入した。導入してから36時間後
にX-gal染色を行った。
導 ZIP-キナーゼのキナーゼ・ドメインと高い相同性を示す
DAP-キナーゼはHeLa細胞においてアポトーシスを誘導す
ることが示されている。そこでZIP-キナーゼがアポトー
シス活性を有するか検討した。HAでタグを施したRNA野
生型 ZIP-キナーゼ（pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ）、ZIP-
キナーゼサブドメインII内に存在し、他のキナーゼにお
いても保存されているリジン（アミノ酸42番目）をアラ
ニンに置換した変異体（pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ K42
A）及びロイシンジッパードメイン内のバリン、ロイシ
ンをアラニンに置換した変異体（pEF-BOS-HA-ZIP-キナ
ーゼ LA）を作成し、これらの各タンパク質をコードす
るDNAを、LacZ発現ベクター（pEF-BOS-LacZ）とともにN
IH 3T3細胞に一過性に導入した。導入してから36時間後
にX-gal染色を行った。
【００５９】その結果、顕微鏡下で青く染色されている
細胞の形態を観察した（図7）。対照であるpEF-BOS-moc
k（図７、左上）と比べて、野生型ZIP-キナーゼを導入
した細胞（図７、右上）では核の凝集を伴う典型的なア
ポトーシスの形態を示した。この時のアポトーシス形態
を示すLacZ発現細胞の割合を計測したところ44.9％であ
った（図８）。
細胞の形態を観察した（図7）。対照であるpEF-BOS-moc
k（図７、左上）と比べて、野生型ZIP-キナーゼを導入
した細胞（図７、右上）では核の凝集を伴う典型的なア
ポトーシスの形態を示した。この時のアポトーシス形態
を示すLacZ発現細胞の割合を計測したところ44.9％であ
った（図８）。
【００６０】一方、ZIP-キナーゼ-K42A変異株(図７、左
下)ではこのような形態変化は認められず、アポトーシ
スの割合も対照と変化は認められなかった。また、ZIP-
キナーゼ-LA（図７、右下）においてはアポトーシスを
起こしている細胞が存在するものの、野生型と比べる
と、その割合は有意に減少していた。
下)ではこのような形態変化は認められず、アポトーシ
スの割合も対照と変化は認められなかった。また、ZIP-
キナーゼ-LA（図７、右下）においてはアポトーシスを
起こしている細胞が存在するものの、野生型と比べる
と、その割合は有意に減少していた。
【００６１】以上の結果から、ZIP-キナーゼの発現によ
るアポトーシスの誘導にはZIP-キナーゼのキナーゼ活性
が必須であると考えられる。さらにZIP-キナーゼ同士の
ホモ二量体を阻害するような変異においてアポトーシス
が抑制されることから、ZIP-キナーゼはホモ二量体を形
成して活性化型になることが示唆される。
るアポトーシスの誘導にはZIP-キナーゼのキナーゼ活性
が必須であると考えられる。さらにZIP-キナーゼ同士の
ホモ二量体を阻害するような変異においてアポトーシス
が抑制されることから、ZIP-キナーゼはホモ二量体を形
成して活性化型になることが示唆される。
【００６２】(6)ZIP-キナーゼのキナーゼ活性 ZIP-キナーゼが実際にキナーゼとしての活性を有するか
どうか検討を行った。pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ、pEF-B
OS-HA-ZIP-キナーゼ K42A、及びpEF-BOS-HA-ZIP-キナー
ゼ LAをそれぞれCOS-7細胞へ一過性に導入し、36時間後
に細胞を回収した後、0.5 % Nonidet P-40溶解バッファ
ーで可溶化した。可溶化物を抗HAモノクローナル抗体で
免疫沈降を行い、沈降物中のキナーゼ活性をin vitroキ
ナーゼアッセイで検出した（図９A）。
どうか検討を行った。pEF-BOS-HA-ZIP-キナーゼ、pEF-B
OS-HA-ZIP-キナーゼ K42A、及びpEF-BOS-HA-ZIP-キナー
ゼ LAをそれぞれCOS-7細胞へ一過性に導入し、36時間後
に細胞を回収した後、0.5 % Nonidet P-40溶解バッファ
ーで可溶化した。可溶化物を抗HAモノクローナル抗体で
免疫沈降を行い、沈降物中のキナーゼ活性をin vitroキ
ナーゼアッセイで検出した（図９A）。
【００６３】その結果、野生型ZIP-キナーゼには約50kD
aにZIP-キナーゼのリン酸化のバンドが認められた（図
９A, HA-ZIP-キナーゼのレーン）。一方、ZIP-キナーゼ
K42Aにおいてはこれに相当するバンドは認められなか
った。またZIP-キナーゼ LAにおいては、リン酸化のバ
ンドが認められた。しかしながら、同可溶化物における
HA-ZIP-キナーゼおよびその変異体の発現を抗HAモノク
ローナル抗体を用いたウェスタンブロットで確認したと
ころ、HA-ZIP-キナーゼの発現量が他の２つの変異体と
比べると顕著に減少していた（図９B）。この結果か
ら、ZIP-キナーゼ LAで認められるキナーゼ活性は野生
型のそれと比べると非常に弱いものと考えられる。ま
た、野生型ZIP-キナーゼの発現量がCOS-7細胞において
低いことは、ZIP-キナーゼがCOS-7細胞に対して何らか
の致死的な作用（例えばアポトーシス）を及ぼした結果
と考えられる。
aにZIP-キナーゼのリン酸化のバンドが認められた（図
９A, HA-ZIP-キナーゼのレーン）。一方、ZIP-キナーゼ
K42Aにおいてはこれに相当するバンドは認められなか
った。またZIP-キナーゼ LAにおいては、リン酸化のバ
ンドが認められた。しかしながら、同可溶化物における
HA-ZIP-キナーゼおよびその変異体の発現を抗HAモノク
ローナル抗体を用いたウェスタンブロットで確認したと
ころ、HA-ZIP-キナーゼの発現量が他の２つの変異体と
比べると顕著に減少していた（図９B）。この結果か
ら、ZIP-キナーゼ LAで認められるキナーゼ活性は野生
型のそれと比べると非常に弱いものと考えられる。ま
た、野生型ZIP-キナーゼの発現量がCOS-7細胞において
低いことは、ZIP-キナーゼがCOS-7細胞に対して何らか
の致死的な作用（例えばアポトーシス）を及ぼした結果
と考えられる。
【００６４】(7)ZIP-キナーゼの細胞内局在 ZIP-キナーゼの細胞内局在を知ることはZIP-キナーゼの
機能を解析する上で、大きな手がかりとなると考えられ
る。そこで本発明者は、ZIP-キナーゼの局在を共焦点レ
ーザー顕微鏡を用いて調べた。FLAGでタグをしたATF4を
コードするDNAを含む発現ベクター（pEF-BOS-FLAG-ATF
4）及びFLAGでタグを施したZIP-キナーゼ K42Aをコー
ドするDNA （pEF-BOS-FLAG-ZIP-キナーゼ K42A）を、そ
れぞれCOS-7細胞に一過性に導入た。36時間後、細胞を
固定し、抗FLAGモノクローナル抗体と反応させ、二次抗
体としてFITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体を用い
て染色した。
機能を解析する上で、大きな手がかりとなると考えられ
る。そこで本発明者は、ZIP-キナーゼの局在を共焦点レ
ーザー顕微鏡を用いて調べた。FLAGでタグをしたATF4を
コードするDNAを含む発現ベクター（pEF-BOS-FLAG-ATF
4）及びFLAGでタグを施したZIP-キナーゼ K42Aをコー
ドするDNA （pEF-BOS-FLAG-ZIP-キナーゼ K42A）を、そ
れぞれCOS-7細胞に一過性に導入た。36時間後、細胞を
固定し、抗FLAGモノクローナル抗体と反応させ、二次抗
体としてFITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体を用い
て染色した。
【００６５】共焦点レーザー顕微鏡下で観察したとこ
ろ、FLAG-ATF4を導入した細胞では細胞質が染色されて
おらず、核が染色されていた（図10 A）。同様にしてFL
AG-ZIP-キナーゼの局在を調べたところ、ATF4の場合と
同じ染色パターンが示され、核での局在が確認された
（図10 B）。従って、ZIP-キナーゼは新規の核内セリン
／スレオニンキナーゼであると結論づけることができ
た。
ろ、FLAG-ATF4を導入した細胞では細胞質が染色されて
おらず、核が染色されていた（図10 A）。同様にしてFL
AG-ZIP-キナーゼの局在を調べたところ、ATF4の場合と
同じ染色パターンが示され、核での局在が確認された
（図10 B）。従って、ZIP-キナーゼは新規の核内セリン
／スレオニンキナーゼであると結論づけることができ
た。
【００６６】
【発明の効果】本発明により、セリン／スレオニンキナ
ーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む
組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形
質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼの製造方法が
提供される。ZIP-キナーゼはアポトーシスを誘導する機
能を有するため、ZIP-キナーゼ及び該キナーゼをコード
するDNAは癌に対する遺伝子治療剤及び抗癌剤等として
利用できる点で有用である。
ーゼ、該キナーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む
組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形
質転換体及びセリン／スレオニンキナーゼの製造方法が
提供される。ZIP-キナーゼはアポトーシスを誘導する機
能を有するため、ZIP-キナーゼ及び該キナーゼをコード
するDNAは癌に対する遺伝子治療剤及び抗癌剤等として
利用できる点で有用である。
【００６７】
配列番号：1 配列の長さ：454 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Thr Phe Arg Gln Glu Asp Val Glu Asp His Tyr Glu Met Gly 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Ser Gly Gln Phe Ala Ile Val Arg Lys Cys Arg Gln 20 25 30 Lys Gly Thr Gly Lys Glu Tyr Ala Ala Lys Phe Ile Lys Lys Arg Arg 35 40 45 Leu Ser Ser Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg Glu Glu Ile Glu Arg Glu 50 55 60 Val Asn Ile Leu Arg Glu Ile Arg His Pro Asn Ile Ile Thr Leu His 65 70 75 80 Asp Ile Phe Glu Asn Lys Thr Asp Val Val Leu Ile Leu Glu Leu Val 85 90 95 Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Phe Leu Ala Glu Lys Glu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Asp Glu Ala Thr Gln Phe Leu Lys Gln Ile Leu Asp Gly Val His 115 120 125 Tyr Leu His Ser Lys Arg Ile Ala His Phe Asp Leu Lys Pro Glu Asn 130 135 140 Ile Met Leu Leu Asp Lys Asn Val Pro Asn Pro Arg Ile Lys Leu Ile 145 150 155 160 Asp Phe Gly Ile Ala His Lys Ile Glu Ala Gly Asn Glu Phe Lys Asn 165 170 175 Ile Phe Gly Thr Pro Glu Phe Val Ala Pro Glu Ile Val Asn Tyr Glu 180 185 190 Pro Leu Gly Leu Glu Ala Asp Met Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr 195 200 205 Ile Leu Leu Ser Gly Ala Ser Pro Phe Leu Gly Glu Thr Lys Gln Glu 210 215 220 Thr Leu Thr Asn Ile Ser Ala Val Asn Tyr Asp Phe Asp Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Phe Ser Asn Thr Ser Glu Leu Ala Lys Asp Phe Ile Arg Arg Leu Leu 245 250 255 Val Lys Asp Pro Lys Arg Arg Met Thr Ile Ala Gln Ser Leu Glu His 260 265 270 Ser Trp Ile Lys Ala Ile Arg Arg Arg Asn Val Arg Gly Glu Asp Ser 275 280 285 Gly Arg Lys Pro Glu Arg Arg Arg Leu Lys Thr Thr Arg Leu Lys Glu 290 295 300 Tyr Thr Ile Lys Ser His Ser Ser Leu Pro Pro Asn Asn Ser Tyr Ala 305 310 315 320 Asp Phe Glu Arg Phe Ser Lys Val Leu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Glu 325 330 335 Glu Gly Leu Arg Glu Leu Gln Arg Ser Arg Arg Leu Cys His Glu Asp 340 345 350 Val Glu Ala Leu Ala Ala Ile Tyr Glu Glu Lys Glu Ala Trp Tyr Arg 355 360 365 Glu Glu Ser Asp Ser Leu Gly Gln Asp Leu Arg Arg Leu Arg Gln Glu 370 375 380 Leu Leu Lys Thr Glu Ala Leu Lys Arg Gln Ala Gln Glu Glu Ala Lys 385 390 395 400 Gly Ala Leu Leu Gly Thr Ser Gly Leu Lys Arg Arg Phe Ser Arg Leu 405 410 415 Glu Asn Arg Tyr Glu Ala Leu Ala Lys Gln Val Ala Ser Glu Met Arg 420 425 430 Phe Val Gln Asp Leu Val Arg Ala Leu Glu Gln Glu Lys Leu Gln Gly 435 440 445 Val Glu Cys Gly Leu Arg 450
【００６８】配列番号：2 配列の長さ：448 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Thr Phe Arg Gln Glu Asp Val Glu Asp His Tyr Glu Met Gly 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Ser Gly Gln Phe Ala Ile Val Arg Lys Cys Gln Gln 20 25 30 Lys Gly Thr Gly Met Glu Tyr Ala Ala Lys Phe Ile Lys Lys Arg Arg 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg Glu Glu Ile Glu Arg Glu 50 55 60 Val Ser Ile Leu Arg Glu Ile Arg His Pro Asn Ile Ile Thr Leu His 65 70 75 80 Asp Val Phe Glu Asn Lys Thr Asp Val Val Leu Ile Leu Glu Leu Val 85 90 95 Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Phe Leu Ala Glu Lys Glu Ser Leu Thr 100 105 110 Glu Asp Glu Ala Thr Gln Phe Leu Lys Gln Ile Leu Asp Gly Val His 115 120 125 Tyr Leu His Ser Lys Arg Ile Ala His Phe Asp Leu Lys Pro Glu Asn 130 135 140 Ile Met Leu Leu Asp Lys His Ala Ala Ser Pro Arg Ile Lys Leu Ile 145 150 155 160 Asp Phe Gly Ile Ala His Arg Ile Glu Ala Gly Ser Glu Phe Lys Asn 165 170 175 Ile Phe Gly Thr Pro Glu Phe Val Ala Pro Glu Ile Val Asn Tyr Glu 180 185 190 Pro Leu Gly Leu Glu Ala Asp Met Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr 195 200 205 Ile Leu Leu Ser Gly Ala Ser Pro Phe Leu Gly Glu Thr Lys Gln Glu 210 215 220 Thr Leu Thr Asn Ile Ser Ala Val Asn Tyr Asp Phe Asp Glu Glu Tyr 225 230 235 240 Phe Ser Ser Thr Ser Glu Leu Ala Lys Asp Phe Ile Arg Arg Leu Leu 245 250 255 Val Lys Asp Pro Lys Arg Arg Met Thr Ile Ala Gln Ser Leu Glu His 260 265 270 Ser Trp Ile Lys Val Arg Arg Arg Glu Asp Gly Ala Arg Lys Pro Glu 275 280 285 Arg Arg Arg Leu Arg Ala Ala Arg Leu Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Ser 290 295 300 His Ser Ser Met Pro Arg Asn Thr Ser Tyr Ala Ser Phe Glu Arg Phe 305 310 315 320 Ser Arg Val Leu Glu Asp Val Ala Ala Ala Glu Gln Gly Leu Arg Glu 325 330 335 Leu Gln Arg Gly Arg Arg Gln Cys Arg Glu Arg Val Cys Ala Leu Arg 340 345 350 Ala Ala Ala Glu Gln Arg Glu Ala Arg Cys Arg Asp Gly Ser Ala Gly 355 360 365 Leu Gly Arg Asp Leu Arg Arg Leu Arg Thr Glu Leu Gly Arg Thr Glu 370 375 380 Ala Leu Arg Thr Arg Ala Gln Glu Glu Ala Arg Ala Ala Leu Leu Gly 385 390 395 400 Ala Gly Gly Leu Lys Arg Arg Leu Cys Arg Leu Glu Asn Arg Tyr Asp 405 410 415 Ala Leu Ala Ala Gln Val Ala Ala Glu Val Gln Phe Val Arg Asp Leu 420 425 430 Val Arg Ala Leu Glu Gln Glu Arg Leu Gln Ala Glu Cys Gly Val Arg 435 440 445
【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：2132 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：94..1455 配列 GTTGCCATTA GGGGACTCCT GAGGTCCTAT CTCCAGGCTG CGGTGACTGC ACTTTCCCTG 60 GAGTGGAAGC TGCTGGAAGG CGGACCGGCC GCC ATG TCC ACG TTC AGG CAG GAG 114 Met Ser Thr Phe Arg Gln Glu 1 5 GAC GTG GAG GAC CAT TAT GAG ATG GGG GAG GAG CTG GGC AGC GGC CAG 162 Asp Val Glu Asp His Tyr Glu Met Gly Glu Glu Leu Gly Ser Gly Gln 10 15 20 TTT GCG ATC GTG CGG AAG TGC CGG CAG AAG GGC ACG GGC AAG GAG TAC 210 Phe Ala Ile Val Arg Lys Cys Arg Gln Lys Gly Thr Gly Lys Glu Tyr 25 30 35 GCA GCC AAG TTC ATC AAG AAG CGC CGC CTG TCA TCC AGC CGG CGT GGG 258 Ala Ala Lys Phe Ile Lys Lys Arg Arg Leu Ser Ser Ser Arg Arg Gly 40 45 50 55 GTG AGC CGG GAG GAG ATC GAG CGG GAG GTG AAC ATC CTG CGG GAG ATC 306 Val Ser Arg Glu Glu Ile Glu Arg Glu Val Asn Ile Leu Arg Glu Ile 60 65 70 CGG CAC CCC AAC ATC ATC ACC CTG CAC GAC ATC TTC GAG AAC AAG ACG 354 Arg His Pro Asn Ile Ile Thr Leu His Asp Ile Phe Glu Asn Lys Thr 75 80 85 GAC GTG GTC CTC ATC CTG GAG CTG GTC TCT GGC GGG GAG CTC TTT GAC 402 Asp Val Val Leu Ile Leu Glu Leu Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp 90 95 100 TTC CTG GCG GAG AAA GAG TCG CTG ACG GAG GAC GAG GCC ACC CAG TTC 450 Phe Leu Ala Glu Lys Glu Ser Leu Thr Glu Asp Glu Ala Thr Gln Phe 105 110 115 CTC AAG CAG ATC CTG GAC GGC GTT CAC TAC CTG CAC TCT AAG CGC ATC 498 Leu Lys Gln Ile Leu Asp Gly Val His Tyr Leu His Ser Lys Arg Ile 120 125 130 135 GCA CAC TTT GAC CTG AAG CCG GAA AAC ATC ATG CTG CTG GAC AAG AAC 546 Ala His Phe Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Met Leu Leu Asp Lys Asn 140 145 150 GTG CCC AAC CCA CGA ATC AAG CTC ATC GAC TTC GGC ATC GCG CAC AAG 594 Val Pro Asn Pro Arg Ile Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ile Ala His Lys 155 160 165 ATC GAG GCG GGG AAC GAG TTC AAG AAC ATC TTC GGC ACC CCG GAG TTT 642 Ile Glu Ala Gly Asn Glu Phe Lys Asn Ile Phe Gly Thr Pro Glu Phe 170 175 180 GTG GCC CCA GAG ATT GTG AAC TAT GAG CCG CTG GGC CTG GAG GCG GAC 690 Val Ala Pro Glu Ile Val Asn Tyr Glu Pro Leu Gly Leu Glu Ala Asp 185 190 195 ATG TGG AGC ATC GGT GTC ATC ACC TAT ATC CTC CTG AGC GGT GCA TCC 738 Met Trp Ser Ile Gly Val Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Ala Ser 200 205 210 215 CCG TTC CTG GGC GAG ACC AAG CAG GAG ACG CTC ACC AAC ATC TCA GCC 786 Pro Phe Leu Gly Glu Thr Lys Gln Glu Thr Leu Thr Asn Ile Ser Ala 220 225 230 GTG AAC TAC GAC TTC GAC GAG GAG TAC TTC AGC AAC ACC AGC GAG CTG 834 Val Asn Tyr Asp Phe Asp Glu Glu Tyr Phe Ser Asn Thr Ser Glu Leu 235 240 245 GCC AAG GAC TTC ATT CGC CGG CTG CTC GTC AAA GAT CCC AAG CGG AGA 882 Ala Lys Asp Phe Ile Arg Arg Leu Leu Val Lys Asp Pro Lys Arg Arg 250 255 260 ATG ACC ATT GCC CAG AGC CTG GAA CAT TCC TGG ATT AAG GCG ATC CGG 930 Met Thr Ile Ala Gln Ser Leu Glu His Ser Trp Ile Lys Ala Ile Arg 265 270 275 CGG CGG AAC GTG CGT GGT GAG GAC AGC GGC CGC AAG CCC GAG CGG CGG 978 Arg Arg Asn Val Arg Gly Glu Asp Ser Gly Arg Lys Pro Glu Arg Arg 280 285 290 295 CGC CTG AAG ACC ACG CGT CTG AAG GAG TAC ACC ATC AAG TCG CAC TCC 1026 Arg Leu Lys Thr Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Thr Ile Lys Ser His Ser 300 305 310 AGC TTG CCG CCC AAC AAC AGC TAC GCC GAC TTC GAG CGC TTC TCC AAG 1074 Ser Leu Pro Pro Asn Asn Ser Tyr Ala Asp Phe Glu Arg Phe Ser Lys 315 320 325 GTG CTG GAG GAG GCG GCG GCC GCC GAG GAG GGC CTG CGC GAG CTG CAG 1122 Val Leu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Glu Glu Gly Leu Arg Glu Leu Gln 330 335 340 CGC AGC CGG CGG CTC TGC CAC GAG GAC GTG GAG GCG CTG GCC GCC ATC 1170 Arg Ser Arg Arg Leu Cys His Glu Asp Val Glu Ala Leu Ala Ala Ile 345 350 355 TAC GAG GAG AAG GAG GCC TGG TAC CGC GAG GAG AGC GAC AGC CTG GGC 1218 Tyr Glu Glu Lys Glu Ala Trp Tyr Arg Glu Glu Ser Asp Ser Leu Gly 360 365 370 375 CAG GAC CTG CGG AGG CTA CGG CAG GAG CTG CTC AAG ACC GAG GCG CTC 1266 Gln Asp Leu Arg Arg Leu Arg Gln Glu Leu Leu Lys Thr Glu Ala Leu 380 385 390 AAG CGG CAG GCG CAG GAG GAG GCC AAG GGC GCG CTG CTG GGG ACC AGC 1314 Lys Arg Gln Ala Gln Glu Glu Ala Lys Gly Ala Leu Leu Gly Thr Ser 395 400 405 GGC CTC AAG CGC CGC TTC AGC CGC CTG GAG AAC CGC TAC GAG GCG CTG 1362 Gly Leu Lys Arg Arg Phe Ser Arg Leu Glu Asn Arg Tyr Glu Ala Leu 410 415 420 GCC AAG CAA GTA GCC TCC GAG ATG CGC TTC GTG CAG GAC CTC GTG CGC 1410 Ala Lys Gln Val Ala Ser Glu Met Arg Phe Val Gln Asp Leu Val Arg 425 430 435 GCC CTG GAG CAG GAG AAG CTG CAG GGC GTG GAG TGC GGG CTG CGC 1455 Ala Leu Glu Gln Glu Lys Leu Gln Gly Val Glu Cys Gly Leu Arg 440 445 450 TAGGCGCAGT GGGGTGGGCC AGGCCCCAGG ACAGCCGGAG CTCGGCCTGC GGTGGGGGCG 1515 CTTCCTGTGG ACGCTGCGCC TCCCATCGCC CGGGTGCCTG TCCTTGCCCA GCGCCACCAG 1575 GCTGGAGGCG GAGTGGGAGG AGCTGGAGCC AGGCCCGTAA GTTCGCAGGC AGGGGTGGGT 1635 GTGGGACGGG GCTGCTTCTC TACACAGCCT CTACGCTGGC CTTCACCTTC ACCCCTGCAT 1695 CGTCGGTGAC CCTGGGACCC TCCAGGCAGC GTGGCCTGTG GCACCGTGAG GGTTGGGACC 1755 CACCGAGGCG CAGAGGCGGC CCGAATGCAG CCCTGGTTCA GGCCCGGAGG AGGGTTTGCG 1815 GGTAGTTGCA CGGACAATTC GGCGGGGTGC TGCCTGTTGC TGCCATTAGC CCAGGAGGAG 1875 GTCGTGGGAC GGGGAGGGTG GGATGGACGG CGGACAGGCA GTCCCCACGC TGCTGGGTGG 1935 CGCCGGGCTT GGTGGGGTCT TCCACTGTGT GCCCTTCTCG CCGAGGCCGG TCCCCCGGGT 1995 GTGGGGTGCC CTGCTGCGGA CTCCTCCGCG AGCCCCATCG TCGCGCCTGT GGACGCCTAG 2055 GCAAGAGCGG CCCTCTGCAG CCAAGAGAAA TAAAATACTG GCTTCCAGAT AAAAAAAAAA 2115 AAAAAAAAAA AAAAAAA 2132
【００７０】配列番号：4 配列の長さ：1429 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：10..1353 配列 CCAGCCGCC ATG TCC ACA TTC AGG CAA GAG GAT GTT GAG GAC CAT TAT 48 Met Ser Thr Phe Arg Gln Glu Asp Val Glu Asp His Tyr 1 5 10 GAG ATG GGA GAG GAG CTT GGC AGT GGC CAA TTT GCC ATC GTG CGC AAG 96 Glu Met Gly Glu Glu Leu Gly Ser Gly Gln Phe Ala Ile Val Arg Lys 15 20 25 TGC CAG CAG AAG GGC ACG GGC ATG GAG TAT GCA GCC AAG TTC ATC AAG 144 Cys Gln Gln Lys Gly Thr Gly Met Glu Tyr Ala Ala Lys Phe Ile Lys 30 35 40 45 AAG CGG CGC CTG CCA TCC AGC CGG CGC GGT GTG AGC CGG GAG GAG ATC 192 Lys Arg Arg Leu Pro Ser Ser Arg Arg Gly Val Ser Arg Glu Glu Ile 50 55 60 GAA CGC GAG GTG AGC ATC CTG CGC GAG ATC CGC CAC CCC AAC ATC ATA 240 Glu Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg Glu Ile Arg His Pro Asn Ile Ile 65 70 75 ACA CTG CAT GAC GTG TTC GAG AAC AAG ACA GAT GTG GTG CTG ATC CTG 288 Thr Leu His Asp Val Phe Glu Asn Lys Thr Asp Val Val Leu Ile Leu 80 85 90 GAG CTG GTG TCC GGT GGC GAG CTT TTC GAC TTC CTG GCC GAG AAG GAG 336 Glu Leu Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Phe Leu Ala Glu Lys Glu 95 100 105 TCA TTG ACG GAG GAT GAG GCC ACG CAG TTC CTC AAA CAA ATC CTA GAC 384 Ser Leu Thr Glu Asp Glu Ala Thr Gln Phe Leu Lys Gln Ile Leu Asp 110 115 120 125 GGT GTC CAC TAC CTG CAC TCC AAG CGC ATC GCA CAC TTT GAC CTG AAG 432 Gly Val His Tyr Leu His Ser Lys Arg Ile Ala His Phe Asp Leu Lys 130 135 140 CCC GAG AAC ATC ATG TTG CTG GAC AAG CAC GCA GCC AGC CCC CGC ATT 480 Pro Glu Asn Ile Met Leu Leu Asp Lys His Ala Ala Ser Pro Arg Ile 145 150 155 AAG CTC ATC GAC TTT GGC ATC GCG CAC AGG ATC GAG GCT GGC AGC GAG 528 Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ile Ala His Arg Ile Glu Ala Gly Ser Glu 160 165 170 TTC AAG AAC ATC TTT GGC ACA CCC GAG TTT GTC GCC CCC GAG ATC GTG 576 Phe Lys Asn Ile Phe Gly Thr Pro Glu Phe Val Ala Pro Glu Ile Val 175 180 185 AAC TAT GAG CCA CTT GGC TTG GAG GCT GAC ATG TGG AGC ATT GGC GTC 624 Asn Tyr Glu Pro Leu Gly Leu Glu Ala Asp Met Trp Ser Ile Gly Val 190 195 200 205 ATC ACC TAC ATC CTC CTG AGC GGA GCG TCC CCA TTC CTG GGC GAG ACC 672 Ile Thr Tyr Ile Leu Leu Ser Gly Ala Ser Pro Phe Leu Gly Glu Thr 210 215 220 AAG CAG GAG ACG CTG ACG AAC ATC TCA GCA GTG AAC TAT GAC TTT GAT 720 Lys Gln Glu Thr Leu Thr Asn Ile Ser Ala Val Asn Tyr Asp Phe Asp 225 230 235 GAG GAA TAC TTC AGC AGC ACC AGC GAG CTG GCC AAG GAC TTC ATC CGC 768 Glu Glu Tyr Phe Ser Ser Thr Ser Glu Leu Ala Lys Asp Phe Ile Arg 240 245 250 AGG CTG CTG GTC AAA GAC CCC AAG AGG AGG ATG ACC ATC GCA CAG AGC 816 Arg Leu Leu Val Lys Asp Pro Lys Arg Arg Met Thr Ile Ala Gln Ser 255 260 265 CTG GAG CAT TCC TGG ATC AAG GTG CGC AGG CGC GAG GAC GGC GCC CGG 864 Leu Glu His Ser Trp Ile Lys Val Arg Arg Arg Glu Asp Gly Ala Arg 270 275 280 285 AAG CCA GAG CGA CGG CGG CTG CGC GCC GCG CGC CTG CGC GAG TAC AGC 912 Lys Pro Glu Arg Arg Arg Leu Arg Ala Ala Arg Leu Arg Glu Tyr Ser 290 295 300 CTC AAG TCC CAC TCG AGC ATG CCG CGC AAC ACG AGC TAC GCC AGC TTC 960 Leu Lys Ser His Ser Ser Met Pro Arg Asn Thr Ser Tyr Ala Ser Phe 305 310 315 GAG CGC TTC TCA CGC GTG CTG GAG GAC GTG GCG GCG GCA GAG CAG GGG 1008 Glu Arg Phe Ser Arg Val Leu Glu Asp Val Ala Ala Ala Glu Gln Gly 320 325 330 CTG CGC GAG CTG CAG CGA GGC AGG CGC CAG TGC CGG GAG CGC GTG TGT 1056 Leu Arg Glu Leu Gln Arg Gly Arg Arg Gln Cys Arg Glu Arg Val Cys 335 340 345 GCG CTG CGC GCG GCC GCC GAG CAG CGG GAG GCG CGC TGC CGC GAC GGG 1104 Ala Leu Arg Ala Ala Ala Glu Gln Arg Glu Ala Arg Cys Arg Asp Gly 350 355 360 365 AGC GCA GGG CTA GGG CGC GAC CTG CGA CGC CTG CGC ACG GAG CTG GGG 1152 Ser Ala Gly Leu Gly Arg Asp Leu Arg Arg Leu Arg Thr Glu Leu Gly 370 375 380 CGC ACC GAG GCT CTG CGC ACG CGC GCG CAG GAG GAG GCG CGG GCG GCG 1200 Arg Thr Glu Ala Leu Arg Thr Arg Ala Gln Glu Glu Ala Arg Ala Ala 385 390 395 CTG TTG GGT GCC GGG GGC CTG AAG CGT CGC CTG TGT CGC CTG GAG AAC 1248 Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Lys Arg Arg Leu Cys Arg Leu Glu Asn 400 405 410 CGT TAC GAC GCG CTA GCC GCT CAG GTG GCC GCT GAG GTG CAA TTC GTG 1296 Arg Tyr Asp Ala Leu Ala Ala Gln Val Ala Ala Glu Val Gln Phe Val 415 420 425 CGC GAC CTG GTG CGT GCG CTG GAG CAG GAA CGG CTG CAG GCT GAG TGC 1344 Arg Asp Leu Val Arg Ala Leu Glu Gln Glu Arg Leu Gln Ala Glu Cys 430 435 440 445 GGC GTG CGC TAGGCTGCGG CACCCCCAGA CCCCGACCCA CCCCCAGAAT 1393 Gly Val Arg AAAGCTGCTT TCCACGTAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1429
【００７１】配列番号：5 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸(合成DNA) 配列 GGGAATTCGC GGAGCAGGAG GCT 23
【００７２】配列番号：6 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸(合成ＤＮＡ） 配列 ＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴ ＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴ ＴＴＴＣＴＡ
26
26
【００７３】配列番号：7 配列の長さ：62 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸(合成DNA) 配列 GGGTCGACCAC CATGGCTTAC CCATACGATG TTCCAGATTA CGCTATGTCC ACATTCAGGC 60 AA 62
【００７４】配列番号：8 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸(合成DNA) 配列 GGGTCGACTA GCGCACGCCG CACTCAGCCT GC 32
【図１】アミノ酸配列のホモロジー検索結果を示す図で
ある。
ある。
【図２】アミノ酸配列のホモロジー検索結果を示す図で
ある。
ある。
【図３】ウエスタンブロットの結果を示す電気泳動写真
である。
である。
【図４】選択培地でのコロニー形成結果を示す写真であ
る(生物の形態) 。
る(生物の形態) 。
【図５】ノーザンブロットの結果を示す電気泳動写真で
ある。
ある。
【図６】選択培地でのコロニー形成結果を示す写真であ
る(生物の形態) 。
る(生物の形態) 。
【図７】アポトーシスの形態を示すNIH3T3細胞の写真で
ある(生物の形態) 。
ある(生物の形態) 。
【図８】アポトーシスの形態を示すLacZ発現細胞の割合
を示す図である。
を示す図である。
【図９】ZIP-キナーゼのキナーゼ活性を示す電気泳動写
真である。
真である。
【図１０】ZIP-キナーゼの細胞内局在を示す写真である
(生物の形態) 。
(生物の形態) 。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【整理番号】 Ｐ９７−０３７２
【提出日】 平成１０年１０月０７日
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６４４６
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４８７
【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１６４４７
【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所
工業技術研究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６４８８
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (9)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 - 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質。 （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 - 【請求項３】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 - 【請求項４】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質 （ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において1
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなり、かつセリン／スレオニンキナ
ーゼ活性を有するタンパク質 - 【請求項５】 配列番号３で表わされる塩基配列を含
む、請求項3記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号４で表わされる塩基配列を含
む、請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項３〜６のいずれか1項に記載のＤ
ＮＡを含む組換えベクター。 - 【請求項８】 請求項７記載の組換えベクターによって
形質転換された形質転換体。 - 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からセリン／スレオニンキナーゼを
採取することを特徴とするセリン／スレオニンキナーゼ
の製造方法。
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| DE69832453T DE69832453T2 (de) | 1997-09-26 | 1998-09-24 | DNA kodierend für eine Serin/Threonin Kinase |
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