DE60027928T2

DE60027928T2 - MENSCHLICHES, ZERVIKALKREBS-SPEZIFISCHES SUPPRESSORPROTEIN, FüR DAS PROTEIN CODIERENDES POLYNUKLEOTID, MIT DEM POLYNUKLEOTID TRANSFORMIERTE ZELLE UND VERFAHREN ZUR UNTERDRÜCKUNG DER PROLIFERATION VON KREBSZELLEN UNTER VERWENDUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS

Info

Publication number: DE60027928T2
Application number: DE60027928T
Authority: DE
Inventors: Jin Woo Kim
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2020-12-05
Also published as: US6977296B2; EP1282641B1; CN1216909C; ATE325812T1; JP3749182B2; HK1060136A1; WO2001081387A1; EP1282641A1; CA2405983A1; KR100426455B1; DE60027928D1; JP2003534783A; US20040086974A1; CN1451016A; EP1282641A4; KR20010097640A; AU2001220255A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanes Zervikalkrebs-Suppressorprotein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, ein Polynucleotid, das das Protein codiert, einen Expressionsvektor, der das Polynucleotid enthält, eine Zelle, die den Expressionsvektor umfasst, den Expressionsvektor zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Suppression der Proliferation von Krebszellen durch Induzieren einer Apoptose und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verhütung und Behandlung von Krebs, die das Polynucleotid umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Ein Tumor-Suppressorprotein hemmt die Transformation einer normalen Zelle zu einer Krebszelle, und darum kann der Verlust seiner Aktivität, z.B. eine Mutation, zur bösartigen Umwandlung einer normalen Zelle beitragen (Weinberg RA, Science, 254, 1138-1146 (1991); und Klein G., FASEB J, 7, 821-825 (1993)).
Über 20 Tumor-Suppressor-Gene und durch deren Mutation verursachte Krebs-Prädispositionssyndrome wurden bereits beschrieben (Haber DA et al., Lancet, 351, 1-8 (1998)). Von diesen wurde festgestellt, dass Veränderungen der codierenden Sequenzen des p53-Tumor-Suppressor-Gens für die meisten der humanen Krebserkrankungen genetischen Ursprungs verantwortlich sind (Weinberg RA, vide supra; Klein G., vide supra; und Bishop JM, Cell, 64, 235-248 (1991)). Allerdings zeigt nur ein kleiner Teil, d.h. 2-11 %, der Zervikalkrebsgewebe eine p53-Mutation. Crook T et al., (Lancet, 339, 1070-1073 (1992)) und Busby-Earle RMC et al., (Br. J. Cancer, 69, 732-737 (1994)) haben die Existenz von weiteren Tumor-Suppressor-Genen im Falle von Zervikalkrebs vorgeschlagen. Daher bedarf es der Identifizierung eines Gens, das den Zervikalkrebs unterdrückt.
Zusammenfassung der Erfindung
Demnach besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Tumor-Suppressorproteins, eines Polynucleotids, das das Protein codiert, eines Expressionsvektors, der das Polynucleotid enthält, und einer mit dem Expressionsvektor transformierten Zelle.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Expressionsvektors zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Suppression der Proliferation von Krebszellen.
Eine weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhütung oder Behandlung von Krebs, die das Polynucleotid umfasst.
Unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Tumor-Suppressorprotein bereitgestellt, das aus Homo sapiens isoliert wurde, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die obigen Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen hervor. Es zeigen:
1 die Differential-Display-Ergebnisse von normalem Exozervikalgewebe, Zervikalkrebsgewebe, metastatischem Gewebe und der Zervikalkrebszelllinie CUMC-6;
2 die SDS-PAGE-Analyseergebnisse von Proteinproben von E. coli, die mit dem HCCS-1-Gen transformiert waren, vor und nach der Induktion;
3A die Northern Blot-Analyseergebnisse, die das Expressionsniveau des HCCS-1-Gens in normalen Zervikalgeweben, primären Zervikalkrebsgeweben und in den Zervikalkrebszelllinien HeLa und CUMC-6 zeigen und 3B den gleichen mit einer β-Actin-Sonde hybridisierten Blot;
4A die Northern Blot-Analyseergebnisse, die das Expressionsniveau des HCCS-1-Gens in normalen humanen Geweben zeigen, und 4B den gleichen mit einer β-Actin-Sonde hybridisierten Blot;
5A die Northern Blot-Analyseergebnisse, die das Expressionsniveau des HCCS-1-Gens in humanen Leukämie- und Lymphomzelllinien zeigen, und 5B den gleichen mit einer β-Actin-Sonde hybridisierten Blot;
6 die Northern Blot-Analyseergebnisse, die das Expressionsniveau des HCCS-1-Gens in mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, in mit dem pcDNA3-Vektor allein transfizierten HeLa-Zellen und in parentalen Wildtyp-Zellen zeigen;
7 die Wachstumskurven von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, mit pcDNA3 allein transfizierten HeLa-Zellen und von parentalen Wildtyp-Zellen;
8 die DNA-Fragmentierungsanalyseergebnisse von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, von mit pcDNA3 transfizierten HeLa-Zellen und von parentalen Wildtyp-Zellen;
9 die Western Blot-Analyseergebnisse, die den Cytochrom c-Gehalt der Cytoplasma- und Mitochondrien-Fraktionen zeigen;
Die 10A und 10B die Durchflusszytometrie-Analyseergebnisse von HCCS-1-transfizierten HeLa-Zellen bzw. von parentalen Wildtyp-Zellen, die mit Annexin V-FITC und PI angefärbt wurden; und
Die 11A und 11B die Zellzyklus-Profile von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen bzw. von parentalen Wildtyp-Zellen ohne Behandlung mit Adriamycin oder UVC; die 11C und 11D nach Behandlung mit 0,1 μg/ml Adriamycin; die 11E und 11F nach Behandlung mit 2 μg/ml Adriamycin; und die 11G und 11H nach Behandlung mit UVC.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen
Das erfindungsgemäße Tumor-Suppressorprotein, d.h. das humane Zervikalkrebs-Suppressor-1-Protein (hier im folgenden "HCCS-1-Protein") weist die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und ein Molekulargewicht von etwa 9 kDa auf. Allerdings können verschiedene Substitutionen, Additionen und/oder Deletionen der Aminosäurereste des Proteins durchgeführt werden, ohne die Funktion des Proteins zu beeinträchtigen. Außerdem kann ein Teil des Proteins verwendet werden, wenn ein bestimmter Zweck zu erfüllen ist. Der hier verwendete Begriff "erfindungsgemäßes Tumor-Suppressorprotein" umfasst diese modifizierten Aminosäuren und Fragmente davon. Darum schließt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit im Wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie das HCCS-1-Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und ein Fragment davon ein. Wie hier verwendet, bedeutet "im Wesentlichen das gleiche Polypeptid" ein Polypeptid, dessen Aminosäurese quenz vorzugsweise 80 % oder mehr, stärker bevorzugt 90 % oder mehr, am stärksten bevorzugt 95 % oder mehr Homologie mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 zeigt.
Das erfindungsgemäße HCCS-1-Protein kann von einem Polynucleotid (im folgenden "HCCS-1-Gen") codiert werden, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die von der Aminosäuresequenz des HCCS-1-Proteins nach dem genetischen Code abgeleitet ist. Es ist bekannt, dass auf Grund der Codon-Degeneration mehrere verschiedene Codons existieren können, die die gleiche Aminosäure codieren, und dass daher das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen verschiedene Nucleotidsequenzen umfassen kann, die von der Aminosäuresequenz des HCCS-1-Proteins abgeleitet sind. Ein bevorzugtes HCCS-1-Gen weist die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 auf, die 555 Bp lang ist und ein offenes Leseraster von 79 Aminosäureresten enthält. Die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 wurde bei GenBank unter der Zugriffsnummer AF249227 am 24. März 2000 registriert.
Das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen oder -Protein kann aus Humangewebe erhalten oder unter Anwendung eines herkömmlichen DNA- oder Peptid-Syntheseverfahrens synthetisiert werden. Außerdem kann das so hergestellte Gen in einen herkömmlichen Vektor insertiert werden, um einen Expressionsvektor zu erhalten, der wiederum in einen geeigneten Wirt, z.B. einen Mikroorganismus, wie eine E. coli- oder Hefe- oder eine tierische Zelle, wie eine Maus- oder humane Zelle, eingebracht werden kann.
Anschließend kann der transformierte Wirt zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA oder des erfindungsgemäßen Proteins in großem Maßstab verwendet werden. Beispielsweise wird E. coli JM109 mit dem pCEV-LAC-Expressionsvektor (Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989)), der das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen enthält (als HCCS-1/pCEV-LAC bezeichnet), transformiert, um eine als JM109/HCCS-1 bezeichnete E. coli-Transformante zu erhalten, die bei der Korean Collection for Type Cultures (Adresse: Nr. 52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333, Republik Korea) am 10. April 2000 unter der Hinterlegungsnummer KCTC 0768BP gemäß den Ausfüh rungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt wurde.
Bei der Herstellung eines Vektors werden die Expressionskontrollsequenzen, z.B. ein Promotor, eine Terminationssequenz, eine Selbstreplikationssequenz und ein Sekretionssignal, zweckmäßigerweise in Abhängigkeit von der eingesetzten Wirtszelle gewählt.
Das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen wird in normalen humanenen Geweben, z.B. normalem Zervikal-, Plazenta-, Nieren-, Leber-, Skelettmuskel-, Herzgewebe, allerdings nicht in Krebsgeweben, z.B. primäres Zervikalkrebsgewebe und metastatische allgemeine Hüft-Lymphknotengewebe, und Krebszelllinien, z.B. promyelozytische Leukämie-HL-60-Zellen, HeLa-Zervikalkrebszellen, chronische myelogene Leukämie K-562-Zellen, lymphoblastische Leukämie-MOLT-4-Zellen, BurKitt-Lymphom-Raji-Zellen, SW 480-Darmkrebszellen, A549-Lungenkrebszellen und G361-Melanomzellen, exprimiert. In einem normalen Gewebe besitzt der größte Teil seiner Transkripte eine Länge von 0,6 kB, obwohl 1,6- oder 1,0-kB-Transkripte festgestellt wurden.
Das so exprimierte erfindungsgemäße HCCS-1-Protein besitzt eine Aktivität zur Induktion der Apoptose der Krebszelle. Insbesondere induziert das erfindungsgemäße HCCS-1-Protein die Cytochrom-c-Freisetzung aus Mitochondrien in das Cytosol, um die DNA-Fragmentierung zu erreichen. Außerdem ruft das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen Plasmamembranlipidänderungen, z.B. eine Translokation von Phosphatidylserin (PS) des aus der inneren Membranseite auf die extrazelluläre Seite, hervor, um den Zelltod irreversibel herbeizuführen. Außerdem läßt das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen Zellen, die gegenüber einem apoptotischen Weg, der durch chemotherapeutische Mittel, z.B. Adriamycin, oder durch Bestrahlung, z.B. UVC, ausgelöst wird, empfindlicher werden. Das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen induziert die Herunterregulation eines Tumor-beschleunigenden Proteins, z.B. eines mutierten p53-Tumor-Suppressorproteins, Bcl-2 oder c-Myc.
Eine solche die Apoptose induzierende Aktivität des erfindungsgemäßen HCCS-1-Proteins kann zweckmäßigerweise bei der Suppression der Proliferation einer Krebszelle eingesetzt werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Suppression der Proliferation einer Krebszelle bereit, umfassend das Einbringen eines Expressionsvektors, der das erfindungsgemäße HCCS-1-Gen enthält, in eine Krebszelle, um deren Apoptose auszulösen. Jeder Krebszellentypus kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Bevorzugt sind Zervikal-, Plazenta-, Niere-, Leber-, Skelettmuskel-, und Herz-Krebszellen, und mehr bevorzugt ist eine Zervikalkrebszelle.
Die vorliegende Erfindung schließt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Krebs ein, welche das erfindungsgemäße Tumor-Suppressor-Gen als Wirkstoff und, sofern notwendig, pharmazeutisch verträgliche Träger, Exzipientien oder andere Hilfsstoffe umfasst. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise zur Verabreichung durch Injektion formuliert.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird auf herkömmliche Weise in ein kanzeröses Gewebe eines Individuums verabreicht, um die Apoptose des Gewebes auszulösen. Beispielsweise wird das erfindungsgemäße Tumor-Suppressor-Gen unter Verwendung eines hydrophobisierten poly-L-Lysin-Derivats nach dem von Kim, J.S. et al., (J. Controlled Release, 53, 175-182 (1998)) offenbarten Verfahren verkapselt, und das resultierende verkapselte Gen wird in ein kanzeröses Gewebe eines Individuums injiziert.
Die Menge des tatsächlich verabreichten Tumor-Suppressor-Gens sollte im Lichte von verschiedenen relevanten Faktoren bestimmt werden, einschließlich des zu behandelnden Zustands, gewählten Verabreichungswegs, Alters und Gewichts des individuellen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne ihren Schutzbereich einzuschränken.
Beispiel 1: Differential-Display von mRNA
(Schritt 1) Isolierung von Gesamt-RNA
Normale Exozervikalgewebeproben wurden aus Uterusmyom-Patientinnen im Rahmen einer Hysterektomie erhalten, und unbehandelte primäre Zervikalkrebs- und metastatische allgemeine Hüft-Lymphknotengewebeproben wurden im Rahmen einer Radikalhysterektomie erhalten. Die humane Zervikalkrebszelllinie CUMC-6 (Kim JW et al., Gynecol Oncol, 62, 230-240 (1996)) wurde in Waymouth MB 751/1-Medium kultiviert.
Die Gesamt-RNA wurden aus den Gewebeproben und Zellen unter Verwendung eines handelsüblichen Systems (RNeasy total RNA Kit, Qiagen AG, Deutschland) extrahiert, und die DNA-Verunreinigungen wurden daraus unter Anwendung des Message Clean Kits (GenHunter Corp., Brookline, MA) entfernt.
(Schritt 2) Differential-Display
Der Differential-Display wurde nach Liang et al. (Science, 257, 967-971 (1992) und Cancer Res., 52, 6966-6968 (1992)), mit geringfügigen Modifikationen wie folgt durchgeführt.
Mit jeweils 0,2 μg der in Schritt 1 erhaltenen Gesamt-RNA wurden eine reverse Transkription unter Verwendung des H-T₁₁-A-Primers (SEQ ID NO: 3) als Oligo-dT-Ankerprimer (RNAimage Kit, GenHunter) und anschließend eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung desselben Ankerprimers und des arbiträren 5'-13-Mers (RNAimage Primersatz 1, H-AP 1-40) in Gegenwart von 0,5 mM mit [α³⁵S]-markiertem dATP (1200 Ci/mmol) durchgeführt. Der PCR-Wärmezyklus wurde 40 mal wiederholt, wobei jeder Zyklus aus 40 s bei 95 °C, 2 min bei 40 °C, 40 s bei 72 °C bestand, und schließlich wurde eine Reaktion 5 min bei 72 °C durchgeführt. Mit dem so erhaltenen PCR-Produkt wurde eine Elektrophorese in 6 % Polyacrylamid-Sequenzierungsgelen und anschließend eine Autoradiographie durchgeführt.
1 zeigt die Differential-Display-Ergebnisse von normalem Exozervikalgewebe, Zervikalkrebsgewebe, metastatischem Gewebe und der Zervikalkrebszelllinie CUMC-6 unter Verwendung des Oligo-dT-Ankerprimers und des arbiträren 5'-13-Mers H-AP 37 (SEQ ID NO: 4), wobei der Pfeil ein 193-bp-Fragment anzeigt, das als CG373 bezeichnet wird, das ausschließlich im normalen Exozervikalgewebe exprimiert wird. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das CG373-Fragment ein Tumor-Suppressor-Gen-Kandidat ist.
Die Bande des CG373-Fragments wurde aus dem getrockneten Sequenzierungsgel ausgeschnitten und 15 min in Wasser gekocht, um das CG373-Fragment zu eluieren. Mit dem CG373-Fragment wurde unter Anwendung derselben Bedingungen, mit der Ausnahme, dass [α³⁵S]-markiertes dATP und 20 μM dNTPs weggelassen wurden, eine PCR durchgeführt. Das amplifizierte CG373-Fragment wurde unter Verwendung des TA Cloning Systems (Promega, USA) in den pGEM-T-Easy-Vektor kloniert, und seine Nucleotidsequenz wurde unter Anwendung des Sequenase Version 2.0 DNA Sequenzierungssystems (United States Biochemical Co., USA) bestimmt, um die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 5 zu erhalten. Eine Vergleichsanalyse der Nucleotidsequenz des CG373-Fragments mit der GenBank-Datenbank wurde unter Anwendung der BLAST- und FASTA-Programme durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass dieses Fragment mit jeder Nucleotidsequenz, die in der GenBank-Datenbasis verzeichnet war, wenig Sequenzähnlichkeit aufwies.
Beispiel 2: cDNA-Bibliothek-Screening
Eine λgt11-Bakteriophagen-Humanlungenembryofibroblasten-cDNA-Bibliothek (freundlicherweise von Prof. IY Chung, Hanyang Universität, Seoul, Korea, zur Verfügung gestellt) wurde durch Plaque-Hybridisierung mit einer ³²P-markierten zufallsgeprimten CG373-cDNA-Sonde (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)) gescreent, um ein Volllängen-cDNA-Klon (als HCCS-1 bezeichnet) zu erhalten. Die Nucleotidsequenz des Volllängen-HCCS-1-cDNA-Klons wurde bestimmt.
Der Volllängen-HCCS-1-cDNA-Klon enthält ein 555-Bp-Insert mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 und ein vollständiges offenes Leseraster, das ein Polypeptid, das aus 79 Aminosäureresten (SEQ ID NO: 2) besteht, mit einem ungefähren Molekulargewicht von 9 kDa codiert. Die Nucleotidsequenz des Volllängen-HCCS-1-cDNA-Klons wurde am 24. März 2000 bei GenBank unter der Zugriffsnummer AF249277 registriert.
Die Volllängen-HCCS-1-cDNA wurde in den pCEV-LAC-Vektor (Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989)) insertiert, um den rekombinanten Vektor HCCS-1/pCEV-LAC zu erhalten, und E. coli JM109 wurden mit dem rekombinanten HCCS-1/pCEV-LAC-Vektor transformiert, um transformierte E. coli mit der Bezeichnung JM109/HCCS1 zu erhalten, welche am 10. April 2000 bei der Korean Collection for Type Cultures (Adresse: Nr. 52, Oun-dong-Yusong-ku, Taejon 305-333, Republik Korea) unter der Zugriffsnummer KCTC 0768BP hinterlegt wurden.
Um das HCCS-1-Protein zu bestätigen, wurde die Volllängen-HCCS-1-cDNA in die BamHI- und SaII-Schnittstellen des prokaryotischen Expressionsvektors pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia, USA) insertiert. Der resultierende rekombinante HCCS-1/pGEX4T-1-Vektor wurde in E. coli BL21 transformiert. Die resultierende Transformante wurde in LB-Medium kultiviert, und die Expression des HCCS-1-Gens wurde durch Zugabe von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPTG) induziert, und das Gemisch wurde 3 h bei 37 °C inkubiert. Aus den vor und nach der Induktion entnommenen Kulturproben wurden Proteinproben erhalten, und damit wurde eine SDS-PAGE nach Sambrook et al. (vide supra) durchgeführt.
2 zeigt das SDS-PAGE-Analyseergebnis der Proteinproben der mit dem HCCS-1-Gen transformierten E. coli vor und nach der Induktion. Wie aus 2 ersichtlich ist, wurde nach der Induktion ein 35-kDa-Protein exprimiert, wobei das Protein aus HCCS-1-Protein, fusioniert mit dem 26-kDa-Protein, das aus pGEX4T-1 stammt, besteht. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das HCCS-1-Protein eine relative Molekülmasse von ungefähr 9 kDa aufweist.
Beispiel 3: Northern-Blot-Analyse
Zur Bestimmung des Expressionsniveaus des HCCS-1-Gens in verschiedenen normalen Geweben, Krebsgeweben und Krebszelllinien wurde die Northern-Blot-Analyse wie folgt durchgeführt.
Gesamt-RNA wurde aus normalem Exozervikalgewebe, primärem Zervikalkrebs und metastatischem allgemeinem Hüft-Lymphknotengewebe und aus den humanen Zervikalkrebszelllinien CUMC-6 und HeLa (ATCC CCL-2) durch Wiederholung der Verfahrensweise von Schritt 1 von Beispiel 1 hergestellt. Jeweils 20 μg der Gesamt-RNA wurde denaturiert und sodann auf einem 1 %-Formaldehydagarosegel elektrophoresiert und auf Nylonmembranen (Boehringer Mannheim, Deutschland) überführt. Die Blots wurden über Nacht bei 42°C mit einer ³²P-markierter zufallsgeprimten HCCS-1-cDNA-Sonde hybridisiert, die unter Verwendung eines Rediprime II Random Prime Labeling Systems (Amersham, England) hergestellt wurde. Die Northern-Blot-Analyseergebnisse wurden zweimal reproduzierbar wiederholt, durch Densitometrie quantifiziert, und die gleichen Blots wurden mit einer β-Actin-Sonde hybridisiert, um die mRNA-Integrität zu bestätigen.
Unter Verwendung von 12 verschiedenen normalen humanen Geweben (Clontech) und humanen Krebszelllinien (Clontech) wurden auch Northern-Blot-Analysen, wie von der Lieferfirma empfohlen, durchgeführt.
3A zeigt die Northern-Blot-Analyseergebnisse von normalen Zervikalgeweben, primären Zervikalkrebsgeweben und der Zervikalkrebszelllinien HeLa und CUMC-6 unter Verwendung der HCCS-1-cDNA-Sonde; und 3B zeigt den gleichen Blot, hybridisiert mit einer β-Actin-Sonde. Wie aus den 3A und 3B ersichtlich ist, war das Expressionsniveau des HCCS-1-Gens in sämtlichen normalen Zervikalgeweben erhöht, fehlte allerdings fast vollständig in den Zervikalkrebsgeweben und den Zervikalkrebszelllinien.
4A zeigt die Northern-Blot-Analyseergebnisse von normalen humanen Geweben, d.h. Gehirn, Herz, Skelettmuskel, Darm, Thymus, Milz, Niere, Leber, Dünndarm, Plazenta, Lunge und periphere Blutleukozyten, unter Verwendung der HCCS-1-cDNA-Sonde; und 4B zeigt den gleichen Blot, hybridisiert mit einer β-Actin-Sonde. Wie aus den 4A und 4B ersichtlich ist, war ebenfalls ein dominantes HCCS-1-mRNA-Transkript von ungefähr 1,6 kB in normaler Plazenta, Niere, Leber, im normalen Skelettmuskel und Herz überexprimiert, und andere Gewebe, die niedrige Expressionsniveaus zeigen, umfassen, in absteigender Reihenfolge, das Lungen-, Milz-, periphere Blutleukozyten- und Dickdarmgewebe. Zusätzlich wurden in Plazenta-, Niere-, Leber-, Skelettmuskel-, und Herzgewebe Transkripte von ungefähr 1,0 und 0,6 kB identifiziert.
5A zeigt die Northern-Blot-Analyseergebnisse von humanen Leukämie- und Lymphomzelllinien, d.h. promyelocytische Leukämie-HL-60-Zellen, HeLa-Zervikalkrebszellen, chronische myelogene Leukämie-K-562-Zellen, lymphoblastische Leukämie-MOLT-4-Zellen, BurKitt-Lymphom-Raji-Zellen, SW480-Dickdarmkrebszellen, A549-Lungenkrebszellen und G361-Melanomzellen, unter Verwendung der HCCS-1-cDNA-Sonde; und 5B zeigt den gleichen Blot, hybridisiert mit einer β-Actin-Sonde. Wie aus den 5A und 5B ersichtlich ist, wurden die HCCS-1-Transkripte mit 0,6, 1,0 und 1,6 kB nicht in humanen Leukämie- und Lymphomzelllinien nachgewiesen.
Beispiel 4: Herstellung von mit dem humanen HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen
(Schritt 1) Konstruktion des Expressionsvektors
Der in Beispiel 2 hergestellte rekombinante Vektor HCCS-1/pCEV-LAC wurde mit SaII gespalten, um ein Fragment zu erhalten, das die 555-Bp-Volllängen-HCCS-1-cDNA enthält. Anschließend wurde das SaII-Fragment in die SaII-Stelle des eukaryotischen pCEV-27-Expressionsvektors (Miki, T. et al., Gene, 83, 137-146 (1989)) insertiert, um den Expressionsvektor HCCS-1/pCEV-27 zu erhalten.
(Schritt 2) Transfektion
Der in Schritt 1 erhaltene Expressionsvektor HCCS-1/pCEV-27 wurde unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BRL) in HeLa-Zervikalkrebszellen (ATCC CCL-2) eingebracht, und sodann wurden die resultierenden HeLa-Zellen, die mit dem Expressionsvektor HCCS-1/pCEV-27 transfiziert waren, in Medien selektiert, die mit 0,6 mg/ml G418 (Gibco) angereichert waren. Eine weitere Population von HeLa-Zellen, die pcDNA3 allein enthielt, wurde als Kontrolle hergestellt.
Die transfizierten HeLa-Zellen wurden kloniert und auf Überexpression des HCCS-1-Gens gescreent. Die Gesamt-RNA wurde aus den transfizierten HeLa-Zellen durch Wiederholung der Verfahrensweise von Schritt 1 von Beispiel 1 erhalten, elektrophoretisiert und auf Nylonmembranen überführt. Die Blots wurden mit einer ³²P-markierten zufallsgeprimten HCCS-1-cDNA-Sonde hybridisiert.
6 zeigt die Northern Blot-Analyseergebnisse der mit dem HCCS-1-Gen (HCCS-1) transfizierten HeLa-Zellen, der mit dem Vektor pcDNA3 allein (pcDNA3) tranfizierten HeLa-Zellen bzw. der parentalen Wildtyp-HeLa-Zellen. Wie aus 6 ersichtlich ist, wurde ein einziges 0,6-kB-mRNA-Transkript, welches zu demjenigen der normalen Zervikalgewebe identisch war, das in Beispiel 3 gezeigt ist, in den mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, allerdings nicht in den mit dem Vektor pcDNA3 allein transfizierten HeLa-Zellen und den parentalen Wildtyp-HeLa-Zellen exprimiert.
Beispiel 5: Wachstumsinhibition von Krebszellen durch das HCCS-1-Gen
Zur Untersuchung der Wirkung des HCCS-1-Gens auf das Zervikalkrebszellenwachstum wurden jeweils HeLa-Zellen, die mit dem HCCS-1-Gen transfiziert waren und in Schritt 2 von Beispiel 4 erhalten wurden. HeLa-Zellen, die mit pcDNA3 allein transfiziert waren, und Wildtyp-HeLa-Zellen (in einer Zellanzahl von 1 × 10⁵) 9 Tage kultiviert. In drei unabhängigen Experimenten wurden die Zellen in dreifacher Ausführung in Kolben unter Verwendung von Trypsin abgelöst, und die lebensfähigen Zellen wurden am Tag 0, 1, 3, 5, 7 bzw. 9 unter Anwendung des Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusses (Freshney, I.R., Culture of animal cells, 2. Ausg., Hrsg. A.R. Liss, New York (1987)) gezählt. Die Daten wurden durch den Mittelwert ± S.D. aus den drei Bestimmungen dargestellt.
7 zeigt die Wachstumskurven von mit dem HCCS-1-Gen (HCCS-1) transfizierten HeLa-Zellen, von mit pcDNA3 allein (pcDNA) transfizierten HeLa-Zellen und von parentalen Wildtyp-Zellen. Wie aus 7 ersichtlich ist, nahm die Todesrate von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen im Vergleich zu denjenigen Zellen, die mit pcDNA3 allein transfiziert wurden, oder im Vergleich zu den Wildtyp-HeLa-Zellen zu. Etwa 50 % der HeLa-Zellen, die mit dem HCCS-1-Gen transfiziert wurden, blieben im Vergleich zu den Wildtyp-HeLa-Zellen nach 9 Tagen überlebensfähig. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das HCCS-1-Gen das Wachstum der HeLa-Zervikalkrebszellen hemmt.
Beispiel 6: Apoptose-induzierende Aktivität des HCCS-1-Gens
Um zu überprüfen, ob das HCCS-1-Gen eine Apoptose-induzierende Aktivität aufweist, wurden die DNA-Fragmentierung, die cytoplasmatische Translokation von Cytochrom c, die Membran-PS-Änderung und eine durch ein chemotherapeutisches Mittel induzierte Apoptose von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen wie folgt untersucht.
(1) DNA-Fragmentierungsanalyse
Die mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, die in Schritt 2 von Beispiel 4 erhalten wurden, die mit pcDNA3 allein transfizierten HeLa-Zellen und die parentalen Wildtyp-HeLa-Zellen wurden 3, 5 oder 7 Tage in Waymouth MB 751/1-Medium und anschließend noch 1 Tag in serumfreiem Medium kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt und über Nacht bei 48 °C in einem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, und 0,5 % SDS), enthaltend 100 μg/ml Proteinase K, lysiert. Ein 1/5 Volumen von 5 M NaCl und ein gleiches Volumen von Isoamylalkohol wurden zur Fällung der DNA zugesetzt. Das DNA-Pellet wurde wieder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM EDTA) gelöst und 4 h bei 37 °C mit 0,1 mg/ml RNase A behandelt. 5 μg DNA wurden auf einem 1 % Agarosegel elektrophoretisiert, mit Ethydiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht.
8 zeigt die DNA-Fragmentierungsanalyseergebnisse der mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen an den Tagen 3, 5, 7 (Tag 3, Tag 5 bzw. Tag 7), der mit pcDNA3 (pcDNA3) transfizierten HeLa-Zellen am Tag 7 und der parentalen Wildtyp-HeLa-Zellen am Tag 7. Wie aus 8 ersichtlich ist, war während des Verlaufs des Zelltods in dem serumfreien Medium die zeitabhängige Fragmentierung der DNA zu oligonucleosomalen Leitern in den mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, verglichen mit den parentalen Wildtyp-Zellen offensichtlich, was nahe legt, dass das HCCS-1-Gen die Apoptose in Zervikalkrebszellen auslöst.
(2) Cytoplasmatische Translokation von Cytochrom c
Zur Überprüfung der cytoplasmatischen Translokation von Cytochrom c in den transfizierten Zellen wurde der Cytochrom-c-Gehalt der subzellulären Fraktion nach Akao Y et al. (Cancer Res., 54, 2468-71 (1994)) wie folgt bestimmt.
(Schritt 1) Subzelluläre Fraktionierung
Die mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, die in Schritt 2 von Beispiel 4 erhalten wurden, wurden mit PBS gewaschen und in hypotonischer Lösung (10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure, 10 mM MgCl₂, und 42 mM KCl) 5 min auf Eis suspendiert. Die Zellen wurden durch eine 30er Nadel passiert und 10 min bei 600 × g zentrifugiert, um die rohen Nuclei zu sammeln. Der Überstand wurde 10 min bei 10000 × g zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten, der weiterhin 90 min bei 100000 × g zentrifugiert wurde. Das resultierende Pellet und der Überstand wurden als leichte Membranfraktion (Mitochondrien-Fraktion) bzw. Cytoplasma-Fraktion verwendet.
(Schritt 2) Western-Blot
Zur Messung des Cytochrom-c-Gehalts der Cytosol- und Mitochondrienfraktion wurde ein Western-Blot wie folgt durchgeführt.
Die Cytosol- und die Mitochondrienfraktion, die in Schritt 1 erhalten wurden, wurden auf 10 % SDS-PAGE elektrophoretisiert und anschließend auf Nitrocellulosemembran elektrogeblottet. Die Membran wurde 1 h mit 5 % fettfreier Trockenmilch in Trisgepufferter Salzlösung (TBS; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 150 mM NaCl) inkubiert und mit primären Antikörpern, d.h. monoklonalen Maus-Anti-Cytochrom-c-Antikörpern (PharMingen, USA) 16 h bei 4°C inkubiert. Die resultierende Membran wurde gewaschen und sodann mit einer Blockierungslösung, die eine 1:1000 Verdünnung von sekundären Antikörpern, d.h. Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Ziegen-Anti-Maus- oder Ziegen-Anti-Kaninchen-Immunglobuline (Jackson ImmunoResearch), enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteine wurden durch ein ECL-Western-Blot-Nachweis-Testkit (Amersham, Buckinghamshire, UK) ermittelt.
9 zeigt die Western-Blot-Analyseergebnisse der Mitochondrien- und Cytoplasmafraktion der mit dem HCCS-1-Gen (HCCS-1) transfizierten HeLa-Zellen und der parentalen Wildtyp-HeLa-Zellen (wild). Wie aus 9 ersichtlich ist, war das Cytochrom c der Mitochondrienfraktion abgereichert, während gleichzeitig dasjenige in der Cytosolfraktion in den mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen erhöht war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das HCCS-1-Gen die Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Cytosol auslöst.
(3) Membran-PS-Änderung
Zur Untersuchung der Plasmamembran-PS-Translokation wurde die Durchflusszytometrieanalyse mit dem Annexin V/PI-Testsystem kombiniert (Vermes I et al., J Immunol Methods, 184, 39-51 (1995)) wie folgt durchgeführt.
1 × 10⁷ mit dem HCCS-1-Gen transfizierte HeLa-Zellen, die in Schritt 2 von Beispiel 4 erhalten wurden, wurden mit kaltem PBS gewaschen und in 10 μl 10 × Bindungspuffer (100 mM HEPES, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂ und 18 mM CaCl₂) verdünnt. 1 μl des Annexin-V-Konjugats und 10 μl Propidiumiodid (PI) wurden zugesetzt, wie vom Hersteller des ApoptoseKits (TACSTM Annexin V-FITC, Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD, USA) vorgegeben. Die resultierende Zellsuspension wurde 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, und 400 μl 1 × Bindungspuffer wurden zugesetzt und sodann mit einem Coulter XL Epics Flow Cytometer (Coulter Corp., Miami, FL) analysiert.
Die 10A und 10B zeigen die Durchflusszytometrie-Analyseergebnisse von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen bzw. von parentalen Wildtyp-Zellen unter Verwendung von Annexin-V-FITC und PI. In den 10A und 10B ergab der Logarithmus der grünen Fluoreszenz (Annexin-V-FITC) gegen den Logarithmus der roten Fluoreszenz (PI) vier Populationen: Für beide Fluorochrome negative Zellen (R1; unterer linker Quadrant), die lebende Zielzellen darstellen; Annexin-V-FITC-positive und P1-negative Zellen (R2; unterer rechter Quadrant), die früh apoptotische Zellen charakterisieren; für beide Fluorochrome positive Zellen (R3; oberer rechter Quadrant), was Apoptose im Spätstadium oder nekrotische Zellen kennzeichnet, und Annexin-V-FITC-negative und P1-positive Zellen (R4; oberer linker Quadrant), was nur Zellen mit permeabilisierten Membranen darstellt (Aubry J-P et al., Cytometry, 37, 197-204 (1999)). Wie aus den 10A und 10B ersichtlich ist, existieren überlebensfähige (R1), früh apoptotische (R2) und spät apoptotische oder nekrotische (R3) Zellen, und 22 % aller mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen befanden sich in dem früh apoptotischen Prozess, wohingegen 2,2 % Wildtyp-HeLa-Zellen vorhanden waren. Dieses Ergebnis legt nahe, dass das HCCS-1-Gen Apoptoseassoziierte Plasmamembran-Lipidänderungen induziert.
Diese Annexin V/P1-Durchflusszytometrieergebnisse waren insofern gut mit dem Cytochrom c-Freisetzungsergebnis aus (2) korreliert, als HCCS-1 die Apoptose in HeLa-Zervikalkrebszellen induzierte.
(4) Adriamycin- oder UVC-ausgelöste Apoptose
Um zu überprüfen, ob ein Arzneimittel oder UV-Licht die Apoptose der mit dem HCCS-1-Gen transfizierten Zellen auslöst, wurde die Zellzyklus-Kinetikanalyse, wie von Hedley, D.W. (in Flow Cytometry, DNA Analysis from Paraffin-embedded Blocks (Hrsg. Darzynkiewicz, Z. & Crissman, H.A.) 139 (Academic Press, San Diego, 1990)) beschrieben, durchgeführt.
Die mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen, die in Schritt 2 von Beispiel 4 erhalten wurden und die parentalen Wildtyp-Zellen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase kultiviert und in Waymouth MB 752/1-Medium, enthaltend 0,5 % Rinderkälberserum, 36 h inkubiert, um das Zellwachstum in der G₀/G₁-Phase anzuhalten. Die Zellen wurden mit Adriamycin (0,1 bzw. 2 μg/ml) oder UVC (50 J/m²) behandelt, und sodann wurden die Zellen in Waymouth MB 752/1-Medium, enthaltend 0,5 Rinderkälberserum, kultiviert, um das Zellwachstum wieder aufzunehmen. Nach 24 h wurden die HeLa-Zellen geerntet, mit Trypsin behandelt und in 70 % Ethanol fixiert.
50 μg/ml P1-Färbelösung (SIGMA) und 100 Einheiten/ml RNase A (Boehringer Mannheim) wurden zu 2 × 10⁶ der fixierten Zellen zugesetzt. Nach 1 h Inkubation wurde der Zell-DNA-Gehalt durch Fluoreszenzanalyse bei 488 nm unter Verwendung eines FACS-Calibers (Becton Dickinson) bestimmt. Ein Minimum von 1 × 10⁴ Zellen pro Probe wurde mit der Modfit 5.2 Software analysiert.
Die 11A und 11B sind die Zellzyklusprofile der mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen bzw. der parentalen Wildtyp-Zellen ohne Behandlung mit Adriamycin oder UVC; die 11C und 11D nach Behandlung mit 0,1 μg/ml Adriamycin; die 11E und 11F nach Behandlung mit 2 μg/ml Adriamycin; und die 11G und 11H nach Behandlung mit UVC, wobei M1 die G₀/G₁-Phase darstellt; M2 die S-Phase darstellt; M3 die G₂/M-Phase darstellt; und M4 die apoptotische Sub-G0/G1-Phase darstellt. Wie aus den 11A bis 11H ersichtlich ist, induzierte Adriamycin in den Zellpopulationen keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Zellzyklusprogression zwischen parentalen Wildtyp-Zellen und mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen. In den Wildtyp-HeLa-Zellen verblieben nach der Behandlung mit Adriamycin oder UVC wenige Zellen in der apoptotischen Sub-G0/G1-Phase. Im Gegensatz dazu befand sich immer noch eine beträchtliche Menge von mit dem HCCS-1-Gen transfizierten HeLa-Zellen in der apoptotischen Sub-G0/G1-Phase. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das HCCS-1-Gen Zellen gegenüber einer durch Arzneimittel oder durch UV-Licht ausgelösten Apoptose empfindlicher macht.

Claims

Tumor-Suppressorprotein, isoliert aus Homo sapiens, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2 aufweist.
Polynucleotid, welches das Tumor-Suppressorprotein von Anspruch 1 codiert.
Polynucleotid von Anspruch 2, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 aufweist.
Expressionsvektor, der das Polynucleotid nach Anspruch 2 oder 3 enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, in dem das Polynucleotid in den Vektor pCEV-LAC insertiert ist.
Zelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei die Zelle ein Mikroorganismus oder eine Tierzelle ist.
Zelle nach Anspruch 6, die Escherichia coli JM109/HCCS1 (KCTC 0768BP) ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4 zur Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, um die Proliferation von Krebszellen durch Induzieren einer Apoptose zu unterdrücken.
Zusammensetzung zur Verhütung oder Behandlung von Krebs, welche eine therapeutisch wirksame Menge des Polynucleotids nach Anspruch 2 oder 3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.