JP2001526063A - Ｓａｇ：アポトーシス感受性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、レドックス感受性蛋白質をコードする新規な遺伝子およびそれに由来するポリペプチドを提供する。レドックス感受性蛋白質は、細胞増殖を促進し、細胞をアポトーシスから保護し、酸素ラジカルを除去し、さらに腫瘍表現型を逆行させるために用いることができる。１，１０フェナントロリン（ＯＰ）によって腫瘍細胞で誘発されるアポトーシスの原因遺伝子を特定すべく、ディファレンシャルディスプレー技術を用いてＯＰを誘発することができる遺伝子、ＳＡＧ（アポトーシス感受性遺伝子）をクローニングした。ＳＡＧは、亜鉛ＲＩＮＧフィンガードメインを有する、新規でレドックス感受性のヘム結合蛋白質をコードする。ＳＡＧ蛋白質は１１３アミノ酸から成る蛋白質で、計算分子量が１２.７ｋＤａである。アンチセンスＳＡＧトランスフェクションは、ＤＬＤ１ヒト細胞株でのある種の腫瘍細胞表現型を抑制し、さらにＳＡＧＲＮＡのマイクロインジェクションは細胞増殖を促進する。本発明者等は、ＳＡＧ蛋白質は、酸化ストレス誘発損傷を和らげるレドックスセンサーとして、さらに細胞増殖を刺激する増殖因子として機能する細胞保護分子であると提唱する。ＳＡＧ蛋白質は、神経退行性疾患、癌、筋ジストロフィーに対する薬剤および創傷治癒促進薬剤の開発で理想的な標的分子であろう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】

本発明は、細胞をアポトーシスから保護し、かつ細胞の増殖を促進するレドッ
クス感受性蛋白質をコードする新規な遺伝子およびそれから誘導されるポリペプ
チド、さらにポリペプチドに対して作製された抗体に関する。本発明はまた、遺
伝子の遺伝的欠失の検出、ポリペプチドの細胞内の存在場所の決定、個々のクラ
スのＲＮＡの単離、アポトーシスの抑制、酸素ラジカルの除去、腫瘍表現型の復
帰、および遺伝子治療による治療への応用において新規な遺伝子、ポリペプチド
および抗体を使用する方法を開示する。

【０００２】

【従来技術】

アポトーシス（プログラムされた細胞死とも称される）は、生理学的条件下で
恒常性を維持し、種々の刺激に反応するために遺伝的にプログラムされた過程で
ある（Thompson, Science 267:1456-1462(1995))。この形態の細胞死は、細胞膜
の小気胞形成（blebbing）、細胞質の収縮、核クロマチンの縮合およびＤＮＡの
断片化を特徴とする（Wyllie, Int. Rev. Cytol. 68:251-306(1980))。アポトー
シスの過程は別個の３つの相、すなわち開始、エフェクター分子の刺激およびＤ
ＮＡ分解に分けることができる（Kroemer et al., FASEB J. 9:1277-1287(1995)
; Vaux & Strasser, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2239-2244(1996)）。ア ポトーシスは、種々の癌治療薬、酸化性ＤＮＡ損傷薬およびサイトカインを含む
多様な物理的、化学的および生物学的刺激（内部および外部）によって種々の細
胞タイプで開始する（Kroemer, Nature Med. 3:614-620(1997); White, Genes D
ev. 10:1-15(1996); Sen & D'Incalci, FEBS Lett. 307:122-127(1992); Dive &
Hickman, Br. J. Cancer 64:192-196(1991); Yuan et al., Cell 75:641-652(1
993)）。これらの開始物質は、細胞内のエフェクター分子にアポトーシスシグナ
ルのトランスダクションおよび増幅を開始させ、それによって最終的に不可逆的
なＤＮＡ分解および細胞死がもたらされる。

【０００３】 多くの遺伝子がこのアポトーシス過程に関わっている。一般に、これらの遺伝
子の産物はアポトーシス誘発物質または抑制物質のいずれかに分類される。細胞
内でのアポトーシス誘発物質と抑制物質の活性間のバランスによって、細胞がア
ポトーシスを経るか否かが決定される。アポトーシス調節遺伝子の数が増してい
く中で、最も特性付けられたものは、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、Ｂｃｌ−２遺伝子
ファミリー（アポトーシス誘発物質および抑制物質の両方から成る）、インター
ロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）遺伝子ファミリー、およびＦＡＳ／Ｆａｓリガ
ンドである（Kroemer(1997); White(1996); Yuan et al.(1993); Nagata & Gols
tein, Science 267:1449-1456(1995))。アポトーシス時に、アポトーシス調節遺
伝子産物が関与する実質的な相互反応（Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリーの遺伝子産
物間でのヘテロダイマーの生成およびバクス（Bax）発現のｐ５３活性化を含む ）が生じる（Oltvai et al., Cell 74:609-619(1993); Miyashita & Reed, Cell
80:293-299(1995))。

【０００４】 本発明者は、最近１，１０フェナントロリン（“ＯＰ”、金属キレート試薬）
は、ｐ５３活性を活性化し、内因性野性型ｐ５３を保有する２種のネズミ腫瘍細
胞系でアポトーシスを誘発することを発見した（Sun et al., Oncogene 14:385-
393(1997))。ＯＰは、Ｆｅ（II）をキレート化し、フェントン反応によるＦｅ（
II）仲介ヒドロキシルラジカルの生成を防止する点で典型的な金属キレート試薬
である（Halliwell et al., "Free Radicals in Biology and Medicine", 2nd e
d., Clarendon Press, Oxford; Auld, "Methods in Enzymology", Vol.158(J.F.
Riordan & B.L. Valle, Eds.), pp.110-114, Academic Press, New York）。Ｏ
Ｐは、多くの細胞系でヒドロキシルラジカル誘発ＤＮＡ損傷を防止することが示
された（Y. Sun, Free Radic. Biol. Med. 8:583-599(1990); Martins & Menegh
ini, Biochem. J. 299:137-140(1994); Morgan et al., Biochem. Pharmacol. 4
4:215-221(1992))。ＯＰによるｐ５３の活性化は、その後のアポトーシスによる
細胞死に必要ではないが大きな影響を与えることが見出された（Sun et al., On
cogene 14:385-393(1997); Sun et al., FEBS Lett. 408:16-20(1997))。ＯＰ誘
発アポトーシスに必要な決定的遺伝子および遺伝子産物はまだ特性が明らかでは
ない。アポトーシス誘発の分子メカニズムをよく理解することによって、アポト
ーシス誘発（抗癌）または抑制（抗老化）のための医薬のよりよいデザインが可
能になるであろう。

【０００５】

【発明の概要】

本発明は、細胞をアポトーシスから保護し、酸素ラジカルを除去し、腫瘍表現
型を元に復帰させるために用いることができるレドックス感受性蛋白質をコード
する新規な遺伝子およびそれに由来するポリペプチドを提供する。 本発明の態様の１つは、配列番号：１および配列番号：３に示した新規な単離
され精製されたＤＮＡ配列（本明細書では“マウスＳＡＧ”および“ヒトＳＡＧ
”と呼ぶ）、および１，１０−フェナントロリン（“ＯＰ”）−誘発アポトーシ
ス時に誘発される配列番号：２および配列番号：４に示したそれらの遺伝子産物
（本明細書では“マウスＳＡＧ蛋白質”および“ヒトＳＡＧ蛋白質”と呼ぶ）を
提供することである。別の態様では、本発明は、ストリンジェンシーの高いハイ
ブリダイゼーション条件下で配列番号：１および配列番号：３に示したヌクレオ
チド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様では、こ
の単離精製されたＤＮＡ配列は本質的に配列番号：１または配列番号：３のＤＮ
Ａ配列から成る。

【０００６】 本発明の別の態様では、染色体外ベクターにサブクローン化されたＳＡＧを含
む新規なリコンビナントＤＮＡ分子が提供される。さらに別の態様では、本発明
は、染色体外ベクターにサブクローン化されたＳＡＧを含むリコンビナントＤＮ
Ａ分子で安定にトランスフェクトされているリコンビナントホスト細胞を提供す
る。 別の態様では、本発明は、配列番号：２および配列番号：４に示したＳＡＧ蛋
白質と実質的に同様なポリペプチドを含む実質的に精製されたリコンビナント蛋
白質を提供する。また別の態様では、本発明は、配列番号：２および配列番号：
４に示したアミノ酸配列と実質的に同様なアミノ酸配列を有する蛋白質と選択的
に結合する多クローン性（ポリクローナル）抗体を提供する。

【０００７】 本発明のさらに別の態様では、細胞内のＳＡＧ蛋白質を検出する方法（この方
法は細胞をＳＡＧ蛋白質を認識するポリクローナル抗体と接触させることを含む
）；ＳＡＧ欠失を有する細胞を検出する方法（この方法は、細胞から全ゲノムＤ
ＮＡを単離し、このゲノムＤＮＡを配列番号：１および配列番号：３のＤＮＡ配
列に由来するプライマーを用いてＰＣＲ増幅に付すことを含む）；およびＳＡＧ
欠失を有する細胞を検出する方法（この方法は、全細胞ＲＮＡを単離し、このＲ
ＮＡを配列番号：１および配列番号：３のＤＮＡ配列に由来するプライマーを用
いて逆転写ＰＣＲ増幅に付すことを含む）が提供される。

【０００８】 また別の態様で、本発明は、ポリＡ、ポリＣまたはポリＵ残基ストレッチを含
むＲＮＡを細胞から単離する方法を提供する。この方法は、全細胞ＲＮＡをＳＡ
Ｇ蛋白質と接触させ、ＲＮＡ−ＳＡＧ蛋白質混合物をＳＡＧ蛋白質を認識する抗
体とインキュベートすることを含む。 さらに別の態様では、本発明は、細胞のアポトーシス時に誘発される遺伝子を
単離する方法を提供する。この方法は、細胞をＯＰで処理し、ＯＰ誘発ＲＮＡを
種々の表示工程に付し、このＯＰ誘発遺伝子をクローニングすることを含む。

【０００９】 また別の態様で、本発明は、レドックス試薬によって誘発されるアポトーシス
から哺乳類細胞および／または非哺乳類細胞を保護する方法を提供する。この方
法は、配列番号：１および配列番号：３に示したＤＮＡ配列と実質的に同様なＤ
ＮＡ配列を含む発現ベクターを哺乳類および／または非哺乳類細胞に導入するこ
とを含む。前記のＤＮＡ配列は、この配列の発現を促進するＤＮＡ配列に機能的
（operatively）に連結されており、配列番号：１および配列番号：３の単離精 製されたＤＮＡ配列は哺乳類細胞および／または非哺乳類細胞で高レベルで発現
される。

【００１０】 本発明のさらに別の態様では哺乳類および／または非哺乳類の腫瘍細胞を処置
する方法が提供される。この方法は、配列番号：１および配列番号：３に示した
ＤＮＡ配列と実質的に同様なＤＮＡ配列を含む発現ベクターを哺乳類および／ま
たは非哺乳類腫瘍細胞に導入することを含む。前記のＤＮＡ配列は、このＤＮＡ
配列のアンチセンス鎖の発現を促進するＤＮＡ配列と機能的に連結されており、
配列番号：１および配列番号：３のＤＮＡ配列のアンチセンス鎖は哺乳類細胞お
よび／または非哺乳類細胞で高レベルで発現される。

【００１１】 本発明のまた別の態様では、生物体で酸素ラジカルを除去する方法が提供され
る。この方法は、ＳＡＧ蛋白質および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物
を酸素ラジカルを減少させる量で投与することを含む。 また別の態様で、本発明は、患者の創傷閉鎖（すなわち治癒）を促進させる方
法を含むがこれに限定されないＳＡＧの遺伝子治療への応用を提供する。 前述の記載は本発明を制限することを意図するものではない。本明細書に引用
した全ての特許および刊行物は全て参照により本明細書に含まれる。

【００１２】 〔図面の簡単な説明〕 図１Ａは、マウスおよびヒトのＳＡＧｃＤＮＡの推論される蛋白質配列の予想
される構造的特徴であり、図１Ｂは、ヒトＳＡＧ蛋白質変異体を示す。 図２は、種々の安定なＳＡＧトランスフェクト細胞株の軟寒天コロニー増殖の
棒グラフである。 図３は、ＳＡＧトランスフェクタントの移植後の日数に対してＳＣＩＤマウス
の腫瘍質量をあらわすグラフである。

【００１３】

【発明の詳述】

本発明は、細胞をアポトーシスから保護し、酸素ラジカルを除去し、さらに腫
瘍表現型を元に復帰させるために用いることができるレドックス感受性蛋白質を
コードする新規な遺伝子およびそれに由来するポリペプチドを提供する。本発明
はまた、ＯＰ誘発アポトーシスに関係する遺伝子およびそれら遺伝子の産物を含
む。そのような遺伝子およびそれら遺伝子産物の単離によって、ＯＰ誘発アポト
ーシス経路の詳細な分析が可能になり、したがって、ＯＰ誘発アポトーシスのメ
カニズムの特定に有用な実験室用ツールが提供され、アポトーシスを調節する医
薬のデザインの改良が可能になる。

【００１４】 本明細書では、特に記載がなければ、用いた技術は下記のようないくつかの周
知の文献のいずれかで見出すことができる：“Molecular Cloning: A Laborator
y Manual" (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press);
“Gene Expression Technology" (Methods in Enzymology, Vol.185, D. Goedde
l, Ed., 1991, Academic Press, San Diego, CA); “Guide to Protein Purific
ation"(Methods in Enzymology)(M.P. Deutshcer, Ed., 1990, Academic Press,
Inc.); “PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications" (Innis et a
l., 1990, Academic Press, San Diego, CA); “Culture of Animal Cells:A Ma
nual of Basic Technique", 2nd Ed.(R.I. Freshney, 1987, Liss, Inc. New Yo
rk, NY); “Gene Transfer and Expression Protocols", pp.109-128, E.J. Mur
ray, Ed., The Humana Press Inc., Clifton, N.J.）。

【００１５】 本発明の態様の１つでは、単離精製された新規なＤＮＡ配列（以下アポトーシ
ス感受性遺伝子（Sensitive to Apoptosis Genes, “ＳＡＧ”）と称する）が提
供される。これはＳＡＧ蛋白質をコードする。ある態様では、本発明は、それぞ
れ配列番号：１（マウスＳＡＧ）または配列番号：２（ヒトＳＡＧ）に示した配
列と実質的に同様なＤＮＡ配列を含む。本明細書で規定するように、“実質的に
同様”とは、同一配列だけでなく、その蛋白生成物の機能を維持し、同様な亜鉛
結合モチーフを保持している、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質配列の欠失物、置換
物または付加物を含む。好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、本質的に配列番号
：１または配列番号：３のＤＮＡ配列から成るか、または配列番号：１１、配列
番号：１３、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２
７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列
番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４
５、配列番号：４７および配列番号：４９から成る群から選ばれる。これらの新
規な精製単離ＤＮＡ配列をＳＡＧ蛋白質の発現を誘導およびＳＡＧ蛋白質機能の
変異分析に用いることができる。 当業者は、以下の実施例８に記載したような本明細書で提供する教示および当
業者に周知の技術を用いて日常的態様で本発明の変異配列を特定することができ
る。

【００１６】 別の態様では、本発明は、ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション
条件下で配列番号：１および／または配列番号：３とハイブリダイズするヌクレ
オチド配列を含む。本明細書で用いられるように、“ストリンジェンシーの高い
ハイブリダイゼーション条件”という語句は、塩濃度の低いハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中で２×１０⁸ｃｐｍ／μｇで問題のプローブと約８時間から２４時 間６５℃でハイブリダイズさせ、続いて１％ＳＤＳ、２０ｍＭリン酸緩衝液およ
び１ｍＭのＥＤＴＡで約３０分から４時間６５℃で洗浄することを指す。好まし
い態様では、塩濃度の低いハイブリダイゼーション緩衝液は、０.５−１０％Ｓ ＤＳおよび０.０５Ｍ−０.５Ｍのリン酸ナトリウムを含む。最も好ましい態様で
は、塩濃度の低いハイブリダイゼーション緩衝液は、７％のＳＤＳおよび０.１ ２５Ｍのリン酸ナトリウムを含む。これらのＤＮＡ配列は、ＳＡＧ蛋白質の発現
の誘導およびＳＡＧ蛋白質機能の変異分析に用いることができ、記載のようにハ
イブリダイゼーションによって単離される。

【００１７】 また別の態様では、本発明は、ＳＡＧまたはそれと実質的に同様な染色体外ベ
クターにサブクローン化した配列を含む新規なリコンビナントＤＮＡ分子を提供
する。本発明のこの態様では、ＳＡＧ遺伝子のin vitro発現が可能になり、した
がってＳＡＧ遺伝子の調節並びにＳＡＧ蛋白質の構造および機能を分析できる。
本明細書で用いられるように、“染色体外ベクター”という用語には、プラスミ
ド、バクテリオファージ、コスミド、レトロウイルスおよび人工染色体が含まれ
るが、ただしこれらに限定されない。好ましい態様では、染色体外ベクターは、
リコンビナントＤＮＡ分子をホスト細胞に挿入したときにＳＡＧ蛋白質の産生を
可能にする発現ベクターを含む。当技術分野ではいくつかのベクターがよく知ら
れているが、これらベクターにはＴ３またはＴ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＶ
４０プロモータ、ＣＭＶプロモータを含むベクター、または遺伝子発現を誘導す
ることができる任意のプロモータもしくは遺伝子発現を誘導する能力を調べたい
任意のプロモータを含むベクターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
これらのリコンビナントベクターは、上記で引用した文献に記載されている標準
的なリコンビナントＤＮＡプロトコルによって作製される。本発明のこの態様は
ＳＡＧ蛋白質の高レベル発現を可能にする。

【００１８】 また別の態様では、本発明は、染色体外ベクターにサブクローン化したＳＡＧ
を含むリコンビナントＤＮＡ分子で安定にトランスフェクトしたリコンビナント
ホスト細胞を提供する。本発明のホスト細胞はいずれのタイプでもよいが、これ
らには非真核細胞（例えば細菌）および真核細胞、例えば真菌細胞（例えば酵母
）、植物細胞、ヒトでない動物細胞、ヒトでない哺乳類細胞（例えばウサギ、ブ
タ、マウス、ウマ）およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない。ホス
ト細胞のリコンビナントＤＮＡ分子によるトランスフェクションは当技術分野で
はよく知られており（Sambrook et al., Molecular Clonig, A Laboratory Manu
al, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989）、本明細書で用いられるよう に、リン酸カルシウムトランスフェクション、硫酸デキストラントランスフェク
ション、電気穿孔、リポフェクション、およびウイルスによる感染が含まれるが
、これらに限定されない。本発明のこの態様によって、ＳＡＧおよびその遺伝子
産物のin vivoおよびin vitro発現が可能になり、したがって下記実施例６で述 べるようにＳＡＧ蛋白質の高レベル発現が可能になる。

【００１９】 本発明の別の態様では、配列番号：２および配列番号：４に示したＳＡＧポリ
ペプチドと実質的に同様なポリペプチドを含む実質的に精製されたリコンビナン
ト蛋白質が提供される。さらに、本発明のこの態様は、下記のいくつかのin vit
roアッセイでＳＡＧ蛋白質を使用することを可能にする。本明細書で用いられる
ように、“実質的に同様”という用語は、in vitroでの任意の手段によって配列
番号：１−４の配列に（適当に）導入された欠失、置換および付加を含む。本明
細書で用いられるように、“実質的に精製”という用語は、その蛋白質が検出可
能な夾雑蛋白質を含まないということを意味するが、ＳＡＧ蛋白質は相互作用す
る蛋白質と同時精製してもよく、またオリゴマーとして精製してもよい。好まし
くは、本発明の蛋白質配列は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１２、
配列番号：１４、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号
：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、
配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号
：４６、配列番号：４８および配列番号：５０から成る群から選ばれるアミノ酸
配列を含む。最も好ましい態様では、本発明の蛋白質配列は、配列番号：２およ
び配列番号：４から成る群から選ばれるアミノ酸を含む。本発明の変異配列は、
本明細書で提供される教示および当技術分野で周知の技術を用いて当業者により
日常的態様で特定できる。本発明のこの態様は、下記実施例１２で述べるように
in vitroアッセイのために、さらに下記の酸素ラジカル除去用医薬組成物の成分
として用いることができる新規な精製蛋白質を提供する。

【００２０】 さらに別の態様で、本発明は抗体および抗体を検出する方法を提供する。この
抗体は、配列番号：２および配列番号：４のアミノ酸配列と実質的に同様なアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドと選択的に結合する。本発明の抗体は、ポリクロ
ーナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、配列番号：２または配列番号：４
の配列の全部もしくは部分、または標準的な方法（Harlow & Lane, eds., “Ant
ibody": A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1988))にしたがって
ホストの動物で免疫反応を引き出すためにその変性部分を用いて調製してもよい
。好ましい態様では、配列番号：２または配列番号：４の完全なポリペプチド配
列が、ホスト動物でポリクローナル抗体産生を引き出すために用いられる。

【００２１】 ＳＡＧ抗体を検出する方法は、ＳＡＧ蛋白質を認識する抗体と細胞を接触させ
、ＳＡＧ蛋白質−抗体複合体の検出を可能にする態様で細胞をインキュベートす
ることを含む。抗原による抗体検出のための標準的条件を用いて本発明のこの態
様を達成することができる（Harlow & Lane, 1988)。本発明のこの態様は、下記
の実施例１２および１４で述べるように、in vivoおよびin vitroの両方でＳＡ Ｇ蛋白質を検出することを可能にする。

【００２２】 さらに別の態様では、本発明は、ＳＡＧ欠失を有する細胞を検出する診断アッ
セイを提供する。このアッセイは、細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、このゲノ
ムＤＮＡを以下の配列番号のＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いてＰＣＲ増
幅に付すことを含む：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１１、配列番号
：１３、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、
配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号
：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、
配列番号：４７および配列番号：４９。

【００２３】 本発明のこの態様は、任意の細胞タイプでＳＡＧ欠失を検出することを可能に
し、遺伝的検査または実験室ツールとして用いることができる。ＰＣＲプライマ
ーは、ゲル電気泳動で検出するために充分な大きさを有するＳＡＧ遺伝子フラグ
メントの増幅を可能にする任意の態様で選択できる。検出はいずれの方法によっ
て実施してもよい。これらには、アガロースまたはポリアクリルアミドゲルの臭
化エチジウム染色、放射能標識ＳＡＧ遺伝子フラグメントのオートラジオグラフ
検出、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列分析が含まれる
が、ただしこれらに限定されない。好ましい態様では、検出は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、続いてＤＮＡ配列の分析により欠失を特定して実施できる。
ＰＣＲの条件は、当技術分野で周知の技術にしたがって選択したプライマーの長
さおよび塩基内容を基に日常的に決定できる（Sambrook et al., 1989)。

【００２４】 本発明のまた別の態様は、ＳＡＧ欠失を有する細胞を検出する診断アッセイを
提供する。このアッセイは、全細胞ＲＮＡを単離し、このＲＮＡを以下の配列番
号のＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いて逆転写ＰＣＲ増幅に付すことを含
む：配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号
：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、
配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号
：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７お
よび配列番号：４９。本発明のこの態様は任意の細胞タイプにおけるＳＡＧ欠失
の検出を可能にし、遺伝的検査または実験室ツールとして用いることを可能にす
る。 逆転写は標準的技術（Ausubel et al., “"Current Protocols in Molecular
Biology", ed. John Wiley & Sons, Inc., 1994)により日常的に実施でき、さら
にＰＣＲは上記のように実施できる。

【００２５】 別の態様では、本発明は、ポリＡ（アデニン）、ポリＣ（シトシン）またはポ
リＵ（ウリジン）残基ストレッチを含有するＲＮＡを単離する方法を提供する。
この方法は、ＲＮＡサンプルをＳＡＧ蛋白質と接触させ、ＲＮＡ−ＳＡＧ蛋白質
混合物をＳＡＧポリペプチドを認識する抗体とインキュベートし、抗体−ＳＡＧ
蛋白質−ＲＮＡ複合体を単離し、抗体−ＳＡＧ蛋白質複合体からＲＮＡを精製す
ることを含む。本発明のこの態様は、別個ま種類のＲＮＡを単離する新規なin v
itroの方法を提供する。好ましい態様では、ＲＮＡサンプルは還元剤の存在下で
（ポリＡおよびポリＣ含有ＲＮＡの優先的単離のため）または非存在下で（ポリ
Ｕ含有ＲＮＡの優先的単離のため）ＳＡＧ蛋白質と接触させる。本発明のこの態
様で使用される好ましい還元剤にはＤＴＴおよびβ-メルカプトエタノールが含 まれるが、これらに限定されない。還元剤は、好ましくは約５０ｍＭから１Ｍの
濃度で用いられる。抗体−ＳＡＧ蛋白質−ＲＮＡ複合体の単離は、当技術分野で
標準的な技術によって達成できるが、これにはアガロースまたはセルロースビー
ズに共役させた蛋白質Ａの使用が含まれるが、ただしこれに限定されない。

【００２６】 本発明の別の態様では、細胞のアポトーシス時に誘発される遺伝子を単離する
方法が提供される。この方法は、１セットの細胞をＯＰで処理し、コントロール
の細胞セットは処理せず、各細胞セットからＲＮＡを単離し、各細胞セットから
得たＲＮＡを逆転写とＰＣＲ（“ディファレンシャルディスプレー"）に付し、 コントロールの細胞セットでは発現せずＯＰ処理細胞セットで発現するｃＤＮＡ
を特定し、このＯＰ誘発ｃＤＮＡをクローニングすることを含む。本発明のこの
態様は、ＯＰ誘発アポトーシス経路を制御する他の遺伝子を単離し、アポトーシ
ス調節医薬のデザインを可能にする方法として、さらにＯＰ誘発アポトーシスの
メカニズムを特定する実験室ツールとして有用な手段を提供する。ディファレン
シャルディスプレー技術の詳細は、プライマーの選別も含めて当技術分野では周
知である（Liang & Pardee, Science 257:967-971(1992))。逆転写およびＰＣＲ
条件は、当技術分野で周知の技術（Sambrook et al., 1989)にしたがって選別さ
れるプライマーの長さおよび塩基内容を基に日常的に決定される。好ましい態様
では、ＯＰは５０μＭから３００μＭの濃度で用いられる。最も好ましい実施態
様では、ＯＰは１００μＭから１５０μＭの濃度で用いられる。

【００２７】 本発明のまた別の態様では、哺乳類細胞および／または非哺乳類細胞をレドッ
クス試薬によって誘発されるアポトーシスから保護する方法が提供される。この
方法は、哺乳類および／または非哺乳類細胞に配列番号：１または配列番号：３
に示したＤＮＡ配列と実質的に同様なＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列の発現を促進
するＤＮＡ配列と機能的に連結されている）を含む発現ベクターを導入し、この
細胞を配列番号：１または配列番号：３のＤＮＡ配列が高レベルで哺乳類細胞お
よび／または非哺乳類細胞で発現される条件下でインキュベートすることを含む
。好ましい態様では、ＤＮＡ配列は、本質的に配列番号：１または配列番号：３
から成る。適当な発現ベクターは上記で述べたようなものである。好ましい態様
では、ヒトＳＡＧ遺伝子のコード領域は、構造ＳＡＧ遺伝子発現を可能にするた
めにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの転写制御下で発現ベクターに
サブクローニングされる。

【００２８】 本発明のさらに別の態様では、哺乳類および／または非哺乳類腫瘍細胞の増殖
を抑制する方法が提供される。この方法は、配列番号：１または配列番号：３に
示したＤＮＡ配列と実質的に同様な配列に対してアンチセンスのＤＮＡ（アンチ
センスＤＮＡ配列の発現を促進するＤＮＡ配列とこのアンチセンスＤＮＡ配列は
機能的に連結されている）を含む発現ベクターを哺乳類および／または非哺乳類
腫瘍細胞に導入することを含む。続いて、配列番号：１または配列番号：３のア
ンチセンスＤＮＡ配列が、高レベルで前述の哺乳類および／または非哺乳類腫瘍
細胞で発現する条件下でこの細胞を増殖させる。好ましい態様では、このＤＮＡ
配列は本質的に配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１１、配列番号：１３
、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番
号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７
、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番
号：４７および配列番号：４９から成る。 最も好ましい態様では、このＤＮＡ配列は本質的に配列番号：１または配列番
号：３から成る。さらに好ましい態様では、発現ベクターはアデノウイルスベク
ターを含み、この場合、ホスト細胞でのＳＡＧアンチセンスｃＤＮＡの構造的な
発現を可能にするために、ＳＡＧｃＤＮＡはアンチセンスの向きでサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）プロモータに機能的に連結される。好ましい態様では、ＳＡ
Ｇアデノウイルス発現ベクターは、哺乳類腫瘍細胞塊に注入することによって哺
乳類腫瘍細胞に導入される。

【００２９】 本発明のさらに別の態様では、生物体で酸素ラジカルを除去する方法が提供さ
れる。この方法は、配列番号：１または配列番号：３に示したＤＮＡ配列と実質
的に同様なＤＮＡ配列（この配列は前述のＤＮＡ配列の発現を促進するＤＮＡ配
列と機能的に連結されている）を含む発現ベクターを哺乳類および／または非哺
乳類細胞に導入することを含む。続いて、配列番号：１または配列番号：３のＤ
ＮＡ配列が高レベルで前述の哺乳類および／または非哺乳類細胞で発現する条件
下で、この細胞を増殖させる。好ましい態様では、このＤＮＡ配列は本質的に配
列番号：１または配列番号：３から成る。好ましい態様では、ホスト細胞でのＳ
ＡＧｃＤＮＡの構造的な発現を可能にするために、ＳＡＧｃＤＮＡはサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモータに機能的に連結される。 本発明のさらに別の態様では、生物体で酸素ラジカルを除去する医薬組成物お
よび方法が提供される。この方法は、配列番号：２または配列番号：４のＳＡＧ
蛋白質および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を酸素を減少させる量で
投与することを含む。

【００３０】 ＳＡＧポリヌクレオチド配列を含有する本発明のキメラ遺伝子構築物（例えば
発現ベクター）を遺伝子治療に用いて、選択した標的細胞（非真核細胞、すなわ
ち植物）および真核細胞を含む）でＳＡＧまたはアンチセンスＳＡＧポリヌクレ
オチド配列を発現させることができる。遺伝子治療への応用は、典型的には治療
を必要としている標的ホスト細胞または組織を特定し、この特定した細胞内で所
望の遺伝子産物を発現することができるベクター構築物をデザインし、標的細胞
の効率的な形質導入が得られる態様でこの構築物を細胞に送達することを含む。 遺伝子治療の対象となる細胞または組織は、典型的にはベクター構築物がその
治療のためにデザインされた疾患の影響を受けている細胞または組織である。例
えば、癌の場合には対象組織は悪性腫瘍である。

【００３１】 ある態様では、本発明は、患者の創傷閉鎖（すなわち治癒）を促進する方法を
提供する。この方法は、外因性ＳＡＧを創傷領域に移し、それによってＳＡＧ生
成物を創傷領域で産生させ、創傷の閉鎖(すなわち治癒)を促進することを含む。

【００３２】 本発明の方法は、外部（例えば表面）および内部創傷の両方の閉鎖（すなわち
治癒）を促進する。本発明の方法がその閉鎖（例えば治癒）の促進に有用な創傷
には、擦過傷、剥離、打撲傷、火傷、挫傷、銃創、切り傷、開放創、瘻形成傷、
刺し傷、手術傷、皮下傷、裂傷(tangential wounds)、外傷性気胸傷が含まれる が、ただしこれらに限定されない。好ましくは、本発明の方法は、慢性の開放創
（例えば難治性外部潰瘍など）の閉鎖に用いられる。

【００３３】 外因性ＳＡＧは、任意の適当な手段（例えば本明細書に記載するような手段）
によって創傷領域に導入される。例えば、創傷が外傷である場合、ＳＡＧは創傷
領域にＳＡＧ蛋白質を局所的に適用することによって外因的に供給できる。 好ましくは、外因性ＳＡＧは、ＳＡＧ発現カセットを含むベクターを創傷に関
連する細胞に移入することによって創傷に提供される。創傷領域内の細胞でＳＡ
Ｇが発現されるとき、ＳＡＧ生成物が産生され創傷の閉鎖（すなわち治癒）が促
進される。ＳＡＧ発現カセットを含むベクターを創傷関連細胞に移入することが
好ましい。なぜならばそのような方法は、侵襲が最も少なく、創傷領域内に局所
的にＳＡＧ生成物を供給し、軟膏、溶液または他の非本質的媒体の再適用を必要
としないからである。さらに、ＳＡＧの活性は創傷閉鎖中に発現し続け、治癒後
に不活化される。

【００３４】 ＳＡＧ発現カセットを含むベクターは、細胞に特異的なベクタータイプを移入
するために適した任意の態様（例えば本明細書で考察するような態様）で、創傷
関連細胞に移入することができる。 上記で考察するように、ベクターを移入しようとする創傷関連細胞は、これら
の細胞内でのＳＡＧの発現が創傷閉鎖（すなわち治癒）を促進させる、創傷と十
分に連結された任意の細胞（例えば創傷内の細胞または他に由来する細胞）であ
る。ある態様では、これらの細胞は創傷の細胞で、本発明の方法は系中でこれら
の細胞にベクターを移入することを含む。

【００３５】 他の態様では、これらの細胞は創傷の細胞ではなく、外因性組織（例えば移植
片）またはin vitroの細胞である。例えば、あるタイプの創傷の治癒を促進する
ために、創傷関連細胞は移植片（例えば皮膚移植片）内の細胞である。創傷関連
細胞へのベクターの移入は、したがって移植片内の細胞に生体外で（ex vivo)ベ
クターを移入することを含む。他の創傷の場合、創傷関連細胞はin vitroの細胞
で、これらの細胞はＳＡＧ発現カセット含有ベクターをそれらに移入させた後創
傷領域に移される。 本発明の方法は、創傷を有する任意の患者に適用される。例えばこの患者は動
物（例えば哺乳類）でもよい。好ましくは患者はヒトである。

【００３６】 別の態様では、本発明は植物細胞の増殖を抑制または促進する方法を提供する
。本方法は、キメラ遺伝子構築物を使用して、ＳＡＧを発現させ（植物の成長を
促進させる場合）、またはアンチセンスＳＡＧを発現させ（植物（すなわち雑草
）の成長を抑制させる場合）、選択した対象植物細胞でポリヌクレオチド配列を
発現させることを含む。

【００３７】 ＳＡＧ蛋白質の投与によってin vivoで酸素ラジカルを除去するための用法・用
量は多様な因子（損傷のタイプ、年齢、体重、性別、個々の医学的状態、症状の
重篤度、投与経路、用いられる特定の化合物を含む）を基に決定される。したが
って、用法・用量は広範囲に変動するが、標準的な方法を用いて日常的に決定で きる。好ましい態様では、医薬組成物は０.１から１００mgのＳＡＧ蛋白質を含 む。最も好ましい態様では、医薬組成物は１から１０mgのＳＡＧ蛋白質を含む。

【００３８】 ＳＡＧ蛋白質は固形（顆粒、粉末または坐薬を含む）または液状形態例えば溶
液、懸濁液、乳液）として製造できる。ＳＡＧ蛋白質は通常の製剤化操作（例え
ば滅菌）に付すことができ、および／または通常のアジュバント、例えば保存料
、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などを含むことができる。 ＳＡＧ蛋白質を単一の活性な医薬として投与することができるが、一方、１つ
または２つ以上の他の剤と組み合わせて用いてもよい。組み合わせて投与する場
合、治療薬は同時または別の時間に投与される別個の組成物として処方してもよ
いが、また単一組成物として投与してもよい。

【００３９】 投与する場合、ＳＡＧ蛋白質は通常は表示の投与経路について適切な１つまた
は２つ以上のアジュバントと組み合わされる。ＳＡＧ蛋白質は、乳糖、蔗糖、澱
粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸
マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシ
ウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリド
ン、および／またはポリビニルアルコールと混合し、さらに通常の投与のために
打錠またはカプセルに封入することができる。また別法として、ＳＡＧ蛋白質は
、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメ
チルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、ピーナッツ油、綿
実油、胡麻油、トラガカントゴム、および／または種々の緩衝液に溶解してもよ
い。他のアジュバントおよび投与態様も医薬分野でよく知られている。担体また
は希釈剤は時間延長剤を含むことができる。例えばグリセリルモノステアレート
またはグリセリルジステアレート単独もしくはワックスと併用するか、または他
の物質も当技術分野で周知である。

【００４０】 本発明の好ましい態様では、ＳＡＧ蛋白質の医薬組成物は筋肉内（ＩＭ）また
は静脈内（ＩＶ）に投与される。ＳＡＧ蛋白質活性成分の適当なＩＭまたはＩＶ
投与量は、１日当たり５mg／mlである。ＩＭまたはＩＶ投与の場合、活性成分は
、製剤重量に対して０.００１％から１０％ｗ／ｗ、例えば１％から２％含まれ る。しかし、１０％ｗ／ｗで含むこともできるが、好ましくは５％ｗ／ｗを越え
ず、より好ましくは製剤の０.１％から１％である。 本発明は、下記の実施例を参考にして一層理解が容易になるであろう。これら
実施例は詳述のために提供され、添付の請求の範囲によって定義される発明の範
囲を限定しようとするものではない。

【００４１】

【実施例】

実施例１：ＯＰ誘発性遺伝子の特定 ディファレンシャルディスプレー（ＤＤ）技術を用いて、２つのマウス腫瘍株
でＯＰ誘発 アポトーシスをもたらすか、またはＯＰ誘発 アポトーシスに関連す
る遺伝子を単離した。ＯＰ誘発 アポトーシスは暴露後１２時間で目で見て分か るので（Sun, FEBS Lett. 408:16-20(1997))、 アポトーシス誘発の原因となる 遺伝子は アポトーシス出現前にアップレギュレートまたはダウンレギュレート されると推論できる。したがってこれら腫瘍株の１つでＯＰ処理を６時間実施し
、その後ＤＤ分析を実施した。

【００４２】 マウスＪＢ６腫瘍株Ｌ−ＲＴ１０１（上皮由来腫瘍細胞株）を５％ウシ胎児血
清（Sigma）を含むアール塩類（Earle's salts）添加最少必須培地（BRL）で培 養した。Ｈ−Ｔｘ細胞（偶発的に形質転換したマウス肝臓株）を１０％のウシ胎
児血清および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地
（Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM）で培養した。ヒト結腸癌株ＤＬＤ
−１は１０％ＤＭＥＭで増殖させた。

【００４３】 Ｌ−ＲＴ１０１細胞は１５０μＭのＯＰで６時間処理し、ＤＭＳＯ−処理細胞
をコントロールとして用いディファレンシャルディスプレー分析に付した。簡単
に記せば、ＯＰ処理細胞およびコントロール細胞からＲＮＡゾル（RNAzol）溶液
を用い製造元の指示にしたがい全ＲＮＡを単離し（Ｔｅｌ試験）、さらに先に報
告されたように（Sun et al., Mol. Carcinogenesis 8:49-57(1993))、逆転写（
ＲＴ）に付し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。逆転写に用
いたプライマー（Ｐ１）は配列５ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＲ（配列
番号：５）から成り、ここでＲはアデニン、グアニンまたはシトシンから成る。
Ｐ１をその後のＰＣＲで下流プライマーとして用い、一方、上流プライマーは配
列ＡＡＧＣＴＴＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号：６）から成り、ここでＮはアデニン
、シトシン、グアニンまたはチミンから成る。

【００４４】 プライマーＰ１およびＰ２によって、コントロールとＯＰ処理細胞間で区別可
能な発現が再現性をもって検出された。同じプライマーを用いて、弁別可能な発
現を再現性をもって示すフラグメントをＰＣＲで増幅し、ＯＰで処理したＬ−Ｒ
Ｔ１０１およびＨ−Ｔｘ細胞のノーザン分析（Sun et al., Cancer Res. 52:190
7-1915(1992)）のプローブとして用いた（Sun, FEBS Lett. 408:16-20(1997))。
続いて、製造元の指示にしたがいＴＡクローニングベクター（In Vitrogen）に ＯＰで誘発されたこれらフラグメント（ノーザン分析で決定された）をサブクロ
ーニングし、ＤＮＡシーケナーゼ（DNA Sequenase）バージョン２.０（Amersham
）によって製造元の指示にしたがって配列決定した。得られたクローンはＯＰ誘
発性ｃＤＮＡフグラグメントを含む。

【００４５】 実施例２：ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび５′ＲＡＣＥ ＯＰ誘発性クローンの１つをプローブとして用い、完全な長さのマウスＳＡＧ
ｃＤＮＡをクローニングするためにマウスの肺ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングした。簡単に記せば、１×１０⁶のリコンビナントプラークを１５０mmの プレート（全部で２０枚）で１％ＮＺＹで平板培養した。リコンビナントファー
ジＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、以下を含むハイブリダイゼーション溶液
中で６０℃で１６−１８時間マウスＳＡＧプローブとハイブリダイズさせた（２
×１０⁸cpm／μｇ）：５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０mMリン酸ナトリウ
ム、および１００μｇ／mLの変性ＤＮＡ。続いて、フィルターを２×ＳＳＣ／０
.１％ＳＤＳの溶液中で５分１回、０.５×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで５分１回、 さらに０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳで１５分２回洗浄した。

【００４６】 単離した最も長いクローンは１.０キロベース（“kb"）のフラグメントで、部
分的なオープンリーディングフレームおよび完全な３′末端非翻訳領域から成っ
ていた。マウスの脳のマラソン−レディ（Marathon-Ready）ｃＤＮＡ（Clon Tec
h）を、この１kbフラグメントに由来するプライマーおよびベクター配列に由来 する別のプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーと一緒に供給されたプロトコ
ルにしたがってＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。このスクリーニングに
よって、さらに１００bpのフラグメント（５′末端非翻訳配列およびいくらかの
コード配列から成る）が得られた。得られたｃＤＮＡクローンは１１４０塩基対
（“bp"）（配列番号：１）から成り、１１３アミノ酸を有する新規な推定蛋白 質（１２のシステイン残基を含む（配列番号：２））をコードする。オープンリ
ーディングフレームには１７bpの上流配列が先行していた。開始コドンはコザッ
クコンセンサス配列（M. Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867-19870(1991)）と１
００％一致する形で配置されていた。インフレーム終止コドンは、１つのゲノム
クローンの５′非翻訳領域内の開始コドンから７２bp上流で特定された（図示さ
れていない）。３′末端非翻訳領域は、２つのポリアデニル化シグナル（ＡＡＴ
ＡＡＡ）を有する７９２bpの配列から成る。これらのデータは、ほぼ完全な長さ
のｃＤＮＡが単離されたことを示している。

【００４７】 マウスｃＤＮＡをプローブとして用い、上記のようにヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮ
Ａライブラリー（Strategene）をスクリーニングした。１つの正のクローンを単
離しさらに２回スクリーニングして精製した。この態様では、３′末端にポリア
デニル化シグナルを含む７５４bpのクローンが単離された（配列番号：３）。こ
のヒトｃＤＮＡはまた、１２のシステイン残基を含む新規な予想１１３アミノ酸
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する（配列番号：
４）。単離マウスｃＤＮＡとヒトｃＤＮＡ間の配列同一性は配列全体で８２％で
、コード領域では９４％である。蛋白質レベルでは、それらは９６.５％の同一 性を共有し、１２のシステイン残基は全て保存されていた。ＧＣＧプログラム（
Genetics Computing Group, Madison, WI）を用いた蛋白質データベースのコン ピュータ解析によって、このコード蛋白質は酵母（登録番号Ｚ７４８７６）およ
びＣ−エレガンス（登録番号８０４４９）からの仮定的蛋白質と７０％の同一性
を共有することが示された。

【００４８】 ＧＣＧプログラムを用いて推定される蛋白質配列のモチーフサーチでは、既知
の機能的ドメインは全く得られなかった。しかしながら他のコンセンサスモチー
フについては、それらは各々、不完全な２つのヘム結合部位（コドン４７−５１
および５０−５４にＣＸＸＣＨ）（Matthews, Prog. Biophys. Mol. Biol. 45:1
-56(1985))を、さらに分子のＣ−末端に１つの不完全なＣ₃ＨＣ₄亜鉛環フィンガ
ードメイン（Freemont et al., Cell 64:483-484(1991)）を含んでいる（図１Ａ
）。第二の潜在的なヘム結合ドメイン（図１Ａ）は、アルギニンからヒスチジン
への（アミノ酸５４）置換を含んでいる。これら２つのアミノ酸は構造的に類似
しているので、これは本物のヘム結合部位を構成しているのであろう。この亜鉛
環フィンガードメインのミスマッチはアミノ酸８５でのシステインのヒスチジン
による置換を伴う。この蛋白質の環フィンガードメインはＣ₃ＨＣ₄のコンセンサ
ス構造ではなくＣ₃Ｈ₂Ｃ₃構造である。システインおよびヒスチジン残基は亜鉛 の結合に互換性を有するので（Berg & Shi, Science 271:1081(1996); Inouye e
t al., Science 278:103-106(1997))、これら蛋白質のＣ₃Ｈ₂Ｃ₃ドメインは本物
の亜鉛結合部位を含んでいるのであろう。驚くべきことには、これらのヘムおよ
び亜鉛環フィンガードメインはＣ・エレガンス、マウスおよびヒトで１００％保
存されている。酵母では、Ｃ₃Ｈ₂Ｃ₃モチーフの最後のシステイン残基のみが保 存されていなかった。ヘムおよび亜鉛結合ドメインのこの進化過程での保存はそ
れらの機能的な重要性を示唆している。

【００４９】 ＳＡＧ蛋白質の推定配列で特定される他のモチーフには、ただ１つのミスマッ
チを許すならば、アミノアシルトランスファーＲＮＡシンセターゼII型モチーフ
(コドン５４−６３)、カザルセリンプロテアーゼインヒビターファミリーのモチ
ーフ(コドン８５−１０７)、Ｌｙ−６／Ｕ−ｐａｒドメイン(コドン６５−１０ ７)、原核細胞膜リポ蛋白脂質結合部位（コドン１６−２７）並びにソマトトロ ピン、プロラクチンおよび関連ホルモンモチーフ(コドン４９−６)が含まれる。 したがって、これらの実験によって、別個のヘムおよび亜鉛結合モチーフを含
む、ほぼ同一で発生中に保存された蛋白質をコードする新規なマウスおよびヒト
の遺伝子がクローニングされた。

【００５０】 実施例３：ＳＡＧはマウスおよびヒトの腫瘍細胞でＯＰによって誘発できる クローン化ｃＤＮＡがＯＰ誘発に付されたことを確認するために、マウス腫瘍
株Ｌ−ＲＴ１０１およびＨ−Ｔｘ並びにヒト結腸癌株ＤＬＤ−１から単離したＲ
ＮＡを用いてノーザン分析を実施した。互いに完全に接触する前（サブコンフル
エント）の細胞を１５０μＭのＯＰで２４時間まで種々の時間処理し、さらに全
ＲＮＡを単離した。マウスＳＡＧまたはヒトＳＡＧｃＤＮＡをプローブとして用
い、１５μｇの全ＲＮＡをノーザン分析に付した。 クローン化マウスおよびヒトｃＤＮＡは両方とも、それぞれ１.２kbおよび０.
９kbのサイズのＯＰ誘発性転写物を検出した。これらの遺伝子は、ＯＰ誘発 ア ポトーシス経路で誘発されるので、これらの遺伝子を アポトーシス感受性遺伝 子（以下では“ＳＡＧ”と称する）と命名した。これらの遺伝子はＳＡＧ蛋白質
をコードする。

【００５１】 実施例４：ＳＡＧの組織分布および胚での発現 次にＳＡＧの発現をヒトの多数の組織で調べた。このアッセイは以前に詳細に
報告されたように実施した（Sun et al., Mol. Carcinogenesis 8:49-57(1993);
Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2827-2831(1993)）。簡単に記 せば、全ＲＮＡを多数のヒト組織（Clon Tech）から単離し、続いてマウスおよ びヒトのＳＡＧｃＤＮＡをプローブとして用いてノーザンブロット分析に付した
。ＳＡＧＲＮＡは、調べた全組織（心臓、脳、膵臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓
、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球を含む）
で検出された。高レベルの酸素が消費される心臓、骨格筋および精巣では非常に
高い発現レベルが検出された。その組織分布および酸素消費組織での高レベル発
現、並びにレドックス感受性化合物（ＯＰ）によるその誘発によって、ＳＡＧは
レドックス感受性蛋白質をコードすることが暗示される。

【００５２】 ＳＡＧ蛋白質は発生過程で保存されるので、全ＲＮＡの逆転写とその後以下の
プライマーによるＰＣＲを用いマウスの胚組織でＳＡＧを測定することにより、
ＳＡＧの可能な発生に関する役割を調べた（マウスの胚組織はDr. Tom Glaser (
University of Michigan）から提供された）：ＳＡＧＴＡ.０１、５′−ＣＧＧ ＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＧＧ−３′（配列番号：７）および
ＳＡＧＴ.０２、５′-ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＴＴＧ
−３′（配列番号：８）（これらは完全なＳＡＧコード領域と接する）。１１の
サンプルのＰＣＲ反応混合物は、５５μｌの１０×緩衝液、２２μｌの１.２５m
MｄＮＴＰ、それぞれ１.１μｌのＳＡＧＴＡ.０１およびＳＡＧＴ.０２、５.５ μｌのTaqＤＮＡポリメラーゼ、５.５μｌの³²Ｐ−ｄＣＴＰを含み滅菌水を加え
て４９５μｌになる。マウス胚組織から単離した全ＲＮＡから逆転写した第一の
鎖のｃＤＮＡ５μｌ（Sun et al., Mol. Carcinogenesis 8:49-57(1997)）を含 む各反応管に、４５μｌの反応混合物を添加し、ＰＣＲを２５サイクル実施した
（９５℃４５秒、６０℃で１分および７２℃で２分）。ＰＣＲ生成物の部分標本
５μｌを変性させ、シークエンシングゲルで分離し、これを乾燥させてＸ線フィ
ルムを感光させた。 ＳＡＧＲＮＡは９.５日齢から１９.５日齢のマウスの完全な胚で発現され、よ
り高レベルの発現は９.５日から１１.５日の間で検出された。これらの結果は、
ＳＡＧは胚の発生において役割を有することを示唆している。

【００５３】 実施例５：免疫蛍光反応による細胞内存在場所の決定 ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）を２４穴培養皿内のカバースリ
ップ上で平板培養し、標準的技術（Sambrook et al.1989）にしたがいリン酸カ ルシウム法によって以下の構築物をトランスフェクトした：ｐｃＤＮＡ３.１（m
yc-hisタグを有するInvitorgenベクターｐｃＤＮＡ３）；ｐｃＤＮＡ３.１−Ｓ ＡＧ（ヒトＳＡＧｃＤＮＡがｐｃＤＮＡ３.１にＢａｍＨＩ部位でサブクローニ ングされている。この部位はＣＭＶプロモータの下流で、myc-hisタグについて は上流かつインフレームでその結果、発現に際して得られる融合蛋白質はＳＡＧ
のカルボキシ末端にmyc-hisタグが続くＳＡＧ蛋白質から成る）；またはｐｃＤ ＮＡ３.１−ＬａｃＺ（Invitrogen）。トランスフェクション後２日して、冷Ｐ ＢＳで細胞を１回洗浄し、続いてＰＢＳ中の３％ホルムアルデヒドで１０分、さ
らに１：１のメタノール：アセトンで５分固定した。固定細胞をＰＢＳで４回洗
浄し、Ｍｙｃタグに対して作製された抗体（Invitrogen, １：２００希釈）およ
び１％ＢＳＡ、０.１％サポニン、２μｇ／ml ＤＡＰＩを含むＰＢＳ中で暗所で
震盪しながら１時間インキュベートした。続いて細胞を０.１％サポニン含有Ｐ ＢＳで４回洗浄し、第一の抗体の場合と同じ条件でＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗
体（Jackson Laboratory, １：１００希釈）と１時間インキュベートした。イン
キュベーション後、細胞を０.１％サポニン含有ＰＢＳで４回、さらにＰＢＳで ２回洗浄した。続いて非褪色性マウント液でこのカバースリップをガラススライ
ドにマウントし、Leita Dialux２０顕微鏡を用いて精査した。

【００５４】 ＳＡＧ融合蛋白質は細胞質と核の両方で検出され、一方、β−ガラクトシダー
ゼコントロールはもっぱら細胞質で発現された。免疫蛍光染色はベクターのみの
コントロールでは認められなかった。ＳＡＧの細胞質／核分布は、ＳＡＧおよび
myc−タグ抗体の両方によってＳＡＧが安定にトランスフェクトされた細胞でも 確認された。これらのデータは、ＳＡＧ蛋白質と融合させたエピトープに対して
作製された抗体を用いることによって、外因的に発現されたＳＡＧ融合蛋白質が
トランスフェクトされた細胞内で検出できることを示している。

【００５５】 実施例６：細菌でのＳＡＧ蛋白質の発現と精製 ヒトＳＡＧｃＤＮＡの完全なオープンリーディングフレームを上記のようにＰ
ＣＲで増幅させ、Ｔ７プロモータの制御下でｐＥＴ１１発現ベクター（Novogen ）にサブクローニングし、構築物ｐＥＴ１１ａ−ｈＳＡＧを得た。ＳＡＧＤＮＡ
挿入物の配列と方向性はＤＮＡ配列決定で確認した。ｐＥＴ１１ａ−ｈＳＡＧを
用いて、大腸菌ＢＬ２１（Novagen, Inc.）を形質転換した。形質転換細胞をア ンピシリン（５０μｇ／ml）含有ＬＢ培地で増殖させた。ＳＡＧ発現を０.５mM のＩＰＴＧで誘発し、ＳＡＧ蛋白質は封入体内に見出された。この封入体を以下
のように単離した。

【００５６】 ＩＰＴＧ誘発に続いて、４リットルの細胞を１５０rpmに設定した震盪装置で ３７℃で４.５時間増殖させた。５０００rpmで１０分遠心分離して細胞ペレット
を得、１００mlの１００μＭＰＭＳＦ含有ＴＮ緩衝液（２０mMトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ７.５）、５０mM ＮａＣｌ）に再懸濁させた。この再懸濁させた細胞ペレッ
トを続いて超音波処理（フィッシャー・サイエンティフィック社のモデル５０ソ
ニックディスメンブレータで設定１５で１５秒／回で５回処理）し、さらにフレ
ンチ細胞圧搾機で１７５.８kg／cm²（２５００lb／in²）で圧縮し、続いて１mM のＭｇＣｌ₂および１０mgのＤＮＡ分解酵素Ｉを加えた。細胞溶解物を氷上に３ ０−６０分静置し続いて１８０００rpmで遠心分離して上清を廃棄した。

【００５７】 ペレットは２つの層をもつように見えた。上部の白色層をＴＮ緩衝液で注意深
く吹き飛ばして除去した。残存する底部の暗褐色層を１５ｍｌの尿素緩衝液（７
Ｍ尿素、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、２００mMのＮａＣｌ）に完全に 再懸濁させ、一晩室温で放置した。再懸濁細胞ペレットを血清学用ピペットで激
しく均質化し、続いて４０分ＳＷ５０超遠心ロータを用いて４００００rpmで遠 心分離した。上清を集め、セントリコン−１０で５mlの容積に濃縮し、尿素緩衝
液で平衡化させたセファクリル−１００カラム（直径２.５cm、長さ１００cm） に負荷した。０.２５ml／分の速度でカラムを操作し、分画を採集した。予想さ れたように、褐色の初期分画は分子量の大きい蛋白質で構成されていた。それら
はまた、ＳＡＧ蛋白質（約１３kDa）と同じサイズの蛋白質を含んでいた。ＳＡ Ｇ蛋白質は１２のシステイン残基を含むので、ＳＡＧ蛋白質は細菌で発現される
場合オリゴマーを形成し、したがってＳＡＧ蛋白質オリゴマーとして溶出する。
ＳＡＧはレドックス感受性蛋白質であるので、ＳＤＳサンプル緩衝液に存在する
ＤＴＴはＳＡＧ蛋白質オリゴマーをモノマーに還元し、速く移動するバンドの検
出をもたらす。初期分画をＤＴＴを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させるとき
、１３kDa ＳＡＧ蛋白質ハンドは消失し、２６０kDaバンドが検出され、これは ＳＡＧ蛋白質の２０量体を示す。この特有の性質はＳＡＧ蛋白質の精製に役立つ
。初期分画をまとめて、７Ｍ尿素と５mMのＤＴＴで予備平衡化させた同じセファ
クリル−１００カラムに負荷した。

【００５８】 ＳＡＧ蛋白質オリゴマーは、負荷緩衝液にＤＴＴを用いることによってモノマ
ーに還元され、後期分画に溶出し、したがってそれを高分子量の夾雑蛋白質（よ
り早く溶出する）から分離した。褐色の分画をまとめ、セントリコン−１０を用
いて５mlの容積に濃縮した。ＤＴＴを５mMの濃度に添加した。尿素緩衝液プラス
５mMのＤＴＴで平衡化したＳ−１００カラム（直径２.５cm、長さ１００cm）に まとめた分画を負荷した。カラムを０.２５ml／分の流速で操作し、分画を採集 した。ＳＡＧ蛋白質を含む分画は褐色で、ＳＡＧはヘム含有蛋白質であることを
強く示唆している。ＳＡＧ蛋白質含有分画およびそのＤＴＴ感受性はＳＡＧ抗体
を用いてウェスタンブロットで確認した。褐色分画をまとめ、セントリコン−１
０濃縮装置で２ｍｌの容積に濃縮した。得られたサンプルを４リットルの透析緩
衝液（１５０mMのＫＣｌ、２０mMトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)）に対して４℃で 一晩透析し、尿素およびＤＴＴを除去して再び折り畳まれたＳＡＧ蛋白質を得た
。透析緩衝液で平衡化したＳ−１００カラム(長さ１００cm、直径２.５cm)にこ の透析サンプルを負荷した。褐色分画をまとめ、セントリコン−１０で１mlの容
積に濃縮した。得られたサンプルは４℃で保存した。蛋白濃度をバイオラド蛋白
アッセイによって測定した。サンプルの純度は１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
示した。これらのデータはリコンビナントＳＡＧ蛋白質の精製を明らかにした。

【００５９】 実施例７：ＳＡＧ蛋白質のレドックス感受性 精製リコンビナントＳＡＧ蛋白質が、蛋白精製時に示したように同じレドック
ス感受性を有していることを確認するために、次に、再度折り畳まれたＳＡＧの
レドックス試薬に対する感受性を調べた。ＳＡＧ蛋白質（１μｇ）を種々の濃度
のＤＴＴ（１Ｍ、３００mM、１００mM、または３０mM）またはＨ₂Ｏ₂（１５mM、
５０mM、１５０mMまたは４５０mM）に１０分間暴露し、その後ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、続いてウェスタンブロット分析を実施し
た。別法として、１０μｇのＳＡＧ蛋白質を５０mMのＨ₂Ｏ₂で１０、３０、６０
または１２０分インキュベートし、続いてＰＡＧＥ分離さらにクーマシーブルー
染色を実施した。

【００６０】 ＳＡＧ蛋白質の二量体は還元剤ＤＴＴに対して相当な抵抗性を有する。なぜな
らば、大量の二量体がＤＴＴ処理後にモノマーに還元されたわけではないからで
ある。しかしながら、Ｈ₂Ｏ₂は、おそらく分子間ジスルフィド結合の形成を介し
て１５mMでもＳＡＧ蛋白質のオリゴマー化を誘導する。インキュベーション時間
が長くなればより規模の大きいＳＡＧ蛋白質オリゴマーが検出されたので、この
オリゴマー化はインキュベーション時間に依存する。興味深いことには、モノマ
ー型より速く移動するバンドはＨ₂Ｏ₂処理で認められ、ＳＡＧ蛋白質のモノマー
型は、おそらく分子内ジスルフィド結合の形成のために二重体になる。

【００６１】 Ｈ₂Ｏ₂誘発ＳＡＧ蛋白質のオリゴマー化はＤＴＴ処理によって逆行できるか否
かを決定するために、１μｇの精製ＳＡＧ蛋白質を５０mMのＨ₂Ｏ₂とともに１０
分間インキュベートし、さらにＨ₂Ｏ₂、５０mM ＤＴＴ、１００mM、５００mMま たは１mM ＤＴＴのいずれかで１０分間インキュベートした。サンプルをＰＡＧ Ｅで分離し続いてウェスタンン分析に付した。結果は、Ｈ₂Ｏ₂誘発ＳＡＧ蛋白質
のオリゴマー化は、ＤＴＴでその後インキュベーションすることによって用量依
存的態様で逆行させることができることを明らかにした。このことは、ＳＡＧ蛋
白質のオリゴマー化はレドックス調節を受けることを示している。

【００６２】 ＳＡＧ蛋白質のオリゴマー化および二重体形成はそれぞれ分子間および分子内
ジスルフィド結合の形成によることを確認するために、ＳＡＧ蛋白質をＨ₂Ｏ₂に
暴露する前に、５０mMのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ＳＡＧ蛋白質の遊離
ＳＨ基をアルキル化するアルキル化試薬で処理した。精製ＳＡＧ蛋白質（１μｇ
）を、Ｈ₂Ｏ₂処理の前に５０mM ＮＥＭまたはＤＭＳＯまたは緩衝液のみと１０ 分間予備インキュベートした。サンプルをＰＡＧＥで分離し、続いてウェスタン
ブロット分析を実施した。ＳＡＧ蛋白質のＤＭＳＯとの予備インキュベーション
はＨ₂Ｏ₂誘発オリゴマー化および二重体形成に影響を与えず、一方、ＮＥＭの予
備処理はＨ₂Ｏ₂の活性を無効にした。分子間ジスルフィド結合（オリゴマー化）
も分子内ジスルフィド結合（二重体形成）も形成されなかったことは、遊離ＳＡ
Ｇ蛋白質ＳＨ基のアルキル化はＨ₂Ｏ₂感受性を失わせることを示している。これ
らのデータは、ＳＡＧ蛋白質はレドックス感受性であることを明らかにした。二
重体形成およびオリゴマー形成の両方から明らかなように、それは、Ｈ₂Ｏ₂に暴
露されたとき分子内および分子間ジスルフィド結合が形成される。これらのＨ₂ Ｏ₂誘発変化は、その後の還元剤（ＤＴＴを含む）による処理によって逆行され るか、またはＮＥＭ予備処理によって防ぐことができる。亜鉛はまたＨ₂Ｏ₂誘発
オリゴマー化を促進することができることが観察されたが、ただし亜鉛自体はオ
リゴマー化を誘発できなかった。

【００６３】 実施例８：ＳＡＧ変異体の作製 ヘム結合およびＳＡＧオリゴマー化における個々の特定のシステイン残基の役
割を知るために、一連の単一および二重ＳＡＧ変異体をヘム結合部位だけでなく
亜鉛環フィンガーモチーフでも作製した（図１Ｂ参照）。ＳＡＧｃＤＮＡの１点
変異を作出するために１５対のセンスおよびアンチセンスプライマーをデザイン
した。これらは部分的に相補的で、所望の点変異を含んでいる。NheＩ／BamHＩ 部位でｐＥＴ１１ａベクターにクローニングした野性型ＳＡＧｃＤＮＡをＰＣＲ
増幅のための鋳型として用いた。ａ）プライマーＳＡＧＰ.０１（５′−ＴＡＴ ＧＧＣＴＡＧＣ ＡＴＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧ−３）（配列番号：９）と
アンチセンスプライマーの各々、およびｂ）センスプライマーの各々とＳＡＧＴ
.０２（配列番号：８）をそれぞれ用い、２つの別々のＰＣＲ反応を実施した。 互いにオーバーラップし、さらに所望の点変異を含む得られたＰＣＲ生成物を混
合し、第三のＰＣＲの鋳型として用いた。用いたプライマーはＳＡＧＰ.０１お よびＳＡＧＴ.０２で、これらはＳＡＧｃＤＮＡの完全なコード領域に接してい る。ＰＣＲは以前に報告したように実施した（Sun et al., BioTechniques 12:6
39-640(1992)）。ＰＣＲ生成物を制限酵素NheＩおよびBamHＩで消化し、同じ制 限酵素で消化したｐＥＴ１１ａベクターにサブクローニングした。ＳＡＧ二重変
異体（ＭＭ１０、ＭＭ１３、ＭＭ１４、図１Ｂを参照）を作製するために、位置
指向的突然変異誘発キット、クィックチェンジをスタラテジーン社（Strategene
, La Jolla, CA）から購入し、指示にしたがって使用した。作製した全てのＳＡ
Ｇ変異体はＤＮＡ配列決定によって確認した（配列番号：２１、配列番号：２３
、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番
号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１
、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７および配列番号：４９）。
これらの変異ＳＡＧによってコードされる予想される変異ＳＡＧ蛋白質は、配列
番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３
０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列
番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４
８および配列番号：５０に示されている。

【００６４】 個々のＳＡＧ変異体発現ベクターを用いて大腸菌株ＢＬ２１（Novagen, Inc. ）を形質転換した。変異ＳＡＧ蛋白質を発現させ、実施例６で詳述したように精
製した。セファクリル−１００カラムを通した後の分画を集め、８−２５％ファ
スト（Phast）ゲルで解析し続いてクーマシブルー蛋白質染色を施した。変異Ｓ ＡＧ蛋白質を含む純粋な分画を４リットルの２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５ ）で透析し、ＳＡＧ蛋白質オリゴマー化実験に用いた。 精製した野性型ＳＡＧ蛋白質はヘム含有褐色蛋白質である（実施例９参照）。
精製したＳＡＧ蛋白質変異体のいくつかは、褐色の色を失っているか（ＭＭ３お
よびＭＭ１３）、または野性型ＳＡＧ蛋白質と比較して褐色が減少している（Ｍ
Ｍ１）ことが分かった。この色の変化はヘム結合の消失または減少を示している
（表１）。

【００６５】

【表１】

【００６６】 変異ＳＡＧ蛋白質のオリゴマー化を調べるために、各変異ＳＡＧ蛋白質だけで
なく野性型ＳＡＧを５０mMのＨ₂Ｏ₂で１０分処理した。ＭＭ１４を除き全てのＳ
ＡＧ変異体はＨ₂Ｏ₂に暴露したときオリゴマー化することができる。変異体１４
（亜鉛環フィンガードメインのＣ７位およびＣ８位の二重変異体）はオリゴマー
化に対して感受性を失い（表１）、このことは、これら２つの位置が分子間ジス
ルフィド結合形成に重要であることを示している。

【００６７】 実施例９：ＳＡＧ蛋白質のヘム測定 ＳＡＧ蛋白質のヘム含有量を先に報告されたように測定した（Rieske, Method
s in Enzymol. 76:488-493(1967)）。簡単に記せば、１mgの精製されたＳＡＧ蛋
白質をチトクロームＣ、カタラーゼおよびＢＳＡ（コントロールとして）ととも
に冷アセトン（０.５ml）で抽出した。遠心分離後、ペレットをクロロホルム： メタノール（２：１）０.５ml、冷アセトン０.５ml、最後に５μｌの２.４Ｎ Ｈ
Ｃｌを含む冷アセトン０.５mlで連続的に抽出した。アセトン抽出物を急速真空 下で乾燥させ、０.５mlのピリジンに溶解した。０.５mlの０.２ＮＮａＯＨを添 加した後、溶液を簡単に遠心分離して透明な上清を回収した。上清に希フェリシ
アン化カリウム（０.０５Ｍ）を１滴添加し、水をブランクとして用い、吸収を １.０mlの石英キュベットで５５６nmで測定した。続いて１０μｌの２ＭのＤＴ Ｔを添加して溶液を還元し、吸収を５５６nm、５８７nmおよび５５０nmでそれぞ
れ測定した。 ５５６、５８７および５５０nmでのヘムの吸収をＳＡＧ蛋白質、チトクローム
Ｃおよびカタラーゼ中で観測したがＢＳＡ中ではしなかった。この結果は、ＳＡ
Ｇ蛋白質はヘムを含むことを示したが、ＳＡＧ蛋白質とヘム分子との分子比は明
らかにしなかった。

【００６８】 実施例１０：ＳＡＧ蛋白質抗体作製 ＳＡＧ蛋白質に対する２つのポリクローナル抗体を標準的方法（ワーナー・ラ
ンバート（Warner-Lambert）と役務契約下ザイムド・ラボラトリーズ社（Zymed
Laboratories, Inc. San Francisco）による）作製した。簡単に記せば、ペプチ
ド抗体は以下のようにして作製された。ＳＡＧ蛋白質のＣ−末端に位置する１６
アミノ酸ペプチド（ＳＡＧ−Ｐｅｐ１：ＱＮＮＲＣＰＬＣＱＱＤＷＶＶＱＲ）（
配列番号：１０）（コドン９５−１１０）を標準的技術で合成し精製した。精製
ペプチドをキーホールリンペットのヘモシアニン（ＫＬＨ）とシステイン残基を
介して結合させた。この結合ペプチド（０.５mg）を等容積のフロイントの完全 アジュバント（ＣＦＡ）で乳化させ、ウサギの皮下に注射し、続いてフロイント
の不完全アジュバント（ＩＦＡ）中の０.５mgをそれぞれ用いて３週間間隔で４ 回追加免疫を施した。最後の追加免疫から１０日後にウサギから採血し抗血清を
採集した。抗原として精製ヒトＳＡＧ蛋白質（上記のように調製）を使用する蛋
白質抗体の作製にも同じプロトコルを用いた。

【００６９】 実施例１１：ＳＡＧ蛋白質転写調節活性の解析 ＳＡＧ蛋白質は、そのＣ₃Ｈ₂Ｃ₃モチーフにより亜鉛環フィンガー蛋白質ファ ミリーに属する（Saurin et al., TIBS 21:208-214(1996)）。いくつかの亜鉛環
フィンガー蛋白質はＤＮＡと結合し、転写抑制物質（例えばＲＩＮＧ１）として
機能し（Satijn et al., Mol. Cell. Biol. 17:4105-4113(1997)）、一方、他の
ものは転写活性化物質として機能することが示された（Chapman & Verma, Natur
e 382:678-679(1996); Monteiro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:135
95-13599(1996)）。ＳＡＧ蛋白質の転写調節活性を調べるために、ヒトＳＡＧの
完全なオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅させ
、ｐＧ４ベクター（Sadowski et al., Nature 335:563-564(1988)）のＧａｌ− ４ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１４７をコードする）の下流でインフレー
ム融合およびアンチセンス融合として融合させた。得られた構築物を配列決定し
て、インフレーム融合およびＰＣＲにより発生する変異がないことを確認した。
ヒト腎２９３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１５７３）へのトランスフェクショ
ン効率の標準化のために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）レポーター発現ベクター（Sadowski et al., Nature 335:563-564(1988
)）およびβ−ガラクトシダーゼレポーター（その発現はＣＭＶプロモータによ って駆動される）とともにこの構築物をリン酸カルシウム法により同時トランス
フェクトした。ＣＡＴ活性は、ＣＡＴアッセイキット（Quan-T-CAT; Amersham）
を用い製造元の指示にしたがってトランスフェクション後３６時間で測定した。
ＰＧ４−ＶＰ１６（既知の転写因子（Triezenberg et al., Genes and Develop.
2:718-729(1988)）をＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインの下流に融合させ、陽性コン
トロールとして用いた。活性化は、ベクターコントロールから１番として任意に
ＣＡＴ活性を選択し、それと他の構築物とを比較することによって算出した。３
回のトランスフェクションおよびアッセイを別個に実施した。

【００７０】 ＳＡＧ蛋白質はトランスアクチベーション活性を示さなかった。陽性コントロ
ール、ＶＰ１６はＣＡＴ活性を３００倍活性化させた。トランスリプレッション
活性について調べるために、ＳＡＧ構築物（センスおよびアンチセンスの両方）
をｐＧ４−ＶＰ１６とともに同時にトランスフェクトした。再度、いずれの向き
のＳＡＧもＶＰ１６誘発トランスアクチベーションの顕著な発現を誘発しなかっ
た。これらの結果は、ＳＡＧ蛋白質は、Ｇａｌ−４ＤＮＡ結合ドメインの下流に
融合させたとき転写調節活性を欠くことを示している。

【００７１】 実施例１２：ＳＡＧはＲＮＡ結合蛋白質である ＭＤＭ２蛋白質の亜鉛環フィンガードメインはＲＮＡと結合することが示され
た（Elenbaas et al., Mol. Med. 2:439-445(1996)）。ＳＡＧ蛋白質は転写調節
活性を示さなかったので、ＳＡＧ蛋白質がＲＮＡまたはＤＮＡに結合することが
できるか否かを調べた。精製ＳＡＧ蛋白質と種々の核酸セルロース抱合物との結
合を文献（Elenbaas et al.1996)にしたがって実施した。簡単に記せば、０.５ μｇのＳＡＧ蛋白質を３００μｌのＲＮＡ結合緩衝液中で４℃で１時間、二本鎖
ウシ胸腺ＤＮＡ、変性ウシ胸腺ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、またはアガロースもしく
はセルロースビーズ（Sigma)に抱合させ製造元に指示にしたがって使用した４種
のＲＮＡホモポリマーカラム（Sigma）の１つとともにインキュベートした。Ｒ ＮＡ結合緩衝液は、２０mMトリス（ｐＨ７.５）、１５０mMのＮａＣｌ、５mMの ＭｇＣｌ₂、０.１％のノニデットＰ−４０、５０μＭのＺｎＣｌ₂、２％グリセ ロール、および１mMのＤＴＴから成る。カラムを３mlのＲＮＡ結合緩衝液で洗浄
し、非特異的に結合した蛋白質をビーズから除去し、続いてＳＤＳサンプル緩衝
液中で煮沸した。ビーズから溶出させた蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｓ
ＡＧ蛋白質に対して作製したポリクローナル抗体（これについては、ＥＣＬケミ
ルミネセンス（Amersham）を用い製造元の指示にしたがって検出を行ったことを
以前に述べた）を用いウェスタンブロット分析を実施するためにニトロセルロー
スに移した。

【００７２】 精製ＳＡＧはポリＵ、ポリＡおよびポリＣＲＮＡにそれぞれ結合した。ポリＧ
ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡへの結合は認められなかった。ｄｓＤＮＡ結合を示すバ
ンドはＳＡＧの分子量と一致しなかった。オリゴマーのＳＡＧ蛋白質はポリＵＲ
ＮＡと結合し、一方、モノマー形態のＳＡＧはポリＡおよびポリＣＲＮＡと結合
する。精製ＳＡＧ蛋白質をマーカーとして泳動させた。これらの結果は、ＳＡＧ
はＲＮＡ結合蛋白質で、結合特異性はオリゴマー形態ＳＡＧによって決定される
ことを示唆している。

【００７３】 実施例１３：癌細胞系の２つの欠失変異ＳＡＧの特定 全ＲＮＡをＤＬＤ−１結腸癌細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ２２１）から単離
し、プライマーＳＡＧＴＡ．０１およびＳＡＧＴ．０２を用いてＲＴ−ＰＣＲに
付した。得られたＰＣＲフラグメントをＴＡクローニングベクター（Invitrogen
）にサブクローニングした。得られたクローンの配列確認時に、いくつかのクロ
ーンは、それぞれヌクレオチド１７０または１７７で７ｂｐまたは４８ｂｐの欠
失を有することが認められた（開始コドンの最初のＡをヌクレオチド＃１とする
）。両方のＳＡＧ欠失は潜在的ヘム結合部位をコードする。７塩基対欠失（ＳＡ
Ｇ変異体１）（配列番号：１１）はフレームシフト欠失で、生じた蛋白質（配列
番号：１２）において下流でコードされる亜鉛環フィンガーモチーフが破壊され
ている。一方、４８塩基対欠失（ＳＡＧ変異体２）（配列番号：１３）は、イン
フレーム欠失で、コードされる蛋白質（配列番号：１４）で１６アミノ酸が排除
されているが、亜鉛環フィンガーモチーフは維持されている。

【００７４】 肺、脳、腎臓、前立腺、精巣、鼻咽頭、骨、子宮頸管および包皮に由来する２
０のヒト腫瘍株および形質転換株全てから全ＲＮＡを単離し、先に記載されたよ
うに（Sun et al., Mol. Carcinogenesis 8:49-57(1993))、ＲＴ−ＰＣＲ分析に
付した。ゲノムＤＮＡもまたこれらの細胞株から単離し、文献（Sun et al., Bi
oTechniques 12:639-640(1992)）にしたがってＰＣＲ増幅に付した。ＰＣＲに用
いたプライマーは以下のとおりであった：ｈＳＡＧ.Ｍ１、５′−ＧＣＣＡＴＣ ＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧ−３′（配列番号：１５）（ｈＳＡＧのｃＤＮＡのヌ
クレオチド１５１から始まる）、およびＳＡＧＴ.０２−１、５′−ＧＧＡＴＣ ＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＣ−３′（配列番号：１６）（終
止コドン（下線部）を含む）。得られたフラグメントは野性型ＳＡＧの２００ｂ
ｐである。ＰＣＲを³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（Amersham）の存在下で実施し、先に報告さ
れたように（Sun et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 4:2
61-267(1995)）、ＰＣＲ生成物を６％の変性配列決定ゲルで解析した。野性型お
よび２つの欠失変異体に一致するバンドをゲルから切り出し、同じプライマーセ
ットでＰＣＲ増幅を実施し、得られたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列を確認す
るためにシークエンシングを実施した。

【００７５】 ７塩基対欠失および４８塩基対欠失の両方が、ＣＡＴＥＳ−１Ｂ細胞株（ＡＴ
ＣＣ（登録番号ＨＴＢ１０４）から得た精巣癌株）由来のＲＮＡでのみ検出され
た。この腫瘍株はまた野性型ＳＡＧＤＮＡ配列も含んでいる。これら３つのバン
ドの同定はＰＣＲ増幅およびＴＡクローニング後のＤＮＡ配列決定によって確認
した。野性型ＳＡＧのみを含むＨＯＮＥ−１（鼻咽頭癌株）を比較のために含め
た。

【００７６】 次に、これらＳＡＧ欠失がＤＮＡレベルで検出可能か否かを調べた。ゲノムＤ
ＮＡをＣＡＴＥＳ−１Ｂ細胞から単離し、先の報告（Sun et al., BioTechnique
s 12:639-640(1992)）にしたがってＰＣＲ分析に付した。用いたプライマーはｈ
ＳＡＧ.Ｍ１およびＳＡＧＴ.０２（配列は上記参照）であった。ＣＡＴＥＳ−１
Ｂ細胞のゲノムＤＮＡは野性型ＳＡＧのみを有し、ＳＡＧ欠失変異は検出されな
かった。これらの結果は、ＳＡＧ欠失変異はヒト癌細胞株で非常に稀に発生する
ことを示している。ＳＡＧＲＮＡ（ゲノムＤＮＡではなく）の変異の検出は、Ｓ
ＡＧメッセンジャーＲＮＡのＲＮＡ編集改変を反映しているのかもしれない。

【００７７】 実施例１４：安定にＳＡＧがトランスフェクトされた哺乳類細胞の製造 次に、ヒトＳＡＧ蛋白質の潜在的な生物学的機能を細胞でのその過剰発現によ
って調べた。ＤＬＤ−１細胞を以下のプラスミドでトランスフェクトした：ｎｅ
ｏコントロールｐｃＤＮＡ−３（Invitrogen）（上記のｐｃＤＮＡ３.１と同一 であるが、ただしmyc-hisタグを欠く）、ｐｃＤＮＡ−ＳＡＧ、ｐｃＤＮＡ−Ｓ ＡＧ−変異体１、およびｐｃＤＮＡ−ＳＡＧ−変異体２（当技術分野で周知の方
法を用いてそれぞれBamHＩ部位にサブクローニングしたＳＡＧ、ＳＡＧ１または
ＳＡＧ２を含むｐｃＤＮＡ３）。ＳＡＧ変異構築物は以下のようにしてＲＴ−Ｐ
ＣＲによって作製した。全ＲＮＡをＤＬＤ−１細胞から単離し、逆転写、続いて
ＰＣＲ増幅に付した。用いたプライマーはＳＡＧ.ＴＡ０１（配列番号：７）お よびＳＡＧＴ.０２（配列番号：８）で、これらはＳＡＧ遺伝子の完全なコード 領域に接する。ＰＣＲ生成物を制限酵素BamHＩで消化し、ｐｃＤＮＡ（Invitrog
en, San Diego)（ＣＭＶプロモータで転写制御されている哺乳類の発現ベクター
で、構造的に遺伝子発現を駆動する）にサブクローニングした。得られたクロー
ンを配列決定して、センスおよびアンチセンスの向き並びにＰＣＲにより発生す
る変異を含まないこと確認した。ＤＮＡ配列決定によって、ＤＬＤ腫瘍細胞で野
性型ＳＡＧクローンおよび２つの欠失変異体が明らかにされた：ＳＡＧ変異体１
（７ｂｐ欠失、配列番号：１１）およびＳＡＧ変異体２（４８ｂｐ欠失、配列番
号：１３）。

【００７８】 野性型（センスおよびアンチセンスの両方向）、ＳＡＧ変異体１およびＳＡＧ
変異体２を発現しているプラスミドをｎｅｏコントロールベクターとともにＤＬ
Ｄ−１細胞をリポフェクタミン（ＢＲＬ)によりトランスフェクトした。ネオマ イシン耐性コロニーを１８日間のＧ４１８選別（６００μｇ／ml）によって特定
した。安定なクローンを周知の方法（Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 90:2827-2831(1993)）によってリング単離し、ＳＡＧ発現はノーザン分析によ
ってモニターした。ＳＡＧ蛋白質発現について、選別したクローンを下記のよう
に免疫沈降反応によって調べた。

【００７９】 全ＲＮＡをクローン化細胞株から単離しノーザン分析を実施した。以下の構築
物をトランスフェクトした細胞株を分析した：ベクターコントロールＤ１−３お
よびＤ１−６；ＳＡＧ野性型Ｄ１２−１およびＤ１２−８；ＳＡＧ変異体１、Ｄ
３−３およびＤ３−４；並びにＳＡＧ変異体２、Ｄ４−２およびＤ４−５。 ヒトＳＡＧｃＤＮＡでプローブした選別した安定的ＳＡＧ発現クローンから得
たＲＮＡのノーザンブロット分析によって、全てのＳＡＧトランスフェクタント
がＳＡＧｍＲＮＡを発現することが示され、一方、非常に低レベルの内因性ＳＡ
Ｇメッセージがｎｅｏコントロール細胞で検出された。

【００８０】 続いて、ベクターコントロール株並びにＳＡＧ野性型およびＳＡＧ欠失変異体
トランスフェクタントを、標準的技術を用いて（Sun et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 90:2827-2831(1993)；Ｓun et al., Mol. Carcinogenesis 8:49-57
(1993)）免疫沈降反応に付した。サブコンフルエントのＳＡＧトランスフェクタ
ントを１時間メチオニン枯渇に付し、続いて³⁵Ｓ−トランスラベル（０.２mCi／
mL）で代謝により３時間標識した。続いて、２％ノニデットＰ４０、０.２％Ｓ ＤＳ、０.５％デオキシコール酸ナトリウム、１mMオルトバナジン酸ナトリウム 、５mMフッ化ナトリウム、５mMピロリン酸ナトリウム、１mMフェニルメチルスル
ホニルフルオリドおよび１μｌ／mlのロイペプチンを含む溶解緩衝液中で３０分
氷上で細胞を溶解させ、１２０００×ｇで遠心分離した。ウサギの抗ヒトＳＡＧ
抗体（上記のとおり発生させた）を用いて、ＴＣＡで沈澱する上清の放射能活性
（１×１０⁸cpm）を免疫沈降させた。免疫沈降物を集め洗浄し、１０−２０％の
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し、続いてオートラジオグラフィーを実
施した。ＳＡＧ蛋白質の高発現が野性型のトランスフェクタントでのみ検出され
た。用いた抗体はこの２つのＳＡＧ蛋白質変異体を認識しなかった。これらのデ
ータは、野性型または変異ＳＡＧ蛋白質のいずれかを発現している安定にトラン
スフェクトされた細胞の産生を示している。

【００８１】 実施例１５：レドックス試薬に暴露後のＳＡＧトランスフェクタントの形態的外
観 ２つのneoコントロール（Ｄ１−３およびＤ１−６）および２つのＳＡＧ産生 株（Ｄ１２−１およびＤ１２−８）を選び、それらのレドックス化合物に対する
感受性を形態の観察によって調べた。１５０μＭのＯＰ、２００μＭのＨ₂Ｏ₂ま
たは１２５μＭの亜鉛に２４時間暴露した後、ｎｅｏコントロール細胞は収縮し
て剥離した（アポトーシスの徴候である）が、一方、ＳＡＧ発現細胞は形態的に
は正常であった。これらの結果は、ＳＡＧ産生はレドックス化合物によって誘発
されるアポトーシスから細胞を保護することを示している。しかしながら、ＳＡ
Ｇの発現は銅に対する保護はもたらさなかった。ベクターコントロールとＳＡＧ
トランスフェクタント間ではＣｕＳＯ₄処理（７５０μＭまで）でアポトーシス の形態的徴候に違いは観察されなかった。高用量では全ての株でアポトーシスが
誘発された。

【００８２】 実施例１６：ＳＡＧ発現はＤＮＡの分断から細胞を保護する 次に、これらのＳＡＧをトランスフェクトされた細胞のＯＰ誘発アポトーシス
に対する感受性を、ＤＮＡ分断（アポトーシスの顕著な特徴）をモニターするこ
とによって調べた。サブコンフルエント（８０−９０％）の、野性型ＳＡＧ、Ｓ
ＡＧ変異体１、ＳＡＧ変異体２を発現しているＳＡＧトランスフェクト細胞また
はベクターコントロール細胞を３.５×１０⁶／１００mm培養皿に播種し、１６−
２４時間後に１５０μＭのＯＰ、１２５μＭ硫酸亜鉛、または２００μＭのＨ₂ Ｏ₂に２４時間暴露した。２×１００mm培養皿の剥離細胞および付着細胞の両方 を採集し、以下のようにＤＮＡ分断分析に付した。細胞を遠心分離によって集め
、溶解緩衝液（５mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）；２０mMのＥＤＴＡ；０.５％ト リトンＸ−１００）で氷上で４５分溶解させた。１４０００rpm（４℃で４５分 ）の遠心分離の上清中の分断ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで２回、さらに
クロロホルムで１回抽出し、エタノールおよび塩で沈澱させた。ＤＮＡペレット
を７０％エタノールで１回洗浄し、１００μｇ／mlのＲＮＡ分解酵素を含むＴＥ
緩衝液に２時間３７℃で再懸濁させた。分断ＤＮＡを１.８％アガロースゲル電 気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色し、紫外線で可視化した。

【００８３】 ＯＰはベクターコントロール細胞でアポトーシスを誘発した。コントロール細
胞と比較して野性型ＳＡＧトランスフェクト細胞で観察されたＤＮＡ分断は少な
い。ＳＡＧ変異体１（これは亜鉛環フィンガーモチーフをコードしない）は、Ｏ
Ｐ誘発ＤＮＡ分断に対して全く防御を示さなかった。一方、ＳＡＧ変異体２（こ
れは亜鉛環フィンガードメインを保持している）はなお防御を示した。これらの
結果は、ＳＡＧ蛋白質の過剰発現はＯＰ誘発アポトーシスから細胞を保護し、亜
鉛環フィンガードメインはこの保護活性に必要であることを示唆している。

【００８４】 ＳＡＧ蛋白質は亜鉛環フィンガーモチーフを含むので、次にＳＡＧトランスフ
ェクタントの亜鉛処理に対する感受性を調べた。亜鉛は、ベクターのみでトラン
スフェクトしたＤＬＤ−１細胞でアポトーシスを誘発した。アポトーシスの誘発
はＳＡＧ過剰発現によって制限され、コントロール株よりはるかに少ないＤＮＡ
分断を示した。このデータは、ＳＡＧ蛋白質は、亜鉛環フィンガードメインを介
して亜鉛と結合してこれをキレート化し、したがって非トランスフェクト細胞と
比較して亜鉛の毒性に対して抵抗性を高めることを示唆している。

【００８５】 ＳＡＧのもう一つの特徴はＨ₂Ｏ₂暴露後のオリゴマー形成である。細胞は、Ｓ
ＡＧオリゴマー化によってＨ₂Ｏ₂誘発毒性から保護され得る。したがって、ＳＡ
Ｇトランスフェクト細胞をＨ₂Ｏ₂で処理し、続いてＤＮＡ分断についてアッセイ
した。Ｈ₂Ｏ₂はＤＬＤ−１細胞でアポトーシスを誘発した。ＳＡＧ蛋白質の過剰
発現は、ＤＮＡ分断の減少によって立証されるように、Ｈ₂Ｏ₂誘発アポトーシス
から細胞を部分的に保護した。総合すれば、これらの結果は、ＳＡＧは、レドッ
クス化合物（例えばＯＰおよびＨ₂Ｏ₂）によって誘発されるアポトーシスに対し
て、さらに亜鉛によって惹起されるアポトーシスに対しても少なくともある程度
の保護を与えることを示している。

【００８６】 実施例１７：アンチセンスＳＡＧ発現は腫瘍細胞増殖を抑制する ＳＡＧ発現によって誘発される増殖作用を調べるために、ＤＬＤ−１細胞にｎ
ｅｏコントロールベクター、またはＳＡＧ、ＳＡＧ変異体１もしくは２、アンチ
センスＳＡＧを発現しているベクターを上記のようにトランスフェクトした。ネ
オマイシン耐性コロニーをＧ４１８（６００μｇ／ml）で１８日間選別し、５０
％メタノール／１０％酢酸／０.２５％クーマシーブルーで染色した。

【００８７】 ＳＡＧ発現減少によって惹起される腫瘍細胞表現型における可能な変化を調べ
るために、アンチセンスＳＡＧｍＲＮＡを発現している安定なＤＬＤ−１トラン
スフェクタント（Ｄ１５−１）をＧ４１８選別後にクローニングした。サブコン
フルエントのＤ１５−１細胞を、ベクターコントロール細胞（Ｄ１−６）および
ＳＡＧ（センス）過剰発現細胞（Ｄ１２−１およびＤ１２−８）とともに代謝に
より標識し、さらに上記のようにＳＡＧ蛋白質抗体を用いて免疫沈降させた。コ
ンピュータ制御デンシトメーター（Molecular Dynamics）を用いたＳＡＧ蛋白質
発現の濃度的定量を製造元の指示にしたがって実施した。ベクターコントロール
細胞Ｄ１−６から１として任意に値を選択することによって数値を算出した。ア
ンチセンスＳＡＧトランスフェクト細胞（Ｄ１５−１）は内因性ＳＡＧ蛋白質の
６０％減少を示した。ＤＬＤ−１細胞の単層増殖はアンチセンスＳＡＧのトラン
スフェクションによって顕著に抑制された。ｎｅｏコントロールと比較したとき
、他のトランスフェクタントのいずれも増殖は抑制されなかった。

【００８８】 次に、アンチセンスＳＡＧトランスフェクト細胞が軟寒天中で増殖抑制を示す
か否かを調べた。野性型ＳＡＧ（Ｄ１２−８）、ＳＡＧ変異体１（Ｄ３−３）、
ＳＡＧ変異体２（Ｄ４−２）を発現しているトランスフェクタントおよびneoコ ントロール（Ｄ１−３）とともに、Ｄ１５−１細胞を０.２５％寒天培地中で１ ４日間増殖させた。１６個以上の細胞を含むコロニーを数えた。実験（各実験に
つき２回）はそれぞれ別個に３回実施した。結果は平均＋／−平均の標準誤差で
示した。図２に示したように、ｎｅｏコントロール（Ｄ１−３）、ＳＡＧ（セン
ス）発現株であるＤ１２−８およびＳＡＧ変異体（Ｄ３−３、Ｄ４−２）と比較
したとき、Ｄ１５−１細胞のＳＡＧダウンレギュレーションは、軟寒天コロニー
数の７５％減少によって明らかなようにＤＬＤ−１細胞の顕著な増殖抑制を惹起
した。

【００８９】 さらに別の実験で、親株のＤＬＤ−１細胞、ベクターコントロールＤ１−６お
よびＳＡＧ野性型トランスフェクタントＤ１２−１細胞とともに、４×１０⁶の コンフルエントＤ１５−１細胞をＳＣＩＤマウス（Taconic Farms, Germantown,
New York）の皮下に接種した（各群１０匹）。腫瘍の増殖を週２回観察した。 １０匹のマウスの平均腫瘍サイズ／塊を注射後２４日まで経過時間に対して作図
した。ＳＣＩＤマウスに移植したとき、アンチセンス発現株Ｄ１５−１は接種後
２４日まで腫瘍を形成できなかった。一方、実質的な腫瘍増殖が親株のＤＬＤ−
１細胞、ｎｅｏコントロールＤ１−６細胞、およびＳＡＧ（センス）発現Ｄ１２
−１細胞（図３）で観察された。これらの実験は全て、ＳＡＧ発現のダウンレギ
ュレーションは腫瘍細胞の増殖抑制をもたらすこと、さらにＳＡＧは細胞保護分
子であることを示している。

【００９０】 実施例１８：アンチセンスＳＡＧを発現するアデノウイルスを用いる癌の遺伝子
治療 アンチセンスＳＡＧの発現はin vitroとin vivoの両方（実施例１７）で腫瘍 の増殖を抑制することを示したので、ＳＡＧは癌の遺伝子治療の標的として用い
ることができる。癌の遺伝子治療を実施する方法は当技術分野でよく知られてい
る：Zhang & Fang, Exp. Opin, Invest. Drugs 4:487-514(1995); Zhang et al.
, Adv. Pharmacol. 32:289-341(1995)参照）。 内因性ＳＡＧ発現を有する腫瘍細胞株（ＤＬＤ−１（結腸）、Ｄｕ１４５（前
立腺）、Ｇ４０１（腎臓）、Ｈ２００９（肺）およびＨＯＮＥＴ−１（鼻咽頭）
を含むが、ただしこれらに限定されない）を用いて腫瘍モデルを確立させる。組
織培養由来の腫瘍細胞を５×１０⁷／mlの濃度でＰＢＳに懸濁させ、氷上で保存 する。０.２mlの細胞懸濁液（約１千万の細胞を含む）を６から８週齢の無胸腺 ヌードマウスの横腹に皮下注射し、３０−４０日間または平均腫瘍サイズが５mm
に達するまで腫瘍を増殖させる。

【００９１】 シャトルプラスミド（ｐＪＭ１７、環状化Ａｄ５ゲノム）およびリコンビナン
トプラスミド（ｐＥＣ−ＳＡＧ；Ａｄ５ゲノムの左ア−ムを含むＣＭＶ駆動プラ
スミド）を２９３細胞に同時にトランスフェクトすることによって、アンチセン
スヒトＳＡＧ（ＣＭＶプロモータによって駆動されている）を発現するリコンビ
ナントアデノウイルスベクター（Ａｄ.ＣＭＶ−ＳＡＧ）を作製した。 腫瘍に０.１mlのリコンビナントアデノウイルス液（１−５×１０¹⁰pfu／ml）
、またはコントロールとして０.１mlのＰＢＳのみを注射する。日常処理を２日 間実施し、処理を施さないで１週間後、日常処理を３日間再開する。腫瘍サイズ
を２週間毎日測定する。酸素ラジカル発生試薬または照射による併用療法を調べ
るために、処置群を３つのサブグループに分ける（１０マウス／サブグループ）
：Ａグループはアデノウイルスのみ（上記参照）を与えられる；Ｂグループはア
デノウイルスおよび同時に酸素ラジカル発生試薬のアドリアマイシン（３mg／kg
）を腹腔内注射される；Ｃグループはアデノウイルス＋照射（セシウム−１３７
を３５０ｃＧｙ）を施される。薬剤コントロールまたは照射コントロールとして
数匹の担癌マウスに同じ用量のアドリアマイシンまたは照射が施される。

【００９２】 アンチセンスＳＡＧの発現は内因性ＳＡＧ合成を阻害し、これは腫瘍細胞を酸
素ラジカルに対して高感受性にする。ビヒクルコントロールと比較して、薬剤投
与もしくは非投与または照射もしくは非照射の処置腫瘍での顕著な腫瘍萎縮はこ
の治療法の有効性を示唆している。コントロールおよび処理群の腫瘍をさらに組
織学的に調べることができる。サンプルを直ちに最適切断温度化合物（Miles, I
nc. Elkhart, Indiana）中に包埋し、さらに酵素染色（例えばアポトーシスのた
めの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Boehringer Manheim, In
dianapolis, Indiana)染色）、またはアンチセンスＳＡＧ発現についての免疫組
織化学染色用凍結切片調製物（３−５μｍ）のために液体窒素で瞬間凍結するこ
とができる。また別法として、組織切片作製のためにサンプルを１０％ホルマリ
ンで固定し、ヘマトキシリン−エオシン（Sigma, St. Louis, Missouri）染色で
分析してもよい。

【００９３】 実施例１９：ＳＡＧは酸素ラジカル除去剤として機能し、酸素ラジカル誘発損傷
を防止する ＳＡＧ蛋白質は１２のシステイン残基を含み、過酸化水素に暴露触後に分子間
および分子内の両方でジスルフィド結合を形成する。ＳＡＧ蛋白質はまたヘムと
結合し、これは、Ｆｅ（＋＋）の酸化／還元によってオキシダントを調節するこ
とができる。この酸化緩衝活性によってＳＡＧは酸素ラジカル除去剤として適格
である。 抗酸化酵素遺伝子（スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラー
ゼ（ＣＡＴ))に欠失を有する酵母細胞はスーパーオキシド陰イオンおよび過酸化
水素に対して高感受性である（Longo et al., J. Cell Biol. 137:1581-1588(19
97))。（ａ）Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、（ｂ）Ｍｎ−ＳＯＤ、（ｃ）Ｃｕ、Ｚｎ−Ｓ
ＯＤおよびＭｎ−ＳＯＤの両方、および（ｄ）ＣＡＴを欠く酵母細胞にヒトＳＡ
Ｇ発現プラスミドをトランスフェクトした。酸素ラジカル生成化合物、例えばパ
ラクアット（スーパーオキシド陰イオン発生化合物）および過酸化水素に対する
これらのトランスフェクト細胞の感受性を酵母増殖アッセイで調べ、ベクターコ
ントロールをトランスフェクトした同じホスト細胞の増殖と比較する。酸素ラジ
カル誘発細胞死からのこれら酵母細胞の救済は、ＳＡＧは有効な酸素ラジカル除
去物質であることを示している。

【００９４】 実施例２０：虚血時のＩＬ−１β誘発脳損傷のＳＡＧ投与による防止 ラットの中脳動脈閉塞はインターロイキン−１の過剰発現を惹起し、これは遊
離ラジカルの放出によって脳損傷を誘発することが以前に示された（Yang et al
., Brain Research 751:181-188(1997))。ＳＡＧが放出遊離ラジカルを除去する
ことによって脳損傷を防止できるか否かを調べるために２つの実験を実施する。 第一の実験では、ＲＳＶプロモータ駆動アデノウイルスベクター（ＡｄＲＳＶ
−ＳＡＧ）にヒトＳＡＧをサブクローニングする。脳内でのＳＡＧ発現を確実に
するために、このアデノウイルス懸濁液を側脳室に定位的に注射した。アデノウ
イルスの投与後５日して、動物の中脳動脈を記載にしたがって２４時間閉塞させ
る（Yang et al., Brain Research 751:181-188(1997))。脳浮腫（脳水含有量に
よって測定）および脳梗塞サイズ（組織学的に測定：Yang et al., Stroke 23:1
331-1336(1992)）を求める。ベクターコントロールと比較して、脳浮腫および梗
塞サイズの減少はいずれも遊離ラジカル誘発損傷に対するＳＡＧの防御作用を示
している。

【００９５】 第二の実験では、中脳動脈閉塞をラットの縫合モデルを用いて実施する。この
モデルは、永久閉塞（６時間）または一時的閉塞（３時間閉塞および３時間再灌
流）のいずれかを可能にする（Yang & Betz, Stroke 25:1658-1665(1994)）。続
いてラットに閉塞サイズで精製ＳＡＧ蛋白質を注射する。脳水、イオン含有量、
および梗塞容積を測定し、脳梗塞サイズおよび血液脳関門破壊を決定する。ビヒ
クルコントロールの注射と比較して、脳梗塞サイズおよび脳血液関門の破壊の減
少はＳＡＧの保護作用を示している。

【００９６】 実施例２１：ＳＡＧをマーカーとして用いるヒトの癌の診断 結腸および精巣に由来するヒト癌細胞株における２つのＳＡＧ欠失変異体を特
定した。結腸癌と周辺の正常組織との１２の組み合わせを１２人の患者から採集
した。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡをこれらのサンプルから単離し、ＰＣＲ増幅
に付した。ＳＡＧ欠失変異を検出するために、得られた増幅生成物を当技術分野
で周知の方法（欠失変異体のＲＮＡ保護アッセイ、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダ
イゼーション、ゲル電気泳動が含まれるが、ただしこれらに限定されない）によ
り分析する。正常な周辺組織では検出されないが腫瘍組織で検出される変異は、
それらが腫瘍特異的変異であることを示し、結腸癌および精巣癌の診断ツールと
して診療所で用いることができる。

【００９７】 実施例２２：ヒトＳＡＧ遺伝子の酵母相同体は酵母増殖について必須である ＳＡＧの機能をさらに理解するために、酵母ＳＡＧノックアウト変異体を相同
組換えによって構築した。酵母ＳＡＧをノックアウトするために用いた構築物は
、ｋａｎＭＸ４プラスミド（Wach et al., Yeast 10:1793-1808(1994)）由来の カナマイシンカセットのＰＣＲによって作製した。ＰＣＲに用いたプライマーは
、ＳＡＧＫａｎＭＸ４−５：５′−ＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣＴ ＴＴＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＴＴＣＡＡＣ ＣＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧ
ＡＣ−３′（配列番号：１７）、およびＳＡＧＫａｎＭＸ４−３：５′ＡＣＣＴ ＣＧＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＧＧＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴ ＡＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧ−３′（配列番号：１８）である。プ
ライマーＳＡＧＫａｎＭＸ４−５は、ＡＴＧ開始コドンの直ぐ上流の酵母ＳＡＧ
ＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ登録番号Ｚ７４８７６）（下線部）および３′末端に存在
するカナマイシンカセット配列上流部から成る。プライマーＳＡＧＫａｎＭＸ４
−３は、終止コドンＴＧＡの直ぐ下流の酵母ＳＡＧＤＮＡ配列（下線部）および
３′末端に存在するカナマイシンカセット配列下流部から成る。

【００９８】 ＰＣＲは、９４℃で１分、５０℃で１.５分、７２℃で２分の５サイクル、続 いて９４℃で１分、５６℃で１.５分、７２℃で２分の２５サイクル、その後７ ２℃で１０分伸長を実施した。得られたＰＣＲ生成物（１.５kb）をQuaex IIゲ ル精製キット（Qiagen）を用い製造元の指示にしたがいゲル精製を実施し、イー
ストメーカー酵母形質転換系（YEASTMAKER yeast Transformation System, Clon
Tech Laboratory, Inc.）を用い製造元の指示にしたがい二倍体酵母株Ｙ２１に トランスフェクトした。トランスフェクション後、酵母細胞を２００μｇ／mlの
Ｇ４１８（ＢＲＬ）を含むＹＰＤ培地（Difco）で増殖させ、カナマイシンカセ ットを含むトランスフェクタントを選別した。これは相同組換えによって欠失を
もつ酵母ＳＡＧを含んでいた。

【００９９】 いくつかのＧ４１８耐性クローンを選別し、ヘテロ接合体またはホモ接合体欠
失が生成されたか否かを決定するために分析した。用いたプライマーは、ＳＡＧ
ＰＣＲ−５：５′−ＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＣＡＧＡＧＡＡＣ−３′（配列番号
：１９）およびＳＡＧＰＣＲ−３：５′−ＡＴＧＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＣ
ＧＧＧＣ−３′（配列番号：２０）である。これらのプライマーは、それぞれＳ
ＡＧＫａｎＭＸ４−５およびＳＡＧＫａｎＭＸ４−３のフラグメントを構成し、
完全な酵母ＳＡＧコード領域に接している。野性型酵母ＳＡＧのＰＣＲは０.３５
kbバンドを生じ、一方、ＳＡＧ欠失変異体のＰＣＲはカナマイシンカセットから
成る１.５kbバンドを生じる。０.３５kbおよび１.５kbフラグメントはともに検 査した全てのクローンで生成され、ヘテロ接合変異体が産生されたことを示して
いる。同一のノックアウト実験を一倍体酵母細胞ＩｎｖＳＣ１（InVitrogen) で
実施したが、Ｇ４１８耐性クローンは単離されなかった。

【０１００】 酵母ＳＡＧ欠失変異体のホモ接合体を単離できなかったことは、酵母ＳＡＧが
増殖に必須であることを示唆している。これを確認するために、１２の個々のヘ
テロ接合体酵母株（ｙ２１−ｙＳＡＧ／ｙＳＡＧ：：Ｋａｎ）で胞子を形成させ
、酵母ＳＡＧ−ｋａｎ一倍体が生存可能か否かを決定した。この株を、ウラシル
、リジン、アデニンおよびトリプトファン補充最少酢酸カリウム胞子形成培地（
Kassir & G. Simchen, Method Enzymol. 194:94-110(1991)）に接種し、３０℃ で７日間増殖させた。各株の四分子を４つの一倍体の子株に切り分けた。切り分
けのために、胞子形成プレートの細胞塊（clamp）を１００μｌの１Ｍグリセロ ール（０.５mg／mlのチモラーゼＴ２０を含む）に懸濁させた。３７℃で３０分 後、懸濁物を８００μｌの滅菌水で希釈し、氷上に静置した。懸濁ループをＹＰ
Ｄプレート接触させ、四分子用ツァイス・テトラド顕微鏡下で調べた。顕微鏡の
ガラスの微細針を用い、各株から４つの四分子を切り分けた。これら４つの一倍
体細胞の２つは野性型ＳＡＧを含み、他方の２つは酵母ＳＡＧ欠失を含んでいる
はずである。全ての１２クローンで、４つの分割細胞のうち２つだけが増殖し、
Ｇ４１８を補充したＹＰＤ培地ではいずれも生存できなかった。このことは、生
存細胞はカナマイシンカセットまたはＳＡＧ欠失を含んでいないことを示してい
る。この実験は、ＳＡＧは酵母の増殖に必須であることを明示し、その進化上の
重要性を示している。

【０１０１】 ｙＳＡＧが正常な増殖に必要なのか、または単に発芽に必要なのかを決定する
ために、ｈＳＡＧをＵＲＡ３選別マーカーを有する酵母発現ベクターにクローニ
ングした。続いて、ｈＳＡＧ−ＵＲＡプラスミドをヘテロ接合体ｙＳＡＧノック
アウト細胞に形質転換し、形質転換体をＵＲＡ（−）プレートで選別した。ｈＳ
ＡＧ発現クローン（ウェスタンブロット分析で測定）で胞子を形成させ、四分子
を切り分けた。続いて生存コロニーをＹＰＤ単独またはＹＰＤ＋Ｇ４１８または
ＹＰＤ＋５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ；ＵＲＡ３含有セントロメアプラ
スミドに対する選別に用いられる（Boeke et al., Mol. Gen. Genet. 197:345(1
984)）のいずれかでスクリーニングした。再度、個々の４つの四分子から得た４
つの一倍体全てが増殖したので、ｈＳＡＧ−ＵＲＡ３プラスミドはｙＳＡＧ：： ｋａｎ 対立遺伝子を補足する。ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレートで増殖させたとき、各
四分子から得られた２つの一倍体は生存せず、このことはそれらが野性型ｙＳＡ Ｇ 遺伝子を含むことを示している。各四分子から得た他の２つの一倍体は生存し
、それらがｙＳＡＧ：：ｋａｎ対立遺伝子を含むことを示している。これら後者
のコロニーをＹＰＤ＋５−ＦＯＡプレート（ＵＲＡ３プラスミドを除去する）で
増殖させたとき、全てが増殖できず、ｙＳＡＧが正常な植物性増殖に必須で、単
に胞子形成に必要なのではないことを示している。

【０１０２】 実施例２３：酵母ＳＡＧノックアウト表現型のヒトＳＡＧによる救済 ヒトＳＡＧが酵母ＳＡＧノックアウトの致死表現型を回復させることができる
か否かを調べるために、ＳＡＧ変異体（ＭＭ３、配列番号：２５；ＭＭ１０、配
列番号：３９；およびＭＭ１４、配列番号：４７（図１Ａ))とともに、野性型ヒ
トＳＡＧをＴｒｐ選別マーカーを有するプラスミドに組み入れ、ヘテロ接合体酵
母株に上記のようにトランスフェクトした（ｙ２１−ＳＡＧ／ｙＳＡＧ：：Ｋａ
ｎ）。Ｔｒｐ（−）／Ｇ４１８（＋）プレートで増殖するクローンをＳＡＧ発現
についてウェスタンブロット分析によって調べた。ヒトＳＡＧ発現クローンの胞
子を形成させ、切り分けた。１０の野生型ヒトＳＡＧクローンで、３または４つ
の一倍体が生存した。それらのいくつかは酵母ＳＡＧを含み、一方、他のものは
ｙＳＡＧＫ／Ｏ＋ヒトＳＡＧを含んでいた。このことは、ヒト野性型ＳＡＧは酵
母ＳＡＧノックアウトを補足できることを示している。３つの変異クローンは全
て（全部で４１個をテストした）、１つまたは２つの一倍体を生じ、全ての生存
一倍体は酵母ＳＡＧを含んでいた。これは、ヒトＳＡＧ変異体は酵母ＳＡＧノッ
クアウトを補足できないことを示している。

【０１０３】 実施例２４：ＳＡＧは金属に結合する ＳＡＧは亜鉛環フィンガードメインを含むのでＳＡＧは金属と結合する能力を
有する。ＳＡＧの潜在的な金属結合能を測定するために、電子スプレーイオン化
質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ)(Fenn et al. 1989）を用い、変性および非変性溶液
条件下でＳＡＧの分子質量を比較した（Loo, 1997; Witkowska et al. 1995）。

【０１０４】 ＥＳＩ−ＭＳは、ダブルフォーカシングハイブリッド質量分光計（Finnigan,
ＭＡＴ９００Ｑ，Bremen, Germany)を用い、５ｋＶの完全加速電圧で質量対電荷
（ｍ／ｚ）範囲を１０００として実施した。位置時間解析イオン計測（position
-and-time-resolved-ion-counting, PATRIC)スキャンニングアレー検出装置を用
いた。加熱金属毛細管導入口によるＥＳＩインターフェースおよび低速ミクロ−
ＥｓＩ供給源（分析物の流速は１５０nL／分）を用いた（Sannes-Lowery et al.
(1997)）。金属−蛋白質複合体実験では、金属毛細管の温度は１５０−２００℃
を維持した。７Ｍ尿素変性溶液下のリコンビナント蛋白質は、５０μＭのＺｎＣ
ｌ₂中で緩衝液を３回変えながら３日間透析することによって再び折り畳まれた 。ＥＳＩ−ＭＳ測定の前に、ＳＡＧ溶液を１０mMの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ
７）および１mMのＤＴＴで洗浄し、さらに分子量１０kDaカットオフ遠心ろ過カ ートリッジ（Microcon-10 microconcentrator, Amicon, Beverly, MA）を通過さ
せることにより遠心限外濾過で過剰の亜鉛を除去した。ＥＳＩ−ＭＳ分析のため
には、ろ過ＳＡＧ蛋白質溶液の少量を変性溶媒（８０：１５：５のアセトニトリ
ル：水：酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）、ｐＨ２.５）または非変性溶液（１０mMの炭酸水 素アンモニウムおよび１mMのＤＴＴ、ｐＨ７）のどちらかに希釈した。 ＳＡＧの亜鉛結合を先ず測定した。この蛋白質が亜鉛の存在下であっても金属
結合特性を維持できないと思われる変性酸性溶液下（ｐＨ２.５および高濃度の 有機物）で、ＳＡＧの分子質量を測定し１２５５０であることが分かった。これ
は、アポ−蛋白質の予想質量（１２５５２Ｄａ）に極めて近い。非変性水溶液（
ｐＨ７）でのＳＡＧ蛋白質のＥＳＩ−ＭＳ分析では質量は１２７３３および１２
８００Ｄａに増加した。これらの質量は、それぞれ３つおよび４つの亜鉛金属イ
オンが結合したホロ蛋白質と一致する。

【０１０５】 ＳＡＧとの銅結合も測定した。透析溶液中のわずかに１μＭのＣｕＳＯ₄が青 色（銅）を有するＳＡＧの沈澱をもたらし、銅の結合を示唆する。次に、ＥＳＩ
−ＭＳを用いて、ＳＡＧの潜在的な銅結合能を上記のように非変性溶液で測定し
た。酢酸銅を最終濃度１０μＭで添加したとき、質量はさらに１２９２９Ｄａに
増加した。しかしながら、銅アダクトが広範囲にＳＡＧ蛋白質に結合しているよ
うであるので正確な質量は得られなかった。高濃度の銅の添加はこの蛋白質の沈
澱をもたらした。

【０１０６】 実施例２５：ＳＡＧは銅イオンまたは遊離ラジカル発生物質によって誘発される
ＬＤＬ酸化を最小限に留めるかまたは予防する そのＨ₂Ｏ₂緩衝作用および金属結合作用のために、ＳＡＧは、金属または遊離
ラジカル発生物質によって誘発される巨大分子の酸化を防止できる。銅イオンま
たは遊離ラジカル発生物質（ＡＡＰＨ（２,２−アゾビス−２−アミジノプロパ ンヒドロクロリド）によるＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）酸化を、脂質過酸化に抗
するＳＡＧの潜在的保護活性を調べるモデルとして用いた。

【０１０７】 リポ蛋白質（１００μｇ蛋白質／ml、Intraocel）を１０μＭのＣｕＳＯ₄また
は５mMのＡＡＰＨと種々の濃度の精製ＳＡＧ蛋白質の存在下で３７℃で４時間イ
ンキュベートした。ＡＡＰＨは水溶性のアゾ化合物で、熱により分解し一定の速
度で水溶性のペルオキシルラジカルを発生させる（Frei et al.(1988))。酸化は
、１０μＭのブチル化ヒドロジトルエンス（ＢＨＴ）の添加および４℃での冷却
によって停止させた。記載（Buege & Aust(1978)）のように標準曲線としてマロ
ンジアルデヒド（ＭＤＡ）を用いＴＢＡＲＳアッセイによって、リポ蛋白質の酸
化の程度を測定した。

【０１０８】 銅誘発ＬＤＬ酸化（チオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の生成によ
って測定される）は、低濃度ＳＡＧでわずかに強化された。しかしながら、高濃
度ＳＡＧでは用量依存性のＬＤＬ酸化抑制（９０％まで）が観察された。熱処理
（６０℃１５分）ＳＡＧでも活性を維持したので抑制は熱耐性で、酵素活性は必
要としないことを示唆している。しかしながら、抑制活性は、アルキル化試薬Ｎ
ＥＭおよびｐ−ヒドロキシ水銀ベンゾエート（ＰＨＭＢ）で予備処理することに
よってそれぞれ完全にまたは部分的に失われた。これらの結果は、ＳＡＧの遊離
ＳＨ基はこの活性に対して主要因であることを示している。さらに、メタロチオ
ネイン（６１アミノ酸のうち２０がシステイン残基で構成されている金属を結合
する小蛋白質）（Nordberg & Kojima, 1979）はＳＡＧと同様な抑制曲線を示し た。さらにシステインを含むペプチドであるグルタチオン（ＧＳＨ）は、１００
μＭの濃度で２５％抑制を示した。しかしながら、銅誘発ＬＤＬ酸化の抑制は、
スーパーオキシドジスムターゼのような他の既知の抗酸化酵素、カタラーゼまた
はＢＳＡのような他の蛋白質およびチトクロームＣでは観察されなかった。これ
らの結果は、その遊離ＳＨ基により銅イオンと結合しこれをキレート化すること
によって、ＳＡＧは、銅によって開始しＬＤＬ酸化をもたらす遊離ラジカル反応
を防止し、さらに超酸化物または過酸化水素はこの反応過程に含まれないらしい
ということを明瞭に示している。ＬＤＬ酸化に対するＳＡＧによる防御が銅結合
によりもっぱら仲介されるのか否かを調べるために、本発明者等は、ＡＡＰＨ（
遊離ラジカル発生物質）によってＬＤＬ酸化を開始させた。この金属イオン非含
有系では、ＳＡＧはまた５９μＭ（７５０μｇ／ml）の濃度でＬＤＬ酸化を防御
した（８５％まで）。したがって、金属結合および遊離ラジカル除去によって、
ＳＡＧは脂質の過酸化に対する防御物質として機能する。

【０１０９】 実施例２６：ＳＡＧは金属イオンによって誘発されるチトクロームＣの遊離とカ
スパーゼ活性化を防止する チトクロームＣのミトコンドリアからの遊離およびカスパーゼ活性化はアポト
ーシスにおける基本的事象であるので（Liu et al.(1996); Yang et al.(1997);
Li et al.(1997); Hengartner (1998);概論としては、Mignotte & Vayssiere (
1998))、金属で処理したときに細胞質に遊離されるチトクロームＣのレベルおよ
びカスパーゼの潜在的活性化を測定した。ＺｎＳＯ₄による細胞の処理で細胞質 にチトクロームＣが時間に依存して遊離される。ベクターコントロール細胞（Ｄ
１−６）と比較して、ＳＡＧの過剰発現細胞（Ｄ１２−１）はチトクロームＣの
細胞質遊離がはるかに少なかった。同様に、カスパーゼ７の活性化（プロ酵素形
態の消失によって示される）は、亜鉛処理後に時間依存性態様で観察された。Ｓ
ＡＧ過剰発現細胞（Ｄ１２−１）よりも強い活性化が、ベクターコントロール細
胞（Ｄ１−６）で認められた。同様な結果がＣＰＰ３２（カスパーゼ３）活性で
得られた。しかしながら、銅処理に際してはＤ１−６とＤ１２−１細胞との間で
チトクロームＣの遊離またはアスパーゼ活性化について顕著な相違は観察されな
かった。これは、銅処理時に２つの株で形態的変化の相違が無いことと一致する
が、ただしＤＮＡ分断はベクターコントロール細胞でのみ明白であった。金属誘
発チトクロームＣ遊離およびＣＰＰ３２活性化に対するＳＡＧの潜在的保護能力
をさらに調べるために、ＳＡＧ過剰発現プラスミドで２９３細胞を一過性にトラ
ンスフェクトし続いて銅に暴露して、チトクロームＣの遊離とＣＰＰ３２の活性
化を測定した。ＣｕＳＯ₄（２.０mM）処理後６時間で顕著な量のチトクロームＣ
が遊離し始め、１２時間まで持続した。ＳＡＧ発現は、チトクロームＣの遊離を
１６時間まで遅らせた。カスパーゼ７の活性化は、銅処理後１２時間および１６
時間でベクターコントロール細胞で観察された。顕著な活性化はＳＡＧトランス
フェクタントで認められなかった。同様な結果がＣＰＰ３２抗体を用いて観察さ
れた。コントロール細胞とＳＡＧトランスフェクタントとの間で亜鉛処理ではチ
トクロームＣの遊離とカスパーゼ活性化に顕著な相違は検出されなかった。この
ことは、アポトーシスの形態的徴候に相違が無いことと一致している。これらの
結果は、金属処理はチトクロームＣの遊離とカスパーゼ活性化をアポトーシス時
に誘発し、これはＳＡＧによって強く防止されるかまたは遅らされ、アポトーシ
スの形態的徴候とチトクロームＣ遊離／カスパーゼ活性化との間に明瞭な相関性
があることを示している。

【０１１０】 実施例２７：ＳＡＧはニューロンのアポトーシスに対して保護作用を示す ＳＡＧをＨＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞にトランスフェクトし、ウェスタンブ
ロットで調べたとき外因性ＳＡＧを発現しているいくつかの安定株を選別した。
１つのＳＡＧトランスフェクタント（ＳＹＷ−２０）およびベクターコントロー
ル（ＳＹＶ−３）を用いて、金属イオン（亜鉛および銅）に対するそれらの感受
性を決定した。１.２５mMのＣｕＳＯ₄または２００μＭのＺｎＳＯ₄で１６時間 処理し、ｎｅｏコントロール細胞で細胞の収縮および剥離が誘発されたが、ＳＡ
Ｇ発現細胞ではその程度は少なかった。形態的な相違は亜鉛処理で一層明瞭に認
められた。細胞死の性状を決定するために、ＴＵＮＥＬアッセイ、アポトーシス
時にゲノムＤＮＡの切断によって発生する遊離３′−ＯＨ末端の蛍光標識アッセ
イを実施した。

【０１１１】 in situ細胞死アッセイ（ＴＵＮＥＬアッセイ）を製造元（Boehringer Mannhe
im)の指示にしたがって実施した。簡単に記せば、５×１０⁴の細胞を８ウェルの
ガラススライドで平板培養した。１.２５mMの銅（ＣｕＳＯ₄）または２００μＭ
の亜鉛（ＺｎＳＯ₄）で１６時間処理した後、細胞を０.５％グルタルアルデヒド
で１０分固定し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。固定細胞を氷上で２分透過性付
与溶液（０.１％トリトンＸ−１００、０.１％クエン酸ナトリウム）中でインキ
ュベートした。ＴＵＮＥＬ反応混合物（５０μｌ）をサンプルに付加し、３７℃
で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡で分析す
る前にサンプルをアンチフェードで包埋した。１.２５mMのＣｕＳＯ₄または２０
０μＭのＺｎＳＯ₄で１６時間処理した後で、実質的にさらに多い蛍光染色がベ クターコントロール細胞で観察された。この結果は、ＳＡＧ蛋白質の発現はニュ
ーロン細胞をアポトーシスから保護することを示している。

【０１１２】 実施例２８：ＳＡＧは増殖を刺激する 潜在的な増殖刺激活性を調べるために、ＳＡＧＲＮＡ（８μｇ／mlまたは２５
μｇ／ml）を、コントロールのβ−ガラクトシダーゼ（２５μｇ／ml）と併せて
血清枯渇ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の単層に注入した。食刻された輪の中のガラス
のカバースリップに付着した約５０の細胞を注入した。注射後１０から２４時間
して〔³Ｈ〕チミジン（５μＣｉ／ml、Amersham）の３時間パルスを実施した。 培養を等張のリン酸緩衝食塩水で洗浄し、３.７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド で固定した。ＳＡＧ注入細胞では、血清枯渇線維芽細胞の核内への〔³Ｈ〕チミ ジンの誘導（ＤＮＡ合成のインジケーター）が明瞭に観察された。対照的に、β
−ガラクトシダーゼの注入はＤＮＡ合成を誘発せず、〔³Ｈ〕チミジンの取り込 みも観察されなかった。これらの結果は、ヒトＳＡＧは細胞増殖を刺激する増殖
性活性を有することを示している。

【０１１３】 ＳＡＧの増殖促進活性はまた、ｈＳＡＧｃＤＮＡトランスフェクションによっ
てｈＳＡＧ蛋白質を過剰発現しているヒトの神経芽細胞腫細胞（ＳＹ５Ｙ）で調
べられた。ベクター発現コントロール細胞およびＳＡＧ過剰発現細胞で先ず４８
時間血清を枯渇させ、続いて血清枯渇条件または１％血清条件のどちらかで１６
時間³Ｈ−チミジン標識を実施した。細胞を洗浄し溶解し、³Ｈについて液体シン
チレーション計測機（ＤＮＡへの³Ｈ−チミジン取り込み（Ｓ字型エントリー） を測定するアッセイ）で計測した。ベクターコントロール細胞と比較して、ＳＡ
Ｇ発現細胞は両条件（血清非含有または１％血清）で１０倍多い³Ｈ−チミジン の取り込みを有し、ＳＡＧは細胞の増殖／成長を刺激することを示した。

【０１１４】 ＳＡＧの増殖促進活性をまた酵母で調べた。実施例２２で述べたように、ヒト
ＳＡＧ遺伝子の酵母相同体は酵母の増殖に必須である。酵母の増殖速度とＳＡＧ
発現を相関させるために、ｈＳＡＧ発現プラスミドをＧａｌプロモータの制御下
で構築した。このプラスミドをヘテロ接合体ｙＳＡＧノックアウトに形質転換し
、形質転換体で胞子を形成させ切り分けた。ｈＳＡＧプラスミドを含む一倍体ｙ
ＳＡＧノックアウトクローンを特定し分析した。非誘発条件では、プロモータの
リークによるＳＡＧ発現で、完全サイズの野性型クローンと比較して小さなクロ
ーンを形成したものは殆どなかった。誘発条件下では、ＳＡＧ発現レベルは増加
し、クローンサイズもまた増加した。この実験は、ＳＡＧは用量依存態様で細胞
増殖を促進することを明瞭に示している。

【０１１５】 本発明は、本明細書で示したとおりの操作の詳細、化合物、組成物、方法、手
順または実施態様に限定しようとするものではなく、当業者には改変および同等
物は明白で、したがって本発明は請求の範囲によってのみ限定される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 39/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ 5/10 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１に示したＤＮＡ配列と実質的に同様な単離され
   精製されたＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件下で
   配列番号：１に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズする単離され精製されたＤＮ
   Ａ配列。
3. 【請求項３】 本質的に配列番号：１に示したＤＮＡ配列から成る単離され
   精製されたＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 染色体外ベクターにサブクローニングされた請求項１、２ま
   たは３の単離され精製されたＤＮＡ配列を含むリコンビナントＤＮＡ分子。
5. 【請求項５】 請求項４のリコンビナントＤＮＡ分子でトランスフェクトさ
   れたホスト細胞を含むリコンビナントホスト細胞。
6. 【請求項６】 受託番号９８４０２でＡＴＣＣに寄託されたリコンビナント
   ホスト細胞。
7. 【請求項７】 配列番号：３に示したＤＮＡ配列と実質的に同様な単離され
   精製されたＤＮＡ配列。
8. 【請求項８】 ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件下で
   配列番号：３に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズする単離され精製されたＤＮ
   Ａ配列。
9. 【請求項９】 本質的に配列番号：３に示したＤＮＡ配列から成る単離され
   精製されたＤＮＡ配列。
10. 【請求項１０】 染色体外ベクターにサブクローニングされた請求項７、８
    または９の単離され精製されたＤＮＡ配列を含むリコンビナントＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 請求項１０のリコンビナントＤＮＡ分子でトランスフェク
    トされたホスト細胞を含むリコンビナントホスト細胞。
12. 【請求項１２】 受託番号９８４０３でＡＴＣＣに寄託されたリコンビナン
    トホスト細胞。
13. 【請求項１３】 受託番号９８４０４でＡＴＣＣに寄託されたリコンビナン
    トホスト細胞。
14. 【請求項１４】 受託番号９８４０５でＡＴＣＣに寄託されたリコンビナン
    トホスト細胞。
15. 【請求項１５】 配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：２１、配列
    番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３
    １、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列
    番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７および配列番号
    ：４９から成る群から選ばれる単離され精製されたＤＮＡ配列。
16. 【請求項１６】 染色体外ベクターにサブクローニングされた請求項１５の
    単離され精製されたＤＮＡ配列を含むリコンビナントＤＮＡ分子。
17. 【請求項１７】 請求項１６のリコンビナントＤＮＡ分子でトランスフェク
    トされたホスト細胞を含むリコンビナントホスト細胞。
18. 【請求項１８】 実質的に精製されたリコンビナントポリペプチドのアミノ
    酸配列が配列番号：２に示したアミノ酸配列と実質的に同様である前記実質的に
    精製されたリコンビナントポリペプチド。
19. 【請求項１９】 実質的に精製されたリコンビナントポリペプチドのアミノ
    酸配列が、本質的に配列番号：２に示したアミノ酸配列から成る前記実質的に精
    製されたリコンビナントポリペプチド。
20. 【請求項２０】 実質的に精製されたリコンビナントポリペプチドのアミノ
    酸配列が配列番号：４に示したアミノ酸配列と実質的に同様である前記実質的に
    精製されたリコンビナントポリペプチド。
21. 【請求項２１】 実質的に精製されたリコンビナントポリペプチドのアミノ
    酸配列が、本質的に配列番号：４に示したアミノ酸配列から成る前記実質的に精
    製されたリコンビナントポリペプチド。
22. 【請求項２２】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１２、配列番
    号：１４、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８
    、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番
    号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６
    、配列番号：４８および配列番号：５０から成る群から選ばれる前記実質的に精
    製されたリコンビナントポリペプチド。
23. 【請求項２３】 請求項１８、１９、２０、２１または２２のアミノ酸配列
    と実質的に同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドと選択的に結合する抗体。
24. 【請求項２４】 細胞を請求項２３の抗体と接触させ、さらにこの細胞をＳ
    ＡＧ蛋白質−抗体複合体の検出を可能にする態様でインキュベートする工程を含
    む、細胞のＳＡＧ蛋白質を検出する方法。
25. 【請求項２５】 細胞から全ゲノムＤＮＡを単離し、さらに請求項１、２、
    ３、７、８、９または１５の単離され精製されたＤＮＡ配列に由来するプライマ
    ーを用いてこのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅に付し、さらに生じたＰＣＲ生成物が
    変異を含むか否かを決定する工程を含む、ＳＡＧ変異含有細胞を検出する診断用
    アッセイ。
26. 【請求項２６】 全細胞ＲＮＡを単離し、請求項１、２、３、７、８、９ま
    たは１５の単離され精製されたＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いてこのＲ
    ＮＡを逆転写ＰＣＲ増幅に付し、さらに得られたＰＣＲ生成物が変異を含むか否
    かを決定する工程を含む、ＳＡＧ変異含有細胞を検出する診断用アッセイ。
27. 【請求項２７】 次の工程： (ａ) 還元剤の存在下でＲＮＡサンプルをＲＮＡ結合緩衝液中でＳＡＧ蛋白質
    と接触させ； (ｂ) ＲＮＡ−ＳＡＧ蛋白質混合物を請求項２３の抗体とインキュベートし; (ｃ) 抗体−ＳＡＧ蛋白質−ＲＮＡ複合体を単離し；そして、 (ｄ) このＲＮＡを抗体−ＳＡＧ蛋白質複合体から分離して精製する、 ことを含むポリＡまたはポリＣ残基ストレッチを含むＲＮＡを単離する方法。
28. 【請求項２８】 次の工程： (ａ) 還元剤の非存在下でＲＮＡサンプルをＲＮＡ結合緩衝液中でＳＡＧ蛋白
    質と接触させ； (ｂ) ＲＮＡ−ＳＡＧ蛋白質混合物を請求項２３の抗体とインキュベートし; (ｃ) 抗体−ＳＡＧ蛋白質−ＲＮＡ複合体を単離し；そして、 (ｄ) このＲＮＡを抗体−ＳＡＧ蛋白質複合体から分離して精製する、 ことを含むポリＵ残基ストレッチを含むＲＮＡを単離する方法。
29. 【請求項２９】 次の工程： (ａ) １セットの細胞をＯＰで処理し、さらにコントロールの細胞セットはＯ
    Ｐで処理せず； (ｂ) 各細胞セットからＲＮＡを単離し； (ｃ) このＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反
    応に付すディファレンシャルディスプレー工程に各細胞セットから得たＲＮＡを
    付し； (ｄ) ＯＰ処理細胞セットで発現され、コントロール細胞セットでは発現され
    ないｃＤＮＡを特定し；そして (ｅ) このＯＰ誘発ｃＤＮＡをクローニングする、 ことを含む細胞のアポトーシス時に誘発される遺伝子を単離する方法。
30. 【請求項３０】 請求項１、２、３、７、８、９または１５の単離され精製
    されたＤＮＡ配列を含み、細胞内でのこの単離され精製されたＤＮＡ配列の高レ
    ベル発現を促進するＤＮＡ配列と前記ＤＮＡが機能的に連結されている発現ベク
    ターを前記細胞に導入することを含む、レドックス試薬によって誘発されるアポ
    トーシスから細胞を保護する方法。
31. 【請求項３１】 請求項１、２、３、７、８、９または１５の単離され精製
    されたＤＮＡ配列を含み、腫瘍細胞内でのこの単離され精製されたＤＮＡ配列の
    アンチセンス鎖の高レベル発現を促進するＤＮＡ配列と前記ＤＮＡ配列が機能的
    に連結されている発現ベクターを前記腫瘍細胞に導入することを含む、腫瘍細胞
    の増殖を抑制する方法。
32. 【請求項３２】 次の工程： (ａ) 細菌ホスト細胞で遺伝子発現を誘導することができるプロモータに機能
    的に連結された請求項１、２、３、７、８、９または１５の単離され精製された
    ＤＮＡ配列を含むベクターで細菌ホスト細胞をトランスフェクトし； (ｂ) 細菌細胞で前記単離され精製されたＤＮＡ配列の発現を誘発し； (ｃ) 細菌細胞を溶解し； (ｄ) 細菌の封入体を単離し；そして (ｅ) 単離封入体からＳＡＧ蛋白質を精製する、 ことを含む細菌細胞からＳＡＧ蛋白質を精製する方法。
33. 【請求項３３】 請求項１８、１９、２０、２１または２２の実質的に精製
    されたリコンビナントポリペプチドおよび医薬的に許容できる担体を含む医薬組
    成物。
34. 【請求項３４】 実質的に精製されたリコンビナントポリペプチドがオリゴ
    マーを含む請求項３３記載の医薬組成物。
35. 【請求項３５】 酸素ラジカルを減少させる量で請求項３３または３４の医
    薬組成物を生物体に投与することを含む生物体で酸素ラジカルを除去する方法。
36. 【請求項３６】 請求項１記載のＤＮＡ配列を創傷関連細胞に投与すること
    を含む創傷治癒を促進させる方法。
37. 【請求項３７】 請求項１記載のＤＮＡ配列または、請求項１記載のＤＮＡ
    配列と相補的なＤＮＡ配列を植物細胞に投与することを含む植物細胞の増殖を促
    進または抑制する方法。