JP2002539833A - カリンレギュレーターｒｏｃ１およびｒｏｃ２をコードする単離ｄｎａ、それらによってコードされた単離タンパク質、ならびにそれらの利用法 - Google Patents

カリンレギュレーターｒｏｃ１およびｒｏｃ２をコードする単離ｄｎａ、それらによってコードされた単離タンパク質、ならびにそれらの利用法

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JP2002539833A JP2000608753A JP2000608753A JP2002539833A JP 2002539833 A JP2002539833 A JP 2002539833A JP 2000608753 A JP2000608753 A JP 2000608753A JP 2000608753 A JP2000608753 A JP 2000608753A JP 2002539833 A JP2002539833 A JP 2002539833A
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オータ，トモヒコ
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ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、タンパク質ＲＯＣ１およびＲＯＣ２をコードする単離ポリヌクレオチド配列ならびにそれを含む宿主細胞に関する。ＲＯＣ１およびＲＯＣ２タンパク質の抗体およびそれらをコードするポリヌクレオチドに相補的なアンチセンス分子と同様に、ＲＯＣ１およびＲＯＣ２タンパク質の産生法も開示し、サンプル中のポリヌクレオチドの検出法が本発明に含まれる。本発明はさらに、ＲＯＣタンパク質に結合することができる生物活性因子のスクリーニング法、ＲＯＣタンパク質の結合を干渉することができる生物活性因子のスクリーニング法、およびＲＯＣタンパク質の活性を調整することができる生物活性因子のスクリーニング法を含む。このような薬理学的に活性な化合物を含む薬学的処方物およびその投与法は本発明のさらなる態様である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願） 本出願は、１９９９年３月３１日に提出された米国特許仮出願番号６０／１２
７，２６１および１９９９年１１月２２日に提出された米国特許仮出願番号６０
／１６６，９２７の利益を主張する。両仮出願は、その全体が本明細書の記載の
一部として援用される。
【０００２】 （連邦政府援助の陳述） 本発明は、国立衛生研究所の助成金番号ＲＯ１ ＣＡ６５５７２−０１の政府
援助を用いて行った。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】 （発明の分野） 本発明は、ユビキチンリガーゼ活性に関連するカリンレギュレーターの核酸お
よびアミノ酸配列ならびにこれらの配列の利用法に関する。
【０００４】 （発明の背景） ユビキチン依存性タンパク質分解工程は、生理学的細胞条件での変化の結果と
して濃度が急速に変化する多数の短命細胞内タンパク質を制御する。Ｈｏｃｈｓ
ｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．ら、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、３０、
４０５〜４３９；Ｋｉｎｇ，Ｒ．Ｗ．ら１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、１
６５２〜１６５９；Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．ら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９、７８８〜７９９を参照のこと。恒常性および誤って
折りたたまれたタンパク質の除去などの「ハウスキーピング」機能の実行に加え
て、タンパク質分解工程には、多くの調節タンパク質（サイカリン、ＣＤＫイン
ヒビター、転写因子、およびシグナル伝達因子など）の分解に関与する。簡単に
述べれば、ユビキチン媒介性タンパク質分解は、ユビキチン（ユビキチン活性化
酵素（Ｅ１またはＵｂａ）によってＡＴＰ依存様式において全ての真核細胞で発
現される７６アミノ酸タンパク質）の活性化から開始される。活性化ユビキチン
は、Ｅ１と高エネルギーチオールエステル結合を形成し、Ｅ２またはＵｂｃと呼
ばれるユビキチン結合化酵素内のチオールエステル結合を介してもシステイン残
基にわたる。次いで、Ｅ２連結ユビキチンは、基質中のリジン残基のアミノ酸側
鎖に導入されてＥ３として公知のユビキチンリガーゼによって直接的またはしば
しば間接的に標的される末端イソペプチド結合を形成する。基質タンパク質を、
単一のユビキチン（モノユビキチン結合化）または複数のユビキチン分子（ポリ
ユビキチン結合化）に結合することができる。モノユビキチン結合化結合物の有
意性は、短命ではないようであるので明白ではない。イソペプチド結合を介した
前述のユビキチンのＬｙｓ４６へのさらなるユビキチンの連続的な共有結合によ
り、迅速に検出され且つ２６Ｓプロテオソームによって分解されるポリユビキチ
ン結合化結合物が得られる。Ｅ３は、構造的というよりはむしろ機能的に、ユビ
キチン付加Ｅ２から基質へのユビキチンの伝達に必要且つ十分であり、基質特異
性の獲得によって多数のポリユビキチン化反応に関連するとさらに考えられるユ
ビキチンリガーゼ活性と定義する。ほとんどのポリユビキチン結合化タンパク質
が分解用の２６Ｓプロテオソームであると無差別に考えられるので、Ｅ３リガー
ゼ活性の機構および制御の惹起は、タンパク質分解制御の理解の重要な中心的問
題となる。
【０００５】 多重遺伝子族の存在ならびにＳＩＣ１、ＣＬＮ、およびＳＷＥ１タンパク質の
ユビキチン結合化を媒介するためのそれぞれＳＫＰ１−ＣＤＣ４、ＳＫＰ１−Ｇ
ＲＲ１、およびおそらくＳＫＰ１−ＭＥＴ３０との少なくとも３つの異なるＥ３
複合体への酵母ＣＤＣ５３のアセンブリによって示されるように、タンパク質の
カリンファミリーは、多数の異なるＥ３を潜在的に形成する。例えば、Ｓｋｏｗ
ｙｒａ，Ｄ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ、９１、２０９〜２１９；Ｆｅｌｄｍａｎ
，Ｒ．Ｍ．Ｒ．、１９９７、Ｃｅｌｌ、９１、２２１〜２３０；およびＫａｉｓ
ｅｒ，Ｐ．ら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．、１２、２５８７〜２５９７を
参照のこと。異なる基質を標的化するにもかかわらず、異なるカリンは、種々の
細胞工程において機能する。例えば、ＣＤＣ５３は、Ｓ期への移行（Ｍａｔｈｉ
ａｓ，Ｎ．ら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１６、６６３４〜６
６４３）；遺伝子発現および細胞周期を感知するグルコースのカップリング（Ｌ
ｉ，Ｆ．Ｎ．およびＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｍ．、１９９７、ＥＭＢＯ Ｊ．、１６
、５６２９〜５６３８）；およびおそらく有糸分裂ＣＬＢ−ＣＤＣ２８活性の活
性化（Ｋａｉｓｅｒ，Ｐ．ら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．、１２、２５８
７〜２５９７）に必要である。以下により詳細に記載するように、Ｃ．ｅｌｅｇ
ａｎｓ Ｃｕｌ−１ｐ変異体は、過形成表現型を示す。ヒトＣＵＬ２は、低酸素
症誘導性ｍＲＮＡの安定性の制御に関連する癌抑制ＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅ
ｌ−Ｌｉｎｄａｕ）に関連する（Ｐａｕｓｅ，Ａ．ら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、２１５６〜２１６１；Ｌｏｎｅｒｇ
ａｎ，Ｋ．Ｍ．ら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１８、７３２〜７
４１を参照のこと）。ヒトＣＵＬ４Ａは、乳癌におけるそのゲノム増幅および過
剰発現による腫瘍形成に関連し（Ｃｈｅｎ，Ｌ−Ｃ．ら、１９９８、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．、６８、３６７７〜３６８３）、カリン関連ＡＰＣ２の欠損により
有糸分裂が停止する（Ｚａｃｈａｒｉａｅ，Ｗ．ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２７９、１２１６〜１２１９；Ｙｕ，Ｈ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ、６、４５５〜４６６）。
【０００６】 Ｅ３ユビキチンリガーゼの知識は限られている。あまりないが、特徴づけられ
ているＥ３リガーゼは、基質タンパク質のアミノ末端での塩基性または疎水性残
基への結合によってタンパク質を認識するユビキチンリガーゼＥα／Ｕｂｒ１の
Ｎ末端での役割（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ａ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３、１２１４２〜１２１４９）；ｐ５３
のユビキチン−リガーゼとして機能する哺乳動物Ｅ６ＡＰ−Ｅ６複合体に代表さ
れるＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシ末端相同性）ドメインタンパク質（Ｓｃｈ
ｅｆｆｉｎｅｒ，Ｍ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７５、４９５〜５０５；Ｈｕｉ
ｂｒｅｇｔｓｅ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、９２、２５６３〜２５６７；Ｓｃｈｅｆｆｉｎｅｒ，Ｍ．ら、１９
９５、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、８１〜８３を参照のこと）；およびＡＰＣ（分裂
後期促進複合体またはシクロソーム）（８〜１２個のサブユニットからなり、分
裂後期への移行ならびに有糸分裂の終了に必要な２０Ｓ複合体）（Ｋｉｎｇ，Ｒ
．Ｗ．、Ｄｅｓｈａｉｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、１６５２〜１６５９を参
照のこと）である。
【０００７】 ＡＰＣは、多くのタンパク質のユビキチン依存性タンパク質分解の促進による
細胞の分裂後期への移行の制御に重要な役割を果たす。ＡＰＣは、ＣＤＣ２キナ
ーゼ活性の活性化および細胞質分裂の開始に関する分裂Ｂ型サイカリンを破壊す
る。ＡＰＣはまた、姉妹染色分体分離および紡錘体分解用の他のタンパク質（分
裂後期インヒビターＰＤＳＩ（Ｃｏｈｅｎ−Ｆｉｘ，Ｏ．ら、１９９６、Ｇｅｎ
ｅｓ＆Ｄｅｖ．、１０、３０８１〜３０９３）およびＣＵＴ２（Ｆｕｎａｂｉｋ
ｉ，Ｈ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８１、４３８〜４４１）、ＡＳＥ１（
Ｊｕａｎｇ，Ｙ−Ｌ．ら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５、１３１１〜１３
１４）、および接着タンパク質ＳＣＣ１Ｐ（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｃ．ら、１９
９７、Ｃｅｌｌ、９１、３５〜４５）を含む）の分解に必要である。ＡＰＣによ
って分解される公知の全てのタンパク質は、ユビキチン結合およびその後の分解
に必要な破壊ボックスとして一般に公知の変換された９個のアミノ酸を含む（Ｇ
ｌｏｔｚｅｒ，Ｍ．ら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、１３２〜１３８）。
Ｇ１サイカリンおよびＣＤＫインヒビターから転写因子の範囲のＧ１期に分解さ
れるタンパク質は、保存された破壊ボックスまたは任意の他の共通の構造モチー
フを含まない。その代わりに、基質のリン酸化は、その後のユビキチン結合のた
めのＥ３との相互作用の標的化に重要な役割を果たすようである。遺伝的および
生物学的分析により、Ｇ１進行の調節に重要な役割を果たす別名ＳＣＦの酵母に
おけるＥ３様活性が同定される。ＳＣＦは、少なくとも３つのサブユニット（Ｓ
ＫＰ１、ＣＤＣ５３／カリン、およびＦボックス含有タンパク質）からなり、Ｓ
ＫＰ１は基質に直接結合するＦボックスにＣＤＣ５３を連結させるためのアダプ
ターとして機能する（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｒ．ら、１９９７、Ｃｅｌｌ、
９１、２２１〜２３０；Ｂａｉ，Ｃ．ら、１９９６、Ｃｅｌｌ、８６、２６３〜
２７４；Ｗｉｌｌｅｍｓ，Ａ．Ｒ．、１９９６、Ｃｅｌｌ、８６、４５３〜４６
３；Ｖｅｒｍａ，Ｒ．、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８、４５５〜４６０；
Ｓｋｏｗｙｒａ，Ｄ．、１９９７、Ｃｅｌｌ、９１、２０９〜２１９）。
【０００８】 Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける過剰な後胚細胞分裂を行う変異体についてのスク
リーニングでは、遺伝子カリン１（ＣＵＬ１）が同定された。この遺伝子の機能
喪失により、細胞周期からの適切な退出に失敗した結果として、全組織が過形成
を起こした。Ｋｉｐｒｅｏｓ，Ｅ．Ｔ．、１９９６、Ｃｅｌｌ、８５、８２９〜
８３９を参照のこと。ＣＵＬ１は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは少なくとも７個、ヒ
トでは少なくとも６個、およびＣｄｃ５３ｐを含む出芽酵母では少なくとも３つ
のメンバーを含む進化によって変換した多重遺伝子族を示す（Ｋｉｐｒｅｏｓら
、前出およびＭａｔｈｉａｓ，Ｎ．ら）、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．、１６、６６３４〜６６４３）。酵母ＣＤＣ５３と同様に、ヒトカリン１は
、ＳＫＰ１に直接結合して、ＳＫＰ２（Ｆボックスタンパク質）と、サイカリン
Ａと、ＣＤＫ２との多重サブユニット複合体を形成し（Ｌｉｓｚｔｗａｎ，Ｊ．
ら、１９９８、ＥＭＢＯ Ｊ．、１７、３６８〜３８３；Ｍｉｃｈｅｌ，Ｊ．お
よびＸｉｏｎｇ，Ｙ．、１９９８、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．、
９、４３９〜４４５；Ｌｙａｐｉｎａ，Ｓ．Ａ．ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、７４５１〜７４５６；およびＹｕ，Ｚ
．Ｋ．ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、
９５、１１３２４〜１１３２９）、酵母ＳＣＦ成分と機能的なキメラユビキチン
リガーゼを構築することができる。最近、有糸分裂ＡＰＣ Ｅ３複合体のサブユ
ニットＡＰＣ２はＣＤＣ５３／カリンと限定された配列類似性を含むことが見出
された（Ｚａｃｈａｒｉａｅ，Ｗ．ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９、１
２１６〜１２１９；Ｙｕ，Ｈ．ら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９、１２１
９〜１２２２）。これらの所見は、ＳＣＦおよびＡＰＣ複合体の他の成分の間の
明確な構造上の類似性が存在しないという事実と考え合わせて、おそらくユビキ
チンリガーゼの内因性パートナーとしてのユビキチン媒介性タンパク質分解につ
いての重要で変換された役割を強調している。しかし、ＡＰＣおよびＳＣＦ Ｅ
３リガーゼについての詳細な調査にもかかわらず、ユビキチンリガーゼの性質の
理解は困難であった。ＡＰＣおよびＳＣＦ中に「リガーゼ」が存在するかどうか
の同定が残されている。カリンタンパク質がイソペプチド結合形成を媒介するユ
ビキチンリガーゼとしてまたはＥ２−Ｕｂと基質とを合わせる足場タンパク質と
して作用するのかどうかについては記載されていない。
【０００９】 基質特異性を同定する機構としてＥ３リガーゼの制御は同様に重要であるが、
現在あまり理解されていない。ＡＰＣの活性は細胞周期を制御し、分裂後期から
Ｇ１後期まで活性である。Ａｍｏｎ，Ａ．、１９９４、Ｃｅｌｌ、７７、１０３
７〜１０５０；Ｋｉｎｇ，Ｒ．ら、１９９５、前出；Ｂｒａｎｄｅｉｓ，Ｍ．お
よびＨｕｎｔ，Ｔ．、１９９６、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５、５２８０〜５２８９を
参照のこと。おそらく、ＣＤＣ２０およびＣＤＨ１結合などのサブユニット再配
列によって主に調節される（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ，ら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２７８、４６０〜４６３；Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．、１９９７、Ｃｅｌｌ、９０、
６８３〜６９３；Ｓｉｇｒｉｓｔ，Ｓ．Ｊ．およびＬｅｈｎｅｒ，Ｃ．Ｆ．、１
９９７、Ｃｅｌｌ、９０、６７１〜６８１；およびＦａｎｇ，Ｇ．、１９９８、
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２、１６３〜１７１）。一定のサブユニットのリン酸化はま
た、重要であるが補助的役割を果たし得る（Ｌａｈａｖ−Ｂａｒａｔｚ，Ｓ．、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９３０３〜９３０７；
Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．−Ｍ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、１１９９〜
１２０１）。静止期のＣＤＣ５３およびカリン媒介Ｅ３リガーゼ活性の制御は以
前には説明されていない。
【００１０】 （発明の要旨） 本発明者らは、ＡＰＣ１１に類似し、ＡＰＣ複合体のサブユニットである、２
つに密接に関連したＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＯＣ１およびＲＯＣ２のフ
ァミリーを同定した。ＲＯＣ１およびＲＯＣ２は、一般に全てのカリンタンパク
質と相互作用するが、ＡＰＣ１１は、ＡＰＣ２と特異的に相互作用する。ＲＯＣ
１は、インビボでＳＣＦ経路によってＣＤＫインヒビターＳｉｃ１分解の必須の
レギュレーターとして機能する。さらに、本発明者らは、ＲＯＣ−カリンは触媒
ユビキチンリガーゼを構成することを見出した。本発明者らは本発明のいかなる
理論にも束縛されることを望まないが、ＲＯＣ１−カリンとＡＰＣ１１−ＡＰＣ
２との二量体複合体は静止期および有糸分裂中にユビキチンリガーゼとして機能
すると考えられる。
【００１１】 従って、本発明は、タンパク質ＲＯＣ１をコードする単離ポリヌクレオチド配
列を提供する。ポリヌクレオチド配列を、（ａ）（本明細書中で配列番号２とし
て示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする）本明細書中で配列番
号１として示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）（例えば、ストリンジェントな条件下で）上記（ａ）のＤＮＡとハイブリ
ッド形成し、ＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチド、および （ｃ）遺伝コードの縮重により上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと異なり、上記
（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるＲＯＣ１をコードするポリヌ
クレオチドからなる群から選択することができる。
【００１２】 本発明は、さらに、特許請求の範囲に記載の任意のポリヌクレオチド配列の少
なくともフラグメントを含む発現ベクターを提供する。さらに別の態様では、ポ
リヌクレオチド配列を含む発現ベクターは宿主内に含まれる。
【００１３】 本発明は、さらに、上記で示されたポリヌクレオチドによってコードされるタ
ンパク質またはそのフラグメント（本明細書中で配列番号２として示されるタン
パク質）を提供する。このようなタンパク質を、公知の技術に従って単離および
／または精製することができる。
【００１４】 本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリ
ペプチドの産生法であって、（ａ）上記ポリペプチドの発現に適切な条件下で、
ＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記宿主細胞培養からポリペプ
チドを回収する工程とを包含する方法を提供する。
【００１５】 本発明はまた、上記のタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体）を提供する。
【００１６】 本発明は、上記のポリヌクレオチド配列に相補的で、生理学的条件下でハイブ
リッド形成するために十分な長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提
供する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡならび
にプロモーターおよびプロモーターに操作可能に連結された外因性核酸を有する
構築物（外因性核酸はこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする
ＤＮＡである）もまた本発明の態様である。
【００１７】 本発明はまた、生物サンプル中のＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチドの検
出法であって、（ａ）生物サンプルの核酸物質に配列番号１をコードするポリヌ
クレオチド配列の相補物をハイブリッド形成させて、ハイブリッド形成複合体を
形成させる工程と、（ｂ）前記ハイブリッド形成複合体を検出する工程とを包含
し、前記複合体の存在が生物サンプル中のＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチ
ドの存在と一致する方法を提供する。１つの態様では、生物サンプルの核酸物質
を、ハイブリッド形成前にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させる。
【００１８】 さらに、本発明は、タンパク質ＲＯＣ２をコードする単離ポリヌクレオチド配
列を提供する。ポリヌクレオチド配列を、（ａ）（本明細書中で配列番号４とし
て示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする）本明細書中で配列番
号３として示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）（例えば、ストリンジェントな条件下で）上記（ａ）のＤＮＡとハイブリ
ッド形成し、ＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチド、および （ｃ）遺伝コードの縮重により上記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと異なり、上記
（ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるＲＯＣ１をコードするポリヌ
クレオチドからなる群から選択することができる。
【００１９】 本発明は、さらに、特許請求の範囲に記載の任意のポリヌクレオチド配列の少
なくともフラグメントを含む発現ベクターを提供する。さらに別の態様では、ポ
リヌクレオチド配列を含む発現ベクターは宿主内に含まれる。
【００２０】 本発明は、さらに、上記で示されたポリヌクレオチドによってコードされるタ
ンパク質またはそのフラグメント（本明細書中で配列番号４として示されるタン
パク質）を提供する。このようなタンパク質を、公知の技術に従って単離および
／または精製することができる。
【００２１】 本発明はまた、配列番号４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリ
ペプチド質の産生法であって、前記方法は（ａ）前記ポリペプチドの発現に適切
な条件下で、ＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメント
を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）前記宿主細胞培養
からポリペプチドを回収する工程とを包含する方法を提供する。
【００２２】 本発明はまた、上記のタンパク質に特異的に結合する抗体（例えば、ポリクロ
ーナル抗体、モノクローナル抗体）を提供する。
【００２３】 本発明は、上記のポリヌクレオチド配列に相補的で、生理学的条件下でハイブ
リッド形成するために十分な長さを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提
供する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＤＮＡならび
にプロモーターおよびプロモーターに操作可能に連結された外因性核酸を有する
構築物（外因性核酸はこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする
ＤＮＡである）もまた本発明の態様である。
【００２４】 本発明はまた、生物サンプル中のＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドの検
出法であって、（ａ）生物サンプルの核酸物質に配列番号３をコードするポリヌ
クレオチド配列の相補物をハイブリッド形成させて、ハイブリッド形成複合体を
形成させる工程と、（ｂ）前記ハイブリッド形成複合体を検出する工程とを包含
し、前記複合体の存在が生物サンプル中のＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチ
ドの存在と一致する方法を提供する。１つの態様では、生物サンプルの核酸物質
を、ハイブリッド形成前にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【００２５】 本発明は、ＲＯＣタンパク質と候補生物活性因子が組み合わされている、ＲＯ
Ｃタンパク質に結合することができる生物活性因子（用語「因子」およびその文
法上の等価物は、「化合物」およびその文法上の等価物と交換可能に使用される
）のスクリーニング法を提供する。次いで、候補生物活性因子の結合を同定する
。ＲＯＣタンパク質の結合を干渉することができるかＲＯＣタンパク質の活性を
調整することができる生物活性因子のスクリーニング法はまた、本発明の態様で
ある。このようなスクリーニング法は、薬理学的（薬学的）活性を有する化合物
を同定することができる。このような薬理学的に活性な化合物を含む薬学的処方
物およびその投与法は、本発明の別の態様である。本発明のさらに別の態様は、
被験体または宿主における予防または治療用の薬物製造用の本明細書中に記載の
方法によって同定される薬理学的に活性な化合物の使用である。
【００２６】 本発明の上記および他の目的ならびに態様を、以下に詳細に説明する。
【００２７】 （発明の詳細な説明） 本発明を、添付の図面を参照して以下により完全に説明し、本発明の好ましい
実施形態を示す。しかし、本発明を異なる形態で実施することができ、本明細書
中に記載の実施形態に制限されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの
実施形態を行った結果、この開示が十分かつ完全であり、当業者に本発明の範囲
が十分に伝授される。
【００２８】 別で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語
は、本発明分野に属する当業者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。
本明細書中に記載の全ての刊行物、特許出願書類、特許書類、および他の引例は
、その全体が本明細書中で本明細書の記載の一部として援用される。
【００２９】 本明細書中に開示のアミノ酸配列左から右にアミノ末端またはカルボキシ末端
の方向で示す。アミノ基およびカルボキシ基は配列中に存在しない。ヌクレオチ
ド配列は、本明細書中では一本鎖のみを５’→３’方向で左から右に示す。ヌク
レオチドおよびアミノ酸は、本明細書中では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委
員会の推奨様式、すなわち連邦法施行規則第３７巻１．８２２章および確立され
た用途に従った（アミノ酸について）３文字表記で示す。例えば、Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｎｕａｌ、９９〜１０２（１９９０年１１月）（合衆
国特許商標庁）を参照のこと。
【００３０】 本明細書中で使用される、ＲＯＣ１およびＲＯＣ２（本明細書中で「ＲＯＣタ
ンパク質」という）は、天然、合成、半合成、または組換えのいずれか任意の起
源由来の任意の種（特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、および好ましく
はヒトを含む哺乳動物）から得た実質的に精製されたＲＯＣ１およびＲＯＣ２の
アミノ酸配列をいう。
【００３１】 本明細書中で使用される、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、ＲＯ
Ｃ１およびＲＯＣ２をコードする遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、核酸
配列中の少なくとも１つの変異に起因し、それによりｍＲＮＡまたはポリペプチ
ドが変化し得るが、その構造または機能が変化してもしなくても良い。任意の所
与の天然または組換え遺伝子は、対立遺伝子形態を全く有さないか、１つ有する
か、多数有し得る。対立遺伝子を生じる一般的な変異による変化は、一般に、ヌ
クレオチドの天然の欠失、付加、または置換による。これらの変化の各型は、所
与の配列で単独または他と組み合わせて、１回または複数回起こり得る。
【００３２】 本明細書中での「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチ
ド、およびペプチドを含む少なくとも２つの共有結合アミノ酸を意味する。タン
パク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣
物構造で構成され得る。従って、本明細書中で使用される、「アミノ酸」または
「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味
する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノルエロイシンは、
本発明の目的のアミノ酸と考える。「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキ
シプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置の
いずれかで存在し得る。好ましい実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ配
置で存在する。天然に存在しない側鎖を使用する場合、例えばインビボでの分解
を防止または遅延させるために非アミノ酸置換基を使用することができる。化学
封鎖基または他の化学的置換基を付加することもできる。
【００３３】 本明細書中で使用される、「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、
ポリペプチド、またはタンパク質配列およびそのフラグメント、および天然に存
在する分子または合成分子をいう。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２のフラグメ
ントは、好ましくは約５〜約１５アミノ酸長であり、ＲＯＣ１および／またはＲ
ＯＣ２の生物活性または免疫学的活性を保持する。「アミノ酸配列」を天然に存
在するタンパク質分子アミノ酸配列、および類似の用語をいうために本明細書中
で引用する場合、アミノ酸配列を引用したタンパク質分子に関連する完全で天然
のアミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００３４】 本明細書中で使用される、「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生を言
いい、一般に、当該分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて
行う（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．およびＧ．Ｓ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、１
９９５、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．
Ｙ．）。
【００３５】 本明細書中で使用される、用語「抗体」は、エピトープ決定基に結合すること
ができるインタクトな分子ならびにそのフラグメント（Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２、
およびＦｃなど）をいう。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２ポリペプチドに結合
する抗体を、免疫原として目的の小さなペプチドを含むポリペプチドまたはフラ
グメントを使用して調製することができる。動物の免疫化に使用したポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳または化学合成に由来し、所望ならば
キャリアタンパク質に結合させることができる。ペプチドに化学結合した一般に
使用されるキャリアには、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリン、キーホ
ールリンペットヘモシアニンが含まれる。次いで、結合ペプチドを使用して動物
（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化する。
【００３６】 本明細書中で使用される、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子
のフラグメント（すなわち、エピトープ）をいう。タンパク質またはタンパク質
のフラグメントを使用して宿主動物を免疫化した場合、タンパク質の多数の領域
は、所与の領域またはタンパク質上の三次元構造に特異的に結合する抗体の産生
を含み得る。これらの領域または構造を、抗原決定基という。抗原決定基は、抗
体との結合についてインタクトな抗原（すなわち、免疫応答の惹起に使用される
免疫原）と競合し得る。
【００３７】 本明細書中で使用される、用語「アンチセンス」は、特異的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む任意の組成物をいう。用語「アンチセ
ンス鎖」は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖に関して使用される。アンチセンス
分子にはペプチド核酸が含まれ、合成または転写を含む任意の方法で産生させる
ことができる。一旦細胞に移入されると、相補的ヌクレオチドを細胞によって産
生された天然の配列と組み合わせて二重鎖を形成させて、転写または翻訳をブロ
ックする。表示「負」は、時折アンチセンス鎖に関して使用し、「正」は時折セ
ンス鎖に関して使用する。
【００３８】 本明細書中で使用される、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対合につ
いて許容塩および温度条件下でのポリヌクレオチドの天然の結合をいう。例えば
、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分
子間の相補性は「部分的」であり、核酸のいくつかのみが結合するか、一本鎖分
子間に全相補性が存在する場合競合することができる。核酸鎖の間の相補性の程
度は、核酸鎖の間のハイブリッド形成の効率および強度に優位な効果を有する。
【００３９】 本明細書中で使用される「欠失」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列中の変
化をいい、その変化により１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドが
欠乏する。
【００４０】 本明細書中で使用される、用語「誘導体」は、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ
２をコードするか相補的な核酸またはコードされたＲＯＣ１および／またはＲＯ
Ｃ２の化学修飾をいう。このような修飾には、例えば、水素のアルキル、アシル
、またはアミノ基への置換が含まれる。核酸誘導体は、天然の分子の生物学的ま
たは免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは
、グリコシル化、ペグ化、または誘導されたポリペプチドの生物学的または免疫
学的機能を保持する類似の工程によって修飾されたものである。
【００４１】 本明細書中で使用される、用語「相同性」は、相補性の程度をいう。部分的相
同性または完全な相補性（すなわち、同一性）であってもよい。標的核酸とのハ
イブリッド形成由来の同一配列を少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な
配列は、機能的用語「実質的に相同性」を使用していう。標的配列に完全に相補
的な配列のハイブリッド形成の阻害を、低ストリンジェンシーな条件下でのハイ
ブリッド形成アッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリ
ッド形成など）を使用して試験することができる。実質的に相補的な配列または
ハイブリッド形成プローブは、低ストリンジェンシーの条件下で標的配列に完全
に相同的な配列と競合するか阻害する。これは、低ストリンジェンシー条件は、
非特異的結合が許容されるというほどではないが、低ストリンジェンシー条件に
は、２つの配列の互いの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であること
が必要である。非特異的結合の有無を、ほんの一部分の相補性を欠く（例えば、
約３０％未満の同一性）第の標的配列の使用によって試験することができる。非
特異的結合の非存在下では、プローブは第２の非特異的標的配列とハイブリッド
形成しない。
【００４２】 本明細書中で使用することができる、用語「ハイブリッド形成」は、核酸の鎖
は塩基対合による相補鎖と結合する任意の工程をいう。本明細書中で使用される
、用語「ハイブリッド形成複合体」は、相補的ＧおよびＣ塩基ならびに相補的Ａ
およびＴ塩基との間の水素結合の形成による２つの核酸配列との間に形成された
複合体をいい、これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によってさらに
安定化させることができる。２つの相補的核酸は、逆平行配置で水素結合されて
いる。ハイブリッド形成複合体を溶液中（例えば、ＣoｔまたはＲoｔ分析）また
は溶液中に存在するある核酸配列と固体支持体（例えば、紙、メンブレン、濾紙
、チップ、ピン、もしくははガラススライド、または細胞またはその核酸が固定
されている任意の他の適切な基質）に固定した別の核酸配列との間で形成するこ
とができる。
【００４３】 本明細書中で使用される、「挿入」または「付加」は、天然に存在する分子と
比較して１つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加を生じるアミ
ノ酸またはヌクレオチド配列の変化をいう。
【００４４】 本明細書中の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」またはその文法上の等価
物は、少なくとも２つの互いに共有結合したヌクレオチドを意味する。本発明の
核酸は、一般に、いくつかの例ではあるが以下に概説するようにリン酸ジエステ
ル結合を含み、例えば、以下を含む代替バックボーンを有し得る核酸アナログを
含む：ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９（
１０）、１９２５、１９９３およびその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３５、３８００、１９７０；Ｓｐｒｉｎｚｌ，ら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８１、５７９、１９７７；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ら、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４、３４８７、１９８６；Ｓａｗａｉ，ら、
Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８０５、１９８４、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ら、Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０、４４７０、１９８８；およびＰａｕｗｅｌｓ，
ら、Ｃｈｅｍｉｃａ．Ｓｃｒｉｐｔａ．、２６、１４１、１９８６）、ホスホロ
チオエート（Ｍａｇ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、１４
３７、１９９１および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエー
ト（Ｂｒｉｕ，ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１、２３２１、１９８
９）、Ｏ−メチルホスホラミダイド（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、「オリゴヌクレオチド
およびアナログ：実際的アプローチ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、およびペプチド核酸バックボーンおよび結合（Ｅｇ
ｈｏｌｍ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４、１８９５、１９９２；Ｍｅ
ｉｅｒ，ら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３１、１００８、１９９２
；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５、５６６、１９９３；Ｃａｒｌｓｓｏ
ｎ，ら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０、２０７、１９９６（その全体が本明細書の記載
の一部として援用される）を参照のこと）。他のアナログ核酸には、以下を有す
るものが含まれる：正電荷のバックボーン（Ｄｅｎｐｃｙ，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、６０９７、１９９５、非イオン性バッ
クボーン（米国特許第５，３８６，０２３号；同第５，６３７，６８４号；同第
５，６０２，２４０号；同第５，２１６，１４１号；および同第４，４６９，８
６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉ，ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．
Ｅｎｇｌｉｓｈ、３０、４２３、１９９１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ら、Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０、４４７０、１９８８；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ら
、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、１３、１５９７、１９９４；
ＡＳＣシンポジウムシリーズ５８０、第２および第３章、「アンチセンス研究に
おける炭水化物修飾」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ およびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ
編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ，ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅ
ｍ．Ｌｅｔｔ．、４、３９５、１９９４、Ｊｅｆｆｓ，らＪ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ＮＭＲ、３４、１７、１９９４、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
．、３７、７４３、１９９６）、および非リボースバックボーン（米国特許第５
，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号ならびにＡＳＣシンポジウ
ムシリーズ５８０、第６および第７章、「アンチセンス研究における炭水化物修
飾」、Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ およびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編を含む）。１つ
または複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義の範囲内に含まれる（Ｊ
ｅｎｋｉｎｓ，ら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、１９９５、１６９〜１７６を
参照のこと）。いくつかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ．＆Ｅ Ｎｅｗｓ、
Ｊｕｎｅ ２、１９９７、３５に記載されている。標識などのさらなる部分の添
加を容易にするか、このような分子の生理学的環境下で安定性および半減期を増
加させるためにリボース−リン酸バックボーンのこれらの修飾を行うことができ
る。さらに、天然に存在する核酸とアナログとの混合物を作製することができる
。あるいは、異なる核酸アナログの混合物および天然に存在する核酸とアナログ
との混合物を作製することができる。核酸は一本鎖または二本鎖であってよく、
特に、二本鎖または一本鎖配列の両方の一部を含む。核酸は、デオキシリボ核酸
またはリボ核酸のいかなる組み合わせをも含み、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよびｃ
ＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはハイブリッドで良く、ウラシル、アデニン、チミン、
シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシ
ン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせであり得る。
【００４５】 タンパク質について上記に一般的に記載のように、核酸候補生物活性因子は、
天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏った」ランダム核酸であり得る
。例えば、原核または真核ゲノムの消化物を、タンパク質について上記で概説し
たように使用することができる。
【００４６】 本明細書中で使用される、「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチ
ド、またはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントならびに一本鎖または二
本鎖でセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡ
またはＲＮＡをいう。「フラグメント」は、６０個を超えるヌクレオチド長であ
る核酸配列であり、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長または少な
くとも１０００ヌクレオチド長、および少なくとも１０，０００ヌクレオチド長
であるフラグメントを含む。
【００４７】 用語「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅またはハイブリッド形成アッセイ
またはマイクロアレイに使用することができる少なくとも約６〜約６０ヌクレオ
チド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜２５ヌク
レオチドの核酸配列をいう。本明細書中で使用される、オリゴヌクレオチドは、
当該分野で一般的に定義される用語「アンプリマー」、「プライマー」、「オリ
ゴマー」、および「プローブ」と実質的に等価である。
【００４８】 本明細書中で使用される、用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用され
る。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする核酸もしくはそのフラグメン
トを含むと疑われる生物サンプルまたＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２自体は、
体液、細胞抽出物、染色体、オルガネラ、または細胞から単離した膜、細胞、ゲ
ノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡ（溶液中または固体支持体、組織、組織プ
リントなどに結合している）を含み得る。本明細書中で使用される、用語「スト
リンジェントな条件」または「ストリンジェンシー」は、核酸、塩、および温度
によって定義されるハイブリッド条件をいう。これらの条件は、当該分野で周知
であり、同一または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更
することができる。低いまたは高いストリンジェンシーのいずれかを含む多数の
等価な条件は以下の要因に依存する：配列の長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、
塩基組成物）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、環境（溶液中また
は固体支持体に固定されている）、塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムア
ミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリコール）、および反応
温度（約５℃〜約２０℃から２５℃までのプローブの融解温度までの範囲内）。
上記の条件と異なるが等価である低いまたは高いストリンジェンシー条件を得る
ために、１つまたは複数の要因を変更することができる。
【００４９】 本明細書中で使用される、「置換」は、１つまたは複数のアミノ酸またはヌク
レオチドの異なるアミノ酸またはヌクレオチドへの置換をいう。
【００５０】 本明細書中で使用される、「形質転換」は、外因性ＤＮＡをレシピエント細胞
に移入するかレシピエント細胞を変化させる工程を説明する。これは、天然条件
または当該分野で周知の種々の方法を用いた人工的条件下で起こり得る。形質転
換は、原核または真核宿主細胞への外来核酸配列の任意の公知の挿入法に依存し
得る。この方法を、形質転換される宿主細胞の型に基づいて選択され、この方法
には、ウイルス感染、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション
、および微粒子銃が含まれるが、これらに限定されない。このような「形質転換
」細胞には、挿入されたＤＮＡが自発性複製プラスミドまたは宿主の染色体の一
部として複製することができる安定に形質転換された細胞が含まれる。これらに
は、制限時間中に挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡが一過性発現する細胞も含まれ
る。
【００５１】 本発明のポリヌクレオチドには、本明細書中に開示のタンパク質に相同で本質
的に同一の生物学的性質を有するタンパク質をコードするもの、特に、本明細書
中で配列番号１として開示され、且つ本明細書中で配列番号２として占めされた
タンパク質ＲＯＣ１をコードするＤＮＡならびに本明細書中で配列番号３として
開示され、且つ本明細書中で配列番号４として占めされたタンパク質ＲＯＣ１を
コードするＤＮＡが含まれる。この定義は、その天然の対立遺伝子配列を含むこ
とが意図される。したがって、本発明の単離ＤＮＡまたはクローン化遺伝子は、
マウス、ラット、ネコ、ブタ、およびヒトを含む任意の起源であり得るが、哺乳
動物起源が好ましい。したがって、本明細書中で配列番号１として開示されたＤ
ＮＡ（または下記のハイブリッド形成プローブとして作用するそのフラグメント
もしくは誘導体）とハイブリッド形成し、且つ本発明のタンパク質（例えば、配
列番号２のタンパク質）の発現をコードするポリヌクレオチドならびに本明細書
中で配列番号３として開示されたＤＮＡ（または下記のハイブリッド形成プロー
ブとして作用するそのフラグメントもしくは誘導体）とハイブリッド形成し、且
つ本発明のタンパク質（例えば、配列番号４のタンパク質）の発現をコードする
ポリヌクレオチドもまた本発明の態様である。他のポリヌクレオチドが本明細書
中に開示の配列番号１または配列番号３とハイブリッド形成する本発明のタンパ
ク質の発現をコードする条件を、公知の技術に従って同定することができる。例
えば、このような配列のハイブリッド形成を、標準的なハイブリッド形成アッセ
イにおける本明細書中に開示の配列番号１または配列番号３のＤＮＡの低ストリ
ンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、またはさらにストリンジェントな
条件下（例えば、それぞれ、３７℃での５×デンハート液を含む３５〜４０％ホ
ルムアミド、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥの洗浄ストリンジェンシーに
代表される条件；４２℃での５×デンハート液を含む４０〜４５％ホルムアミド
、０．５％ＳＤＳ、および１×ＳＳＰＥの洗浄ストリンジェンシーに代表される
条件；４２℃での５×デンハート液を含む５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ
、および１×ＳＳＰＥの洗浄ストリンジェンシーに代表される条件）で行うこと
ができる。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。一般に、
本発明のタンパク質をコードし、且つ本明細書中に開示の配列番号１または配列
番号３のＤＮＡとハイブリッド形成する配列は、配列番号１または配列番号３と
それぞれ少なくとも７５％相同、８５％相同、さらに９５％またはそれ以上相同
である。さらに、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは配列
番号１もしくは配列番号３とハイブリッド形成するが、遺伝コードの縮重のため
に配列番号１もしくは配列番号３とコドン配列が異なるポリヌクレオチドもまた
本発明の態様である。異なる核酸配列が同一のタンパク質またはペプチドをコー
ドする遺伝コードの縮重は、文献中で周知である。例えば、Ｔｏｏｌｅらに付与
された米国特許第４，７５７，００６号の第２段落、表１を参照のこと。
【００５２】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードするヌクレオチド配列およびその変
異体は適切な選択ストリンジェンシー条件下で天然に存在するＲＯＣ１および／
またはＲＯＣ２のヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができることが
好ましいにもかかわらず、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードするヌクレ
オチド配列または実質的に異なるコドンを保有する誘導体を産生させることが有
利であり得る。特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って特定の原核
または真核宿主で起こるペプチド発現速度を増加させるようにコドンを選択する
ことができる。コードされたアミノ酸配列を変化させることなくＲＯＣ１および
／またはＲＯＣ２をコードするヌクレオチド配列およびその誘導体実質的に変化
させる他の理由には、天然に存在する配列から産生した転写物よりも望ましい性
質（より長い半減期など）を有するＲＮＡ転写物の産生が含まれる。
【００５３】 本発明の１つの実施形態では、ＲＯＣ核酸（ＲＯＣタンパク質またはそのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドと定義する）またはＲＯＣタンパク質（
上記のように定義する）を、本明細書中に記載の配列との実質的な核酸および／
またはアミノ酸配列同一性または類似性によって最初に同定する。好ましい実施
形態では、ＲＯＣ核酸またはＲＯＣタンパク質は、本明細書中の以下に記載の配
列に対する配列同一性または類似性および本明細書中にさらに記載の１つまたは
複数のＲＯＣタンパク質生物活性を有する。このような配列同一性または類似性
は、全核酸またはアミノ酸配列に基づき得る。
【００５４】 当該分野で公知のように、多数の異なるプログラムを使用してタンパク質（ま
たは以下に記載の核酸）が既知の配列に同一または類似の配列を有するかどうか
を同定することができる。配列同一性および／または類似性を、当該分野で公知
の標準的な技術（Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ
．，２、４８２、１９８１の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８、４４３、１９７０の配列同一
性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、２４４４、１９８８の類似性検索法
、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉ
ｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ，およびＴＦＡＳＴＡ）、
好ましくはデフォルト値を使用したＤｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．、１２、３８７〜３９５、１９８４に記載のＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プロ
グラム、または適合性検査が含まれるが、これらに限定されない）を用いて同定
する。好ましくは、同一性％を、以下のパラメータに基づいたＦａｓｔＤＢによ
って計算する：ミスマッチペナルティー：１、ギャップペナルティー：１、ギャ
ップサイズペナルティー：０．３３、結合ペナルティ：３０（「現在の配列比較
および分析法」、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ および
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、選択法および適用、１２７〜１４９、１９８８、Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００５５】 有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、向上した
対合アルゴリズムを使用して関連配列群から複数の配列アラインメントを作製す
る。これはまた、アラインメントの作製に使用するクラスター形成関係を示す系
統樹をプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、３５、３５１〜３６０、１９８７の向上したア
ラインメント法（この方法はＨｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５、
１５１〜１５３、１９８９に記載の方法と類似する）の単純化を使用する。有用
なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトギャップウェイト：３．００、デフォ
ルトギャップレングスウェイト：０．１０、末端ギャップの加重を含む。
【００５６】 有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．、２１５、４０３〜４１０、１９９０およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５８７３〜５７８７、１９９３に記載
のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ、２６６、４６０
〜４８０、１９９６、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａ
ｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムで
ある。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメータを使用し、そのほと
んどはデフォルト値の設定である。調整可能なパラメータを、以下の値に設定す
る：重複スパン＝１、重複フラクション＝０．１２５、行列数（Ｔ）＝１１。Ｈ
ＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは変数であり、それ自体が特定の配列と
の比較および目的の配列が検索される特定のデータベースの比較に依存したプロ
グラムによって確立されているが、値は感度を高めるように調整することができ
る。
【００５７】 さらに有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、２５、３３８９〜３４０２に記載のギャップＢＬＡＳＴである
。ギャップＢＬＡＳＴは、以下のＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用する：閾 値 Ｔパラメータ：９；非ギャップ伸長を誘発するための２ヒット法；ｋコストの
負荷ギャップ長：１０＋ｋ；Ｘu：１６；およびデータベース検索段階ではＸg：
４０およびアルゴリズム出力段階ではＸg：６７。ギャップアルゴリズムは、約
２２ビットに対応するスコアによって開始される。
【００５８】 アミノ酸配列同一性％値を、同一残基の適合数を整列させた領域中の「より長
い」配列の全残基数で割ることによって同定する。「より長い」配列は、整列さ
せた領域中の最も現実的な残基を有する配列である（アラインメントスコアを最
大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって挿入されたギャップは無視する）
。
【００５９】 類似の様式では、本明細書中で定義したポリペプチドのコード配列に関する「
核酸配列類同一性％」を、細胞周期タンパク質のコード配列中のヌクレオチド残
基の百分率と定義する。好ましい方法では、デフォルトパラメータを設定した（
重複スパンおよび重複フラクションをそれぞれ１および０．１２５に設定した）
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【００６０】 アラインメントには、整列させるべき配列中へのギャップの移入を含み得る。
さらに、図中の配列によってコードされるタンパク質より多いまたは少ないアミ
ノ酸を含む配列について、１つの実施形態では、配列同一性％を、全アミノ酸数
と比較した同一のアミノ酸数に基づいて同定することが理解される。したがって
、例えば、下記のように、１つの実施形態では、図に示した配列よりも短い配列
の配列同一性を、より短い配列中のアミノ酸配列数を使用して同定する。同一性
％の計算では、相対重量を配列の変形形態（挿入、欠失、置換など）の種々の徴
候に割り当てない。
【００６１】 １つの実施形態では、配列類似性計算について以下に記載のように加重スケー
ルまたはパラメータを必要としないように、同一性のみを正（＋１）として記録
し、ギャップを含む配列の変形形態の全ての形態を「０」と割り当てる。配列同
一性％を、例えば、同一残基の適合数を整列させた領域中の「より短い」配列の
全残基数で割り、１００を掛けることによって計算することができる。「より長
い」配列は、整列させた領域中の最も現実的な残基を有する配列である。
【００６２】 本発明はまた、完全に合成化学によるＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコー
ドするＤＮＡ配列またはそのフラグメントの産生を含む。産生後、合成配列を、
当該分野で周知の試薬を用いて多数の利用可能な発現ベクターおよび細胞系に挿
入することができる。さらに、合成化学を使用して、ＲＯＣ１および／またはＲ
ＯＣ２をコードする配列またはその任意のフラグメントをコードする配列に変異
を移入することができる。
【００６３】 本明細書中で配列番号１または配列番号３として開示したヌクレオチド配列の
知識を使用して、本発明のタンパク質の増幅または過剰発現の存在を同定するた
めの本発明のＤＮＡまたはｍＲＮＡに特異的に結合するハイブリッド形成プロー
ブを作製することができる。
【００６４】 遺伝子操作によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換宿主
細胞、およびタンパク質フラグメントの産生は周知である。例えば、Ｂｅｌｌら
に付与された米国特許第４，７６１，３７１号、第６段落３行目〜６５行目；Ｃ
ｌａｒｋらに付与された米国特許第４，８７７，７２９号、第４段落３８行目〜
第７段落６行目；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇに付与された米国特許第４，９１２，０３
８号、第３段落２６行目〜題１４段落１２行目；Ｗａｌｌｎｅｒに付与された米
国特許第４，８７９，２２４号、第６段落８行目〜第８段落５９行目（出願人は
、特に、全ての特許引例の開示が本明細書中で本明細書の記載の一部として援用
されることを意図する）を参照のこと。
【００６５】 当該分野で周知で一般に利用可能なＤＮＡ配列決定法を使用して、本発明の任
意の実施形態を実施することができる。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（商品名）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（
Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、
Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ）、またはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、Ｍｄ．）から市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｓｙｓｔｅｍなどに見出される酵素などのポリメラーゼと校正エキソヌク
レアーゼとの組み合わせなどの酵素を使用することができる。好ましくは、この
工程を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
、Ｒｅｎｏ、Ｎｅｖ．）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐ
ＴＣ２００、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．）、お
よびＡＢＩ Ｃａｔａｌｙｓｔならびに３７３および３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）などの機械を用いて自動化する。
【００６６】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチ
ド配列の利用ならびにプロモーターおよび調節エレメントなどの上流配列を検出
するため当該分野で公知の種々の方法の使用によって伸長することができる。例
えば、使用することができる１つの方法である「制限部位」ＰＣＲは、普遍プラ
イマーを使用して既知の遺伝子座に隣接する未知の配列を検索する（Ｓａｒｋａ
ｒ，Ｇ．、１９９３、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．、２、３１８〜
３２２）。特に、最初にリンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特
異的なプライマーの存在下でゲノムＤＮＡを増幅させた。次いで、増幅配列を、
同一のリンカープライマーおよび第１の配列の内部の別の特異的プライマーを用
いて第２ラウンドのＰＣＲに供する。各ラウンドのＰＣＲ産物を、適切なＲＮＡ
ポリメラーゼで転写して、逆転写酵素を使用して配列決定する。
【００６７】 ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物である。本明細書中では、本発明のタン
パク質をコードするＤＮＡを増幅するか本発明のタンパク質を発現するために、
ベクターを使用する。発現ベクターは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ
配列が適切な宿主中の本発明のタンパク質を発現することができる適切な調節配
列に操作可能に連結されている複製可能なＤＮＡ構築物である。このような調節
配列の必要性は、選択された宿主および選択した形質転換法に依存して変化する
。一般に、調節配列には、転写プロモーター、任意選択的な調節転写に配するオ
ペレーター配列、安定なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、ならび
に転写および翻訳の終止を調節する配列が含まれる。増幅ベクターは発現調節ド
メインに必要ない。必要とされるものは宿主中での複製能力であり、通常これは
複製起点および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子によって付与さ
れる。
【００６８】 ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロ
ウイルス）、ファージ、レトロウイルス、および組み込み可能なＤＮＡフラグメ
ント（すなわち、組換えによって宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）を
含む。ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製および機能するか、いくつかの
場合、ゲノム自体に組み込むことができる。発現ベクターは、発現されるべき遺
伝子に操作可能に連結され、且つ宿主生物中で操作可能なプロモーターおよびＲ
ＮＡ結合部位を含むべきである。
【００６９】 ＤＮＡ領域は、機能的に互いに関連する場合、操作可能に連結されているか操
作可能に会合している。例えば、配列の転写を調節する場合にはプロモーターを
コード配列に操作可能に連結し、翻訳させるために存在する場合にはリボゾーム
配列をコード配列に操作可能に連結する。一般に、操作可能に連結されたとは、
リーダー配列に隣接するか、読み枠に隣接することを意味する。
【００７０】 形質転換宿主細胞は、タンパク質を発現する必要の無い本発明のタンパク質を
コードするＤＮＡを含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞
である。
【００７１】 適切な宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞が含まれ
る。原核生物宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物（例えば、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢａｃｉｌｌｉ）が含まれ
る。高等真核生物細胞には、下記の哺乳動物起源の確立された細胞株が含まれる
。宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）、Ｅ
．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。広範な種々の原核生物および
細菌ベクターが利用可能である。典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉはｐＢＲ３２２を使
用して形質転換する。Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２、９５、１９７７を参照
のこと。組換え微生物発現ベクターに最も一般的に使用されるプロモーターには
、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａ
ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５、６１５、１９７８およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎ
ａｔｕｒｅ、２８１、５４４、１９７９；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ
ー系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８、４０５
７、１９８０および欧州特許出願番号３６，７７６）；ｔａｃプロモーター（Ｈ
．Ｄｅ Ｂｏｅｒら）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０
、２１、１９８３が含まれる。プロモーターおよびシャイン−ダルカルノ配列（
原核生物宿主発現用）を、本発明のＤＮＡに操作可能に連結させる。すなわち、
これらをＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するために置く。
【００７２】 発現ベクターは、宿主生物によって認識されるプロモーターを含むべきである
。一般に、これは、意図される宿主から得たプロモーターを意味する。組換え微
生物発現ベクターに最も一般的に使用されるプロモーターには、βラクタマーゼ
（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、２７５、６１５、１９７８およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２８
１、５４４、１９７９）；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８、４０５７、１９８０お
よび欧州特許出願番号３６，７７６）；ｔａｃプロモーター（Ｈ．Ｄｅ Ｂｏｅ
ｒら）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、２１、１９８
３が含まれる。これらを一般的に使用する一方で、他の微生物プロモーターが適
切である。多数のヌクレオチド配列に関する詳細は公表されており（Ｓｉｅｂｅ
ｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ、２０、２６９、１９８０）、当業者はプラスミドまた
はウイルスベクター中でタンパク質をコードするＤＮＡにヌクレオチドを操作可
能に連結することができる。プロモーターおよびシャイン−ダルカルノ配列（原
核生物宿主用）を、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに操作可能に連結する
。すなわち、これらをＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するために
置く。
【００７３】 酵母培養物などの真核微生物を適切なタンパク質コードベクターで形質転換す
ることができる。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照のこと。一般
に、下等真核宿主微生物のなかでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅが最も一般的に使用されているが、多数の株が利用可能である。酵母ベク
ターは、２ミクロンの酵母プラスミド由来の複製起点、非自発的複製配列（ＡＲ
Ｓ）、プロモーター、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化お
よび転写終結配列、ならびに選択遺伝子を含み得る。プラスミドの例は、ＹＲｐ
７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２、３９、１９７９；
Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７、１４１、１９７９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら
、Ｇｅｎｅ、１０、１５７、１９８０）。このプラスミドは、トリプトファン中
での成長能力を欠く酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４
−１）用の選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含む（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、８５、１２、１９７７）。次いで、酵母宿主ゲノム中のｔｒｐ１損
傷の存在により、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換検出用の有
効な環境が得られる。
【００７４】 酵母ベクター中での適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホ
スホ−グリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
、２５５、２０７３、１９８０）または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ
．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．、７、１４９、１９６８およびＨｏｌｌａｎｄら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７、４９００、１９７８）（エノラーゼ、グリセル
アルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボ
キシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、３
−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなど）のプロモ
ーターが含まれる。酵母発現で使用される適切なベクターおよびプロモーターは
、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、欧州特許公報７３，６５７にさらに記載されている
。
【００７５】 多細胞生物由来の細胞培養物は、組換えタンパク質合成用の望ましい宿主であ
る。主に、脊椎動物または無脊椎動物（昆虫細胞を含む）由来の任意の高等真核
生物細胞培養物を使用可能である。このような細胞の細胞培養における増幅は、
日常的手順となっている（「組織培養」、Ａａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｒｕ
ｓｅ およびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、１９７３を参照のこと）。有用な宿主細胞
株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞株、および ＷＩ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、およびＭＤＣＫ細
胞株である。このような細胞の通常の発現ベクターは、（必要な場合）複製起点
、発現される遺伝子から上流に存在し、リボゾーム結合部位を含むプロモーター
、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡを使用する場合）、ポリ
アデニル化部位、および転写終結配列を含む。
【００７６】 脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクター中の転写および翻訳調節配
列は、しばしばウイルス供給源から得られる。例えば、一般的に使用されるプロ
モーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、およびシミアンウイルス４０（Ｓ
Ｖ４０）由来である。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照のこと。
初期および後期プロモーターは共にウイルスからＳＶ４０ウイルス複製起点も含
むフラグメントとして容易に得られるので有用である。Ｆｉｅｒｓ ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２７３、１１３、１９７８を参照のこと。さらに、このような調節配列
は選択した宿主細胞に適合可能である場合、タンパク質プロモーター、調節配列
および／またはシグナル配列を使用することもできる。
【００７７】 外因性起点を含むためのベクターの構築によって複製起点を得ることができ、
これはＳＶ４０または他のウイルス供給源（例えば、ポリオーマ、アデノウイル
ス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）由来であるか、宿主細胞染色体複製機構によって得
ることができる。ベクターを宿主染色体に組み込まれた場合、後者で十分であり
得る。
【００７８】 Ｓｍｉｔｈらに付与された米国特許第４，７４５，０５１号および同第４，８
７９，２３６号に記載のように、昆虫細胞などの宿主細胞（例えば、培養したＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞）およびバキュロウイルス発現
ベクターなどの発現ベクター（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ ＭＮＰＶ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ＭＮＰＶ、Ｒａｃｈｉ
ｐｌｕｓｉａ ｏｕ ＭＮＰＶ、またはＧａｌｌｅｒｉａ ｏｕ ＭＮＰＶ由来
のベクター）を使用して、本発明の実行に有用なタンパク質を作製することがで
きる。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリヘドリン転写開始シグナ
ルからＡＴＧ開始部位までの範囲の位置で且つバキュロウイルスポリヘドリンプ
ロモーターの転写調節下で、ポリヘドリン遺伝子に挿入された発現されるべき遺
伝子を含むバキュロイウイルスゲノムを含む。
【００７９】 哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系を利用することができ
る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、ＲＯＣ１および／また
はＲＯＣ２をコードする配列を、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列か
らなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートすることができる。ウイル
スゲノムの必須でないＥ１またはＥ３領域中の挿入を使用して、感染宿主細胞中
でＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２を発現することができる生きたウイルスを得
ることができる（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．、１９８４、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、３６５５〜３６５９）。さらに、ラ
ウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、
哺乳動物宿主細胞中での発現を増加させることができる。
【００８０】 ウイルス複製起点を含むベクターの使用よりも選択マーカーおよびキメラタン
パク質ＤＮＡを用いた同時形質転換法によって哺乳動物細胞を形質転換すること
ができる。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）
またはチミジンキナーゼである。米国特許第４，３９９，２１６号を参照のこと
。このようなマーカーは、形質転換細胞（すなわち、外因性ＤＮＡの取り込みに
適切な細胞）の同定が可能なタンパク質（一般に酵素）である。一般に、毒性を
示す培養培地中での生存または形質転換体によるか、細胞がマーカータンパク質
を取り込むことなく重要な栄養素を得ることができないことによって同定を行う
。
【００８１】 一般に、当業者は、本発明のペプチドのアミノ酸配列の軽度の欠失または置換
をその活性を過度の損なうことなく行うことができることを認識する。したがっ
て、このような欠失または置換を含むペプチドは、本発明のさらなる態様である
。アミノ酸の置換または置換を含むペプチドを、このような置換により配列の機
能に影響を与えることなく１つまたは複数の他のアミノ酸に置換することができ
る。このような変化を、電荷密度、疎水性／親水性、サイズ、および配置などの
物理的特徴におけるアミノ酸の間の公知の類似性によって説明することができる
ので、アミノ酸が本質的に同一の機能的性質を有する他のアミノ酸に置換される
。例えば、ＡｌａをＶａｌまたはＳｅｒに置換することができ、ＶａｌをＡｌａ
、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＩｌｅ（好ましくはＡｌａまたはＬｅｕ）に置換する
ことができ、ＬｅｕをＡｌａ、Ｖａｌ、またはＩｌｅ（好ましくはＶａｌまたは
Ｉｌｅ）に置換することができ、ＧｌｙをＰｒｏまたはＣｙｓ（好ましくはＰｒ
ｏ）に置換することができ、ＰｒｏをＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ（
好ましくはＧｌｙ、Ｃｙｓ、またはＳｅｒ）に置換することができ、ＣｙｓをＧ
ｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔ（好ましくはＰｒｏまたはＭｅｔ）に置換
することができ、ＭｅｔをＰｒｏまたはＣｙｓ（好ましくはＣｙｓ）に置換する
ことができ、ＨｉｓをＰｈｅまたはＧｌｎ（好ましくはＰｈｅ）に置換すること
ができ、ＰｈｅをＨｉｓ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ（好ましくはＨｉｓまたはＴｙ
ｒ）に置換することができ、ＴｙｒをＨｉｓ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ（好ましく
はＰｈｅまたはＴｒｐ）に置換することができ、ＴｒｐをＰｈｅまたはＴｙｒ（
好ましくはＴｙｒ）に置換することができ、ＡｓｎをＧｌｎまたはＳｅｒ（好ま
しくはＧｌｎ）に置換することができ、ｋＧｌｎをＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ
ｓｎ、またはＳｅｒ（好ましくはＡｓｎまたはＳｅｒ）に置換することができ、
ＳｅｒをＧｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、またはＡｌａに置換することができ
、ＴｈｒをＧｌｎまたはＳｅｒ（好ましくはＳｅｒ）に置換することができ、Ｌ
ｙｓをＧｌｎまたはＡｒｇ置換することができ、ＡｒｇをＬｙｓ、Ａｓｐ、また
はＧｌｕ（好ましくはＬｙｓまたはＡｓｐ）に置換することができ、ＡｓｐをＬ
ｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｕ（好ましくはＡｒｇまたはＧｌｕ）に置換すること
ができ、ＧｌｕをＡｒｇまたはＡｓｐ（好ましくはＡｓｐ）に置換することがで
きる。一旦作製されると、変化を日常的にスクリーニングして、酵素の機能に対
する効果を同定することができる。
【００８２】 上記のように、本発明は、精製および単離ＲＯＣ１およびＲＯＣ２タンパク質
（哺乳動物（またはより好ましくはヒト）ＲＯＣ１およびＲＯＣ２など）を提供
する。このようなタンパク質を、公知の技術に従ってそれを発現する宿主細胞か
ら精製するか、合成によって製造することができる。
【００８３】 本発明の核酸、それを含む構築物、およびコードタンパク質を発現する宿主細
胞は、本発明のタンパク質の作製に有用である。
【００８４】 本発明のタンパク質は、本明細書中に記載される抗体を作製するための免疫原
として有用であり、これらの抗体およびタンパク質は「特異的結合ペア」を提供
する。そのような特異的結合ペアは、この分野において知られているように、様
々な免疫アッセイおよび精製技術の構成要素として有用である。
【００８５】 本発明のタンパク質は、本明細書中に開示されているようにアミノ酸配列が知
られており、従って構造が未知であるタンパク質の分子量を決定する際の分子量
マーカーとして有用である。
【００８６】 特異的な開始シグナルもまた、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする
配列のより効率的な翻訳を達成するために使用することができる。そのようなシ
グナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。ＲＯＣ１および
／またはＲＯＣ２をコードする配列、その開始コドン、ならびに上流配列が適切
な発現ベクターに挿入された場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シ
グナルを必要としないことがある。しかし、コード配列のみまたはそのフラグメ
ントが挿入された場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナル
が提供されなければならない。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実
に行うために正しい読み枠でなければならない。外因性の翻訳エレメントおよび
開始コドンは様々な起源であってもよく、天然および合成の両方であり得る。発
現効率は、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら（１９９４）、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｒｒｏ
ｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５〜１６２）に記載されるエンハン
サーなどの、使用される特定の細胞システムに適切なエンハンサーを挿入するこ
とによって増強させることができる。
【００８７】 さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または発現タン
パク質を所望の様式でプロセシングするその能力について選ぶことができる。ポ
リペプチドのそのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化
、リン酸化、脂質化およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。タン
パク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、
折り畳みおよび／または機能を容易にするために使用することができる。翻訳後
活性に必要な特定の細胞装置および特徴的な機構を有する種々の宿主細胞（例え
ば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）は、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ）から入手することができ、そして外来タンパク質の正しい
修飾およびプロセシングを確実に行うために選ぶことができる。
【００８８】 組換えタンパク質を長期間かつ高収率で産生させる場合には、安定的な発現が
好ましい。例えば、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２を安定的に発現する細胞株
を、ウイルスの複製起点および／または内因性の発現エレメントおよび選択マー
カー遺伝子を同じベクターまたは別のベクターに含有し得る発現ベクターを使用
して形質転換することができる。ベクター導入後、細胞は、選択培地に切り替え
る前に富化培地で１日間〜２日間増殖させることができる。選択マーカーの目的
は、選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在により、導入された配
列をうまく発現する細胞の成長および回収が可能になる。安定的に形質転換され
た細胞の耐性クローンを、細胞タイプに適切な組織培養技術を使用して増殖させ
ることができる。
【００８９】 任意の数の選択システムを、形質転換された細胞株を回収するために使用する
ことができる。これらには、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌ
ｅｒ，Ｍ．ら（１９７７）、Ｃｅｌｌ、１１：２２３〜３２）およびアデニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９８０）、Ｃｅｌｌ、
２２：８１７〜２３）の各遺伝子（これらに限定されない）が含まれ、これらは
それぞれ、ｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる。また
、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤に対する耐性を選択するための基礎とし
て使用することができる：例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄ
ｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．７７：３５６７〜７０）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ４
１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら
（１９８１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１〜１４）、そしてクロルスル
フロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそ
れぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）。さらなる選択遺伝子
が記載されている：例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
することができるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒス
チノールを利用することができるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ
．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７〜５１）。最近、可視的なマーカーの使用が、アン
トシアニン類、グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラー
ゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーの場合にさかんに使用されてい
る。これらは、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクターシステム
に起因し得る一過性または安定的なタンパク質発現の量を定量するためにも広く
使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら（１９９５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１〜１３１）。
【００９０】 マーカー遺伝子発現の有無は、目的とする遺伝子もまた存在することを示唆す
るが、その存在および発現を確認することが必要になる場合がある。例えば、Ｒ
ＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする配列がマーカー遺伝子配列の内部に
挿入された場合、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする配列を含有する
形質転換細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことによって同定すること
ができる。あるいは、マーカー遺伝子を、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコ
ードする配列とともに１個のプロモーターの制御下に縦列状に配置することがで
きる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、縦列状の遺伝
子の発現を同様に示している。
【００９１】 あるいは、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする核酸配列を含有し、
かつＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２を発現する宿主細胞は、当業者によく知ら
れている様々な手法で同定することができる。これらの手法には、核酸またはタ
ンパク質の検出および／または定量を行うためのメンブラン、溶液またはチップ
に基づく技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ−ＲＮ
Ａハイブリダイゼーションおよびタンパク質のバイオアッセイ技術または免疫ア
ッセイ技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチド配列の存在は
、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードするプローブまたはフラグメントま
たはポリヌクレオチドのフラグメントを使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーションまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出
することができる。核酸増幅に基づくアッセイは、ＲＯＣ１および／またはＲＯ
Ｃ２をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する形質転換体を検出するために、
ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド
またはオリゴマーを使用することを含む。
【００９３】 タンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれ
かを使用して、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２の発現を検出および測定するた
めの様々なプロトコルがこの分野では知られている。例には、酵素結合免疫吸着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および蛍光標示式細胞分
取（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２における２つの非
干渉性エピトープに対して反応し得るモノクローナル抗体を利用する二部位モノ
クローナル型免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることがで
きる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、特に、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら
（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ Ｐａｕｌ、Ｍｉｎｎ）および
Ｍａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１
〜１２１６）に記載されている。
【００９４】 広範囲の様々な標識および結合技術が当業者により知られており、様々な核酸
アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ＲＯＣ１および／また
はＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識
されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを作製する手段に
は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識、または標識されたヌク
レオチドを使用するＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、ＲＯＣ１および／または
ＲＯＣ２をコードする配列またはその任意のフラグメントを、ｍＲＮＡプローブ
を作製するベクターにクローン化することができる。そのようなベクターはこの
分野では知られており、また市販され、そしてこれらは、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ
６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えること
によってインビトロでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。
これらの手順は、様々な市販のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ（Ｋ
ａｌａｍａｚｏｏ、Ｍｉｃｈ．）；Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．
）；およびＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ
、Ｏｈｉｏ））を使用して行うことができる。検出を容易にするために使用され
得る好適なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発
光剤または発色剤、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが含まれる。
【００９５】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードするヌクレオチド配列で形質転換さ
れた宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養からのタンパク質の回収に好
適な条件のもとで培養することができる。形質転換された細胞によって産生され
るタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、分泌され
得るか、または細胞内に含有され得る。当業者によって理解されるように、ＲＯ
Ｃ１および／またはＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベク
ターは、原核生物または真核生物の細胞膜を通過してＲＯＣ１および／またはＲ
ＯＣ２を分泌させるシグナル配列を含有するように設計することができる。他の
構築物を使用して、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２をコードする配列を、可溶
性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチ
ド配列に連結することができる。精製を容易にするそのようなドメインには、固
定化された金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールな
どの金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリンでの精製を可能にす
るプロテインＡのドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長部／アフィニティー精製シス
テム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）において用
いられるドメインが含まれるが、これらに限定されない。第ＸＡ因子またはエン
テロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）に
特異的な配列などの切断可能なリンカー配列を精製ドメインとＲＯＣ１および／
またはＲＯＣ２との間に含めることは、精製を容易にするために使用することが
できる。１つのそのような発現ベクターは、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２と
、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼの切断部位の前に６個のヒスチジン残
基をコードする核酸とを含有する融合タンパク質の発現をもたらす。このヒスチ
ジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ
．３：２６３〜２８１）に記載されているようにＩＭＡＣ（固定化金属イオンア
フィニティークロマトグラフィー）での精製を容易にし、同時に、エンテロキナ
ーゼの切断部位は、融合タンパク質からＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２を精製
するための手段を提供する。融合タンパク質を含有するベクターの考察がＫｒｏ
ｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９３；ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜４
５３）に示されている。
【００９６】 組換え産生に加えて、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２のフラグメントは、固
相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．８５：２１４９〜２１５４）を使用する直接的なペプチド合成によって作製
することができる。タンパク質の合成は、手作業技術を使用して、あるいは自動
化によって行うことができる。自動化された合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を
使用して達成され得る。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２の様々なフラグメント
を別々に化学合成し、そして全長の分子を作製するための化学的な方法を使用し
て結合させることができる。
【００９７】 本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体（すなわち、タンパク質における
単一の抗原性部位またはエピトープに結合する抗体）は様々な診断目的に有用で
ある。
【００９８】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２に対する抗体は、この分野においてよく知ら
れている方法を使用して作製することができる。そのような抗体には、ポリクロ
ーナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発
現ライブラリーによって産生されるフラグメントが含まれるが、これらに限定さ
れない。中和抗体（すなわち、ダイマー形成を阻害ずる抗体）は、治療的使用に
特に好ましい。
【００９９】 抗体を産生させるために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスおよびヒトなどを含
む様々な宿主を、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２あるいは免疫原性を有するそ
の任意のフラグメントまたはオリゴペプチドを注射することによって免疫化する
ことができる。宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用して、免疫学的応
答を増大させることができる。そのようなアジュバントには、水酸化アルミニウ
ムなどのフロイントの鉱物ゲル、リソレシチンなどの表面活性物質、プルロニッ
クポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリン
ペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定さ
れない。ヒトにおいて使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（カルメット・ゲ
ラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルブムが特に好ましい。
【０１００】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２に対する抗体を誘導するために使用されるオ
リゴペプチド、ペプチドまたはフラグメントは、少なくとも５個のアミノ酸から
なる配列、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなる配列を有することが
好ましい。それらは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることも
また好ましく、そしてそれらは、天然に存在する小さい分子のアミノ酸配列全体
を含有することができる。ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２のアミノ酸の短い領
域を、キーホールリンペットヘモシアニン、およびキメラ分子に対して産生され
た抗体などの別のタンパク質の領域と融合させることができる。
【０１０１】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２に対するモノクローナル抗体は、培養におけ
る連続的な細胞株によって抗体分子の産生がもたらされる任意の技術を使用して
調製することができる。これには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリド
ーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない
。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら（１９７５）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５
〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ら（１９８５）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、８１、３１〜４２；Ｃｏｔｅ，Ｒ．Ｊ．ら（１９８３）、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ，Ｓ
．Ｐ．ら（１９８４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６２、１０９〜１２０を
参照のこと。
【０１０２】 さらに、「キメラ抗体」を作製するために開発された技術、すなわち、適切な
抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子をヒ
ト抗体遺伝子にスプラシングすることを使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１、
６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ．Ｍ．Ｓ．ら（１９８４）、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３１２：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ら（１９８５）、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３１４：４５２〜４５４）。あるいは、単鎖抗体を作製するために記載さ
れた技術を、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２に特異的な単鎖抗体を作製するた
めに、この分野において知られている技術を使用して適応させることができる。
関連する特異性を有するが、異なるイディオタイプ組成の抗体を、免疫グロブリ
ンのランダムなコンビナトリアルライブラリーからの鎖シャフリングによって作
製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８、１１１２０〜３）。
【０１０３】 抗体はまた、文献に開示されているように、リンパ球集団におけるインビボ産
生を誘導することによって、あるいは免疫グログリンのライブラリー、または大
きな特異性を有する結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって得るこ
とができる。例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ら（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、３８３３〜３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら（１
９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９を参照のこと。
【０１０４】 ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ２に対する特異的な結合部位を含有する抗体フ
ラグメントもまた作製することができる。例えば、そのようなフラグメントには
、抗体分子をペプシン消化することによって得ることができるＦ（ａｂ’）2フ
ラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド結合を還元する
ことによって作製することができるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに
限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望する特異性を有する
モノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構
築することができる。Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
５４、１２７５〜１２８１を参照のこと。
【０１０５】 様々な免疫アッセイを、所望する特異性を有する抗体を同定するためのスクリ
ーニングに使用することができる。明らかにされた特異性を有するポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイまた
は免疫放射測定アッセイに関する多数のプロトコルがこの分野ではよく知られて
いる。そのような免疫アッセイは、典型的には、ＲＯＣ１および／またはＲＯＣ
２とその特異的な抗体との複合体形成の測定を含む。ＲＯＣ１および／またはＲ
ＯＣ２の２つの非干渉性エピトープに対して反応し得るモノクローナル抗体を利
用する二部位モノクローナル型免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイ
もまた用いることができる（Ｍａｄｄｏｘ、上記）。
【０１０６】 抗体は、沈殿などの知られている技術に従って診断アッセイに好適な固体支持
体（例えば、ラテックスもしくはポリスチレンなどの材料から形成されるビーズ
、プレート、スライドガラスまたはウエル）に結合させることができる。抗体は
、知られている技術に従って放射標識（例えば、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ）、酵素標
識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）および蛍
光標識（例えば、フルオレセイン）などの検出可能な基に同様に結合させること
ができる。
【０１０７】 サンプルが本発明のタンパク質を含有するかどうかを明らかにするキットは、
本発明のタンパク質の有無を検出するために特異的な少なくとも１つの試薬を含
む。抗体アッセイを行うための診断キットは、多数の方法で作製することができ
る。１つの実施形態において、診断キットは、（ａ）固体支持体に結合させた、
本発明のタンパク質に結合する抗体、および（ｂ）検出可能な基に結合させた、
本発明のタンパク質に結合する第２の抗体、を含む。試薬にはまた、緩衝剤およ
びタンパク質安定化剤（例えば、多糖類など）などの補助的な薬剤を含んでもよ
い。診断キットはさらに、必要な場合には、検出可能な基がそのシステムの要素
であるシグナル生成システムの他の要素（例えば、酵素基質）、試験におけるバ
ックグランド妨害を低下させる薬剤、コントロール試薬、および試験を行うため
の装置などを含んでもよい。試験キットの別の実施形態は、（ａ）上記の抗体、
および（ｂ）検出可能な基に結合された抗体に対する特異的な結合パートナー、
を含む。上記に記載された補助的な薬剤を同様に含んでもよい。試験キットは、
任意の好適な様式でパッキングすることができ、典型的には、すべての要素が、
試験を行うための印刷された１冊の説明書とともに１つの容器に入れられる。
【０１０８】 ＲＯＣ１またはＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドを細胞内において検出
するか、またはその増幅の程度を決定するためのアッセイは、典型的には、最初
に、細胞またはそれに由来する核酸を含有する細胞抽出物を、本明細書中に示さ
れているように（典型的には、オリゴヌクレオチドが細胞内物質と接触すること
を可能にする条件のもとで）ＲＯＣ１またはＲＯＣ２のポリヌクレオチドに特異
的に結合するオリゴヌクレオチドと接触させること、次いで、それに対するオリ
ゴヌクレオチドの結合の有無を検出することを含む。再度ではあるが、任意の好
適なアッセイ形式を用いることができる（例えば、米国特許第４，３５８，５３
５号（Ｆａｌｋｏｗら）；米国特許第４，３０２，２０４号（Ｗａｈｌら）；同
第４，９９４，３７３号（Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら）；同第４，４８
６，５３９号（Ｒａｎｋｉら）；同第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉら）；
同第４，８６８，１０４号（Ｋｕｒｎら）を参照のこと）（これらの開示は本明
細書の記載の一部として本明細書中に組み込まれることが特に意図される）。
【０１０９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを発
現する核酸を、従来的な技術に従って作製することができる。例えば、米国特許
第５，０２３，２４３号（Ｔｕｌｌｉｓら）；米国特許第５，１４９，７９７号
（Ｐｅｄｅｒｓｏｎら）を参照のこと。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さ
（すなわち、それにおけるヌクレオチドの数）は、それが意図された位置に選択
的に結合する限り重要ではないが、日常的な手順に従って決定することができる
。一般に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８ヌクレオチド、１０ヌクレオ
チドまたは１２ヌクレオチドの長さから、２０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド
または５０ヌクレオチドまでの長さである。そのようなアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、少なくとも１つ、またはすべて、またはリン酸残基を架橋する内部
ヌクレオチドが、メチルホスホナート、メチルホスホノチオアート、ホスホロモ
ルホリダート、ホスホロピペラジダートおよびホスホルアミダートなどの修飾リ
ン酸であるオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、リン酸残基を架橋する内部
ヌクレオチドは１つおきに上記のように改変することができる。別の非限定的な
例において、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少
なくとも１つまたはすべてが２’低級アルキル基（例えば、メチル、エチル、エ
テニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニルおよびイソプロピルなどの
Ｃ1〜Ｃ4の直鎖状または分枝状の飽和アルキルまたは不飽和アルキル）を含有す
るオリゴヌクレオチドである。例えば、ヌクレオチドは１つおきに上記のように
改変することができる。同様に、Ｐ．Ｆｕｒｄｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１７、９１９３〜９２０４（１９８９）；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、１４０１〜１４０５
（１９９０）；Ｃ．Ｂａｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８
、３５３７〜３５４３（１９９０）；Ｂ．Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７、３３７３〜３３８６（１９８９）；Ｒ．Ｗａｌｄｅｒ
およびＪ．Ｗａｌｄｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
５、５０１１〜５０１５（１９８８）を参照のこと。
【０１１０】 好ましい実施形態において、ＲＯＣタンパク質、核酸、変化体、修飾タンパク
質、ＲＯＣ核酸もしくはタンパク質を含有する細胞および／または遺伝子組換え
体は、スクリーニングアッセイにおいて使用される。本明細書中に提供されるＲ
ＯＣタンパク質を同定することにより、ＲＯＣタンパク質に結合するか、または
ＲＯＣタンパク質に対する結合を妨げる化合物、あるいはＲＯＣ活性を調節する
化合物に対する薬物スクリーニングアッセイの設計が可能になる。
【０１１１】 本明細書中に記載されるアッセイでは、好ましくは、ヒトのＲＯＣタンパク質
が用いられるが、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、家
畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）および霊長類を含む他の哺乳動物のタンパ
ク質もまた使用することができる。後者の実施形態は、ヒト疾患の動物モデルを
開発する際には好ましいと考えられる。いくつかの実施形態においては、本明細
書中に概略されているように、上記に概略された欠失ＲＯＣタンパク質を含む変
化体または誘導体のＲＯＣタンパク質を使用することができる。
【０１１２】 好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＲＯＣタンパク質および候補の
生物活性薬剤を一緒にすること、およびＲＯＣタンパク質に対する候補薬剤の結
合を測定することを含む。別の実施形態では、下記において議論されているよう
に、結合競合または生物活性が測定される。
【０１１３】 本明細書中で使用されている用語の「候補の生物活性薬剤」または「外因性化
合物」は、任意の分子（例えば、タンパク質、小さな有機分子、炭水化物（多糖
類を含む）、ポリヌクレオチド、脂質など）を表す。一般に、複数のアッセイ混
合物が、様々な濃度に対する示差的な応答を得るために異なる薬剤濃度を用いて
平行して処理される。典型的には、これらの濃度の１つが陰性コントロールとし
て使用される。すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満の濃度において使用さ
れる。さらに、陽性コントロール、すなわち、ＲＯＣの活性を変化させることが
知られている薬剤の使用を用いることができる。
【０１１４】 候補薬剤には多数の化学クラスが含まれるが、それらは、典型的には、有機分
子であり、好ましくは、分子量が１００ダルトンよりも大きく、約２，５００ダ
ルトン未満である小さな有機分子である。候補薬剤は、タンパク質との構造的な
相互作用（特に、水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には、少なくとも１
つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含み、好
ましくは少なくとも２つのそのような機能的な化学基を含む。候補薬剤は、多く
の場合、１つまたは２つ以上の上記官能基で置換される環状の炭素構造もしくは
複素環構造および／または芳香族構造もしくは多芳香族構造を含む。候補薬剤は
また、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、それ
らの誘導体、構造的アナログまたは組合せを含む生物分子の中に見出される。
【０１１５】 候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範囲の様々
な供給源から得られる。例えば、数多くの手段を、広範囲の様々な有機化合物お
よび生物分子のランダムな合成および直接的な合成のために利用することができ
る。これには、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現が含まれる。あるいは、細
菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態での天然化合物ライ
ブラリーを利用することができ、またはこれらは容易に作製される。あるいは、
天然または合成的に得られるライブラリーおよび化合物は、従来的な化学的手段
、物理的手段および生化学的手段によって容易に改変される。知られている薬理
学的薬剤は、構造的アナログを作製するために、アシル化、アルキル化、エステ
ル化、アミド化など特異的またはランダムな化学的改変に供することができる。
【０１１６】 好ましい実施形態において、種々の候補の生物活性薬剤のライブラリーが使用
される。好ましくは、ライブラリーは、特定の標的に対する結合を可能にする確
率論的に十分な多様性範囲を達成するためには、ランダム化された薬剤の十分な
構造的に多様な集団を提供しなければならない。従って、相互作用ライブラリー
は、その成分の少なくとも１つが、標的に対する親和性をもたらす構造を有する
ように十分に大きくなければならない。相互作用ライブラリーの必要とされる全
体的なサイズを求めることは困難であるが、自然は１つのヒントを免疫応答に関
して提供している：１０7個〜１０8個の異なる抗体の多様性により、生物が直面
する大部分の潜在的な抗原と相互作用する十分な親和性を有する少なくとも１つ
の組合せが提供される。発表されたインビトロ選択技術はまた、１０7個〜１０8 個のライブラリーサイズは、標的に対する親和性を有する構造を見出すためには
十分であることを示している。例えば、長さが７アミノ酸〜２０アミノ酸のペプ
チドのすべての組合せからなるライブラリーは、２０7（１０9）個〜２０20個を
コードする可能性を有する。従って、１０7個〜１０8個の異なる分子のライブラ
リーにより、本発明の方法は、７アミノ酸に対する理論的に完全な相互作用ライ
ブラリーの「作業」部分集団を可能にし、そして２０20ライブラリーに対する具
体的な部分集団を可能にする。従って、好ましい実施形態において、少なくとも
１０6個、好ましくは少なくとも１０7個、より好ましくは少なくとも１０8個、
最も好ましくは少なくとも１０9個の異なる配列が、本発明の方法において同時
に分析される。好ましい方法はライブラリーのサイズおよび多様性を最大にする
。
【０１１７】 好ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤はタンパク質である。別の好
ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤は、天然に存在するタンパク質、
または天然に存在するタンパクのフラグメントである。従って、例えば、タンパ
ク質を含有する細胞抽出物、タンパク質性細胞抽出物のランダムな消化物または
特異的な消化物を使用することができる。このようにして、原核生物タンパク質
および真核生物タンパク質のライブラリーを、本明細書中に記載されるシステム
におけるスクリーニングのために作製することができる。この実施形態において
特に好ましいものは、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳動物のタンパク質ライブ
ラリーである。後者が好ましく、ヒトのタンパク質が特に好ましい。
【０１１８】 好ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤は約５個〜約３０個のアミノ
酸のペプチドであり、約５個〜約２０個のアミノ酸のペプチドが好ましく、約７
個〜約１５個のアミノ酸のペプチドが特に好ましい。これらのペプチドは、上記
に概略されているように天然に存在するタンパク質の消化物、ランダムペプチド
、または「偏った」ランダムペプチドであり得る。「ランダム化」または文法的
等価体により、本明細書中では、それぞれの核酸およびペプチドがそれぞれ、本
質的にはランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からなることが意味される。一
般に、これらのランダムペプチド（または核酸、下記において議論）は化学合成
されるが、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を任意の位置に取り込むことがで
きる。合成方法は、ランダム化されたタンパク質または核酸を作製するために設
計することができ、配列の長さについて可能な組合せのすべてまたは大部分の形
成が可能となり、従って、ランダム化された候補の生物活性なタンパク質性薬剤
のライブラリーを形成させることができる。
【０１１９】 １つの実施形態において、ライブラリーは完全にランダム化され、配列の選り
好みまたは不変部をいずれの位置にも有しない。好ましい実施形態において、ラ
イブラリーは偏りを有する。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定である
ように保持されているか、あるいは限定された数の可能性から選択される。例え
ば、好ましい実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、例えば、
疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（小さいか、または大きいいずれ
かの）残基の規定されたクラスの中で、架橋するためのシステインの形成、ＳＨ
−３ドメインに関するプロリンの形成、リン酸化部位に関するセリン、トレオニ
ン、チロシンまたはヒスチジンの形成などに対して、あるいはプリン類などに対
してランダム化される。
【０１２０】 好ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤は核酸である。別の好ましい
実施形態において、候補の生物活性薬剤は、その広範囲な多様性が文献において
得られる有機化学的部分である。
【０１２１】 本明細書中に記載される方法の１つの実施形態において、ＲＯＣタンパク質の
部分が用いられる。好ましい実施形態において、ＲＯＣ活性を有する部分が使用
される。ＲＯＣ活性は、本明細書中に記載されている通りであり、そして本明細
書中に概略されているようにカリンに対する結合活性を含む。さらに、本明細書
中に記載されるアッセイは、単離されたＲＯＣタンパク質またはＲＯＣタンパク
質を含む細胞のいずれかを用いることができる。
【０１２２】 一般に、本明細書中における方法の好ましい実施形態において、例えば、結合
アッセイの場合、ＲＯＣタンパク質または候補の薬剤は、単離されたサンプルの
収容領域を有する不溶性支持体（例えば、マイクロタイタープレート、アレイな
ど）に非拡散的に結合させられる。不溶性支持体は、組成物が結合することがで
きる任意の組成から作製することができ、可溶性物質から容易に分離され、そし
てそれ以外の場合には、スクリーニングの方法全体と適合し得る。そのような支
持体の表面は緻密または多孔性であり、そして任意の好都合な形状であり得る。
好適な不溶性支持体の例には、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブラン
およびビーズが含まれる。これらは、典型的には、ガラス、プラスチック（例え
ば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン（登
録商標）などから作製される。マイクロタイタープレートおよびアレイは、少量
の試薬およびサンプルを使用して非常に多くのアッセイを同時に行うことができ
るので特に好ましい。いくつかの場合には、磁気ビーズなどが含まれる。組成物
の特定の結合様式は、それが試薬および本発明の方法全体と適合可能で、組成物
の活性を維持し、かつ非拡散性である限り重要ではない。好ましい結合方法には
、（タンパク質が支持体に結合したときにタンパク質上の重要な部位を立体的に
阻止しない）抗体、「粘着性」支持体またはイオン性支持体に対する直接的な結
合、化学的架橋、表面におけるタンパク質または薬剤の合成などの使用が含まれ
る。タンパク質または薬剤を結合させた後、過剰な未結合の物質が洗浄により除
かれる。次いで、サンプル収容領域は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイ
ンあるいは他の無害なタンパク質または他の成分とのインキュベーションにより
ブロッキングされる。本発明にはまた、固体支持体が使用されないスクリーニン
グアッセイも含まれる。そのようなアッセイの例が下記に記載される。
【０１２３】 好ましい実施形態では、ＲＯＣタンパク質が支持体に結合させられ、候補の生
物活性薬剤がアッセイに加えられる。あるいは、候補の薬剤が支持体に結合させ
られ、ＲＯＣタンパク質が加えられる。新規な結合剤には、特異的な抗体、化学
ライブラリーのスクリーニングにおいて同定された非天然の結合剤、ペプチドア
ナログなどが含まれる。特に注目されるものは、ヒト細胞に対する低い毒性を有
する薬剤に対するスクリーニングアッセイである。広範囲の様々なアッセイをこ
の目的のために使用することができる。これには、標識されたインビトロタンパ
ク質−タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結
合に関する免疫アッセイおよび機能的アッセイなどが含まれる。
【０１２４】 ＲＯＣタンパク質に対する候補の生物活性薬剤の結合の測定は多数の方法で行
うことができる。好ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤は標識され、
結合が直接的に測定される。例えば、これは、ＲＯＣタンパク質のすべてまたは
一部を固体支持体に結合させ、標識された候補薬剤（例えば、蛍光標識）を加え
、過剰な試薬を洗って除き、その後、標識が固体支持体上に存在しているかどう
かを測定することによって行うことができる。様々なブロッキング工程および洗
浄工程を、この分野において知られているように用いることができる。
【０１２５】 「標識（された）」により、本明細書中では、検出可能なシグナルをもたらす
標識（例えば、放射性同位体、蛍光剤、酵素、抗体、磁気粒子などの粒子、化学
発光剤、または特異的な結合分子など）により化合物が直接的または間接的のい
ずれかで標識されていることが意味される。特異的な結合分子には、ビオチンお
よびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシンなどのペアが含まれる
。特異的に結合する成分の場合、通常、相補的な成分が、知られている手法に従
って、検出をもたらす分子で標識される。標識により、検出可能なシグナルを直
接的または間接的に得ることができる。
【０１２６】 いくつかの実施形態において、成分の一方のみが標識される。例えば、タンパ
ク質（またはタンパク質性の候補薬剤）を、125Ｉを使用して、または蛍光剤を
用いてチロシンの位置で標識することができる。あるいは、２つ以上の成分を、
異なる標識で標識することができる；例えば、タンパク質に対して125Ｉを使用
し、そして候補薬剤に対して蛍光剤を使用して標識することができる。
【０１２７】 好ましい実施形態において、候補の生物活性薬剤の結合は、競合的結合アッセ
イを使用することによって測定される。この実施形態において、競合剤は、標的
分子（すなわち、ＲＯＣタンパク質）に結合することが知られている結合成分で
あり、例えば、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどである。好まし
い実施形態において、競合剤はカリンである。特定の状況のもとでは、生物活性
薬剤と結合成分との間において、結合成分が生物活性薬剤と入れ替わるような競
合的な結合が存在し得る。このアッセイは、ＲＯＣタンパク質とその生物学的な
結合パートナーとの結合を妨げる候補薬剤を決定するために使用することができ
る。本明細書中において使用される「結合の干渉」は、ＲＯＣタンパク質の本来
の結合が候補薬剤の存在下で異なることを意味する。結合はなくすことができ、
あるいは親和性を低下させることができる。従って、１つの実施形態において、
干渉が、本来の結合部位に対する直接的な競合ではなく、例えば、立体配座の変
化によって生じる。
【０１２８】 １つの実施形態において、候補の生物活性薬剤が標識される。候補の生物活性
薬剤または競合剤のいずれか、あるいその両方が、存在する場合には結合を可能
にする十分な時間にわたって最初にタンパク質に加えられる。インキュベーショ
ンは、最適な活性を促進する任意の温度で、典型的には４℃〜４０℃の間で行う
ことができる。インキュベーション時間は、最適な活性に関して選択されるが、
迅速な高処理スクリーニングを容易にするために最適化することもできる。典型
的には、０．１時間〜１時間で十分である。過剰な試薬は、一般には除かれ、す
なわち洗い流される。その後、第２の成分が加えられ、そして標識された成分の
有無が、結合を示すために追跡される。
【０１２９】 好ましい実施形態において、競合剤が最初に加えられ、その後、候補の生物活
性薬剤が加えられる。競合剤の置換は、候補の生物活性薬剤がＲＯＣタンパク質
に結合しているということ、従って、ＲＯＣタンパク質に結合し得ること、およ
びＲＯＣタンパク質の活性を潜在的に調節し得るということを示している。この
実施形態において、いずれかの成分を標識することができる。従って、例えば、
競合剤が標識されている場合には、標識が洗浄液に存在することにより、薬剤に
よる置換が示される。あるいは、候補の生物活性薬剤が標識されている場合には
、標識が支持体上に存在することにより、置換が示される。
【０１３０】 代替的な実施形態においては、候補の生物活性薬剤が最初に加えられ、インキ
ュベーションおよび洗浄とともに、その後、競合剤が加えられる。競合剤による
結合が存在しないことにより、生物活性薬剤がより大きな親和性でＲＯＣタンパ
ク質に結合していることが示される。従って、候補の生物活性薬剤が標識されて
いる場合には、標識が支持体上に存在することにより、競合剤の結合がないこと
と一致して、候補薬剤がＲＯＣタンパク質に結合できることが示され得る。
【０１３１】 好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＲＯＣタンパク質の活性を調節
し得る生物活性薬剤を同定するための示差的なスクリーニングを含む。そのよう
なアッセイは、ＲＯＣタンパク質または前記ＲＯＣタンパク質を含む細胞を用い
て行うことができる。１つの実施形態において、この方法は、ＲＯＣタンパク質
および競合剤を第１のサンプルにおいて一緒にすることを含む。第２のサンプル
は、候補の生物活性薬剤、ＲＯＣタンパク質および競合剤を含む。競合剤の結合
が両方のサンプルについて測定され、そして２つのサンプル間の結合の変化また
は差により、ＲＯＣタンパク質に結合し、その活性を潜在的に調節し得る薬剤の
存在が示される。すなわち、競合剤の結合が、第１のサンプルに対して第２のサ
ンプルにおいて異なる場合、薬剤はＲＯＣタンパク質に結合することができる。
【０１３２】 あるいは、好ましい実施形態において、本来のＲＯＣタンパク質に結合するが
、修飾されたＲＯＣタンパク質には結合することができない薬物候補物を同定す
るための示差的なスクリーニングが利用される。ＲＯＣタンパク質の構造はモデ
ル化することができ、そしてその部位と相互作用する薬剤を合成するための合理
的な薬物設計において使用することができる。細胞周期の生物活性に影響を及ぼ
す薬物候補物もまた、タンパク質の活性を増強または低下させるいずれかの能力
について薬物をスクリーニングすることによって同定される。
【０１３３】 陽性コントロールおよび陰性コントロールをアッセイにおいて使用することが
できる。好ましくは、すべてのコントロールサンプルおよび試験サンプルは、統
計学的に有意な結果を得るために少なくとも三連で実施される。すべてのサンプ
ルのインキュベーションは、薬剤がタンパク質に結合するために十分な時間であ
る。インキュベーション後、すべてのサンプルは、非特異的に結合した物質が存
在しないように洗浄され、そして、一般には標識された、結合した薬剤の量が測
定される。例えば、放射標識が用いられる場合には、サンプルは、結合した化合
物の量を測定するためにシンチレーションカウンターで計数することができる。
【０１３４】 様々な他の試薬をスクリーニングアッセイにおいて含めることができる。これ
らには、塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などのような
試薬が含まれ、これらの試薬は、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進する
ために、かつ／または非特異的な相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を
低下させるために使用することができる。また、それ以外の点で、アッセイ効率
を改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤な
どを使用することができる。成分の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序
で加えることができる。
【０１３５】 ＲＯＣタンパク質の活性を調節する薬剤に関するスクリーニングもまた行うこ
とができる。好ましい実施形態において、ＲＯＣタンパク質の活性を調節し得る
生物活性薬剤に関するスクリーニング方法は、候補の生物活性薬剤をＲＯＣタン
パク質のサンプル（またはＲＯＣタンパク質を含む細胞）に加える工程、および
ＲＯＣタンパク質の生物学的活性における変化を測定する工程を含む。「ＲＯＣ
タンパク質の活性を調節する」ことは、活性の増大、活性の低下、あるいは存在
する活性のタイプまたは種類の変化を含む。従って、この実施形態において、候
補薬剤は、ＲＯＣタンパク質に結合し（しかし、これは必須ではなくてもよい）
、かつ本明細書中に定義されているようなその生物学的または生化学的な活性を
変化させなければならない。この方法には、上記に一般的に概略されているよう
にインビトロでのスクリーニング方法、およびＲＯＣタンパク質の存在、分布、
活性または量における変化に関する細胞のインビボでのスクリーニングの両方が
含まれる。
【０１３６】 従って、この実施形態において、本発明の方法は、ＲＯＣタンパク質および候
補の生物活性薬剤を一緒にすること、およびＲＯＣタンパク質の生物活性に対す
る作用を評価することを含む。「ＲＯＣタンパク質の活性」または文法的等価体
により、本明細書中において、ＲＯＣタンパク質の生物学的活性の少なくとも１
つが意味される。これには、カリン類（カリン１、２、３、４Ａおよび５（これ
らに限定されない）を含む）に結合するタンパク質の能力、ユビキチンを連結す
るその活性およびユビキチン依存のタンパク質分解プロセスにおける活性、ＳＩ
Ｃｐ分解におけるその役割、ならびに本明細書中に記載されるようなＲＯＣタン
パク質の任意の他の活性などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】 好ましい実施形態において、ＲＯＣタンパク質の活性は低下する；別の好まし
い実施形態では、ＲＯＣタンパク質の活性は増大する。従って、アンタゴニスト
である生物活性薬剤がいくつかの実施形態では好ましく、アゴニストである生物
活性薬剤が別の実施形態では好ましいと考えられる。
【０１３８】 好ましい実施形態において、本発明は、ＲＯＣタンパク質の活性を調節し得る
生物活性薬剤に対するスクリーニング方法を提供する。この方法は、上記に定義
されているような候補の生物活性薬剤を、ＲＯＣタンパク質を含む細胞に加える
ことを含む。好ましい細胞タイプには、ほとんど任意の細胞が含まれる。細胞は
、ＲＯＣタンパク質をコードする組換え核酸を含有する。好ましい実施形態にお
いて、候補薬物のライブラリーが複数の細胞において試験される。
【０１３９】 ＲＯＣ活性の検出は、当業者により理解されているように行うことができる。
ＲＯＣの生物活性における変化の検出を可能にするために評価またはアッセイさ
れ得る多数のパラメーターが存在する。
【０１４０】 すべての状態が、生物活性薬剤などの存在下または非存在下で、それぞれの測
定について同じであるか、あるいは様々な条件のもとでの測定値を求めることが
できる。例えば、候補の生物活性薬剤が存在する場合、および候補の生物活性薬
剤が存在しない場合におけるＲＯＣ活性の測定値を細胞または細胞集団において
求めることができる。別の例では、細胞または細胞集団の条件または環境が互い
に異なる場合におけるＲＯＣ活性の測定値が求められる。例えば、生理学的なシ
グナル、例えば、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、
作用ポテンシャル、化学療法剤を含む薬理学的薬剤、放射線、発ガン物質、また
は他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触）の存在下または非存在下において、あ
るいはそれらに暴露された前後において細胞を評価することができる。
【０１４１】 「細胞の集団」または「細胞のライブラリー」により、本明細書中では、少な
くとも２個の細胞が意味され。少なくとも１０3個が好ましく、少なくとも１０6 個が特に好ましく、少なくとも１０8個〜１０9個がとりわけ好ましい。集団また
はサンプルは、一次培養物または二次培養物のいずれかに由来する異なる細胞タ
イプの混合物を含有し得るが、単一の細胞対応のみを含有するサンプルが好まし
く、例えば、サンプルは細胞株（特に、腫瘍細胞株）に由来し得る。好ましい実
施形態において、複製または増幅する細胞が使用される；これは、候補の生物活
性薬剤を導入するためにレトロウイルスベクターの使用を可能にし得る。あるい
は、複製しない細胞を使用してもよく、他のベクター（アデノウイルスベクター
およびレンチウイルスベクターなど）を使用することができる。さらに、必要と
されないが、細胞は色素および抗体との適合性を有する。
【０１４２】 本発明において使用される好ましい細胞タイプには、動物（マウス、ラット、
ハムスターおよびアレチネズミを含む齧歯類）、霊長類およびヒトの細胞を含む
哺乳動物細胞、特に、乳房、皮膚、肺、頸部、結腸直腸、白血病、脳などを含む
すべてのタイプの腫瘍細胞を含む哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定され
ない。
【０１４３】 本明細書中に提供されるタンパク質および核酸はまた、ＲＯＣタンパク質のタ
ンパク質−タンパク質相互作用が同定され得るスクリーニング目的のために使用
することができる。様々な遺伝学的システムが、タンパク質−タンパク質相互作
用を検出するために記載されている。最初の研究は、酵母システムにおいて、す
なわち、「酵母ツーハイブリッド」システムにおいて行われた。基本的システム
は、レポーター遺伝子の転写を開始させるためにタンパク質−タンパク質相互作
用を必要とする。その後の研究が哺乳動物細胞において行われた。Ｆｉｅｌｄｓ
ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４０、２４５（１９８９）；Ｖａｓａｖａｄａら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、１０６８６（１９９１）；Ｆ
ｅａｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、７９５
８（１９９２）；Ｄａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、９５４（１
９９１）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
８、９５７８（１９９１）；ならびに米国特許第５，２８３，１７３号、同第５
，６６７，９７３号、同第５，４６８，６１４号、同第５，５２５，４９０号お
よび同第５，６３７，４６３号を参照のこと。
【０１４４】 一般には、２つの核酸が細胞に形質転換される。この場合、一方が、ＲＯＣタ
ンパク質またはその一部をコードする遺伝子などの「おとり」であり、もう一方
が試験候補物をコードする。この２つの発現産物が互いに結合する場合にだけ、
蛍光性タンパク質などの指示物が発現される。指示物の発現により、試験候補物
がＲＯＣタンパク質に結合していることが示される。同じシステムおよび新しく
同定されたタンパク質を使用して、逆のことを行うことができる。すなわち、本
明細書中に提供されるＲＯＣタンパク質は、新しいおとり、またはＲＯＣタンパ
ク質と相互作用する薬剤を同定するために使用することができる。さらに、おと
り、およびおとりを妨げるカリンなどの薬剤を決定するための核酸をコードする
ＲＯＣタンパク質に加えて試験候補物が添加されるツーハイブリッドシステムを
使用することができる。
【０１４５】 このようにして、生物活性薬剤が同定される。薬理学的活性を有する生物活性
薬剤（すなわち、化合物）は、少なくとも１つのＲＯＣタンパク質の活性を増強
または妨害し得るそのような化合物である。所望する薬理学的活性を有する化合
物は、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、薬学的配合物）で宿主または被
験者に投与することができる。好適な被験者は、好ましくはヒト被験者であるが
、イヌ、ネコおよび家畜などの他の哺乳動物被験者であってもよい（すなわち、
獣医学的目的のため）。
【０１４６】 本発明の薬学的配合物は、薬理学的活性を有する化合物（これは本発明の方法
を使用して同定される）を薬学的に受容可能なキャリアに含む。好適な薬学的配
合物には、吸入投与、経口投与、直腸投与、局所投与（口内、舌下、皮膚、膣お
よび眼内を含む）、非経口投与（皮下、皮内、筋肉内、静脈内および動脈内を含
む）および経皮投与に適した配合物である。そのような組成物は、好都合には単
位投薬形態で提供することができ、この分野においてよく知られている方法のい
ずれかにより調製することができる。任意の特定の場合における最も好適な投与
経路は、被験者において処置される状態の解剖学的位置、処置される状態の性質
および重篤度、ならびに使用される特定の薬理学的活性化合物に依存し得る。配
合物は、好都合には単位投薬形態で提供することができ、この分野においてよく
知られている方法のいずれかにより調製することができる。
【０１４７】 本発明による医薬品（「配合物」）の製造において、薬理学的に活性な化合物
またはその生理学的に受容可能な塩（「活性化合物」）は、典型的には、特に、
受容可能なキャリアと混合される。キャリアは、当然のことではあるが、配合物
における任意の他の成分と適合し得るという意味で受容可能でなければならず、
そして患者に対して有害であってはならない。キャリアは、固体または液体また
はその両方であってもよく、好ましくは、０．５重量％〜９９重量％の活性化合
物を含有し得る単位用量配合物（例えば、錠剤）として化合物と配合される。１
つまたは２つ以上の活性化合物を本発明の配合物に組込むことができる。そのよ
うな配合物は、本質的には成分を混合することからなり、必要に応じて１つまた
は２つ以上の補助的な治療成分を含ませるよく知られている製薬技術のいずれか
によって調製することができる。
【０１４８】 経口投与に好適な配合物は、それぞれが所定量の活性化合物を含有するカプセ
ル剤、サシェ剤、トローチ剤または錠剤などの分割ユニットで、あるいは粉末剤
または顆粒剤として、あるいは水性液体または非水性液体における溶液または懸
濁物として、あるいは水中油エマルションまたは油中水エマルションとして提供
され得る。そのような配合物は、活性化合物および好適なキャリア（これは上記
に示されるような１つまたは２以上の補助成分を含有し得る）を一緒にする工程
を含む任意の好適な製薬方法によって調製することができる。一般に、本発明の
配合物は、活性化合物を、液体キャリアまたは細かく分割された固体キャリアと
、あるいはその両方と均一かつ十分に混合し、次いで、必要な場合には、得られ
た混合物を形状化することによって調製される。例えば、錠剤は、活性化合物を
、必要に応じて１つまたは２つ以上の補助成分とともに含有する粉末または顆粒
を圧縮成型または成型することによって調製することができる。圧縮成型された
錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤
と必要に応じて混合された粉末または顆粒などの易流動性形態の化合物を好適な
装置において圧縮成型することによって調製することができる。成型された錠剤
は、不活性な液体結合剤で湿らされた粉末化化合物を好適な装置で成型すること
によって作製することができる。経口投与用の配合物は、胃における配合物の分
解を妨げ、小腸における薬物の放出をもたらす、この分野において知られている
腸溶性コーティング剤を必要に応じて含むことができる。
【０１４９】 口内投与に好適な配合物には、活性化合物を好ましい基剤（通常的には、スク
ロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム）に含むトローチ剤；および
ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な
基剤に化合物を含む香剤が含まれる。
【０１５０】 非経口投与に好適な本発明の配合物には、活性化合物の無菌の水性注射液およ
び非水性注射液が含まれる。そのような調製物は、好ましくは、意図された受容
者の血液と等張性である。これらの調製物は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、お
よび配合物を意図された受容者の血液と等張性にする溶質を含有することができ
る。水性および非水性の無菌の懸濁物は懸濁剤および増粘剤を含むことができる
。配合物は、単位用量容器または多用量容器で、例えば、密封されたアンプルお
よびバイアルで提供され得るが、無菌の液体キャリア（例えば、使用直前の生理
食塩水または注射用水）を加えることのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾
燥）状態で保存することができる。処方箋に従って調製される注射用の溶液また
は懸濁物は、前記に記載された種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製する
ことができる。例えば、本発明の１つの局面において、式（Ｉ）の化合物または
その塩を単位投薬形態で密閉容器に含む注射可能で安定な無菌の組成物が提供さ
れる。そのような化合物または塩は、患者に対するその注射に好適な液体組成物
を形成するために好適な薬学的に受容可能なキャリアで再構成され得る凍結乾燥
物の形態で提供される。単位投薬形態は、典型的には、約１０ｍｇ〜約１０ｇの
化合物または塩を含む。化合物または塩が実質的に水に不溶性である場合、生理
学的に受容可能な十分な量の乳化剤を、化合物または塩を水性キャリアに乳化す
るために十分な量で用いることができる。そのような有用な乳化剤の１つがはホ
スファチジルコリンである。
【０１５１】 直腸投与に好適な配合物は、好ましくは、単位用量坐薬として提供される。こ
れは、活性化合物を１つまたは２つ以上の従来的な固体キャリア（例えば、カカ
オ脂）と混合し、次いで得られた混合物を形状化することによって調製すること
ができる。
【０１５２】 皮膚に対する局所適用に好適な配合物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ロー
ション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルの形態を取る。使
用され得るキャリアには、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アル
コール、経皮増強剤、およびそれらの２つ以上の組合せが含まれる。
【０１５３】 経皮投与に好適な配合物は、受容者の表皮と長時間にわたり十分な接触状態を
維持するために適合した分割されたパッチとして提供され得る。経皮投与に好適
な配合物はまたイオン導入によっても送達することができ（例えば、Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３、３１８（１９８６）を参照のこと
）、そして必要に応じて緩衝化された活性化合物の水性溶液の形態を取る。
【０１５４】 さらに、本発明は、本明細書中に開示された化合物およびその塩のリポソーム
配合物を提供する。リポソーム懸濁物の形成技術はこの分野ではよく知られてい
る。化合物またはその塩が水溶性の塩である場合、従来的なリポソーム技術を使
用して、それらを脂質ビヒクルに取り込むことができる。そのような場合、化合
物または塩の水溶性のために、化合物または塩は、実質的には、リポソームの親
水性の中心部またはコアの内部に取り込まれる。用いられる脂質層は、任意の従
来的な組成であってもよく、そしてコレステロールを含有してもよく、あるいは
コレステロールを含まなくてもよい。目的とする化合物または塩が水に不溶性で
ある場合、再度ではあるが、従来的なリポソーム形成技術を用いて、リポソーム
の構造を形成する疎水性の脂質二重層の内部に塩を実質的に取り込ませることが
できる。いずれの場合においても、作製されたリポソームは、標準的な超音波処
理技術およびホモジネート処理技術を使用することなどによってサイズを小さく
することができる。
【０１５５】 当然のことではあるが、本明細書中に記載された方法を用いて同定された薬学
的に活性な化合物を含有するリポソーム配合物は、リポソーム懸濁物を再構成す
るために水などの薬学的に受容可能なキャリアで再構成され得る凍結乾燥物を作
製するために凍結乾燥することができる。
【０１５６】 他の薬学的な配合物（水系エマルションなど）は、本明細書中に開示されてい
る水不溶性の化合物から、あるいはその塩から調製することができる。そのよう
な場合、配合物は、所望する量の化合物またはその塩を乳化するために十分な量
の薬学的に受容可能な乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤には、ホスファチジ
ルコリンおよびレシチンが含まれる。
【０１５７】 薬理学的に活性な化合物に加えて、薬学的組成物は、ｐＨ調節用添加剤などの
他の添加剤を含有することができる。特に、有用なｐＨ調節剤には、塩酸などの
酸、塩基、あるいは乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエ
ン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたはグルコン酸ナトリウムなどの緩衝剤が
含まれる。さらに、組成物は微生物防止剤を含有することができる。有用な微生
物防止剤には、メチルパラベン、ポリパラベンおよびベンジルアルコールが含ま
れる。微生物防止剤は、典型的には、配合物が多回用量使用を目的とするバイア
ルに入れられている場合に用いられる。当然のことではあるが、示されているよ
うに、本発明の薬学的配合物は、この分野においてよく知られている技術を使用
して凍結乾燥することができる。
【０１５８】 本発明の方法により同定された任意の特定の薬理学的に活性な化合物（そのよ
うな化合物の使用は本発明の範囲に含まれる）の治療的有効投薬量は、化合物毎
に、また被験者毎に幾分か異なり、そして患者の状態および送達経路に依存して
いる。
【０１５９】 下記の実施例は、本発明を例示するために提供されるが、本発明の限定として
解釈してはならない。
【０１６０】 実施例１：材料および方法 ｃＤＮＡクローン、プラスミド構築および酵母ツーハイブリッドアッセイ 全長のマウスのカリンＡ４をコードするｃＤＮＡ配列を、Ｍｉｃｈｅｌおよび
Ｘｉｏｎｇ、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．９、４３９〜４４５（１
９９８）に記載される酵母ツーハイブリッドアッセイによって、カリンと相互作
用するタンパク質についてＨｅＬａ細胞由来ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングするためのおとりとして使用した。ヒトＲＯＣ２およびヒトＡＰＣ１１の両
方に対する全長のｃＤＮＡクローンをＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリーからＰＣ
Ｒ増幅によって単離し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。全長の哺乳動物ＡＰ
Ｃ２をコードするｃＤＮＡを同定するために、ＥＳＴデータベースを検索した。
全長のｃＤＮＡクローンは、現在のＥＳＴデータベースにおいてヒトＡＰＣ２に
ついて得られなかった。その代わり、全長に近いマウスＡＰＣ２のＥＳＴ ｃＤ
ＮＡクローン（Ｗ１３２０４）が同定された。これは、９４ｋＤａの計算された
分子量を有する８２３アミノ酸のオープンリーディングフレームが予測された。
このマウスｃＤＮＡクローンは、発表されたヒトＡＰＣ２（Ｙｕら、１９９８ａ
）よりも１アミノ酸残基長く、開始メチオニンコドンを有していない。マウスＡ
ＰＣ２タンパク質とヒトＡＰＣ２タンパク質との極めて近い関連性（８２３個の
残基全体にわたる９３％の同一性）を考慮して、マウスＡＰＣ２を、ヒトＡＰＣ
１１との相互作用について試験するときには使用した。
【０１６１】 酵母のｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲによって酵母のゲノムＤＮＡから増幅して、Ｄ
ＮＡ配列決定によって確認した。ＳｃＲＯＣ１を得るために使用されたプライマ
ーは、５’−ＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣ
ＧＡＡ−３’［配列番号５］および５’−ＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＧＡ ＡＴＴＣ ＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴ−３’［配列番号６］であった。これらには
、５’のＢａｍＨＩ部位および３’のＥｃｏＲＩ部位（下線部）が組み込まれ、
それらにより、ＰＣＲ産物をｐＧＡＤ餌食ベクターに読み枠を合わせて挿入した
。ｐＧＢＴ８−ＳｃＲＯＣ１を、ＳｍａＩおよびＳａｃＩの制限部位を使用して
ｐＧＥＸ−ＳｃＲＯＣ１から構築した。ＳｃＡＰＣ１１を増幅するためのプライ
マーは、５’−ＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡＡＡＧＴ
ＴＡＡＡ−３’［配列番号７］および５’−ＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＣＴＡＧＡ ＡＴＴＣＴ ＴＴＴＴＴＡＴＣＧＴＡＡ［配列番号８］である。これらには、５’
のＢａｍＨＩ部位および３’のＥｃｏＲＩ部位（下線部）が組み込まれ、それら
により、ＰＣＲ産物をｐＧＡＤベクターに読み枠を合わせて挿入した。ＣＤＣ５
３は、Ｍｉｋｅ Ｔｙｅｒｓ博士から提供され、ＢａｍＨＩ部位およびＮｏｔＩ
部位を使用してｐＭＴ１１４４からｐＢＳＫＳにサブクローニングした。これか
ら、ＣＤＣ５３を、ＢａｍＨＩ部位およびＳａｃＩ部位を使用して、読み枠を合
わせてｐＧＢＴ８にサブクローニングして、ｐＧＢＴ８−ＣＤＣ５３を作製した
。ＣＵＬ Ｂ（ＯＲＦ ＹＧＲ００３ｗ）を、下記のプライマーを使用してＰＣ
Ｒクローニングした：５’−ＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＡＡＣＴＡＡ
ＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡ−３’［配列番号９］および５’−ＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴ Ｃ ＧＴＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡ−３’［配列番号１０］。こ
れらには、５’のＮｃｏＩ部位および３’のＳａｃＩ部位（下線部）が組み込ま
れ、それらにより、ＰＣＲ産物をｐＧＢＴ８餌食ベクターに読み枠を合わせて挿
入した。ＣＵＬ Ｃ（ＯＲＦ ＹＪＬ０４７ｃ）を、下記のプライマーを使用し
てＰＣＲクローニングした：５’−ＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＡＡＡ
ＴＧＡＧＡＧＣＧＴＴＴＣＣ−３’［配列番号１１］および５’−ＡＧＣＴＣＧ ＴＣＧＡＣ ＡＴＴＡＧＴＡＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＧＣＴＡＴ−３’［配列番号１
２］。これらには、５’のＮｃｏＩ部位および３’のＳａｌＩ部位（下線部）が
組み込まれ、それらにより、ＰＣＲ産物をｐＧＢＴ８餌食ベクターに読み枠を合
わせて挿入した。ＳｃＡＰＣ２を、下記のプライマーを使用してＰＣＲクローニ
ングした：５’−ＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＧＡＴＴＡ
ＣＣＣＣＡ−３’［配列番号１３］および５’−ＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣ
ＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＴＴ−３’［配列番号１４］。これらには
、５’のＮｏｔＩ部位および３’のＳａｌＩ部位（下線部）が組み込まれ、それ
らにより、ＰＣＲ産物をｐＧＢＴ８餌食ベクターに読み枠を合わせて挿入した。
すべてのＰＣＲクローニングは、リチカーゼで処理されたＹＥＦ４７３ゲノムＤ
ＮＡをテンプレートとして使用し、下記のプロトコル１を使用して行われた：９
４℃で１分、５５℃で１分、６８℃で１分／ｋｂの２５サイクル、その後、６８
℃での１０分間の伸長。ＳｃＲＯＣ１およびＳｃＡＰＣ１１の場合には、１ＸＰ
ＣＲ緩衝液、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｍＭの各プライマーおよび０．１
ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する反応液において、Ｐｆｕ校正ＤＮＡポリメラーゼ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＣＵＬ Ｂ、ＣＵＬ ＣおよびＳｃＡＰＣ
２をＰＣＲ増幅する場合には長テンプレート伸長キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造者の説明書に従って使用した。反応物は、０．１ｍ
ＭのＭｇＣｌ2（緩衝剤１）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．５ｍＭの各プライ
マーおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有した。ＳｃＲＯＣ１、ＳｃＡＰＣ１
１、ｈＲＯＣ１およびｈＲＯＣ２をすべて、５’のＢａｍＨＩ制限部位および３
’のＸｈｏＩ制限部位を使用してｐ４１４−ＡＤＨベクター（ＣＥＮ）に挿入し
た。
【０１６２】 哺乳動物における発現を行う場合、個々のｃＤＮＡクローンを、ＣＭＶプロモ
ーターの制御下にあるｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ある
いはＨＡまたはｍｙｃのエピトープで標識された融合タンパク質を発現されるた
めのｐｃＤＮＡ３−ＨＡまたはｐｃＤＮＡ３−Ｍｙｃにサブクローニングした。
酵母ツーハイブリッドアッセイのために、個々のカリン配列を、Ｇａｌ４のＤＮ
Ａ結合ドメインと読み枠を合わせて、ｐＧＴＢ９の改変体であるｐＧＴＢ８にク
ローニングした。ＲＯＣ１、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１を、Ｇａｌ４のＤＮＡ活
性化ドメインと読み枠を合わせてｐＧＡＤにクローニングした。ヒトＣＵＬ１、
ＣＵＬ１欠失変異体およびＳＫＰ１に対する酵母ツーハイブリッド発現プラスミ
ドは以前に記載された（ＭｉｃｈｅｌおよびＸｉｏｎｇ、１９９８、上記）。
【０１６３】 実施例２：材料および方法 細胞株、培養条件および細胞トランスフェクション すべての哺乳動物細胞は、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭにおいて、５
％ＣＯ2を有する３７℃のインキュベーターで培養された。細胞には、ＨｅＬａ
（ヒトの子宮頸部類上皮ガン）、Ｓａｏｓ−２（骨肉腫）および２９３Ｔ（ヒト
の形質転換された初代胚腎臓ｃ細胞）が含まれる。細胞のトランスフェクション
は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬を製造者の説明書（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）
に従って行った。それぞれのトランスフェクションには、４μｇの総プラスミド
ＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３ベクターＤＮＡ類について調節する）を６０ｍディッシュ
について使用した。
【０１６４】 実施例３：材料および方法 抗体および免疫化学手法 ［35Ｓ］−メチオニンの代謝的標識、免疫沈降および免疫ブロッティングに関
する手順は以前に記載されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｃ．Ｗ．およびＸｉｏｎｇ
，Ｙ．（１９９５）、「細胞周期研究における免疫沈降および免疫ブロッティン
グ」、Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌ およびｍｅｔｈｏｄｓ、Ｍ．
Ｐａｇａｎｏ編（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、２５
０頁〜２６３頁）。ウサギポリクローナル抗体を作製する際に使用された合成ペ
プチドの配列は下記の通りである：抗ヒトＲＯＣ１Ｎ（ＣＭＡＡＡＭＤＶＤＴＰ
ＳＧＴＮ、アミノ酸残基１〜１４）［配列番号１５］、抗ヒトＲＯＣ１Ｃ（ＣＤ
ＮＲＥＷＥＦＱＫＹＧＨ、残基９７〜１０８）［配列番号１６］、抗ヒトＡＰＣ
１１（ＣＲＱＥＷＫＦＫＥ、残基７６〜８４）［配列番号１７］、および抗ヒト
ＣＵＬ２（ＣＲＳＱＡＳＡＤＥＹＳＹＶＡ、残基７３３〜７４５）［配列番号１
８］。Ｋｉｐｒｅｏｓら、１９９６（上記）；ＭｉｃｈｅｌおよびＸｉｏｎｇ、
１９９８（上記）を参照のこと。システイン（下線部）を、活性化されたキーホ
ールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にペプチドを共有結合させるためにそれ
ぞれのペプチドのＮ末端に付加した。ヒトＣＵＬ１およびＳＫＰ１に対する抗体
は以前に記載された（ＭｉｃｈｅｌおよびＸｉｏｎｇ、１９９８、上記）。この
研究において使用されたウサギポリクローナル抗体はすべて、製造者の説明書（
Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従っ
たそれぞれのペプチドカラムを使用してアフィニティー精製された。モノクロー
ナル抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およ
びモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ＮｅｏＭａｒｋｅｒ）は市販品を購
入した。酵母アクチンに対する抗体はＪ．Ｐｒｉｎｇｌｅ博士から提供された。
結合させたインビトロでの転写および翻訳は、製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ
）に従ってＴＮＴキットを使用して行った。
【０１６５】 実施例４；材料および方法 ＲＯＣ１複合体の免疫精製およびタンパク質マイクロシーケンシング ＲＯＣ１複合体を調製スケールで免疫精製するために、総溶解物を、ＮＰ−４
０溶解緩衝液による溶解後の１５０ｍｍプレートからまとめたＨｅＬａ細胞から
調製し、高速遠心分離（１３，０００ｇで３０分間）により透明化した。非コー
ティングのセファデックスビーズを用いた予備透明化の後、ヒトＲＯＣ１に対す
るアフィニティー精製抗体の１００μｇを透明化した細胞溶解物に加えた。揺す
りながら４℃で１時間インキュベーションした後、プロテインＡビーズを溶解物
に加え、１時間インキュベーションした。ビーズをＮＰ−４０溶解緩衝液で３回
洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ負荷緩衝液中で３分間煮沸して、タンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分離した。銀染色後、ＲＯＣ１に特異的に結合したバンドを、
モル過剰量の競合抗原ペプチドの存在下で同じ抗ＲＯＣ１抗体による同じＨｅＬ
ａ溶解物の平行した免疫沈降と比較することによって同定した。分子量が７０ｋ
Ｄａ〜１２０ｋＤａの間にある競合バンドをＳＤＳゲルから切り出し、リシルエ
ンドペプチダーゼ（５０ｎｇ／ｍｌ）を使用するゲル内プロテアーゼ消化に付し
た。消化されたペプチドフラグメントをアセトニトリルにより抽出し、Ｃ１８カ
ラム（１ｍｍｘ２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ）を使用するＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋ
ａｒｄ社の１１００ＨＰＬＣシステムでの逆相高圧液体クロマトグラフィーで分
離した。ＨＰＬＣから集められた個々のペプチドのタンパク質配列を、Ｇｌａｘ
ｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅタンパク質マイクロシーケンシング施設において自動化Ａ
ＢＩマイクロシーケンサーで決定した。
【０１６６】 実施例５：材料および方法 酵母株 すべてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株はＹＥＦ４７３（ａ／α ｕｒａ３−５
２／ｕｒａ３−５２ ｈｉｓ３Δ−２００／ｈｉｓ３Δ−２００ ｔｒｐ１Δ−
６３／ｔｒｐ１Δ−６３ ｌｅｕ２Δ−１／ｌｅｕ２Δ−１ ｌｙｓ２−８０１
／ｌｙｓ２−８０１）に由来した。酵母は、別途示されていない限り、２％グル
コースまたは２％ラフィノースおよび様々な量のガラクトースを適するように含
有するＹＰ培地またはＳＤ培地（これらは適切なアミノ酸を有しない）において
３０℃で培養された。タンパク質発現を測定するために、酵母培養物を遠心分離
によって集め、蒸留水で１回洗浄し、−８０℃で一晩保存した。細胞ペレットを
、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％
のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのＮ
ａＶＯ3および１Ｘのプロテアーゼ阻害剤（２５μ／ｍｌロイペプチン、２５μ
／ｍｌアプロトニン、１ｍＭベンゾアミジンおよび１０μ／ｍｌトリプシン阻害
剤）を含有する溶解緩衝液に再懸濁した。ガラスビーズを加え、サンプルを、そ
れぞれの振とうの間に少なくとも３０秒間氷上に置きながら、３０秒間、４回振
とうした。懸濁物を新しいエッペンドルフチューブに移し、１３０００ｇにおい
て４℃で３０分間遠心分離した。全細胞抽出物におけるタンパク質濃度を、Ｂｒ
ａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した。各サンプルからの等量の総タンパク
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、免疫ブロッティングした。核染
色の場合、酵母を、３０℃のローラードラムにおいて、３．７％ホルムアルデヒ
ドを含む培養培地で１時間固定した。固定処理された細胞を１ＸＰＢＳで３回洗
浄し、その後、Ｐｒｉｎｇｌｅ，Ｊ．Ｒ．（１９９１）、「酵母の免疫蛍光法」
、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４、５６５〜６０２に記載され
ているように包埋培地（１％ｗ／ｖのｐ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を
含む１ＸＰＢＳ（ｐＨ９）、９０％グリセロール、および０．５μｇ／ｍｌのＨ
ｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素）に再懸濁した。
【０１６７】 変異酵母株を、ＰＣＲに基づく遺伝子欠失、およびＬｏｎｇｔｉｎｅら、Ｙｅ
ａｓｔ、１４（１０）、９５３〜９６１（１９９８）に従った相同組換えによる
改変を使用して構築した。構築されたすべての株に対するＰＣＲ産物のプライマ
ーは、データベースに公開されている配列に基づいて設計され、遺伝子特異的な
配列に対して相同的な４０ｂｐの配列（上流部）と、ベクターテンプレートに対
して相同的な２０ｂｐ（下流部）とを含有した。ＲＯＣ１の完全な欠失体を作製
し、そして大腸菌ｋａｎｒ遺伝子を含有するモジュールによりＲＯＣ１を置換す
るために（ＪＭ１株）、ｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ６テンプレートを下記のプライ
マーとともに使用した：ＲＯＣ１−Ｆ１（５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧ
ＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＴＴＣＡＡＣｃｇｇａｔｃｃｃｃｇ
ｇｇｔｔａａ−ｔｔａａ５’）［配列番号１９］およびＲＯＣ１−Ｒ１（５’−
ＡＣＣＴＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＡＴ
ＴＴＴＴｇａａｔｔｃ−ｇａｇｃｔｃｇｔｔｔａａａｃ３’）［配列番号２０］
。ＳｃＲＯＣ１遺伝子と読み枠を合わせたＧＡＬ１プロモーターおよびＨＡ３標
識を伴うＳ．ｐｏｍｂｅのｈｉｓ５＋遺伝子を染色体に組み込むために（ＪＭ５
株）、ｐＦＡ６ａ−Ｈｉｓ３ＭＸ６−ｐＧＡＬ１−ＨＡ３テンプレートを下記の
プライマーととも使用した：ＲＯＣ１−Ｆ４（５’ＡＴＡＧＡＣＧＴＡＴＧＧＧ
ＣＴＴＣＡＡＴＡＴ−ＧＴＧＣＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＡｇａａｔｔｃｇａ
ｇｃｔｃｇｔｔｔａａａｃ−３’）［配列番号２１］およびＲＯＣ１−Ｒ３（５
’ＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡ−ＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＡＣＴＴＣＧＴＴ
ＧＣＴＣＡＴｇｃａｃｔｇａｇｃａｇｃｇｔａａｔ−ｃｔｇ３’）［配列番号２
２］。ＴＲＰ１選択マーカーを伴うＨＡ３標識でＳＩＣ１のＣ末端をエピトープ
標識するために（ＪＭ７株）、ｐＦＡ６ａ−ＨＡ３−ＴＲＰ１テンプレートを下
記のプライマーととも使用した：ＳＩＣ１−Ｆ２（５’ＣＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧ
ＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＧＡＴ−ＣＡＡＧＡＧＣＡＴｃｇｇａｔｃ
ｃｃｃｇｇｇｔｔａａｔｔａａ３’）［配列番号２３］およびＳＩＣ１−Ｒ１（
５’ＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＣＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡ−ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＣＡＴＴＴＣＴｇａａｔｔｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｔａａａｃ３’）［配列番号２
４］。
【０１６８】 ＰＣＲを、Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を下記のプロトコルとともに使
用して行った。混合物１（２５μｌ）は、２．５μｌのＥｘｐａｎｄ緩衝液１、
０．８ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０μｇのＢＳＡ、および２ｍＭの各プライマーを含
有した。混合物２（１００μｌ）は、７．５μｌのＥｘｐａｎｄ緩衝液１、０．
７５μＬのＥｘｐａｎｄ酵素混合物、および０．１μｇのテンプレートＤＮＡを
含有した。この２つの混合物を一緒にし、十分に混合して、直ちにＰＣＲに供し
た：９４℃で１分間、５５℃で１分間、６８℃で１分／ｋｂの２０サイクル、そ
の後、６８℃での１０分間の伸長。少なくとも８個の反応物からのＰＣＲ産物を
まとめ、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）
で１回抽出し、エタノール沈殿させた。ＰＣＲ産物を、（ＪＭ１株およびＪＭ５
株を構築するために）二倍体ＹＥＦ４７３酵母に、あるいは（ＪＭ７株を構築す
るために）半数体ＪＭ５株に、標準的なプロトコルを使用して形質転換し、富化
培地（ＪＭ１株およびＪＭ５株についてはＹＰＤ平板、そしてＪＭ７株について
は、ＹＰ平板＋２％ラフィノースおよび２％ガラクトース）に２日間置床した。
その後、平板を適切な選択培地に２日間〜３日間にわたりレプリカ置床した。選
択された形質転換体を選択培地に２回画線培養した。相同組換えによって組み込
まれた形質転換体を同定するために、ＰＣＲを、組み込まれたモジュールにアニ
ーリングする１つのプライマーと、組換えによって変化した領域の外側領域にア
ニーリングする１つのプライマーとを使用して、リチカーゼ処理によって調製さ
れたゲノムＤＮＡに対して行った。適切なサイズのＰＣＲ産物により、相同組換
えが確認された。さらに、選択マーカーの２：２分離によってもまた、相同組換
えが確認された。
【０１６９】 実施例６：材料および方法 ユビキチンリガーゼ活性アッセイ ヒトＥ１およびマウスＥ２のＣＤＣ３４の精製、３２Ｐ−標識ユビキチンの調
製、ならびにＥ３リガーゼ複合体を含有するＲＯＣ１／ＣＵＬ１の一過性トラン
スフェクション２９３Ｔ細胞からの免疫精製に関する詳細な手順（図６）は添付
された論文（Ｔａｎら）に記載されている。非トランスフェクション細胞から免
疫沈降させる場合には、２μｇのアフィニティー精製した抗ＲＯＣ１Ｃ、抗ＣＵ
Ｌ１または抗ＡＰＣ１１を使用した。プロテインＡアガロースビーズに固定化さ
れた免疫精製ＲＯＣ１／ＣＵＬ１含有複合体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＮａＦ、１０ｎＭのオカダ酸、２
ｍＭのＡＴＰ、０．６ｍＭのＤＴＴ、１μｇの３２Ｐ−Ｕｂ、６０ｎｇのＥ１、
および３００ｎｇのマウスＣＤＣ３４タンパク質を含有するユビキチン連結反応
混合物（３０μｌ）に加えた。インキュベーションは、本明細書中に別途示され
ていない限り、３７℃において３０分間であった。その後、反応混合物を、７．
５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、１０ｍＭのＤＴＴを含む２０μｌの４ＸＬａ
ｅｍｍｌｉ負荷緩衝液に加え、３分間煮沸した。
【０１７０】 実施例７ ＲＯＣ１はすべてのカリンと直接相互作用する。 上記に記載されているようにカリンファミリーのタンパク質と相互作用する細
胞タンパク質に関する酵母ツーハイブリッドスクリーニングを使用することによ
り、ヒトＨｅＬａのｃＤＮＡライブラリーを、マウスのカリン４Ａをおとりとし
て使用してスクリーニングした。全長のマウスＣＵＬ４Ａは、７５９アミノ酸の
タンパク質をコードし、候補の１３ｑアンプリコン標的遺伝子として最近同定さ
れ、そして乳ガンサンプルにおいて高い割合で増幅または過剰発現するヒトＣＵ
Ｌ４Ａと９６％の同一性を有する（Ｃｈｅｎら、１９９８、上記）。予測される
３ｘ１０6個の形質転換体がスクリーニングされた。ヒスチジン欠乏選択培地に
おいて生育する、このスクリーニングから単離された１７クローンのうち、１１
個は、ＤＮＡ配列決定および特徴的な制限消化分析によって明らかにされるよう
に、ＲＯＣ１（カリンの調節因子）と名付けられた遺伝子に対応した。ＲＯＣ１
のＤＮＡ配列は、本明細書中において、配列番号１として、図２Ａに示されてい
る。ＣＵＬ４Ａに加えて、ＲＯＣ１はまた、酵母ツーハイブリッドアッセイによ
って明らかにされるように、カリン１、２および５と相互作用し得る（図１Ａ）
。酵母細胞においてＲＯＣ１と非常に弱く相互作用するカリン３は、その後、培
養された哺乳動物細胞においてＲＯＣ１に結合することもまた見出された（下記
参照）。従って、ＲＯＣ１は、ＣＵＬ１のみと選択的に相互作用するＳＫＰ１（
ＭｉｃｈｅｌおよびＸｉｏｎｇ、１９９８（上記）、図１Ａを参照のこと）とは
異なり、一般的なカリン相互作用タンパク質であると考えられる。
【０１７１】 哺乳動物のカリン遺伝子は、約９０ｋＤａの分子量を有する非常に関連するタ
ンパク質のファミリーをコードする。ＣＵＬ１は、ＮＨ2端のタンパク質ドメイ
ンを介してＳＫＰ１と相互作用する（ＭｉｃｈｅｌおよびＸｉｏｎｇ、１９９８
（上記）を参照のこと）。カリンとＲＯＣ１との特異的な相互作用を生じさせる
構造的基礎を明らかにするために、ＲＯＣ１とのその相互作用に必要なＣＵＬ１
の領域をマッピングした。酵母Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインと読み枠を合わせ
て融合させた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方からの一連のＣＵＬ１
欠失体を、酵母細胞においてＲＯＣ１と相互作用するその能力について試験した
。ＲＯＣ１は、ＣＵＬ１のＣ末端の５２７アミノ酸残基と相互作用するが、ＣＵ
Ｌ１のＮ末端の２４９残基とは相互作用しない（図１Ｂ）。これに対して、ＳＫ
Ｐ１は、ＣＵＬ１のＮ末端ドメインに結合する。これらの結果は、ＣＵＬ１が、
少なくとも２つのドメイン、すなわち、ＳＫＰ１と相互作用するためのＮ末端ド
メインと、ＲＯＣ１と結合するためのＣ末端ドメインとを含有することを示して
いる。そのような構造的分離は、ＲＯＣ１が、ＳＫＰ１との競合的な様式でＣＵ
Ｌ１と相互作用し得ないことを示唆している。従って、ＲＯＣ１およびＳＫＰ１
は、異なる機能を行うために、ＣＵＬ１との同じタンパク質複合体において共存
し得る。
【０１７２】 実施例８ ＲＯＣ１はＡＰＣ１１に関連するＲＩＮＧフィンガータンパク質のファミリー
を表す。
【０１７３】 ＲＯＣ１は、１２２６５Ｄの予想される分子量を有する１０８アミノ酸残基の
タンパク質をコードする（図２Ａ、配列番号２）。データベース検索により、Ｒ
ＯＣ１が、高度に進化的に保存された遺伝子として同定された。そのＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅホモログ（ＲＯＣ１−Ｓｃ）、Ｓ．ｐｏｍｂｅホモログ（ＲＯＣ
１−Ｓｐ）および植物ホモログ（ＲＯＣ１−Ａｔ）は、比較された８２アミノ酸
の領域にわたって、それぞれ、ヒトＲＯＣ１と、６７％、８８％、そして驚くほ
どの９８％のタンパク質配列同一性を有する（図２Ｃ）。データベース検索によ
り、ＲＯＣ１に非常に関連する２つのさらなる遺伝子もまた同定された：高等真
核生物におけるＲＯＣ２、およびすべての真核生物種におけるＡＰＣ１１（図２
Ｂおよび２Ｃ）。ヒトのＲＯＣ２およびＡＰＣ１１は、それぞれ、８５アミノ酸
（Ｍｒ．１０００７Ｄ）のタンパク質および８４残基（Ｍｒ．９８０５Ｄ）のタ
ンパク質をコードする。ＲＯＣ２のＤＮＡ配列は、本明細書中において、配列番
号３として、図２Ｂに示されている。そのアミノ酸配列は、本明細書中において
、配列番号４として、図２Ｂに示されている。ＲＯＣ１およびＲＯＣ２は、５１
％のタンパク質配列全体の同一性を互いに有し、そしてＡＰＣ１１と、それぞれ
、３８％および３５％の同一性を有する。このことは、ＲＯＣ１およびＲＯＣ２
が、ＡＰＣ１１に対するよりも大きく互いに密接に関連していることを示してい
る。ＲＯＣ１のように、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１の両方もまた進化時に高度に
保存されている。従って、ＲＯＣ１／ＲＯＣ２／ＡＰＣ１１により、重要な細胞
機能を行うと考えられる新しいタンパク質ファミリーが規定される。
【０１７４】 ＲＯＣ／ＡＰＣ１１のタンパク質は、ＲＩＮＧフィンガーと、トリプトファン
残基が多いこととの２つの特徴的な特徴を含む。ＲＩＮＧフィンガードメインは
、多様な機能を有する多くの真核生物タンパク質において見出されており、タン
パク質−タンパク質相互作用を媒介していると考えられる（Ｂｏｒｄｅｎ，Ｋ．
Ｌ．およびＦｒｅｅｍｏｎｔ，Ｐ．Ｓ．（１９９６）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉ
ｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６、３９５〜４０１
）。ＲＩＮＧフィンガータンパク質の大多数は、３個および４個のシステイン残
基が両側に隣接するヒスチジン残基（Ｃ3ＨＣ4）を有する高度に保存された構造
モチーフを含有する。注目すべきことに、すべての種に由来するＲＯＣ１タンパ
ク質は、最後のシステインがアスパラギン酸残基によって置換されている（図２
Ｃ）。このタンパク質ファミリーの第２の特徴は、６個の非常に保存されたトリ
プトファン残基である。ＲＯＣ１における３個のトリプトファン残基は、ＷＤ反
復に類似する酸性アミノ酸残基（Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐ）が続き、そして
タンパク質−タンパク質相互作用の媒介にも潜在的に関与していると考えられる
。
【０１７５】 ＡＰＣ１１は、核分裂後期の開始および有糸分裂からの脱出における欠陥がそ
の機能喪失により生じた酵母ＡＰＣ複合体のサブユニットとして最近同定された
（Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９８、上記）。別のＡＰＣサブユニットであるＡ
ＰＣ２が、カリンのＣ末端領域に対する限定された配列類似性を含むことが見出
された（上記）。出願人は本発明の何らかの理論にとらわれることを望まないが
、これらの観測結果は、ＲＯＣ１およびＲＯＣ２（下記参照）がともにカリンと
直接的に相互作用するという発見とともに、（１）ＡＰＣ１１はＡＰＣ２と直接
的に相互作用し得ること、（２）ＲＯＣおよびＡＰＣ１１と相互作用する領域が
、カリンタンパク質およびＡＰＣ２タンパク質における保存されたＣ末端部分に
存在し得ること、および（３）ＲＯＣタンパク質は、ユビキチンに依存するタン
パク質分解を調節する際に機能し得ることを示唆している。
【０１７６】 実施例９ ＲＯＣ１とカリンのインビボでの会合 ＲＯＣ１とカリンタンパク質の間の相互作用を確認するために、Ｓａｏｓ−２
細胞を、上記に示したように、ＣＵＬ１または他の個々のｍｙｃ−エピトープタ
グカリンと共に、ＨＡ−エピトープタグヒトＲＯＣ１（ＨＡ−ＲＯＣ１）の発現
を指示するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、
［35Ｓ］−メチオニンで代謝的に標識し、細胞溶解液を、抗ＨＡ、抗ＣＵＬ１ま
たは抗ｍｙｃ抗体で相互に免疫沈降させた（図３Ａ）。ｍｙｃ抗体もＲＯＣ１と
交差反応せず（例えば、レーン２および３、図３Ａ）、ＨＡ抗体もカリンと交差
反応しなかった（レーン１２、図３Ａ、およびまた図４Ｄのレーン６〜９）。全
５つのカリンを、ＨＡ抗体によりＲＯＣ１と共沈降させた。相互免疫沈降におい
て、ＨＡ−ＲＯＣ１タンパク質は、抗ｍｙｃ−ｍＣＵＬ４Ａにおいてｍｙｃ抗体
により容易に検出されたが、抗ｍｙｃ−カリン２、３および５免疫複合体では明
らかではなかった。非タグＣＵＬ１は、ｍｙｃタグカリンと類似の効率で共トラ
ンスフェクトＲＯＣ１と複合体を形成し（レーン１、図３Ａ）、ｍｙｃエピトー
プタギングまたはｍｙｃ抗体の交差反応性により引き起こされ得るＲＯＣ１とカ
リンタンパク質の間の任意の人為現象的結合の可能性を排除する。ＲＯＣ１−カ
リン会合に加えて、実体の不明な数個の細胞タンパク質が、ＲＯＣ１またはカリ
ンタンパク質（これは、他のカリンではなくＣＵＬ１が共発現される場合にＨＡ
−ＲＯＣ１と共沈降する１３０ｋＤａ細胞タンパク質（ｐ１３０）を含む）と共
に沈降した。トランスフェクト細胞でのＲＯＣ１−カリン会合は、連続的免疫沈
降およびイムノブロット（ＩＰ−ウェスタン）により確認されている。カリン１
、２、４Ａおよび５は、抗ＨＡ免疫複合体において容易に検出された（データは
示していない）。
【０１７７】 より生理学的条件下でインビボでのＲＯＣ１−カリン会合の証拠を得るために
、ＲＯＣ１に特異的なウサギポリクローナル抗体を産生した。この抗体は、イン
ビトロで翻訳されたタンパク質の使用により決定したところ、ＲＯＣ１およびＲ
ＯＣ１−ＣＵＬ１複合体の両方を沈降できる（レーン１および２、図３Ｂ）。代
謝標識ＨｅＬａおよびＳａｏｓ−２細胞から、抗ＲＯＣ１抗体が、約１４ｋＤａ
のタンパク質を沈降させた（レーン３および５）。この１４ｋＤａタンパク質は
、インビトロで産生されたＲＯＣ１との共移動により、および抗原ペプチドを使
用した競合により判断したところ、ＲＯＣ１に対応する（レーン４および６）。
ＲＯＣ１に加えて、７５ないし２００ｋＤａの多くの細胞タンパク質が、ＲＯＣ
１と共沈降した。抗ＲＯＣ１免疫複合体におけるこれらのタンパク質の存在は、
競合抗原ペプチドにより遮断され、これは、これらのタンパク質が、ＲＯＣ１と
特異的に会合し得ることを示唆する。
【０１７８】 この観察により、インビボのＲＯＣ１は、多くの異なるタンパク質と会合し得
ることが示唆され、結論は、全てのカリンタンパク質とのその広い相互作用と一
致する。これを直接確認するために、７０ないし１２０ｋＤａの分子量の数個の
タンパク質が、ＲＯＣ１免疫複合体から免疫精製され（図３Ｂで「カリン」とし
て示す）、その配列はタンパク質ミクロシークエンスにより決定された。少なく
とも４つのカリンタンパク質が、これまでこの解析から同定され；カリン１また
はカリン２（ＫＤＶＦＱＫ、［配列番号２５］ヒトＣＵＬ１の４５９〜４６４残
基に対応、データベース目録ＡＦ０６２５３６、またはヒトＣＵＬ２の４２８〜
４３３、目録Ｑ１３６１７）、カリン２（ＫＩＦＬＥＮＨＶＲＨＬＨ、［配列番
号２６］６２〜７３残基、目録Ｑ１３６１７）、カリン３（ＫＤＶＦＥＲＹＹ、
４２５〜４３２残基［配列番号２７］およびＫＶＹＴＹＶＡ、［配列番号２８］
７６２〜７６８残基、目録ＡＦ０６２５３７）、およびカリン４Ａまたは４Ｂ（
ＫＲＩＥＳＬＩＤＲＤＹ、［配列番号２９］ヒトＣＵＬ４Ａの３９６〜４０６残
基、目録Ｑ１３６１９、またはヒトＣＵＬ４Ｂの２６３〜２７３残基、目録Ｑ１
３６２０）。ＲＯＣ１と、これらの多くのカリンの間の会合は、０．１％ＳＤＳ
を含む緩衝液による免疫複合体の洗浄により破壊されず（データは示していない
）、これは、ＲＯＣ１−カリン会合は極めて安定であることを示す。
【０１７９】 過剰発現なくインビボでのＲＯＣ１−カリン会合をさらに実証するために、Ｈ
ｅＬａ細胞溶解液を、ＲＯＣ１、ＣＵＬ１およびＣＵＬ２に対する抗体で免疫沈
降させ、沈降物をウェスタンブロットにより解析した。図３Ｃに示したように、
ＣＵＬ１（レーン３）およびＣＵＬ２（レーン７）の両方が、ＲＯＣ１免疫複合
体において容易に検出され、競合ＲＯＣ１抗原ペプチドにより特異的に遮断され
た。相反的に、ＲＯＣ１は、ＣＵＬ１（レーン１）およびＣＵＬ２（レーン５）
複合体の両方で検出された（下のパネル、図３Ｃ）。ＩＰ−ウェスタンによるＲ
ＯＣ１と他のカリンの間の会合の実証は、現在のところ他のカリンに対する抗体
がないことから実施しなかった。
【０１８０】 実施例１０ ＲＯＣ２と、ＡＰＣ１１と、カリンファミリータンパク質の間の選択的相互作
用 本明細書に記載した酵母二重ハイブリッドアッセイおよびインビボ結合アッセ
イを使用して、ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１は、ＲＯＣ１のように、カリンと相互
作用するかどうかを決定した。全長ヒトＲＯＣ２またはＡＰＣ１１を、酵母Ｇａ
ｌ４ＤＮＡ活性化ドメインとインフレーム融合し、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン
に融合した個々のカリンと共に酵母細胞に共形質転換した。ＲＯＣ１とほぼ同じ
ように、ＲＯＣ２は、カリン１、２、４Ａおよび５と強く相互作用し（図４Ａ）
、これは、ＲＯＣ２も一般的なカリン相互作用タンパク質であることを示す。対
照的に、ＡＰＣ１１は、カリン５のみと相互作用したが、他のカリンとは相互作
用しなかった（図４Ｂ）。
【０１８１】 ＲＯＣ２とＡＰＣ１１の間のカリンとの相互作用をさらに評価するために、Ｓ
ａｏｓ−２細胞を、ＨＡタグヒトＲＯＣ２（ＨＡ−ＲＯＣ２）またはＡＰＣ１１
（ＨＡ−ＡＰＣ１１）の発現を指示するプラスミドで、非タグＣＵＬｌまたは個
々のｍｙｃタグカリンと共にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を［35 Ｓ］−メチオニンで代謝標識し、細胞溶解液を、抗ＨＡ、抗ＣＵＬ１または抗
ｍｙｃ抗体と共に免疫沈降させた（図４Ｃおよび４Ｄ）。トランスフェクトＨＡ
−ＲＯＣ２タンパク質は、二重線として移動する（レーン６〜１０、図４Ｃ）。
ｍｙｃ抗体は、どの形のＲＯＣ２とも相互作用しない（例えばレーン５と６を比
較）。全５つのカリンが、ＨＡ抗体によりＲＯＣ２と共沈降した（レーン６〜１
０）。相反的に、ＲＯＣ２（優先的にはより速く移動している形）も、カリン２
、３および４免疫複合体に検出された（レーン２〜４）。
【０１８２】 対照的に、およびカリン５を除いて、ＡＰＣ１１およびカリンは、相反的沈降
における互いの相互作用は検出されなかった（レーン１〜１０、図４Ｄ）。カリ
ン５は、弱いが、再現的に、ＡＰＣ１１免疫複合体に検出された（レーン１０）
。全６つの哺乳動物カリンの中で、ＣＵＬ５は、カリンファミリーの最も異なる
メンバーであり、ＡＰＣ２と最も高い配列類似性を含む。カリンに加えて、約１
３０ｋＤａのバンドを含む数個の細胞タンパク質が、他のカリンではなくＣＵＬ
５が共発現された場合にＲＯＣ２複合体に検出された（図４Ｃ、レーン５および
１０）。ｐ１３０は、ＣＵＬ５およびＲＯＣ１（図３Ａのレーン１１）またはＡ
ＰＣ１１（図４Ｄのレーン１０）で共トランスフェクトした細胞では検出されな
かった。このＲＯＣ２−ＣＵＬ５会合ｐ１３０が、ＲＯＣ１―ＣＵＬ１―会合ｐ
１３０に関連しているかどうか（図３Ａ、レーン７）、そして、これらのタンパ
ク質がカリン−ＲＯＣ複合体で果たし得る機能的役割は決定されていない。カリ
ン２、３および４免疫複合体は、ＡＰＣ１１ではなく、ＲＯＣ２で共トランスフ
ェクトした細胞から沈降した場合に、約１７ｋＤａの細胞タンパク質を含んだ。
この１７ｋＤａのポリペプチドの存在は、ＲＯＣ２をほとんど含まない、ＣＵＬ
１またはＣＵＬ５免疫複合体では明らかでなく、これは、カリン２〜４とのその
会合は、ＲＯＣ２とのカリンの会合と関連するか、そして、実際にそれに依存し
得るか、またはそれにより促進され得ることを示唆する。
【０１８３】 実施例１１ ＲＯＣ１およびＲＯＣ２はＡＰＣ２と相互作用しない ＡＰＣ１１を、カリンに限定された配列類似性を含む、別のＡＰＣサブユニッ
トであるＡＰＣ２と共精製した（Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９８；Ｙｕら、１
９９８ａ、上記）。二重ハイブリッドアッセイにより試験すると、ＡＰＣ１１は
、酵母細胞でＡＰＣ２と相互作用したが、ＲＯＣ１もＲＯＣ２も相互作用しなか
った（図４Ｅ）。哺乳動物細胞での、ＡＰＣ２と、これらの３つの密接に関連し
たＲＩＮＧフィンガータンパク質の間の相互作用を評価するために、ＨｅＬａ細
胞を、ＨＡ−エピトープタグＲＯＣ１、ＲＯＣ２またはＡＰＣ１１と共に、ｍｙ
ｃエピトープタグＡＰＣ２の発現を指示するプラスミドでトランスフェクトし、
そのそれぞれの結合をインビボで決定した。酵母二重ハイブリッドアッセイと一
致して、ＡＰＣ２およびＡＰＣ１１は、相反的に、それぞれ、ＡＰＣ１１および
ＡＰＣ２免疫複合体で検出された（データは示していない）。弱い結合が、相反
的に発現されたＲＯＣ１とＡＰＣ２の間に検出されたが、過剰産生の場合でさえ
、ＲＯＣ２は、ＡＰＣ２と相互作用するとは認められなかった（データは示して
いない）。
【０１８４】 実施例１２ ＲＯＣ１ｐタンパク質の減少は、ｃｄｃ５３−、ｃｄｃ３４−、およびｃｄｃ
４−類似表現型を引き起こす 酵母ゲノムは、１つのＲＯＣ遺伝子であるＳｃ−ＲＯＣ１（ＯＲＦ ＹＯＬ１
３３ｗ）を含み、これは、ヒトＲＯＣ１と６５％の配列同一性を共有し（図２Ｃ
）、ＲＯＣファミリータンパク質のインビボでの機能を決定するための、より簡
単でより遺伝子的に容易なシステムを提供する。ＳｃＲＯＣ１遺伝子を、カナマ
イシン耐性モジュールでそれと置換することにより欠失させた結果をＰＣＲ相同
的組換えにより決定した。１コピーのＳｃＲＯＣ１を二倍体で置換し、ヘテロ接
合性酵母を、胞子形成および四分染色体解体にかけた（図５Ａ）。２：２の分離
が、完全培地上で解体された２０個の四分染色体中１９個に観察され、全ての生
存可能なコロニーを、選択培地上にレプリカプレーティングした場合にカナマイ
シン感受性であった（データは示していない）。生存不可能な胞子の顕微鏡検査
時に、発芽およびミクロコロニーを形成する細胞分裂の数の限定が観察され、Ｒ
ＯＣ１ｐの「母体」供給を反映する。従って、ＳｃＲＯＣ１は、酵母生存に必須
な遺伝子のようである。
【０１８５】 ＳｃＲＯＣ１は、ガラクトース誘導性のグルコース抑制ＧＡＬ１プロモーター
の制御下にある条件酵母株を創製した。ＨＡ３タグを、ＳｃＲＯＣ１遺伝子とイ
ンフレーム融合し、ＲＯＣ１タンパク質発現レベルをモニタリングした。形質転
換体を胞子形成させ、解体し（２：２の分離が観察された）、ＧＡＬ−ＨＡ３−
ＳｃＲＣＯ１を含むハプロイド酵母を単離し、ＰＣＲ解析（データは示していな
い）およびタンパク質発現により確認した（図５Ｃ）。ＧＡＬ１プロモーターか
らの、高い発現レベルのＨＡ３−ＲＯＣ１ｐ（図５Ｂ）または非タグＲＯＣ１ｐ
（データは示していない）は、酵母増殖に検出可能な効果を及ぼさなかった。グ
ルコースに切り換えた後のＳｃＲＯＣ１発現の抑止により、ＲＯＣ１ｐタンパク
質は迅速に減少し（図５Ｃ）、これは、過剰発現ＲＯＣ１ｐは短い半減期（〜ｔ1/2 ＜２０分間）を有する不安定なタンパク質であることを示唆する。しかし、
グルコースの存在下での酵母細胞の長期培養は、全てのＲＯＣ１タンパク質を完
全に除去しなかった。僅かに検出可能な量のＲＯＣ１ｐが、グルコースの存在下
で培養した場合に２４時間まで発現され、これは、ＲＯＣ１ｐは、おそらくＧＡ
Ｌ１プロモーターの漏出の結果として、低いレベルで連続的に発現され得ること
を示す（図５Ｃ）。ＳｃＲＯＣ１発現の減少により、酵母は、９時間後に変異表
現型を示し始め、２４時間までに１つの核を含む、複数の伸長した発芽した酵母
個体群が蓄積した（図５Ｂ）。
【０１８６】 ＲＯＣ１ｐ欠失誘導表現型は、ＣＤＣ５３、ＣＤＣ４、およびＣＤＣ３４遺伝
子の温度感受性変異により引き起こされた表現型と区別できない（Ｍａｔｈｉａ
ｓら、１９９６、上記）。この結果により、ＳｃＲＯＣ１遺伝子は、ＣＤＫ阻害
剤ｐ４０Ｓｉｃ１ｐなどの細胞周期Ｇ１期中のユビキチンにより媒介されるタン
パク質のタンパク質分解の制御において、これらの遺伝子と同じ経路に関与する
ことが示唆される。この結論を支持する証拠を提供するために、酵母ＲＯＣ／Ａ
ＰＣ１１ファミリーは、そのヒト相同体のように、酵母カリン／ＣＤＣ５３ファ
ミリーと直接相互作用し得るかどうかを酵母二重ハイブリッド系により決定した
。酵母ゲノムは、４つのカリンメンバー、ＣＤＣ５３、ＣＵＬ−Ｂ（ＯＲＦ Ｙ
ＧＲ００３ｗ）、ＣＵＬ−Ｃ（ＯＲＦ ＹＪＬ０４７ｃ）およびＡＰＣ２を含む
。各遺伝子を、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインとインフレーム融合し、ＧＡＬ４活
性化ドメインとインフレーム融合したＳｃＲＯＣ１またはＳｃＡＰＣ１１と共形
質転換した。ＳｃＡＰＣ２は、エサ（ｂａｉｔ）として自己活性化し、ＧＡＬ４
活性化ドメインとインフレーム融合し、ＤＮＡ結合ドメインとインフレーム融合
したＳｃＲＯＣ１を用いて試験した。ＳｃＲＯＣ１は、ヒスチジンレポーター遺
伝子の活性化により決定したところ、最も隔たって関連したＡＰＣ２を含む、全
４つの酵母カリン遺伝子と相互作用した。これに対し、ＳｃＡＰＣ１１はＣＵＬ
−Ｃのみと弱く相互作用したが、ＣＤＣ５３またはＣＵＬ−Ｂとは相互作用しな
かった（図５Ｄ）。ＳｃＡＰＣ１１とＳｃＡＰＣ２の相互作用は、両方がエサ（
ｂａｉｔ）として自己活性化しているために試験できなかった。従って、ヒトＲ
ＯＣタンパク質と同様、酵母ＲＯＣ１も、カリンファミリータンパク質の全ての
メンバーと共通して相互作用する。
【０１８７】 実施例１３ ＲＯＣ１ｐ欠損の機能的救出 ＲＯＣ１ｐの欠失により誘導された条件表現型を利用して、ＲＯＣファミリー
タンパク質の機能的保存および特異性を決定した。ＲＯＣ１ｐ欠失により受ける
多出芽表現型は、酵母ＲＯＣ１の発現により完全に救出できるが、ベクター対照
では救出できず（図５Ｅ）、これは、ＲＯＣ１ｐのレベルは、多出芽表現型を引
き起こす律速因子であることを確認する。ヒトＲＯＣ１およびＲＯＣ２の両方の
異所性発現も、ＳｃＲＯＣ１ｐ欠失の表現型を救出したが、表現型を依然として
示している少数の細胞により実証されたところ、酵母ＲＯＣ１よりも効率的では
なかった。これは、ＲＯＣ遺伝子ファミリーの進化的保存を示し、ユビキチン媒
介タンパク質分解におけるヒトＲＯＣ１の機能を支持するインビボでの証拠を提
供する。一方、酵母ＡＰＣ１１の異所的発現は、ＲＯＣ１ｐのレベルの減少によ
り引き起こされた表現型を救出せず（図５Ｅ）、これは、ＲＯＣ／ＡＰＣ１１フ
ァミリーのメンバー間の機能的特異性を実証する。
【０１８８】 実施例１４ ＲＯＣ１ｐは、ＳＩＣ１ｐ分解に必要である ＳｃＲＯＣ１がタンパク質分解の調節に役割を果たしているかどうかについて
の決定は、ＲＯＣ１ｐ欠失細胞とｃｄｃ５３変異細胞の間の表現型類似性および
ＳｃＲＯＣ１とＣＤＣ５３の相互作用に基づいた。ＣＤＣ５３経路の重要な基質
は、Ｇ１ ＣＤＫ阻害剤のｐ４０Ｓｉｃｌｐであり、これは酵母ＳＣＦによるユ
ビキチン媒介分解に標的化される（Ｓｋｏｗｙｒａら、１９９７；Ｆｅｌｄｍａ
ｎら、１９９７、上記）。Ｓｉｃ１ｐは、ＳｃＲＯＣ１ｐの欠失した酵母で安定
化されるかどうかを決定するために、酵母株を、ＰＣＲ相同的組換えにより創製
し、ここでＧＡＬ−ＨＡ３−ＳｃＲＯＣ１酵母のＳＩＣ１遺伝子はＨＡ３でタグ
されたエピトープであった。レベルの低下したＲＯＣ１ｐを発現しているが、依
然として野生型表現型を示している、低濃度のガラクトース（０．０５％プラス
２％ラフィノース）中で増殖した酵母細胞を、ＲＯＣ１ｐの発現を欠失させるた
めに、様々な期間の間、グルコース培地に切り換えた。多出芽表現型の外見は、
顕微鏡検査により確認された。全細胞溶解液を、各時間点から集めたサンプルか
ら調製し、ウェスタン解析にかけた。ＲＯＣ１ｐタンパク質は欠失し、９時間の
時点でグルコース培地中で培養した後にほぼ検出不可能となった（データは示し
ていない）。複数の伸長した芽の外見と緊密に関連して、Ｓｉｃ１タンパク質が
、グルコース中１４時間培養後に蓄積し、実験期間中、高いレベルで維持した（
図５Ｆ）。抗アクチン抗体を使用して、様々な時間点の、等価なタンパク質添加
を確認した（図５Ｆ）。これらの結果は、ＲＯＣ１が、ユビキチン媒介タンパク
質分解に機能するというインビボの証拠を提供する。
【０１８９】 実施例１５ ＲＯＣ１は、カリンユビキチンリガーゼ活性の重要なサブユニットである ＣＤＣ５３は、ヒトＣＵＬ１の最も近い酵母相同体であるが、これは昆虫細胞
で、Ｅ２ＣＤＣ３４、ＳＫＰ１およびＦボックスタンパク質（ＳＣＦ複合体）と
、機能的Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体に会合し、リン酸化基質のユビキチン化
を触媒する（Ｓｋｏｗｙｒａら、１９９７；Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９７、上記
）。しかし、昆虫細胞に会合した、ヒトＣＵＬ１、ＳＫＰ１およびＳＫＰ２を含
むタンパク質複合体は、ほとんどユビキチンリガーゼ活性を含まないことが判明
したが、ＨｅＬａ細胞溶解液とインキュベートした後に活性になり（Ｌｙａｐｉ
ｎａら、１９９８、上記）、追加の律速成分（群）がカリン依存性ユビキチンリ
ガーゼ活性に必要である可能性が生じる。ＲＯＣ１が、ユビキチンリガーゼ活性
のサブユニットとして生化学的に機能し得るかを決定するために、ＲＯＣ１およ
びＣＵＬ１免疫複合体のユビキチンライゲーション活性を解析した。２９３Ｔ細
胞を、ＨＡエピトープタグＲＯＣ１（ＨＡ−ＲＯＣ１）およびカリン１を発現す
るプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクトし、ＲＯＣ１−ＣＵＬ１複合体
を、抗ＨＡ抗体を使用した免疫沈降により回収した。機能的ＲＯＣ１−およびカ
リン−１会合ユビキチンリガーゼ複合体の回収を容易にするために、以前にＣＵ
Ｌ１と相互作用することが実証されている、Ｆ−ボックスタンパク質ＳＫＰ２を
、トランスフェクションに含めた。ＣＵＬ１とＳＫＰ２の結合を媒介するＳＫＰ
１は、細胞で高レベルで発現され、トランスフェクションに含まれなかった。Ｒ
ＯＣ１およびＣＵＬ１のユビキチンリガーゼ活性を、プロテインＡアガロースビ
ーズ上に固定したＨＡ−ＲＯＣ１−ＣＵＬ１免疫複合体を、精製ヒトＥ１、マウ
スＥ２ＣＤＣ３４、ＡＴＰおよび32Ｐ標識油ユビキチン（Ｕｂ）と共にインキュ
ベートすることにより測定した。インキュベート後、反応を、ＳＤＳおよび還元
剤の存在下でサンプルを煮沸することにより終結し、混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
、次いでオートラジオグラフィーにより分解した。32Ｐ−Ｕｂの、ユビキチン化
タンパク質の特徴である共有結合高分子量スメアへの取込みにより可視化した、
明らかで時間経過依存的ユビキチンライゲーションが、Ｅ１およびＥ２ ＣＤＣ
３４の両方をＨＡ−ＲＯＣ１／ＣＵＬ１／ＳＫＰ２免疫複合体に加えた場合には
検出されたが（レーン１、レーン４〜９、図６Ａ）、Ｅ１（レーン２）もＥ２（
レーン３）も削除された場合には検出されず、これは、Ｅ１およびＥ２依存的ユ
ビキチンライゲーションを示す。対照として、ＨＡタグタンパク質を用いずにト
ランスフェクトした細胞から得られた抗ＨＡ沈降物は、Ｅ１またはＥ２連結モノ
ユビキチンコンジュゲートのみを示した（レーン５および８、図６Ｂ）。観察さ
れたタンパク質ラダーは、１つの３２Ｐ−Ｕｂ（組換えタンパク質の形で〜１２
ｋＤａ）の増加を反映し、これはユビキチン化反応の特徴である。反応混合物の
ＤＴＴ、ＳＤＳおよび煮沸による処理により、Ｕｂ−Ｅ１（３２Ｐ−Ｕｂ−Ｅ１
として示す、図６）およびＵｂ−ＣＤＣ３４（３２Ｐ−Ｕｂ−ＣＤＣ３４として
示す）コンジュゲートを有意に減少したが、完全に消失できなかった。外来性基
質タンパク質は全く反応液に加えなかった。それ故、高分子量ユビキチン化タン
パク質の蓄積は、ＨＡ−ＲＯＣ１複合体と共沈降したＳＫＰ２−標的化基質（群
）のユビキチン化またはユビキチンタンパク質のライゲーションから生じ得る。
ユビキチン化反応からの分子量増加の注意深い観察により、ＲＯＣ１−ＣＵＬ１
複合体は、基質に独立的なユビキチンライゲーションを触媒でき、全てではなく
ても大半の高分子量が、付着した基質を有さない一連のユビキチン分子からなる
ポリユビキチン鎖に対応することが示される（データは示していない）。
【０１９０】 ＨＡ−ＲＯＣ１免疫複合体でのユビキチンリガーゼ活性に対する個々のタンパ
ク質の寄与を決定するために、一連の「ドロップアウト」トランスフェクション
を実施した。基質タンパク質（群）をＣＵＬ１におそらくもたらすＦ−ボックス
タンパク質のＳＫＰ２の削除により、ユビキチンリガーゼ活性は僅かしか減少し
なかった（レーン２と３を比較、図６Ｂ）。ＨＡ−ＲＯＣ１複合体のユビキチン
リガーゼ活性に対する、トランスフェクトＳＫＰ２のこのような必須ではない役
割は、一部には、２９３細胞での内因性ＳＫＰ２の存在に起因し得るか（Ｚｈａ
ｎｇ，Ｈら（１９９５）Ｃｅｌｌ ８２、９１５〜９２５）、または、ユビキチ
ン分子の基質独立的ライゲーションを示す。しかし、ＣＵＬ１の削除は、ＲＯＣ
１免疫複合体のユビキチンリガーゼ活性を重度に低下させた（レーン４）。相反
的に、ＣＵＬ１複合体からのＲＯＣ１の削除は、ＲＯＣ１複合体からのＣＵＬ１
の削除のように、ユビキチンリガーゼ活性を有意に低下させた（レーン６と７を
比較）。ＲＯＣ１での共トランスフェクションを実施しなければＣＵＬ１免疫複
合体のリガーゼ活性レベルは低く、内因性ＲＯＣ１タンパク質から生じるようで
ある。これらの結果により、両方のタンパク質の発現時のＲＯＣ１−およびＣＵ
Ｌ１−関連ユビキチンリガーゼ活性の内部依存性が示され、これは、ＲＯＣ１お
よびＣＵＬｌはＥ３ユビキチンリガーゼの内部分として作用することを示唆する
。
【０１９１】 実施例１６ ＲＯＣ１およびＣＵＬ１のインビボでのユビキチンリガーゼ活性 ＲＯＣ１関連ユビキチンリガーゼ活性をインビボで直接実証するために、２９
３ＴまたはＨｅＬａ細胞からのＲＯＣ１およびＣＵＬ１複合体を、タンパク質に
特異的なアフィニティ精製抗体を使用して免疫沈降し、ユビキチンライゲーショ
ンを触媒する能力についてアッセイした（図６Ｃ）。トランスフェクト細胞から
沈降したＨＡ−ＲＯＣ１免疫複合体のように、ＨｅＬａ（レーン３）および２９
３Ｔ細胞（レーン７）の両方から得られたＲＯＣ１免疫複合体は、Ｅ１（レーン
１）およびＥ２ ＣＤＣ３４（レーン２）依存的に、高分子量への32Ｐ標識ユビ
キチンの取り込みを活発に触媒した。同様に、ＣＵＬ１複合体はまた、高レベル
のユビキチンリガーゼ活性を示した（レーン６）。これに対し、抗ＡＰＣ１１複
合体は、Ｅ１およびＥ２ ＣＤＣ３４（レーン５）と同様にインキュベートした
場合に、バックグラウンドレベルのリガーゼ活性しか示さなかった。抗ＡＰＣ１
１抗体は、ＡＰＣ１１、並びに、ＡＰＣ複合体の他の成分に対応するようである
、多くの追加の細胞タンパク質を沈降できることが実証された（データは示して
いない）。これらの結果は、ＣＵＬ１−ＲＯＣ１二量体複合体の触媒的役割を実
証したインビトロの生化学的解析と共に（Ｔａｎら、添付論文）、ＲＯＣ１が、
カリン関連ユビキチンリガーゼの必須サブユニットであることを示す。
【０１９２】 実施例１７ 実験結果の要約 本明細書に提供した４系列の証拠により、ＲＯＣファミリータンパク質が、カ
リンユビキチンリガーゼの必須サブユニットとして機能することが実証される。
第一に、ＲＯＣ１およびＲＯＣ２は両方共、インビトロおよびインビボの両方で
数個の異なるアッセイにより決定したところ、我々が調べた５つ全ての哺乳動物
カリンと直接相互作用する（図１および３）。慣用的な生化学的精製により、Ｃ
ＵＬ１ユビキチンリガーゼ活性の化学両論的関連サブユニットとしてＲＯＣ１を
さらに同定した（Ｔａｎら、添付論文）。この二成分相互作用の一般性をさらに
強調するのは、カリン関連タンパク質のＡＰＣ２とＲＯＣ相同タンパク質のＡＰ
Ｃとの間のＡＰＣ Ｅ３リガーゼの平行的関連である（図４）。同定された１２
個以上のサブユニットの中で、ＲＯＣ／ＡＰＣ１１およびカリン／ＡＰＣ２が、
ＡＰＣとＳＣＦ複合体の間に共通な僅か２つのタンパク質である。
【０１９３】 第二に、上記に示した実施例は、ＲＯＣ１が、インビボでカリン機能に必須で
あることを実証する。酵母ＲＯＣ１は、その欠失により、ｃｄｃ５３、ｃｄｃ３
４およびｃｄｃ４変異により引き起こされたものから識別不可能な複数の伸長し
た芽の表現型が生じ、ｃｄｃ５３、ｃｄｃ３４およびｃｄｃ４変異体のようなＣ
ＤＫ阻害剤Ｓｉｃ１の蓄積をもたらす、必須遺伝子である。同様に、ＲＯＣ関連
ＡＰＣ１１は、ＡＰＣ機能の必須サブユニットであることが示された。酵母での
ＡＰＣ１１機能の消失により、ＡＰＣ基質は蓄積し、分裂中期停止を引き起こし
た（Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９８、上記）。
【０１９４】 第三に、上記の実施例により、ＲＯＣ１は、カリンユビキチンリガーゼの必須
サブユニットであることが示される。インビボから沈降したＲＯＣ１およびカリ
ン１免疫複合体は、ユビキチンのライゲーションを触媒し、ポリユビキチン鎖を
形成した。ＲＯＣ１の削除により、ＣＵＬ１免疫複合体からのユビキチンリガー
ゼ活性は劇的に減少した（図６）。
【０１９５】 最後に、Ｅ１およびＥ２に特に依存的なインビトロＲＯＣ１およびＣＵＬ１ユ
ビキチンリガーゼ活性が復元された（Ｔａｎら、添付論文）。
【０１９６】 本明細書に示した知見の１つの分枝は、ＡＰＣ１１（ＲＯＣ１相同体）および
ＡＰＣ２（カリンに相同）は、ＡＰＣにおけるリガーゼであるということである
。細胞周期の分裂中期中のユビキチン媒介タンパク質分解に関する徹底的な研究
により、大半の分裂中期調節タンパク質を分解するのに必要な１つの主要なＥ３
ユビキチンリガーゼとしてＡＰＣが同定された。近年、酵母ＣＤＣ５３は、Ｓ期
移行を調節する主要なＥ３リガーゼ活性として同定された。大半のカリンのイン
ビボ機能は依然として決定されていないが、細胞周期制御に関連していない他の
機能も実施し得る。ＡＰＣおよびＳＣＦ複合体の両方のユビキチンリガーゼコア
は構造的類似性を共有しているが、１つはＡＰＣ１１およびＡＰＣ２を含み、他
はＣＵＬ１およびＲＯＣ１を含み、２つのリガーゼは明らかな特異性を示す。両
方のＲＯＣタンパク質が共通して全てのカリンと相互作用するが、ＡＰＣ１１は
特異的にＡＰＣ２と相互作用する。この特異性への機能的支持は、ヒトＲＯＣ１
およびＲＯＣ２の両方が、酵母ＲＯＣ１の欠失により引き起こされた表現型を機
能的に救出できるが、酵母ＡＰＣ１１はできないという知見に由来する（図５）
。従って、ＲＯＣ−カリンおよびＡＰＣ１１−ＡＰＣ２は、それぞれ、分裂間期
および分裂中期中に別々に機能する。さらに、高等真核生物には２つの異なるＲ
ＯＣタンパク質が存在し、両方が、カリンファミリーの全メンバーと直接相互作
用できる。異なるカリンとのその組合せ的相互作用は、潜在的に大量のユビキチ
ンリガーゼを示し、各々が、ＳＣＦおよびＡＰＣ複合体の場合のような特異的細
胞経路に関与し得、おそらく分裂間期調節の複雑性を反映する。
【０１９７】 前記は本発明の説明であり、それを限定するものとは捉えない。本発明は、以
下の特許請求の範囲により定義され、その特許請求の範囲の均等物が本明細書に
含まれる。
【０１９８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Xiong, Yue Ohta, Tomohiko <120> Isolation of ROC1 and ROC2 <130> 13-573 <140> PCT/US00/08592 <141> 2000-03-31 <150> US 60/127,261 <151> 1999-03-31 <150> US 60/166,927 <151> 1999-11-22 <160> 41 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 1 atg gcg gca gcg atg gat gtg gat acc ccg agc ggc acc aac agc ggc 48 Met Ala Ala Ala Met Asp Val Asp Thr Pro Ser Gly Thr Asn Ser Gly 1 5 10 15 gcg ggc aag aag cgc ttt gaa gtg aaa aag tgg aat gca gta gcc ctc 96 Ala Gly Lys Lys Arg Phe Glu Val Lys Lys Trp Asn Ala Val Ala Leu 20 25 30 tgg gcc tgg gat att gtg gtt gat aac tgt gcc atc tgc agg aac cac 144 Trp Ala Trp Asp Ile Val Val Asp Asn Cys Ala Ile Cys Arg Asn His 35 40 45 att atg gat ctt tgc ata gaa tgt caa gct aac cag gcg tcc gct act 192 Ile Met Asp Leu Cys Ile Glu Cys Gln Ala Asn Gln Ala Ser Ala Thr 50 55 60 tca gaa gag tgt act gtc gca tgg gga gtc tgt aac cat gct ttt cac 240 Ser Glu Glu Cys Thr Val Ala Trp Gly Val Cys Asn 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Cys Thr 35 40 45 Val Ala Trp Gly Thr Cys Asn His Ala Phe His Phe His Cys Ile Ser 50 55 60 Arg Trp Leu Asn Thr Arg Asn Val Cys Pro Leu Asp Asn Arg Glu Trp 65 70 75 80 Glu Phe <210> 35 <211> 82 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <221> SIMILAR <222> (1)..(82) <223> Partial Protein Sequence <400> 35 Phe Glu Ile Lys Lys Trp Thr Ala Val Ala Phe Trp Ser Trp Asp Ile 1 5 10 15 Ala Val Asp Asn Cys Ala Ile Cys Arg Asn His Ile Met Glu Pro Cys 20 25 30 Ile Glu Cys Gln Pro Lys Ala Met Thr Asp Thr Asp Asn Glu Cys Val 35 40 45 Ala Ala Trp Gly Val Cys Asn His Ala Phe His Leu His Cys Ile Asn 50 55 60 Lys Trp Ile Lys Thr Arg Asp Ala Cys Pro Leu Asp Asn Gln Pro Trp 65 70 75 80 Gln Leu <210> 36 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <221> SIMILAR <222> (1)..(79) <223> Partial Protein Sequence <400> 36 Phe Ser Leu Lys Lys Trp Asn Ala Val Ala Met Trp Ser Trp Asp Val 1 5 10 15 Glu Cys Asp Thr Cys Ala Ile Cys Arg Val Gln Val Met Asp Ala Cys 20 25 30 Leu Arg Cys Gln Ala Glu Asn Lys Gln Glu Asp Cys Val Val Val Trp 35 40 45 Gly Glu Cys Asn His Ser Phe His Asn Cys Cys Met Ser Leu Trp Val 50 55 60 Lys Gln Asn Asn Arg Cys Pro Leu Cys Gln Gln Asp Trp Val Val 65 70 75 <210> 37 <211> 78 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <221> SIMILAR <222> (1)..(78) <223> Partial Protein Sequence <400> 37 Phe Val Leu Lys Lys Trp Asn Ala Leu Ala Val Trp Ala Trp Asp Val 1 5 10 15 Glu Cys Asp Thr Cys Ala Ile Cys Arg Val His Leu Met Glu Glu Cys 20 25 30 Leu Arg Cys Gln Ser Glu Pro Ser Ala Glu Cys Tyr Val Val Trp Gly 35 40 45 Asp Cys Asn His Ser Phe His His Cys Cys Met Thr Gln Trp Ile Arg 50 55 60 Gln Asn Asn Arg Cys Pro Leu Cys Gln Lys Asp Trp Val Val 65 70 75 <210> 38 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <221> SIMILAR <222> (1)..(80) <223> Partial Protein Sequence <400> 38 Val Lys Ile Lys Cys Trp Asn Gly Val Ala Thr Trp Leu Trp Val Ala 1 5 10 15 Asn Asp Glu Asn Cys Gly Ile Cys Arg Met Ala Phe Asn Gly Cys Cys 20 25 30 Pro Asp Cys Lys Val Pro Gly Asp Asp Cys Pro Leu Val Trp Gly Gln 35 40 45 Cys Ser His Cys Phe His Met His Cys Ile Leu Lys Trp Leu His Ala 50 55 60 Gln Gln Val Gln Gln His Cys Pro Met Cys Arg Gln Glu Trp Lys Phe 65 70 75 80 <210> 39 <211> 80 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <221> SIMILAR <222> (1)..(80) <223> Partial Protein Sequence <400> 39 Val Thr Ile Lys Ser Trp Thr Gly Val Ala Thr Trp Arg Trp Ile Ala 1 5 10 15 Asn Asp Glu Asn Cys Gly Ile Cys Arg Met Ser Phe Glu Ser Thr Cys 20 25 30 Pro Glu Cys Ala Leu Pro Gly Asp Asp Cys Pro Leu Val Trp Gly Val 35 40 45 Cys Ser His Cys Phe His Met His Cys Ile Val Lys Trp Leu Asn Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Asn Lys Gln Cys Pro Met Cys Arg Gln Ser Trp Lys Phe 65 70 75 80 <210> 40 <211> 74 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <221> SIMILAR <222> (1)..(74) <223> Partial Protein Sequence <400> 40 Ile Thr Val Lys Lys Leu His Val Cys Gly Glu Trp Lys Trp Leu Asp 1 5 10 15 Thr Cys Gly Ile Cys Arg Met Glu Phe Glu Ser Ala Cys Asn Met Cys 20 25 30 Lys Phe Pro Gly Asp Asp Cys Pro Leu Val Leu Gly Ile Cys Arg His 35 40 45 Ala Phe His Arg His Cys Ile Asp Lys Trp Ile Gln Pro Arg Ala Gln 50 55 60 Cys Pro Leu Cys Arg Gln Asp Trp Thr Ile 65 70 <210> 41 <211> 76 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <221> SIMILAR <222> (1)..(76) <223> Partial Protein Sequence <400> 41 Val Lys Ile Asn Glu Val His Ser Val Phe Ala Trp Ser Trp Asp Val 1 5 10 15 Cys Gly Ile Cys Arg Ala Ser Tyr Asn Gly Thr Cys Pro Ser Cys Lys 20 25 30 Phe Pro Gly Asp Gln Cys Pro Leu Val Ile Gly Leu Cys His His Asn 35 40 45 Phe His Asp His Cys Ile Tyr Arg Trp Leu Asp Thr Pro Thr Ser Lys 50 55 60 Gly Leu Cys Pro Met Cys Arg Gln Thr Phe Gln Leu 65 70 75
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび図１Ｂ】 ＲＯＣ１がカリンファミリーメンバーと相互作用することを示す図である。図
１Ａに示した実験では、酵母ＨＦ７ｃ細胞を、表示のタンパク質（Ｋｅｙ）を発
現するプラスミドで同時形質転換し、ロイシンおよびトリプトファン（−ＬＷ）
を欠く培地にプレートしてベイト（Ｌｅｕ＋）およびプレイ（Ｔｒｐ＋）プラス
ミドの存在を評価するか、ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジンを欠く
培地（−ＬＷＨ）にプレートしてベイトタンパク質とプレイタンパク質との間の
相互作用をアッセイした。
【図１Ｂ】 ＲＯＣ１がＣＵＬ１のＣ末端部分と相互作用することを示す図である。ＨＦ７
ｃ酵母細胞を、表示のタンパク質を発現するプラスミドで同時形質転換した。タ
ンパク質−タンパク質相互作用を、本明細書中に記載のようにアッセイした。
【図２Ａ】 ヒトＲＯＣ１のヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番
号２）を示す図である。先端のコドンをアスタリスクで示す。
【図２Ｂ】 ヒトＲＯＣ１のヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番
号４）を示す図である。先端のコドンをアスタリスクで示す。
【図２Ｃ】 以下の代表的な生物由来のタンパク質のＲＯＣ／ＡＰＣ１１ファミリーの配列
比較を示す図である：ヒト（Ｈｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ショウジョウ
バエ（Ｄｍ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃｅ
、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ヤナギタンポポ（Ａｔ、
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、分裂酵母（Ｓｐ、Ｓｃｈｉｚｏ
ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、および発芽酵母（Ｓｃ、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。全配列間で同一の残基を太字で
示す。特定の配列の角括弧中の数字は省略した挿入の長さを示す。各配列の上お
よび下の数字は、それぞれ各遺伝子中の最初のアミノ酸残基位置および各タンパ
ク質の全長を示す。
【図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃ】 ＲＯＣ１のカリンとのインビボでの会合を示す図である。図３Ａに示した実験
では、［35Ｓ］−メチオニン標識溶解物を、表示のタンパク質を発現するプラス
ミドでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から調製した。溶解物を二等分し、表
示の抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。［35Ｓ］−メチ
オニン標識で示した実験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクトＲＯＣ１（レ
ーン１）、ＲＯＣ１とＣＵＬ１との混合物（レーン２）、またはＨｅＬａおよび
Ｓａｏｓ−２細胞由来の細胞溶解物を、競合ＲＯＣ１抗原タンパク質と予備イン
キュベートした（＋）またはしていない（−）抗ＲＯＣ１抗体で免疫沈降させ、
これを、各レーンの上部に示した。数回の洗浄後、沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離した。 図３Ｃに示した実験について、ＨｅＬａ細胞から調製した全細胞溶解物を、競
合抗原ペプチドを含む（＋）または含まない（−）表示の抗体で免疫沈降した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質を、ニトロセルロースに移し、ＣＵＬ１（レー
ン１〜４、上のパネル）、ＣＵＬ２（レーン５〜８、上のパネル）、またはＲＯ
Ｃ１（下のパネル）の抗体を使用したウェスタン分析によって分析した。
【図４Ａ〜図４Ｅ】 ＲＯＣ２およびＡＰＣ１１がカリンおよびＡＰＣ２と選択的に相互作用するこ
とを示す図である。図４Ａおよび図４Ｂに示した実験では、ＨＦ７ｃ高母細胞を
、ヒトＲＯＣ２またはヒトＡＰＣ１１および種々のカリンを発現するプラスミド
で同時形質転換した。ｐＧＢＴ８−ＰＣＮＡおよびｐＧＡＤベクタープラスミド
を、陰性コントロールとして誘導させた。タンパク質−タンパク質相互作用を、
本明細書中に記載のように酵母２ハイブリッドアッセイによって同定した。図４
Ｃおよび図４Ｄは、哺乳動物細胞中でのＲＯＣ２と、ＡＰＣ１１と、カリンファ
ミリータンパク質との相互作用を示す図である。ＨＡタグ化ＲＯＣ２またはＡＰ
Ｃ１１を、ＣＵＬ１またはｍｙｃタグ化したカリンタンパク質を発現するベクタ
ーのＨｅＬａ細胞へに同時トランスフェクトした。トランスフェクションから２
日後、細胞を［35Ｓ］−メチオニンで２時間パルス標識した。標識細胞から調製
した細胞溶解物を二等分し、表示の抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
した。５つ全てのカリンタンパク質を、ＨＡ−ＲＯＣ２と同時沈降させたが、Ｃ
ＵＬ−５のみはＡＰＣ１１と同時沈降させた。図４Ｅに示す実験では、ＡＰＣ２
とＲＯＣまたはＡＰＣ１１との間の選択的相互作用を示す。ＨＦ７ｃ酵母細胞を
、表示のタンパク質（ｋｅｙ）を発現するプラスミドで同時トランスフェクトし
た。タンパク質−タンパク質相互作用を、ＧＡＬ４ＢＤ−ＡＰＣ２融合タンパク
質の低トランス活性化活性（「自己活性化」）を抑制するために５ｍＭ ３−Ａ
Ｔを補足したヒスチジンを各選択培地（−ＬＷＨ）を使用した酵母２ハイブリッ
ドアッセイによって同定した。
【図５Ａ〜図５Ｆ】 酵母でのＲＯＣ１の融合を示す図である。図５Ａは、ＳｃＲＯＣ１が必須遺伝
子であることを示す。ａ＋／ｒｏｃ１：ｋａｎＲ胞子形成培地由来の２０個の四
分子を、示したようにＹＰＤプレート上で分析した。
【図５Ｂ】 ＳｃＲＯＣ１ｐの欠失によって多出芽酵母が得られることを示す図である。Ｇ
ＡＬ−ＨＡ３−ＳｃＲＯＣ１半数体を、２％ガラクトース＋２％ラフィノース（
上のパネル）または２％グルコース（下のパネル）中で２４時間培養した。ＤＮ
Ａを、ヘキスト色素を使用して染色した。
【図５Ｃ】 ＳｃＲＯＣ１ｐの欠失を示す図である。ＧＡＬ−ＨＡ３−ＳｃＲＯＣ１酵母細
胞を、２％または０．０５％ガラクトース＋２％ラフィノースまたは２％グルコ
ース中で表示の異なる時間増殖させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分
離し、ニトロセルロースに移し、抗ＨＡ抗体でブロットしてＨＡ３−ＲＯＣ１を
検出した。
【図５Ｄ】 ＳｃＲＯＣ１が全ての酵母カリンと相互作用することを示す図である。ＨＦ７
ｃ細胞（ｈｉｓ３−２００、ｌｅｕ２−３、ｔｒｐ１−９０１、ＧＡＬ４−ｌａ
ｃＺ、ＧＡＬ１−ＨＩＳ３）を、表示のタンパク質（ｋｅｙ）を発現するプラス
ミドで同時形質転換した。図１Ａに記載のように、タンパク質−タンパク質相互
作用を酵母２ハイブリッドアッセイによって同定した。
【図５Ｅ】 ヒトＲＯＣ１およびヒトＲＯＣ２は、ＳｃＲＯＣ１−欠失に起因する多出芽表
現型をレスキューすることができることを示す図である。ＧＡＬ−ＨＡ３−Ｓｃ
ＲＯＣ１半数体を、ｐＡＤＨ−４１４ベクター、ｐＡＤＨ−４１４−ＳｃＲＯＣ
１、ｐＡＤＨ−ＳｃＡＰＣ１１、ｐＡＤＨ−ｈＲＯＣ１、またはｐＡＤＨ−ｈＲ
ＯＣ２で形質転換した。形質転換体を、２％グルコースを含む選択プレートに画
線し、公募細胞が多出芽表現型を示すまで２４時間増殖させた。細胞を、ホルム
アルデヒドで固定して写真撮影した。
【図５Ｆ】 ＳｃＲＯＣ１ｐ欠失酵母においてＳｉｃ１ｐが蓄積することを示す図である。
ＧＡＬ−ＨＡ３−ＳｃＲＯＣ１／ＳＩＣ１−ＨＡ３酵母細胞を、０．０５％また
は２％グルコース中で表示の異なる時間増殖させた。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで分離し、ニトロセルロースに移し、抗ＨＡ抗体でブロットしてＳｉｃ−ＨＡ
３を検出し、抗アクチン抗体でのブロットによって作用を検出して等しいタンパ
ク質ローディングを評価した。
【図６Ａ〜図６Ｃ】 ＲＯＣ１がカリン依存性ユビキチンリガーゼアッセイを刺激することを示す図
である。図６Ａは、表示のタンパク質を発現するプラスミドで一過性にトランス
フェクトしたヒト２９３Ｔ細胞由来の溶解物（全タンパク質の１ｍｇ）を、抗Ｈ
Ａ抗体に結合させたプロテインＡビーズと混合したことを示す図である。ビーズ
に固定したＨＡ免疫複合体を洗浄して、精製Ｅ１、Ｅ２ ＣＤ３４（別で表示し
ない場合）、32Ｐ標識ユビキチン（ｕｂ）、およびＡＴＰと混合した。３７℃で
３０分のインキュベーション後（特記しない場合）、ボイリングによって反応を
停止させ、ＳＤＳおよびＤＴＴ、および混合物の存在下でサンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分離し、オートラジオグラフィーを行った。図６Ｂは、ユビキチンリガ
ーゼ活性を表示のタンパク質の異なる組み合わせを発言するプラスミドでトラン
スフェクトした細胞由来の溶解物を使用してアッセイしたことを示す図である（
Ａ）。図６Ｃは、インビボユビキチンリガーゼアッセイを示す図である。非トラ
ンスフェクトヒトＨｅＬａまたは２９３Ｔ細胞由来の溶解物を、ＲＯＣ１、ＡＰ
Ｃ１１、またはＣＵＬ１のいずれかの抗体で免疫沈降させ、競合ペプチドを含む
（レーン４）または含まないを示した。ユビキチンリガーゼ活性を、本明細書中
に記載のようにアッセイした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｍ 33/53 33/566 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 45/00 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB20 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB02 FB03 FB06 FB07 4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA02 DA03 DA12 EA04 GA13 HA03 HA13 HA14 4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ43 QQ53 QQ61 QQ89 QR08 QR32 QR35 QR40 QR56 QR62 QR77 QS16 QS25 QS34 QX02 QX10 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CE12 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA05 BD14 CA24 CA46 4C084 AA16 ZC80 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA72 FA74 GA01 GA26

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＲＯＣ１をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記
    ポリヌクレオチドは、 （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）のＤＮＡとハイブリッド形成し、
    ＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチド、および （ｃ）遺伝コードの縮重により前記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと異なり、前記
    （ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるＲＯＣ１をコードするポリヌ
    クレオチドからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＲＯＣ１をコードする請求項１に記載の単離ポリヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＲＯＣ１を
    コードする請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号１として示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
    である請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現ベクターを含む細胞。
  7. 【請求項７】 ＲＯＣ１を発現することができる請求項６に記載の発現ベク
    ターを含む細胞。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単
    離タンパク質。
  9. 【請求項９】 配列番号２として示されるアミノ酸配列を有する請求項１に
    記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離タンパク質。
  10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる
    タンパク質に特異的に結合する抗体。
  11. 【請求項１１】 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項１０に記載の
    抗体。
  12. 【請求項１２】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１０に記載の
    抗体。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載のポリヌクレオチドに相補的で、生理学的
    条件下でハイブリッド結合するために十分な長さを有するアンチセンスオリゴヌ
    クレオチド。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコ
    ードするＤＮＡ。
  15. 【請求項１５】 請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含
    む発現ベクター。
  16. 【請求項１６】 配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む
    タンパク質の産生法であって、 （ａ）前記タンパク質の発現に適切な条件下で、ＲＯＣ１をコードするポリヌク
    レオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養す
    る工程と、 （ｂ）前記宿主細胞培養からタンパク質を回収する工程とを包含する方法。
  17. 【請求項１７】 生物サンプル中のＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチド
    の検出法であって、 （ａ）生物サンプルの核酸物質に配列番号１をコードするポリヌクレオチド配列
    の相補物をハイブリッド形成させて、ハイブリッド形成複合体を形成させる工程
    と、 （ｂ）前記ハイブリッド形成複合体を検出する工程とを包含し、前記複合体の存
    在が生物サンプル中のＲＯＣ１をコードするポリヌクレオチドの存在と一致する
    方法。
  18. 【請求項１８】 ＲＯＣ２をコードする単離ポリヌクレオチドであって、前
    記ポリヌクレオチドは、 （ａ）配列番号３のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）ストリンジェントな条件下で前記（ａ）のＤＮＡとハイブリッド形成し、
    ＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチド、および （ｃ）遺伝コードの縮重により前記（ａ）または（ｂ）のＤＮＡと異なり、前記
    （ａ）または（ｂ）のＤＮＡによってコードされるＲＯＣ２をコードするポリヌ
    クレオチドからなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 ＲＯＣ２をコードする請求項１８に記載の単離ポリヌクレ
    オチド。
  20. 【請求項２０】 配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するＲＯＣ２
    をコードする請求項１８に記載の単離ポリヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 配列番号３として示されるヌクレオチド配列を有するＤＮ
    Ａである請求項１８に記載の単離ポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 請求項１８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の発現ベクターを含む細胞。
  24. 【請求項２４】 ＲＯＣ１を発現することができる請求項２２に記載の発現
    ベクターを含む細胞。
  25. 【請求項２５】 請求項１８に記載のポリヌクレオチドによってコードされ
    る単離タンパク質。
  26. 【請求項２６】 配列番号４として示されるアミノ酸配列を有する請求項１
    ８に記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離タンパク質。
  27. 【請求項２７】 請求項１８に記載のポリヌクレオチドによってコードされ
    るタンパク質に特異的に結合する抗体。
  28. 【請求項２８】 前記抗体がポリクローナル抗体である請求項２７に記載の
    抗体。
  29. 【請求項２９】 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項２７に記載の
    抗体。
  30. 【請求項３０】 請求項１８に記載のポリヌクレオチドに相補的で、生理学
    的条件下でハイブリッド結合するために十分な長さを有するアンチセンスオリゴ
    ヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】 請求項３０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコ
    ードするＤＮＡ。
  32. 【請求項３２】 請求項３０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含
    む発現ベクター。
  33. 【請求項３３】 配列番号４のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む
    タンパク質の産生法であって、 （ａ）前記タンパク質の発現に適切な条件下で、ＲＯＣ２をコードするポリヌク
    レオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養す
    る工程と、 （ｂ）前記宿主細胞培養からタンパク質を回収する工程とを包含する方法。
  34. 【請求項３４】 生物サンプル中のＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチド
    の検出法であって、 （ａ）生物サンプルの核酸物質に配列番号３をコードするポリヌクレオチド配列
    の相補物をハイブリッド形成させて、ハイブリッド形成複合体を形成させる工程
    と、 （ｂ）前記ハイブリッド形成複合体を検出する工程とを包含し、前記複合体の存
    在が生物サンプル中のＲＯＣ２をコードするポリヌクレオチドの存在と一致する
    方法。
  35. 【請求項３５】 ＲＯＣタンパク質に結合することができる生物活性因子の
    スクリーニング法であって、前記方法は、 ａ）ＲＯＣタンパク質と候補生物活性因子とを組み合わせる工程と、 ｂ）前記候補生物活性因子と前記ＲＯＣタンパク質との結合を同定する工程とを
    包含する方法。
  36. 【請求項３６】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ１である請求項３５に記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ２である請求項３５に記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 ＲＯＣタンパク質とカリンタンパク質との結合を干渉する
    ことができる生物活性因子のスクリーニング法であって、前記方法は、 ａ）ＲＯＣタンパク質と、生物活性因子と、カリンタンパク質とを組み合わせる
    工程と、 ｂ）前記ＲＯＣと前記カリンタンパク質との結合を同定する工程とを包含する方
    法。
  39. 【請求項３９】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ１である請求項３８に記載
    の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ２である請求項３８に記載
    の方法。
  41. 【請求項４１】 前記カリンタンパク質は、カリン１、カリン２、カリン３
    、カリン４Ａ、およびカリン５からなる群から選択される請求項３８に記載の方
    法。
  42. 【請求項４２】 ＲＯＣタンパク質の活性を調整することができる生物活性
    因子のスクリーニング法であって、前記方法は、 ａ）ＲＯＣタンパク質と候補生物活性因子とを組み合わせる工程と、 ｂ）前記ＲＯＣタンパク質の活性に対する前記候補生物活性因子の効果を同定す
    る工程とを包含する方法。
  43. 【請求項４３】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ１である請求項４２に記載
    の方法。
  44. 【請求項４４】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ２である請求項４２に記載
    の方法。
  45. 【請求項４５】 ＲＯＣタンパク質の活性を調整することができる生物活性
    因子のスクリーニング法であって、 ａ）ＲＯＣタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞に候補生物活性因子を
    添加する工程と、 ｂ）前記細胞に対する前記候補生物活性因子の効果を同定する工程とを包含する
    方法。
  46. 【請求項４６】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ１である請求項４５に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 前記ＲＯＣタンパク質がＲＯＣ２である請求項４５に記載
    の方法。
  48. 【請求項４８】 前記候補生物活性因子のライブラリーをＲＯＣタンパク質
    をコードする組換え核酸を含む多数の細胞に添加する請求項４５に記載の方法。
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