DE10100280A1 - DNA-Sequenzen, codierend für ein Apoptose-Signaltransduktionsprotein - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für ein apoptotisches Signaltransduktionsprotein (Bcl-Rambo) bzw. für Polypeptide mit einer Domäne eines solchen Proteins (BHNo-Domäne von Bcl-Rambo) codieren, Expressionsvektoren, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten Sequenzen, Antikörper gegen diese Genprodukte, Verfahren zur Expression und Isolierung, Verbindungen, die die apoptotische Wirkung modulieren, Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen und die Verwendung von diesen Verbindungen bzw. den DNA-Sequenzen oder Genprodukten als Arzneimittel.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für ein apoptotisches Signaltransduktionsprotein (Bcl-Rambo) bzw. für Polypeptide mit einer Domäne eines solchen Pro­ teins (BHNo-Domäne von Bcl-Rambo) codieren, Expressions­ vektoren, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten Se­ quenzen, Antikörper gegen diese Genprodukte, Verfahren zur Expression und Isolierung, Verbindungen, die die apoptotische Wirkung modulieren, Verfahren zur Identifi­ zierung solcher Verbindungen und die Verwendung von die­ sen Verbindungen bzw. den DNA-Sequenzen oder Genprodukten als Arzneimittel.

Neben der Nekrose, die eine Form des Zelltods darstellt, ist aus dem Stand der Technik auch die Apoptose als wei­ tere Form des Zelltods bekannt. Bei der Apoptose handelt es sich um einen physiologischen Prozeß, der regulierend in viele physiologische Prozesse bei multizellulären Or­ ganismen eingreift. So etwa tritt die Apoptose in der Em­ bryonalentwicklung auf, spielt bei der Gewebe- oder Or­ ganmorphologie eine Rolle, greift in die Modulation der Immunabwehr ein und ist somit - um allgemein zu sprechen - von zentraler Bedeutung für die Homöostase in multizel­ lulären Organismen (Wyllie et al. (1980) Rev. Cytol 68 (251), 251-251). Verschiedene apoptotische Signaltrans­ duktionswege sind in den letzten Jahren im Stand der Technik aufgeklärt worden, beispielsweise die durch FasL induzierte Zellapoptose, die nach extrazellulärer Auslö­ sung intrazellulär durch eine Kaskade von zu aktivieren­ den Caspasen weitergeleitet wird. Aus den Arbeiten von Adams et al. ((1998) Science 281, 1322-1326) und Gross et al. ((1999) Genes Dev 13 (15), 1899-911) ist nicht nur - wie seit langem aus dem Stand der Technik bekannt - zu entnehmen, daß Proteine der Bcl-2-Familie an der Regula­ tion der Apoptose beteiligt sind, sondern auch, daß diese Proteine drei verschiedenen Subfamilien angehören. Wäh­ rend Bcl-2 und weitere nahe Verwandte von Bcl-2 ein­ schließlich Bcl-x, Bcl-w und C. Elegans CED-9, die Apop­ tose inhibieren und eine eigene Subfamilie begründen, gibt es zwei weitere Subfamilien, die im Ergebnis genau gegenteilige Wirkung haben, d. h. den Zelltod fördern. Hierbei handelt es sich einerseits um die Subfamilie mit Proteinen, wie z. B. Bax, Bak, Bok, und andereseits um die dritte Subfamilie, der die folgenden Proteine angehö­ ren: Bad, Bik/Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim/Bod und Noxa bzw. das Protein EGL/1 von C. Elegans. Die beiden Subfamilien, denen zum einem Bcl-2, als Inhibitor der Apoptose, und zum anderen Bax, als Aktivator der Apoptose, angehören, zeichnet sich gemeinsam durch drei von vier konservierten "BH"-(Kurzbezeichnung für Bcl-2-Homologie) Sequenzmoti­ ven aus. In Gegensatz hierzu gibt es zur dritten Subfami­ lie, die beispielsweise durch die Säugetierproteine Bad, Bik/Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim/Bod und Noxa bzw. das Protein EGL/l von C. Elegans vertreten werden, nur eine Homologie mit dem kurzen BH3-Sequenzmotiv zu den beiden vorgenann­ ten Subfamilien, weswegen Proteine dieser dritten Subfa­ milie im Stand der Technik auch als "BH3-only"-Proteine bezeichnet werden. Weiterhin ist bekannt, daß diejenigen Proteine, die den beiden Subfamilien mit anti­ apoptotischer Wirkung angehören, sich durch einen hydro­ phoben C-terminal gelegenen Sequenzabschnitt auszeichnen, der die Interaktion mit dem endoplasmatischen Reticulum, der Kernhülle oder der äußeren Mitochondrien-Membran er­ möglicht. Diese das Überleben der Zelle fördernden Pro­ teine liegen nämlich typischerweise membrangebunden vor, im Gegensatz zu anderen an der Apoptose beteiligten Pro­ teinen.

Schließlich ist aus den Arbeiten von Oltvai et al ((1993) Cell 74(4), 609-619; (1994) Cell 79 (2), 189-92) bekannt, daß die jeweils in der Zelle vorherrschenden relativen Konzentration der Proteine, die gegensätzlich wirkenden Subfamilien angehören, über den Zelltod oder das Überle­ ben der Zelle entscheiden. Hierbei könnte die Tatsache eine Rolle spielen, daß die gegensätzlich wirkenden Pro­ teine aus den jeweiligen Subfamilien, d. h. Proteine mit pro- oder antiapoptotischer Wirkung, Heterodimere bilden können, die deren jeweilige gegensätzliche Wirkung aufzu­ heben in der Lage sind. Dabei ist bislang noch nicht ge­ klärt, ob beispielsweise Bcl-2 für seine apoptoseinhibi­ torische Wirkung notwendigerweise pro-apoptotische Fami­ lienmitglieder, beispielsweise Bax oder Bak, binden muß, um die inhibitorische Wirkung entfalten zu können, oder ob die Bindung an diese pro-apoptotischen Proteine für die Wirkung von Bcl-2 nicht entscheidend ist (Yin et al. (1994) Nature 369 (6478), 321-323; Cheng et al. (1996) Nature 379 (6565), 554-556).

Aus den dargelegten Gründen ist daher im Stand der Tech­ nik die apoptotische Signaltransduktion, die Wechselwir­ kung zwischen Bcl-2-Homologen verschiedener Subfamilien und die Vollständigkeit der an der Regulation dieses apoptotischen Signaltransduktionswegs beteiligten Protei­ ne noch völlig unzureichend aufgeklärt. Daher ist es auch nach dem Stand der Technik nicht möglich, durch therapeu­ tische Maßnahmen gezielt die apoptotischen Geschehnisse in der Zelle zu modulieren.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einerseits, apoptotische Signaltransduktionsmechanismen aufzuklären sowie solche Proteine (mit ihren Aminosäuresequenzen) und den zugrundeliegenden DNA-Sequenzen zu identifizieren, die an der apoptotischen Signaltransduktion beteiligt sind, um andererseits auf der Basis dieser Erkenntnisse und mit Hilfe ggf. pathophysiologischer Befunde Stoffe oder deren Verwendung zur Behandlung von diesbezüglichen Erkrankungen oder Störungen zur Verfügung stellen zu kön­ nen.

Diese Aufgaben werden im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung durch Stoffe, Verfahren und Verwendungen gemäß den Ansprüchen 1, 5, 6, 8, 11, 14, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 27, 28 und 29 gelöst. Jeweilige vorteilhafte Ausführungs­ formen sind in den dazu gehörigen Unteransprüchen be­ schrieben.

Zur Lösung dieser Aufgaben haben die Erfinder zunächst festgestellt, daß Proteine mit einer sog. BHNo-Domäne ei­ ne entscheidende Rolle bei der intrazellulären Weitergabe oder Auslösung eines apoptotischen Signals spielen. Wei­ terhin können diese Proteine ggf. BH-Sequenzmotive auf­ weisen, bspw. mindestens ein BH1-, BH2-, BH3- und/oder BH4-Sequenzmotiv. Damit werden erfindungsgemäß Proteine mit Beteiligung an der apoptotischen Signalkaskade zur Verfügung gestellt, die einer weiteren aus dem Stand der Technik unbekannten Subfamilie von apoptotischen Signal­ transduktionsproteinen angehören.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA- Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 codiert (BHNo-Domäne), einschließlich aller funktionsho­ mologen Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle DNA-Sequenzen mit umfaßt, die mit den erfin­ dungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert, wie in Fig. 7 wiedergegeben, einschließlich al­ ler funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Deri­ vate, Allele, Analoga oder Fragmente, die die apoptoti­ sche Signalkaskade inhibieren können. Auch mit diesen er­ findungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA- Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementä­ ren DNA-Stranges) sind mitoffenbart (Anspruch 2). Die Herstellung derartiger Derivate, Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den DNA-Sequenzen, die für ein Protein, das eine BHNo-Domäne enthält, codieren, ein oder mehrere Codons eingefügt, weggelassen oder sub­ stituiert, um ein Polypeptid zu erhalten, das einen Un­ terschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure gegen­ über der nativen Sequenz aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehö­ ren auch DNA-Teilsequenzen, die für Abschnitte der BHNo- Domäne codieren, insbesondere für die Teilsequenz von AS 213 bis AS 459 oder bis zu einer weiter N-Terminal gele­ genen AS, insbesondere weiterhin für die Teilsequenz von AS 245 bis AS 459 oder bis zu einer weiter N-Terminal ge­ legenen AS, weiterhin insbesondere auch für die Teilse­ quenz von AS 285 bis AS 459 oder bis zu weiter einer N- Terminal gelegenen AS und insbesondere weiterhin für eine Teilsequenz von AS 431 bis AS 459 oder bis zu einer wei­ ter N-Terminal gelegenen AS. Hinsichtlich der jeweiligen AS-Sequenzen wird auf die Numerierung gemäß Fig. 1A ver­ wiesen. Allgemein gesprochen werden erfindungsgemäß DNA- Sequenzen offenbart, die mindestens eine DNA- Sequenzenthalten, die für eine mindestens 8, vorzugsweise mindestens 12, noch stärker bevorzugt mindestens 20 AS langen Teilabschnitt auf der BHNo-Domäne (AS 205 bis AS 485 gemäß Fig. 1A) codieren, einschließlich aller Deriva­ te, Analoga oder Allele. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ergebenden AS-Sequenzen werden mitoffenbart. Ganz besonders bevorzugt sind die den AS- Sequenzen gemäß Fig. 1B zugrundeliegenden DNA-Sequenzen (Repeat-Sequenzen) bzw. DNA-Sequenzen, die Abschnitte enthalten, die für diese AS-Sequenzen codieren, ein­ schließlich aller Derivate, Allele und Analoga. Auch die durch die vorgenannten DNA-Sequenzen erhältlichen Oligo- oder Polypeptid-Sequenzen werden mitoffenbart.

Weiter bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbe­ reich enthalten, der für ein Polypeptid gemäß Fig. 8 co­ diert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente, oder einschließlich aller mit die­ sen Sequenzen hybridisierenden Sequenzen (Anspruch 3). Vorzugsweise werden die Hybridisierungsbedingungen so ge­ wählt, daß eine Hybridisierung bei 40°C stärker bevorzugt bei 50°C und noch stärker bevorzugt bei 60°C gegeben ist.

Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die eine der in Fig. 9 angegebenen (c)DNA-Sequenzen enthalten (Anspruch 4).

Weiterhin werden erfindungsgemäß alle DNA-Sequenzen mi­ toffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesent­ lichen dem Bcl-Rambo-Protein entspricht. Diese DNA- Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in Fig. 9 angegebenen Sequenz, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzverän­ derungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit der für Bcl-Rambo codieren DNA-Sequenz entsprechenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Apoptoseauslösung identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese-Verfahren gehö­ ren die site-directed-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer destens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Poly­ mersierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem transferiert (z. B. E.coli) und ent­ sprechend transformierte Klone isoliert. Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Her­ stellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer kön­ nen bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz eingeführt werden, wie z. B. Restriktionsschnitt­ stellen, Terminationscodons. Hierdurch können erfindungs­ gemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz, bspw. wie zuvor offenbart oder gemäß Ansprüchen 1 bis 4 beansprucht, enthalten (Anspruch 5). Derartige erfindungsgemäße Expressionsvektoren (bspw. Plasmide) enthalten neben mindestens einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz typischerweise auch Promotor-Bereiche und Termi­ nator-Bereiche, ggf. auch mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene) und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Pro­ teins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressions­ vektor transformiert wurden (Anspruch 6). Als geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenzen kommen Prokaryotenhefen oder höhere eukaryotische Zellen in Frage. Bei Prokaryoten sind Gram­ negative oder Gram-positive Organismen ausdrücklich einge­ schlossen. Zu nennen ist hier E.coli oder Bazillen. Als be­ vorzugte Wirtszellen zur Klonierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden die Stämme E.coli 294, E.coli B und E.coli X1776 sowie E.coli W3110 offenbart. Bei den Bazillen stehen Bazillus subtilis, Salmonella typhimurium oder ähn­ liche. Wie oben bereits erwähnt, enthalten die Expressions­ vektoren typischerweise mindestens eine bakterienspezifi­ sche Signalsequenz zum Transport des Proteins in das Kul­ turmedium. Neben Prokaryoten kommen auch eukaryotische Mi­ kroben als Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Ex­ pressionsvektor transfiziert worden sind, in Frage. So etwa können filamentöse Pilze oder Hefen als geeignete Wirtszel­ len für die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierende Vek­ toren eingesetzt werden. Zu nennen ist vor allem Saccha­ romyces cerevesiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Ex­ pression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glyko­ silierung (N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Ver­ gleich zu Prokaryotenzellen - in geeigneter Weise ausge­ führt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Men­ schen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer kei­ neswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zel­ linien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterova­ rien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden mit Expressions­ vektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufwei­ sen, vorzugsweise Zellen des Säugetierimmunsystems, vor al­ lem des humanen Immunsystems, transfiziert (Anspruch 7).

Insbesondere kommt die Transfektion von B- und/oder T- Zellen in Betracht.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 8). Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfin­ dung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufge­ reinigter Form (Anspruch 9). Diese Proteine weisen erfin­ dungsgemäß mindestens eine BHNo-Domäne auf und regulieren oder transportieren insbesondere apoptotische, ggf. auch inflammatorische Signale. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es die in Fig. 7 angegebene Ami­ nosäuresequenz (für eine BHNo-Domäne), oder ein funkti­ onshomologes Allel, Fragment oder Derivat dieser Sequenz enthält (Anspruch 10). Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS-Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezep­ tors an eine erfindungsgemäße AS-Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers oder Fett(säure)- restes oder einer Phosphatgruppe oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N- oder C-Terminus. Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusi­ onsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekop­ pelt ist.

Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Se­ quenz auszeichnen (Insertion, Substitution). Bevorzugt sind konservative Substitutionen, bei denen der physiko­ chemische Charakter der ausgetauschten AS erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit aromati­ scher Gruppe). Bevorzugt sind die Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auf­ tritt, bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Substitutionen können auch weniger konservative AS- Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz einge­ führt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre Funktion als Transduktor eines apoptotischen Signals bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungsas­ says oder zytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die einen sogenannten dominant negativen Ef­ fekt hervorrufen, d. h. auf Grund ihre veränderten Primär­ sequenz zwar noch Bindungsaktivität an eine in der Kaska­ de stromaufwärts gelegene Sequenz aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed"-Mutagenese einer DNA-Sequenz, die für ei­ ne erfindunsgemäßes Protein, enthaltend eine BHNo-Domäne (typischerweise Bcl-Rambo), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinaten Zellkultur exprimiert Sambrook et al., 1989, s. o.). Auch alle Deri­ vate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS-Sequenzen zugrun­ deliegenden DNA-Sequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfin­ dungsgemäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C-terminal oder auch intrasequentiell). Sie kön­ nen einen dominant negativen oder dominant-positiven Ef­ fekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich erfin­ dungsgemäß von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA- Allelen der in Fig. 9 angegebenen DNA-Sequenz nach Trans­ kription und Translation ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine che­ misch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch be­ liebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungs­ gemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Pepti­ den oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Pro­ teins, insbesondere am N- oder C-Terminus einer BHNo- Domäne, fusioniert sein, ggf. aber auch in die Sequenz der erfindungsgemäßen BHNo-Domäne integriert sein. Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"-Sequenzen am N- Terminus der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N- oder am C- Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Amino­ säuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit minde­ stens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des rekombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.

Erfindungsgemäße genomische DNA-Sequenzen können in zahl­ reichen Exons, die durch Introns voneinander getrennt sind, auf dem Strang des Erbinformationsmoleküls abgelegt sein, bspw. wie in Fig. 1C gezeigt. Erfindungsgemäße DNA- Sequenzen können damit als cDNA (ohne intronische Sequenzen) oder genomisch mit mindestens einer Intronsequenz vor­ liegen. Wie in Fig. 1C beispielhaft für die humane Bcl- Rambo-Sequenz angegeben, können erfindungsgemäße DNA- Sequenzen ein, zwei, drei, vier oder 5 Intronsequenzen ent­ halten (in beliebiger Kombination, bspw. nur Intron 2 (5,7 kb) und Intron 3 (7,2 kb)), oder auch als cDNA (ohne Intronsequenz) vorliegen. Auch alle denkbaren SPLICE- Varianten (auf mRNA-Ebene) als Genprodukte gehören zum er­ findungsgemäßen Gegenstand. Auch alle von diesen verschie­ denen SPLICE-Varianten auf mRNA-Ebene codierten Proteine unterfallen der vorliegenden Erfindung. Damit können erfin­ dungsgemäße Proteine die BHNo-Domäne ohne oder mit minde­ stens einer weiteren Exonsequenz oder Exonteilsequenz auf­ weisen, bspw. die AS-Sequenz von Exon III und Exon IV sowie die ersten 15 AS von Exon V in Kombination mit der Ami­ nosäuresequenz der BHNo-Domäne auf Exon VI (mit oder ohne Transmembran-Domäne).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemä­ ßen Genprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Pro­ tein, erkennt (Anspruch 11). Der Begriff "Antikörper" um­ faßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (Anspruch 12), chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von er­ findungsgemäßen Antikörpern in Alleinstellung können er­ findungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auf­ treten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfin­ dungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionspro­ teinen werden typischerweise durch die Methoden enzymati­ scher Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fach­ mann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um hete­ rogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen im­ munisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehö­ ren aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Anti­ körper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US- Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor La­ boratory (1988)). Die in den vorgenannten Literaturstel­ len enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vor­ liegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen. Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorge­ nannten Klassen. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsge­ mäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vor­ zugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile ent­ halten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ab­ leiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der An­ wendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. ergeben murine monoklona­ le Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vor­ zugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312 643-­ 646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A- 171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-­ 3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laboratory Ma­ nual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezo­ gen.

Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemä­ ßer Antikörper gegen einen Sequenzabschnitt auf der BHNo- Domäne als Epitop gerichtet sein (Anspruch 13).

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen An­ tikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z. B. ei­ nes Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti­ idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt wer­ den. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Deter­ minanten des immunisierenden Antikörpers durch die Pro­ duktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemä­ ßer anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti- idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti- idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität expri­ mieren, identifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Pro­ teine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfin­ dungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisier­ ten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-idiotypische monoklonale An­ tikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocya­ nin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann an­ ti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigen­ schaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen, z. B. Fab und F(ab')₂. Fab und F(ab')₂-Fragmente entbehren eines Fc- Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht­ spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufwei­ sen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab')₂ Frag­ mente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen ein­ gesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischer­ weise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab- Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')₂, Fragmenten) verwendet werden.

Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, können zur quantitativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem Protein in einer Probe eingesetzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Die Detektion kann mit Hilfe von Im­ munofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluores­ zenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikro­ skopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Antikörper (oder Fragmente dieser Anti­ körper) eignen sich für histologische Untersuchungen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoelektro­ mikroskopie, für die in situ Detektion eines erfindungs­ gemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch er­ folgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten genommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu einer solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikör­ per (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in mar­ kierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Protein in der Probe zu bestimmen, son­ dern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebe­ extrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Ver­ fahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträ­ ger, wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägerma­ terial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektier­ bar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht- gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebun­ dener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Po­ lypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natür­ liche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maß­ gabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Träger­ material kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf ver­ schiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Anti­ körper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung ent­ steht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere opti­ sche Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparigi­ nase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die De­ tektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spe­ zifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Ver­ gleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays sichergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Bioche­ mistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Hol­ land Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillati­ onszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Mar­ kierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phy­ cocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluoresca­ min. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können ein­ gesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessig­ säure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Che­ milumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz-markierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer che­ mischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für der­ artige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniu­ mester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleichermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Che­ milumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumi­ neszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispiels­ weise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two­ site" oder "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Ty­ pische immunometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"-Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem ge­ bunden sind und daß der Antikörper mit der Probe, die un­ tersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit ei­ ner Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten An­ tikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen An­ tigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sandwich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikör­ per beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufge­ bracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, ge­ folgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikör­ per, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf ei­ ner geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inku­ bationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von mar­ kiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben be­ schrieben, durchgeführt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Ver­ fahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer refindungsgemäßen Aminosäuresequenz, insbesondere einer BHNo-Domäne (wie in Fig. 7 dargestellt), wobei die Wirts­ zellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor trans­ formiert und dann unter geeigneten, die Expression fördern­ den Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann (Anspruch 14). Das Protein der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die jeweili­ gen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreini­ gung des von einer erfindungsgemäßen DNA codierten, rekom­ binanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme ein­ gesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Pro­ teins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentra­ tionsfilter, z. B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkon­ zentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gelfiltrationsschritt oder säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der ei­ ne Matrix mit DEAE aufweist.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung be­ kannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaus­ tauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed- Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genpro­ dukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt wer­ den. In diesem Fall kann das translatierte Protein se­ kretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes rekombinantes Protein aus einer Hefe­ wirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296: 171 (1994)) offenbart sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Ver­ fahren zur Expression von Genprodukten, die mindestens eine BHNo-Domäne enthalten, einschließlich aller Derivate, Ana­ loge und Fragmente, wobei hierbei Wirtszellen mit einem Ex­ pressionsvektor, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz ent­ hält, transformiert werden (Anspruch 15). Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungs­ gemäßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entspre­ chende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, son­ dern vielmehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einfüh­ ren der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressi­ onsvektoren transformierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteu­ erter intrazellulärer Signaltransduktion oder fehlgesteuer­ ter Homöostase von Überlebens- und Todessignalen, vor allem zur Regulation der Apoptose, zu denken (Anspruch 16). Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplan­ tiert werden.

Je nach den gewünschten Bedingungen kann eine erfindungsge­ mäße DNA-Sequenz hinter einen konstitutiv aktivierten Pro­ motor geschaltet sein oder vielmehr operabel mit einem wunschgemäß induzierbaren Promotor auf dem zur Zelltrans­ fektion verwendeten Expressionsvektor verbunden sein. Im Falle der Induzierbarkeit wird die erfindungsgemäße DNA- Sequenz vorzugsweise als Suizidgen eingesetzt werden kön­ nen. Dies bedeutet, daß nach Transfektion der Wirtszelle die Transkription der erfindungsgemäßen, den Zelltod indu­ zierenden Sequenz bspw. zunächst reprimiert ist oder nicht aktiviert werden kann. Die Wirtszellen, ggf. transfiziert mit mindestens einem weiteren Gen oder Genfragment (auf demselben oder mindestens einem weiteren Expressionsvek­ tor), beispielsweise einem Tumorsuppressor-Gen oder einem therapeutischen Gen im Falle von Erbkrankheiten, werden dann zur Gentherapie dem Patienten (re)transplantiert (autogenes oder allogene Wirtszellen). Falls erforderlich, kann nach Transplantation - je nach medizinischer Indika­ tion - durch Gabe eines Inducers oder negativen Repressors die Transkription der Apoptose induzierenden erfindungsge­ mäßen DNA zur Induktion des Zellsuizids eingeleitet werden. Damit kann abhängig vom Verlauf der Gentherapie die trans­ plantierte Wirtszelle am Leben erhalten werden oder gezielt ausgelöst der Apoptose anheimfallen. Ganz allgemein eignet sich damit die Transfektion von Wirtszellen mit einer indu­ zierbaren erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zur negativen Se­ lektion von entsprechend transfizierten Wirtszellen.

Weiterhin werden erfindungsgemäß auch doppelt(dominant)- negative Mutanten (DN) offenbart, die den ggf. extrazellulär induzierten Zelltod unterdrücken können. Bspw. kann es sich hierbei um Fragmente erfindungsgemäßer Sequen­ zen handeln, die zwar das apoptotische Signal empfangen, aber nicht mehr kaskadenartig weiterleiten können. Derarti­ ge erfindungsgemäße DN-Sequenzen sind geeignet, nach ent­ sprechender Transfektion Wirtszellen gegen die Apoptose oder zumindest gegen gewisse apoptotische Ereignisse zu schützen und die hiermit transfizierten Zellen unsterblich zu machen. Verwendungen derartiger apoptoseimmuner oder tw. apoptoseimmuner Wirtszellen ergeben sich bspw. im Rahmen der Gentherapie bei Erkrankungen, die ätiologisch durch fehlgesteuerten Untergang von Zellen (oder Geweben) hervor­ gerufen werden, zumindest von pathologischem Zelluntergang begleitet werden oder massenhaften pathologischen Zelltod als Symptom aufweisen (Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, virale Erkrankungen, bspw. HIV-Infektionen). Je nach Indi­ kation werden die Wirtszellen allein mit erfindungsgemäßen DN-Mutanten transfiziert oder zumindest cotransfiziert, d. h. auch mit mindestens einem weiteren therapeutischen Gen auf demselben oder mindestens einem weiteren Vektor trans­ fiziert. Ganz allgemein eignet sich damit die Transfektion von Wirtszellen mit einer erfindungsgemäßen DN-DNA-Sequenz zur positiven Selektion von entsprechend transfizierten Wirtszellen.

Die Wirtszellinien werden durch die vorgenannten Methoden gegenüber einer Vielzahl von apoptotischen Stimulanzien re­ sistent. Bei den in vitro mit den erfindungsgemäßen Expres­ sionsvektoren manipulierten Zellen handelt es sich vorzugs­ weise um solche Zellen, die im Organismus einer Fehlsteue­ rung der Apoptose anheimgefallen sind und durch erfindungs­ gemäße transformierte Zellen nunmehr nach Transplantation regeneriert werden können. Insbesondere werden in einem solchen gentherapeutischen Ansatz erfindungsgemäße Sequen­ zen eingesetzt, die als doppelt-negative Mutanten das apop­ totische Geschehen blockieren.

Mit dem vorliegenden Erfindungsgedanken geht aber auch ein gentherapeutisches Verfahren, das in vivo durchgeführt werden kann, einher. Zu diesem Zwecke werden Vektoren einge­ setzt (z. B. Liposomen, Adenoviren, Retroviren oder ähnliche oder auch nackte DNA), die die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen gezielt in die gewünschten Zielzellen des Orga­ nismus insertieren. Bei den Zielzellen handelt es sich ty­ pischerweise um Zellen, deren Tod-/Überlebenshomöostase ge­ stört ist, insbesondere um Zellen, die pathologisch eine verstärkte Disposition zur Apoptose zeigen (bspw. bei Dia­ betes mellitus, Morbus Parkinson, Autoimmunerkrankungen). In diesem Zusammenhang können Fragmente einer erfindungsge­ mäßen DNA-Sequenz zum Einsatz kommen, die inhibitorische Wirkung entfalten, bspw. DN-DNA-Sequenzen, die biologische Signale im wesentlichen nicht mehr weitergeben können - al­ so keine weitere biologische bzw. apoptosetransduzierende Funktionalität aufweisen.

Vektoren, die die Apoptose durch Expression erfindungsgemä­ ßer Sequenzen induzieren können, kommen aber auch bei in vivo Gentherapie-Verfahren als Arzneimittel in Betracht. Insbesondere wird die Verwendung derartiger viraler oder liposomaler Vektoren zur Behandlung von Tumorerkrankungen offenbart. Aber auch nackte erfindungsgemäße DNA kann dies­ bezüglich als Arzneimittel eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz (Allele, Derivate, Fragmente) oder eines erfindungsgemä­ ßen Genprodukts zur Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Signaltransduktion beru­ hen (Anspruch 16). Die vorgenannte erfindungsgemäße Ver­ wendung von DNA-Sequenzen schließt auch die Verwendung von oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionsvek­ toren ein, die eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, bspw. eine in Fig. 9 offenbarte Nukleotidsequenz oder ein funktionelles Derivat, Fragment, Analogon oder Allel ei­ ner solchen Sequenz (oder auch ein infunktionelles Deri­ vat einer solchen Sequenz, bspw. eine DN-Mutante) aufwei­ sen, mit dem Ziel, die fehlgeleitete intrazelluläre Si­ gnaltransduktion zu korrigieren. Die Verwendung kann nach nach gentherapeutischen Verfahren über Injektion von nackter erfindungsgemäßer DNA oder dem Protein oder über Genfähren, insbesondere virale oder liposomale Vektoren, erfolgen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind da­ her auch sowohl die Verwendung derartiger erfindungsgemä­ ßer DNA-Sequenzen, Genprodukte, Expressionsvektoren sowie die Verwendung von erfindungsgemäßen Zellen, die mit er­ findungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert sind, als Arzneimittel.

Erfindungsgemäße Polypeptide, Expressionsvektoren oder DNA- Sequenzen bzw. deren jeweilige Derivate, Analoge oder Frag­ mente können verschiedenen Verwendungszwecken dienen, bspw. die Apoptosereaktion verstärken, wenn ein solcher Effekt erwünscht ist, bspw. bei anti-Tumor-, anti-Entzündungs oder anti-HIV-Anwendungen. Bevorzugt ist dabei die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder eines erfin­ dungsgemäßen Genprodukts, wenn es sich bei der Erkrankung um eine solche mit einer fehlgesteuerten Zellapoptose, insbesondere um eine Apoptosedefizienz bestimmter Zellen in einem multizellulären Organismus, handelt (Anspruch 17). Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung einer solchen DNA-Sequenz oder eines solchen Genprodukts zur Behandlung (zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be­ handlung) von Tumorerkrankungen oder auch zur Bekämpfung einer überschießenden Immunantwort bei Autoimmunerkran­ kungen (Anspruch 18). Zu nennen wäre insbesondere die Be­ handlung von soliden Tumoren, bspw. von Tumoren des Epit­ helgewebes (bspw. Darm, Lunge), Gehirntumoren (bspw. Gli­ oblastom, Astrozytom), Sarkomen, Tumoren des Immunsy­ stems, und auch Leukämien, insbesondere der akuten mye­ loischen oder der chronisch myeloischen Leukämie.

Um die erfindungsgemäßen Proteine bzw. DNA-Sequenzen in die ZU behandelnden Patientenzellen zu schleusen kann bspw. ein rekombinates Tiervirus eingesetzt werden (bspw. abstammend von Vaccinia), wobei mindestens zwei Gene hin­ zugefügt werden. Zum einen ein Gen für einen Liganden, der an einen Rezeptor auf der Zielzelle bindet (bspw. gp120 für CD4-tragende Lymphozyten) und zum anderen die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zur Auslösung oder Verstär­ kung des Zelltods.

Andererseits können Derivate oder Fragmente erfindungsge­ mäßer Sequenzen, die in bezug auf die Weiterleitung des apoptotischen Signals infunktionell sind, auch als Arz­ neimittel eingesetzt werden, bspw. DN-Mutanten erfin­ dungsgemäßer Sequenzen. Sie dienen insbesondere zur Be­ handlung von degenerativen Erkrankungen, bspw. neurodege­ nerativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, oder In­ fektionserkrankungen. Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden also Verbindungen zur Ver­ fügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet, daß sie die Funktion der erfindungsgemäßen Genprodukte (Proteine) als intrazelluläres Signalmolekül einer apoptotischen Signal­ kaskade zur Auslösung des Zelltods modulieren, insbeson­ dere inhibieren (Anspruch 19). Insbesondere blockieren erfindungsgemäße Verbindungen die spezifische durch Bcl- Rambo vermittelte Aktivierung der Caspase-3 (Anspruch 20). Bevorzugt handelt es sich bei einer erfindungsgemä­ ßen chemischen Verbindung, die die Apoptose blockiert, um ein Oligo- oder Polypeptid (s. o. zur DN-Mutante), das chemisch modifiziert (bspw. zur erleichterten Passage durch die Zellmembran, insbesondere durch endständige (vor allem N-terminale) Sequenzbereiche) sein kann oder auch nicht modifiziert sein kann. Ggf. kann ein derarti­ ges Oligo- oder Polypeptid auch dadurch chemisch modifi­ ziert sein, daß die amidartige Bindung zwischen den ein­ zelnen Aminosäuren durch eine gegen proteolytischen Abbau resistente alternative chemische Gruppe (bspw. Schwefel- oder Phosphorbrücken) ersetzt wird.

Eine Inhibition der Apoptose, wie sie bspw. beim septi­ schen Schock, GvHD oder akuter Hepatitis erwünscht ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fachmann geläufige Verfahren Oligonukleotide, die für einen Anti­ sense-Strang der nativen Bcl-Rambo-Sequenz oder eines an­ deren nativen Proteins mit einer BHNo-Domäne codieren, in die betroffenen Zellen einzuschleusen. Hierdurch wird die in den entsprechend transformierten Zellen die Translati­ on der nativen mRNA von bspw. Bcl-Rambo blockiert, was im Ergebnis die Überlebensfähigkeit der transfizierten Zelle steigert. Auch in diesem Fall kan das oben beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinater Viren eingesetzt werden. Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose bei Er­ krankungen, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung beruhen, kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert wer­ den. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribo­ zyme offenbart, die native Bcl-Rambo-mRNA oder die mRNA anderer BHNo-Domänen enthaltender Proteine spalten kön­ nen. Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der er­ findungsgemäßen Ziel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. Bcl-Rambo zu blockieren. Die erfin­ dungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifi­ zierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist vorzugs­ weise eine organisch-chemische Verbindung mit einem Mole­ kulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor allem < 1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträg­ lich und kann vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passie­ ren (Anspruch 21). Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusam­ mensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevor­ zugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bin­ dungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die Domäne BHNo eines erfin­ dungsgemäßen Proteins, mindestens 10⁷ mol^-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaf­ fen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine (Anspruch 22), ggf. nach entsprechender Modifikati­ on, bspw. mit einer angekoppelten AS-Sequenz.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorlie­ genden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen die BHNo-Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch genthe­ rapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen einge­ schleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße "Intrabodies" sind die Zellen vor einer apoptotischen Reaktion geschützt. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zeigen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Ke­ ratinozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskelzellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vor­ liegenden Erfindung.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß als Inhibitoren der durch Bcl-Rambo vermittelten Apoptose insbesondere die Substanzklasse der sogenannten IAPs wirkt. Neben c- IAP-1 und c-IAP2 sind insbesondere die xIAPs als starke Inhibitoren hervorzuheben. In diesem Zusammenhang wird die Druckschrift von Deveraux und Reed ((1999), Genes Dev. 13(3), 239-252) explizit vollinhaltlich in die Of­ fenbarung des vorliegenden Erfindungsgegenstands einbezo­ gen.

Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung mit der Funk­ tion der Blockade der bspw. apoptotischen Funktion von erfindungsgemäßen physiologischen Proteinen kann als Arz­ neimittel Verwendung finden. Insbesondere ist eine erfin­ dungsgemäße chemische Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die zumindest tw. eine pathologische hyperapoptotischen Reak­ tion kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (bspw. ein Intrabody), ein Ribozym, anti-sense RNA, dominant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten inhibitorischen organischen Verbindungen) der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen Proteins, also bspw. der apoptotischen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Er­ krankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, vi­ rale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankun­ gen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz) oder akuter Hepatitis (Anspruch 25). Die vorgenannten apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäßen Substanzen kön­ nen auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammenset­ zung sein, die weitere pharmazeutische Träger-Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusam­ mensetzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die biologische Verfügbarkeit und/oder die Pharmakodynamik zu verbessern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von Verbindungen mit inhibitorischen Eigenschaften in Hin­ blick auf die Auslösung oder Weiterleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftretende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelöste apoptotischen Reaktionen in Zusam­ menhang stehen. Erfindungsgemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für das Protein Bcl-Rambo codiert, ggf. mindestens einem Expressionsvek­ tor, der für mindestens einen Apoptoseinhibitor codiert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reportergen codiert, transfiziert werden, und (b) ein zur Beobachtung der Bcl-Rambo vermittelten Apop­ tose geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Ver­ gleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird (Anspruch 23). Hierzu werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere parallele Versuche mit an­ steigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer die Apoptose inhibierenden Wirkung der Testsubstanz deren ID₅₀-Wert bestimmen zu können. Bevor­ zugt ist ein erfindungsgemäßes "Screening-Verfahren" dann, wenn der zur Transfektion eingesetzte Apoptoseinhi­ bitor FLIP, CrmA, DN-FADD und/oder DN-Caspase-9 und das Reportergen bspw. β-Galaktosidase ist (Anspruch 24).

Ein erfindungsgemäßes "Screening"-Verfahren kann auch mit Hilfe von sogenannten "Proteomics"-Techniken durchgeführt werden. Hierzu werden zur Bestimmung eines Standards ty­ pische Unterschiede im Expressionsmuster von Zellen mit apoptotischer Reaktion und Kontrollzellen experimentell erhoben. Methodisch wird für ein derartiges Verfahren ty­ pischerweise die 2D-Gelelektrophorese eingesetzt.

Erfindungsgemäße Sequenzen können auch in Verfahren ein­ gesetzt werden, die die Identifizierung von zellulären Interaktionspartnern des Proteins Bcl-Rambo zum Ziel ha­ ben. Ein derartiges Verfahren kann bspw. mit der sog. "Yeast-two-hybrid"-Methode durchgeführt werden, die dem Fachmann geläufig ist (Anspruch 26) oder über affinität­ schromatographische Verfahren. Damit wird auch die Ver­ wendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder eines Genprodukts einer derartigen erfindungsgemäßen Sequenz zur Identifizierung von weiteren an der apoptotischen Si­ gnaltransduktion beteiligten Proteinen offenbart (Anspruch 27). Im Rahmen der Affinitätschromatographie werden erfindungsgemäße AS-Sequenzen oder deren Derivate, Analoge, Fragmente oder Allele an eine Matrix gekoppelt, mit bspw. Zellextrakten in Kontakt gebracht und nach ei­ nem Waschschritt erfolgt die Eluierung mit nachfolgender Charakterisierung der eluierten Komplexe.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert:

Fig. 1 stellt einen Vergleich der Sequenzen des erfin­ dungsgemäßen Proteins Bcl-Rambo mit anti-apoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie dar. Hierzu gehören die huma­ nen Sequenzen des Proteins Bcl-2, des humanen Proteins Bcl-XL und des humanen Proteins Bcl-w. Ebenso wie die vorgenannten Proteine der Bcl-2-Familie weist auch die erfindunsgemäße humane Sequenz von Bcl-Rambo die charak­ teristischen Sequenzabschnitte BH1, BH2, BH3 und BH4 so­ wie eine Transmembranregion (MA) auf. Die vorgenannten Sequenzabschnitte sind in Fig. 1 umrandet. Identische Aminosäuren in den vier Sequenzen sind schwarz, ähnliche Aminosäuren sind grau unterlegt. Aus Fig. 1a wird deut­ lich, daß bei der humanen Sequenz von Bcl-Rambo C- terminal von der BH2-Region ein mehr als 200 Aminosäuren umfassender Sequenzabschnitt eingefügt ist, gefolgt von einer C-terminalen Ankerregion. Dieser erfindungsgemäß als BHNo-Domäne bezeichnete Abschnitt enthält sog. Re­ peats (Repeat A, Repeat B), die, wie in Fig. 1B darge­ stellt, jeweils eine mindestens 80%ige Identität aufwei­ sen. Fig. 1B vergleicht die Sequenzen der beiden als "Repeat A" bezeichneten Regionen und der beiden als "Repeat B" bezeichneten Regionen, die im C-terminalen Be­ reich von Bcl-Rambo auftreten.

Fig. 1C stellt die Exon-Intron-Organisation des humanen Bcl-Rambo-Gens dar. Das Gen umfaßt 6 Exons (durchnumeriert von I bis VI, jeweils getrennt durch Intron-Sequenzen). ExonI ist durch 27,4 kb von ExonII, ExonII durch 5,7 kb von ExonIII, ExonIII durch 7,4 kb von ExonIV, ExonIV durch 6 kb von ExonV und schließlich ExonV durch 24,3 kb von ExonVI getrennt. In Fig. 1c sind wei­ terhin die Regionen BH1, BH2, BH3 und BH4 in ihrer Lage auf den entsprechenden Exons dargestellt. Die erfindungs­ gemäße als BHNo-Domäne bezeichnete Aminosäuresequenzab­ schnitt ist auf ExonVI zwischen dem C-terminalen Bereich des BH2-Motivs und der Transmembranregion positioniert. Grau unterlegt sind die nicht-codierenden Regionen, abge­ grenzt von den codierenden Regionen durch das Start-Codon ATG und das Stop-Codon TAG (Position durch Pfeile mar­ kiert).

Fig. 2A stellt Northern Blots verschiedener humaner Gewe­ be dar. Diese wurden ³²P-markierten cDNA-Fragmenten des N- terminalen Teils von Bcl-Rambo ausgesetzt. Bei den Gewe­ ben handelt es sich um Herz-, Hirn-, Plazenta-, Lungen-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren- und Pankreasgewebe. Diese "Northern Blot"-Auftragung ergibt, daß ein Bcl-Rambo- Transkript von 4,1 kb Länge in allen untersuchten Geweben enthalten ist. Die höchsten mRNA-Expressionswerte wurden im Herz-, Pankreas- und Plazentagewebe ermittelt. Zwei deutlich schwächere Banden von 2,1 kb und 1,2 kb Länge entsprechen alternativen Spliceformen von humanem Bcl- Rambo. Untersuchungen wie in Fig. 2A wurden auch für ver­ schiedene Tumorzellinien, nämlich HL60, Hela, K562, MOLT- 4, Raji, SW480, A549 und G361 durchgeführt. In allen Zel­ linien wurde das 4,1 kb Transkript (also die mRNA von Bcl-Rambo) detektiert.

In Übereinstimmung hiermit stehen die Western-Blot- Untersuchungen, die die Expression von Bcl-Rambo-Protein in verschiedenen humanen und murinen Zellen (abgekürzt mit mu) darstellen. In allen untersuchten humanen Zelli­ nien finden sich Banden für ein 85 kD Protein, das mit Hilfe von affinitätsgereinigtem Antikörper (AL167), der gegen die Bcl-2-Homologieregion von Bcl-Rambo (Aminosäuren 1-223) gerichtet ist, detektiert wurde. Im einzelnen wurden Western-Blot-Auftragungen für Jurkat- Zellen, murine EL4-Zellen (Leukämie T-Zellen), A20- Zellen, Raji-Zellen, Ramos-Zellen, Bjab-Zellen, Raw- Zellen (Lymphoma-B-Zellen), THP-1-Zellen, U937-Zellen, K562-Zellen (Monozyten-Zellinien), HeLa-Zellen (Cervix- Karzinomzellen), HEK293-Zellen, und 293-T-Zellen (embryonische Nierenzellinien), untersucht.

Um zu überprüfen, ob die 85 kD Banden in den Western- Blot-Auftragungen gemäß Fig. 2C dem Bcl-Rambo Protein entsprechen, wurden 293T-Zellen mit verschiedenen Flag­ markierten Bcl-Rambo-Expressionsplasmiden transfiziert. Hierbei wurden Expressionsplasmide eingesetzt, die (a) die humane Sequenz von Bcl-Rambo in Vollänge (Aminosäuren 1-485), (b) die Bcl-2-Homologie-Domäne (Aminosäuren 1-223 des humanen Bcl-Rambo-Proteins), und (c) schließlich die C-terminale Region von Bcl-Rambo, einschließlich der BHNo-Domäne (Aminosäuren 205-485 des humanen Bcl-Rambo- Proteins), exprimiert. Diese Zellextrakte wurden mit Hil­ fe von anti-Flag-Antikörper M2 untersucht, wie in der linken Auftragung von Fig. 2D dargestellt, und mit poly­ klonalem Antikörper gegen Bcl-Rambo (wie in der rechten Darstellung aufgetragen) behandelt. Hierbei zeigte sich, daß das humane Bcl-Rambo-Protein in Vollänge ein Moleku­ largewicht von ca. 85 kD aufweist, die N-terminale Bcl-2- Homologiedomäne von Bcl-Rambo bei ca. 28 kD detektiert wird und die charakteristische C-terminale Domäne (AS 205-485) ein überraschend hohes Molekulargewicht von un­ gefähr 52 kD aufweist.

Fig. 3 zeigt die subzelluläre Lokalisierung des Bcl- Rambo-Proteins, die mit Hilfe von konfokaler Lasermikro­ skopie ermittelt wurde. Hierzu wurden HeLa-Zellen mit Ex­ pressionsplasmiden, die die Sequenz für das Bcl-Rambo Protein in voller Länge, also die Aminosäuren 1-485, einerseits oder andererseits für das Bcl-Rambo-Protein ohne die C-terminale Transmembrandomäne, also nur die Aminosäuren 1-459 (abgekürzt mit ΔMA), enthalten, transfiziert. Die Bestimmung der Lokalisierung erfolgte 48 Stunden nach der Transfektion, wobei hierzu anti-Bcl- Rambo-Antikörper Al167 eingesetzt wurde. Vor dem Fixie­ rungsschritt wurden die transfizierten Zellen mit Mi­ totracker inkubiert. Dargestellt ist (a) die Überlagerung von Bcl-Rambo-Fluoreszenz (grün) und Mitotracker (rot) in gelb, (b) Mitotracker allein, (c) die Lokalisierung von anti-Bcl-Rambo-Antikörper allein und (d) schließlich die Photographie in der Phasenkontrast-Darstellung. Hierbei zeigt sich, daß das Bcl-Rambo-Protein im wesentlichen im Cytosol lokalisiert ist und dort in intrazellulären Orga­ nellen lokalisiert ist, wie es auch für andere Proteine der Bcl-2-Familie typisch ist. Vergleichbare Untersuchun­ gen mit transfizierten 293T-Zellen ergaben identische Re­ sultate, die in Fig. 3 nicht abgebildet sind. Die vorlie­ genden Co-Lokalisierungsuntersuchungen machen deutlich, daß das Bcl-Rambo-Protein im wesentlichen mit Mitotracker in den Mitochondrien co-lokalisiert ist. Die Untersuchun­ gen von ΔMA, also dem Bcl-Rambo-Protein ohne die C- terminale Membranankerregion, läßt erkennen, daß in die­ sem Fall die Markierung des Proteins im Cytoplasma ver­ schwunden ist und eine diffuse nukleäre Lokalisierung dieses Polypeptids festzustellen ist. Hieraus ist zu schließen, daß die offenbar vorwiegend mitochondriale Lo­ kalisierung von Bcl-Rambo-Protein durch seinen hydropho­ ben C-terminalen Anker vorgegeben ist, wie bereits für andere Proteine der Bcl-2-Familie in Hinblick auf dessen Bedeutung für die subzelluläre Verteilung beschrieben.

Fig. 4 stellt die Ergebnisse von Experimenten zur Frage der Interaktion von Bcl-Rambo-Protein mit verschiedenen anti- und pro-apoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie dar, wobei hierbei wiederum entsprechend transfizierte und Bcl-Rambo überexprimierende 293T-Zellen verwendet wurden. Hierzu wurden 293T-Zellen transient mit Flag­ markiertem Bcl-Rambo-Protein sowie entweder mit einem Flag-markierten, anti-apoptotischen Protein der Bcl-2- Familie (Fig. 4A) oder einem EE-markierten, pro­ apoptotischen Bcl-2 in Gegenwart von Caspase-Inhibitor z- VAD-fmk (Fig. 4B) transfiziert. Postnukleäre Lysate dieser Zellen wurden mit Hilfe von anti-Flag-M2-Agarose im­ munopräzipitiert und mit anti-EE-Antikörper geblottet. Eine Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen Bcl-Rambo und den pro-apoptotischen Proteinen Bax, Bak, Bik, Bid, Bim, Bad und Bcl-Rambo konnte hierbei nicht detektiert werden (Fig. 4A). Resultate entsprechender Experimente sind in Fig. 4B dargestellt, wobei in diesen Experimenten HA-markiertes Bcl-Rambo gemeinsam mit einem anti- apoptotischen Flag-markierten Protein der Bcl-2-Familie in 293T-zellen transfiziert wurden. Auch in diesem Fall ist erkennbar, daß keine Interaktionen zwischen Bcl-Rambo und den anti-apoptotischen Proteinen (Bcl-2, Bcl-X_L, Bcl- w, A1, MCL-1, EIB-19K, BHRF1) detektiert werden konnte.

Um zu zeigen, daß das Ausbleiben der Interaktionen zwi­ schen Bcl-Rambo und pro-apoptotischen Proteinen der Bcl2- Familie nicht auf einer erhöhten Zelltodrate der transfi­ zierten Zellen beruht, wurden die Experimente in Gegen­ wart des Caspase-Inhibitors z-VAD-fmk wiederholt. Dieser Inhibitor unterdrückt als Pan-Caspase-Inhibitor apoptoti­ sche Ereignisse. Auch in diesem Fall konnte das Ergebnis aus Fig. 4A reproduziert werden, so daß die fehlende In­ teraktion zwischen Bcl-Rambo und den untersuchten Protei­ nen nicht auf einem systematischen Fehler beruht. Gemäß Fig. 4B wurden die Wechselwirkung zwischen Bcl-Rambo und verschiedenen anti-apoptotischen Protein der Bcl2- Familie, nämlich Bcl-2, Bcl-x_L Bcl-w, A1, Mcl-1, EIB19K, Bhrf1, untersucht und gleichfalls konnten keine Interak­ tionen beobachtet werden. Ohne in Fig. 4B dargestellt zu sein, konnte gleichfalls gezeigt werden, daß Bcl-Rambo auch dann nicht mit anderen Proteinen der Bcl-2-Familie interagiert, wenn Bcl-Rambo nur in einer verkürzten Ver­ sion, nämlich mit den Aminosäuren 1-223, also aus­ schließlich mit der Bcl-2-Homologieregion exprimiert wird. Gleichfalls sind für Bcl-Rambo keine Homodimere de­ tektierbar.

Fig. 4C stellt das Resultat eines Kontrollexperiments dar, wobei 293T-Zellen mit Flagmarkiertem Bcl-X_L und EE- markiertem Bax, Bak, Bik, Bid, Bim oder Bad in Gegenwart von zVAD-fmk für die Dauer von 22 Stunden transfiziert wurde. Die postnukleären Lysate wurden mit anti-FlagM2- Agarose immunopräzipitiert und mit anti-EE-Antikörpern geblottet. Der Western Blot (Fig. 4C obere Darstellung, zeigt - im Unterschied zu den Western Blots in den Fig. 4A und 4B Banden, die die Protein-Protein- Wechselwirkung zwischen Bcl-X_L und den vorgenannten EE markierten Proteinen widerspiegeln. Dies bedeutet, daß eine Wechselwirkung zwischen den vorgenannten sog. BH3- only-Proteinen und Bcl-X_L auftritt.

Fig. 5 beschreibt die von Bcl-Rambo induzierte Apoptose, die durch die C-terminale Domäne von Bcl-Rambo ausgelöst wird. Hierzu wurden 293T-Zellen mit 2 µg verschiedener Bcl-Rambo-Konstrukte, nämlich Scheintransfektanten, Voll­ längen-Bcl-Rambo (Aminosäuren 1-485), Bcl-Rambo ohne die C-terminale Ankerdomäne (Aminosäuren 1-459), die N- terminale Bcl-2-Homologie-Domäne (Aminosäuren 1-223), die C-terminale Domäne mit der BHNo-Region (Aminosäuren 205-485), die C-terminale Domäne ohne die Ankerregion (Aminosäuren 205-459) und schließlich eine verkürzte N- terminale Domäne (Aminosäuren 1-201) transfiziert. Alle vorbezeichneten Konstrukte sind in Fig. 5 (rechte Dar­ stellung) schematisch dargestellt, wobei jeweils die BH- Regionen (BH4 (4), BH3 (3), BH1 (1), BH2 (2)) sowie, falls vorhanden, die "Tandern-Repeats" bzw. die Ankerre­ gionen (MA) schematisch eingezeichnet sind. Die Transfek­ tion erfolgte gemeinsam mit 0,2 µg eines EGFP- Expressionsvektors, nämlich pEGFP-C1, für die Dauer von 42 Stunden. In der linken oberen Darstellung von Fig. 5 ist die Aktivität der Caspase-3 (als x-faches der Induk­ tion) aufgetragen. Unter Berücksichtigung der Fluoreszen­ zintensität von transfiziertem EGFP wurde die Aktivität für die einzelnen Versuchsansätze normalisiert, d. h. die Co-Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor diente der Überprüfung der Transfektionsrate zur Sicherstellung vergleichbarer Ergebnisse in den verschiedenen Versuchsan­ sätzen. Ein deutlicher pro-apoptotischer Effekt von Vol­ längen-Bcl-Rambo ist nachweisbar (ca. 70fache Erhöhung der Caspase-3-Aktivität mit nachfolgendem Zelltod), wobei aus dem Vergleich mit der Wirkung der Scheintransfektante erkennbar ist, daß der pro-apoptotische Effekt von Bcl- Rambo spezifisch ist. Die Scheintransfektante beeinträch­ tigt nämlich das Überleben der Zelle nicht.

Hingegen hat die Überexpression von Bcl-Rambo-Protein, das für die N-terminale Bcl-2-Homologieregion codiert, nämlich der Konstrukte mit den Aminosäuren 1-223 oder 1 -203, keinen Effekt auf die Zellüberlebensrate. Die Ex­ pression der C-terminalen BHNo-Domäne (Aminosäuren 205- 459) ergaben demgegenüber eine sogar noch stärker erhöhte Caspse-3-Aktivierung (ca. 80fache Erhöhung) gegenüber dem Bcl-Rambo-Protein in Vollänge, obwohl die Expressionsrate in beiden Versuchsansätzen identisch war. Aus den Ergeb­ nissen der in Fig. 5 dargestellten Versuche ergibt sich, daß die BHNo-Domäne (und nicht etwa die Bcl-2- Homologiedomäne) für die Auslösung des Zelltods bei Überexpression von Bcl-Rambo verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig muß auch die C-terminale Transmembranregion vorhanden sein, da das Konstrukt 205-459 (also die C- terminale Domäne ohne die Ankerregion) den Zelltod über eine Aktivierung der Caspase-3 nicht mehr hervorrufen konnte. Die Stärke der Expression der einzelnen Konstruk­ te in den transfizierten Zellen wurde für alle Zellex­ trakte durch "Western Blot"-Analyse unter Zuhilfenahme von anti-Flag-Antikörper M2 überprüft (Fig. 5 untere Dar­ stellung, links).

In Fig. 6 wird die Wirkung verschiedener Apoptose­ inhibitoren auf die apoptotische Aktivität von Bcl-Rambo untersucht. Hierzu wurden (in Fig. 6A) 293T-Zellen mit 2 µg Bcl-Rambo Expressionsplasmid und 0,5 µg von Expressi­ onsvektoren, die für verschiedene Inhibitoren der Apopto­ se codieren, gemeinsam mit 0,5 µg β-Galactosidase- Expressionsvektor für die Dauer von 27 Stunden transfiziert. Bei den Apoptoseinhibitoren wurden die folgenden Proteine gewählt: FLIP, CrmA, cIAP-1, cIAP-2, XIAP, DN-F- ADD, DN-Caspase9, Bcl-X_L sowie ein Vergleichsexperiment ohne Zugabe eines einen Apoptoseinhibitor exprimierenden Vektors ("none"). Aufgetragen findet sich die Erhöhung der Caspase-3-Aktivität (als Vielfaches, normalisiert nach Maßgabe der gleichfalls gemessenen β-Galactosidase- Aktivität, weswegen die einzelnen Versuchsansätze ver­ gleichbar sind. Die Ergebnisse in Fig. 6 zeigen, daß die Co-Expression von cFLIP, einer dominant negativen Form von FADD, CrmA, Bcl-Cl und einer dominant negativen Form der Caspase-9 entweder nicht oder nur marginal den durch Bcl-Rambo indizierten Zelltod blockieren können. Gleich­ wohl, in Fig. 6 nicht dargestellt, ist der Bcl-Rambo in­ duzierte Zelltod Caspase-abhängig, da er vollständig durch den Pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk unterdrückt werden kann. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, daß der Bcl-Rambo induzierte Zelltod unabhängig von einem To­ desrezeptor bzw. dem apoptotischen Cytochrom C-Apafl- Caspase-9-Signalweg verläuft. In Fig. 6A kann ebenfalls beobachtet werden, daß ein inhibitorischer Effekt sich nach Co-Expression von xIAPs ergibt und auch die Apopto­ seinhibitoren c-IAP1 und c-IAP2 inhibitorische Wirkung zeigen. Für die Apoptose-Inhibitoren der IAP-Familie konnte bereits früher nachgewiesen werden, daß sie an die Caspasen-3 bzw. -6 und in geringerem Maß an die Caspase- 9, aber nicht an die Caspasen 1, 6, 8 oder 10 binden und diese inaktivieren.

Gemäß den in Fig. 6B dargestellten Resultaten verhalten sich die Apoptose-Inhibitoren gegenüber der Expression von transfiziertem C-terminalen Bcl-Rambo, das für die BHNo-Domäne und die Membranankerdomäne (Aminosäuren 205- 485) codiert, genauso wie für das Vollängenprotein (s. Fig. 6A).

Fig. 7 stellt die Aminosäuresequenz der C-terminalen Do­ mäne von humanem Bcl-Rambo dar, die auch die BHNo-Domäne enthält. Es handelt sich um den Sequenzabschnitt zwischen Aminosäure 205 und Aminosäure 485 des Vollängenproteins von humanen Bcl-Rambo.

Fig. 8 zeigt die Vollängen-Aminosäuresequenz von Bcl- Rambo, einem 485 Aminosäuren umfassenden Protein. Die cDNA-Sequenz von humanem Bcl-Rambo in der Langform mit allen Exons (I-VI) ist in Fig. 9 dargestellt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:

1. Ausführungsbeispiel Die Identifizierung der Sequenz von Bcl-Ranbo

Mit Hilfe einer Datenbanksuche und einer Profilierung der Recherche mit einem spezifischen Suchmuster wurde der EST Klon T48205 identifiziert, der - wie sich später heraus­ stellen sollte - für eine kurze Splice-Variante von huma­ nem Bcl-Rambo codiert. Diese Splice-Variante weist nach Transfektion die N-terminalen Aminosäuren 1-200 des später identifizierten insgesamt 485 Aminosäuren umfas­ senden Proteins Bcl-Rambo auf. Ein weiterer EST-Klon (AA190545) konnte identifiziert werden, der den Bereich der C-terminalen Aminosäuren 255 bis 485 des Vollängen­ proteins Bcl-Rambo entspricht. Daraufhin wurde eine cDNA- Bibliothek verwendet, um fehlende weitere Abschnitte des Bcl-Rambo Proteins zu amplifizieren. Wie sich später her­ ausstellen sollte, handelte es sich um den Bereich der Aminosäuren 201-254 von Bcl-Rambo. Der fehlende Bereich wurde unter Zuhilfenahme vom 5'-Vorwärts-Primer JT1108 (5'-CCT TCA CCA GCA CAG GCT TTG ACC G-3') und des 3'- Rückwärts-Primers JT1109 (5'GGA CCA CCT CCT CCA CTT CAG TAG G-3') amplifiziert. Das sich hieraus ergebende PCR- Produkt wurde in einer gegen den Uhrzeigersinn weisenden Richtung des PCR-Blunt Vektors cloniert (von Invitrogen). Das durch die Schnittstellen für Not1 und BamH1 vorgegebene Fragment wurde dann in die entsprechenden Not1- und BamH1-Restriktionsschnittstellen des EST-Klons AA190545 insertiert, wobei sich hierdurch ein Fragment von Bcl-Rambo ergab, das - wie sich später herausstellte - den Aminosäuren 78-485 entsprach. Doppel-PCR-Methoden wurden durchgeführt, um zum Vollängen-Bcl-Rambo-Protein zu gelangen. Hierzu wurden 2 DNA-Fragmente aus dem Plas­ mid, das das Bcl-Rambo-Fragment (Aminosäuren 78-485) trägt, unter Zuhilfenahme von 5'-Primer JT1145 (5'-CAT ACC TCG AGG ACT ATT C-3') und vom 3'-Primer (flankiert von der Not1-Schnittstelle) JT1144 (5'-TAG CGG CCG CCT ATT TCT TTC TCA G-3') einerseits und dem EST-Klon T48205 unter Zuhilfenahme des 5'-Primers (flankiert von der Eco- RI Schnittstelle) JT1143 (5'-AAA GAA TTC ATG GCG TCC TCT TCT AC-3') und des 3'-Primers JT1146 (5'-GAA TAG TCC TCG AGG TAT G-3') andererseits amplifiziert. Die beiden sich hieraus ergebenden DNA-Fragmente wurden vermischt und durch PCR-Methoden ohne Primer amplifiziert, gefolgt von einer Amplifizierung mit den Primern JT1143 und JT1144. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor PCR-Blunt kloniert und das EcoRI/NotI-Fragment wurde dann in eine modifi­ zierte Version des Vektors PCR3 (von Invitrogen) im Le­ seraster mit einer N-terminalen Flag-Sequenz oder einem HA-Peptid subklöniert.

2. Ausführungsbeispiel Funktionelle Analyse des Bcl-Rambo-Proteins (a) Plasmidkonstruktion für die funktionelle Analyse des Vollängenproteins Bcl-Rambo (Aminosäuren 1-485)

Hierzu wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, die Teilsequenzen des Vollängenproteins entsprechen.

• 1. Bcl-Rambo umfassend Aminosäuren 1-201 (Bcl-Rambo (1- 201)): Dieses Konstrukt wurde durch PCR-Methoden aus dem EST-Klon T48205 mit einem 5'-Vorwärts-Primer, der die EcoRI-Schnittstelle enthält, JT993 (5'-AAA GAA TTC ATG GCG TCC TCT-3') und dem 3'-Rückwärts-Primer, der eine NotI-Schnittstelle enthält, JT994 (5-TAG CGG CCG CTC ATA CCC AGC CAC C-3') amplifiziert und anschlie­ ßend in den PCR-Blunt-Vektor kloniert.
• 2. Die anderen Deletionsmutanten des Vollängenproteins von Bcl-Rambo wurden durch PCR-Amplifikation unter Zu­ hilfenahme des Vollängenproteins Bcl-Rambo als "Template" mit einem 5'-Vorwärts-Primer, flankiert von einer EcoRI-Schnittstelle, und einem 3'-Rückwärts- Primer, flankiert von einer NotI-Schnittstelle, wie folgt, konstruiert:
  • 1. 2.1 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 1-223 (Bcl- Rambo (1-223)): 5'-Primer JT1143 und 3'-Primer JT1244 (5'-AT AGC GGC CGC CTA GTC ATT GCT ATC TTC GT- 3'),
  • 2. 2.2 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 1-459 (Bcl-Rambo (1-459)): 5'-Primer JT1143 und 3'-Primer JT1245 (5'-AT AGC GGC CGC CTA AGA CTT GCC CTC AGA C-3');
  • 3. 2.3 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 205-485 (Bcl- Rambo (205-485)): 5'-Primer JT1251 (5'-AAA GAA TTC AGT CTT GAG TCA GAG G-3') und 3'-Primer JT1144;
  • 4. 2.4 Bcl-Rambo umfassend die Aminosäuren 205-459 (Bcl- Rambo 205-459)): 5'-Primer JT1251 und 3'-Primer JT1245.

Die EcoRI/NotI-Fragmente wurden in eine modifizierte Ver­ sion des PCR3-Vektors mit einem N-terminalen Flag-Epitop subkloniert.

(b)Zellinien

Die vorgenannten Konstrukte wurden zur Transformation von Zellinien verwendet, die so aufgezogen und kultiviert wurden, wie in der Druckschrift von Thome et al. ((1999) J. Biol. chem. 274(15), 9962-8) beschrieben. Die vorge­ nannte Druckschrift ist hinsichtlich ihrer experimentel­ len Beschreibung daher vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.

(c) Untersuchungen der transfizierten Zellen

• 1. "Western-Blotting"-Untersuchungen
  Zunächst wurden hierfür ungefähr 10⁶ 293T-Zellen pro 10 cm Kulturschale mit den jeweiligen Expressionsplasmiden mit Hilfe der Calciumphosphat/HEPES-Methode - wie bei Ausubel et al. ((1999) Introduction of DNA into Mammalian Cells. Current Protocols in Molecular Biology (Chanda, V. B. Ed.) 2.4 vols. John Wiley & Sons, Inc.) beschrieben - transfiziert. Die Methodenbeschreibung von Ausubel et al. ((1999) Introduction of DNA into Mammalian Cells. Current Protocols in Molecular Biology (Chanda, V. B. E.), 2.4 vols. John Wiley & Sons, Inc.) ist daher vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. 30 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und in einem vollständigen NP40-Lysepuffer auf Eis lysiert. Der NP40- Lysepuffer entspricht 1% Nonidet P-40-Lysepuffer mit 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und Proteaseinhibitor- Cocktail (Complete, von Boehringer Mannheim).
  Für die nachfolgende Immunopräzipitation wurden die post­ nukleären Lysate zunächst in bezug auf ihren Proteinan­ teil normalisiert (um die einzelnen Meßreihen vergleichen zu können), auf Sepharose 6B (von Sigma) für die Dauer von 2 Stunden bei 4°C vorgereinigt und dann erst der Im­ munopräzipitation mit anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen (von Sigma) für mindestens 2 Stunden bei 4°C auf einer rotie­ renden Scheibe der Immunopräzipitation unterzogen. Die Immunopräzipitate wurden zwei Mal mit Lysepuffer gewa­ schen, der 1% bzw. 0,05% NP-40 enthielt, und die gewa­ schenen Kügelchen ("beads") wurden in reduzierendem Probenpuffer vor der SDS-PAGE-Auftragung und dem nachfolgen­ den "Western Blotting" gekocht.
  Für die "Western Blotting"-Analyse wurden die jeweils mit entweder Flag-, HA- oder EE-Markern markierten, immuno­ präzipitierten Proteine durch anti-Flag-M2-Antikörper (von Sigma) (gerichtet gegen Flag-Markierungen), durch anti-VSV P5D4-Antikörper (von Sigma) (gerichtet gegen die HA-Markierung) oder durch anti-EE-Antikörper (von Euro­ gentec) (gerichtet gegen EE-markierte Proteine) detek­ tiert. Zur Bestimmung des zellulären (also endogenen) Bcl-Rambo-Proteinanteils wurden affinitätsgereinigte po­ lyklonale Kaninchen-Antikörper (AL167) in Zellysaten (50 µg) eingesetzt.
  AL167-Antikörper wurde in Kaninchen gegen rekombinantes Bcl-Rambo-Protein hergestellt, und zwar gerichtet gegen dessen N-terminalen Teil, umfassend die Aminosäuren 1- 223. Schließlich wurden der polyklonale Antikörper dann auf immobilisiertem Antigen affinitätsgereinigt, so wie es dem Fachmann nach dem Stand der Technik geläufig ist.
  Die Aminosäuren 1-223 stimnmen mit dem entsprechenden Abschnitt des humanen Bcl-Rambo-Proteins überein. Die "Western Blots" wurden dann mit Peroxidase gekoppeltem Ziegen-anti-Maus- oder -anti-Kaninchen-Sekundärantikörper entwickelt (von den Jackson ImmunoResearch Laboratorien).
• 2. Die "Northern Blots" (von Clontech) wurden durch Hy­ bridisierung nach Einsatz von zufallsbedingt markierten radioaktiven Proben in ExpressHyb-Puffer (von Clontech, Palo Alto, Kalifornien) nach ungefähr 3 Stunden erhalten, dann bei Raumtemperatur für die Dauer von 40 Minuten mit mehrmaligem Wechsel von 2 × SSC/0,1% SDS gewaschen, ge­ folgt von 0,1 × SSC/0,05% SDS für 40 Minuten bei 50°C.

(d) Untersuchungen zur Apoptose

293T-Zellen (3 × 10⁵ Zellen) wurden auf 60 mm Kulturscha­ len am Tag vor der Transfektion ausgesetzt und dann tran­ sient mit 2 µg Bcl-Rambo-Expressionsplasmiden und 0,2 µg EGFP-Expressionsvektor (pEGFP-C1, von Clontech) oder mit 0,5 µg pCMV-β-Galactosidase-Expressionsvektor co­ transfiziert. Die postnukleären Lysate wurden dann in Hinblick auf die Fluoreszenz-Intensität von EGFP, die Ga­ lactosidase-Aktivität und die Caspase-3-Aktivität unter­ sucht, indem ein Peptid-Substrat (Ac-DEVD-AMC, von Ale­ xis) verwendet wurde. Um die einzelnen Messungen verglei­ chen zu können, wurde die Caspase-3-Aktivität (gemessen als x-faches der Induktion) mit Hilfe der Fluoreszenzin­ tensität von EGFP bzw. der β-Galactosidase-Aktivität nor­ malisiert.

(e) Immunmarkierung und konfokale Laser-Rastermikroskopie ("Laser Scanning Microscopy")

Am Tag vor der Transfektion wurden HeLa-Zellen auf 20 ml Glasabdeckplättchen in 5,5 cm Kulturschalen mit einer Konfluenz von 10-20% ausplattiert. Die Zellen wurden am folgenden Tag mit Hilfe von Calciumphosphat/BES-Verfahren transfiziert und ungefähr 36 Stunden nach dem Beginn der Transfektion geerntet. Um eine mitochondriale Markierung sicherzustellen, wurden die Zellen für die Dauer von 30 Minuten in Gegenwart von 1 µM Mitotracker (von Molecular probes) in einem Kulturmedium inkubiert. Die Zellen auf Glasplättchen wurden dann zweimal mit kaltem PBS gewa­ schen, für 12 Minuten in 4%igem Paraformaldehyd bei Raum­ temperatur fixiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in PBS mit 0,1% Saponin (PBSS) über Nacht bei 4°C permea­ bilisiert. Die Glasplättchen wurden dann für die Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 5% Milch in PBSS (PBSSM) blockiert, mit primärem Antikörper AL167 (1 µg/ml) (anti-Bcl-Rambo-Antikörper) für eine Stunde bei Raumtem­ peratur markiert, 3 × mit PBSS gewaschen und mit Alexa- 488-markiertem (von Molecular probes) sekundären anti- Maus- oder anti-Kanichen-Antikörper, auf 1/100 in PBSSM für eine Stunde in der Dunkelheit verdünnt, markiert. Schließlich wurden die Glasplättchen dreimal mit PBS ge­ waschen und mit FluorSave-Reagenz (von Calbiochem) auf Mikroskop-Plättchen befestigt. Die konfokale Mikroskopie wurde auf einem Zeiss Axiovert 100 Mikroskop (Zeiss Laser Scanning Microscope 510) durchgeführt. Um Cy5-Fluorchrom detektieren zu können, wurde ein Helium-Laser bei 633 nm gefiltert. Dagegen wurde ein Argon-Laser bei 488 nm ein­ gesetzt, um den Alexa-Fluorchrom detektieren zu können. Standardbedingungen wurden hinsichtlich der Lochgröße für die Bildaufnahme gewählt, wobei jedes Bild ein Mittelwert aus 16 Durchläufen ist.

SEQUENCE LISTING

Claims (29)

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 codiert, ein­ schließlich aller funktionshomologen Derivate, Frag­ mente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Fig. 7 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid gemäß Fig. 8 codiert, ein­ schließlich aller funktionshomologen Derivate, Alle­ le oder Fragmente, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 9 ange­ gebene (c) DNA-Sequenz enthält.

5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit ei­ nem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine huma­ ne Zelle, ist.

8. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprü­ che 1 bis 4 codiert wird.

9. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.

10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 7 ange­ gebene Aminosäuresequenz enthält, einschließlich al­ ler funktionshomologen Allele, Fragmente oder Deri­ vate.

11. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epi­ top auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10 erkennt.

12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

13. Antikörper nach einem der Ansprüche 11 oder 12, da­ durch gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzab­ schnitt auf der BHNo-Domäne als Epitop gerichtet ist.

14. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten, die min­ destens eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7, ein­ schließlich aller funktionshomologen Fragmente, De­ rivate oder Allele dieser Sequenz, enthalten, da­ durch gekennzeichnet, daß Wirtszellen nach Anspruch 6 oder 7 unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden und das Genprodukt an­ schließend aus der Kultur aufgereinigt wird.

15. Verfahren zur Expression von Genprodukten, die min­ destens eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7, ein­ schließlich aller funktionshomologen Fragmente, De­ rivate oder Allele dieser Sequenz, enthalten, da­ durch gekennzeichnet, daß Wirtszellen mit einem Ex­ pressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert wer­ den.

16. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprü­ che 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstel­ lung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Erkran­ kungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Si­ gnaltransduktion beruhen.

17. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 16 zur Behandlung (bzw. zur Herstel­ lung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Erkran­ kungen, die auf fehlgesteuerter Zellapoptose, insbe­ sondere Apoptosedefizienz, beruhen.

18. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 16 oder 17 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Tumorerkrankungen.

19. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in­ trazelluläre Funktion von Bcl-Rambo moduliert, ins­ besondere inhibiert.

20. Verbindung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie die durch Bcl-Rambo vermittelte Aktivierung der Caspase-3 inhibiert.

21. Verbindung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbin­ dung mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 ist.

22. Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, da­ durch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.

23. Verfahren zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) ein geeignetes Wirtszellsystem mit einem Expressi­ onsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Ex­ pressionsvektor, der für das Protein Bcl-Rambo co­ diert, mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens einen Apoptoseinhibitor codiert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reportergen codiert, transfiziert wird, und
• b) ein zur Beobachtung der Bcl-Rambo vermittelten Apoptose geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer Test­ verbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Apoptoseinhibitor FLIP, CrmA, DN-FADD und/oder DN-Caspase-9 und das Reportergen β- Galaktosidase ist.

25. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 19 bis 22 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Ar­ neimittels zur Behandlung von) neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Demenz und Mor­ bus Parkinson, Muskeldystrophie, viralen Infekti­ onserkrankungen und Autoimmunerkrankungen.

26. Verfahren zur Identifizierung von zellulären Inter­ aktionspartner des Proteins Bcl-Rambo, wobei ein sog. "yeast-two-hybrid"-System eingesetzt wird.

27. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprü­ che 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Identifizierung von weiteren an der apoptotischen Signaltransduktion beteiligten Proteinen.

28. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprü­ che 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen.

29. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 28, wobei das Suizidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die Transkripti­ on reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird.