JP3906078B2 - Ｂｈ４融合ポリペプチド - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、アポトーシスを抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチドおよびその使用、アポトーシス抑制剤ならびに虚血性疾患の治療方法に関する。詳しくは、細胞への取り込み作用を有し、かつアポトーシスを抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチドおよびその使用、該融合ポリペプチドを含有したアポトーシス抑制剤ならびに虚血性疾患の治療方法に関する。ＢＨ４融合ポリペプチドは、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、感染性多臓器不全、劇症肝炎、虚血性再灌流障害、糖尿病などの治療剤として有用である。
背景技術
細胞死は、生体内の臓器、組織などの細胞動態に重要な役割を果たしている。かかる細胞死の多くは、アポトーシスにより進行し、該アポトーシスの機構は、通常厳密に制御されている。前記アポトーシスは、病理的要因によっても引き起こされる。
近年、アポトーシスに関わる多くの分子が同定され、アポトーシスのシグナル伝達機構が調べられている。例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質やＢｃｌ−ｘ_Ｌタンパク質は、アポトーシス誘導に必須なプロテアーゼであるカスペースの上流でアポトーシスシグナル伝達を抑制的に調節し、カスペースファミリーは、該シグナルのメディエーターとして作用することが示唆されている。
前記Ｂｃｌ−２タンパク質は、ミトコンドリア膜電位（ΔΨ）の低下、シトクロムｃの漏出およびアポトーシス誘導因子（以下、ＡＩＦという）の漏出を抑制することにより、アポトーシスを抑制しうると考えられている。前記Ｂｃｌ−２タンパク質は、癌遺伝子の１つとして辻本らにより発見されたｂｃｌ−２遺伝子〔Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１４４０−１４４３（１９８５）〕の発現産物である。
最近、▲１▼Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、電位依存陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）がシトクロムｃのアポトーシス性の漏出を調節することを直接標的とすること、▲２▼アンチアポトーシス性因子が該チャネルを抑制するが、Ｂａｘ、Ｂａｋなどのプロアポトーシス性因子がＶＤＡＣ活性を刺激してシトクロムｃの通過を可能にすること、および▲３▼ＶＤＡＣは、アポトーシス性のΔΨのロスを生じさせることに必要とされることが示唆されている。前記ＶＤＡＣは、ミトコンドリア外層膜に豊富であり、ミトコンドリア膜透過性を調節する機能を有し、アデニンヌクレオチドトランスロケーター（ＡＮＴ）と他の分子とを伴い透過性遷移ポアを構成する。
前記したように、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、シトクロムｃの漏出の抑制、ΔΨのロスの抑制など様々な関与が示唆されるが、その詳細な作用機構などは不明な点が多いのが現状である。
また、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をそのままの状態で用いる場合、タンパク質が大きくなり分解されやすいという欠点を有し、また、生産効率が低下する場合もある。
発明の開示
本発明は、アポトーシスを効率よく抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチドおよびその使用、アポトーシス抑制剤、虚血性疾患の治療方法を提供することを目的とする。
本発明は、
〔１〕 細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列またはその誘導体配列と、
（Ａ）少なくともアンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインの配列（配列番号：１）を含有するアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されたアミノ酸配列とを含有してなり、かつアポトーシスを抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチド、
〔２〕 前記〔１〕記載のＢＨ４融合ポリペプチドをコードしてなるＤＮＡ、
〔３〕 前記〔１〕記載のＢＨ４融合ポリペプチドを含有してなるアポトーシス抑制剤、
〔４〕 前記〔３〕記載のアポトーシス抑制剤を虚血性疾患患者に投与してアポトーシスを抑制し、それにより虚血性疾患を治療することを特徴とする、虚血性疾患の治療方法、ならびに
〔５〕 虚血性疾患の予防または治療剤を製造するための、前記〔１〕記載のＢＨ４融合ポリペプチドの使用、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列またはその誘導体配列と、
（Ａ）少なくともアンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインの配列（配列番号：１）を含有するアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されたアミノ酸配列とを含有してなり、かつアポトーシスを抑制しうることを１つの大きな特徴とする。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、アポトーシスを抑制するための最小単位、すなわち、（Ａ）少なくともアンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインの配列（配列番号：１）を含有するアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、および
（Ｃ）配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されたアミノ酸配列
を含有するため、効率よくアポトーシスを抑制することができるという優れた性質を発現する。本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、ＢＨ４ドメインを含有するので、ミトコンドリアΔΨロスおよびシトクロムｃ漏出のそれぞれを抑制することができるため、アポトーシスを抑制することができると考えられる。
さらに、本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列またはその誘導体配列を含有するため、より細胞へ取り込まれ、効率よくアポトーシスを抑制することができるという優れた効果を発揮しうる。
本明細書において、「アポトーシス」とは、細胞の核の凝縮および断片化、該細胞自体の凝縮および断片化、該細胞の染色体ＤＮＡのヌクレオソーム単位（約１８０ｂｐ）の断片化などに代表される変化を特徴とする細胞の死に方であり、疾患などの病理的要因および生理的要因（例えば、免疫、ホルモン作用、発生などの生理的現象の発現など）により生じる現象を含む。
アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質とは、Ｂｃｌ−２タンパク質と、該Ｂｃｌ−２タンパク質に類似したタンパク質のうちアポトーシスを抑制する作用を有するタンパク質を意味する。なお、アポトーシスを抑制する活性を「アンチアポトーシス活性」といい、アポトーシスを促進する活性を「プロアポトーシス活性」という。
アポトーシスの抑制、および促進は、例えば、下記の方法により調べることができるが、かかる方法に限定されるものではない：ＶＰ１６で２４時間処理した後、１μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による染色後、全細胞に対する核断片化を呈した細胞の割合としてアポトーシスの程度を算出する。
また、アンチアポトーシス活性は、ミトコンドリアにおけるΔΨの低下と、シトクロムｃの漏出の抑制とにより評価することができる。
ΔΨは、例えば、清水らの既報〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，２１−２９（１９９６）〕のようにローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の取り込みを測定することにより評価できる。
シトクロムｃ漏出は、ミトコンドリアを調製し、遠心分離し、ミトコンドリアペレットと上清とを得、ついで得られたペレットをＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁したミトコンドリア懸濁液と上清とを抗シトクロムｃ抗体を用いて、ウエスタンブロット解析に供することにより調べることができる。
前記アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、Ｂｃｌ−２ホモロジー（ＢＨ）１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４ドメインの配列ホモロジーを含有する。前記ＢＨ１ドメインおよびＢＨ２ドメインと、おそらくＢＨ３ドメインは、変異構造解析により、プロアポトーシス性因子ファミリーのタンパク質との二量体化に非常に重要であり、それによりプロアポトーシス活性を阻害すると考えられる。
配列番号：１に示されるアミノ酸配列は、アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質にのみ共通して保存されているＢＨ４ドメインの配列である。かかるＢＨ４ドメインにおいて、α−ヘリックスは、ＢＨ４ドメインを含有したポリペプチドによるアポトーシス抑制作用に重要であり、特によく保存されているアミノ酸残基（配列番号：１中のアミノ酸番号：８、９）が、該α−ヘリックスの形成に重要な役割を果たしていると考えられる。また、配列番号：１中のアミノ酸番号：５、６、９、１０および１４のアミノ酸残基は、前記ＢＨ４ドメインのα−ヘリックスの他のタンパク質との結合面に整列していることが推定される。
したがって、前記アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインは、前記配列番号：１中のアミノ酸番号：５、６、８、９、１０および１４のアミノ酸残基が保存している配列であれば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入の変異を有するアミノ酸配列を有していてもよい。かかる変異を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アンチアポトーシス活性を呈しうるポリペプチドであり、前記アンチアポトーシス活性は、前述の方法のように、ミトコンドリアにおけるΔΨの低下と、シトクロムｃの漏出の抑制とを評価することにより調べることができる。
ここで、「少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列」は、公知の方法によりペプチドを合成する際、所望の配列に応じて任意に作製することができる。
さらに、前記アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインは、前記配列番号：１中のアミノ酸番号：５、６、８、９、１０および１４のアミノ酸残基が保存している配列であれば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。
かかる配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、アンチアポトーシス活性を呈しうるポリペプチドであり、前記アンチアポトーシス活性は、前述の方法のように、ミトコンドリアにおけるΔΨの低下と、シトクロムｃの漏出の抑制とを評価することにより調べることができる。
なお、本明細書において、「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列間、すなわち配列番号：１のアミノ酸配列と比較対象となるアミノ酸配列との間のアミノ酸残基の同一性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象のアミノ酸配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つのアミノ酸配列を比較することにより決定されうる。ここで、比較対象のアミノ酸配列は、本明細書における配列番号：１に示されるアミノ酸配列と比べて、付加または欠失（例えば、ギャップ、オーバーハングなど）を有していてもよい。
配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一のアミノ酸残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内のアミノ酸残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメントおよびホモロジーを得るためのアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴなどが挙げられる。具体的には、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＧ Ｖｅｒ．４．０１（ソフトウェア開発社製）、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ〔インターネットアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ；参考文献：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２，（１９９７）〕などを用いて、最適なアラインメントおよびホモロジーを得ることができる。
また、本発明においては、前記アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインは、かかるドメインを有するポリペプチドが、前述の方法によりアンチアポトーシス活性、すなわち、ミトコンドリアにおけるΔΨの低下と、シトクロムｃの漏出の抑制とを呈するものであれば、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上の配列ホモロジーを有するアミノ酸配列を有していてもよい。ここで、前記アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインは、保存的置換を有するアミノ酸配列を有していてもよい。前記「保存的置換」は、類似した性質（すなわち疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴）を有するアミノ酸との置換；本来のポリペプチドの生理活性を維持する程度にのみしか該ポリペプチドの立体構造、折り畳み構造を変化させ得ないアミノ酸との置換を包含する。保存的置換としては、例えば、下記：▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン；▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
ＢＨ４ドメインの具体例としては、（ａ）Ｂｃｌ−２のＢＨ４ドメイン（配列番号：２）、（ｂ）Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメイン（配列番号：３）、（ｃ）Ｂｃｌ−ｗのＢＨ４ドメイン（配列番号：４）、（ｄ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（エレガンス） Ｃｅｄ−９のＢＨ４ドメイン（配列番号：９のアミノ酸番号：７９〜９８）などが挙げられる。本発明においては、Ｂｃｌ−２のＢＨ４ドメイン（配列番号：２）およびＢｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメイン（配列番号：３）が好ましい。また、かかるＢＨ４ドメインは、前記方法により、前述の方法のように、ミトコンドリアにおけるΔΨの低下と、シトクロムｃの漏出の抑制が検出できるものであれば、前記（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、および前記（ａ）〜（ｄ）いずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドに用いられる細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドとしては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴ、ＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２７、ＨＩＶ由来のａｒｔ／ｔｒｓ、ＨＳＶ−１由来のＶＰ２２、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＡｎｔｐなどが挙げられる。
細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列としては、例えば、（ｉ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：４９〜５７を少なくとも含有する配列；
（ｉｉ）配列番号：２４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１３を少なくとも含有する配列；
（ｉｉｉ）配列番号：２５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１６を少なくとも含有する配列；
（ｉｖ）配列番号：２６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜３０１を少なくとも含有する配列；および
（ｖ）配列番号：２７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１６を少なくとも含有する配列
などが挙げられる。なかでも、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴ配列（配列番号：５）の少なくともアミノ酸番号：４９〜５７の領域のアミノ酸配列（配列番号：６）が好ましい。
前記「細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列の誘導体配列」としては、（Ｉ）細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１残基の化学修飾基を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換もしくは挿入を有するアミノ酸配列であって、得られたポリペプチドが細胞への取り込み作用を発揮しうるものが挙げられる。
細胞への取り込み作用は、ペプチドに対する抗体による免疫染色、またはペプチドに蛍光ラベルを導入することにより、顕微鏡下に調べることができる。
化学修飾基としては、蛍光性を呈する官能基、ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基などが挙げられ、該化学修飾アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含有したポリペプチドが、細胞への取り込み作用を発揮するものであればよい。なお、本明細書においては、化学修飾基とは、天然由来の「細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチド」を構成するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基（例えば、β−アラニンなど）であってもよい。
蛍光性を呈する官能基としては、エオシンやフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などが挙げられる。
ポリペプチドの立体構造の形成には関与しない官能基としては、β−アラニン残基などに代表されるスペーサー基などが挙げられる。かかる官能基は、「細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチド」と「アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメイン」とを融合させる末端に存在することが好ましい。かかる官能基を導入することにより、「細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチド」および「アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメイン」のそれぞれが本来の立体構造を維持することができるため、それぞれの機能を十分に発揮させることができる。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドとしては、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴ配列（配列番号：５）の少なくともアミノ酸番号：４９〜５７の領域のアミノ酸配列（配列番号：６）と、（ａ）Ｂｃｌ−２タンパク質のＢＨ４ドメイン（配列番号：２）配列、（ｂ）Ｂｃｌ−ｘ_Ｌタンパク質のＢＨ４ドメイン（配列番号：３）のアミノ酸配列、（ｃ）Ｂｃｌ−ｗのＢＨ４ドメイン（配列番号：４）のアミノ酸配列または（ｄ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（エレガンス） Ｃｅｄ−９のＢＨ４ドメイン（配列番号：９のアミノ酸番号：７９〜９８）とを含有するポリペプチドが好ましい。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、具体的には、配列番号：７、８、２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群より選ばれた１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましい。
本発明のＢＨ４融合ペプチドであるＣｙｓ（ＴＡＴ）−β−Ａｌａ−ＢＨ４ペプチドは、Ｆｍｏｃのリンクアミドレジンを用いて、Ｆｍｏｃ法によりＡＢＩ４３３Ａ自動合成機で合成することができる。得られた保護ペプチド樹脂をトリフルオロ酢酸を含有した試薬で処理し、遊離ペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製する。つぎに、ＤＭＦに溶解したエオシン−５−ヨードアセトアミドと、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解させた上記の精製されたペプチドを混合し、室温で１時間反応させる。反応後、再度、逆相ＨＰＬＣで精製し、シングルピークとして分取する。精製試料はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分子量を確認する。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドによれば、例えば、ＨｅＬａ細胞におけるアポトーシス抑制能として、該ＢＨ４融合ポリペプチド非存在下に比べ、少なくとも５０％、好ましくは７０％以上、より好ましくは、９０％以上の抑制率が期待できる。
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、アンチアポトーシス活性を発現するため、アポトーシス抑制剤の有効成分として使用することができる。かかるアポトーシス抑制剤も本発明に含まれる。
本発明のアポトーシス抑制剤は、前記ＢＨ４融合ポリペプチドを含有することを１つの特徴とする。
本発明のアポトーシス抑制剤は、アンチアポトーシス活性を発現するＢＨ４融合ポリペプチドを含有するため、ＡＩＤＳ、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、骨髄異形成疾患（再生不良性貧血など）、虚血性疾患（心筋梗塞、脳梗塞、脳卒中、虚血性再灌流障害など）、劇症肝炎、アルコールなどの中毒による肝疾患、感染性多臓器不全、糖尿病などの治療効果が期待される。本発明には、前記アポトーシス抑制剤を前記疾患患者に投与し、アポトーシスを抑制し、それにより疾患を治療することを特徴とする、前記疾患の治療方法も包含される。かかる治療方法は、なかでも、虚血性疾患、特に、心筋梗塞、脳梗塞、とりわけ、心筋梗塞の治療に好適である。また、臓器移植の際に用いられる臓器の保存液に添加することにより、移植時までの臓器をより適した状態で保存できることが期待される。
本発明のアポトーシス抑制剤は、前記ＢＨ４融合ポリペプチドを特定の細胞への取込みが容易になるように各種修飾を施した形態で含有してもよい。また、本発明のアポトーシス抑制剤は、アンチアポトーシス活性を発揮しうる範囲で、通常用いられる各種助剤を含有してもよい。
かかるアポトーシス抑制剤を投与する際、その投与形態、投与方法、投与量は、対象となる個体の年齢、体重、疾患の状態などにより適宜設定されうる。
さらに、本発明により、前記疾患、なかでも、虚血性疾患、特に、心筋梗塞、脳梗塞、とりわけ、心筋梗塞の予防または治療剤の製造のためのＢＨ４融合ポリペプチドの使用が提供される。
以下、実施例などにより本発明を具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
試薬
ヒトシトクロムｃとラットシトクロムｃと交差反応する抗ハトシトクロムｃモノクローナル抗体（７Ｈ８．２Ｃ１２）として、Ｅ．マーゴリアッシュ（Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ）博士（イリノイ大学、イリノイ州）の厚意により提供されたものを用いた。ラットＶＤＡＣに交差反応する抗ヒトＶＤＡＣ（ポーリン）モノクローナル抗体（３１ＨＬ）として、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社より入手したものを用いた。抗ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌポリクローナル抗体〔ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌのアミノ酸配列（配列番号：１０）のアミノ酸番号：１９３〜２１２の領域に特異的なＬ１９および該アミノ酸配列のアミノ酸番号：２〜１９の領域に特異的なＳ１８〕は、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から入手したものを用いた。ハイドロキシアパタイトおよびセライトとして、それぞれバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社およびロス（Ｒｏｔｈ）社から入手したものを用いた。ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性化Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、ジェンザイム−シエナ（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｓｙｅｎａ）社から入手したものを用いた。他の試薬などは、特に記載しない限り、和光純薬社製の試薬などを用いた。参考例１ ＤＮＡトランスフェクションおよびアポトーシスアッセイ
ヒトＢ細胞由来ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）を鋳型とし、配列番号：１１および配列番号：１２のそれぞれで示される配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、プルーフ−リーディングＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ヒトｂｃｌ−ｘ_Ｌ変異体ＤＮＡを作製した。前記ヒトｂｃｌ−ｘ_Ｌ変異体ＤＮＡの配列を配列表の配列番号：１３に示す。得られた増幅断片をｐＵＣ−ＧＡＧＧＳ発現ベクター〔清水ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，２１−２９（１９９６）〕にそれぞれサブクローニングした。
リポフェクタミンを用い、ＤＮＡトランスフェクションをモニターするためのグリーンフルオレッセンスプロテイン（以下、ＧＦＰという）の発現構築物ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテック社製）（０．１μｇ）と共にヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌまたはその変異体の発現プラスミド（０．１μｇ）により、ヒト頸部癌細胞株であるＨｅＬａ細胞を２４時間トランスフェクトした。
得られたトランスフェクト細胞をＶＰ１６で２４時間処理した。ついで、１μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による染色後、全陽性細胞に対する核断片化を呈したＧＦＰ陽性細胞の割合として、アポトーシスの程度を算出した。
また、崩壊促進因子（ＤＡＦ）を発現させる場合、０．１μｇのＤＡＦ発現構築物（ｐＵＣ−ＣＡＧＧＳ−ＤＡＦ）と共にヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌまたはその変異誘導体の発現プラスミド（各０．１μｇ）により、ＨｅＬａ細胞を２４時間トランスフェクトした。２４時間後、得られた細胞を抗ヒトＤＡＦ抗体とＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧとで１時間染色した。ついで、セルソーター〔商品名：ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ，ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製〕を用いてＤＡＦ陽性細胞を採取し、ＤＡＦおよびＢｃｌ−ｘ_Ｌの発現をフローサイトメーターにより評価した。前記のようにして集められたＤＡＦ陽性細胞を２００μＭのＶＰ１６で２４時間処理した。その後、細胞を１０μＭジギトニンで３７℃で１０分間処理し、遠心分離により上清とペレットとを分離した。シトクロムｃ量を抗ハトシトクロムｃ抗体を用いたウエスタンブロット解析により推定した。
参考例２ ミトコンドリアの生化学的パラメータ（ΔΨおよびシトクロムｃ漏出）の測定
清水らの既報〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，２１−２９（１９９６）〕に従って単離したラット肝臓ミトコンドリア（１ｍｇタンパク質／ｍｌ）を０．３Ｍ マンニトール、１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ／Ｋ^＋（ｐＨ７．４）、０．１％脂肪酸フリーのＢＳＡ、１ｍＭ リン酸カリウム、４０μＭ ＣａＣｌ_２および活性化のための４．２ｍＭ コハク酸塩を含む培地で組換えタンパク質の存在下または非存在下に２５℃でインキュベートした。
ΔΨについて、清水らの既報〔Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１３，２１−２９（１９９６）〕のようにローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の取り込みを測定することにより評価した。
シトクロムｃ漏出について、前記ミトコンドリアを遠心分離し、得られたペレットをＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁してミトコンドリア懸濁液を得、該ミトコンドリア懸濁液と上清とを抗シトクロムｃ抗体を用いて、ウエスタンブロット解析に供することにより調べた。
参考例３ 免疫沈降およびウエスタンブロット解析
精製ＶＤＡＣ（２０μｇ／ｍｌ）を組換えＢｃｌ−ｘ_Ｌ（ｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ）と組換えΔ２１（ｒΔ２１）とインキュベートし、得られた混合物を抗Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ（Ｌ１９）抗体と正常ラビットＩｇＧとにより免疫沈降させた。ポリペプチドとＶＤＡＣとの間の相互作用を検出するために、単離ミトコンドリア（１ｍｇ）を２０μｇのＢｃｌ−ｘ_Ｌ Ｎ末端ポリペプチドまたはＢｃｌ−ｘ_Ｌ Ｃ末端ポリペプチドと５分間インキュベートした。ついで、得られたミトコンドリアをペレット化し、洗浄し、プロテイナーゼインヒビター（０．１ｍＭ ｐ−ＡＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍｌアプロチニン，１μｇ／ｍｌキモスタチン，１μｇ／ｍｌロイペプチン，１μｇ／ｍｌアンチパイン，１μｇ／ｍｌペプスタチン）の存在下、溶解用緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１４２．５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１ｍＭ ＥＧＴＡおよび０．５％ ＮＰ４０）に懸濁した後、超音波破砕を行なった。免疫沈降は、用いたポリペプチドに対応する抗Ｂｃｌ−ｘポリクローナル抗体で行なった。抗ＶＤＡＣ抗体を用いたウエスタンブロッティングによりＶＤＡＣの共免疫沈降を検出した。
参考例４ リポソームでのＶＤＡＣの再構成
精製ＶＤＡＣを、清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕に記載の超音波凍結融解手法により、小さな単膜リポソームに再構成した。スクロース取り込み実験は、リポソームの膨潤を評価することにより行なった。
ｐＨ５．２で生産されたリポソームを、ｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ、ｒΔ２１、ｒＢａｘまたはポリペプチドと共に１ｍｌのリポソームバッファー中２５℃で３分間インキュベートした。なお、酸性ｐＨは、ｒＢｃｌ−ｘ_ＬとｒＢａｘのリポソームへの効率のよい取り込みに要求される条件である。ついで、スクロースを５０ｍＭまで添加し、リポソームの膨潤を分光光度計（Ｆ−４５００、日立製作所社製）を用いて、５２０ｎｍの波長で光分散の減少により評価した。スクロース取り込みは、清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕に記載の^１４Ｃ−スクロース取り込みからも推定された。
実施例１ ヒトＢｃｌ−ｘ_ＬおよびヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌ Δ２１の精製
ヒトＢｃｌ−ｘ_ＬおよびＢｃｌ−ｘ_Ｌ Δ２１（Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＮ末端２１アミノ酸残基を欠失）を大腸菌株ＤＨ５α中グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させ、得られた融合タンパク質をグルタチオン−セファロースカラムに供して精製した。ついで、トロンビンによる切断により、ヒトＢｃｌ−ｘ_ＬまたはＢｃｌ−ｘ_Ｌ Δ２１とＧＳＴとを分離した。また、ヒトＢａｘは、成田らの文献〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５，１４６８１−１４６８６（１９９８）〕に従って得られた。得られた精製タンパク質を緩衝液〔組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ジチオスレイトール〕に溶解した。挿入断片を持たないベクター由来のＧＳＴタンパク質を調製し、模擬の対照タンパク質として用いた。ラット肝臓ＶＤＡＣを清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕に従って精製した。得られたＶＤＡＣは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示した。
実施例２ ポリペプチドの合成
ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール活性化Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を用いて、モデル３９６マルチプルポリペプチドシンセサイザー〔アドバンスド・ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）社製〕でポリペプチドを合成した。
合成したポリペプチドを以下に示す：
合成ポリペプチド：
ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４（ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌのアミノ酸番号：４−２３）：ＳＮＲＥＬＶＶＤＦＬＳＹＫＬＳＱＫＧＹＳ（配列番号：３）、
第１４図に記載された該ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４（ヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４のアミノ酸番号：４−２３）の変異体（配列番号：１４〜２１）、
ヒトＢｃｌ−２ ＢＨ４（ヒトＢｃｌ−２ ＢＨ４のアミノ酸番号：７−３０）：ＴＧＹＤＮＲＥＩＶＭＫＹＩＨＹＫＬＳＱＲＧＹＥＷ（配列番号：２）、
ヒトＢａｋ ＢＨ４（ヒトＢａｋ ＢＨ４のアミノ酸番号：２７−５０）：ＶＡＱＤＴＥＥＶＦＲＳＹＶＦＹＲＨＱＱＥＱＥＡＥ（配列番号：２２）。
前記ポリペプチドについて、それぞれ、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）により、純度が９５％を超えることが確認された。
Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＮ末端（アミノ酸番号：２−１９）ポリペプチドおよびＢｃｌ−ｘ_ＬのＣ末端（アミノ酸番号：１９３−２１２）ポリペプチドは、サンタクルーズバイオテクノロジー社から購入した。
ＨＩＶ ＴＡＴ（配列番号：５）のタンパク質トランスダクションドメイン〔ＰＴＤ（アミノ酸番号：４９−５７）〕に対応する、ポリペプチドＴＡＴ−ＰＴＤのＮ末端にエオシン結合システイン残基を導入したポリペプチド〔エオシン−Ｃ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２３）〕を合成した。ついで、β−アラニン残基を介してエオシン標識ＴＡＴ−ＰＴＤポリペプチドとヒトＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドとを結合させることにより、ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＢＨ４ポリペプチド（ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチド）を作製した。
得られたＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドは、逆相ＨＰＬＣを用い、タンパク質由来の蛍光（２８０ｎｍにおける吸収）をモニターすることにより、純度が、９０％以上であることが確認された。
実施例３ アポトーシスミトコンドリア変化のＢｃｌ−ｘ_Ｌによる抑制におけるＢＨ４ドメインの重要性
Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘ_Ｌがアポトーシスミトコンドリア変化をブロックすることによりアポトーシスが抑制されるので、ＢＨ４ドメインがＢｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘ_Ｌによるアポトーシスミトコンドリア変化の抑制に必要とされるかどうかを調べた。
参考例１に従い、Ｂｃｌ−ｘ_ＬまたはそのＢＨ４欠失変異体（Δ２１：Ｂｃｌ−ｘ_Ｌのアミノ酸残基２−２１位を欠く）のＤＮＡでＨｅＬａ細胞をトランスフェクトし、アポトーシスアッセイを行なった。ＤＡＦの発現構築物と共にＢｃｌ−ｘ_Ｌ、Δ２１またはベクター単独の発現構築物でＨｅＬａ細胞を一過的にトランスフェクトした。ＤＡＦの細胞表面発現を用いて、前記ＤＮＡでトランスフェクトした細胞を同定し、これらの細胞をフローサイトメーターを用いて回収した。
その結果、第１図に示すように、ＢＨ４ドメインを有するＢｃｌ−ｘ_Ｌを発現するトランスフェクト細胞は、１００μＭまたは２００μＭのＶＰ１６でのアポトーシス誘導に抵抗性を示すが、ＢＨ４ドメインを欠くΔ２１を発現するトランスフェクト細胞およびベクター単独のトランスフェクト細胞は、１００μＭのＶＰ１６でのアポトーシス誘導に抵抗性を示さない。
また、第２図に示すように、９３％を超える純度のＤＡＦ陽性細胞を得られた。また、得られた、ほぼ全てのＤＡＦ陽性細胞は、Ｂｃｌ−ｘ_ＬまたはΔ２１を同等のレベルで発現した。
ついで、回収細胞をＶＰ１６で処理してアポトーシスを誘導した後、シトクロムｃ漏出を試験した。その結果、第３図に示されるように、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌの過剰発現は、ＶＰ１６処理後のミトコンドリアからのシトクロムｃ漏出を妨げたが、Δ２１の過剰発現は、シトクロムｃ漏出を妨げなかったので、ＢＨ４ドメインがアポトーシスシトクロムｃ漏出を抑制するのに必要とされることが示される。また、この結果と一致して、第４図に示すように、単離ミトコンドリアを用いた場合、組換えＢｃｌ−ｘ_Ｌ（ｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ）は、Ｃａ^２＋誘導されたミトコンドリアΔΨロスとシトクロムｃ漏出との両方を抑制したが、組換えΔ２１（ｒΔ２１）は、実際にミトコンドリアΔΨロスとおよびシトクロムｃ漏出それぞれの抑制活性を示さなかった。また、ミトコンドリアが、例えば、アトラクチロシド、過酸化水素などの他のアポトーシス刺激に曝された場合も、同様の結果が得られた。
実施例４ ＶＤＡＣ調節におけるＢＨ４ドメインの役割
Ｂｃｌ−ｘ_Ｌが直接ＶＤＡＣに結合し、このチャネルの活性を抑制して、アポトーシスシトクロムｃ漏出の抑制およびΔΨロスの抑制を導くことが知られている。また、清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕に記載のようにＢｃｌ−ｘ_ＬとＶＤＡＣとの間の相互作用も細胞で検出されている。そこで、ＶＤＡＣ調節におけるＢＨ４ドメインの機能的役割を調べた。
まず、参考例３に従って共免疫沈降解析を行ない、Ｂｃｌ−ｘ_ＬとＶＤＡＣとの間の相互作用におけるＢＨ４ドメインの欠損の影響を調べた。その結果、第５図に示すように、共免疫沈降解析により、Ｂｃｌ−ｘ_ＬおよびＶＤＡＣは、同程度にＶＤＡＣと相互作用するため、ＢＨ４ドメインは、Ｂｃｌ−ｘ_ＬとＶＤＡＣとの間の結合に重要ではないことが示唆される。
次に、ＶＤＡＣ活性の調節におけるＢＨ４ドメインの機能的役割を調べた。２つの手法：清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕に記載の放射標識スクロースを用いる方法と、光散乱の減少をモニターすることにより、リポソームのスクロース依存性膨潤を測定する方法とを用いて、ＶＤＡＣ含有リポソームへのスクロース取り込みを評価して、ＶＤＡＣ活性を測定した。その結果を第６図に示す。顕微鏡観察またはフローサイトメトリー解析により、スクロース取り込み依存性リポソーム膨潤が確認されたので、該リポソーム膨潤は、水の浸透圧依存的な流出を圧倒する、大きなＶＤＡＣポアを介したスクロースと水の速い流入にもとづくと思われる。ＶＤＡＣリポソームは、第６図に示すように、スクロースの存在下に膨潤したが、ＶＤＡＣを含有しないリポソームと変性ＶＤＡＣリポソームとは、膨潤を示さなかったため、スクロース取込みがＶＤＡＣにより介されることが示される。
第７図に示すように、ｒＢｃｌ−ｘ_ＬのＶＤＡＣリポソームへの添加は、ＶＤＡＣ媒介スクロース取り込みを抑制し、ｒΔ２１のＶＤＡＣリポソームへの添加は、ＶＤＡＣ媒介スクロース取り込みに影響しなかったため、ＢＨ４がＢｃｌ−ｘ_ＬによるＶＤＡＣの抑制に必須であることが示される。また、第８図に示すように、放射標識スクロースの流入を評価することによりＶＤＡＣ活性を直接測定した場合にも同様の結果が得られた。
これらの結果により、ＢＨ４ドメインは、ＶＤＡＣへの結合に顕著に影響を与えないが、該ドメインは、Ｂｃｌ−ｘ_ＬがＶＤＡＣ活性を抑制することに要求されることが示唆される。
実施例５ Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメインのＶＤＡＣ活性抑制への関与
ＶＤＡＣ活性の抑制におけるＢＨ４ドメインの役割を明らかにするために、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌのドメインに対応するポリペプチドをＶＤＡＣリポソームに添加し、ＶＤＡＣ活性を評価した。その結果、第９図に示されるように、ＢＨ４ポリペプチドは、濃度依存的様式でＶＤＡＣ活性を抑制した。
２０μｇ／ｍｌ ＢＨ４ポリペプチドの存在下における光散乱の増加（第９図に示す）は、該ＢＨ４ポリペプチドによるＶＤＡＣの完全な閉鎖後のＶＤＡＣリポソームの浸透圧依存性収縮によるものであった。また、第１０図に示すように、Ｂｃｌ−２由来のＢＨ４ポリペプチドは、ＶＤＡＣ活性を抑制したが、Ｂａｋ由来の対応するポリペプチドは不活性であった。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ由来のＢＨ４ポリペプチドは、ＶＤＡＣを含有しないリポソームにおいて、いかなる有意な影響をも示さなかった。清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕によれば、ＢａｘおよびＢａｋがＶＤＡＣの活性を促進し、この影響がＢｃｌ−ｘ_Ｌにより拮抗されることが示されている。第１１図に示すように、ＢＨ４ポリペプチドは、投与量依存的様式で、ＶＤＡＣ活性のｒＢａｘ誘導促進を抑制したが、Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ポリペプチドは、Ｂａｘに結合しなかった。
これらの結果により、ｒＢｃｌ−ｘ_ＬおよびＢａｘのＶＤＡＣに対する拮抗的な影響がヘテロダイマーの形成によるものでなく、独立した作用によるものであることが示唆される。また、一般的にｒＢｃｌ−ｘ_Ｌの膜への挿入を容易にする酸性ｐＨ〔清水ら、Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕でＶＤＡＣリポソーム実験を行なわれていたが、中性ｐＨでポリペプチドを用いた場合にも、実際に同じ結果が得られた。
第１２図に示すように、ｒＢｃｌ−ｘ_Ｌと比較してより少ない程度であるが、Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ポリペプチドによるＶＤＡＣの抑制に一致して、Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＮ末端断片（アミノ酸番号：２−９）とＶＤＡＣとの間の相互作用が検出された。Ｂｃｌ−ｘ_Ｌは、ＢＨ４以外の幾つかの領域でＶＤＡＣに主に結合するので、他の領域は、恐らくＶＤＡＣへの親和性および／または接近能を増加させることにより、ＢＨ４の活性を促進すのであろう。これらの結果により、アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインがＶＤＡＣを抑制するに十分であることが示唆される。
Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＬ^８Ｖ^９、Ｆ^１２などのＢＨ４ドメインの保存残基のいくつかが、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘ_Ｌのアンチアポトーシス活性に重要であることが報告されている。ＢＨ４ドメインによるＶＤＡＣの抑制における前記保存残基の役割を評価するために、第１３図に示す数種類のＢＨ４変異体ポリペプチドを作製し、ＶＤＡＣにおける抑制効果を調べた。その結果を第１４図に示す。
第１４図に示されるように、Ｌ^８Ｖ^９の変異体ポリペプチド（ＬＶ８９ＶＦ、ＬＶ８９ＧＧおよびΔＬＶ）とＦ^１２Ｌ^１３の変異体ポリペプチド（ＦＬ１２１３ＧＧおよびΔＦＬ）は、ＶＤＡＣを抑制しなかった。さらに、Ｄ^１１での１アミノ酸置換（Ｄ１１Ｇ）およびＬ^１７での１アミノ酸置換（Ｌ１７Ｗ）のそれぞれを有するポリペプチドは、正常ＢＨ４ポリペプチドのＶＤＡＣ抑制活性の約７０％および約半分であり、フアングらの既報〔Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１７，１０２９−１０３９（１９９８）〕に記載のように、アンチアポトーシス活性の減少に一致した。これらの結果は、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌのアンチアポトーシス機能がＶＤＡＣ活性の抑制により媒介されることを示唆する。
実施例６ Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメインによるＣａ^２＋誘導された単離ミトコンドリアのΔΨの漏出の抑制
前記第１３図に示す数種類のＢＨ４変異体ポリペプチドを用い、ΔΨの漏出における影響を調べた。単離ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μＭ Ｃａ^２＋の存在下に２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドとインキュベートし、ローダミン１２３強度を連続的にモニターした結果を第１４図の左パネルに示す。また、単離ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μＭ Ｃａ^２＋の存在下に２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドおよび種々の変異体ポリペプチドを１５分間インキュベートして、ローダミン１２３強度を用いてΔΨを測定した結果を第１４図の右パネルに示す。
第１４図および１５に示されるように、Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ポリペプチドは、Ｃａ^２＋誘導ΔΨロスおよびＶＤＡＣ活性を有意に抑制するが、組換えＢｃｌ−ｘ_Ｌのモル濃度の約２５倍を超えるモル濃度でのみ有効で、ＢＨ４以外の他の領域がＶＤＡＣへの接近能を増加させるであろうことに一致する。実際にアンチアポトーシス活性に影響する、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ１変異体およびＢＨ２変異体は、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘ_ＬがＶＤＡＣへの結合能に実際に影響する。さらに、全ＢＨ４変異体ポリペプチドは、それぞれ、ミトコンドリアΔΨを抑制する能力（第１４図）に比例してＶＤＡＣ活性を抑制する能力（第１５図）を示した。
これらの結果により、アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメインが、ＶＤＡＣ活性の抑制能に並行して、アポトーシスミトコンドリア変化の抑制能を有することが示唆される。
実施例７ ＢＨ４ドメインによるアポトーシス（細胞死）の抑制
前記実施例６の結果より、ＢＨ４ポリペプチド単独でもアポトーシス性のミトコンドリア変化を抑制する能力を有することが導き出されたので、さらに、ＢＨ４ポリペプチドがアポトーシスを抑制する能力を有する可能性を調べた。
そこで、細胞へのＢＨ４ポリペプチドの移送を容易にするため、Ｎ末端エオシン標識システインとＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドと融合させたＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のＰＴＤとを含む３０アミノ酸残基の前記ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドを合成し、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドの存在下に２００μＭ ＶＰ１６でＨｅＬａ細胞を処理し、光位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡それぞれにより観察した。なお、ＴＡＴ−ＰＴＤは、迅速な、濃度依存的様式でのタンパク質の細胞への輸送を容易にすることが知られている。その結果を第１６図に示す。上段パネルは、細胞形態、下段パネルは、ポリペプチドの細胞内蓄積を調べた結果を示す。
第１６図は、培養培地に添加されたＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドが約９０％のトランスフェクション効率で細胞に入ったことを示す。マイトトラッカーによるトランスフェクト細胞の共染色により、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドが、主にミトコンドリアに局在することが示された。第１６図、第１７図、第１８図に示されるように、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドは、濃度依存的様式でＶＰ１６誘導アポトーシスを有意に抑制したが、ＴＡＴのみのポリペプチドは、いかなる濃度においてもＶＰ１６誘導アポトーシスを有意に抑制しなかった。また、ポリペプチドの細胞への非効率的な運搬の結果、ＢＨ４のみのポリペプチドは、ＶＰ１６誘導アポトーシスへの影響を示さなかった。これらの知見により、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドは、細胞におけるアポトーシス性の細胞死を抑制するに十分であることが示される。
実施例８ 各種ＢＨ４融合ポリペプチドのアンチアポトーシス活性の評価
実施例２と同様にして、下記アミノ酸配列（配列番号：２８〜３３）を有するＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチド（ＢＨ４融合ポリペプチド）を合成した。

得られた各種ＢＨ４融合ポリペプチドをＨ_２Ｏに溶解して、０．１μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのＢＨ４融合ポリペプチド溶液を得た（アポトーシス抑制剤）とＨｅＬａ細胞とを３時間接触させることにより、ＨｅＬａ細胞を前処理した。ついで、２００μＭ ＶＰ１６でＨｅＬａ細胞を処理し、アポトーシスを誘導した。各細胞を１μＭ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２により染色し、全細胞に対する核断片化を呈した細胞の割合としてアポトーシスの程度（生存率）を算出した。その結果を表１に示す。

表１の結果より、細胞への取込み作用を発揮しうるポリペプチド（ＴＡＴ）とアンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメインとの間のスペーサー基は、β−アラニンのみでなく、アラニンまたはプロリンに置換することができることがわかる。また、アンチアポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質のＢＨ４ドメイン部分において４番目のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換した場合でも実用可能なレベルのアンチアポトーシス活性を有することがわかる。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、アンチアポトーシス性Ｂｃｌファミリータンパク質に保存されたＢＨ４ドメインのコンセンサス配列を示す。
配列番号：７の配列中、１位のＸａａは、エオシン結合システイン残基を示し、１１位のＸａａはβ−アラニン残基を示す。
配列番号：８の配列中、１位のＸａａは、エオシン結合システイン残基を示し、１１位のＸａａはβ−アラニン残基を示す。
配列番号：１１の配列は、ヒトｂｃｌ−ｘ_ＬのＤＮＡに基づいてデザインされた、変異体ｂｃｌ−ｘ_Ｌの作製のためのプライマーの配列である。
配列番号：１２の配列は、ヒトｂｃｌ−ｘ_ＬのＤＮＡに基づいてデザインされた、変異体ｂｃｌ−ｘ_Ｌの作製のためのプライマーの配列である。
配列番号：１３の配列は、合成されたｂｃｌ−ｘ_Ｌ変異体ＤＮＡの配列である。
配列番号：１４の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１５の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１６の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１７の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１８の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１９の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２０の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２１の配列は、合成されたＢｃｌ−ｘ_ＬＢＨ４変異体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２３の配列は、ポリペプチドＴＡＴ−ＰＴＤのＮ末端にエオシン結合システイン残基を導入したポリペプチドの配列である。前記配列中、１位のＸａａは、エオシン結合システイン残基を示す。
配列番号：２８の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。前記配列中、Ｘａａは、β−アラニン残基を示す。
配列番号：２９の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。前記配列中、Ｘａａは、β−アラニン残基を示す。
配列番号：３０の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３１の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３２の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３３の配列は、合成されたＢＨ４融合ポリペプチドのアミノ酸配列である。
産業上の利用可能性
本発明のＢＨ４融合ポリペプチドは、ミトコンドリアΔΨロスおよびシトクロムｃ漏出のそれぞれを抑制することができ、より効率よく細胞へ取り込まれるため、効率よくアポトーシスを抑制することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のアポトーシス抑制剤は、アポトーシスを抑制することができるため、ＡＩＤＳ、神経変性疾患、骨髄異形成疾患、虚血性疾患、感染性多臓器不全、劇症肝炎、糖尿病などの治療剤として有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｂｃｌ−ｘ_ＬおよびΔ２１の一過的な発現のＶＰ１６により誘導されたアポトーシスへの影響を調べた結果を示す図である。ＨｅＬａ細胞は、（ＤＮＡトランスフェクト細胞の検出のための）０．１μｇのＧＦＰ発現構築物と共に、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ（○）、Δ２１（■）またはベクターのみ（□）のそれぞれの発現構築物で２４時間トランスフェクトした。示された濃度で２４時間ＶＰ１６によりトランスフェクト細胞を処理し、ついで処理後の細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。全ＧＦＰ陽性細胞中の核断片化を伴うＧＦＰ陽性細胞の割合として、アポトーシス性の細胞死を決定した。データは、３回の独立した実験の結果の１つを示す。
第２図は、フローサイトメトリーによる、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ発現ＨｅＬａ細胞およびΔ２１発現ＨｅＬａ細胞の分類を調べた結果を示す図である。ＨｅＬａ細胞はＤＡＦ発現プラスミドと共にＢｃｌ−ｘ_Ｌ、Δ２１またはベクター単独の発現産物で２４時間トランスフェクトした。ついで細胞を抗ヒトＤＡＦ抗体で染色し、ＤＡＦ陽性細胞をフローサイトメトリーで分取した。分取された細胞によるＤＡＦ（上段パネル）の発現またはＢｃｌ−ｘ_Ｌタンパク質およびΔ２１タンパク質（下段パネル）をフローサイトメトリーを用いて解析した。点線はＢｃｌ−ｘ_Ｌ発現細胞を示し、実線はΔ２１発現細胞を示す。ＤＮＡでトランスフェクトされていない細胞を黒塗りの領域で示す。データは、３回の独立した実験の代表的な結果を示す。
第３図は、Ｂｃｌ−ｘ_ＬまたはΔ２１によるアポトーシスシトクロムｃ漏出への影響を調べた結果を示す図である。示された時間、２００μＭ ＶＰ１６により第２図と同様に分取されたＤＡＦ陽性細胞を処理し、ついで生化学的細胞分画の後、ウエスタンブロット解析によりシトクロムｃ漏出を決定した。データは、３回の独立した実験の結果の１つを示す。
第４図は、Ｃａ^２＋誘導のΔΨロスおよび単離ミトコンドリアからのシトクロムｃ漏出の抑制に対するＢｃｌ−ｘ_ＬのＢＨ４ドメインの役割を調べた結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ラット肝臓ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μＭ Ｃａ^２＋と共に、２０μｇ／ｍｌのｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ、ｒΔ２１または模擬タンパク質で処理し、Ｒｈ１２３を用いてΔΨを調べた結果を示し、パネル（Ｂ）は、インキュベーション１５分後の上清画分（ｓｕｐ）およびミトコンドリア画分（ｐｔ）におけるシトクロムｃレベルを調べた結果を示す。データは、３回の独立した実験の結果の１つを示す。「トータル」は、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００によるシトクロムｃ漏出の総量を示す。
第５図は、Ｂｃｌ−ｘ_ＬおよびΔ２１のＶＤＡＣとの直接相互作用を調べた結果を示す図である。精製ラット肝臓ＶＤＡＣ（２０μｇ／ｍｌ）をｒＢｃｌ−ｘ_Ｌタンパク質（２０μｇ／ｍｌ）およびｒΔ２１タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。試料を抗Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ抗体、Ｌ１９（α−Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ）および正常ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ）と免疫沈降させた。ついで、免疫沈降物を抗ＶＤＡＣ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。「トータル」は、用いられたＶＤＡＣの総量を示す。
第６図は、ＶＤＡＣリポソームによるスクロース取り込みを調べた結果を示す図である。清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕の記載に従い、ＶＤＡＣを含有しないリポソーム、ＶＤＡＣリポソームおよび熱変性ＶＤＡＣリポソーム（加熱ＶＤＡＣリポソーム）を５０ｍＭスクロースとインキュベートした。リポソーム膨潤を５２０ｎｍの波長で分光光度計を用いて光散乱の減少により連続的にモニターした。
第７図は、Δ２１のＶＤＡＣ活性抑制に対する影響を調べた結果を示す図である。左パネルは、ＶＤＡＣリポソームを２０μｇ／ｍｌのｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ、ｒΔ２１および模擬タンパク質と共に５０ｍＭスクロースとインキュベートした。光散乱は、第６図と同様にモニターした。右パネルは、Δ２１のＶＤＡＣ活性抑制に対するタンパク質濃度の影響を調べた結果を示す図である。ＶＤＡＣリポソームを示された濃度でｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ（黒カラム）、ｒΔ２１（白カラム）と共に５０ｍＭスクロースとインキュベートした。開始時の値（時間０）から１０分経過時の光散乱の差異（Δ光散乱）を示す。
第８図は、ＶＤＡＣリポソームへの^１４Ｃ−スクーロースの取り込みへのＢｃｌ−ｘ_Ｌの影響を調べた結果を示す図である。清水らの既報〔Ｎａｔｕｒｅ，３９９，４８３−４８７（１９９９）〕の記載に従い、２０μｇ／ｍｌのｒＢｃｌ−ｘ_Ｌ若しくはｒΔ２１の存在または非存在下にＶＤＡＣを含有しないリポソーム、熱変性ＶＤＡＣリポソーム（加熱）およびＶＤＡＣリポソームを^１４Ｃ−スクーロース（２μＣｉ）と１０分間インキュベートした。遠心濾過後、リポソームを回収し、２％ＳＤＳに溶解した。ついで、リポソームにおける^１４Ｃ−スクロース放射活性をカウントした。
第９図は、ＢＨ４ポリペプチドによるＶＤＡＣ活性の抑制を調べた結果を示す図である。ＶＤＡＣリポソームを示された濃度のＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドと共に５０ｍＭ スクロースとインキュベートし、光散乱を測定した。
第１０図は、種々のＢＨ４ポリペプチドによるＶＤＡＣ活性の抑制を調べた結果を示す図である。ＶＤＡＣリポソームを２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−２ ＢＨ４ポリペプチド、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドまたはＢａｋ推定ＢＨ４ポリペプチドと共にスクロースとインキュベートし、光散乱を測定した。
第１１図は、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドによるＶＤＡＣ活性のＢａｘ誘導促進の抑制を調べた結果を示す図である。ＶＤＡＣリポソームを５μｇ／ｍｌのｒＢａｘおよび示された濃度のＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドの存在下または非存在下に５０ｍＭスクロースとインキュベートし、光散乱を測定した。開始時の値（時間０）から１０分経過時の光散乱の差異（Δ光散乱）を示す。
第１２図は、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ Ｎ末端断片またはＣ末端断片とＶＤＡＣ 間の相互作用を示す図である。ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）をＢｃｌ−ｘ_Ｌ Ｎ末端（アミノ酸番号：２−１９）ポリペプチド（２０μｇ／ｍｌ）およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ Ｃ末端（アミノ酸番号：１９３−２１２）ポリペプチド（２０μｇ／ｍｌ）と５分間インキュベートした。ミトコンドリアライゼートを抗Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ抗体（Ｓ１８）（α−ＮＢｃｌ−ｘ_Ｌ、アミノ酸番号：２−１９に対応する抗体）およびＬ１９抗体（α−ＣＢｃｌ−ｘ_Ｌ、アミノ酸番号：１９３−２１２に対応する抗体）による免疫沈降に供した。正常ウサギＩｇＧ（ＩｇＧ）を対照として用いた。抗ＶＤＡＣ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより免疫沈降物を解析した。
第１３図は、変異体Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。図中、置換残基を黒塗りで示す。
第１４図は、変異体ＢＨ４ポリペプチドのＶＤＡＣ活性抑制能を調べた結果を示す図である。ＶＤＡＣリポソームを５０ｍＭ スクロースと共に２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドまたは示された変異体ポリペプチドとインキュベートし、ついで光散乱を測定した。左パネルは、光散乱を連続的に測定した結果を示す。右パネルは、開始時の値（時間０）から１０分経過時の光散乱の差異（Δ光散乱）を示す。
第１５図は、Ｃａ^２＋誘導されたミトコンドリアのΔΨロスのＢＨ４ポリペプチドによる抑制を調べた結果を示す図である。左パネルは、単離ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μＭ Ｃａ^２＋の存在下に２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドとインキュベートし、ローダミン１２３強度を連続的にモニターした結果を示す。右パネルは、単離ミトコンドリア（１ｍｇ／ｍｌ）を４０μＭ Ｃａ^２＋の存在下に２０μｇ／ｍｌのＢｃｌ−ｘ_Ｌ ＢＨ４ポリペプチドおよび種々の変異体ポリペプチドを１５分間インキュベートして、ローダミン１２３強度を用いてΔΨを測定した結果を示す。
第１６図は、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドの存在または非存在下にＶＰ１６で処理したＨｅＬａ細胞の代表例を示す図である。示された濃度のＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドの存在下にＨｅＬａ細胞を２００μＭ ＶＰ１６で示された時間処理した。ついで、光位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡それぞれにより、細胞形態（上段パネル）およびポリペプチドの細胞内蓄積（下段パネル）を調べた。
第１７図は、ＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドのＶＰ１６誘導アポトーシスへの影響を調べた結果を示す図である。１００μｇ／ｍｌのＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチド（□）、ＴＡＴポリペプチド（○）の存在下またはポリペプチドの非存在下（●）に示された濃度のＶＰ１６で２４時間処理し、ついでＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。蛍光顕微鏡を用いて核形態によりアポトーシス細胞死を決定した。データは、３回の独立した実験の結果の１つを示す。
第１８図は、ＶＰ１６誘導アポトーシスのＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチドによる投与量依存的抑制を調べた結果を示す図である。示された濃度のＴＡＴ−ＢＨ４ポリペプチド（□）またはＴＡＴポリペプチド（○）の存在下に２００μＭ ＶＰ１６で２４時間ＨｅＬａ細胞を処理した。アポトーシス細胞死を第１７図と同様にして決定した。

Claims (9)

1. 細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列またはその誘導体配列と、
   （Ａ）配列番号：１，２，３，４，９，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１または２９のＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ３０に記載のアミノ酸配列、および
   （Ｂ）配列番号：１，２，３，４，９，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１または２９のＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ３０に記載のアミノ酸配列において、１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、
   からなる群より選択されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチド。
2. 誘導体配列が、（Ｉ）細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１残基の化学修飾基を有するアミノ酸配列、または
   （II）細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１残基のアミノ酸の置換もしくは挿入を有するアミノ酸配列であり、かつ細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列、
   である、請求項１記載のＢＨ４融合ポリペプチド。
3. 細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドが、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＴ、ＨＴＬＶ−Ｉ由来のｐ２７、ＨＩＶ由来のａｒｔ／ｔｒｓ、ＨＳＶ−1 由来のＶＰ２２およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＡｎｔｐからなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１または２記載のＢＨ４融合ポリペプチド。
4. 細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列が、
   （ｉ）配列番号：５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：４９〜５７を少なくとも含有する配列；
   （ii）配列番号：２４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１３を少なくとも含有する配列；
   (iii) 配列番号：２５に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１６を少なくとも含有する配列；
   （iv）配列番号：２６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜３０１を少なくとも含有する配列；および
   （ｖ）配列番号：２７に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号：１〜１６を少なくとも含有する配列
   からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項３記載のＢＨ４融合ポリペプチド。
5. 配列番号：６に記載のアミノ酸配列と、
   （ａ）配列番号：１，２，３，４，９，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１または２９のＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ３０に記載のアミノ酸配列、および
   （ｂ）配列番号：１，２，３，４，９，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１または２９のＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ３０に記載のアミノ酸配列において、１残基のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するアミノ酸配列、
   からなる群より選択されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを抑制しうるＢＨ４融合ポリペプチド。
6. 配列番号：７、８、２８、２９、３０、３１、３２および３３からなる群より選ばれた１種のアミノ酸配列を有する、請求項５記載のＢＨ４融合ポリペプチド。
7. 細胞への取り込み作用を発揮しうるポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ末端にシステイン残基を有し、カルボシキル末端側にβ−アラニン残基を有する、請求項１〜６いずれか記載のＢＨ４融合ポリペプチド。
8. 請求項１、３〜６いずれか記載のＢＨ４融合ポリペプチドをコードしてなるＤＮＡ。
9. 請求項１〜７いずれか記載のＢＨ４融合ポリペプチドを含有してなるアポトーシス抑制剤。

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