WO2002048353A2 - Dna-sequenzen, codierend für ein apoptose-signaltransduktionsprotein - Google Patents

Dna-sequenzen, codierend für ein apoptose-signaltransduktionsprotein Download PDF

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WO2002048353A2
WO2002048353A2 PCT/EP2001/014597 EP0114597W WO0248353A2 WO 2002048353 A2 WO2002048353 A2 WO 2002048353A2 EP 0114597 W EP0114597 W EP 0114597W WO 0248353 A2 WO0248353 A2 WO 0248353A2
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to DNA sequences which code for an apoptotic signal transduction protein (Bcl-Rambo) or for polypeptides with a domain of such a protein (BHNo domain from Bcl-Rambo), expression vectors, host cells, gene products of the abovementioned sequences, Antibodies against these gene products, methods for expression and isolation, compounds which modulate the apoptotic effect, methods for identifying such compounds and the use of these compounds or the DNA sequences or gene products as medicaments.
  • Bcl-Rambo apoptotic signal transduction protein
  • BHNo domain from Bcl-Rambo apoptotic signal transduction protein
  • Apoptosis is also known from the prior art as a further form of cell death.
  • Apoptosis is a physiological process that regulates many physiological processes in multicellular organisms. For example, apoptosis occurs in embryonic development, plays a role in tissue or organ morphology, intervenes in the modulation of the immune system and is therefore - to speak generally - of central importance for homeostasis in multicellular organisms (Wyllie et al. (1980) Rev. Cytol 68 (251), 251-251).
  • Elegans CED-9 inhibit apoptosis and create their own subfamily, there are two other subfamilies that have the opposite result Have an effect, ie promote cell death.
  • this is the subfamily with proteins, such as. B. Bax, Bak, Bok, and elsewhere around the third subfamily, to which the following proteins belong: Bad, Bik / Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim / Bod and Noxa or the EG / l protein from C. Elegans.
  • the two subfamilies which include Bei-2 as an inhibitor of apoptosis and Bax as an activator of apoptosis, are characterized by three of four conserved "BH" (short name for Bei-2 homology) sequence motifs out.
  • the third subfamily which is represented by the mammalian proteins Bad, Bik / Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim / Bod and Noxa or the EGL / l protein by C. Elegans, only has homology with the short BH3 sequence motif for the two aforementioned subfamilies, which is why proteins of this third subfamily are also referred to in the prior art as "BH3-only" proteins.
  • proteins which belong to the two subfamilies with anti-apoptotic activity are characterized by a hydrophobic sequence section located at the C-terminal, which interacts with the endoplasmic reticulum, the nuclear envelope or the outer mitochondrial membrane. These proteins that promote cell survival are typically membrane-bound, in contrast to other proteins involved in apoptosis.
  • Bei-2 must necessarily bind pro-apoptotic family members, for example Bax or Bak, for its apoptosis-inhibitory effect in order to be able to develop the inhibitory effect, or whether binding to it apoptotic proteins is not critical for the action of Bcl-2 (Yin et al. (1994) Nature 369 (6478), 321-323; Cheng et al. (1996) Nature 379 (6565), 554-556).
  • the prior art has therefore completely inadequately elucidated the apoptotic signal transduction, the interaction between Bei-2 homologs of different subfamilies and the completeness of the proteins involved in the regulation of this apoptotic signal transduction pathway. Therefore, even according to the prior art, it is not possible to specifically modulate the apoptotic events in the cell by therapeutic measures.
  • the object of the present invention is on the one hand to elucidate apoptotic signal transduction mechanisms as well as to identify those proteins (with their amino acid sequences) and the underlying DNA sequences that are involved in the apoptotic signal transduction, on the other hand on the basis of these findings and with the help of pathophysiological findings, if necessary, substances or their use for the treatment of related diseases or disorders to be able to provide.
  • proteins with a so-called BHNo domain play a crucial role in the intracellular transmission or triggering of an apoptotic signal.
  • these proteins can optionally have BH sequence motifs, for example at least one BH1, BH2, BH3 and / or BH4 sequence motif. Proteins with participation in the apoptotic signal cascade are thus made available according to the invention, which belong to a further subfamily of apoptotic signal transduction proteins unknown from the prior art.
  • the present invention therefore relates to DNA sequences which contain a sequence region which codes for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 7 (BHNo domain), including all functionally homologous derivatives, fragments or alleles.
  • all DNA sequences are included which hybridize with the DNA sequences according to the invention, including the sequences which are complementary in each case in the double strand (claim 1).
  • DNA sequences are disclosed, the gene product of which codes for a polypeptide, as shown in FIG. 7, including all functionally homologous derivatives, alleles or fragments of such a DNA sequence and also infunctional derivatives, alleles, analogs or fragments which form the can inhibit apoptotic signal cascade.
  • DNA sequences hybridizing with these DNA sequences according to the invention are also disclosed (claim 2).
  • the present invention relates to DNA sequences which contain a sequence region which codes for a polypeptide with an amino acid sequence according to FIG. 7 (BHNo domain), including all functionally homologous derivatives, fragments or alleles
  • the subject matter of the present application also includes DNA partial sequences which code for sections of the BHNo domain, in particular for the partial sequence from AS 213 to AS 459 or up to an AS located further N-terminal, in particular furthermore for the partial sequence of AS 245 to AS 459 or up to a further N-terminal AS, furthermore in particular also for the partial sequence from AS 285 to AS 459 or up to another N-terminal AS and in particular furthermore for a partial sequence from AS 431 to AS 459 or up to a further N-terminal AS.
  • the respective AS sequences reference is made to the numbering according to FIG. 1A.
  • DNA sequences which contain at least one DNA sequence which for a at least 8, preferably at least 12, more preferably at least 20 AS long section on the BHNo domain (AS 205 to AS 485 according to FIG. 1A) encode, including all derivatives, analogs or alleles. Even those that result from these AS sequences resulting from DNA sequences according to the invention are also disclosed.
  • the DNA sequences (repeat sequences) or the DNA sequences on which the AS sequences according to FIG. 1B are based, which contain sections which code for these AS sequences, including all derivatives, alleles and analogs, are very particularly preferred.
  • the oligo or polypeptide sequences obtainable by the aforementioned DNA sequences are also disclosed.
  • DNA sequences which contain a sequence region which codes for a polypeptide according to FIG. 8, including all functionally homologous derivatives, alleles or fragments, or including all sequences hybridizing with these sequences, are further preferred (claim 3).
  • the hybridization conditions are preferably selected such that hybridization at 40 ° C. is more preferred at 50 ° C. and even more preferably at 60 ° C.
  • DNA sequences which contain one of the (c) DNA sequences indicated in FIG. 9 are also preferred (claim 4).
  • DNA sequences which code for a protein which essentially corresponds to the Bcl-Rambo protein are also disclosed. These DNA sequences receive only a small number of changes compared to the sequence shown in FIG. 9, for example they can be isoforms. The number of sequence changes will typically not be greater than 10.
  • Such DNA sequences essentially corresponding to the DNA sequence coding for Bcl-Rambo and also coding for a biologically active protein can be obtained by generally known mutagenesis methods and the biological activity of the proteins coded by the mutants can be obtained by screening methods, For example, binding studies or the ability to trigger apoptosis can be identified.
  • the corresponding mutagenesis methods include site-directed mutagenesis, which is the automatic synthesis of a primer with at least one at least provides for a base change.
  • the heteroduplex vector is transferred to a suitable cell system (eg E. coli) and appropriately transformed clones are isolated.
  • a suitable cell system eg E. coli
  • all methods familiar to the person skilled in the art for the production, modification and / or detection of DNA sequences according to the invention which can be carried out in vivo, in situ or in vitro, are suitable (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) or chemical synthesis).
  • Appropriate PCR primers can be used, for example, to introduce new functions into a DNA sequence according to the invention, such as restriction sites, termination codons. In this way, sequences according to the invention can be designed accordingly for transfer into cloning vectors.
  • the present invention furthermore relates to expression vectors which contain a DNA sequence according to the invention, for example as disclosed above or as claimed in claims 1 to 4 (claim 5).
  • expression vectors according to the invention typically contain, in addition to at least one DNA sequence according to the invention, also promoter regions and terminator regions, if appropriate also at least one marker gene (for example antibiotic resistance genes) and / or at least one signal sequence Transport of the translated protein, for example into a certain cell organelle or into the extracellular space.
  • the present invention further relates to host cells which have been transformed with an expression vector according to the invention (claim 6).
  • Prokaryotic yeasts or higher eukaryotic cells are suitable as suitable host cells for cloning or expression of the DNA sequences according to the invention. In prokaryotes, gram-negative or gram-positive organisms are expressly included. E. coli or bacilli should be mentioned here.
  • the strains E.coli 294, E.coli B and are preferred host cells for cloning the DNA sequences according to the invention E.coli X1776 and E.coli W3110.
  • the bacilli are bacillus subtilis, Salmonella typhimurium or the like.
  • the expression vectors typically contain at least one bacterial-specific signal sequence for transporting the protein into the culture medium.
  • eukaryotic microbes are also suitable as host cells which have been transfected with an expression vector according to the invention.
  • filamentous fungi or yeasts can be used as suitable host cells for the vectors coding for the DNA sequences according to the invention.
  • Saccharomyces cerevesiae or ordinary baker's yeast Saccharomyces cerevesiae or ordinary baker's yeast (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)).
  • cells from multicellular organisms are selected for the expression of DNA sequences according to the invention. This also takes place against the background of a possibly necessary glycosylation (N- and / or O-coupled) of the encoded proteins.
  • This function can be carried out in a suitable manner in higher eukaryotic cells compared to prokaryotic cells.
  • any higher eukaryotic cell culture is available as a host cell, although cells from mammals, for example monkeys, rats, hamsters or humans, are very particularly preferred.
  • a large number of established cell lines are known to the person skilled in the art. In a list that is by no means exhaustive, the following cell lines are named: 293T (embryonic kidney cell line), (Graham et al., J.
  • expression vectors which have the DNA sequences according to the invention are preferably used to transfect cells of the mammalian immune system, especially the human immune system (claim 7).
  • gene products are understood to mean both primary transcripts, that is to say RNA, preferably mRNA, and proteins or polypeptides, in particular in purified form (claim 9). According to the invention, these proteins have at least one BHNo domain and regulate or transport, in particular, apoptotic, possibly also inflammatory signals.
  • a purified gene product is preferred if it contains the amino acid sequence given in FIG. 7 (for a BHNo domain), or a functionally homologous allele, fragment or derivative of this sequence (claim 10).
  • a derivative is understood to mean, in particular, those AS sequences which have been modified by modifications to their side chains. For example.
  • Derivatives can also be the coupling of a sugar or fatty (acid) residue or a phosphate group or any modification of a side chain, especially a free OH group or NH2 group or at the N or C terminus.
  • derivatives also includes fusion proteins in which a DNA sequence according to the invention is coupled to any oligo- or polypeptides.
  • Analogs Sequences that are characterized by at least one AS change compared to the native sequence (insertion, substitution) are referred to as "analogs". Conservative substitutions are preferred in which the physico-chemical character of the exchanged AA is retained (polar AA, long aliphatic chain, short aliphatic chain, negatively or positively charged AA, AA with aromatic group). The analogs are preferred if they retain the secondary structure as they occur in the native sequence. In addition to conservative sub- institutions can also be less conservative AS
  • Variations according to the invention are introduced into the native sequence. They typically retain their function as transducers of an apoptotic signal. The effect of a substitution or deletion can easily be checked by appropriate investigations, binding assays or cytotoxic tests.
  • sequences are also included which produce a so-called dominant-negative effect, i.e. due to their changed primary sequence they still have binding activity to a sequence located upstream in the cascade, but cannot transmit the signal downstream.
  • Such analogs therefore act as inhibitors of apoptosis.
  • Such analogs are produced by genetic engineering measures, typically by the so-called "site-directed" mutagenesis of a DNA sequence which codes for a protein according to the invention containing a BHNo domain (typically Bcl-Rambo). This produces the DNA sequence on which the analog is based, which ultimately expresses the protein in a recombinant cell culture. Sambrook et al. , 1989, see above). All derivatives of the above-described analogs are also disclosed, as are the DNA sequences on which the above-described AS sequences are based.
  • fragments of a native AS sequence according to the invention also form part of the subject matter of the present invention. Fragments are characterized by deletions
  • the gene products (proteins) according to the invention also include all those gene products (proteins) which, according to the invention, are derived from DNA derivatives, DNA fragments or DNA alleles of the DNA sequence shown in FIG. 9 after transcription and translation.
  • the proteins according to the invention can be chemically modified. For example, there may be a protecting group at the N-terminus. Glycosyl groups can be attached to hydroxyl or amino groups, lipids can be covalently linked to the protein according to the invention, as can phosphates or acetyl groups and the like. Any chemical substances, compounds or groups can also be bound to the protein according to the invention by any synthetic route.
  • Additional amino acids for example in the form of individual amino acids or in the form of peptides or in the form of protein domains and the like, can also be used with the N and / or C terminus of a protein according to the invention, in particular at the N or C terminus of a BHNO Domain, be fused, but possibly also be integrated into the sequence of the BHNo domain according to the invention.
  • signal or "leader" sequences at the N-terminus of the amino acid sequence according to the invention are preferred, which lead the peptide cotranslationally or post-translationally into a specific cell organelle or into the extracellular space (or the culture medium).
  • Amino acid sequences can also be present at the N- or at the C-terminus, which allow the binding of the amino acid sequence according to the invention to antibodies as antigen.
  • the flag peptide the sequence of which in the single-letter code of the amino acids is: DYKDDDDK. Or a His tag with at least 3, preferably at least 6, histidine residues. These sequences have strong antigenic properties and thus allow the recombinant protein to be checked and cleaned quickly.
  • Monoclonal antibodies that bind the flag peptide are available from Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.
  • Genomic DNA sequences according to the invention can be deposited on the strand of the genetic information molecule in numerous exons which are separated from one another by introns, for example as shown in FIG. IC.
  • DNA sequences according to the invention can thus be used as cDNA (without intronic sequences zen) or genomic with at least one intron sequence.
  • DNA sequences according to the invention can contain one, two, three, four or 5 intron sequences (in any combination, for example only intron 2 (5.7 kb) and Intron 3 (7.2 kb)), or also as a cDNA (without intron sequence).
  • Proteins according to the invention can thus have the BHNo domain without or with at least one further exon sequence or partial exon sequence, for example the AS sequence of exon III and exon IV and the first 15 AS of exon V in combination with the amino acid sequence of the BHNo domain on exon VI (with or without the Transmembra domain).
  • the present invention furthermore relates to an antibody which recognizes an epitope on a gene product according to the invention, in particular a protein according to the invention (claim 11).
  • antibody includes i.S. the present invention, both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (claim 12), chimeric antibodies, anti-idiotypic antibodies
  • antibodies according to the invention can also occur in recombinant form as fusion proteins with other (protein) components. Fragments as such or fragments of antibodies according to the invention as constituents of fusion proteins are typically produced by the methods of enzymatic cleavage, protein synthesis or the recombination methods familiar to the person skilled in the art.
  • the polyclonal antibodies are heterogeneous mixtures of antibody molecules which are produced from sera from animals which have been immunized with an antigen.
  • the subject of the invention also includes polyclonal monospecific antibodies which are obtained after the antibodies have been purified (for example via a column which is loaded with peptides of a specific epitope).
  • a monoclonal antibody contains an essentially homogeneous population of antibodies that are specifically directed against antigens, the antibodies having essentially the same epitope binding sites.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by methods known in the art (e.g., Koehler and Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); U.S. Patent 4,376,110; Ausübel et al., Harlow and Lane "Antibodies” : Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory (1988)).
  • Antibodies according to the invention can belong to one of the following immunoglobulin classes: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD and possibly a subclass of the aforementioned classes.
  • a hybridoma cell clone that produces monoclonal antibodies according to the invention can be cultivated in vitro, in situ or in vivo. Large titers of monoclonal antibodies are preferably produced in vivo or in situ.
  • the chimeric antibodies according to the invention are molecules which contain different constituents, and these are derived from different animal species (for example antibodies which have a variable region which is derived from a mouse monoclonal antibody and a constant one) Region of a human immunoglobulin). Chimeric antibodies are preferably used, on the one hand, to reduce the immunogenicity in use and, on the other hand, to increase the yields in production, for example murine monoclonal antibodies give higher yields from hybridoma cell lines, but also lead to a higher immunogenicity in
  • Such an antibody according to the invention is very particularly preferably directed against a sequence section on the BHNo domain as an epitope (claim 13).
  • An anti-idiotypic antibody according to the invention is an antibody which recognizes a determinant which is generally associated with the antigen binding site of an antibody according to the invention.
  • An anti-idiotypic antibody can be produced by immunizing an animal of the same type and the same genetic type (eg a mouse strain) as a starting point for a monoclonal antibody against which an anti-idiotypic antibody according to the invention is directed. The immunized animal will recognize the idiotypic determinants of the immunizing antibody by producing an antibody which is directed against the idiotypic determinants (namely an anti-idiotypic antibody according to the invention) (US Pat. No. 4,699,880).
  • Antibody can also be used as an immunogen to elicit an immune response in another animal and to produce an anti-idiotypic antibody there.
  • the epitope construction of the anti-anti-idiotypic antibody can, but need not, be identical to the original monoclonal antibody, which is the anti-idiotypic
  • Monoclonal antibodies which are directed against proteins, analogs, fragments or derivatives of these proteins according to the invention can be used to bind anti-idiotypic antibodies in corresponding animals, such as, for. B. the BALB / c mouse. Spleen cells from such an immunized mouse can be used to produce anti-idiotypic hybridoma cell lines that secrete anti-idiotypic monoclonal antibodies. Furthermore, anti-idiotypic monoclonal antibodies can also be coupled to a carrier (KLH, "keyhole limpet hemocyanin”) 'and then used to immunize further BALB / c mice.
  • KLH "keyhole limpet hemocyanin"
  • mice contain anti-anti-idiotypic antibodies which have the binding properties of the original monoclonal antibodies and are specific for an epitope of the protein according to the invention or a fragment or derivative thereof.
  • the anti-idiotypic monoclonal antibodies thus have their own idiotypic epitopes or "idiotopes" which are structurally similar to the epitope to be examined.
  • antibody is intended to include both intact molecules and fragments thereof, e.g. Fab and
  • Fragments such as in an intact antibody the so that they can be transported faster in the bloodstream and have comparatively less non-specific tissue binding than intact antibodies.
  • Fab and F (ab ') 2 fragments of antibodies according to the invention can be used in the detection and quantification of proteins according to the invention. Such fragments are typically made by proteolytic cleavage using enzymes such as. B. papain (for the production of Fab fragments) or pepsin (for the production of F (ab ') 2 ' fragments) can be used.
  • Antibodies according to the invention can be used for the quantitative or qualitative detection of protein according to the invention in a sample or also for the detection of cells which express and optionally secrete proteins according to the invention.
  • the detection can be achieved with the aid of immunofluorescence methods, the fluorescence-labeled antibodies are carried out in combination with light microscopy, flow cytometry or fluorometric detection.
  • Antibodies according to the invention are suitable for histological examinations, for example in the context of immunofluorescence or immunoelectroscopy, for the in situ detection of a protein according to the invention.
  • the in situ detection can be carried out by taking a histological sample from a patient and adding labeled antibodies according to the invention to such a sample.
  • the antibody (or a fragment of this antibody) is applied to the biological sample in a labeled form. In this way it is not only possible to determine the presence of protein according to the invention in the sample, but also the distribution of the protein according to the invention in the tissue examined.
  • the biological sample can be a biological fluid, a tissue extract, harvested cells, such as. B.
  • the biological sample can also on a solid phase support, such as. B. nitrocellulose or another carrier material, so that the cells, cell parts or soluble proteins are immobilized.
  • the carrier can then be washed one or more times with a suitable buffer, with subsequent treatment with a detectably labeled antibody according to the present invention.
  • the solid phase support can then be washed with the buffer a second time to remove unbound antibody.
  • the amount of bound label on the solid phase support can then be determined using a conventional method.
  • the carrier can be of either partially soluble or insoluble character to meet the conditions of the present invention.
  • the carrier material can take any shape, e.g. B. in the form of beads, or cylindrical or spherical, with polystyrene beads are preferred as a carrier.
  • Detectable antibody labeling can be done in different ways.
  • the antibody can be bound to an enzyme, the enzyme finally being used in an immunoassay (EIA).
  • EIA immunoassay
  • the enzyme can then react later with a corresponding substrate, so that a chemical compound is formed which can be detected in a manner familiar to the person skilled in the art and, if necessary, quantified, e.g. B. by spectrophotometry, fluorometry or other optical methods.
  • the enzyme can be malate Dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-5 steroid
  • Isomerase yeast alcohol dehydrogenase, alpha-glycerophosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase or gluco-damylolase, or gluco-damylolase, or gluco-dehydrogenase act.
  • the detection is then enabled via a chromogenic substrate that is specific for the enzyme used for the labeling and can finally be e.g. by visual comparison of the substrate converted by the enzyme reaction compared to control standards.
  • the detection can be ensured by other immunoassays, e.g. by radioactive labeling of the antibodies or antibody fragments (ie by a radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978).
  • the radioactive isotope can be Can be detected and quantified using scintillation counters or by autoradigraphy.
  • Fluorescent compounds can also be used for labeling, for example compounds such as fluorescinisothiocyanate, rhodamine, phyoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde and fluoresca- mm. Also fluorescent-emitting metals, such as. B. 152E or other metals from the lanthanide group can be used. These metals are attached to the antibody via chelate groups, such as. B. coupled diethylenetriaminepentaacetic acid (ETPA) or EDTA. Furthermore, the antibody according to the invention can be coupled via a connection which acts with the aid of chemiluminescence.
  • chelate groups such as. B. coupled diethylenetriaminepentaacetic acid (ETPA) or EDTA.
  • chemiluminescence-labeled antibody is then detected via the luminescence which arises in the course of a chemical reaction.
  • luminol isoluminol, acridinium ester, imidazole, acridinium salt or oxalate ester.
  • Bioluminescence is a subspecies of chemiluminescence found in biological systems, where a catalytic protein increases the efficiency of the chemiluminescent reaction.
  • the bioluminescent protein is in turn detected via luminescence, with luciferin, luciferase or aequorin, for example, being suitable as the bioluminescent compound.
  • An antibody according to the invention can be used for use in an immunometric assay, also known as a "two-site” or “sandwich” assay.
  • Typical immunometric assay systems include so-called “forward” assays, which are characterized in that antibodies according to the invention are bound to a solid phase system and that. the antibody is brought into contact with the sample being examined in this way. In this way, the antigen is isolated from the sample by the formation of a binary solid phase-antibody-antigen complex from the sample. After a suitable incubation period, the solid support is washed to remove the remainder of the liquid sample, including any unbound antigen, and then contacted with a solution containing an unknown amount of the labeled detection antibody.
  • the labeled antibody serves as a so-called reporter molecule. After a second incubation period that allows the labeled antibody to associate with the antigen bound to the solid phase, the solid phase support is washed again to remove labeled antibodies that have not reacted.
  • a so-called “sandwich” assay can also be used.
  • a single incubation step can be sufficient if the antibody bound to the solid phase and the labeled antibody are both applied to the sample to be tested at the same time. After the incubation is complete, the Solid phase carriers washed to remove liquid residues
  • Eliminate sample and the unassociated labeled antibody The presence of labeled antibody on the solid phase support is determined in the same way as in the conventional "forward" sandwich assay.
  • reverse assay a solution of the labeled antibody is first gradually added to the liquid sample, followed by the addition of unlabeled antibody, bound to a solid phase support, after a suitable incubation time has elapsed. After a second incubation step, the solid phase support is washed in a conventional manner in order to free it from sample residues and from labeled antibody which has not reacted. The determination of the labeled antibody which has reacted with the solid phase support is then carried out as described above.
  • Another aspect of the present invention is a method for isolating gene products with at least one amino acid sequence according to the invention, in particular one
  • the host cells being transformed with an expression vector according to the invention and then being cultivated under suitable conditions which promote expression, so that the gene product can finally be purified from the culture
  • the protein of the DNA sequence according to the invention can be isolated from a culture medium or from cell extracts.
  • the person skilled in the art can readily recognize that the respective isolation methods and the method for the purification of the recombinant protein encoded by a DNA according to the invention strongly depend on the type of the host cell or also on the fact whether the protein secretes into the medium will depend.
  • expression systems can be used which lead to the secretion of the recombinant protein from the host cell.
  • the culture medium must be concentrated using commercially available protein concentration filters, for example Amicon or Millipore Pelicon.
  • a Purification step for example a gel filtration step or column chromatography methods.
  • an anion exchanger can be used which has a matrix with DEAE.
  • HPLC steps can then be used to further purify a polypeptide encoded by a DNA according to the invention. It can be one or more steps. In particular, the "reversed phase" method is used. These steps serve to obtain an essentially homogeneous recombinant protein of a DNA sequence according to the invention.
  • transformed yeast cells can also be used.
  • the translated protein can be secreted, so that protein purification is simplified.
  • Secreted recombinant protein from a yeast host cell can be obtained by methods as described in Urdal et al. (J. Chromato. 296: 171 (1994)).
  • a further aspect of the present invention is a method for the expression of gene products which contain at least one BHNo domain, including all derivatives, analogs and fragments, in which case host cells are transformed with an expression vector which contains a DNA sequence according to the invention ( Claim 15).
  • This method for the expression of gene products which are based on a DNA sequence according to the invention does not serve to concentrate and purify the corresponding gene product, but rather to improve the cell metabolism by introducing the DNA sequences according to the invention via the expression of the associated gene product to influence.
  • a DNA sequence according to the invention can be connected behind a constitutively activated promoter or rather operably linked to a desired inducible promoter on the expression vector used for cell transfection.
  • the DNA sequence according to the invention can preferably be used as a suicide gene. This means that after transfection of the host cell, the transcription of the sequence according to the invention which induces cell death, for example, is initially repressed or cannot be activated.
  • the host cells possibly transfected with at least one further gene or gene fragment (on the same or at least one further expression vector), for example a tumor suppressor gene or a therapeutic gene in the case of hereditary diseases, are then (re) transplanted to the patient for gene therapy
  • the transcription of the DNA according to the invention which induces apoptosis can be initiated by administration of an inducer or negative repressor to induce the cell suicide.
  • the transplanted host cell can thus be kept alive or specifically triggered by apoptosis.
  • the transfection of host cells with an inducible DNA sequence according to the invention is therefore suitable for the negative selection of correspondingly transfected host cells.
  • double (dominant) negative mutants are also disclosed according to the invention, which possibly can suppress cell-induced cell death.
  • DN double (dominant) negative mutants
  • Such DN sequences according to the invention are suitable, after appropriate transfection, to protect host cells against apoptosis or at least against certain apoptotic events and to render the cells transfected therewith immortal. Uses of such apoptosis immune or tw.
  • Apoptosis-immune host cells result, for example, in the context of gene therapy for diseases which are caused etiologically by incorrectly controlled cell (or tissue) destruction, are at least accompanied by pathological cell death or have massive pathological cell death as a symptom (Parkinson's disease, Alzheimer's disease, viral diseases, e.g. HIV infections).
  • the host cells are transfected alone or at least co-transfected with DN mutants according to the invention, ie also transfected with at least one further therapeutic gene on the same or at least one further vector.
  • the transfection of host cells with a DN-DNA sequence according to the invention is therefore suitable for the positive selection of correspondingly transfected host cells.
  • the above-mentioned methods make the host cell lines resistant to a large number of apoptotic stimulants.
  • the cells manipulated in vitro with the expression vectors according to the invention are preferably cells which have suffered from maladjustment of apoptosis in the organism and can now be regenerated after the transplantation by transformed cells according to the invention.
  • sequences of the invention are used in such a gene therapy approach, which block the apoptotic events as double-negative mutants.
  • vectors are used (eg liposomes, adenoviruses, retroviruses or similar or also naked DNA), which insert the DNA sequences according to the invention specifically into the desired target cells of the organism.
  • the target cells are typically cells whose death / survival homeostasis is disturbed, in particular cells that show an increased pathological disposition to apoptosis (e.g. in diabetes mellitus, Parkinson's disease, autoimmune diseases).
  • fragments of a DNA sequence according to the invention can be used which have an inhibitory effect, for example DN-DNA sequences which can essentially no longer pass on biological signals - ie have no further biological or apoptosis-reducing functionality.
  • Vectors which can induce apoptosis by expressing sequences according to the invention are also suitable as drugs in in vivo gene therapy processes.
  • the use of such viral or liposomal vectors for the treatment of tumor diseases is disclosed.
  • naked DNA according to the invention can also be used as a medicament.
  • DNA sequence according to the invention alleles, derivatives, fragments
  • a gene product according to the invention for the treatment of diseases which are based on incorrectly controlled intracellular signal transduction (claim 16).
  • the aforementioned use of DNA sequences according to the invention also includes the use of the expression vectors according to the invention described above which comprise a nucleotide sequence according to the invention, for example a nucleotide sequence disclosed in FIG. 9 or a functional derivative, fragment, analog or allele of such a sequence (or also have an infunctional derivative of such a sequence, for example a DN mutant), with the aim of correcting the misdirected intracellular signal transduction.
  • Use may vary by gene therapy methods by injection of naked DNA according to the invention or the protein or by gene transporters, in particular viral or liposomal vectors.
  • the present invention therefore also relates both to the use of such DNA sequences according to the invention, gene products, expression vectors and the use of cells according to the invention which are transfected with expression vectors according to the invention as medicaments.
  • Polypeptides, expression vectors or DNA sequences according to the invention, or their respective derivatives, analogs or fragments, can serve various purposes, for example increasing the apoptosis reaction if such an effect is desired, for example in the case of anti-tumor, anti-inflammatory or anti-HIV applications. It is preferred to use a DNA sequence according to the invention or a gene product according to the invention if the disease is one with a misregulated cell apoptosis, in particular an apoptosis deficiency of certain cells in a multicellular organism (claim 17).
  • tumors for example tumors of the epithelial tissue (for example intestine, lungs), brain tumors (for example gliblastoma, astrocytoma), sarcomas, tumors of the immune system, and also leukaemias, in particular acute mye or chronic myeloid leukemia.
  • epithelial tissue for example intestine, lungs
  • brain tumors for example gliblastoma, astrocytoma
  • sarcomas for example gliblastoma, astrocytoma
  • leukaemias in particular acute mye or chronic myeloid leukemia.
  • a recombinant animal virus for example derived from vaccinia
  • vaccinia can be used, for example, to introduce the proteins or DNA sequences according to the invention into the patient cells to be treated, with at least two genes being added.
  • a gene for a ligand that binds to a receptor on the target cell e.g. gpl20 for CD4-bearing lymphocytes
  • the DNA sequence according to the invention for triggering or amplifying cell death.
  • derivatives or fragments of sequences according to the invention which are infunctional with regard to the forwarding of the apoptotic signal can also be used as medicaments, for example DN mutants of sequences according to the invention. They are used in particular for the treatment of degenerative diseases, for example neurodegenerative diseases, autoimmune diseases or infectious diseases.
  • compounds are thus provided which are characterized in that they modulate, in particular inhibit, the function of the gene products (proteins) according to the invention as an intracellular signal molecule of an apoptotic signal cascade to trigger cell death (claim 19).
  • compounds according to the invention block the specific activation of caspase-3 mediated by Bcl-rambo
  • a chemical compound according to the invention which blocks apoptosis is preferably an oligo- or polypeptide (see above for the DN mutant) which chemically modifies (for example to facilitate passage through the cell membrane, in particular through terminal ones
  • oligo- or polypeptide may or may not be modified. Possibly.
  • Such an oligo- or polypeptide can also be chemically modified in that the amide-like bond between the individual amino acids is replaced by an alternative chemical group that is resistant to proteolytic degradation (for example sulfur or phosphorus bridges).
  • An inhibition of apoptosis can also be achieved by using oligonucleotides which are known to the person skilled in the art and which are suitable for an antisense strand of the native by-Rambo Coding sequence or another native protein with a BHNo domain, in infiltrate the affected cells.
  • the method described above can be used with the aid of recombinant viruses.
  • ribozymes are used which can cut a target mRNA.
  • Ribozymes according to the invention must be able to interact with the target mRNA according to the invention, for example via base pairing, and then cleave the mRNA in order to block the translation of, for example, Bcl-Rambo.
  • the ribozymes according to the invention are introduced into the target cells via suitable vectors (in particular plasmids, modified animal viruses, in particular retroviruses), the
  • Vectors in addition to any other sequences, has a cDNA sequence for a ribozyme according to the invention).
  • a chemical compound according to the invention is preferably an organic chemical compound with a molecular weight of ⁇ 5000, in particular ⁇ 3000, especially ⁇ 1500 and is typically physiologically well tolerated and can preferably cross the blood-brain barrier (claim 21). Possibly. it will be part of a composition with at least one further active ingredient and preferably auxiliaries and / or additives and can be used as a medicament.
  • the organic molecule will be particularly preferred if the binding constant for binding to a protein according to the invention, in particular to the domain BHNo of a protein according to the invention, is at least 10 7 mol "1.
  • the compound according to the invention will preferably be such that it can pass through the cell membrane, be it by diffusion or via (intra) membranous transport teine (claim 22), possibly after appropriate modification, for example. With a coupled AS sequence.
  • the compound according to the invention is an antibody, preferably an antibody directed against the BHNo domain of a protein according to the invention, which is introduced ex vivo in retransplanted host cells or by gene therapy in vivo processes in host cells and there as "intrabody” is not secreted, but can exert its effect intracellularly.
  • the intrabodies according to the invention protect the cells against an apoptotic reaction. Such a procedure will typically be considered for cells of those tissues that show apoptotic behavior that is exaggerated in the patient's pathophysiology, that is to say, for example, in cells of the pancreas, keratinocytes, connective tissue cells, immune cells, neurons or muscle cells.
  • cells modified in this way with "intrabodies” according to the invention are also part of the present invention.
  • the substance class of the so-called IAPs acts in particular as inhibitors of Bcl-Rambo-mediated apoptosis.
  • the xIAPs are particularly noteworthy as strong inhibitors.
  • the document by Deveraux and Reed ((1999), Genes Dev. 13 (3), 239-252) is explicitly included in full in the disclosure of the present subject matter.
  • a chemical compound according to the invention with the function of blocking the, for example, apoptotic function of physiological proteins according to the invention can be used as a medicament.
  • a chemical compound according to the invention for producing a Drug for the treatment of diseases for which at least tw. a pathological hyperapoptotic reaction is causal or symptomatic.
  • An inhibitor according to the invention can inhibit the cellular function of a protein of the invention, for example the apoptotic reaction, as a medicament and very particularly in the treatment of the following diseases or in the manufacture of a medicament for the treatment of the following diseases: autoimmune diseases, in particular diabetes, psoriasis, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or asthma, viral infectious diseases (e.g.
  • apoptosis-inhibiting substances according to the invention can also be part of a pharmaceutical composition which can contain further pharmaceutical excipients and / or additives in order to stabilize such compositions for therapeutic administration, for example, to improve the biological availability and / or the pharmacodynamics.
  • the present invention furthermore relates to methods (“screening methods”) for identifying compounds with inhibitory properties with regard to the triggering or forwarding of signals which are related to apoptotic reactions triggered by physiologically occurring sequences according to the invention.
  • Screening methods for identifying compounds with inhibitory properties with regard to the triggering or forwarding of signals which are related to apoptotic reactions triggered by physiologically occurring sequences according to the invention.
  • Methods according to the invention provide that (a) cells with an expression vector according to claim 5, in particular an expression vector which codes for the protein Bcl-Rambo, optionally at least one expression vector which codes for at least one apoptosis inhibitor, and optionally at least one expression vector, the for min at least one reporter gene is encoded, transfected, and
  • a parameter suitable for observing the Bcl-Rambo mediated apoptosis, in particular the activation of caspase-3 is measured after adding a test compound in comparison to the control without adding a test compound for the host cell system obtained according to (a) ).
  • several parallel experiments with increasing concentrations of the test substance are preferably carried out according to the method of the invention in order to, in the event of an apoptosis-inhibiting effect of the
  • Test substance to be able to determine their ID 50 value.
  • a "screening method" according to the invention is preferred when the apoptosis inhibitor used for the transfection is FLIP, CrmA, DN-FADD and / or DN-Caspase-9 and the reporter gene is, for example, ⁇ -galactosidase (claim 24).
  • a “screening” method according to the invention can also be carried out using so-called “proteomics” techniques.
  • proteomics To determine a standard, typical differences in the expression pattern of cells with an apoptotic reaction and control cells are determined experimentally. 2D gel electrophoresis is typically used methodically for such a method.
  • Sequences according to the invention can also be used in methods which aim to identify cellular interaction partners of the Bcl-Rambo protein. Such a method can be carried out, for example, using the so-called “yeast two hybrid” method, which is known to the person skilled in the art (claim 26) or via affinity-chromatographic methods. This also discloses the use of a DNA sequence according to the invention or a gene product of such a sequence according to the invention for identifying further proteins involved in apoptotic signal transduction (claim 27).
  • AS sequences according to the invention or their derivatives, analogs, fragments or alleles are coupled to a matrix, brought into contact with, for example, cell extracts and after a washing step, the elution is carried out with subsequent characterization of the eluted complexes.
  • Proteins of the Bcl-2 family include the human sequences of the Bcl-2 protein, the human protein Bei-XL and the human protein Bcl-w.
  • the human sequence of Bcl-Rambo according to the invention also has the characteristic sequence sections BH1, BH2, BH3 and BH4 and a transmembrane region (MA).
  • the aforementioned sequence sections are outlined in FIG. 1. Identical amino acids in the four sequences are black, similar amino acids are highlighted in gray. From Figure la it is clear that in the human sequence of Bcl-Rambo C-terminal from the BH2 region, a sequence section comprising more than 200 amino acids is inserted, followed by a C-terminal anchor region.
  • This section designated according to the invention as the BHNo domain, contains so-called repeats (Repeat A, Repeat B) which, as shown in FIG. 1B, each have an identity of at least 80%.
  • Figure 1B compares the sequences of the two regions labeled "Repeat A” and the two regions labeled "Repeat B” that occur in the C-terminal region of Bcl-Rambo.
  • FIG. IC shows the exon-intron organization of the human Bei rambo gene.
  • the gene comprises 6 exons (numbered from I to VI, each separated by intron sequences).
  • ExonI is through 27.4 kb from Exonll, ExonII through 5.7 kb from ExonIII, ExonIII through 7.4 kb from ExonlV, ExonlV through 6 kb from ExonV and finally ExonV separated from ExonVI by 24.3 kb.
  • the regions BH1, BH2, BH3 and BH4 are also shown in their position on the corresponding exons in FIG. 1c.
  • BHNo domain The amino acid sequence section according to the invention designated as BHNo domain is positioned on ExonVI between the C-terminal region of the BH2 motif and the transmembrane region.
  • the non-coding regions are highlighted in gray, delimited from the coding regions by the start codon ATG and the stop codon TAG (position marked by arrows).
  • 2A shows Northern blots of various human tissues. These were exposed to 32 P-labeled cDNA fragments of the N-terminal part of Bcl-Rambo.
  • the tissues are heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreatic tissue.
  • This "Northern blot" application shows that a Bcl-Rambo transcript of 4.1 kb in length is contained in all examined tissues. The highest RNA expression values were determined in the heart, pancreas and placenta tissue. Two significantly weaker bands of 2, 1 kb and 1.2 kb in length correspond to alternative splice forms of human Bcl-Rambo. Examinations as in FIG.
  • the 4.1 kb transcript (ie the mRNA from Bcl-Rambo) was detected in all cell lines.
  • Bcl-Rambo expression plasmids were used here which (a) the full length human sequence of Bcl-Rambo (amino acids 1-485), (b) the Bei-2 homology domain (amino acids 1-223 of the human Bcl-Rambo protein), and (c) finally the Bcl-Rambo C-terminal region, including the
  • BHNo domain amino acids 205-485 of the human Bcl-Rambo protein.
  • These cell extracts were examined using anti-flag antibody M2, as shown in the left-hand plot of FIG. 2D, and treated with polyclonal antibody against Bcl-Rambo (as shown in the right-hand representation). It was found that the full-length human Bcl-Rambo protein has a molecular weight of approximately 85 kD, the N-terminal B-2 homology domain of Bcl-Rambo is detected at approximately 28 kD and the characteristic C-terminal domain (AS
  • FIG. 3 shows the subcellular localization of the Bcl-Rambo protein, which was determined with the aid of confocal laser microscopy.
  • HeLa cells with expression plasmids which contain the sequence for the full length of the Bcl-Rambo protein, that is to say amino acids 1-485, on the one hand or on the other hand for the Bcl-Rambo protein without the C-terminal transmembrane domain, that is to say only that Amino acids 1 - 459 (abbreviated to ⁇ MA), contained, transfected. Localization was determined 48 hours after transfection, using anti-Bcl-
  • the increase in caspase-3 activity is plotted (as a multiple, normalized in accordance with the likewise measured ⁇ -galactosidase activity, which is why the individual experimental approaches are comparable.
  • the apoptosis inhibitors behave in the same way for the expression of transfected C-terminal Bcl-Rambo which codes for the BHNo domain and the membrane anchor domain (amino acids 205-485) as for the full-length protein (see FIG 6A).
  • Figure 7 shows the amino acid sequence of the C-terminal domain of human Bcl-Rambo, which also contains the BHNo domain. It is the sequence section between Amino acid 205 and amino acid 485 of the full length protein of human Bcl-Rambo.
  • Figure 8 shows the full length amino acid sequence of Bcl- ⁇ Rambo, a 485 amino acid protein.
  • the cDNA sequence of human Bcl-Rambo in the long form with all exons (I - VI) is shown in FIG. 9.
  • the EST clone T48205 was identified, which - as it turned out later - codes for a short splice variant of human Bcl-Rambo. After transfection, this splice variant has the N-terminal amino acids 1 - 200 of the protein Bcl-Rambo comprising a total of 485 amino acids identified later.
  • Another EST clone (AA190545) was identified that corresponds to the region of the C-terminal amino acids 255 to 485 of the full-length protein Bcl-Rambo.
  • a cDNA library was then used to amplify missing further sections of the Bcl-Rambo protein.
  • the two resulting DNA fragments were mixed and amplified by PCR methods without a primer, followed by amplification with the primers JT1143 and JT1144.
  • the PCR product was cloned into the vector PCR blunt and the EcoRI / NotI fragment was then subcloned into a modified version of the vector PCR3 (from Invitrogen) in reading frame with an N-terminal flag sequence or an HA peptide.
  • Bcl-Rambo comprising amino acids 1-201 (Bcl-Rambo (1-201)): This construct was generated by PCR methods from EST clone T48205 with a 5 'forward primer which the EcoRI interface contains JT993 (5'-AAA GAA TTC ATG GCG TCC TCT-3 ') and the 3 ⁇ backward primer, which contains a Notl interface, JT994 (5' -TAG CGG CCG CTC ATA CCC AGC CAC C-3 1 ) amplified and then cloned into the PCR blunt vector.
  • deletion mutants of the full length protein of Bcl-Rambo were PCR amplified using the full length protein Bcl-Rambo as a "template" with a 5 'forward primer flanked by an EcoRI site and a 3' backward Primer, flanked by a Notl interface, constructed as follows:
  • Bcl-Rambo comprising the amino acids 1 - 223 (Bcl-Rambo (1 - 223)): 5'-primer JT1143 and 3 '-primer JT1244 (5'-AT AGC GGC CGC CTA GTC ATT GCT ATC TTC GT-3 '),
  • Bcl-Rambo comprising amino acids 1-459 (Bcl-Rambo (1-459)): 5 'primer JT1143 and 3' primer JT1245 (5'-AT AGC GGC CGC CTA AGA CTT GCC CTC AGA C-3 ');
  • Bcl-Rambo comprising amino acids 205-485 (Bcl-Rambo (205-485)): 5 'primer JT1251 (5'-AAA GAA TTC AGT
  • Bcl-Rambo comprising amino acids 205-459 (Bcl-Rambo 205-459)): 5 'primer JT1251 and 3' primer JT1245.
  • the NP40 lysis buffer corresponds to 1% Nonidet P-40 lysis buffer with 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl and protease inhibitor cocktail (Complete, from Boehringer Mannheim).
  • the post-nuclear lysates were first normalized with regard to their protein content (in order to be able to compare the individual measurement series), pre-cleaned on Sepharose 6B (from Sigma) for 2 hours at 4 ° C. and only then the immunoprecipitation immunoprecipitated with anti-Flag M2 agarose beads (from Sigma) for at least 2 hours at 4 ° C on a rotating disc.
  • the immunoprecipitates were washed twice with lysis buffer containing 1% and 0.05% NP-40, respectively, and the washed beads were used in reducing pro boiled before the SDS-PAGE application and the subsequent "Western Blotting".
  • the immunoprecipitated proteins labeled with either flag, HA or EE markers were labeled with anti-flag M2 antibody (from Sigma) (directed against flag labels) by anti -VSV P5D4 antibody (from Sigma) (directed against the HA label) or by anti-EE antibody (from Euro-gentec) (directed against EE-labeled proteins).
  • Affinity-purified polyclonal rabbit antibodies (AL167) in cell lysates (50 ⁇ ⁇ g) were used to determine the cellular (ie endogenous) Bcl-Rambo protein content.
  • AL167 antibody was produced in rabbits against recombinant Bcl-Rambo protein, directed against its N-terminal part, comprising amino acids 1-223. Finally, the polyclonal antibody was then affinity-purified on immobilized antigen, as is known to those skilled in the art State of the art is common.
  • Amino acids 1 - 223 correspond to the corresponding section of the human Bcl-Rambo protein. The "Western blots" were then coupled with peroxidase
  • the Northern blots (from Clontech) were obtained by hybridization after using randomly labeled radioactive samples in ExpressHyb buffer (from Clontech, Palo Alto, California) after approximately 3 hours, then at room temperature for 40 Washed minutes with multiple changes of 2 x SSC / 0.1% SDS, followed by 0.1 x SSC / 0.05% SDS for 40 minutes at 50 ° C.
  • HeLa cells were placed on 20 ml glass cover plates in 5.5 cm culture dishes with a
  • the cells were transfected the following day using calcium phosphate / BES methods and harvested approximately 36 hours after the start of transfection. To ensure mitochondrial labeling, the cells were incubated in a culture medium for 30 minutes in the presence of 1 ⁇ M mitotracker (from Molecular probes). The cells on glass slides were then washed twice with cold PBS, fixed for 12 minutes in 4% paraformaldehyde at room temperature, washed twice with cold PBS and permeate in PBS with 0.1% saponin (PBSS) overnight at 4 ° C - bilized.
  • mitotracker from Molecular probes
  • the glass slides were then blocked for 30 minutes at room temperature with 5% milk in PBSS (PBSSM), labeled with primary antibody AL167 (1 ⁇ g / l) (anti-Bei-Rambo antibody) for one hour at room temperature, 3x with PBSS washed and with Alexa 488-labeled (from Molecular probes) secondary anti-mouse or anti-Kanichen antibody to 1/100 in PBSSM diluted for an hour in the dark, marked. Finally, the glass slides were washed three times with PBS and attached to microscope slides with FluorSave reagent (from Calbiochem). Confocal microscopy was performed on a Zeiss Axiovert 100 microscope (Zeiss Laser Scanning Microscope 510).
  • Cy5 fluorochrome In order to be able to detect Cy5 fluorochrome, a helium laser was filtered at 633 nm. In contrast, an argon laser at 488 nm was used in order to be able to detect the Alexa fluorochrome. Standard conditions were chosen for hole size for image acquisition, with each image being an average of 16 passes.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für ein apoptotisches Signaltransduktionsprotein (Bcl-Rambo) bzw. für Polypeptide mit einer Domäne eines solchen Proteins (BHNo-Domäne von Bcl-Rambo) codieren, Expressionsvektoren, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten Sequenzen, Antikörper gegen diese Genprodukte, Verfahren zur Expression und Isolierung, Verbindungen, die die apoptotische Wirkung modulieren, Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen und die Verwendung von diesen Verbindungen bzw. den DNA-Sequenzen oder Genprodukten als Arzneimittel.

Description

DNA-Sequenzen, codierend für ein Apoptose-Signaltransduktionsprotein
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für ein apoptotisches Signaltransduktionsprotein (Bcl-Rambo) bzw. für Polypeptide mit einer Domäne eines solchen Proteins (BHNo-Domäne von Bcl-Rambo) codieren, Expressions- vektoren, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten Sequenzen, Antikörper gegen diese Genprodukte, Verfahren zur Expression und Isolierung, Verbindungen, die die apoptotische Wirkung modulieren, Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen und die Verwendung von die- sen Verbindungen bzw. den DNA-Sequenzen oder Genprodukten als Arzneimittel.
Neben der Nekrose, die eine Form des Zelltods darstellt, ist aus dem Stand der Technik auch die Apoptose als wei- tere Form des Zelltods bekannt. Bei der Apoptose handelt es sich um einen physiologischen Prozeß, der regulierend in viele physiologische Prozesse bei multizellulären Organismen eingreif . So etwa tritt die Apoptose in der Embryonalentwicklung auf, spielt bei der Gewebe- oder Or- ganmorphologie eine Rolle, greift in die Modulation der Immunabwehr ein und ist somit - um allgemein zu sprechen - von zentraler Bedeutung für die Homöostase in multizellulären Organismen (Wyllie et al . (1980) Rev. Cytol 68 (251) , 251-251) . Verschiedene apoptotische Signaltrans- duktionswege sind in den letzten Jahren im Stand der Technik aufgeklärt worden, beispielsweise die durch FasL induzierte Zellapoptose, die nach extrazellulärer Auslö- sung intrazellulär durch eine Kaskade von zu aktivierenden Caspasen weitergeleitet wird. Aus den Arbeiten von Adams et al.((1998) Science 281, 1322-1326) und Gross et al. ((1999) Genes Dev 13 (15), 1899-911) ist nicht nur - wie seit langem aus dem Stand der Technik bekannt - zu entnehmen, daß Proteine der Bei-2-Familie an der Regulation der Apoptose beteiligt sind, sondern auch, daß diese Proteine drei verschiedenen Subfamilien angehören. Während Bei-2 und weitere nahe Verwandte von Bei-2 einschließlich Bcl-x, Bcl-w und C. Elegans CED-9, die Apop- tose inhibieren und eine eigene Subfamilie begründen, gibt es zwei weitere Subfamilien, die im Ergebnis genau gegenteilige Wirkung haben, d. h. den Zelltod fördern. Hierbei handelt es sich einerseits um die Subfamilie mit Proteinen, wie z. B. Bax, Bak, Bok, und andereseits um die dritte Subfamilie, der die folgenden Proteine angehören: Bad, Bik/Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim/Bod und Noxa bzw. das Protein EG /l von C. Elegans. Die beiden Subfamilien, denen zum einem Bei-2, als Inhibitor der Apoptose, und zum anderen Bax, als Aktivator der Apoptose, angehören, zeichnet sich gemeinsam durch drei von vier konservierten "BH"- (Kurzbezeichnung für Bei-2-Homologie) Sequenzmotiven aus. In Gegensatz hierzu gibt es zur dritten Subfamilie, die beispielsweise durch die Säugetierproteine Bad, Bik/Nbk, Blk, Hrk, Bid, Bim/Bod und Noxa bzw. das Protein EGL/l von C. Elegans vertreten werden, nur eine Homologie mit dem kurzen BH3-Sequenzmotiv zu den beiden vorgenannten Subfamilien, weswegen Proteine dieser dritten Subfamilie im Stand der Technik auch als "BH3-only" -Proteine bezeichnet werden. Weiterhin ist bekannt, daß diejenigen Proteine, die den beiden Subfamilien mit anti- apoptotischer Wirkung angehören, sich durch einen hydrophoben C-terminal gelegenen Sequenzabschnitt auszeichnen, der die Interaktion mit dem endoplasmatischen Reticulum, der Kernhülle oder der äußeren Mitochondrien-Me bran ermöglicht. Diese das Überleben der Zelle fördernden Proteine liegen nämlich typischerweise membrangebunden vor, im Gegensatz zu anderen an der Apoptose beteiligten Pro- teinen.
Schließlich ist aus den Arbeiten von Oltvai et al ( (1993) Cell 74(4), 609-619; (1994) Cell 79 (2), 189-92) bekannt, daß die jeweils in der Zelle vorherrschenden relativen Konzentration der Proteine, die gegensätzlich wirkenden Subfamilien angehören, über den Zelltod oder das Überleben der Zelle entscheiden. Hierbei könnte die Tatsache, eine Rolle spielen, daß die gegensätzlich wirkenden Proteine aus den jeweiligen Subfamilien, d. h. Proteine mit pro- oder anti-apoptotischer Wirkung, Heterodimere bilden können, die deren jeweilige gegensätzliche Wirkung aufzuheben in der Lage sind. Dabei ist bislang noch nicht geklärt, ob beispielsweise Bei-2 für seine apoptoseinhibi- torische Wirkung notwendigerweise pro-apoptotische Fami- lienmitglieder, beispielsweise Bax oder Bak, binden muß, um die inhibitorische Wirkung entfalten zu können, oder ob die Bindung an diese pro-apoptotischen Proteine für die Wirkung von Bcl-2 nicht entscheidend ist (Yin et al . (1994) Nature 369 (6478), 321-323; Cheng et al . (1996) Nature 379 (6565) , 554-556) .
Aus den dargelegten Gründen ist daher im Stand der Technik die apoptotische Signaltransduktion, die Wechselwirkung zwischen Bei-2-Homologen verschiedener Subfamilien und die Vollständigkeit der an der Regulation dieses apoptotischen Signaltransduktionswegs beteiligten Proteine noch völlig unzureichend aufgeklärt. Daher ist es auch nach dem Stand der Technik nicht möglich, durch therapeutische Maßnahmen gezielt die apoptotischen Geschehnisse in der Zelle zu modulieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einerseits, apoptotische Signaltransduktionsmechanismen aufzuklären sowie solche Proteine (mit ihren Aminosäuresequenzen) und den zugrundeliegenden DNA-Sequenzen zu identifizieren, die an der apoptotischen Signaltransduktion beteiligt sind, um andererseits auf der Basis dieser Erkenntnisse und mit Hilfe ggf. pathophysiologischer Befunde Stoffe oder deren Verwendung zur Behandlung von diesbezüglichen Erkrankungen oder Störungen zur Verfügung stellen zu können.
Diese Aufgaben werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Stoffe, Verfahren und Verwendungen gemäß den Ansprüchen 1, 5, 6, 8, 11, 14, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 27, 28 und 29 gelöst. Jeweilige vorteilhafte Ausführungsformen sind in den dazu gehörigen Unteransprüchen be- schrieben.
Zur Lösung dieser Aufgaben haben die Erfinder zunächst festgestellt, daß Proteine mit einer sog. BHNo-Domäne eine entscheidende Rolle bei der intrazellulären Weitergabe oder Auslösung eines apoptotischen Signals spielen. Weiterhin können diese Proteine ggf. BH-Sequenzmotive aufweisen, bspw. mindestens ein BH1-, BH2-, BH3- und/oder BH4-Sequenzmotiv. Damit werden erfindungsgemäß Proteine mit Beteiligung an der apoptotischen Signalkaskade zur Verfügung gestellt, die einer weiteren aus dem Stand der Technik unbekannten Subfamilie von apoptotischen Signal- transduktionsproteinen angehören.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher DNA- Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 codiert (BHNo-Domäne) , einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle DNA-Sequenzen mit umfaßt, die mit den erfin- dungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Doppelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1) . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid codiert, wie in Figur 7 wiedergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente einer solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente, die die apoptotische Signalkaskade inhibieren können. Auch mit diesen erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA- Sequenzen (einschließlich der Sequenzen des komplementä- ren DNA-Stranges) sind mitoffenbart (Anspruch 2) . Die
Herstellung derartiger Derivate, Analoga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al . 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) . Hierbei werden bei den DNA-Sequenzen, die für ein Protein, das eine BHNo-Domäne enthält, codieren, ein oder mehrere Codons eingefügt, weggelassen oder substituiert, um ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure gegenüber der nativen Sequenz aufweist.
Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch DNA-Teilsequenzen, die für Abschnitte der BHNo- Domäne codieren, insbesondere für die Teilsequenz von AS 213 bis AS 459 oder bis zu einer weiter N-Terminal gele- genen AS, insbesondere weiterhin für die Teilsequenz von AS 245 bis AS 459 oder bis zu einer weiter N-Terminal gelegenen AS, weiterhin insbesondere auch für die Teilsequenz von AS 285 bis AS 459 oder bis zu weiter einer N- Terminal gelegenen AS und insbesondere weiterhin für eine Teilsequenz von AS 431 bis AS 459 oder bis zu einer weiter N-Terminal gelegenen AS. Hinsichtlich der jeweiligen AS-Sequenzen wird auf die Numerierung gemäß Figur 1A verwiesen. Allgemein gesprochen werden erfindungsgemäß DNA- Sequenzen offenbart, die mindestens eine DNA- Sequenzenthalten, die für eine mindestens 8, vorzugsweise mindestens 12, noch stärker bevorzugt mindestens 20 AS langen Teilabschnitt auf der BHNo-Domäne (AS 205 bis AS 485 gemäß Fig. 1A) codieren, einschließlich aller Derivate, Analoga oder Allele. Auch die sich aus diesen erfin- dungsgemäßen DNA-Sequenzen ergebenden AS-Sequenzen werden mitoffenbart. Ganz besonders bevorzugt sind die den AS- Sequenzen gemäß Figur 1B zugrundeliegenden DNA-Sequenzen (Repeat-Sequenzen) bzw. DNA-Sequenzen, die Abschnitte enthalten, die für diese AS-Sequenzen codieren, einschließlich aller Derivate, Allele und Analoga. Auch die durch die vorgenannten DNA-Sequenzen erhältlichen Oligo- oder Polypeptid-Sequenzen werden mitoffenbart.
Weiter bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die einen Sequenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid gemäß Figur 8 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente, oder einschließlich aller mit diesen Sequenzen hybridisierenden Sequenzen (Anspruch 3) . Vorzugsweise werden die Hybridisierungsbedingungen so gewählt, daß eine Hybridisierung bei 40°C stärker bevorzugt bei 50°C und noch stärker bevorzugt bei 60°C gegeben ist.
Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die eine der in Figur 9 angegebenen (c) DNA-Sequenzen enthalten (Anspruch 4) .
Weiterhin werden erfindungsgemäß alle DNA-Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesent- liehen dem Bcl-Rambo-Protein entspricht. Diese DNA- Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in Fig. 9 angegebenen Sequenz, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit der für Bcl-Rambo codieren DNA-Sequenz entsprechenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch aktives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Mutagenese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening-Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Apoptoseauslösung identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mutagenese-Verfahren gehören die site-directed-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer destens einer Basenveränderung vorsieht . Nach der Polymersierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeignetes Zellsystem transferiert (z.B. E.coli) und entsprechend transformierte Klone isoliert. Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al . PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese) . Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz eingeführt werden, wie z.B. Restriktionsschnittstellen, Terminationscodons . Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die eine erfindungsgemäße DNA- Sequenz, bspw. wie zuvor offenbart oder gemäß Ansprüchen 1 bis 4 beansprucht, enthalten (Anspruch 5) . Derartige erfindungsgemäße Expressionsvektoren (bspw. Plasmide) enthalten neben mindestens einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz typischerweise auch Promotor-Bereiche und Terminator-Bereiche, ggf. auch mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene) und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert wurden (Anspruch 6) . Als geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen kommen Prokaryotenhefen oder höhere eukaryotisehe Zellen in Frage. Bei Prokaryoten sind Gramnegative oder Gram-positive Organismen ausdrücklich eingeschlossen. Zu nennen ist hier E.coli oder Bazillen. Als bevorzugte Wirtszellen zur Klonierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen werden die Stämme E.coli 294, E.coli B und E.coli X1776 sowie E.coli W3110 offenbart. Bei den Bazillen stehen Bazillus subtilis, Salmonella typhimurium oder ähnliche. Wie oben bereits erwähnt, enthalten die Expressionsvektoren typischerweise mindestens eine bakterienspezifi- sehe Signalsequenz zum Transport des Proteins in das Kulturmedium. Neben Prokaryoten kommen auch eukaryotisehe Mikroben als Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Ex- pressionsvektor transfiziert worden sind, in Frage. So etwa können filamentöse Pilze oder Hefen als geeignete Wirtszel- len für die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierende Vektoren eingesetzt werden. Zu nennen ist vor allem Saccha- romyces cerevesiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)).
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden jedoch zur Expression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hintergrund einer möglicherweise erforderlichen Glyko- silierung (N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funktion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Vergleich zu Prokaryotenzellen - in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotisehe Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Men- sehen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie) , (Graham et al., J. Gen. Virol . , 36:59 (1997)), BHK (Babyhamsternierenzellen) , CHO (Zellen aus den Hamsterova- rien) , (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77:4216, (1980) ) , HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden mit Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen aufweisen, vorzugsweise Zellen des Säugetierimmunsystems, vor allem des humanen Immunsystems, transfiziert (Anspruch 7) . Insbesondere kommt die Transfektion von B- und/oder T-
Zellen in Betracht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Genprodukte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 8) . Unter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Proteine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form (Anspruch 9) . Diese Proteine weisen erfin- dungsgemäß mindestens eine BHNo-Domäne auf und regulieren oder transportieren insbesondere apoptotische, ggf. auch inflammatorische Signale. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es die in Figur 7 angegebene Aminosäuresequenz (für eine BHNo-Domäne) , oder ein funkti- onshomologes Allel, Fragment oder Derivat dieser Sequenz enthält (Anspruch 10) . Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS-Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seitenketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikörpers, Enzyms oder Rezep- tors an eine erfindungsgemäße AS-Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers oder Fett (säure) - restes oder einer Phosphatgruppe oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N- oder C-Terminus. Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusionsproteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekoppelt ist.
Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Insertion, Substitution) . Bevorzugt sind konservative Substitutionen, bei denen der physiko- chemische Charakter der ausgetauschten AS erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit aromatischer Gruppe) . Bevorzugt sind die Analoge dann, wenn die Sekundärstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Sub- stitutionen können auch weniger konservative AS-
Variationen erfindungsgemäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre Funktion als Transduktor eines apoptotischen Signals bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, Bindungsas- says oder zytotoxische Tests, überprüft werden.
Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbezogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt hervorrufen, d.h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an eine in der Kaskade stromaufwärts gelegene Sequenz aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der Apoptose. Derartige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen hergestellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site-directed" -Mutagenese einer DNA-Sequenz, die für eine erfindunsgemäßes Protein, enthaltend eine BHNo-Domäne (typischerweise Bcl-Rambo), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer reko binaten Zellkultur exprimiert Sambrook et al . , 1989, s.o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS-Sequenzen zugrundeliegenden DNA-Sequenzen.
Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsgemäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus
(N- oder C-terminal oder auch intrasequentiell) . Sie können einen dominan -negativen oder dominant-positiven Effekt haben.
Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine) , die sich erfindungsgemäß von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA- Allelen der in Figur 9 angegebenen DNA-Sequenz nach Transkription und Translation ableiten. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Aminogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfindungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder Acetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungs- gemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z.B. in Form einzelner Aminosäuren oder in Form von Pepti- den oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines erfindungsgemäßen Proteins, insbesondere am N- oder C-Terminus einer BHNo- Domäne, fusioniert sein, ggf. aber auch in die Sequenz der erfindungsgemäßen BHNo-Domäne integriert sein. Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader" -Sequenzen am N- Terminus der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz bevorzugt, die das Peptid cotranslational oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle oder in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) führen. Am N- oder am C- Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstabencode der Aminosäuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des reko binanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag-Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.
Erfindungsgemäße genomische DNA-Sequenzen können in zahlreichen Exons, die durch Introns voneinander getrennt sind, auf dem Strang des Erbinformationsmoleküls abgelegt sein, bspw. wie in Fig. IC gezeigt. Erfindungsgemäße DNA- Sequenzen können damit als cDNA (ohne intronische Sequen- zen) oder genomisch mit mindestens einer Intronsequenz vorliegen. Wie in Figur IC beispielhaft für die humane Bcl- Rambo-Sequenz angegeben, können erfindungsgemäße DNA- Sequenzen ein, zwei, drei, vier oder 5 Intronsequenzen ent- halten (in beliebiger Kombination, bspw. nur Intron 2 (5,7 kb) und Intron 3 (7,2 kb) ) , oder auch als cDNA (ohne Intronsequenz) vorliegen. Auch alle denkbaren SPLICE- Varianten (auf mRNA-Ebene) als Genprodukte gehören zum erfindungsgemäßen Gegenstand. Auch alle von diesen verschie- denen SPLICE-Varianten auf mRNA-Ebene codierten Proteine unterfallen der vorliegenden Erfindung. Damit können erfindungsgemäße Proteine die BHNo-Domäne ohne oder mit mindestens einer weiteren Exonsequenz oder Exonteilsequenz aufweisen, bspw. die AS-Sequenz von Exon III und Exon IV sowie die ersten 15 AS von Exon V in Kombination mit der Aminosäuresequenz der BHNo-Domäne auf Exon VI (mit oder ohne Transmembra -Domäne) .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemäßen Genprodukt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Protein, erkennt (Anspruch 11) . Der Begriff "Antikörper" umfaßt i.S. der vorliegenden Erfindung sowohl polyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (Anspruch 12) , chimärische Antikörper, anti-idiotypische Antikörper
(gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper) , die alle in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorgenannten Antikörper. Neben den Fragmenten von er- findungsge äßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße Antikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein) -Bestandteilen auftreten. Fragmente als solche oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Bestandteile von Fusionspro- teinen werden typischerweise durch die Methoden enzymati- scher Spaltung, der Protein-Synthese oder die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden hergestellt. Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heterogene Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tieren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehö- ren aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper können durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US- Patent 4,376,110; Ausübel et al . , Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor La- boratory (1988) ) . Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung einbezogen. Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Immunglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.
Bei den erfindungsgemäßen chimärische Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile ent- halten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse-monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen) . Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und andererseits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z.B. ergeben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybridom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogenizität beim
Menschen, so daß human/murine chimärische Antikörper vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al . , Proc. Natl. Sei. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al . Proc. Natl. Acad. Sei USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al . Nature 312 643- 646 (1984); Cabilly et al . , EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al . , EP-A- 171496; Morrion et al . , EP-A-173494; Neuberger et al . , WO 86/01533; Kudo et al . , EP-A-184187; Sahagan et al . , J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al . , WO 87/02671; Liu et al . , Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:3439- 3443 (1987); Sun et al . , Proc. Natl. Acad. Sei USA 84:214218 (1987); Better et al . , Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laboratory Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezogen.
Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper gegen einen Sequenzabschnitt auf der BHNo- Domäne als Epitop gerichtet sein (Anspruch 13) .
Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers assoziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z.B. eines Mäusestamms) als Ausgangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti- idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U.S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer An- tikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in einem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti- idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti- idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, bezüglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originären monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische
Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines monoklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere
Klone, die Antikörper von identischer Spezifität expri- mieren, identifiziert werden.
Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfin- dungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti-idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzieren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikörper auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole limpet hemocya- nin")' und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungseigenschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti-idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.
Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen, z.B. Fab und
F(ab')2. Fab und F (ab ' ) 2-Fragmente entbehren eines Fc-
Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhan- den, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht- spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab und F(ab')2 Frag- mente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen eingesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab- Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')2' Fragmenten) verwendet werden.
Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, können zur quantitativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem Protein in einer Probe eingesetzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Die Detektion kann mit Hilfe von Immunofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluoreszenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikro- skopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.
Erfindungsgemäße Antikörper (oder Fragmente dieser Antikörper) eignen sich für histologische Untersuchungen, wie z.B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoelektro- mikroskopie, für die in situ Detektion eines erfindungsgemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch erfolgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten genommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu einer solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikör- per (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in markierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Protein in der Probe zu bestimmen, sondern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebeextrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Ver- fahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträger, wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägermaterial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder löslichen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektier- bar markierten Antikörper nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewaschen werden, um nicht- gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.
Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amyläsen, natür- liehe oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann beliebige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol-Kügelchen als Träger bevorzugt sind.
Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Anti- körper an ein Enzym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Immunoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie oder andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat- Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid
Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha- Glycerophosphat-dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparigi- nase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetylcholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markierung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z.B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umgesetzten Substrats im Vergleich zu KontrollStandards erfolgen.
Weiterhin kann die Detektion durch andere I munoassays sichergestellt werden, z.B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radioimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Bioche- mistry in Molecular Biology, Work, T. et al . North Holland Publishing Company, New York (1978) . Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillati- onszählern oder durch Autoradigraphie detektiert und quantifiziert werden.
Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markierung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluorescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phy- cocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluoresca- mm. Auch fluoreszensemittierende Metalle, wie z. B. 152E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Metalle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessig- säure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Che- milumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz-markierten Antikörpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer che- mischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniu- mester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Glei- chermaßen können auch biolumineszente Verbindungen zum
Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Che- milumineszenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszenten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.
Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two- site" oder "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immunometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"-Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Antikörper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß. der Antikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, einschließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikorper enthält. Der markierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül . Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten Antikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu beseitigen.
In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sandwich" -Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger Inkubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebundene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzeitig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen
Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so bestimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts" -Sandwich-Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hinzugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf ei- ner geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkubationsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem Antikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger reagiert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer refindungsgemäßen Aminosäuresequenz, insbesondere einer
BHNo-Domäne (wie in Figur 7 dargestellt) , wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genprodukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann
(Anspruch 14) . Das Protein der erfindungsgemäßen DNA- Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssystem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die jeweili- gen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufreini- gung des von einer erfindungsgemäßen DNA codierten, rekom- binanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, abhängt. Zum Beispiel können ExpressionsSysteme ein- gesetzt werden, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z.B. Amicon oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z.B. ein Gelfiltrationsschritt oder säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.
Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z.B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed- Phase"-Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.
Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt wer- den. In diesem Fall kann das translatierte Protein se- kretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes reko binantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Methoden erhalten werden, wie sie bei Urdal et al . (J. Chromato. 296:171 (1994)) offenbart sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Expression von Genprodukten, die mindestens eine BHNo-Domäne enthalten, einschließlich aller Derivate, Analoge und Fragmente, wobei hierbei Wirtszellen mit einem Ex- pressionsvektor, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält, transformiert werden (Anspruch 15) . Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, son- dem vielmehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehörigen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformierten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum
Zwecke der Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Signaltransduktion oder fehlgesteuerter Homöostase von Überlebens- und TodesSignalen, vor allem zur Regulation der Apoptose, zu denken (Anspruch 16) . Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplan- tiert werden.
Je nach den gewünschten Bedingungen kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz hinter einen konstitutiv aktivierten Promotor geschaltet sein oder vielmehr operabel mit einem wunschgemäß induzierbaren Promotor auf dem zur Zelltrans- fektion verwendeten Expressionsvektor verbunden sein. Im Falle der Induzierbarkeit wird die erfindungsgemäße DNA- Sequenz vorzugsweise als Suizidgen eingesetzt werden können. Dies bedeutet, daß nach Transfektion der Wirtszelle die Transkription der erfindungsgemäßen, den Zelltod induzierenden Sequenz bspw. zunächst reprimiert ist oder nicht aktiviert werden kann. Die Wirtszellen, ggf. transfiziert mit mindestens einem weiteren Gen oder Genfragment (auf demselben oder mindestens einem weiteren Expressionsvektor) , beispielsweise einem Tumorsuppressor-Gen oder einem therapeutischen Gen im Falle von Erbkrankheiten, werden dann zur Gentherapie dem Patienten (re) transplantiert
(autogenes oder allogene Wirtszellen) . Falls erforderlich, kann nach Transplantation - je nach medizinischer Indikation - durch Gabe eines Inducers oder negativen Repressors die Transkription der Apoptose induzierenden erfindungsge- mäßen DNA zur Induktion des Zellsuizids eingeleitet werden. Damit kann abhängig vom Verlauf der Gentherapie die trans- plantierte Wirtszelle am Leben erhalten werden oder gezielt ausgelöst der Apoptose anheimfallen. Ganz allgemein eignet sich damit die Transfektion von Wirtszellen mit einer indu- zierbaren erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zur negativen Selektion von entsprechend transfizierten Wirtszellen.
Weiterhin werden erfindungsgemäß auch doppelt (dominant) - negative Mutanten (DN) offenbart, die den ggf. extra- zellulär induzierten Zelltod unterdrücken können. Bspw. kann es sich hierbei um Fragmente erfindungsgemäßer Sequenzen handeln, die zwar das apoptotische Signal empfangen, aber nicht mehr kaskadenartig weiterleiten können. Derarti- ge erfindungsgemäße DN-Sequenzen sind geeignet, nach entsprechender Transfektion Wirtszellen gegen die Apoptose oder zumindest gegen gewisse apoptotische Ereignisse zu schützen und die hiermit transfizierten Zellen unsterblich zu machen. Verwendungen derartiger apoptoseimmuner oder tw. apoptoseimmuner Wirtszellen ergeben sich bspw. im Rahmen der Gentherapie bei Erkrankungen, die ätiologisch durch fehlgesteuerten Untergang von Zellen (oder Geweben) hervorgerufen werden, zumindest von pathologischem Zelluntergang begleitet werden oder massenhaften pathologischen Zelltod als Symptom aufweisen (Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer, virale Erkrankungen, bspw. HIV-Infektionen) . Je nach Indikation werden die Wirtszellen allein mit erfindungsgemäßen DN-Mutanten transfiziert oder zumindest cotransfiziert, d.h. auch mit mindestens einem weiteren therapeutischen Gen auf demselben oder mindestens einem weiteren Vektor transfiziert. Ganz allgemein eignet sich damit die Transfektion von Wirtszellen mit einer erfindungsgemäßen DN-DNA-Sequenz zur positiven Selektion von entsprechend transfizierten Wirtszellen.
Die Wirtszellinien werden durch die vorgenannten Methoden gegenüber einer Vielzahl von apoptotischen Stimulanzien re- sistent. Bei den in vitro mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren manipulierten Zellen handelt es sich vorzugs- weise um solche Zellen, die im Organismus einer Fehlsteuerung der Apoptose anheimgefallen sind und durch erfindungsgemäße transformierte Zellen nunmehr nach Transplantation regeneriert werden können. Insbesondere werden in einem solchen gentherapeutischen Ansatz erfindungsgemäße Sequen- zen eingesetzt, die als doppelt-negative Mutanten das apoptotische Geschehen blockieren.
Mit dem vorliegenden Erfindungsgedanken geht aber auch ein gentherapeutisches Verfahren, das in vivo durchgeführt wer- den kann, einher. Zu diesem Zwecke werden Vektoren eingesetzt (z.B. Liposomen, Adenoviren, Retroviren oder ähnliche oder auch nackte DNA) , die die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen gezielt in die gewünschten Zielzellen des Orga- nismus insertieren. Bei den Zielzellen handelt es sich typischerweise um Zellen, deren Tod-/Überlebenshomöostase gestört ist, insbesondere um Zellen, die pathologisch eine verstärkte Disposition zur Apoptose zeigen (bspw. bei Diabetes mellitus, Morbus Parkinson, Autoimmunerkrankungen) . In diesem Zusammenhang können Fragmente einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zum Einsatz kommen, die inhibitorische Wirkung entfalten, bspw. DN-DNA-Sequenzen, die biologische Signale im wesentlichen nicht mehr weitergeben können - also keine weitere biologische bzw. apoptosetransduzierende Funktionalität aufweisen.
Vektoren, die die Apoptose durch Expression erfindungsgemäßer Sequenzen induzieren können, kommen aber auch bei in vivo Gentherapie-Verfahren als Arzneimittel in Betracht. Insbesondere wird die Verwendung derartiger viraler oder liposomaler Vektoren zur Behandlung von Tumorerkrankungen offenbart. Aber auch nackte erfindungsgemäße DNA kann diesbezüglich als Arzneimittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz (Allele, Derivate, Fragmente) oder eines erfindungsgemäßen Genprodukts zur Behandlung von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Signaltransduktion beru- hen (Anspruch 16) . Die vorgenannte erfindungsgemäße Verwendung von DNA-Sequenzen schließt auch die Verwendung von oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionsvektoren ein, die eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, bspw. eine in Fig. 9 offenbarte Nukleotidsequenz oder ein funktionelles Derivat, Fragment, Analogon oder Allel einer solchen Sequenz (oder auch ein infunktionelles Derivat einer solchen Sequenz, bspw. eine DN-Mutante) aufweisen, mit dem Ziel, die fehlgeleitete intrazelluläre Signaltransduktion zu korrigieren. Die Verwendung kann nach nach gentherapeutischen Verfahren über Injektion von nackter erfindungsgemäßer DNA oder dem Protein oder über Genfähren, insbesondere virale oder liposomale Vektoren, erfolgen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind da- her auch sowohl die Verwendung derartiger erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen, Genprodukte, Expressionsvektoren sowie die Verwendung von erfindungsgemäßen Zellen, die mit erfindungsgemäßen Expressionsvektoren transfiziert sind, als Arzneimittel.
Erfindungsgemäße Polypeptide, Expressionsvektoren oder DNA- Sequenzen bzw. deren jeweilige Derivate, Analoge oder Fragmente können verschiedenen Verwendungszwecken dienen, bspw. die Apoptosereaktion verstärken, wenn ein solcher Effekt erwünscht ist, bspw. bei anti-Tumor-, anti-Entzündungs oder anti-HIV-Anwendungen. Bevorzugt ist dabei die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder eines erfindungsgemäßen Genprodukts, wenn es sich bei der Erkrankung um eine solche mit einer fehlgesteuerten Zellapoptose, insbesondere um eine Apoptosedefizienz bestimmter Zellen in einem multizellulären Organismus, handelt (Anspruch 17) . Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung einer solchen DNA-Sequenz oder eines solchen Genprodukts zur Behandlung (zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be- handlung) von Tumorerkrankungen oder auch zur Bekämpfung einer überschießenden Immunantwort bei Autoimmunerkrankungen (Anspruch 18) . Zu nennen wäre insbesondere die Behandlung von soliden Tumoren, bspw. von Tumoren des Epithelgewebes (bspw. Darm, Lunge) , Gehirntumoren (bspw. Gli- oblastom, Astrozytom) , Sarkomen, Tumoren des Immunsystems, und auch Leukämien, insbesondere der akuten mye- loischen oder der chronisch myeloischen Leukämie.
Um die erfindungsgemäßen Proteine bzw. DNA-Sequenzen in die ZU behandelnden Patientenzellen zu schleusen kann bspw. ein rekombinates Tiervirus eingesetzt werden (bspw. abstammend von Vaccinia) , wobei mindestens zwei Gene hinzugefügt werden. Zum einen ein Gen für einen Liganden, der an einen Rezeptor auf der Zielzelle bindet (bspw. gpl20 für CD4-tragende Lymphozyten) und zum anderen die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zur Auslösung oder Verstärkung des Zelltods.
Andererseits können Derivate oder Fragmente erfindungsgemäßer Sequenzen, die in bezug auf die Weiterleitung des apoptotischen Signals infunktionell sind, auch als Arzneimittel eingesetzt werden, bspw. DN-Mutanten erfindungsgemäßer Sequenzen. Sie dienen insbesondere zur Be- handlung von degenerativen Erkrankungen, bspw. neurodege- nerativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, oder Infektionserkrankungen. Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden also Verbindungen zur Verfügung gestellt, die dadurch gekennzeichnet, daß sie die Funktion der erfindungsgemäßen Genprodukte (Proteine) als intrazelluläres Signalmolekül einer apoptotischen Signal- kaskade zur Auslösung des Zelltods modulieren, insbesondere inhibieren (Anspruch 19) . Insbesondere blockieren erfindungsgemäße Verbindungen die spezifische durch Bcl- Rambo vermittelte Aktivierung der Caspase-3 (Anspruch
20) . Bevorzugt handelt es sich bei einer erfindungsgemäßen chemischen Verbindung, die die Apoptose blockiert, um ein Oligo- oder Polypeptid (s.o. zur DN-Mutante) , das chemisch modifiziert (bspw. zur erleichterten Passage durch die Zellmembran, insbesondere durch endständige
(vor allem N-terminale) Sequenzbereiche) sein kann oder auch nicht modifiziert sein kann. Ggf. kann ein derartiges Oligo- oder Polypeptid auch dadurch chemisch modifiziert sein, daß die amidartige Bindung zwischen den ein- zelnen Aminosäuren durch eine gegen proteolytischen Abbau resistente alternative chemische Gruppe (bspw. Schwefel- oder Phosphorbrücken) ersetzt wird.
Eine Inhibition der Apoptose, wie sie bspw. beim septi- sehen Schock, GvHD oder akuter Hepatitis erwünscht ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fachmann geläufige Verfahren Oligonukleotide, die für einen Anti- sense-Strang der nativen Bei-Rambo-Sequenz oder eines anderen nativen Proteins mit einer BHNo-Domäne codieren, in die betroffenen Zellen einzuschleusen. Hierdurch wird die in den entsprechend transformierten Zellen die Translation der nativen mRNA von bspw. Bcl-Rambo blockiert, was im Ergebnis die Überlebensfähigkeit der transfizierten Zelle steigert. Auch in diesem Fall kan das oben beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinater Viren eingesetzt werden. Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose bei Erkrankungen, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung beruhen, kann auch durch Ribozym-Methoden therapiert wer- den. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart, die native Bei-Rambo-mRNA oder die mRNA anderer BHNo-Domänen enthaltender Proteine spalten können. Erfindungsgemäße Ribozyme müssen dabei mit der er- findungsgemäßen Ziel-mRNA interagieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. Bcl-Rambo zu blockieren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifi- zierte Tierviren, insbesondere Retroviren) , wobei die
Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA -Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist) .
Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung ist vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung mit einem Mole- kulargewicht von <5000, insbesondere <3000, vor allem <1500 und ist typischerweise physiologisch gut verträglich und kann vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren (Anspruch 21) . Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammensetzung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugsweise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das organische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die Domäne BHNo eines erfin- dungsgemäßen Proteins, mindestens 107 mol"1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra) membranöse Transportpro- teine (Anspruch 22), ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten AS-Sequenz.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen die BHNo-Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch gentherapeutische in vivo Verfahren in Wirtszellen einge- schleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern intrazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige erfindungsgemäße "Intrabodies" sind die Zellen vor einer apoptotischen Reaktion geschützt. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pathophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zeigen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Ke- ratinozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskelzellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch derartig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß als Inhibitoren der durch Bcl-Rambo vermittelten Apoptose insbesondere die Substanzklasse der sogenannten IAPs wirkt.Neben c- IAP-1 und c-IAP2 sind insbesondere die xIAPs als starke Inhibitoren hervorzuheben. In diesem Zusammenhang wird die Druckschrift von Deveraux und Reed ( (1999) , Genes Dev. 13(3), 239-252) explizit vollinhaltlich in die Offenbarung des vorliegenden Erfindungsgegenstands einbezogen.
Eine erfindungsgemäße chemische Verbindung mit der Funk- tion der Blockade der bspw. apoptotischen Funktion von erfindungsgemäßen physiologischen Proteinen kann als Arzneimittel Verwendung finden. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße chemische Verbindung (zur Herstellung eines Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die zumindest tw. eine pathologische hyperapoptotisehen Reaktion kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (bspw. ein Intrabody) , ein Ribozym, anti-sense RNA, dominant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten inhibitorischen organischen Verbindungen) der zellulären Funktion eines erfindungsgemäßen Proteins, also bspw. der apoptotischen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der folgenden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabetes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, vi- rale Infektionserkrankungen (bspw. HIV) , degenerativen Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkrankungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz) oder akuter Hepatitis (Anspruch 25) . Die vorgenannten apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäßen Substanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger- Hilfsund/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammensetzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die biologische Verfügbarkeit und/oder die Pharmakodynamik zu verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verfahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von Verbindungen mit inhibitorischen Eigenschaften in Hinblick auf die Auslösung oder Weiterleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftretende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelöste apoptotischen Reaktionen in Zusammenhang stehen. Erfindungsgemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für das Protein Bcl-Rambo codiert, ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens einen Apoptoseinhibitor codiert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für min- destens ein Reportergen codiert, transfiziert werden, und
(b) ein zur Beobachtung der Bcl-Rambo vermittelten Apoptose geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Ver- gleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird (Anspruch 23) . Hierzu werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer die Apoptose inhibierenden Wirkung der
TestSubstanz deren ID50-Wert bestimmen zu können. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes "Screening-Verfahren" dann, wenn der zur Transfektion eingesetzte Apoptoseinhi- bitor FLIP, CrmA, DN-FADD und/oder DN-Caspase-9 und das Reportergen bspw. ß-Galaktosidase ist (Anspruch 24) .
Ein erfindungsgemäßes "Screening" -Verfahren kann auch mit Hilfe von sogenannten "Proteomics" -Techniken durchgeführt werden. Hierzu werden zur Bestimmung eines Standards ty- pisehe Unterschiede im Expressionsmuster von Zellen mit apoptotischer Reaktion und Kontrollzellen experimentell erhoben. Methodisch wird für ein derartiges Verfahren typischerweise die 2D-Gelelektrophorese eingesetzt.
Erfindungsgemäße Sequenzen können auch in Verfahren ein- gesetzt werden, die die Identifizierung von zellulären Interaktionspartnern des Proteins Bcl-Rambo zum Ziel haben. Ein derartiges Verfahren kann bspw. mit der sog. "Yeast-two-hybrid" -Methode durchgeführt werden, die dem Fachmann geläufig ist (Anspruch 26) oder über affinität- schromatographisehe Verfahren. Damit wird auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder eines Genprodukts einer derartigen erfindungsgemäßen Sequenz zur Identifizierung von weiteren an der apoptotischen Si- gnaltransduktion beteiligten Proteinen offenbart (Anspruch 27) . Im Rahmen der Affini ätschromatographie werden erfindungsgemäße AS-Sequenzen oder deren Derivate, Analoge, Fragmente oder Allele an eine Matrix gekoppelt, mit bspw. Zellextrakten in Kontakt gebracht und nach einem Waschschritt erfolgt die Eluierung mit nachfolgender Charakterisierung der eluierten Komplexe.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figuren näher erläutert :
Fig. 1 stellt einen Vergleich der Sequenzen des erfin- dungsgemäßen Proteins Bcl-Rambo mit anti-apoptotischen
Proteinen der Bcl-2-Familie dar. Hierzu gehören die humanen Sequenzen des Proteins Bcl-2, des humanen Proteins Bei-XL und des humanen Proteins Bcl-w. Ebenso wie die vorgenannten Proteine der Bei-2-Familie weist auch die erfindunsgemäße humane Sequenz von Bcl-Rambo die charakteristischen Sequenzabschnitte BH1, BH2 , BH3 und BH4 sowie eine Transmembranregion (MA) auf. Die vorgenannten Sequenzabschnitte sind in Figur 1 umrandet. Identische Aminosäuren in den vier Sequenzen sind schwarz, ähnliche Aminosäuren sind grau unterlegt. Aus Figur la wird deutlich, daß bei der humanen Sequenz von Bcl-Rambo C- terminal von der BH2-Region ein mehr als 200 Aminosäuren umfassender Sequenzabschnitt eingefügt ist, gefolgt von einer C-terminalen Ankerregion. Dieser erfindungsgemäß als BHNo-Domäne bezeichnete Abschnitt enthält sog. Re- peats (Repeat A, Repeat B) , die, wie in Figur 1B dargestellt, jeweils eine mindestens 80%ige Identität aufweisen. Fig. 1B vergleicht die Sequenzen der beiden als "Repeat A" bezeichneten Regionen und der beiden als "Repeat B" bezeichneten Regionen, die im C-terminalen Bereich von Bcl-Rambo auftreten.
Fig. IC stellt die Exon-Intron-Organisation des humanen Bei -Rambo-Gens dar. Das Gen umfaßt 6 Exons (durchnumeriert von I bis VI, jeweils getrennt durch Intron-Sequenzen) . ExonI ist durch 27,4 kb von Exonll, ExonII durch 5,7 kb von ExonIII , ExonIII durch 7,4 kb von ExonlV, ExonlV durch 6 kb von ExonV und schließlich ExonV durch 24,3 kb von ExonVI getrennt. In Fig. lc sind weiterhin die Regionen BH1, BH2 , BH3 und BH4 in ihrer Lage auf den entsprechenden Exons dargestellt. Die erfindungsgemäße als BHNo-Domäne bezeichnete Aminosäuresequenzab- schnitt ist auf ExonVI zwischen dem C-terminalen Bereich des BH2-Motivs und der Transmembranregion positioniert. Grau unterlegt sind die nicht-codierenden Regionen, abgegrenzt von den codierenden Regionen durch das Start-Codon ATG und das Stop-Codon TAG (Position durch Pfeile mar- kiert) .
Fig. 2A stellt Northern Blots verschiedener humaner Gewebe dar. Diese wurden 32P-markierten cDNA-Fragmenten des N- terminaien Teils von Bcl-Rambo ausgesetzt. Bei den Gewe- ben handelt es sich um Herz-, Hirn-, Plazenta-, Lungen-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren- und Pankreasgewebe . Diese "Northern Blot" -Auftragung ergibt, daß ein Bcl-Rambo- Transkript von 4,1 kb Länge in allen untersuchten Geweben enthalten ist. Die höchsten RNA-Expressionswerte wurden iπi Herz-, Pankreas- und Plazentagewebe ermittelt. Zwei deutlich schwächere Banden von 2 , 1 kb und 1,2 kb Länge entsprechen alternativen Spliceformen von humanem Bcl- Rambo. Untersuchungen wie in Fig. 2A wurden auch für verschiedene Tumorzellinien, nämlich HL60, Heia, K562, MOLT- 4, Raji, SW480, A549 und G361 durchgeführt. In allen Zellinien wurde das 4,1 kb Transkript (also die mRNA von Bcl-Rambo) detektiert.
In Übereinstimmung hiermit stehen die Western-Blot- Untersuchungen, die die Expression von Bcl-Rambo-Protein in verschiedenen humanen und murinen Zellen (abgekürzt mit mu) darstellen. In allen untersuchten humanen Zellinien finden sich Banden für ein 85 kD Protein, das mit Hilfe von affinitätsgereinigtem Antikörper (AL167) , der gegen die Bei-2-Homologieregion von Bcl-Rambo
(Aminosäuren 1-223) gerichtet ist, detektiert wurde. Im einzelnen wurden Western-Blot-Auftragungen für Jurkat- Zellen, murine EL4-Zellen (Leukämie T-Zellen) , A20- Zellen, Raji-Zellen, Ramos-Zellen, Bjab-Zellen, Raw- Zellen (Lymphoma-B-Zellen) , THP-1-Zellen, U937-Zellen, K562-Zellen (Monozyten-Zellinien) , HeLa-Zellen (Cervix- Karzinomzellen) , HEK293-Zellen, und 293-T-Zellen (embryonische Nierenzellinien) untersucht.
Um zu überprüfen, ob die 85 kD Banden in den Western- Blot-Auftragungen gemäß Fig. 2C dem Bcl-Rambo Protein entsprechen, wurden 293T-Zellen mit verschiedenen Flag- markierten Bcl-Rambo-Expressionsplasmiden transfiziert. Hierbei wurden Expressionsplasmide eingesetzt, die (a) die humane Sequenz von Bcl-Rambo in Vollänge (Aminosäuren 1-485) , (b) die Bei-2-Homologie-Domäne (Aminosäuren 1-223 des humanen Bcl-Rambo-Proteins) , und (c) schließlich die C-terminale Region von Bcl-Rambo, einschließlich der
BHNo-Domäne (Aminosäuren 205 - 485 des humanen Bcl-Rambo- Proteins) , exprimiert. Diese Zellextrakte wurden mit Hilfe von anti-Flag-Antikörper M2 untersucht, wie in der linken Auftragung von Fig. 2D dargestellt, und mit poly- klonalem Antikörper gegen Bcl-Rambo (wie in der rechten Darstellung aufgetragen) behandelt. Hierbei zeigte sich, daß das humane Bcl-Rambo-Protein in Vollänge ein Molekulargewicht von ca. 85 kD aufweist, die N-terminale Bei-2- Homologiedomäne von Bcl-Rambo bei ca. 28 kD detektiert wird und die charakteristische C-terminale Domäne (AS
205-485) ein überraschend hohes Molekulargewicht von ungefähr 52 kD aufweist .
Fig. 3 zeigt die subzelluläre Lokalisierung des Bcl- Rambo-Proteins, die mit Hilfe von konfokaler Lasermikroskopie ermittelt wurde. Hierzu wurden HeLa-Zellen mit Ex- pressionsplasmiden, die die Sequenz für das Bcl-Rambo Protein in voller Länge, also die Aminosäuren 1 - 485, einerseits oder andererseits für das Bcl-Rambo-Protein ohne die C-terminale Transmembrandomäne, also nur die Aminosäuren 1 - 459 (abgekürzt mit ΔMA) , enthalten, transfiziert. Die Bestimmung der Lokalisierung erfolgte 48 Stunden nach der Transfektion, wobei hierzu anti-Bcl-
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ziert. Bei den Apoptoseinhibitoren wurden die folgenden
Proteine gewählt: FLIP, CrmA, cIAP-1, cIAP-2, XIAP, DN-F- ADD, DN-Caspase9, Bcl-XL sowie ein Vergleichsexperiment ohne Zugabe eines einen Apoptoseinhibitor exprimierenden Vektors ("none") . Aufgetragen findet sich die Erhöhung der Caspase-3 -Aktivität (als Vielfaches, normalisiert nach Maßgabe der gleichfalls gemessenen ß-Galactosidase- Aktivität, weswegen die einzelnen Versuchsansätze vergleichbar sind. Die Ergebnisse in Fig. 6 zeigen, daß die Co-Expression von cFLIP, einer dominant negativen Form von FADD, CrmA, Bcl-Cl und einer dominant negativen Form der Caspase-9 entweder nicht oder nur marginal den durch Bcl-Rambo indizierten Zelltod blockieren können. Gleichwohl, in Fig. 6 nicht dargestellt, ist der Bcl-Rambo in- duzierte Zelltod Caspase-abhängig, da er vollständig durch den Pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk unterdrückt werden kann. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, daß der Bcl-Rambo induzierte Zelltod unabhängig von einem Todesrezeptor bzw. dem apoptotischen Cytochrom C-Apafl- Caspase-9-Signalweg verläuft. In Fig. 6A kann ebenfalls beobachtet werden, daß ein inhibitorischer Effekt sich nach Co-Expression von xIAPs ergibt und auch die Apoptoseinhibitoren c-IAPl und C-IAP2 inhibitorische Wirkung zeigen. Für die Apoptose-Inhibitoren der IAP-Familie konnte bereits früher nachgewiesen werden, daß sie an die Caspasen-3 bzw. -6 und in geringerem Maß an die Caspase- 9, aber nicht an die Caspasen 1, 6, 8 oder 10 binden und diese inaktivieren.
Gemäß den in Fig. 6B dargestellten Resultaten verhalten sich die Apoptose-Inhibitoren gegenüber der Expression von transfiziertem C-terminalen Bcl-Rambo, das für die BHNo-Domäne und die Membranankerdomäne (Aminosäuren 205 - 485) codiert, genauso wie für das Vollängenprotein (s. Fig. 6A) .
Fig. 7 stellt die Aminosäuresequenz der C-terminalen Domäne von humanem Bcl-Rambo dar, die auch die BHNo-Domäne enthält. Es handelt sich um den Sequenzabschnitt zwischen Aminosäure 205 und Aminosäure 485 des Vollängenproteins von humanen Bcl-Rambo.
Fig. 8 zeigt die Vollängen-Aminosäuresequenz von Bcl- ϊ Rambo, einem 485 Aminosäuren umfassenden Protein. Die cDNA-Sequenz von humanem Bcl-Rambo in der Langform mit allen Exons (I - VI) ist in Fig. 9 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:
1. Ausführungsbeispiel
Die Identifizierung der Sequenz von Bcl-Rambo
Mit Hilfe einer Datenbanksuche und einer Profilierung der Recherche mit einem spezifischen Suchmuster wurde der EST Klon T48205 identifiziert, der - wie sich später herausstellen sollte - für eine kurze Splice-Variante von huma- nem Bcl-Rambo codiert. Diese Splice-Variante weist nach Transfektion die N-terminalen Aminosäuren 1 - 200 des später identifizierten insgesamt 485 Aminosäuren umfassenden Proteins Bcl-Rambo auf. Ein weiterer EST-Klon (AA190545) konnte identifiziert werden, der den Bereich der C-terminalen Aminosäuren 255 bis 485 des Vollängenproteins Bcl-Rambo entspricht. Daraufhin wurde eine cDNA- Bibliothek verwendet, um fehlende weitere Abschnitte des Bcl-Rambo Proteins zu amplifizieren. Wie sich später herausstellen sollte, handelte es sich um den Bereich der Aminosäuren 201 - 254 von Bcl-Rambo. Der fehlende Bereich wurde unter Zuhilfenahme vom 5 ' -Vorwärts-Primer JT1108 (5'-CCT TCA CCA GCA CAG GCT TTG ACC G-3 ' ) und des 3'- Rückwärts-Primers JT1109 (5'GGA CCA CCT CCT CCA CTT CAG TAG G-3') amplifiziert. Das sich hieraus ergebende PCR- Produkt wurde in einer gegen den Uhrzeigersinn weisenden Richtung des PCR-Blunt Vektors cloniert (von Invitrogen) . Das durch die Schnittstellen für Notl und Ba Hl vorgegebene Fragment wurde dann in die entsprechenden Notl- und BamHl-Restriktionsschnittstellen des EST-Klons AA190545 insertiert, wobei sich hierdurch ein Fragment von Bcl-Rambo ergab, das - wie sich später herausstellte - den Aminosäuren 78 - 485 entsprach. Doppel-PCR-Methoden wurden durchgeführt, um zum Vollängen-Bcl-Rambo-Protein zu gelangen. Hierzu wurden 2 DNA-Fragmente aus dem Plas- mid, das das Bcl-Ra bo-Fragment (Aminosäuren 78 - 485) trägt, unter Zuhilfenahme von 5' -Primer JT1145 (5'-CAT ACC TCG AGG ACT ATT C-3') und vom 3 ' -Primer (flankiert von der Notl-Schnittstelle) JT1144 (5 '-TAG CGG CCG CCT ATT TCT TTC TCA G-3') einerseits und dem EST-Klon T48205 unter Zuhilfenahme des 5 '-Primers (flankiert von der Eco- RI Schnittstelle) JT1143 (5'-AAA GAA TTC ATG GCG TCC TCT TCT AC-3') und des 3 ' -Primers JT1146 (5' -GAA TAG TCC TCG AGG TAT G-3') andererseits amplifiziert . Die beiden sich hieraus ergebenden DNA-Fragmente wurden vermischt und durch PCR-Methoden ohne Primer amplifiziert , gefolgt von einer Amplifizierung mit den Primern JT1143 und JT1144. Das PCR-Produkt wurde in den Vektor PCR-Blunt kloniert und das EcoRI/Notl-Fragment wurde dann in eine modifizierte Version des Vektors PCR3 (von Invitrogen) im Leseraster mit einer N-terminalen Flag-Sequenz oder einem HA-Peptid subkloniert.
2. Ausführungsbeispiel
Funktionelle Analyse des Bcl-Rambo-Proteins
(a) Plasmidkonstruktion für die funktioneile Analyse des Vollängenproteins Bcl-Rambo (Aminosäuren 1 - 485) :
Hierzu wurden verschiedene Konstrukte hergestellt, die Teilsequenzen des Vollängenproteins entsprechen.
1. Bcl-Rambo umfassend Aminosäuren 1-201 (Bcl-Rambo (1- 201) ) : Dieses Konstrukt wurde durch PCR-Methoden aus dem EST-Klon T48205 mit einem 5 ' -Vorwärts-Primer, der die EcoRI-Schnittstelle enthält, JT993 (5'-AAA GAA TTC ATG GCG TCC TCT-3') und dem 3 ■ -Rückwärts-Primer, der eine Notl-Schnittstelle enthält, JT994 (5' -TAG CGG CCG CTC ATA CCC AGC CAC C-31) amplifiziert und anschlie- ßend in den PCR-Blunt-Vektor kloniert .
2. Die anderen Deletionsmutanten des Vollängenproteins von Bcl-Rambo wurden durch PCR-Amplifikation unter Zuhilfenahme des Vollängenproteins Bcl-Rambo als "Template" mit einem 5 ' -Vorwärts-Primer, flankiert von einer EcoRI-Schnittstelle, und einem 3 ' -Rückwärts- Primer, flankiert von einer Notl-Schnittstelle, wie folgt , konstruiert :
2.1 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 1 - 223 (Bcl- Rambo (1 - 223)): 5'-Primer JT1143 und 3 ' -Primer JT1244 (5'-AT AGC GGC CGC CTA GTC ATT GCT ATC TTC GT- 3'),
2.2 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 1-459 (Bcl-Rambo (1-459)): 5' -Primer JT1143 und 3 ' -Primer JT1245 (5'-AT AGC GGC CGC CTA AGA CTT GCC CTC AGA C-3 ' ) ;
2.3 Bcl-Rambo, umfassend die Aminosäuren 205 - 485 (Bcl- Rambo (205-485)): 5 '-Primer JT1251 (5'-AAA GAA TTC AGT
CTT GAG TCA GAG G-3') und 3 ' -Primer JT1144;
2.4 Bcl-Rambo umfassend die Aminosäuren 205 - 459 (Bcl- Rambo 205 - 459)): 5 '-Primer JT1251 und 3 ' -Primer JT1245.
Die EcoRI/Notl -Fragmente wurden in eine modifizierte Version des PCR3-Vektors mit einem N-terminalen Flag-Epitop subkloniert .
(b) Zellinien
Die vorgenannten Konstrukte wurden zur Transformation von Zellinien verwendet, die so aufgezogen und kultiviert wurden, wie in der Druckschrift von Thome et al . ((1999) J. Biol . ehem. 274(15), 9962-8) beschrieben. Die vorgenannte Druckschrift ist hinsichtlich ihrer experimentellen Beschreibung daher vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.
(c) Untersuchungen der transfizierten Zellen
1. "Western-Blotting" -Untersuchungen Zunächst wurden hierfür ungefähr 106 293T-Zellen pro 10 cm Kulturschale mit den jeweiligen Expressionsplasmiden mit Hilfe der Calciumphosphat/HEPES-Methode - wie bei Ausubel et al . ((1999) Introduction of DNA into Mammalian Cells. Current Protocols in Molecular Biology (Chanda, V. B. Ed.) 2.4 vols. John Wiley & Sons, Inc.) beschrieben - transfiziert. Die Methodenbeschreibung von Ausubel et al . ((1999) Introduction of DNA into Mammalian Cells. Current Protocols in Molecular Biology (Chanda, V.B. E.), 2.4 vols. John Wiley & Sons, Inc.) ist daher vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. 30 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und in einem vollständigen NP40-Lysepuffer auf Eis lysiert . Der NP40- Lysepuffer entspricht 1% Nonidet P-40-Lysepuffer mit 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und Proteaseinhibitor- Cocktail (Complete, von Boehringer Mannheim) .
Für die nachfolgende Immunopräzipitation wurden die post- nukleären Lysate zunächst in bezug auf ihren Proteinanteil normalisiert (um die einzelnen Meßreihen vergleichen zu können) , auf Sepharose 6B (von Sigma) für die Dauer von 2 Stunden bei 4°C vorgereinigt und dann erst der Immunopräzipitation mit anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen (von Sigma) für mindestens 2 Stunden bei 4°C auf einer rotierenden Scheibe der Immunopräzipitation unterzogen. Die Immunopräzipitate wurden zwei Mal mit Lysepuffer gewaschen, der 1% bzw. 0,05% NP-40 enthielt, und die gewaschenen Kügelchen ("beads") wurden in reduzierendem Pro- benpuffer vor der SDS-PAGE-Auftragung und dem nachfolgenden "Western Blotting" gekocht.
Für die "Western Blotting" -Analyse wurden die jeweils mit entweder Flag-, HA- oder EE-Markern markierten, immuno- präzipitierten Proteine durch anti-Flag-M2-Antikörper (von Sigma) (gerichtet gegen Flag-Markierungen) , durch anti-VSV P5D4-Antikörper (von Sigma) (gerichtet gegen die HA-Markierung) oder durch anti-EE-Antikörper (von Euro- gentec) (gerichtet gegen EE-markierte Proteine) detektiert. Zur Bestimmung des zellulären (also endogenen) Bcl-Rambo-Proteinanteils wurden affinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper (AL167) in Zellysaten (50 ^μg) eingesetzt.
AL167-Antikörper wurde in Kaninchen gegen rekombinantes Bcl-Rambo-Protein hergestellt, und zwar gerichtet gegen dessen N-terminalen Teil, umfassend die Aminosäuren 1- 223. Schließlich wurden der polyklonale Antikörper dann auf immobilisiertem Antigen äffinitatsgereinigt , so wie es dem Fachmann nach dem Stand der Technik geläufig ist.
Die Aminosäuren 1 - 223 stimnmen mit dem entsprechenden Abschnitt des humanen Bcl-Rambo-Proteins überein. Die "Western Blots" wurden dann mit Peroxidase gekoppeltem
Ziegen-anti-Maus- oder -anti-Kaninchen-Sekundärantikδrper entwickelt (von den Jackson ImmunoResearch Laboratorien) .
2. Die "Northern Blots" (von Clontech) wurden durch Hy- bridisierung nach Einsatz von zufallsbedingt markierten radioaktiven Proben in ExpressHyb-Puffer (von Clontech, Palo Alto, Kalifornien) nach ungefähr 3 Stunden erhalten, dann bei Raumtemperatur für die Dauer von 40 Minuten mit mehrmaligem Wechsel von 2 x SSC/0,1% SDS gewaschen, ge- folgt von 0,1 x SSC/0,05% SDS für 40 Minuten bei 50°C.
(d) Untersuchungen zur Apoptose 293T-Zellen (3 x 105 Zellen) wurden auf 60 mm Kulturschalen am Tag vor der Transfektion ausgesetzt und dann tran- sient mit 2 μg Bcl-Rambo-Expressionsplasmiden und 0,2 μg EGFP-Expressionsvektor (pEGFP-Cl, von Clontech) oder mit 0,5 μg pCMV-ß-Galactosidase-Expressionsvektor co- transfiziert . Die postnukleären Lysate wurden dann in Hinblick auf die Fluoreszenz-Intensität von EGFP, die Ga- lactosidase-Aktivität und die Caspase-3-Aktivität untersucht, indem ein Peptid-Substrat (Ac-DEVD-AMC, von Ale- xis) verwendet wurde. Um die einzelnen Messungen vergleichen zu können, wurde die Caspase-3-Aktivität (gemessen als x-faches der Induktion) mit Hilfe der Fluoreszenzintensität von EGFP bzw. der ß-Galactosidase-Aktivität normalisiert .
(e) Immunmarkierung und konfokale Laser-Rastermikroskopie ("Laser Scanning Microscopy")
Am Tag vor der Transfektion wurden HeLa-Zellen auf 20ml Glasabdeckplättchen in 5,5 cm Kulturschalen mit einer
Konfluenz von 10 - 20% ausplattiert. Die Zellen wurden am folgenden Tag mit Hilfe von Calciumphosphat/BES-Verfahren transfiziert und ungefähr 36 Stunden nach dem Beginn der Transfektion geerntet. Um eine mitochondriale Markierung sicherzustellen, wurden die Zellen für die Dauer von 30 Minuten in Gegenwart von lμM Mitotracker (von Molecular probes) in einem Kulturmedium inkubiert. Die Zellen auf Glasplättchen wurden dann zweimal mit kaltem PBS gewaschen, für 12 Minuten in 4%igem Paraformaldehyd bei Raum- temperatur fixiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in PBS mit 0,1% Saponin (PBSS) über Nacht bei 4°C permea- bilisiert. Die Glasplättchen wurden dann für die Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 5% Milch in PBSS (PBSSM) blockiert, mit primärem Antikörper AL167 (lμg/ l) (anti-Bei-Rambo-Antikörper) für eine Stunde bei Raumtemperatur markiert, 3x mit PBSS gewaschen und mit Alexa- 488-markiertem (von Molecular probes) sekundären antiMaus- oder anti-Kanichen-Antikörper, auf 1/100 in PBSSM für eine Stunde in der Dunkelheit verdünnt, markiert. Schließlich wurden die Glasplättchen dreimal mit PBS gewaschen und mit FluorSave-Reagenz (von Calbiochem) auf Mikroskop-Plättchen befestigt. Die konfokale Mikroskopie wurde auf einem Zeiss Axiovert 100 Mikroskop (Zeiss Laser Scanning Microscope 510) durchgeführt. Um Cy5-Fluorchrom detektieren zu können, wurde ein Helium-Laser bei 633 nm gefiltert. Dagegen wurde ein Argon-Laser bei 488 nm eingesetzt, um den AIexa-Fluorchrom detektieren zu können. Standardbedingungen wurden hinsichtlich der Lochgröße für die Bildaufnahme gewählt, wobei jedes Bild ein Mittelwert aus 16 Durchläufen ist.

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Figur 7 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid gemäß Figur 7 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.
3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid gemäß Figur 8 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Alle- le oder Fragmente, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.
4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in Figur 9 ange- gebene (c) DNA-Sequenz enthält.
5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält .
6. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist .
7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle, ist.
8. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.
9. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.
10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die in Figur 7 angegebene Aminosäuresequenz enthält, einschließlich al- 1er funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate.
11. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10 erkennt.
12. Antikörper nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
13. Antikörper nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzabschnitt auf der BHNo-Domäne als Epitop gerichtet ist.
14. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten, die mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 7, einschließlich aller funktionshomologen Fragmente, Derivate oder Allele .dieser Sequenz, enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtszellen nach Anspruch 6 oder 7 unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden und das Genprodukt anschließend aus der Kultur aufgereinigt wird.
15. Verfahren zur Expression von Genprodukten, die mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß Figur 7, einschließlich aller funktionshomologen Fragmente, Derivate oder Allele dieser Sequenz, enthalten, da- durch gekennzeichnet, daß Wirtszellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert werden.
16. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprü- ehe 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der
Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter intrazellulärer Si- gnaltransduktion beruhen.
17. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 16 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter Zellapoptose, insbe- sondere Apoptosedefizienz, beruhen.
18. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 16 oder 17 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung) von Tumorerkrankungen.
19. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die intrazelluläre Funktion von Bcl-Rambo moduliert, insbesondere inhibiert .
20. Verbindung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie die durch Bcl-Rambo vermittelte Aktivierung der Caspase-3 inhibiert.
21. Verbindung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 ist.
22. Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.
23. Verfahren zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß (a) ein geeignetes Wirtszellsystem mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressionsvektor, der für das Protein Bcl-Rambo codiert, mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens einen Apoptoseinhibitor codiert, und ggf . mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reportergen codiert, transfiziert wird, und (b) ein zur Beobachtung der Bcl-Rambo vermittelten Apoptose geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivierung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Apoptoseinhibitor FLIP, CrmA, DN-FADD und/oder DN-Caspase-9 und das Reportergen ß- Galaktosidase ist.
25. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 19 bis 22 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Ar- neimittels zur Behandlung von) neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson, Muskeldystrophie, viralen Infekti- onserkrankungen und Autoimmunerkrankungen.
26. Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktionspartner des Proteins Bcl-Rambo, wobei ein sog. "yeast-two-hybrid" -System eingesetzt wird.
27. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Identifizierung von weiteren an der apoptotischen Signaltransduktion beteiligten Proteinen.
28. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen.
29. Verwendung einer DNA-Sequenz oder eines Genprodukts nach Anspruch 28, wobei das Suizidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird.
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