DE60030587T2

DE60030587T2 - Mit bh4 fusionierte polypeptide

Info

Publication number: DE60030587T2
Application number: DE60030587T
Authority: DE
Inventors: Shigeomi Osaka-shi SHIMIZU; Yoshihide Toyonaka-shi TSUJIMOTO
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 2000-12-26
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-12-27
Also published as: ATE338770T1; EP1243595A1; DE60030587D1; US20030152946A1; EP1243595B1; EP1243595A4; JP3906078B2; WO2001048014A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein BH4-Fusionspolypeptid, das in der Lage ist, die Apoptose zu hemmen, und seine Verwendung, einen Apoptose-Inhibitor und Verwendungen zur Behandlung ischämischer Erkrankungen. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung ein BH4-Fusionspolypeptid, das eine Einbauaktivität in eine Zelle besitzt und in der Lage ist, die Apoptose zu hemmen, und seine Verwendung, einen Apoptose-Inhibitor, der das Fusionspolypeptid umfasst, und Verwendungen zur Behandlung ischämischer Erkrankungen. Das BH4-Fusionspolypeptid ist als therapeutisches Mittel zur Behandlung von AIDS, neurodegenerativen Erkrankungen, Osteomyelodysplasie, ischämischen Erkrankungen, infektiösem multiplem Organversagen, fulminanter Hepatitis, ischämischen Reperfusionsstörungen, Diabetes und ähnlichem nützlich.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Der Zelltod spielt in vivo eine wichtige Rolle bei der Dynamik von Zellen wie z. B. der Zellen der Organe und Gewebe. Viele Zelltode erfolgen durch Apoptose und der Mechanismus der Apoptose wird in der Regel streng kontrolliert. Die vorstehend erwähnte Apoptose kann auch durch pathologische Faktoren verursacht werden.
Vor kurzem ist eine große Zahl an Molekülen identifiziert worden, die mit der Apoptose assoziiert sind, und die apoptotischen Signalübertragungsmechanismen sind untersucht worden. So ist zum Beispiel gezeigt worden, dass die Proteine Bcl-2 und Bcl-x_L die apoptotische Signalübertragung stromauf der Caspase, einer Protease, die für die Induktion der Apoptose essentiell ist, in einer hemmenden Weise regulieren und dass die Caspase-Familie als Vermittler des Signals wirkt.
Das Bcl-2-Protein hemmt die Apoptose durch die Hemmung des Verlusts des mitochondriellen Membranpotentials (ΔΨ), der Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien und der Freisetzung des Apoptose-induzierenden Faktors (der hierin nachstehend als „AIF" bezeichnet wird). Das vorstehend erwähnte Bcl-2-Protein ist das Produkt des bcl-2-Gens, das durch Tsujimoto et al. [Tsujimoto, Y. et al., Science 228: 1440–1443 (1985)] als eines der Onkogene gefunden wurde.
Vor kurzem wurde vorgeschlagen, dass 1) die Bcl-2-Proteinfamilie einen spannungsabhängigen Anionenkanal (VDAC) direkt anzielt, um die apoptotische Freisetzung von Cytochrom c zu regulieren; 2) die pro-apoptotischen Faktoren wie z. B. Bax und Bak die Aktivität des VDAC stimulieren, um den Durchtritt von Cytochrom c zu ermöglichen, wohingegen anti-apoptotische Faktoren den VDAC hemmen; und 3) der VDAC erforderlich ist, damit ein apoptotischer Verlust des ΔΨ stattfinden kann. Der vorstehend erwähnte VDAC, der in der äußeren Mitochondrienmembran in großen Mengen vorliegt, besitzt eine Funktion bei der Regulierung der mitochondriellen Membrandurchlässigkeit und bildet zusammen mit dem Adenin-Nucleotid-Translokator (ANT) und einem anderen Molekül eine Durchlässigkeits-Übergangs-Pore.
Wie vorstehend beschrieben, wurden verschiedene Beteiligungen der Bcl-2-Proteinfamilie an der Hemmung der Freisetzung von Cytochrom c, des Verlusts des ΔΨ oder ähnlichem vorgeschlagen. Gegenwärtig gibt es jedoch noch viele ungeklärte Punkte über den genauen Wirkungsmechanismus.
Wenn man ein intaktes Bcl-2-Protein verwendet, gibt es darüber hinaus einen Defekt, der darin besteht, dass das Protein sich vergrößert und dazu tendiert, degradiert zu werden, und die Effizienz bei der Herstellung ist in einigen Fällen vermindert.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines BH4-Fusionspolypeptids, das in der Lage ist, die Apoptose zu hemmen, und seine Verwendung als ein Apoptose-Inhibitor sowie Verwendungen zur Behandlung ischämischer Erkrankungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft:

[1] ein Bcl-2-Homologie-4-Domäne-(BH4) Fusionspolypeptid, bestehend aus: einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder einer davon abgeleiteten Sequenz, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann; und einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
(A) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 der SEQ ID NO: 29; und
(B) einer Aminosäuresequenz mit Substitution, Deletion oder Insertion eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 der SEQ ID NO: 29, wobei das BH4-Fusionspolypeptid die Apoptose hemmen kann.
[2] eine DNA, die das BH4-Fusionspolypeptid nach Punkt [1] vorstehend codiert;
[3] einen Apoptose-Inhibitor, der das BH4-Fusionspolypeptid nach Punkt [1] vorstehend umfasst;
[4] die Verwendung des Apoptose-Inhibitors nach Punkt [3] für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer ischämischen Erkrankung, die durch die Verabreichung der Krankheit charakterisiert ist, wobei die Apoptose gehemmt wird, wodurch die ischämische Erkrankung behandelt wird; und
[5] die Verwendung des BH4-Polypeptids nach Punkt [1] vorstehend für die Herstellung eines vorbeugenden oder eines therapeutischen Mittels für eine ischämische Erkrankung.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Wirkung einer transienten Expression von Bcl-x_L und Δ21 auf die durch VP16 induzierte Apoptose zeigt. HeLa-Zellen wurden mit einem Bcl-x_L exprimierenden Konstrukt (O), einem Δ21 exprimierenden Konstrukt
der mit dem Vektor alleine (☐) sowie mit 0,1 μg eines GFP-exprimierenden Konstrukts (zum Nachweis der mit DNA transfizierten Zellen) 24 Stunden transfiziert. Dann wurden die transfizierten Zellen 24 Stunden mit VP16 in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Anschließend wurden die behandelten Zellen mit Hoechst 33342 angefärbt. Der apoptotische Zelltod wurde als das Verhältnis GFP-positiver Zellen mit Kernfragmentierung zu der Gesamtanzahl der GFP-positiven Zellen bestimmt. Die gezeigten Daten stammen aus einem von drei unabhängigen Experimenten.
2 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse zur Bewertung der Sortierung von Bcl-x_L-exprimierenden HeLa-Zellen und Δ21-exprimierenden HeLa-Zellen zeigt, die durch Durchfluss-Cytometrie sortiert worden waren. HeLa-Zellen wurden mit dem Produkt für die Expression von Bcl-x_L, von Δ21 oder mit dem Vektor alleine zusammen mit einem DAF exprimierenden Plasmid 24 Stunden transfiziert. Als Nächstes wurden die Zellen mit dem anti-Mensch-DAF-Antikörper angefärbt, und die DAF-positiven Zellen wurden mittels Durchfluss-Cytometrie sortiert. Die Expression von DAF (die obere Abbildung) oder der Proteine Bcl-x_L und Δ21 (die untere Abbildung) durch die sortierten Zellen wurde mittels Durchfluss-Cytometrie untersucht. Die gepunkteten Linien zeigen die Ergebnisse für die Bcl-x_L exprimierenden Zellen und die durchgehenden Linien zeigen die Ergebnisse für die Δ21-exprimierenden Zellen. Schwarz gefärbte Bildbereiche stellen die Ergebnisse für nicht transfizierte Zellen dar. Die gezeigten Daten sind die repräsentativen Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten.
3 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Wirkungen von Bcl-x_L oder Δ21 auf die apoptotische Freisetzung von Cytochrom c zeigt. DAF-positive Zellen, die wie in 2 sortiert worden waren, wurden mit 200 μM VP16 über die angegebenen Zeiträume behandelt, einer biochemischen Zellfraktionierung und dann einer Western-Blot-Analyse unterworfen, um die Freisetzung von Cytochrom c zu bestimmen. Die gezeigten Daten stammen aus einem von drei unabhängigen Experimenten.
4 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Rolle der BH4-Domäne von Bcl-x_L bei der Hemmung des durch Ca²⁺ induzierten Verlusts des ΔΨ und der Freisetzung von Cytochrom c aus isolierten Mitochondrien zeigt. (A) zeigt die Ergebnisse, die durch die Behandlung von Rattenleber-Mitochondrien (1 mg/ml) mit rBcl-x_L, rΔ21 oder einem Scheinprotein (20 μg/ml) zusammen mit 40 μM Ca²⁺ und die Untersuchung des ΔΨ mit Rh123 erhalten wurden. Die (B) zeigt die Ergebnisse einer Bewertung der Cytochrom c-Spiegel in den Überstands-(ÜS) und in den Mitochondrien-(Sed) Fraktionen 15 Minuten nach der Inkubation. Die gezeigten Daten stammen aus einem von drei unabhängigen Experimenten. „Gesamt" zeigt die Gesamtmenge der Cytochrom c-Freisetzung durch 1% Triton-X100 an.
5 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der direkten Wechselwirkung zwischen dem VDAC und Bcl-x_L oder Δ21 zeigt. Der gereinigte VDAC aus Rattenleber (20 μg/ml) wurde mit dem rBcl-x_L-Protein (20 μg/ml) oder mit dem rΔ21-Protein (20 μg/ml) inkubiert. Jede Probe wurde mit dem anti-Bcl-x_L-Antikörper L19 (α-Bcl-x_L) und mit normalem Kaninchen-IgG(IgG) immunpräzipitiert. Anschließend wurden die immunpräzipitierten Produkte durch eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-VDAC-Antikörpers untersucht. „Gesamt" zeigt die Gesamtmenge des verwendeten VDAC an.
6 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Saccharoseaufnahme durch VDAC-Liposomen zeigt. Entsprechend dem vorangegangen Bereicht von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] wurden VDAC-freie Liposomen, VDAC-Liposomen oder hitzedenaturierte VDAC-Liposomen (erhitzte VDAC-Liposomen) mit 50 mM Saccharose inkubiert. Das Anschwellen der Liposomen wurde durch die Abnahme der Lichtstreuung unter Verwendung eines Spektralphotometers bei der Wellenlänge 520 nm kontinuierlich aufgezeichnet.
7 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Wirkungen von Δ21 auf die Hemmung der VDAC-Aktivität zeigt. In der linken Abbildung wurden die VDAC-Liposomen mit 50 mM Saccharose zusammen mit 20 g/ml rBcl-x_L, rΔ21 oder einem Scheinprotein inkubiert. Die Lichtstreuung wurde auf die gleiche Weise wie in 6 aufgezeichnet. Die rechte Abbildung zeigt die Ergebnisse einer Bewertung der Wirkung der Proteinkonzentration auf die Hemmung der VDAC-Aktivität durch Δ21. VDAC-Liposomen mit den angegebenen Konzentrationen wurden mit 50 mM Saccharose zusammen mit rBcl-x_L (gefüllte Säulen) oder mit rΔ21 (offene Säulen) inkubiert. Die Unterschiede in der Lichtstreuung, die zur Startzeit (Zeitpunkt 0) und nach 10 Minuten nachgewiesen wurden (Δ Lichtstreuung), sind angegeben.
8 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Wirkung von Bcl-x_L auf die Aufnahme von ¹⁴C-Saccharose in VDAC-Liposomen zeigt. Entsprechend dem vorangegangen Bereicht von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] wurden VDAC-freie Liposomen, hitzedenaturierte VDAC-Liposomen (erhitzt) oder VDAC-Liposomen 10 Minuten mit ¹⁴C-Saccharose (2 μCi) in Gegenwart oder bei Abwesenheit von 20 μg/ml rBcl-x_L oder Δ21 inkubiert. Nach einer Zentrifugation und Filtration wurden die Liposomen gesammelt und in 2% SDS gelöst. Anschließend wurde die Menge an radioaktiver ¹⁴C-Saccharose in den Liposomen gezählt.
9 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Hemmung der VDAC-Aktivität durch das BH4-Polypeptid zeigt. VDAC-Liposomen wurden mit 50 mM Saccharose zusammen mit dem Bcl-x_L-BH4-Polypeptid in den angegebenen Konzentrationen inkubiert und die Lichtstreuung wurde gemessen.
10 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bestimmung der Hemmung der VDAC-Aktivität durch verschiedene BH4-Polypeptide zeigt. VDAC-Liposomen wurden mit Saccharose zusammen mit 20 μg/ml Bcl-2-BH4-Polypeptid, Bcl-x_L-BH4-Polypeptid oder eines mutmaßlichen BH4-Polypeptid aus Baks inkubiert, und dann wurde die Lichtstreuung gemessen.
11 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bestimmung der Hemmung der durch Bax induzierten Steigerung der VDAC-Aktivität durch das Bcl-x_L-BH4-Polypeptid zeigt. VDAC-Liposomen wurden mit 50 mM Saccharose in Gegenwart oder bei Abwesenheit von 5 μg/ml rBax und/oder dem Bcl-x_L-BH4-Polypeptid in den angegebenen Konzentrationen inkubiert, und die Lichtstreuung wurde gemessen. Die Unterschiede in der Lichtstreuung, die zur Startzeit (Zeitpunkt 0) und nach 10 Minuten nachgewiesen wurden (Δ Lichtstreuung), sind angegeben.
12 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bestimmung der Wechselwirkung zwischen dem N-terminalen oder dem C-terminalen Bcl-x_L-Fragment und VDAC zeigt. Mitochondrien (1 mg/ml) wurden 5 Minuten mit dem N-terminalen (Aminosäure-Nrn.: 2–19) Bcl-x_L-Polypeptid (20 μg/ml) oder dem C-terminalen (Aminosäure-Nrn.: 193–212) Bcl-x_L-Polypeptid (20 μg/ml) inkubiert. Das Mitochondrienlysat wurde mit dem anti-Bcl-x_L-Antikörper (S18) (α-NBcl-x_L, ein Antikörper gegen die Aminosäure-Nrn. 2–19) oder mit dem L19-Antikörper (α-CBcl-x_L, ein Antikörper gegen die Aminosäure-Nrn.: 193–212) immunpräzipitiert. Normales Kaninchen-IgG (IgG) wurde als Kontrolle verwendet. Die immunpräzipitierten Produkte wurden mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-VDAC-Antikörpers analysiert.
13 zeigt die Aminosäuresequenzen der mutierten Bcl-x_L-BH4-Polypeptide. In der Figur sind die ausgetauschten Reste durch Buchstaben mit einem geschwärzten Hintergrund angezeigt.
14 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der Fähigkeit der mutierten BH4-Polypetide, die VDAC-Aktivität zu hemmen. VDAC-Liposomen wurden mit 20 μg/ml Bcl-x_L-BH4-Polypeptid oder angegebenen mutierten Polypeptiden zusammen mit 50 mM Saccharose inkubiert, und die Lichtstreuung wurde gemessen. Die linke Abbildung zeigt die Ergebnisse der kontinuierlich aufgezeichneten Lichtstreuung. Die rechte Abbildung zeigt die Unterschiede zwischen der Lichtstreuung, die zum Startzeitpunkt (Zeit 0) und nach 10 Minuten nachgewiesen wurden (Δ Lichtstreuung).
15 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bestimmung der Hemmung des durch Ca²⁺ induzierten Verlusts des ΔΨ der Mitochondrien durch das BH4-Polypeptid zeigt. Die linke Abbildung zeigt die Ergebnisse, die durch eine Inkubation isolierter Mitochondrien (1 mg/ml) mit 20 μg/ml des Bcl-x_L-BH4-Polypeptids in Gegenwart von 40 μM Ca²⁺ und eine anschließende kontinuierliche Aufzeichnung der Intensität von Rhodamin 123 erhalten wurden. Die rechte Abbildung zeigt die Ergebnisse, die durch Inkubation isolierter Mitochondrien (1 mg/ml) mit 20 μg/ml des Bcl-x_L-BH4-Polypeptids oder verschiedenen mutierten Polypeptiden in Gegenwart von 40 μM Ca²⁺ über 15 Minuten und anschließende Messung des ΔΨ unter Verwendung der Rhodamin 123-Intensität erhalten wurden.
16 ist ein Diagramm, das repräsentative Beispiele von HeLa-Zellen zeigt, die mit VP16 in Gegenwart oder bei Abwesenheit des TAT-BH4-Polypeptids behandelt worden waren. HeLa-Zellen wurden mit 200 μM VP16 über die angegebenen Zeiträume in Gegenwart des TAT-BH4-Polypeptids mit den angegebenen Konzentrationen behandelt. Dann wurde die Morphologie der Zellen (die obere Reihe) und die Akkumulation des Polypeptids in den Zellen (die untere Reihe) durch ein Lichtphasenkontrast-Mikroskop beziehungsweise ein Fluoreszenz-Mikroskop beobachtet.
17 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bestimmung der Wirkung des TAT-BH4-Polypeptids auf die durch VP16 induzierte Apoptose zeigt. Die Zellen wurden 24 Stunden mit VP16 in den angegebenen Konzentrationen in Gegenwart von 100 μg/ml des TAT-BH4-Polypetids (☐) oder des TAT-Polypeptids (O) oder bei Abwesenheit des Polypeptids
behandelt und dann mit Hoechst 33342 angefärbt. Der apoptotische Zelltod wurde durch die Morphologie der Kerne unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops bestimmt. Die gezeigten Daten stammen aus einem von drei unabhängigen Experimenten.
18 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Bewertung der Dosisabhängigen Hemmung der durch VP16 induzierten Apoptose durch das TAT-BH4-Polypeptid zeigt. HeLa-Zellen wurden 24 Stunden mit 200 μM VP16 in Gegenwart des TAT-BH4-Polypeptids (⎕) oder des TAT-Polypeptids (O) bei den angegebenen Konzentrationen behandelt. Der apoptotische Zelltod wurde auf die gleiche Weise wie in 17 bestimmt.
BESTES VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Eines der signifikanten Merkmale des BH4-Fusionspolypeptids der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das BH4-Fusionspolypeptid aus Folgendem besteht:
einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder einer davon abgeleiteten Sequenz, das die Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigt; und
einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(A) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 der SEQ ID NO: 29; und
(B) einer Aminosäuresequenz mit Substitution, Deletion oder Insertion eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 der SEQ ID NO: 29,

Da das BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung eine minimale Einheit für die Hemmung der Apoptose umfasst, nämlich eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt wurde aus der Gruppe, bestehend aus:

Da weiterhin das BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen, oder eine davon abgeleitete Sequenz umfasst, kann das BH4-Fusionspolypeptid herausragende Wirkungen zeigen, wie z.B. dass das BH4-Fusionspolypeptid effizienter in die Zelle eingebaut werden kann, so dass das Polypeptid die Apoptose wirksam hemmen kann.
Der Begriff „Apoptose", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Art des Zelltodes, welche durch Veränderungen charakterisiert ist, die durch die Kondensierung oder die Fragmentierung des Kerns der Zelle, durch Kondensierung oder Fragmentierung der Zelle selbst und durch die Fragmentierung der chromosomalen DNA der Zelle in Nucleosomen-Einheiten (etwa 180 Bp) repräsentiert wird, und sie umfasst diejenigen Ereignisse, die durch pathologische Faktoren und durch physiologische Faktoren verursacht werden (zum Beispiel durch das Auftreten von physiologischen Ereignissen wie z.B. Immunisierung, Hormone oder Entwicklung).
Der Begriff „anti-apoptotische Bcl-2-Proteinfamilie" bedeutet das Bcl-2-Protein und diejenigen unter den Proteinen, die ähnlich dem Bcl-2-Protein sind und eine Apoptose hemmende Wirkung besitzen. Eine Aktivität, die die Apoptose hemmt, wird hierin als „anti-apoptotische Aktivität" bezeichnet, und eine Aktivität, die die Apoptose fördert, wird als „pro-apoptotische" Aktivität bezeichnet.
Die Hemmung und die Förderung der Apoptose können zum Beispiel durch das folgende Verfahren bewertet werten, ohne dass man darauf beschränkt ist. Das Verfahren umfasst die Behandlung von Zellen mit VP16 über 24 Stunden, die anschließende Anfärbung der Zellen mit 1 μM Hoechst 33342 und dann die Berechnung des Ausmaßes der Apoptose als das Verhältnis der Zellen, die eine Kernfragmentierung aufweisen, zu der Gesamtanzahl der Zellen.
Darüber hinaus kann die anti-apoptotische Aktivität durch die Verminderung des mitochondriellen ΔΨ und durch die Hemmung der Cytochrom c-Freisetzung bewertet werden.
Das ΔΨ kann durch die Bestimmung der Aufnahme von Rhodamin 123 (Rh123) bewertet werden, wie es kürzlich zum Beispiel in Shimizu et al. [Oncogene 13, 21–29 (1996)] beschrieben wurde.
Die Freisetzung von Cytochrom c kann bestimmt werden durch die Präparation von Mitochondrien, die Zentrifugation der Mitochondrien, um das Mitochondrien-Sediment und den Überstand zu erhalten, die Resuspendierung des so erhaltenen Sediments in RIPA-Puffer und das Unterwerfen der so erhaltenen Mitochondrien-Suspension und des Überstandes einer Western-Blot-Analyse mit einem anti-Cytochrom c-Antikörper.
Die vorstehend erwähnten anti-apoptotischen Proteine der Bcl-2-Familie besitzen Sequenzhomologien in den Bcl-2-Homologie -(BH)1-, -BH2-, -BH3- und -BH4-Domänen. Die vorstehend erwähnten BH1- und BH2-Domänen und vermutlich auch die BH3-Domäne sind für die Dimerisierung mit irgendeinem der Proteine entscheidend, die zu der pro-apoptotischen Faktor-Proteinfamilie gehören, wie durch eine Mutations-Strukturanalyse bestimmt wurde, wobei man annimmt, dass durch sie die pro-apoptotische Aktivität gehemmt wird.
Die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 ist die Sequenz einer BH4-Domäne, die üblicherweise nur unter den Proteinen konserviert ist, die zu der antiapoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie gehören. Von der BH4-Domäne nimmt man an, dass eine α-Helix für die Wirkung der Hemmung der Apoptose durch ein Polypeptid, welches die BH4-Domäne enthält, entscheidend ist, und dass besonders gut konservierte Aminosäurereste (Aminosäure-Nrn. 8 und 9 in der SEQ ID NO: 1) eine wichtige Rolle bei der Bildung der α-Helix-Struktur spielen. Weiterhin wird abgeleitet, dass die Aminosäurereste mit den Aminosäure-Nrn. 5, 6, 9, 10 und 14 der SEQ ID NO: 1 auf der bindenden Oberfläche der α-Helix der vorstehend erwähnten BH4-Domäne an ein anderes Protein angeordnet sind.
Daher kann die BH4-Domäne der vorstehend erwähnten anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie eine Aminosäuresequenz umfassen, die einen Austausch, eine Deletion oder eine Insertion eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 der SEQ ID NO: 29 enthält. Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die die Mutation umfasst, ist ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine anti-apoptotische Aktivität zu zeigen. Die vorstehend erwähnte anti-apoptotische Aktivität kann durch die Bestimmung der Verminderung des mitochondriellen ΔΨ und der Hemmung der Cytochrom c-Freisetzung gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Hierin kann eine „Aminosäuresequenz, die einen Austausch, eine Deletion oder eine Insertion mindestens eines Aminosäurerests besitzt", entsprechend der gewünschten Sequenz willkürlich hergestellt werden, wenn ein Peptid durch ein bekanntes Verfahren synthetisiert wird.
Die BH4-Domäne eines anti-apoptotischen Proteins der Bcl-2-Familie kann eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens 50%, bevorzugt 70% oder mehr und noch bevorzugter 90% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, solange die BH4-Domäne eine Sequenz aufweist, in der die Aminosäure-Nrn. 5, 6, 8, 9, 10 und 14 der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 konserviert sind.
Das vorstehende Polypeptid, welches die Sequenzidentität aufweist, ist ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine anti-apoptotische Aktivität zu zeigen. Die vorstehend erwähnte anti-apoptotische Aktivität kann durch die Bestimmung der Verminderung des mitochondriellen ΔΨ und der Hemmung der Cytochrom c-Freisetzung gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Der Begriff „Sequenzidentität", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Identität von Aminosäureresten zwischen zwei Aminosäuresequenzen, nämlich zwischen der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 und einer Aminosäuresequenz, die mit ihr verglichen wird. Die vorstehend erwähnte „Sequenzidentität" kann durch einen Vergleich der beiden Aminosäuresequenzen bestimmt werden, die in der Region der Aminosäuresequenzen, die miteinander verglichen werden sollen, optimal zueinander ausgerichtet sind. Hierbei kann die Aminosäuresequenz, die verglichen werden soll, eine Hinzufügung oder eine Deletion (zum Beispiel eine Lücke, einen Überhang oder ähnliches) im Vergleich zu der Aminosäuresequenz enthalten, die hierin unter der SEQ ID NO: 1 angegeben ist.
Der nummerische Wert (Prozentsatz) der Sequenzidentität kann berechnet werden, indem die identischen Aminosäurereste bestimmt werden, die in beiden Sequenzen vorhanden sind, um die Zahl der übereinstimmenden Stellen zu bestimmen, und anschließend, indem die vorstehend erwähnte Zahl an übereinstimmenden Stellen durch die Gesamtanzahl der Aminosäurereste dividiert wird, die in der Region der Sequenz, die verglichen werden soll, vorhanden sind, und indem der so erhaltene nummerische Wert mit 100 multipliziert wird. Ein Algorithmus, der dazu dient, die optimale Ausrichtung und Homologie zu erhalten, ist zum Beispiel BLAST oder ähnliches. Konkret können die optimale Ausrichtung und die Homologie durch die Gen-Analyse-Software GENETYX-SV/RG, Version 4.01 (hergestellt durch Software Development) und durch das Gen-Analyse-Programm BLAST [Internet-Adresse: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; Referenz: Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990), Altschul, S.F. et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)] oder ähnliche erhalten werden.
Darüber hinaus kann die BH4-Domäne eines anti-apoptotischen Proteins der Bcl-2-Famile eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens 50%, bevorzugt 70% oder mehr und noch bevorzugter 90% oder mehr Homologie zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, solange das Polypeptid, das die Domäne enthält, eine anti-apoptotische Aktivität zeigt, d. h. die Verminderung des mitochondriellen ΔΨ und die Hemmung der Cytochrom c-Freisetzung, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Hierbei kann die BH4-Domäne des vorstehend erwähnten anti-apoptotischen Proteins der Bcl-2-Familie eine Aminosäuresequenz besitzen, die einen konservativen Austausch enthält. Der vorstehend erwähnte „konservative Austausch" umfasst einen Austausch mit einer Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften (d. h. Hydrophobe, elektrische Ladung, pK-Wert, Eigenschaften der dreidimensionalen Struktur) besitzt; sowie den Austausch mit einer Aminosäure, der beliebige Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur und der Faltungsstruktur des Polypeptids nur bis zu dem Ausmaß verursacht, bei dem die physiologische Aktivität, die dem Polypeptid eigen ist, beibehalten wird. Ein konservativer Austausch umfasst zum Beispiel die Folgenden: Austausche innerhalb der Gruppen 1) Glycin und Alanin; 2) Valin, Isoleucin und Leucin; 3) Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin und Glutamin; 4) Serin und Threonin; 5) Lysin und Arginin oder 6) Phenylalanin und Tyrosin.
Konkrete Bespiele für die BH4-Domäne umfassen (a) die Bcl-2-BH4-Domäne (SEQ ID NO: 2), (b) die Bcl-x_L-BH4-Domäne (SEQ ID NO: 3), (c) die Bcl-w-BH4-Domäne (SEQ ID NO: 4), (d) die C. elegans-Ced-9-BH4-Domäne und ähnliche. In der vorliegenden Erfindung werden die Bcl-2-BH4-Domäne (SEQ ID NO: 2) und die Bcl-x_L-BH4-Domäne (SEQ ID NO: 3) bevorzugt. Darüber hinaus kann es sich bei der BH4-Domäne um eine Aminosäuresequenz handeln, die einen Austausch, eine Deletion oder eine Insertion eines Aminosäurerests in einer beliebigen der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen (a) bis (d) aufweist. Es werden ebenfalls BH4-Domänen beschrieben, die eine Aminosäuresequenz besitzen, die mindestens 50%, bevorzugt 70% oder mehr und noch bevorzugter 90% oder mehr Sequenzidentität zu einer der vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenzen (a) bis (d) aufweisen, solange die Domäne die Verminderung des mitochondriellen ΔΨ und die Hemmung der Cytochrom c-Freisetzung zeigt, die gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
Das Polypeptid, das in dem BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung verwendet wird und das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen, umfasst zum Beispiel TAT aus dem menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV), p27 aus HTLV-1, art/trs aus HIV, VP22 aus HSV-1, Antp aus Drosophila und ähnliche.
Die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen, umfasst zum Beispiel:

(i) eine Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 49 bis 57 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5;
(ii) eine Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 13 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24;
(iii) eine Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 16 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 25;
(iv) eine Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 301 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 26;
(v) eine Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 16 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 27;

Die vorstehend erwähnte „abgeleitete Sequenz der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen", umfasst zum Beispiel:

(I) eine Aminosäuresequenz, die eine chemisch modifizierte Gruppe mindestens eines Rests der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenz des Polypeptids besitzt, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen, oder
(II) eine Aminosäuresequenz, die einen Austausch oder eine Insertion mindestens eines Aminosäurerests der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenz des Polypeptids besitzt, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen,

Die Aufnahmeaktivität in eine Zelle kann mit einem Mikroskop durch die immunologische Anfärbung mit einem Antikörper gegen das Peptid oder durch die Einbringung einer Fluoreszenzmarkierung an das Peptid untersucht werden.
Die chemisch modifizierte Gruppe umfasst funktionelle Gruppen, die Fluoreszenz zeigen, funktionelle Gruppen, die nicht an der Bildung der dreidimensionalen Struktur des Polypeptids beteiligt sind, und ähnliche, solange die Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die einen chemisch modifizierten Aminosäurerest besitzt, in der Lage sind, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen. Der Begriff „chemisch modifizierte Gruppe", auf den hierin Bezug genommen wird, kann einen anderen Aminosäurerest beinhalten (zum Beispiel β-Alanin oder einen ähnlichen Rest), als die Aminosäurereste, die ein natürlich vorkommendes „Polypeptid", „das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen", bilden.
Die funktionellen Gruppen, die Fluoreszenz zeigen, umfassen Eosin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und ähnliche.
Die funktionellen Gruppen, die nicht an der Bildung der dreidimensionalen Struktur des Polypeptids beteiligt sind, umfassen Spacer-Gruppen, wie sie durch einen β-Alaninrest oder ähnliches repräsentiert werden. Es wird bevorzugt, dass die funktionelle Gruppe an dem Terminus vorliegt, an dem das „Polypeptid, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen", mit der „BH4-Domäne eines anti-apoptotischen Proteins der Bcl-2-Familie" fusioniert ist. Durch die Einführung der funktionellen Gruppe können jedes „Polypeptid, das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in eine Zelle zu zeigen", und die „BH4-Domäne eines antiapoptotischen Proteins der Bcl-2-Familie" jeweils ihre ihnen eigenen dreidimensionalen Strukturen beibehalten, so dass sie ihre Funktionen in ausreichender Weise ausüben können.
Es wird bevorzugt, dass es sich bei dem BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung um ein Polypeptid handelt, das aus einer Aminosäuresequenz der Region besteht, die aus mindestens den Aminosäurenummern 49 bis 57 (SEQ ID NO: 6) der TAT-Sequenz (SEQ ID NO: 5) des menschlichen Immunschwächevirus und (a) der Sequenz der BH4-Domäne (SEQ ID NO: 2) des Bcl-2-Proteins, (b) der Aminosäuresequenz der BH4-Domäne (SEQ ID NO: 3) des Bcl-x_L-Proteins, (c) der Aminosäuresequenz der BH4-Domäne (SEQ ID NO: 4) des Bcl-w-Proteins oder (d) einer BH4-Domäne des Ced-9 aus C. elegans, besteht.
Es wird bevorzugt, dass es sich bei dem BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung konkret um ein Polypeptid handelt, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt wurde aus der Gruppe, bestehend aus den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 7, 8, 28, 29, 30, 31, 32 und 33.
Das Cys-(TAT)-β-Ala-BH4-Peptid, das ein BH4-Fusionspeptid der vorliegenden Erfindung darstellt, kann mittels des Fmoc-Verfahrens unter Verwendung von mit Fmoc verknüpften Amid-Harzen in dem automatisierten ABI-433A-Synthesegerät synthetisiert werden. Das so erhaltene geschützte Peptidharz wird mit einem Reagenz behandelt, das Trifluoressigsäure enthält, und das freie Peptid wird dann durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Als Nächstes wird in DMF gelöstes Eosin-5-jodacetamid mit dem vorstehend erwähnten gereinigten Peptid, das in 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,7) gelöst wurde, vermischt, und man lässt das Gemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur reagieren. Nach der Reaktion wird das Peptid erneut durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und als ein einziger Peak gesammelt. Das Molekulargewicht der gereinigten Probe wird durch MALDI-TOF-MS bestimmt.
Vom dem BH4-Fusionspolypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann, zum Beispiel als ein die Apoptose hemmendes Mittel in HeLa-Zellen, erwartet werden, dass es einen Hemmanteil von mindestens 50%, bevorzugt von 70% oder mehr und noch bevorzugter von 90% oder mehr im Vergleich zu dem Zustand der Abwesenheit des BH4-Fusionspolypeptids aufweist.
Da das BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung eine antiapoptotische Aktivität zeigt, kann das BH4-Fusionspolypeptid als aktiver Bestandteil in einem Apoptose-Inhibitor verwendet werden. Der Apoptose-Inhibitor ist in der vorliegenden Erfindung ebenfalls mit eingeschlossen.
Eine der Eigenschaften des Apoptose-Inhibitors der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Apoptose-Inhibitor das vorstehend erwähnte BH4-Fusionpolypeptid umfasst.
Da der Apoptose-Inhibitor der vorliegenden Erfindung das BH4-Fusionpolypeptid enthält, welches eine anti-apoptotische Aktivität aufweist, können therapeutische Wirkungen bei AIDS, neurodegenerativen Störungen (wie z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe laterale Sklerose, Retinitis pigmentosa oder cerebelläre Degeneration), Osteomyelodysplasie (aplastische Anämie und dergleichen), ischämischen Erkrankungen (Myokardinfarkt, Hirninfarkt, apoplektischer Schlaganfall, ischämische Reperfusionserkrankungen und dergleichen), fulminanter Hepatitis, Leberversagen, das durch Sucht wie z.B. Alkoholismus verursacht wird, infektiösem multiplen Organversagen, Diabetes und ähnlichem erwartet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verwendungen, in denen der vorstehend erwähnte Apoptose-Inhibitor einem Patienten mit den vorstehend erwähnten Erkrankungen verabreicht wird, um die Apoptose zu hemmen, wodurch diese Erkrankungen behandelt werden. Die Behandlung ist vor allem für die Behandlung von ischämischen Erkrankungen, insbesondere des Myokardinfakts und des Hirninfarkts, besonders aber des Myokardinfarkts geeignet. Alternativ kann durch Zugabe des Apoptose-Inhibitors zu einer Stammlösung für die Konservierung eines Organs, das für eine Implantation verwendet werden soll, das Organ in einem stärker bevorzugten Zustand bis zur Implantation aufbewahrt werden.
Der Apoptose-Inhibitor der vorliegenden Erfindung kann das BH4-Fusionpolypeptid in einer beliebig modifizierten Form umfassen, so dass die Aufnahme des vorstehend erwähnten BH4-Fusionpolypeptids in eine bestimmte Zelle erleichtert wird. Darüber hinaus kann der Apoptose-Inhibitor der vorliegenden Erfindung verschiedene Hilfsmittel enthalten, die gewöhnlich innerhalb eines solchen Bereichs verwendet werden, dass die anti-apoptotische Aktivität ausgeübt werden kann.
Wenn der Apoptose-Inhibitor verabreicht wird, können die Form der Verabreichung, das Verfahren der Verabreichung und die Dosis in geeigneter Weise eingestellt werden, die von dem Alter, dem Gewicht und dem Zustand eines Individuums, an das die Verabreichung erfolgen soll, abhängt.
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Verwendung des BH4-Fusionspolypeptids für die Herstellung eines vorbeugenden oder eines therapeutischen Mittels für die vorstehend erwähnten Erkrankungen, insbesondere die ischämischen Erkrankungen, besonders aber den Myokardinfarkt und den Hirninfarkt und insbesondere den Myokardinfarkt bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Hilfe von Beispielen und ähnlichem konkret beschrieben, ohne dass dabei beabsichtigt wird, den Rahmen der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
Reagenzien
Als ein monoclonaler anti-Tauben-Cytochrom c-Antikörper (7H8.2C12) der mit dem menschlichen Cytochrom c und dem Ratten-Cytochrom c kreuzreagiert, einer, der freundlicherweise von Dr. E. Margoliash (University of Illinois, Illinois) bereitgestellt wurde. Als ein monoclonaler anti-Mensch-VDAC-(Porin) Antikörper (31 HL), der mit dem Ratten-VDAC kreuzreagiert, einer, der von Calbiochem bezogen wurde. Als polyclonale anti-Mensch-Bcl-x_L-Antikörper [L19, der für die Region mit den Aminosäurenummern 193 bis 212 der menschlichen Bcl-x_L-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 10) spezifisch ist, und S18, der für die Region mit den Aminosäurenummern 2 bis 19 der Aminosäuresequenz spezifisch ist] diejenigen, die von Santa Cruz Biotechnology bezogen wurden. Es wurden Hydroxyapatit und Celit verwendet, die von Bio-Rad, beziehungsweise von Roth bezogen wurden. Als durch Diisopropylcarbodiimid/1-hydroxybenzotriazol aktivierte und durch Fmoc geschützte Aminosäuren wurden solche verwendet, die von Genzyme-Syena bezogen wurden.
Als andere Reagenzien und ähnliches wurden die von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. hergestellten Reagenzien verwendet, sofern nicht anders angegeben.
Referenz-Beispiel 1: DNA-Transfektion und Apoptose-Testansatz
Die mutierten menschlichen bcl-x_L-DNAs wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Pfu-DNA-Polymerase mit Kontrolllesefunktion (hergestellt durch Stratagene) mit einer aus menschlichen B-Zellen abgeleiteten cDNA-Genbank (hergestellt durch Clontech) als Matrize und den Oligonucleotiden der SEQ ID NO: 11 und der SEQ ID NO: 12 als Primer hergestellt. Die Sequenz der vorstehend erwähnten menschlichen mutierten bcl-x_L-DNA wird in der SEQ ID NO: 13 des Sequenzprotokolls gezeigt. Jedes der so erhaltenen amplifizierten Fragmente wurde in dem Expressionsvektor pUC-GAGGS [Shimizu et al., Oncogene 13, 21–29 (1996)] subcloniert.
Unter Verwendung von Lipofectamin wurden HeLa-Zellen, eine menschliche Cervixkarzinom-Zelllinie, 24 Stunden mit dem Expressionsplasmid (0,1 μg) für das menschliche Bcl-x_L oder einer Mutante davon zusammen mit dem Expressionskonstrukt pEGFP-N1 (hergestellt durch Clontech) des grünfluoreszierenden Proteins (hierin nachstehend als GFP bezeichnet) (0,1 μg) zur Überwachung der DNA-Transfektion transfiziert.
Die so erhaltenen transfizierten Zellen wurden 24 Stunden mit VP16 behandelt. Danach wurden die Zellen mit 1 μM Hoechst 33342 angefärbt und das Ausmaß der Apoptose wurde anschließend als Prozentsatz der GFP-positiven Zellen, die eine Kernfragmentierung aufwiesen, im Verhältnis zu allen positiven Zellen berechnet.
Darüber hinaus wurden im Falle der Expression des Zerfall-beschleunigenden Faktors (DAF, „decay-accelerating factor") die HeLa-Zellen 24 Stunden mit den Expressionsplasmiden (0,1 μg) für das menschliche Bcl-x_L oder eine davon abgeleitete Mutante zusammen mit 0,1 μg des DAF-Expressionskonstrukts (pUC-CAGGS-DAF) transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die so erhaltenen Zellen mit dem anti-Mensch-DAF-Antikörper und mit FITC konjugiertem anti-Maus-IgG 1 Stunde angefärbt. Danach wurden die DAF-positiven Zellen unter Verwendung eines Zell-Sortiergeräts [Handelsname: FACS-Vantage, hergestellt durch Becton-Dickinson] sortiert, und die Expression von DAF und Bcl-x_L wurde mit einem Durchfluss-Cytometer untersucht. Die, wie vorstehend beschrieben, sortierten DAF-positiven Zellen wurden 24 Stunden mit 200 μM VP16 behandelt. Danach wurden die Zellen 10 Minuten mit 10 μM Digitonin bei 37°C behandelt, und Überstand und Sediment wurden durch Zentrifugation getrennt. Die Menge an Cytochrom c wurde durch eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung des anti-Tauben-Cytochrom c-Antikörpers abgeschätzt.
Referenz-Beispiel 2: Messung der biochemischen Parameter der Mitochondrien (ΔΨ und Cytochrom c-Freisetzung)
Rattenleber-Mitochondrien (1 mg Protein/ml), die gemäß einer Veröffentlichung von Shimizu et al. [Oncogene 13, 2–29 (1996)] isoliert worden waren, wurden bei 25°C in einem Medium inkubiert, das 0,3 M Mannit, 10 mM HEPES/K⁺ (pH-Wert 7,4), 0,1% Fettsäure-freies BSA, 1 mM Kaliumphosphat, 40 μM CaCl₂ und 4,2 mM Succinat zur Energetisierung enthielt, dies erfolgte in Gegenwart oder bei Abwesenheit der rekombinanten Proteine.
ΔΨ wurde durch die Messung der Aufnahme von Rhodamin 123 (Rh123) untersucht, wie vorher durch Shimizu et al. [Oncogene 13, 21–29 (1996)] beschrieben wurde.
Die Freisetzung von Cytochrom c wurde durch die Zentrifugation der vorstehend erwähnten Mitochondrien, die Resuspendierung der so erhaltenen Sedimente in RIPA-Puffer, um eine Mitochondrien-Suspension zu erhalten, und das Unterwerfen der Mitochondrien-Suspension und des Überstandes einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-Cytochrom c-Antikörpern bestimmt.
Referenz-Beispiel 3: Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse
Der gereinigte VDAC (20 μg/ml) wurde mit rekombinantem Bcl-x_L (rBcl-x_L) und rekombinantem Δ21 (rΔ21) inkubiert, und das so erhaltene Gemisch wurde mit dem anti-Bcl-x_L-Antikörper (L19) und mit normalem Kaninchen-IgG immunpräzipitiert. Um Wechselwirkungen zwischen dem Polypeptid und dem VDAC nachzuweisen, wurden isolierte Mitochondrien (1 mg) mit 20 μg des N-terminalen Bcl-x_L-Polypeptids oder des C-terminalen Bcl-x_L-Polypeptids 5 Minuten inkubiert. Danach wurden die so erhaltenen Mitochondrien sedimentiert, gewaschen und in einem Lysepuffer (10 mM HEPES, pH 7,4; 142,5 mM KCl; 5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA und 0,5% NP40) in Gegenwart von Proteinase-Inhibitoren (0,1 mM p-APMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Chymostatin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Antipain, 1 μg/ml Pepstatin) suspendiert, worauf hin der Aufbruch durch Ultraschallbehandlung erfolgte. Die Immunpräzipitation wurde mit polyclonalen anti-Bcl-x_L-Antikörpern durchgeführt, die den verwendeten Polypeptiden entsprachen. Eine Co-Immunpräzipitation des VDAC wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung des anti-VDAC-Antikörpers nachgewiesen.
Referenz-Beispiel 4: Rekonstitution des VDAC in Liposomen
Der gereinigte VDAC wurde in kleinen unilamellären Vesikeln durch das Ultraschall-Einfrier-Auftau-Verfahren rekonstituiert, das in einer Veröffentlichung von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] beschrieben wurde. Die Saccharose-Aufnahme-Experimente wurden durch die Messung des Anschwellens der Liposomen durchgeführt.
Liposomen, die bei einem pH-Wert von 5,2 hergestellt worden waren, wurden bei 25°C in 1 ml Liposomen-Puffer zusammen mit rBcl-x_L, rΔ21, rBax oder einem Polypeptid 3 Minuten inkubiert. Hierbei waren saure pH-Wert-Bedingungen für eine effiziente Aufnahme von rBcl-x_L und rBax in die Liposomen erforderlich. Danach wurde dem Gemisch Saccharose bis zu einer Konzentration von 50 mM hinzu gegeben, und das Anschwellen der Liposomen wurde durch die Abnahme der Lichtstreuung bei einer Wellenlänge von 520 nm unter Verwendung eines Spektralphotometers (F-400, hergestellt durch Hitachi, Ltd.) gemessen. Die Saccharose-Aufnahme wurde ebenfalls durch die Aufnahme von ¹⁴C-Saccharose bewertet, wie sie in der Veröffentlichung von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] beschrieben wurde.
Beispiel 1: Reinigung des menschlichen Bcl-x_L und des menschlichen Bcl-x_L-Δ21-Proteins
Menschliches Bcl-x_L und Bcl-x_L-Δ21 (dem die N-terminalen 21 Aminosäurereste des Bcl-x_L fehlen) wurden als Glutathion-S-Transferase-(GST) Fusionsproteine in Escherichia coli, Stamm DH5α exprimiert, und die so erhaltenen Fusionsproteine wurden über eine Glutathion-Sepharose-Säule gereinigt. Als Nächstes wurden menschliches Bcl-x_L oder Bcl-x_L-Δ21 und GST durch Spaltung mit Thrombin voneinander getrennt. Zusätzlich wurde menschliches Bax entsprechend der Veröffentlichung von Narita et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14681–14686 (1988)] hergestellt. Die so erhaltenen, gereinigten Proteine wurden in einem Puffer gelöst [Zusammensetzung: 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit]. GST-Proteine, die von einem Vektor stammten, der keine Insertion enthielt, wurden hergestellt und als Scheinkontrollproteine verwendet. Der VDAC aus Rattenleber wurde gemäß einer Veröffentlichung von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] gereinigt. Der so erhaltene VDAC zeigt eine einzelne Bande bei der SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese.
Beispiel 2: Die Synthese von Polypeptiden
Die Polypeptide wurden mit dem Modell 396-Multiple Polypeptide-Synthesegerät [hergestellt durch Advanced Chemtech] unter Verwendung von durch Diisopropylcarbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol aktivierten und durch Fmoc geschützten Aminosäuren synthetisiert.
Die synthetisierten Polypeptide waren wie folgt:
Synthetisierte Polypeptide:

Menschliches Bcl-x_L-BH4 (Aminosäurenummern: 4 bis 23 des menschlichen Bcl-x_L):
SNRELVVDFLSYKLSQKGYS (SEQ ID NO: 3);
Mutanten des menschlichen Bcl-x_L-BH4 (Aminosäurenummern: 4 bis 23 des menschlichen Bcl-x_L-BH4), die in 14 gezeigt werden (SEQ ID NO: 14 bis 21); menschliches Bcl-2-BH4 (Aminosäurenummern: 7 bis 30 des menschlichen Bcl-2-BH4);
TGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEW (SEQ ID NO: 2); und menschliches Bak-BH4 (Aminosäurenummern: 27 bis 50 des menschlichen Bak-BH4):
VAQDTEEVFRSYVFYRHQQEQEAE (SEQ ID NO: 22).

Es wurde bestätigt, dass die Reinheit jedes der vorstehend erwähnten Polypeptide 95% gemäß der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Ionisierungs-Flugzeit-Massenspektroskopie (MALDI-TOF-MS) übertraf.
Das N-terminate (Aminosäurenummern: 2 bis 19) Polypeptid von Bcl-x_L und das C-terminale (Aminosäuren 193 bis 212) Polypeptid von Bcl-x_L wurden von Santa Cruz Biotechnology bezogen.
Es wurde ein Polypeptid [Eosin-C-RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 23)] synthetisiert, das aus der Einführung eines mit Eosin konjugierten Cysteinrestes in den N-Terminus des Polypeptids TAT-PTD, welches der Protein-Transduktionsdomäne (PTD) (Aminosäurenummern: 49 bis 57) des HIV-TAT (SEQ ID NO: 5) entspricht, erhalten wurde. Anschließend wurde das TAT-PTD-BH4-Polypeptid (TAT-BH4-Polypeptid) durch die Verknüpfung des mit Eosin konjugierten TAT-PTD-Polypeptids mit dem menschlichem Bcl-x_L-BH4-Polypeptid über einen β-Alaninrest hergestellt.
Es wurde bestätigt, dass das so erhaltene TAT-BH4-Polypeptid eine Reinheit von 90% oder mehr aufwies, und zwar durch Überwachung der von dem Protein (Absorption bei 280 nm) stammenden Fluoreszenz unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC.
Beispiel 3: Die Bedeutung der BH4-Domäne bei der Hemmung der apoptotischen mitochondriellen Veränderungen durch Bcl-x_L
Bcl-2/Bcl-x_L hemmt die Apoptose durch die Blockierung der apoptotischen Veränderungen in den Mitochondrien. Daher wurde bestimmt, ob die BH4-Domäne für Bcl-2/Bcl-x_L erforderlich ist, um die apoptotischen Veränderungen in den Mitochondrien zu hemmen oder nicht.
HeLa-Zellen wurden gemäß dem Referenz-Beispiel 1 mit DNA transfiziert, die Bcl-x_L oder seiner BH4-Deletionsmutante (Δ21, der die Aminosäurereste der Positionen 2 bis 21 von Bcl-x_L fehlen) entsprach, und es wurde ein Apoptose-Testansatz durchgeführt. Die HeLa-Zellen wurden mit einem Expressionskonstrukt für Bcl-x_L oder Δ21 oder mit einem leeren Vektor zusammen mit einem Expressionskonstrukt für DAF transient transfiziert. Die Expression von DAF an der Zelloberfläche wurde verwendet, um diejenigen Zellen zu identifizieren, die mit den vorstehend erwähnten DNAs transfiziert waren, und diese Zellen wurden dann unter Verwendung eines Durchfluss-Cytometers gesammelt.
Als Ergebnis, das in 1 gezeigt wird, wiesen die transfizierten Zellen, die Bcl-x_L exprimierten und die BH4-Domäne besaßen, Resistenz gegenüber der Induktion der Apoptose durch 100 μM oder 200 μM VP16 auf, wohingegen die transfizierten Zellen, die Δ21 exprimierten, dem die BH4-Domäne fehlte, und die Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert worden waren, keine Resistenz gegenüber der Induktion der Apoptose durch 100 μM VP16 zeigten.
Wie in 2 gezeigt, wurden darüber hinaus DAF-positive Zellen in einer Reinheit von über 93% erhalten. Darüber hinaus exprimierten beinahe alle der so erhaltenen DAF-positiven Zellen Bcl-x_L oder Δ21 in vergleichbaren Spiegeln.
Danach wurden die gesammelten Zellen mit VP16 behandelt, um die Apoptose zu induzieren, und es wurde die Freisetzung von Cytochrom c untersucht. Als Ergebnis, das in 3 gezeigt wird, hemmte die Überexpression von Bcl-x_L die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien nach der VP16-Behandlung, wohingegen die Überexpression von Δ21 die Cytochrom c-Freisetzung nicht hemmte, was zeigt, dass die BH4-Domäne erforderlich war, um die apoptotische Freisetzung von Cytochrom c zu hemmen. Ebenfalls mit diesen Ergebnissen in Übereinstimmung steht, wie in 4 gezeigt, dass, wenn isolierte Mitochondrien verwendet wurden, das rekombinante Bcl-x_L (rBcl-x_L) sowohl den durch Ca²+ induzierten Verlust des mitochondriellen ΔΨ als auch die Cytochrom c-Freisetzung hemmte, wohingegen rekombinantes Δ21 (rΔ21) praktisch keine hemmende Aktivität gegenüber dem Verlust des mitochondriellen ΔΨ oder der Freisetzung von Cytochrom c zeigte. Darüber hinaus wurden ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn die Mitochondrien anderen apoptotischen Reizen ausgesetzt wurden, wie z.B. Atractylosid oder Wasserstoffperoxid.
Beispiel 4: Rolle der BH4-Domäne bei der Regulation des VDAC
Es ist bekannt, dass Bcl-x_L direkt an den VDAC bindet und die Aktivität dieses Kanals hemmt, was zur Hemmung der apoptotischen Freisetzung von Cytochrom c und des Verlusts des ΔΨ führt. Darüber hinaus wurde eine Wechselwirkung zwischen Bcl-x_L und dem VDAC auch in den Zellen nachgewiesen, wie es in dem Bericht von Shimizu et al.. [Nature 399, 483–487 (1999)] beschrieben wurde. Daher wurde die funktionelle Rolle der BH4-Domäne bei der Regulation des VDAC untersucht.
Zuerst wurde eine Coimmunpräzipitations-Analyse gemäß dem Referenz-Beispiel 3 durchgeführt, und die Wirkung der Deletion der BH4-Domäne auf die Wechselwirkung zwischen Bcl-x_L und dem VDAC wurde untersucht. Als Ergebnis, das in 5 gezeigt wird, offenbarte die Coimmunpräzipitations-Analyse, dass Bcl-x_L und VDAC mit VDAC in einem ähnlichen Ausmaß in Wechselwirkung traten, was vermuten lässt, dass die BH4-Domäne für die Bindung zwischen Bcl-x_L und dem VDAC nicht wichtig ist.
Als Nächstes wurde die funktionelle Rolle der BH4-Domäne bei der Regulation der VDAC-Aktivität untersucht. Die VDAC-Aktivität wurde durch Bestimmung der Saccharose-Aufnahme in die VDAC enthaltenden Liposomen gemessen, dies erfolgte unter Verwendung von zwei Verfahren: ein Verfahren mit radioaktiv markierter Saccharose, das in dem Bericht von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] beschrieben wurde, und ein Verfahren zur Messung der von der Saccharose-Aufnahme abhängigen Anschwellung der Liposomen, die durch eine Abnahme der Lichtstreuung aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Da die von der Saccharose-Aufnahme abhängige Anschwellung der Liposomen durch eine Beobachtung mit dem Mikroskop oder durch Durchfluss-Cytometrie-Analyse bestätigt wurde, nehmen wir an, dass die Anschwellung der Liposomen auf dem raschen Einstrom von Saccharose und Wasser durch die großen VDAC-Poren basiert, der den von der Osmose abhängigen Ausstrom von Wasser überwog. VDAC-Liposomen, wie in 6 gezeigt, entwickelten die Anschwellung in Gegenwart von Saccharose, wohingegen VDAC-freie Liposomen und Liposomen mit denaturiertem VDAC kein Anschwellen zeigten, was bedeutet, dass die Saccharose-Aufnahme durch den VDAC vermittelt wurde.
Wie in 7 gezeigt, hemmte die Zugabe von rBcl-x_L zu den VDAC-Liposomen die durch den VDAC vermittelte Saccharose-Aufnahme, wohingegen die Zugabe von Δ21 zu den VDAC-Liposomen die durch den VDAC vermittelte Saccharose-Aufnahme nicht beeinflusste, was zeigt, dass BH4 für die Hemmung des VDAC durch Bcl-x_L essentiell ist. Darüber hinaus wurden, wie in 8 gezeigt, ähnliche Ergebnisse erhalten, wenn die VDAC-Aktivität direkt durch die Bestimmung des Einstroms radioaktiv markierter Saccharose gemessen wurde.
Aus diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass BH4 für Bcl-x_L erforderlich ist, um die VDAC-Aktivität zu hemmen, obwohl die BH4-Domäne die Bindung an den VDAC nicht signifikant beeinflusst.
Beispiel 5: Beteiligung der BH4-Domäne von Bcl-x_L an der Hemmung der VDAC-Aktivität
Um die Rolle der BH4-Domäne an der Hemmung der VDAC-Aktivität aufzuklären, wurde ein Polypeptid, das der Domäne des Bcl-x_L entsprach, VDAC-Liposomen hinzugegeben, um die VDAC-Aktivität zu bestimmen. Wie in 9 gezeigt, bestand das Ergebnis darin, dass das BH4-Polypeptid die VDAC-Aktivität in einer konzentrationsabhängigen Weise hemmte.
Die Zunahme der Lichtstreuung, die in Gegenwart von 20 μg/ml des BH4-Polypeptids nachgewiesen wurde (gezeigt in 9), erfolgte aufgrund des von der Osmose abhängigen Schrumpfens der VDAC-Liposomen nach dem vollständigen Verschluss des VDAC durch das BH4-Polypeptid. Wie in 10 gezeigt, hemmte das aus Bcl-2 stammende BH4-Polypeptid ebenfalls die Aktivität des VDAC, wohingegen ein entsprechendes Polypeptid, das aus Bak stammte, inaktiv war. Die aus Bcl-2 und Bcl-x_L stammenden Polypeptide wiesen bei VDAC-freien Liposomen keinerlei signifikanten Wirkungen auf. In Übereinstimmung mit dem Bericht von Shimizu et al. [Nature 399, 483–487 (1999)] steigerten Bax und Bak die Aktivität des VDAC, und diese Wirkung wurde durch Bcl-x_L antagonisiert. Wie in 11 gezeigt, hemmte das BH4-Polypeptid die durch rBax induzierte Steigerung der VDAC-Aktivität in einer dosisabhängigen Weise, wohingegen das aus Bcl-x_L stammende BH4-Polypeptid nicht an Bax band.
Aus diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass der antagonistische Einfluss von rBcl-x_L und Bax auf den VDAC nicht aufgrund der Bildung von Heterodimeren erfolgt, sondern aufgrund ihrer unabhängigen Wirkungen. Darüber hinaus wurden, obwohl die VDAC-Liposomen-Experimente in der Regel bei einem sauren pH-Wert durchgeführt wurden, der den Einbau des rBcl-x_L in die Membranen erleichterte [Shimizu et al., Nature 399, 483–487 (1999)], praktisch identische Ergebnisse ebenfalls dann erhalten, wenn die Polypeptide bei einem neutralen pH-Wert verwendet wurden.
Wie in 12 gezeigt, wurde in Übereinstimmung mit der Hemmung des VDAC durch das BH4-Polypeptid von Bcl-x_L eine Wechselwirkung zwischen dem N-terminalen Fragment (Aminosäurenummern: 2 bis 9) von Bcl-x_L und dem VDAC nachgewiesen, obwohl in einem geringeren Ausmaß im Vergleich zu dem mit rBcl-x_L. Da Bcl-x_L an den VDAC vorwiegend in anderen Regionen als der BH4-Domäne bindet, könnten andere Regionen die Aktivität der BH4-Domäne steigern, vermutlich durch die Erhöhung der Affinität und/oder der Zugänglichkeit zu dem VDAC. Aus diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass die BH4-Domäne der antiapoptotischen Bcl-2-Proteinfamilie ausreicht, um den VDAC zu hemmen.
Es wurde berichtet, dass einige der konservierten Reste in der BH4-Domäne von Bcl-x_L wie z.B. L⁸V⁹ oder F¹² für die anti-apoptotische Aktivität von Bcl-2/Bcl-x_L entscheidend sind. Um die Rolle der vorstehend erwähnten konservierten Reste bei der Hemmung des VDAC durch die BH4-Domäne zu untersuchen, wurden mehrere Arten von in der BH4-Domäne mutierten Polypeptiden hergestellt, die in 13 gezeigt werden, und ihre hemmende Wirkung auf den VDAC wurde untersucht. Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt.
Wie in 14 gezeigt, hemmten die in L⁸V⁹ mutierten Polypeptide (LV89VF, LV89GG und ΔLV) und die in F¹²L¹³ mutierten Polypeptide (FL1213GG und ΔFL) den VDAC nicht. Weiterhin zeigten Polypeptide mit einem Aminosäureaustausch in D¹¹ (D11G) beziehungsweise einem Aminosäureaustausch in L¹⁷ (L17W) eine den VDAC hemmende Aktivität von etwa 70% und etwa der Hälfte im Vergleich zu der Hemmung des VDAC durch das normale BH4-Polypeptid, was mit der Verminderung der anti-apoptotischen Aktivität in Übereinstimmung steht, wie sie in dem Bericht von Huang, D.C. et al. [Huang, D. C. et al., EMBO J. 117, 1029–1039 (1998)] beschrieben wurde. In diesen Ergebnissen wurde vorgeschlagen, dass die anti-apoptotische Funktion des Bcl-x_L durch seine Hemmung der VDAC-Aktivität vermittelt wird.
Beispiel 6: Hemmung des durch Ca²⁺ induzierten Verlusts des ΔΨ bei isolierten Mitochondrien durch die BH4-Domäne des Bcl-x_L
Die Wirkungen auf den Verlust des ΔΨ wurden unter Verwendung der vorstehend erwähnten, verschiedenen Arten der in der BH4-Domäne mutierten Polypeptide untersucht, die in 13 gezeigt werden. Isolierte Mitochondrien (1 mg/ml) wurden mit 20 μg/ml des Bcl-x_L-BH4-Polypeptids in Gegenwart von 40 μM Ca²⁺ inkubiert, und danach wurde die Rhodamin 123-Intensität kontinuierlich aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden in der linken Abbildung der 14 gezeigt. Zusätzlich wurden isolierte Mitochondrien (1 mg/ml) mit 20 μg/ml des BH4-Polypeptids aus Bcl-x_L und jedem der verschiedenen mutierten Polypeptide in Gegenwart von 40 μM Ca²⁺ 15 Minuten inkubiert, und anschließend wurde das ΔΨ durch die Rhodamin 123-Intensität gemessen. Die Ergebnisse werden in der rechten Abbildung der 14 gezeigt.
Wie in den 14 und 15 gezeigt wird, hemmte das BH-4-Polypeptid aus Bcl-x_L den durch Ca²⁺ induzierten Verlust des ΔΨ und die Aktivität des VDAC signifikant, obwohl nur bei einer molaren Konzentration, die etwa 25-fach höher lag als die des rekombinanten Bcl-x_L, was mit dem Befund in Übereinstimung steht, dass andere Regionen neben BH4 die Zugänglichkeit zu dem VDAC erhöhen könnten. Tatsächlich beeinflussen die Bcl-2/Bcl-x_L-BH1-Mutante und die -BH2-Mutante, die die apoptotische Aktivität beeinflussen, die Fähigkeit von Bcl-2/Bcl-x_L an den VDAC zu binden. Des Weiteren zeigten alle der in der BH4-Domäne mutierten Polypeptide ihre Fähigkeit, die VDAC-Aktivität zu hemmen (15), im gleichen Verhältnis zu ihrer Fähigkeit, den mitochondriellen ΔΨ zu hemmen (14).
Aus diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass die BH4-Domäne des antiapoptotischen Bcl-x_L die Fähigkeit besitzt, die apoptotischen Veränderungen in den Mitochondrien zu hemmen, was parallel zu der Fähigkeit der Hemmung der VDAC-Aktivität erfolgt.
Beispiel 7: Hemmung der Apoptose (Zelltod) durch die BH4-Domäne
Da aus den Ergebnissen des vorstehend erwähnten Beispiels 6 gefolgert wurde, dass sogar das BH4-Polypeptid alleine die Fähigkeit aufweisen kann, die apoptotischen Veränderungen in den Mitochondrien zu hemmen, wurde die Möglichkeit, dass das BH4-Polypeptid in der Lage sein könnte, die Apoptose zu hemmen, weiter untersucht.
Daher wurde, um den Transport des BH4-Polypeptids in die Zellen zu erleichtern, das vorstehend erwähnte TAT-BH4-Polypeptid mit 30 Aminosäureresten synthetisiert, d. h. das Polypeptid, welches das N-terminale, mit Eosin konjugierte Cystein, und die PTD des HIV-TAT-Proteins, fusioniert mit dem Bcl-x_L-BH4-Polypeptid enthielt. HeLa-Zellen wurden mit 200 μM VP16 in Gegenwart des TAT-BH4-Polypeptids behandelt und dann durch ein optisches Phasenkontrast-Mikroskop beziehungsweise ein Fluoreszenz-Mikroskop betrachtet. Von dem TAT-PTD ist bekannt, dass es die Anlieferung von Proteinen in die Zellen in einer raschen, konzentrationsabhängigen Weise erleichtert. Die Ergebnisse werden in 16 gezeigt, wobei die obere Reihe die Zellmorphologie und die untere Reihe die intrazelluläre Akkumulation des Polypeptids zeigt.
16 zeigt, dass das TAT-BH4-Polypeptid, das dem Kulturmedium zugegeben wurde, in die Zellen mit einer Transfektionseffizienz von etwa 90% eingebaut wurde. Eine gleichzeitige Anfärbung der transfizierten Zellen mit Mitotracker offenbarte, dass das TAT-BH4-Polypeptid vorwiegend in den Mitochondrien lokalisiert war. Wie in den 16, 17 und 18 gezeigt wird, hemmte das TAT-BH4-Polypeptid die durch VP16 induzierte Apoptose in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant, wohingegen das nur aus TAT bestehende Polypeptid die durch VP16 induzierte Apoptose bei keiner Konzentration signifikant hemmte. Auch das BH4-Polypetid alleine zeigte, als Ergebnis eines ineffizienten Transports des Polypeptids in die Zelle, keine Wirkung auf die durch VP16 induzierte Apoptose. Mit diesen Befunden wurde gezeigt, dass das TAT-BH4-Polypeptid ausreicht, um den apoptotischen Zelltod zu hemmen.
Beispiel 8: Bewertung der anti-apoptotischen Aktivität verschiedener BH4-Fusionspolypeptide
TAT-BH4-Polypeptide (BH4-Fusionspolypeptide) mit den folgenden Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 28 bis 33) wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 synthetisiert.

Polypeptid 1 (SEQ ID NO: 28) Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg β-Ala Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser
Polypeptid 2 (SEQ ID NO: 29) Arg Lys Lys Arg Arg Gla Arg Arg Arg β-Ala Ser Asn Arg Asp Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser
Polypeptid 3 (SEQ ID NO: 30) Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser
Polypeptid 4 (SEQ ID NO: 31) Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ser Asn Arg Asp Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser
Polypeptid 5 (SEQ ID NO: 32) Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg pro Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser
Polypeptid 6 (SEQ ID NO: 33) Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Ser Asn Arg Asp Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser

Die so erhaltenen verschiedenen BH4-Fusionspolypeptide wurden in H₂O gelöst um wässrige Lösungen in einer Konzentration von 0,1 μg/ml oder 1 μg/ml des BH4-Fusionspolypeptids (Apoptose-Inhibitor) zu erhalten. Durch Inkontaktbringen dieser wässrigen Lösungen mit HeLa-Zellen über 3 Stunden wurden die HeLa-Zellen vorbehandelt. Dann wurden die HeLa-Zellen mit 200 μM VP16 behandelt, um die Apoptose zu induzieren. Jede der Zellen wurde mit 1 μM Hoechst 33342 angefärbt, und das Ausmaß der Apoptose (Lebensfähigkeit) wurde als das Verhältnis der Zellen, die eine Kernfragmentierung aufwiesen, zu der Gesamtzahl der Zellen berechnet. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Aus den in der Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen kann man erkennen, dass die Spacer-Gruppe, die zwischen dem Polypeptid (TAT), das in der Lage ist, eine Aufnahmeaktivität in die Zellen zu zeigen, und der BH4-Domäne eines antiapoptotischen Proteins der Bcl-2-Familie vorliegt, nicht nur durch β-Alanin, sondern auch durch Alanin oder Prolin ausgetauscht werden kann. Darüber hinaus sieht man, dass diejenigen, die einen Austausch in dem vierten Glutaminsäure-Rest durch einen Asparaginsäure-Rest in der BH4-Domäne besitzen, ebenfalls eine anti-apoptotische Aktivität in einem anwendbaren Maße besitzen.
FREIER TEXT DES SEQUENZPROTOKOLLS
SEQ ID NO: 1 zeigt die Konsensus-Sequenz der BH4-Domäne, die in der antiapoptotischen Bcl-Proteinfamilie konserviert ist.
In der SEQ ID NO: 7 bedeutet Xaa an Position 1 den mit Eosin konjugierten Cysteinrest und Xaa an Position 11 bedeutet einen β-Alaninrest.
In der SEQ ID NO: 8 bedeutet Xaa an Position 1 den mit Eosin konjugierten Cysteinrest und Xaa an Position 11 bedeutet einen β-Alaninrest.
SEQ ID NO: 11 ist die Sequenz eines Primers, der zur Herstellung der mutierten bcl-x_L-Sequenz entworfen wurde, wobei die Sequenz auf der menschlichen bcl-x_L-DNA-Sequenz basiert.
SEQ ID NO: 12 ist die Sequenz eines Primers, der zur Herstellung der mutierten bcl-x_L-Sequenz entworfen wurde, wobei die Sequenz auf der menschlichen bcl-x_L-DNA-Sequenz basiert.
SEQ ID NO: 13 ist die Sequenz einer synthetisierten mutierten bcl-x_L-DNA-Sequenz.
SEQ ID NO: 14 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 15 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 16 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 17 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 18 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 19 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 20 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 21 ist eine Aminosäuresequenz für ein synthetisiertes mutiertes Bcl-x_L-BH4-Polypeptid.
SEQ ID NO: 23 ist eine Polypeptidsequenz, die aus der Einführung eines mit Eosin konjugierten Cysteinrestes in den N-Terminus des Polypeptids TAT-PTD erhalten wurde. In der Sequenz bedeutet Xaa an Position 1 den mit Eosin konjugierten Cysteinrest.
SEQ ID NO: 28 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids. In der Sequenz bedeutet Xaa den β-Ala-Rest.
SEQ ID NO: 29 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids. In der Sequenz bedeutet Xaa den β-Ala-Rest.
SEQ ID NO: 30 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids.
SEQ ID NO: 31 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids.
SEQ ID NO: 32 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids.
SEQ ID NO: 33 ist die Aminosäuresequenz eines synthetisierten BH4-Fusionspolypeptids.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das BH4-Fusionspolypeptid der vorliegenden Erfindung weist hervorragende Wirkungen auf, so dass sowohl der Verlust des mitochondriellen ΔΨ als auch die Freisetzung von Cytochrom c gehemmt werden können, und insofern, dass die Aufnahme des BH4-Fusionspolypeptids in die Zellen effizient durchgeführt werden kann, so dass die Apoptose wirksam gehemmt werden kann. Da der Apoptose-Inhibitor der vorliegenden Erfindung die Apoptose hemmen kann, ist er darüber hinaus als therapeutisches Mittel gegen AIDS, neurodegenerative Störungen, Osteomyelodysplasie, ischämische Erkrankungen, infektiöses multiples Organversagen, fulminante Hepatitis, Diabetes und ähnliches nützlich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid bestehend aus: einer Aminosäuresequenz eines Polypeptides oder eines Derivats davon, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann; und einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 von SEQ ID NO: 29; und (b) einer Aminosäuresequenz mit Substitution, Deletion oder Insertion eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 von SEQ ID NO: 29, wobei das Bcl-2-Homologie-Domäne-4-Fusionspolypeptid Apoptose hemmen kann.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei die Derivatsequenz: (i) eine Aminosäuresequenz mit einer chemisch modifizierten Gruppe von zumindest einem Rest in der Aminosäuresequenz des Polypeptids ist, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann, oder (ii) eine Aminosäuresequenz mit Substitution oder Insertion von mindestens einem Aminosäurerest in der Aminosäuresequenz des Polypeptids ist, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann, wobei das entstandene Polypeptid Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polypeptid, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann, mindestens eines ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TAT vom menschlichen Immunschwächevirus, p27 von HTLV-I, art/trs von HIV, VP22 von HSV-1 und Antp von Drosophila.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das Aufnahmeaktivität in eine Zelle zeigen kann, mindestens eines ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) einer Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 49 bis 57 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5; (ii) einer Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 13 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 24; (iii) einer Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 16 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 25; (iv) einer Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 301 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 26; und (v) einer Sequenz, umfassend mindestens die Aminosäurenummern 1 bis 16 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 27.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bestehend aus mindestens einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6; und einer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 von SEQ ID NO: 29; und (b) einer Aminosäuresequenz mit Substitution, Deletion oder Insertion eines Aminosäurerests in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 9, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder Ser 11 bis Ser 30 von SEQ ID NO: 29, wobei das Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid Apoptose hemmen kann.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit mindestens einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 7, 8, 28, 29, 30, 31, 32 und 33.
Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mit einem Cysteinrest am Amino-Terminus der Aminosäuresequenz des Polypeptids, das Aufnahmeaktivität in eine Zellen zeigen kann, und einem β-Alaninrest am Carboxy-Terminus.
DNA, die das Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
Apoptoseinhibitor, umfassend das Bcl-2-Homologie-4-Domäne-Fusionspolypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Apoptoseinhibitor nach Anspruch 9 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung des Apoptoseinhibitors nach Anspruch 9 oder 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer ischämischen Erkrankung, von AIDS, neurodegenerativen Störungen, Osteomyelodysplasie, fulminanter Hepatitis, Leberversagen, verursacht durch Suchten, infektiösem multiplen Organversagen oder Diabetes.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die ischämische Erkrankung ein Herzinfarkt ist.
Vektor, umfassend die DNA nach Anspruch 8.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 13.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Exprimieren des Polypeptids, das von der DNA nach Anspruch 8 codiert wird, und das Gewinnen des Polypeptids.