DE60129202T2

DE60129202T2 - Caspasen-aktivatoren

Info

Publication number: DE60129202T2
Application number: DE60129202T
Authority: DE
Inventors: Xiaodong U.T. Sothwes Dallas WANG; Chunying U.T. Southwe Dallas DU
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 2000-01-06
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2021-01-06
Also published as: JP2003518943A; EP1244787B1; EP1244787A2; WO2001049719A3; US6534267B1; ATE366309T1; CA2395344A1; CA2395344C; ES2288924T3; AU2630701A; DE60129202D1; WO2001049719A2; JP3851819B2; US6110691A

Description

Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung sind Regulatoren von Enzymen, die an der Zellapoptose beteiligt sind.
Hintergrund
Einer der regulatorischen Schlüsselschritte für die Apoptose ist die Aktivierung von Kaspasen, die zu den charakteristischen morphologischen Änderungen führt, die mit apoptotischen Zellen verbunden sind, einschließlich Chromatin-Kondensation, Fragmentierung der DNA zu nukleosomalen Fragmenten, Auflösung der Kernmembran, Externalisation von Phosphotidylserin und Bildung apoptotischer Körper, die bereitwillig phagozytiert werden (Liu et al., 1997, Cell 89, 175-184; Enari et al., 1998, Nature 391, 43-50; Sahara et al., 1999, Nature 401, 168-173; Lazcbnik et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9042-9046; Martin et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 28753-28756; Zhang et al., 1999, J. Cell Biol. 145, 99-108).
Eine Hauptkaskade der apoptotischen Kaspaseaktivierung wird durch Cytochrom c ausgelöst, ein Protein, das normalerweise in der Elektronenübertragungskette in Mitochondrien arbeitet (Liu et al., 1996, Cell 86, 147-157). In lebenden Zellen existiert Holocytochrom c ausschließlich in dem Zwischenmembranbereich der Mitochondrien und ist daher von seinem tödlichen zytosolischen Partner Apaf-1 (Zou et al., 1997, Cell 90, 405-413) abgeschottet. Bei Empfang apoptotischer Stimuli wie etwa Serumdeprivation, Aktivierung der Zelloberflächentodrezeptoren und exzessiver Schädigung der DNA wird die äußere Membran der Mitochondrien für Cytochrom c durchlässig (Review von Reed, 1997, Cell 91, 559-562). Nach der Freigabe ins Zytosol bindet sich Cytochrom c an Apaf-1 mit einer Stöchiometrie von 2:1 und bildet in der Gegenwart von dATP oder ATP einen oligomeren Apaf-1/Cytochrom-c-Komplex (Purring et al., 1999, J. American Chem. Soc. 121, 7435-7436; Zou et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 11549-11556). Dieser oligomerisierte Apaf-1/Cytochrom-c-Komplex rekrutiert und aktiviert dann die apikale Kaspase dieses Wegs, Prokaspase-9 (Li et al., 1997, Cell 91, 479-489; Zou et al., 1999). Kaspase-9 wiederum aktiviert wegabwärts liegende Kaspasen wie etwa Kaspase-3, -6 und -7, die die Hauptkaspaseaktivität in einer apoptotischen Zelle ausmachen (Li et al., 1997; Srinivasa et al., 1998, Mol. Cell 1, 949-957; Faleiro et al., 1997, EMBO J. 16, 2271-2281).
Hier offenbaren wir die Identifizierung, Reinigung, molekulare Klonierung und Charakterisierung eines neuartigen Faktors, der die Cytochrom-c/Apaf-1 -abhängige Kaspaseaktivierung fördert. Wie Cytochrom c befindet sich dieses Protein normalerweise in den Mitochondrien und wird in das Zytosol freigegeben, wenn Zellen Apoptose durchlaufen. Wir haben dieses Protein Smac genannt, für second mitochrondria-derived activator of caspase (zweiter, aus Mitochondrien stammender Aktivator der Kaspase) nach Cytochrom c. Die Zugabe von Smac zu Zytosolextrakten bewirkt eine robuste Kaspaseaktivierung in diesen Extrakten, selbst ohne die Zugabe von dATP Smac ermöglicht auch eine Kaspaseaktivierung in der Gegenwart physiologischer Pegel von Kaliumsalz.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die sich auf Polypeptidregulatoren (Aktivatoren und Inhibitoren) von Enzymen, die an der Zellapoptose beteiligt sind, insbesondere Kaspasen, beziehen. In einem bestimmten Aspekt stellt die Erfindung Polypeptid- und Polynukleotidsequenzen bereit, die für Kaspaseaktivatoren diagnostisch sind. Diese Sequenzen und die Polypeptide und Polynukleotide, die diese Sequenzen verkörpern, finden breite und vielfältige diagnostische und therapeutische Anwendungen, die an der Erkennung und/oder Modulation der Expression und/oder Funktion von Aktivatoren von Kaspasen oder Genen oder Transkripten, die derartige Aktivatoren kodieren, beteiligt sind. In spezifischeren Aspekten stellt die Erfindung genetische Sonden und Immunsonden bereit, die für Aktivatoren von Kaspasen spezifisch sind.
Da eine unerwünschte Aktivierung oder Inaktivierung von Apoptose mit vielen menschlichen Krankheiten wie etwa Krebs, Autoimmunkrankheit und neurodegenerativen Krankheiten in Verbindung gebracht worden ist, stellen die offenbarten Kaspaseregulationspolypeptide und -polynukleotide sowohl Ziele für Medikamente als auch Regulatoren zur Förderung oder Inhibierung von Apoptose bereit. Da offenbarte native Smac-Proteine während der Apoptose auf natürliche Weise aus den Mitochondrien ins Zytosol translozieren, können Smac-Proteine auch als diagnostische Marker für Apoptose während normaler Phasen oder Krankheitsphasen verwendet werden, z. B. indem markierte Smac-Proteine wie etwa Fusionsproteine verwendet werden oder indem erkennbare, Smac-spezifische Bindungswirkstoffe verwendet werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BESTIMMTER AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die folgenden Beschreibungen bestimmter Ausführungsformen und Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung geboten. Außer bei Gegenanzeige oder anderweitig angemerkt bedeuten die Begriffe „einer", „eine" und „ein" in diesen Beschreibungen und überall in dieser Patentschrift ein oder mehrere, der Begriff „oder" bedeutet und/oder und Polynukleotidsequenzen sind so zu verstehen, dass sie gegenläufige Stränge sowie alternative Hauptketten, die hier beschrieben werden, umgreifen.
Die Polypeptidsequenzen des Gegenstands finden breite und vielfältige Anwendung. In einer Ausführungsform werden die Sequenzen des Gegenstands verwendet, um Polypeptide zu synthetisieren, die wiederum eine Reihe von Anwendungen bereitstellen, einschließlich der Verwendung in proteomischen Mikrorarrays (z. B. Silzel J W et al., Clin Chem, September 1998; 44(9): 2036-2043), Modellen zur gezielten Medikamentenentwicklung, Immunogenen zur Hervorrufung von Antikörpern usw. Die Polypeptidsequenzen werden ebenfalls verwendet, um Sequenzen, die SEQ ID NO:2 oder Fragmente davon beinhalten, spezifisch zu erkennen, insbesondere mindestens eines von SEQ ID NO:2, Reste 1-78 oder SEQ ID NO:2, Reste 176-239 oder Fragmente davon oder Polypeptide, die derartige Sequenzen beinhalten. Jedes zweckdienliche Sequenzerkennungsverfahren kann verwendet werden, einschließlich rechnerischer Verfahren zur direkten Sequenzerkennung (z. B. BLAST-artige Algorithmen, Abstimmungen usw.) und physikalischer Verfahren zur Interferenzsequenzerkennung von Polymeren (z. B. Massenspektroskopie usw.).
Zusätzlich zur direkten Synthese können die Polypeptide des Gegenstands auch in Zellsystemen und zellfreien Systemen (z. B. Jermutus L et al., Curr Opin Biotechnol., Oktober 1998; 9(5): 534-548) aus kodierenden Polynukleotiden exprimiert werden, wie etwa den entsprechenden Mutter-Polynukleotiden oder natürlich kodierenden Polynukleotiden, die mit degenerierten Oligonukleotid-Primern und Sonden isoliert wurden, welche aus den Polypeptidsequenzen des Gegenstands erzeugt wurden („GCG"-Software, Genetics Computer Group, Inc, Madison, Wisconsin), oder Polynukleotiden, die für ausgewählte Expressionssysteme optimiert wurden, hergestellt durch Rücktranslation der Polypeptide des Gegenstands gemäß Computeralgorithmen (z. B. Holler et al. (1993), Gene 136, 323-328; Martin et al. (1995), Gene 154, 150-166).
Die Polypeptide des Gegenstands umfassen Fragmente der aufgeführten Sequenzen, die eine Smac-spezifische Aminosäuresequenz, Bindungsspezifität oder Funktion aufweisen. Bevorzugte Fragmente beinhalten mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, besser mindestens 25, besser mindestens 35, am besten mindestens 50 konsekutive Reste von SEQ ID NO:2, insbesondere mindestens eines von SEQ ID NO:2, Reste 1-78 oder SEQ ID NO:2, Reste 176-239, und weisen eine Aktivität der Bindung, Hervorrufung oder der Inhibition dieser Bindung oder Hervorrufung des für das entsprechende Polypeptid spezifischen Antikörpers auf.

Die spezifische Aktivität oder Funktion kann durch zweckdienliche Assays in vitro, auf Zeltbasis oder in vivo bestimmt werden: z. B. durch In-vitro-Bindungsassays usw. Bindungsassays umschließen jeden beliebigen Assay, bei dem die molekulare Wechselwirkung eines Polypeptids des Gegenstands mit einem Bindungsziel evaluiert wird. Das Bindungsziel kann ein natürliches Bindungsziel wie etwa ein regulatorisches Protein oder ein nicht natürliches Bindungsziel, wie etwa ein spezifisches Immunprotein wie etwa ein Antikörper, oder ein spezifischer Wirkstoff wie etwa die, die in Screening-Assays wie unten beschrieben identifiziert werden, sein. Die Bindungsspezifität kann im Assay durch Konstanten des Bindungsäquilibriums (üblicherweise mindestens etwa 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens etwa 10⁸ M^–1, besser mindestens etwa 109 M^–1), durch Assays der Kaspaseaktivierung oder Apoptose, durch die Fähigkeit des Polypeptids des Gegenstands, als negative Mutanten in exprimierenden Zellen zu wirken, um spezifische Antikörper in einem heterologen Wirt (z. B. einem Nagetier oder Kaninchen) hervorzurufen, usw. bestimmt werden. In einer bestimmten Ausführungsform stellen die Polypeptidfragmente des Gegenstands spezifische Antigene und/oder Immunogene bereit, besonders, wenn sie an Trägerproteine gekoppelt sind. Zum Beispiele werden Peptide kovalent an Keyhole-Limpet-Antigen (KLH) gebunden, und das Konjugat wird im kompletten Freund-Adjuvans zur Emulsion gebracht. Laborkaninchen werden gemäß einem herkömmlichen Protokoll immunisiert und zur Ader gelassen. Die Gegenwart von spezifischen Antikörpern wird durch Festphasen-Immunosorbent-Assays, die ein immobilisiertes, entsprechendes Polypeptid verwenden, siehe z. B. Tabelle 1, im Assay bestimmt. Tabelle 1. Immunogene Smac-Polypeptide, die einen spezifischen polyklonalen Kaninchen-Antikörper hervorrufen: Polypeptid-KLH-Konjugate immunisierten nach oben beschriebenem Protokoll.

Polvpeptidsequenz	Immunogenität
SEQ ID NO:2, Reste 1-8	+++
SEQ ID NO:2, Reste 4-13	+++
SEQ ID NO:2, Reste 7-17	+++
SEQ ID NO:2, Reste 13-24	+++
SEQ ID NO:2, Reste 18-27	+++
SEQ ID NO:2, Reste 35-49	+++
SEQ ID NO:2, Reste 47-54	+++
SEQ ID NO:2, Reste 71-78	+++
SEQ ID NO:2, Reste 83-92	+++
SEQ ID NO:2, Reste 115-124	+++
SEQ ID NO:2, Reste 141-148	+++
SEQ ID NO:2, Reste 166-174	+++
SEQ ID NO:2, Reste 176-184	+++
SEQ ID NO:2, Reste 183-191	+++
SEQ ID NO:2, Reste 192-200	+++
SEQ ID NO:2, Reste 201-208	+++
SEQ ID NO:2, Reste 209-216	+++
SEQ ID NO:2, Reste 215-222	+++
SEQ ID NO:2, Reste 223-231	+++
SEQ ID NO:2, Reste 232-239	+++

Die Polypeptide des Gegenstands und Fragmente davon sind isoliert oder rein: ein „isoliertes" Polypeptid wird mindestens von einigem Material, mit dem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, nicht begleitet, und macht vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.-% und besser mindestens etwa 5 Gew.-% des Gesamtpeptids in einer gegebenen Probe aus, und ein reines Polypeptid macht mindestens etwa 90 Gew.-% und vorzugsweise mindestens etwa 99 Gew.-% des Gesamtpolypeptids in einer gegebenen Probe aus. Die Polypeptide können synthetisiert, durch rekombinante Technologie produziert oder aus Zellen gereinigt werden. Eine große Vielfalt molekularer und biochemischer Verfahren steht zur biochemischen Synthese, molekularen Expression und Reinigung der Zusammensetzungen des Gegenstands zur Verfügung, siehe z. B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, New York) oder solche, die anderweitig auf dem Gebiet bekannt sind.
Die Erfindung stellt Bindemittel, die für die Polypeptide des Gegenstands spezifisch sind, Verfahren zur Identifizierung und Herstellung derartiger Wirkstoffe und ihre Verwendung bereit. Spezifische Bindemittel sind zum Beispiel in einer Vielfalt von diagnostischen und industriellen Anwendungen nützlich und umfassen somatisch rekombinierte Polypeptidrezeptoren wie spezifische Antikörper oder T-Zell-Antigenrezeptoren (siehe z. B. Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory), intrazelluläre Bindemittel, die mit Assays wie etwa Ein-, Zwei- oder Dreihybridscreens identifiziert werden, nicht natürliche intrazelluläre Bindemittel, die in Screens chemischer Bibliotheken wie unten beschrieben identifiziert werden, usw. Demgemäß stellt die Erfindung Sequenzen von komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) und Bibliotheken derartiger Sequenzen bereit.
Die CDR-Sequenzen des Gegenstands finden breite und vielfältige Anwendung. In einer Ausführungsform werden die CDR-Sequenzen des Gegenstands verwendet, um Polypeptide zu synthetisieren, die wiederum eine Reihe von Anwendungen, einschließlich Immun- Mikroarrays, Affinitätsreagenzien usw. bereitstellen. Zusätzlich zur direkten Synthese können die CDR-Polypeptide des Gegenstands auch in Zellsystemen und zellfreien Systemen (z. B. Jermutus L et al., Curr Opin Biotechnol., Okt. 1998; 9(5): 534-548) aus kodierenden Polynukleotiden exprimiert werden, wie etwa den entsprechenden Mutter-Polynukleotiden oder natürlich kodierenden Polynukleotiden, die mit degenerativen Oligonukleotid-Primern und Sonden isoliert wurden, welche aus den Polypeptidsequenzen des Gegenstands erzeugt wurden („GCG"-Software, Genetics Computer Group, Inc, Madison, Wisconsin), oder aus Polynukleotiden, die für ausgewählte Expressionssysteme optimiert wurden, hergestellt durch Rücktranslation der Polypeptide des Gegenstands gemäß Computeralgorithmen (z. B. Holler et al. (1993), Gene 136, 323-328; Martin et al. (1995), Gene 154, 150-166). Im Allgemeinen werden die CDR-Polypeptide als Bindungsdomäne eines Immunglobulins oder eines Fragmentes davon exprimiert und verwendet.
Die Erfindung stellt effiziente Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen oder Leitverbindungen für Wirkstoffe, die die Fähigkeit der Polypeptide des Gegenstands, mit einem Bindungsziel wechselzuwirken, modulieren. Eine große Vielfalt von Assays für Bindemittel wird bereitgestellt, einschließlich markierten In-vitro-Protein-Protein-Bindungsassays, Immunassays, Kaspaseaktivierungs-Assay, Assays auf Zellbasis wie etwa Apoptose-Assays usw. Die Verfahren eignen sich zum automatisierten, kosteneffektiven Screening mit hohem Durchsatz von chemischen Bibliotheken für Leitverbindungen. In-vitro-Bindungsassays nutzen eine Mischung von Komponenten einschließlich des Polypeptids des Gegenstands, das Teil eines Fusionsproduktes mit einem anderen Peptid oder Polypeptid, z. B. einer Markierung zur Erkennung oder Verankerung, sein kann, usw. Die Assay-Mischungen beinhalten ein Bindungsziel. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist das Bindungsziel ein für das Polypeptid spezifischer Antikörper. Während native Bindungsziele voller Länge verwendet werden können, wird es häufig vorgezogen, Abschnitte davon zu verwenden, solange der Abschnitt eine Bindungsaffinität und Avidität für das Polypeptid des Gegenstands bereitstellt, die sich in dem Assay zweckdienlich messen lassen. Die Assay-Mischung beinhaltet auch einen pharmakologischen Wirkstoffkandidaten. Wirkstoffkandidaten umschließen zahlreiche chemische Klassen, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen, und werden aus einer großen Vielfalt von Quellen einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen erhalten. Eine Vielfalt anderer Reagenzien kann in der Mischung ebenfalls eingeschlossen sein. Diese umfassen Reagenzien wie etwa Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien, Proteaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren, antimikrobielle Wirkstoffe usw. können verwendet werden. Die resultierende Mischung wird unter Bedingungen inkubiert, durch die sich das Polypeptid außer in der Gegenwart des pharmakologischen Wirkstoffkandidaten mit einer Referenzbindungsaffinität spezifisch an das Bindungsziel, den Abschnitt oder das Analog bindet. Die Mischungskomponenten können in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden, die die erforderlichen Bindungen bereitstellt, und Inkubationen können mit jeder beliebigen Temperatur durchgeführt werden, die eine optimale Bindung ermöglicht. Inkubationsperioden werden gleichermaßen zur optimalen Bindung ausgewählt, aber auch minimiert, um ein schnelles Screening mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Nach Inkubation wird die wirkstoffbeeinflusste Bindung zwischen dem Polypeptid und einem oder mehreren Bindungszielen auf eine beliebige herkömmliche Weise erkannt. Eine Vielfalt von Verfahren kann verwendet werden, um die Markierung zu erkennen, abhängig von der Beschaffenheit der Markierung und anderer Assay-Komponenten, z. B. durch optische Dichte oder Elektronendichte, Strahlungsemissionen, Nichtstrahlungsenergieübertragungen usw., oder indirekt erkannt mit Antikörperkonjugaten usw. Ein Unterschied der Bindungsaffinität des Polypeptids für das Ziel in Abwesenheit des Wirkstoffes im Vergleich mit der Bindungsaffinität in der Gegenwart des Wirkstoffes zeigt an, dass der Wirkstoff die Bindung des Polypeptids an das Bindungsziel moduliert. Ein Unterschied, wie hier verwendet, ist statistisch signifikant und stellt vorzugsweise einen Unterschied von mindestens 50 % und besser einen Unterschied von mindestens 90 % dar.
Die Polynukleotidsequenzen des Gegenstands finden breite und vielfältige Anwendung. Zum Beispiel werden die Polynukleotidsequenzen auch verwendet, um Smac-Sequenzen spezifisch zu erkennen, insbesondere SEQ ID NO:1, sein entgegengesetztes Komplement oder ein Fragment davon, vorzugsweise mindestens eines von SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, ein entgegengesetztes Komplement von einem von beiden oder ein Fragment von einem davon, oder Polynukleotide, die derartige Sequenzen beinhalten. Jedes herkömmliche Verfahren zur Sequenzerkennung kann verwendet werden. In einer Ausführungsform werden Kandidaten- oder unbekannte Sequenzen bestimmt und mit einer offenbarten Sequenz verglichen, um die Kandidaten- oder unbekannten Sequenzen zu klassifizieren. Zum Beispiel kann ein Algorithmus wie etwa BLAST (z. B. Build sol2.5-x86 01:40:37 05-Feb-1998, Copyright (C)1997 Warren R. Gish, der vorgegebene Parameter verwendet, Altschul et al., Methods in Enzymology, 215: 403-410 (1997)) verwendet werden, um die Verwandtschaft mit einer oder mehreren Sequenzen des Gegenstands, die für Smac-Verwandtschaft in Verfahren auf Computerbasis diagnostisch sind, zu definieren.
In einer anderen Ausführungsform werden die offenbarten Sequenzen verwendet, um Polynukleotide zu synthetisieren, oder sind in ihnen verkörpert, welche wiederum eine Reihe von Anwendungen bereitstellen, einschließlich Methodologien auf Basis von Mikroarrays, siehe z. B. Nat Genet, Jan. 1999; 21(1 Suppl), ganze Ausgabe inkl. Debouck C et al. auf 48-50; Genexpressionsanalyse, siehe z. B. Carulli JP et al., J Cell Biochem Suppl, 1998; 30-31: 286-296; Medikamentzielentdeckung und -entwicklung, siehe Z. B. Jones D A et al., Curr Opin Chem Biol, Februar 1999; 3(1): 71-76; kombinatorischer Chemie, siehe z. B. Lukas T J et al., J Med Chem., 11. März 1999; 42(5): 910-919; Ribozyme und Therapeutika, siehe z. B. Rossi JJ, Chem Biol, Feb. 1999; 6(2): R33-37; Kartierung; usw. In einer Ausführungsform können Kandidaten- und/oder unbekannte Polynukleotide isoliert, verglichen und/oder klassifiziert werden (z. B. nach Verwandtschaft) durch Hybridisierung mit einem oder mehreren offenbarten Polynukleotiden, z. B. unter Verwendung von Mikroarray-Bibliotheken von offenbarten Polynukleotiden. Derartige Polynukleotide können auch als Sonden und/oder Primer verwendet werden, um natürliche Gene und Transkripte zu lokalisieren, zu isolieren, zu amplifizieren usw. In einer anderen Ausführungsform werden die offenbarten Polynukleotide oder Fragmente oder Bibliotheken derartiger Polynukleotide für eine große Vielfalt von Anwendungen bei der Klonierung, Anzeige, Expression usw. einschließlich ,n'-Hybridsystemen, siehe Z. B. Vidal M et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27(4): 919-929 und Proc Natl Acad Sci USA. 93(19): 10315-10320 und 10321-10326; Kartierung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen unter Verwendung von Gesamtgenom-Phagenanzeigebibliotheken, siehe z. B. Palzkill T et al., Gene, 9. Okt. 1998; 221(1): 79-83; Auswahl und Screening von Peptidliganden auf DNA-Basis, siehe z. B. Bartoli F et al., Nat Biotechnol, November 1998; 16(11): 1068-1073, usw. in Zellen transfiziert.
In einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung Mikroarrays der offenbarten Polynukleotide und ihre Verwendungen, wie hier beschrieben oder angeführt, bereit. Eine große Vielfalt von Materialien und Verfahren sind auf dem Gebiet bekannt, um Polynukleotide auf diskreten Elementen von Substraten wie etwa Glas, Silizium, Kunststoff, Nylonmembranen usw. anzuordnen, einschließlich Kontaktablagerung, z. B. US-Patente Nr. 5,807,522 ; 5,770,151 , DeRisi JL et al., Curr Opin Oncol, Jan. 1999; 11(1): 76-79, usw.; Verfahren auf Photolithographie-Basis, z. B. US-Patente Nr. 5,861,242 ; 5,858,659 ; 5,856,174 ; 5,856,101 ; 5,837,832 , Lipshutz RJ et al., Nat Genet, Jan. 1999; 21(1 Suppl): 20-24, usw.; Farbstrahl-Ausgabetechnologien, z. B. Lemmo A V et al., Curr Opin Biotechnol, Dezember 1998; 9(6): 615-617; Verfahren auf Durchflussweg-Basis, z. B. US-Patent Nr. 5,384,261 ; Verfahren auf Tauchstift-Nanolithographie-Basis, z. B. Piner et al., Science, 29. Jan. 1999: 661-663, usw.; usw.
Die Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die mit einem Polynukleotid mit einer Sequenz von SEQ ID NO:1 oder mit seinem entgegengesetzten Komplement hybridisieren. In einer bestimmten Ausführungsform umschließt die Erfindung ein rekombinantes erstes Polynukleotid, das eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 36, vorzugsweise mindestens 48, besser mindestens 96 Nukleotiden beinhaltet, wobei die Sequenz in der Sequenz Ähnlichkeit mit einem zweiten Polynukleotid aufweist, das aus SEQ ID NO:1, vorzugsweise SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, oder einem entgegengesetzten Komplement davon besteht, so dass die Sequenz und das zweite Polynukleotid unter einer Hybridisierungsbedingung unter Hybridisierungsbedingung Nr. 1, vorzugsweise Nr. 2, besser Nr. 3 und so weiter bis Nr. 10, wie in Tabellen A-C identifiziert und beschrieben, hybridisieren. Wenn zum Beispiel die Hybridisierungsbedingung Nr. 7 bevorzugt wird, dann setzen somit die Bedingungen, die zum Identifizieren und Klassifizieren verwandter oder homologer Polynukleotide verwendet werden, den Hybridisierungspuffer M bei einer Hybridisierungstemperatur von 40°C und einen Waschpuffer E bei einer Waschtemperatur von 55°C ein. Bedingung Nr. 1 identifiziert Polynukleotide mit mindestens etwa 50 % Sequenzidentität mit dem Zielpolynukleotid (mit % Identität wie hier beschrieben berechnet). Mit jeder nachfolgenden Bedingung ist die Stringenz so, dass das isolierte Polynukleotid eine Sequenzidentität von mindestens 5 % mehr als die, die unter Verwendung der nächstniedrigen Bedingungsnummer isoliert würde, aufweist. Auf diese Weise identifiziert die Bedingung Nr. 2 zum Beispiel Polynukleotide, die eine Sequenzidentität von mindestens etwa 55 % mit dem Zielnukleotid aufweisen, und die Bedingungen Nr. 9 und Nr. 10 identifizieren Polynukleotide, die eine Sequenzidentität von mindestens etwa 90 % bzw. 95 % mit dem Zielpolynukleotid aufweisen.
SEQ ID NO:1 stammt von einem natürlichen menschlichen Transkript, das ein natürliches Smac kodiert (siehe Beispiele, unten).
Beispielhafte, mit höherer Stringenz hybridisierende Polynukleotide von SEQ ID NO:1 (mit Sequenzidentitäten zu SEQ ID NO:1 von etwa 95 %) werden im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:3-5 bezeichnet, und beispielhafte, mit niedrigerer Stringenz hybridisierende Polynukleotide von SEQ ID NO:1 (mit Sequenzidentitäten zu SEQ ID NO:1 von etwa 90 %) werden im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO:6-8 bezeichnet. In Situationen, in denen es gewünscht wird, enger verwandte Polynukleotide zu klassifizieren, wird die Hybridisierungsbedingung in Inkrementen von eins erhöht, bis die gewünschte Spezifität erhalten wird. Vorzugsweise weist jedes hybridisierende Polynukleotid eine Länge auf, die mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 50 %, besser mindestens 70 % und am besten mindestens 90 % der Länge der hier beschriebenen Polynukleotidsequenz, mit der es hybridisiert, beträgt.

In den Tabellen A und B wird Formamid als Prozent (Volumenteil) in einem gepufferten Verdünnungsmittel, das 1 × bis 6 × SSC beinhaltet, ausgedrückt (1 × SSC ist 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat; SSPE kann SSC ersetzen, 1 × SSPE ist 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4). Verfahrensweisen für Hybridisierungen von Polynukleotiden sind auf dem Gebiet wohl bekannt (siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologs, Wiley Interscience Publishers (1995); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989; Shilo und Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792; und PCT-Veröffentlichung WO 99/01466 .

TABELLE C

Hybridisierungsbedingung Nr.	Hybridisierungspuffer	Hybridisierungstemperatur	Waschpuffer	Waschtemperatur
1	R	25°C	L	35°C
2	R	25°C	L	40°C
3	R	27°C	L	47°C
4	R	34°C	H	45°C
5	R	40°C	F	45°C
6	0	40°C	E	50°C
7	M	40°C	E	55°C
8	L	42°C	D	60°C
9	H	42°C	C	65°C
10	G	42°C	B	70°C

Die Erfindung stellt auch Fragmente der Mutter- und/oder homologen Polynukleotide bereit, die in den vorangegangenen Verfahren verwendet werden können, besonders als Sonden zur Nukleinsäurehybridisierung und Replikations-/Amplifikationsprimer.

Diese Fragmente sind von ausreichender Länge, um spezifisch mit dem entsprechenden SEQ ID NO oder dem Komplement davon zu hybridisieren, und beinhalten im Allgemeinen mindestens 12, vorzugsweise mindestens 24, besser mindestens 36 und am besten mindestens 96 zusammenhängende Nukleotide des entsprechenden SEQ ID NO (siehe z. B. Tabelle 2). Tabelle 2. Beispielhafte Smac-Polynukleotidfragmente, die mit einem Strang von SEQ ID NO:1 unter Hybridisierungsbedingung Nr. 5 hybridisieren.

Polynukleotidfragment	Hybridisierung
SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-24	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 18-42	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 45-69	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 75-92	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 116-141	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 166-199	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 211-234	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 255-299	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 359-383	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 436-460	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 491-513	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-548	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 575-598	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 624-648	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 644-669	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 649-672	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 654-677	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 665-688	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 687-710	+
SEQ ID NO:1, Nukleotide 697-720	+

Die Polynukleotide des Gegenstands umfassen Fragmente der aufgeführten Sequenzen, die eine Smac-spezifische Sequenz aufweisen. Bevorzugte Fragmente beinhalten mindestens 34, vorzugsweise mindestens 36, vorzugsweise mindestens 56, besser mindestens 96, besser mindestens 186 zusammenhängende Nukleotide von SEQ ID NO:1, insbesondere mindestens eines von SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, einem entgegengesetzten Komplement von einem von beiden. Die Polynukleotide des Gegenstands und deren Fragmente können an andere Komponenten wie etwa Markierungen oder andere Polynukleotid-/Polypeptidsequenzen geknüpft werden (d. h. sie können Teil längerer Sequenzen sein) und sind aus synthetischen/nicht natürlichen Sequenzen und/oder sind isoliert, d. h. von mindestens einigem Material, mit dem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind, nicht begleitet, und machen vorzugsweise mindestens etwa 0,5 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 5 Gew.-% der in einer gegebenen Fraktion vorliegenden gesamten Nukleinsäure aus, und sind üblicherweise rekombinant, was bedeutet, dass sie eine nicht natürliche Sequenz oder eine natürliche Sequenz beinhalten, die an ein anderes Nukleotid oder an andere Nukleotide als die, mit denen sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist, geknüpft ist. Rekombinante Polynukleotide, die SEQ ID NO des Gegenstands oder Fragmente davon beinhalten, enthalten eine derartige Sequenz oder ein derartiges Fragment an einem Terminus, unmittelbar flankiert von (d. h. zusammenhängend mit) einer anderen Sequenz als der, mit der sie/es auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist, oder flankiert von einer nativen flankierenden Region von weniger als 10 kb, vorzugsweise weniger als 2 kb, besser weniger als 500 Basen, am besten weniger als 100 Basen, die sich an einem Terminus befindet oder unmittelbar von einer anderen Sequenz als der, mit der sie auf einem natürlichen Chromosom verknüpft ist, flankiert wird. Während die Nukleinsäuren üblicherweise RNA oder DNA sind, ist es häufig vorteilhaft, Nukleinsäuren zu verwenden, die andere Basen- oder Nukleotidanaloge beinhalten, um eine modifizierte Stabilität usw. bereitzustellen.
BEISPIELE
I. DNA-Mikroarray-Konstruktion und Verwendung für Smac-Expressions-Messungen
Vergleichende Genexpression unter Verwendung von Mikroarray-Polynukleotidbibliotheken wird im Wesentlichen wie von DeRisi et al., Science, 24. Oktober 1997; 278: 680-686, beschrieben durchgeführt. Entwicklung und Konstruktion des Mikroanordners werden, wie von Brown et al., Stanford University Department of Biochemistry, am 10. Aug. 1998 auf http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mquide/index.html veröffentlicht, durchgeführt. Alle Verfahrensweise werden bei Zimmertemperatur und mit doppelt destilliertem Wasser durchgeführt, außer anderweitig angegeben. Software: J. DeRisi und V. lyer (1999) ArrayMaker v1.5, veröffentlicht am 15. Feb. 1999 auf http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/software.html.
1. Vorbereitung der Objektträger

Materialien	Menge	Best.-Inf.
Glasmikroskopobjektträger	60	Gold Seal #3010
Objektträgerständer	2	Shandon Lipshaw #121
		⇐Jeder Ständer hält 30 Objektträger.
Objektträgerkammer	6	Shandon Lipshaw #121
		⇐Jede Kammer hält 350 ml.
ddH₂O	~5 l
NaOH	70 g
95 % Ethanol	420 ml
Poly-L-lysin	70 ml	Sigma #P 8920
Gewebekultur-PBS	70 ml
Vakuumofen (45 °C)
Objektträgerkasten	1	Research Products International
		#163000

1. Objektträger in Objektträgerständer platzieren. Ständer in Kammern platzieren.
2. SÄUBERUNGSLÖSUNG zubereiten: 70 g NaOH in 280 ml ddH₂O auflösen. 420 ml 95 % Ethanol hinzugeben. Das Gesamtvolumen beträgt 700 ml (= 2 × 350 ml); bis zur vollständigen Mischung rühren. Wenn die Lösung trüb bleibt, ddH₂O hinzugeben bis klar.
3. Lösung in die Kammern mit den Objektträgern gießen; die Kammern mit Glasdeckeln abdecken. Auf einem Rundschüttler 2 Std. lang mischen. Sobald die Objektträger sauber sind, sollten sie so wenig Luft wie möglich ausgesetzt werden. Staubpartikel stören das Beschichten und Drucken.
4. Ständer schnell in frische Kammern, gefüllt mit ddH₂O, transferieren. Ständer durch energisches Auf- und Abbewegen spülen. Spülen 4 × mit ddH₂O wiederholen. Es ist von entscheidender Bedeutung, alle Spuren von NaOH-Ethanol zu entfernen.
5. POLYLYSINLÖSUNG zubereiten: 70 ml Poly-L-lysin + 70 ml Gewebekultur-PBS in 560 ml Wasser. Messzylinder und -becher aus Kunststoff verwenden.
6. Objektträger in Polylysinlösung transferieren und 15 Min. bis 1 Std. schütteln.
7. Ständer in frische Kammern, gefüllt mit ddH₂O, transferieren. 5 × auf- und ab bewegen, um zu spülen.
8. Objektträger auf Mikrotiterplattenträgern 5 Min. lang bei 500 U/Min. zentrifugieren (Papiertücher unter die Ständer platzieren, um Flüssigkeit zu absorbieren). Objektträgerständer für den Transport in den Vakuumofen in leere Kammern mit Abdeckung transferieren.
9. Objektträgerständer im Vakuumofen bei 45°C 10 Min. lang trocknen (Vakuum ist optional).
10. Objektträger in geschlossenem Objektträgerkasten aufbewahren.
11. VOR DEM DRUCKEN DER ARRAYS: einen Probenobjektträger überprüfen, ob er hydrophob ist – ein Tropfen Wasser sollte davon abperlen. Überprüfen, dass die Polylysinbeschichtung nicht opak ist. Probenobjektträger versuchsweise bedrucken, hyb. und scannen, um die Qualität der Objektträgergruppe zu bestimmen.

2. Zubereitung der DNA-Proben
Klone von Mutter-Polynukleotiden werden mittels PCR im 96-Loch-Format mit aminoverbundenen Primern am 5'-Ende amplifiziert. Gereinigte PCR-Produkte werden in einer Konzentration von ~0,5 mg/ml in 3 × SSC suspendiert, und ~5 ng jedes Produktes werden auf beschichtetem Glas mittels der unten beschriebenen Verfahrensweisen angeordnet. Insgesamt 10 000 Elemente werden auf einem Bereich von 1,8 cm mal 1,8 cm angeordnet, wobei die Elemente voneinander mit einem Abstand von 175 μm angeordnet werden.
DNA-AUSFÄLLUNGEN

1. DNA in 96-Loch-Gewebekulturplatten mit V-Boden (Costar) transferieren.
2. 1/10 Vol. 3 M Natriumacetat (pH 5,2) + gleiches Volumen Isopropanol hinzugeben. Ein paar Stunden lang bei –20°C aufbewahren.
3. In Sorvall bei 3 500 U/Min. 45 Min. lang zentrifugieren.
4. Mit 70 % Ethanol spülen, erneut zentrifugieren.
5. Über Nacht an der Luft trocknen lassen, indem die Platten mit Folie abgedeckt oder auf Papiertücher umgewendet werden. Oder alternativ die Platten in einer Speed Vac (5 Min.) trocknen.
5. DNA über Nacht in 30 μl 3 × SSC resuspendieren.
6. In 4-μl-Aliquots in 384-Loch-Platten (Corning Costar #6557) transferieren, um 7 Duplikat-Druckplattensätze herzustellen. Platten mit Aluminiumfolie (R. S. Hughes #425-3) zur Aufbewahrung fest abdichten. Zur langfristigen Aufbewahrung Druckplattensätze abtrocknen und bei Zimmertemperatur aufbewahren. Vor der Verwendung Niederschläge in 4 μl dH₂O über Nacht resuspendieren.
7. DNA mit 16-Spitzen-Anordner punktförmig auf Polylysin-Objektträger auftragen. Die verwendeten Druckplatten zur Aufbewahrung zwischen dem 2. und 3. Mal der Verwendung abtrocknen.

3. Nachbearbeitung der Arrays

Die Mikroarrays werden dann nachbearbeitet, um die DNA an der Glasoberfläche vor der Hybridisierung mit der unten beschriebenen Verfahrensweise zu fixieren:

Materialien für 30 Arrays	Menge	Best.-Inf.
Feuchte Kammer	1	Sigma #H 6644
Umgewendeter Wärmeblock
(70-80 °C)	1
Diamantschreiber	1	VWR #52865-005
Objektträgerständer	1	Shandon Lipshaw #121
Objektträgerkammer	2	Shandon Lipshaw #121
Bernsteinsäureanhydrid	5,5 g	Aldrich #23,969-0
1-Methyl-2-pyrrolidinon	325 ml	Aldrich #32,863-4
Natriumtetraborat (1 M, pH 8)	25 ml	⇐Borsäure verwenden
		und pH mit NaOH
		einstellen.
ddH₂O	~1l
2-l-Becher	1
95 % Ethanol	350 ml

1. ARRAYS REHYDRATISIEREN: Den Boden der feuchten Kammer mit 1 × SSC füllen. Arrays mit der Oberseite nach unten über 1 × SSC platzieren und die Kammer mit einem Deckel abdecken. Rehydratisieren, bis die Array-Punkte glänzen. Die Punkte sollten leicht schwellen, aber nicht ineinander verlaufen.
2. Jedes Array (mit der DNA-Seite nach oben) auf einem umgewendeten Wärmeblock von 70-80°C 3 Sekunden lang Schnapptrocknen.
3. Grenzen des Arrays auf der Rückseite des Objektträgers mit Diamantschreiber markieren. Das Array wird nach der Nachbearbeitung unsichtbar.
4. DNA mit dem Glas mittels eines Stratalinker Set für 65 mJ mit UV quervernetzen. (Anzeige auf „650" einstellen, was 650 × 100 μJ entspricht). (Wahlweise)
5. Arrays in Objektträgerständer platzieren. Eine leere Objektträgerkammer auf einem Rundschüttler bereit halten.
6. BLOCKIERLÖSUNG zubereiten: 5,5 g Bernsteinsäureanhydrid in 325 ml 1-Methyl-2-pyrrolidinon auflösen. Unmittelbar nachdem sich das Bernsteinsäureanhydrid aufgelöst hat, 25 ml Natriumtetraborat hinzugeben.
7. Unmittelbar nach dem Einmischen der Natriumtetraboratlösung die Lösung in die leere Objektträgerkammer gießen. Den Objektträgerständer mehrere Male in die Lösung tauchen. Auf Rundschüttler 15-20 Min. mischen. In der Zwischenzeit ~700 ml Wasser (genug, um den Objektträgerständer abzudecken) in einem 2-l-Becher auf 95°C erwärmen.
8. Den Objektträgerständer vorsichtig 2 Min. lang in das Wasser mit 95°C tauchen.
9. Den Objektträgerständer 5 × in 95 % Ethanol tauchen.
10. Objektträger auf Mikrotiterplattenträgern 5 Min. lang bei 500 U/Min. zentrifugieren (Papiertücher unter den Ständer platzieren, um Flüssigkeit zu absorbieren).
11. Die Arrays unmittelbar verwenden oder in einem Objektträgerkasten aufbewahren. 1 Min. lang mit Höchstgeschwindigkeit zentrifugieren.

4. Hybridisierung der Arrays
Alles Messungen werden zum Analysieren, welche die Smac-spezifische Expression zeigen, in einer Computerdatenbank gespeichert.
Anweisungen für fluoreszente DNA-Sonden:

1. Das endgültige Volumen sollte 10-12 μl betragen, bei 4 × SSC, wie erforderlich kompetitive DNA usw. enthalted.
2. Array in Hybridisierungskammer aufsetzen. 10 μl 3 × SSC auf die Kante des Objektträgers platzieren, um Feuchtigkeit bereitzustellen.
3. 0,3 μl 10 % SDS zur Sonde geben.
4. Sonde 2 Min. lang kochen.
5. Sonde auf das Array pipettieren und ein Deckglas von 22 mm × 22 mm vorsichtig darauf setzen.
6. Hybridisierungskammer schließen und in einem Wasserbad von 63°C untertauchen.
7. 4-24 Std. hybridisieren.
8. Hybridisierungskammer auseinander nehmen und das Array in 1 × SSC/0,03 % SDS spülen.
9. Array auf einen frischen Objektträgerständer transferieren und ein 2. Mal in 0,2 × SSC spülen.
10. Ein 3. Mal in 0,05 × SSC spülen. Es ist von entscheidender Bedeutung, alles SDS zu entfernen.
11. Objektträger auf Mikrotiterplattenträgern 5 Min. lang bei 500 U/Min. zentrifugieren (Papiertücher unter den Ständer platzieren, um Flüssigkeit zu absorbieren).
12. Array umgehend scannen.

II. Identifizierung und Charakterisierung von natürlichen Smac-Polypeptiden und Polynukleotiden
Identifizierung von Smac. In einem glücklichen Experiment stellten wir fest, dass Zellextrakte, die in einem Detergenzien enthaltenden Puffer zubereitet wurden, eine signifikant stärkere Aktivität der Kaspase-3-Aktivierung aufwiesen als die, die in einem Puffer ohne Detergens zubereitet wurden. Unter der Schlussfolgerung, dass es einen membrangebundenen Faktor geben könnte, der die Kaspase-3-Aktivierung fördert, zusätzlich zu den bekannten wasserlöslichen Faktoren Apaf-1, Cytochrom c und Prokaspase-9, lösten wir den Membranniederschlag in einem Detergens und gaben ihn wieder zu dem Überstand bei 100 000 × g der pufferlöslichen Extrakte (S-100) hinzu. Die durch das Detergens gelösten Membranextrakte (SME) wiesen allein keine Aktivität der Kaspase-3-Aktivierung auf, stimulierten aber signifikant die Aktivität der Kaspase-3-Aktivierung, wenn sie der S-100-Fraktion zugegeben wurden. Das einfache Zugeben derselben Menge von Detergens zu S-100 hatte keinen Effekt auf die Kaspase-3-Aktivierung. Dieses Experiment zeigt an, dass es in der Membranfraktion einen die Aktivierung der Kaspase-3 fördernden Faktor gibt, der normalerweise in der wasserlöslichen Fraktion fehlt.
Unsere vorherigen Experimente der biochemischen Fraktionierung und Rekonstituierung, die einzig auf den S-100-Extrakten basierten, ermöglichten uns, drei Proteine zu identifizieren, die notwendig und ausreichend sind, um die Reaktion der Kaspase-3-Aktivierung in der Gegenwart von 1 mM dATP zu rekonstituieren. Diese Proteine sind Apaf-1, ein Protein von 130 kDa, das das Säugetier-Homolog zu dem Protein CED-4 in C. elegans ist (Zou et al., 1997; Yuan und Horvitz, 1992, Development 116, 309-320), Prokaspase-9 (Li et al., 1997) und Cytochrom c, das während der Homogenisierungsprozedur (Liu et al, 1996) in das S-100 freigegeben wurde. Um zu untersuchen, ob die durch das Detergens gelösten Membranextrakte Proteine enthalten, die Apaf-1 oder Cytochrom c oder Prokaspase-9 ersetzen, reicherten wir zunächst diese drei Proteine mittels Immundepletion aus den S-100-Extrakten individuell ab und gaben die durch das Detergens gelöste Membranfraktion diesen abgereicherten Extrakten zu. In diesen abgereicherten Extrakten wurde keine Aktivität der Kaspase-3-Aktivierung beobachtet, was anzeigt, dass dieser Faktor Apaf-1, Cytochrom c oder Prokaspase-9 nicht ersetzen kann. Des Weiteren hängt die Aktivität dieses Faktors von der Gegenwart von Apaf-1, Cytochrom c und Prokaspase-9 ab. Wir haben diese Aktivität Smac genannt, für second mitochrondria-derived activator of caspase (zweiter, aus Mitochondrien stammender Aktivator der Kaspase), da sich dieses Protein normalerweise in den Mitochondrien befindet.
Reinigung von Smac. Unter Verwendung eines Rekonstituierungsexperiments als Assay fraktionierten wir die Membranfraktion von großen kultivierten HeLa-Zellen, die in 0,5 % CHAPS gelöst waren. Die Aktivität von Smac wurde nach seiner Fähigkeit, die Kaspase-3-Aktivierung in S-100 zu stimulieren, bewertet. Die Reinigung von Smac wurde durch eine Verfahrensweise mit sechs Schritten (siehe experimentelle Verfahrensweisen, unten) erzielt. Die Smac-Aktivität wurde aus der Mono-Q-Säule als ein einzelner Spitzenwert bei ~250 mM NaCl eluiert. Dieselben Proteinfraktionen wurden SDS-Page, gefolgt von Silberfärbung, unterzogen. Eine Proteinbande, die bei 25 kDa migrierte, korrelierte mit der Smac-Aktivität. Natives Smac läuft ~100 kDa in einer Gelfiltrationssäule, was anzeigt, das Smac ein Homotetramer ist. Ein kontaminierendes Protein von 50 kDa, das ebenfalls in der aktiven Fraktion beobachtet wurde, korrelierte nicht mit dem Aktivitätsspitzenwert.
Molekulares Klonen von Smac. Die 25-kDa-Proteinbande aus Fraktionen 3 und 4, die aus der Mono-Q-Säule eluiert wurde, wurde einer tryptischen Verdauung unterzogen. Vier resultierende Peptide wurden durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen gereinigt und mit dem Edman-Abbauverfahren sequenziert. Datenbanksuchen deckten auf, dass diese Peptidsequenzen mit einer zuvor nicht charakterisierten cDNA in der EST-Datenbank (T53449) übereinstimmten. Unter Verwendung der EST-Sequenz als Sonde wurde eine Smac kodierende cDNA aus einer HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek geklont. Die cDNA- und kodierte Aminosäuresequenz sind als SEQ ID NO:1 bzw. 2 offenbart. Ein In frame-Stopcodon wurde vor dem initiierenden Methionin gefunden, was angibt, dass die cDNA die kodierende Region von Smac in voller Länge kodiert. Die Proteinsequenz von Smac in voller Länge wurde verwendet, um die Proteindatenbank (GeneBank und Prosite) zu durchsuchen, und keine bekannte Proteinsequenz und kein bekanntes Motiv wurde gefunden, die/das zu Smac homolog ist.
Um die Gewebeverteilung von Smac zu untersuchen, wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, die mRNA-Blots von mehreren menschlichen Adultgeweben verwendete. In allen untersuchten Geweben wurde eine vorwiegende mRNA von ~1,5 kb erkannt, was eine ubiquitäre Expression von Smac anzeigt. Die Expression von Smac-mRNA war am höchsten in adulten Hoden und hoch in Herz, Leber, Niere, Milz, Prostata und Eierstock. Smac-Expression ist gering in Gehirn, Lunge, Thymus und peripheren Blutleukozyten.
Smac ist ein mitochondriales Protein, das während der Apoptose ins Zytosol freigegeben wird. Um den genauen Aufenthaltsort von Smac in Zellen festzulegen, erzeugten wir einen polyklonalen Antikörper gegen das rekombinante Smac, das in Bakterien exprimiert wurde (Aminosäure 95-239), und verwendeten diesen Antikörper, um Smac durch Immunfärbung und biochemische Fraktionierung zu lokalisieren. Die Immunfärbung von lebenden Zellen durch Smac-Antikörper deckte ein punktiertes Muster mitochondrialer Lokalisierung auf, eine gemeinsame Lokalisierung mit Cytochrom c. Wenn die Zellen jedoch eine durch UV-Bestrahlung induzierte Apoptose durchliefen, änderte sich sowohl die Smac- als auch die Cytochrom-c-Färbung von einem punktierten mitochondrialen Muster zu einem verteilteren zytosolischen Muster. Beide Proteine begannen 2 Stunden nach der UV-Bestrahlung, die verteilte zytosolische Färbung zu zeigen, und das Muster wurde nach 8 Stunden auffälliger. Die Zellen, die die am stärksten verteilte Verteilung von Cytochrom c und Smac zeigten, demonstrierten auch kondensiertes Chromatin, wie durch DAPI-Färbung gemessen.
Um die Immunfärbungsergebnisse weiter zu bestätigen, isolierten wir mitochondriale und zytosolische Fraktionen von normalen oder U-bestrahlten HeLa-Zellen. In lebenden Zellen waren Smac und Cytochrom c ausschließlich in mitochondrialen Fraktionen lokalisiert. 2 Stunden nach der UV-Bestrahlung wurden sowohl Cytochrom c als auch Smac in der zytosolischen Fraktion beobachtet. Das zytosolische Smac und Cytochrom c stiegen bis zu 8 Stunden weiter an, mit entsprechender Abnahme ihrer mitochondrialen Gegenstücke.
Das 25-kDa-Smac ist für die Aktivität der Stimulierung der Kaspase-3-Aktivierung notwendig. Um zu bestätigen, dass das 25-kDa-Smac für die Aktivität der Förderung der Kaspase-3-Aktivierung unbedingt erforderlich ist, verwendeten wir den polyklonalen Antikörper gegen Smac, um es aus den rohen, mit Detergens gelösten Membranextrakten (SME) mittels Immundepletion abzureichern. Immundepletion unter Verwendung von Anti-Smac-Antiserum entfernte das 25-kDa-Protein quantitativ aus den SME. Das Extrakt ohne das 25-kDa-Protein verlor seine Fähigkeit, die Kaspase-3-Aktivierung in S-100 zu stimulieren, was anzeigt, dass das 25-kDa-Smac für eine derartige Aktivität notwendig ist. Das Präimmun-Serum desselben Tieres reicherte das 25-kDa-Smac und die Aktivität der Stimulierung der Kaspase-3-Aktivierung von SME nicht ab.
Reifung von Smac erfordert die Spaltung seines Signalpeptids. Um die Smac-Aktivität weiter zu charakterisieren, exprimierten wir die Smac kodierende cDNA in voller Länge in einem Baculovirus-Expressionssystem. Das rekombinante Smac wurde zur Homogenität gereinigt. Obwohl die cDNA von Smac in voller Länge einen offenen Leserahmen von 239 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von 27 kDa kodiert, beträgt Smac, das sowohl aus HeLa- als auch Sf-21-Zellen gereinigt wird, etwa 25 kDa, weniger als der gesamte offene Leserahmen. Die Helixradanalyse deckte auf, dass die N-terminale Region von Smac einer typischen mitochondrialen Targeting-Signalsequenz ähnelt: einer amphipathischen Alpha-Helix mit positiv geladenen Aminosäure-Seitenketten auf einer Seite (Arg-10, Arg-17, Arg-19, Lys-31, Lys-32, Arg-33, Arg-40) (Review von Schatz und Dobberstein, 1996, Science 271, 1519-1526). Die direkte Sequenzieranalyse zeigte an, dass das aus Sf-21-Zellen gereinigte reife Smac bei der Aminosäure 56 anfing. Dass das in Sf-21-Zellen exprimierte, rekombinante 25-kDa-Smac völlig aktiv ist, zeigt an, dass die Aminosäure 1-55 das mitochondriale Targeting-Signalpeptid ist, dass nachfolgend abgespalten wurde. Das Smac in voller Länge mit seinem intakten Signalpeptid wurde auch durch Western-Blot-Analyse in Sf-21-Zellen beobachtet, die mit dem Baculovirus-Vektor, der das Smac in voller Länge enthielt, infiziert wurden. Das Smac in voller Länge zeigte keinerlei Aktivität, was anzeigte, dass die Spaltung des Signalpeptids im Inneren der Mitochondrien ein erforderlicher Schritt ist, damit Smac seine apoptotische Aktivität erlangen kann.
Smac erhöht die Empfindlichkeit der Zellen für apoptotische Stimuli in vivo. Um die Rolle von Smac in vivo zu untersuchen, transfizierten wir HeLa-Zellen vorübergehend mit dem Smac in voller Länge, verschmolzen mit einer FLAG-Markierung an dem C-Terminus des Proteins. Vorübergehend exprimiertes Smac in Zellen induzierte keine Kaspase-3-Aktivierung und Apoptose ohne apoptotische Stimuli. Das mit FLAG markierte Smac war ausschließlich in den Mitochondrien lokalisiert. Die transfizierten Zellen wurden dann mit zunehmender Länge der Zeit unter einer UV-Lampe bestrahlt. Nach 2 Sekunden UV-Bestrahlung zeigten ~60 % von Smac-transfizierten Zellen Zeichen von Apoptose, wie durch die Kondensation ihres Chromatins gemessen. Aktive Kaspase-3 wurde auch in Extrakten aus diesen Zellen durch Western-Blot-Analyse und enzymatischen Assay beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten nur ~20 % der vektortransfizierten Zellen unter den gleichen Bedingungen Zeichen von Apoptose, und es wurde nur eine geringe Aktivität von Kaspase-3 entdeckt. Bei längerer UV-Aussetzung wurden mehr Apoptose und Kaspase-3-Aktivität beobachtet, aber der Unterschied zwischen Smac- und vektortransfizierten Zellen wurde geringer.
Smac fördert die Kaspase-3-Aktivierung ohne exogenes dATP und in der Gegenwart einer physiologischen Konzentration von Kaliumsalz. Unsere vorherigen biochemischen Untersuchungen der Kaspase-3-Aktivierung haben Apaf-1, Prokaspase-9 und Cytochrom c als für die Kaspase-3-Aktivierung notwendig und ausreichend identifiziert (Zou et al., 1999). Die Aktivierungsreaktion erfordert eine optimale Konzentration von dATP bei 0,1 mM und KCl bei 10 mM. In vivo beträgt die dATP-Konzentration jedoch um die 10 μM und die von Kaliumsalz etwa 150 mM, eine Konzentration, die für die durch Apaf-1, Cytochrom c und Prokaspase-9 katalysierte Kaspase-3-Aktivierung inhibitorisch wirkt. Um zu überprüfen, ob die Gegenwart von Smac die Kaspase-3-Aktivierung unter physiologischen Konzentrationen von dATP und Kaliumsalz fördert, gaben wir gereinigtes rekombinantes Smac aus der Baculovirus-Expression zu dialysiertem S-100 und bestimmten die Kaspase-3-Aktivierung im Assay. In der Abwesenheit von Smac wurde die Kaspase-3-Aktivierung nur beobachtet, wenn die dATP-Konzentration 0,1 mM und die von KCl 10 mM erreichte. In der Gegenwart von Smac wurde die Kaspase-3-Aktivierung selbst dann beobachtet, wenn kein exogenes dATP hinzugegeben wurde, und die Aktivierung erreichte ein Plateau bei 10 μM dATP. Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit ATP erhalten. Erstaunlicherweise wurde in der Gegenwart von Smac eine starke Kaspase-9- und Kaspase-3-Aktivierung beobachtet, selbst wenn die K⁺-Konzentration 150 mM erreichte. Die verstärkte Kaspase-3-Aktivierung erfolgte aufgrund der verstärkten Aktivierung der Kaspase-9, der wegaufwärts gelegenen Kaspase für die Kaspase-3-Aktivierung.
Experimentelle Verfahrensweisen: Allgemeine Verfahren und Materialien. Wir erhielten Nukleotide von Pharmacia; Pferdeherz-Cytochrom c von Sigma; monoklonale Antikörper gegen Cytochrom c von Pharmingen; radioaktive Materialien von Amersham und Standards für Molekülmasse für SDS-PAGE und Gelfiltrationschromatographie von Bio-Rad. Proteinkonzentrationen wurden durch das Bradford-Verfahren bestimmt; allgemeine Verfahren der Molekularbiologie wurden verwendet, wie in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Zubereitung der S-100-Fraktionen von HeLa-Zellen. Menschliche HeLa-S3-Zellen wurden in 150-mm-Gewebekulturschalen in DMEM-Medium (Dulbecco's modified eagle's medium, das 100 U/m, Penicillin und 100 mg/ml Streptomycinsulfat enthielt), ergänzt mit 10 % (Volumenteil) fötalem Kälberserum, kultiviert und in Monolager bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ gezüchtet. Bei 70 % Konfluenz wurden die Zellen einmal mit 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und durch 5 Min. langes Zentrifugieren bei 800 × g bei 4°C gewonnen. Die Zellniederschläge wurde in 3 Volumen von Puffer A (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM Natrium-EDTA, 1 mM Natrium-EGTA, 1 mM DTT und 0,1 mM PMSF) resuspendiert und Zellextrakte wurden wie in Liu et al., 1996 beschrieben zubereitet. Wenn Mitochondrien während der Extraktzubereitung intakt gehalten werden mussten, wurde der Zellniederschlag in Puffer A, der 250 mM Saccharose enthielt, wie in Yang at el., 1997, Science 275, 1129-1132, beschrieben, lysiert.
Assay für die Kaspase-3-Aktivierung. Kaspase-3 wurde wie beschrieben (Liu et al., 1996) translatiert und gereinigt. Ein 2-μl-Aliquot der in vitro translatierten Kaspase-3 wurde mit den angezeigten Proteinfraktionen in der Gegenwart von 1 mM dATP und 1 mM von zusätzlichem MgCl₂ bei 30°C 1 Std. lang in einem Endvolumen von 20 μl von Puffer A inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden jeder Reaktionsmischung 7 μl von 4 × SDS-Probenpuffer hinzugegeben. Nach 3 Min. langem Kochen wurde jede Probe einer 15 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) unterzogen. Das Gel wurde auf einen Nitrozellulose-Filter transferiert, der nachfolgend einer Phosphorimaging-Platte ausgesetzt und in einem Fuji BAS-1500 Phosphorimager sichtbar gemacht wurde.
Zubereitung gelöster Membranextrakte (SME). 250 ml Zellniederschlag aus 100 Litern von in Suspension kultivierten HeLa-Zellen (5 × 10⁶ Zellen/ml) wurden in 1 Liter Puffer A resuspendiert. Die Zellen wurden homogenisiert und Zellkerne wie in Liu et al., 1996 beschrieben entfernt. Der Überstand wurde 30 Min. lang bei 4°C mit 10 000 × g zentrifugiert, um die schwere Membranfraktion als Niederschlag zu erhalten. Der resultierende Membranniederschlag wurde in 1 Liter Puffer A, der 0,5 % (Gew./Vol.) CHAPS enthielt, resuspendiert, und die gelöste Mischung wurde 1 Std. lang bei 4 °C mit 100 000 × g in einem Beckman SW 28 Rotor zentrifugiert. Der resultierende Überstand (gelöste Membranextrakte, SME) wurde bei –80°C aufbewahrt und als Startmaterial für die Reinigung des Proteins Smac verwendet.
Reinigung von Smac aus SME. Alie Reinigungsschritte wurden bei 4°C ausgeführt. Die chromatographischen Schritte der Q-Sepharose-Säule (Pharmacia) und der Hydroxyapatit-Säule (Bio-Rad) wurden unter Verwendung herkömmlicher schrittweiser Chromatographie ausgeführt. Die chromatographischen Schritte von Phenyl-Superose, Superdex 200 und Mono Q wurden an einer automatischen Station zur schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) (Pharmacia) durchgeführt.
1 Liter gelöster Membranfraktinn (5 g Gesamtprotein) wurde auf eine Q-Sepharose-Säule (100 ml Bettvolumen) aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 200 ml Puffer A, gefolgt von 500 ml Puffer A, der 100 mM NaCl enthielt, gewaschen. Die an der Säule gebundenen Materialien wurden mit 500 ml Puffer A, der 300 mM NaCl enthielt, eluiert. Fraktionen von 50 ml wurden gesammelt und im Assay auf Smac-Aktivität bestimmt. 150 ml aktive Proteinfraktionen wurden zusammengelegt und ausgefällt, indem festes Ammoniumsulfat bis zur 40-%-Sättigung hinzugegeben wurde, und die Proteinfällungsprodukte wurden mittels einer 20 Min. langen Zentrifugation mit 35 000 × g gesammelt. Der resultierende Proteinniederschlag wurde in 170 ml Puffer A aufgelöst und auf eine Hydroxyapatit-Säule (50 ml Bettvolumen) gegeben, die mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 150 ml Puffer A, gefolgt von 150 ml Puffer A, der 1 M NaCl enthielt, und dann wieder mit 150 ml Puffer A gewaschen. Die gebundenen Materialien wurden mit 100 ml von 0,12 M KPO₄, pH 7,5 eluiert. Fraktionen von 10 ml wurden gesammelt und im Assay auf Smac-Aktivität bestimmt. Eine Gesamtmenge von 40 ml aktive Proteinfraktionen wurde zusammengelegt und 3,1 g Ammoniumsulfat wurde hinzugegeben, um eine Endkonzentration von Ammoniumsulfat von 0,5 M zu ergeben. Die Protein-Ammoniumsulfat-Mischung wurde äquilibriert, indem sie 1 Std. lang rotiert wurde, gefolgt von einer Zentrifugation bei 35 000 × g über 40 Min. Der resultierende Überstand (44 ml) wurde auf eine Phenyl-Superose-5/5-Säule (Pharmacia) geladen, die mit Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthielt, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 30 ml Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthielt, gewaschen und mit einem linearen 100-ml-Gradienten von Puffer A, der 0,5 Ammoniumsulfat enthielt, zu Puffer A eluiert. Fraktionen von 5 ml wurden gesammelt und im Assay auf Smac-Aktivität bestimmt. Eine Gesamtmenge von 15 ml aktiven Fraktionen, die bei 130-180 mM Ammoniumsulfat eluierten, wurden gesammelt und in zwei separaten Durchgängen auf eine Superdez-200-(26/60)-Gelfiltrationssäule, die mit Puffer A äquilibriert war, der 100 mM NaCl enthielt, geladen. Die Säule wurde mit demselben Puffer eluiert. Fraktionen von 4 ml wurden gesammelt, angefangen mit 90 ml Elution, und im Assay auf Smac-Aktivität bestimmt. Eine Gesamtmenge von 24 ml aktive Fraktionen wurde zusammengelegt und auf eine Mono-Q-5/5-Säule geladen, die mit Puffer A, der 100 mM NaCl enthielt, äquilibriert war. Die Säule wurde mit 10 ml Puffer A, der 200 mM NaCl enthielt, gewaschen und mit einem linearen 20-ml-Gradienten von 200 mM NaCl zu 500 mM NaCl, beides in Puffer A, eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt und im Assay auf Smac-Aktivität bestimmt.
Aktive Fraktionen (2 μg Gesamtprotein) wurden bei 270-300 mM NaCl in Puffer A eluiert und mit der Zugabe von 20 % Glycerin in gleiche Anteile aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt.
Proteinsequenzierung von Smac. Die 25-kDa-Bande (~8 pmol) aus der Mono-Q-Säule wurde aus dem mit Coomassie-Brillantblau gefärbten 15 % SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten. Die Bande wurde mit Trypsin (Promega) verdaut, und die resultierenden Peptide wurde durch eine Kapillar-FPLC-Säule mit umgekehrten Phase (IC Packing, Inc.) getrennt. Vier individuelle Peptide wurden in einem Sequenzer von Applied Biosystems sequenziert.
cDNA-Klonen von Smac. Vier Polypeptidsequenzen wurden erhalten und verwendet, um die EST-Datenbank (tBlastn) zu durchsuchen. Ein positiver EST-Klon (T53449) wurde identifiziert und als Vorlage für die Entwicklung von Oligonukleotiden verwendet, um die cDNA-Klone aus der HeLa-cDNA-Bibliothek durch PCR zu erhalten. Ein 1-ml-Aliquot (10⁸ Pfu) der IExlox-HeLa-cDNA-Bibliothek (Yokoyama et al., 1993, Cell 75, 187-197) wurde bei 99°C 15 Mm. lang erhitzt, um die DNA freizugeben, die unter Verwendung einer PCR-Reaktion mit 1 Zyklus von 94°C über 1 Min. und 35 Zyklen von 94°C über 30 Sec.; 55°C über 30 Sec. und 72°C über 1 Mm., gefolgt von einer Verlängerung bei 72°C über 10 Mm direkt mit Primern amplifiziert wurde. Ein PCR-Produkt mit 559 bp wurde erhalten und nach Subklonierung in den PCR-II-Vektor unter Verwendung eines TA-Klonierkits (Invitrogen) nachfolgend sequenziert. Das 559-bp-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Rediprime II Random Prime Labeling Kit (Amersham) mit a-³² P-dCTP markiert und als Sonde verwendet, um eine HeLa-IExlox-cDNA-Bibliothek durch das Hybridisieren von Doppelfiltern bei 42°C über Nacht in Rapid-hyb- Puffer (Amersham) zu screenen. Die Filter wurden zweimal mit 1x Salzcitrat (SSC)/0,1 % SDS über 15 Min. bei Zimmertemperatur und einmal mit 0,5 × SSC/0,1 % SDS über 10 Min. bei 65°C gewaschen. Von 5 × 10⁵ gescreenten Plaques wurden 14 positive Klone identifiziert und sequenziert. Die cDNA wurde in voller Länge von 719 bp erhalten.
Produktion von polyklonalem Smac-Antikörper. Primer wurden entwickelt, um eine 437-bp-Plasmid-Smac-cDNA mittels PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte DNA-Fragment, das die Aminosäuren 95-239 von Smac kodiert, wurde in-frame in die Xhol/BamHl-Orte des bakteriellen Expressionsvektors pET-15b (Novagen) subkloniert. Das Expressionsplasmid wurde in das Bakterium BL21(DE3) überführt. Bei einer typischen Smac-Zubereitung wurde eine 5-ml-Übernacht-Baktierenkultur, die den Smac-Expressionsvektor enthielt, zu 500 ml LB-Bouillon hinzugegeben und unter Schütteln bei 250 U/Min. bei 37°C kultiviert. Als die Extinktion der Kultur bei 600 nm 0,8 erreichte, wurde Isopropyl-1-thio-B-D-galactopyranosid (IPTG) zu der Kultur mit einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und die Kultur wurde weitere 3 Std. geschüttelt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation als Niederschlag erhalten, und der Bakterienniederschlag wurde in 10 ml Puffer B (6 M GuHCl, 0,1 M Natriumphosphat, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert. Nach Zentrifugation über 15 Min. bei 10 000 × g wurde der Überstand auf eine Nickelaffinitätssäule (4 ml) geladen. Die Säule wurde mit 300 ml Puffer B, gefolgt von 300 ml Puffer C (8 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat, 0,01 M Tris-HCl, pH 8,0) gewaschen. Die Säule wurde mit Puffer C, der 250 mM Imidazol enthielt, eluiert. ~10 mg Smac-Protein wurden aus einer 500-ml-Kultur gereinigt. Dieses gereinigte Smac-Fusionsprotein wurde verwendet, um durch das Immunisieren von Kaninchen einen polyklonalen Antikörper zu erzeugen.
Western-Blot-Analyse. Western-Blot-Analyse für Apaf-1, Kaspase-9 und Cytochrom c wurde wie zuvor beschrieben (Li et al., 1997) durchgeführt. Anti-Smac-Antiserum wurde erzeugt, indem Kaninchen mit einem rekombinanten Smac-Fusionsprotein (siehe oben) immunisiert wurden. Eine Immunblot-Analyse von Smac wurde mit Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin G durchgeführt, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, unter Verwendung von Western-Blot-Erkennungsreagenzien für Enhanced Chemiluminescence (ECL) (Amersham).
Northern-Blot-Analyse. Poly(A)⁺-RNA-Blots, die 2 μg Poly(A)⁺-RNA pro Spur enthielten, von mehreren menschlichen Adultgeweben wurden von Clontech erworben. Blots wurden mit 2 × 10⁶ cpm/ml zufällig primemarkiertem 559-bp-Smac-PCR-Fragment, das bei dem Screening der cDNA-Bibliothek (siehe oben) verwendet wurde, in Rapid-hyb-Puffer (Amersham) bei 65°C über Nacht hybridisiert. Die Filter wurden 15 Min. lang einmal mit 2 × SSC/0,1 % SDS bei 65°C, gefolgt von 15 Min. lang 1 × SSC/0,5 % SDS bei 65°C gewaschen. Dieselben Filter wurden dann abgezogen und bei 65°C 2 Std. lang mit einer 2,0-kb-β-Actin-cDNA-Sonde hybridisiert, und die Filter wurden dann wie oben gewaschen. Die Filter wurden Röntgenfilm mit einer Verstärkerfolie bei –80°C ausgesetzt.
Immunfärbung. Klebrige HeLa-Zellen wurden mit 1 × 10⁴ Zellen pro Kammerobjektträger (Nalge Nunc International) in DMEM-Medium, das mit 10 % (Volumenteil) fötalem Kälberserum ergänzt war, ausgesät und in Monolager bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ gezüchtet. 24 Std. später wurde das Medium entfernt und die HeLa-Zellen wurden 1.5 Sek. lang 3,5 cm unter einer UV-Lampe (5 000 mW/cm², Philips, G36T6L) bestrahlt. Die behandelten Zellen wurden dann weiterhin über mehrere Stunden in frischem DMEM-Medium, wie angezeigt, kultiviert. Die Zellkulturen wurden beendet, indem sie dreimal in PBS gewaschen wurden, gefolgt von Fixierung in frisch zubereitetem 3 % Paraformaldehyd in PBS über 10 Min. Die fixierten Zellen wurden jeweils 15 Min. lang dreimal in PBS gewaschen, gefolgt von Permeabilisierung in 0,15 % Triton X-100 in PBS über 15 Min. Die Zellen wurden dann 60 Min. lang in Blockierpuffer (2 % Rinderserumalbumin in PBS) blockiert, gefolgt von einer 4 Std. langen Inkubation mit entweder einem Antiserum gegen Smac (1:200) oder einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen Cytochrom c (1:200). Die Zellen wurde dreimal, jeweils 10 Min. lang, in Blockierpuffer gewaschen, gefolgt von einer 1 Std. langen Inkubation mit entweder einem Fluorescein-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:500) (Molecular Probe) für Smac, oder mit Texas-Rot markiertem Ziegen-Antimaus-IgG (1:500) (Molecular Probe) für Cytochrom c. Die immungefärbten Zellen wurden dreimal jeweils 10 Min. lang in PBS gewaschen, gefolgt von einer Färbung mit 1 μg/ml DAPI (Molecular Probe), und unter einem Nikon-Eclipse-E800-Fluoreszenz-Mikroskop untersucht.
Transfektion von HeLa-Zellen mit Smac-cDNA. Eine 719-bp-cDNA, die den ganzen Kodierbereich von Smac und eine Flag-Markierung an dem Carboxyl-Terminus enthielt, wurde in XhoI/EcoRI-Orte eines pcDNA 3.1(–)-Vektors (Invitrogen) subkloniert, und das Plasmid wurde als pcDNA-Smac bezeichnet und unter Verwendung eines Qiagen-Midi-Plasmid-Kits zubereitet. HeLa-Zellen wurden mit 1 × 105 pro 60-mm-Schale in DMEM-Medium, das mit 10 % (Volumenteil) fötalem Kälberserum ergänzt war, aufgesetzt und in Monolager bei 37°C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ gezüchtet. Nach Inkubation über 24 Std. wurde jede Schale unter Verwendung des Transfektionsreagens Fugene 6 (Roche) mit entweder 4 μg pcDNA 3.1(–)-Vektor oder 4 μg pcDNA-Smac transfiziert. Nach 16 Std. wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden über unterschiedliche Zeiträume mit UV bestrahlt, wie oben beschrieben. Nach der Bestrahlung wurden die transfizierten Zellen in frischem DMEM-Medium über zusätzliche 6 Std. kultiviert und zur Zubereitung von S-100-Extrakten in der Gegenwart von 0,5 % CHAPS in Puffer A gewonnen. Eine Gesamtmenge von 20 μg Protein wurde auf ein 15 % SDS-PAGE geladen, und das Gel wurde auf einen Nitrocellulosefilter transferiert, der nachfolgend mit einem polyklonalen Antikörper gegen Smac oder einem monoklonalen Antikörper gegen menschliche Kaspase-3 (Transaction Laborstories) geblottet wurde.
Produktion von rekombinantem Smac-Protein in einem Baculovirus-Expressionssystem. Eine 719-bp-cDNA, die das Smac in voller Länge kodiert, verschmolzen mit einer 9-Histidin-Markierung an dem Carboxyl-Terminus, wurde in BamHI/Not1-Orte des Baculovirus-Expressionsvektors pFastBacI (Life Technologies, Inc.) subkloniert. Das Expressionsplasmid wurde in DH10Bac E. coli-Zellen (Life Technologies, Inc.) überführt. Die rekombinante virale DNA, bacmid, wurde gemäß der Verfahrensweise Bac-To-Bac der Baculovirus-Expression gereinigt und durch PCR-Amplifizierungsanalyse bestätigt. Die DNA wurde dann verwendet, um die Insektenzellen Sf-21 unter Verwendung des Reagens CellFECTIN (GIBCO-BRL) zu transfizieren. Die Zellen wurden in IPL41-Medium gezüchtet, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS), 2,6 g/l Tryptosephosphat, 4 g/l Yeastolate und 0,1 % Pluronic F-68 plus Penizillin (100 U/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und Fungizon (0,25 g/ml) ergänzt war. Die Expression von rekombinantem Smac wurde durch Western Blot analysiert. Die Virusvorratslösung wurde auf 100 ml amplifiziert und verwendet, um 1 Liter Sf21-Zellen mit einer Dichte von 2 × 106 Zellen/ml zu infizieren. Nach 24 Std. Infektion wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und der Zellniederschlag wurde in 5 Volumen von Puffer A, der 0,5 % CHAPS enthielt, resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden durch Homogenisierung lysiert, und die Zelllysate wurden 1 Std. lang mit 10 000 × g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine 3-ml-Nickel-Affinitätssäule geladen. Die Säule wurde mit 300 ml Puffer A gewaschen, der 1 M NaCl und 15 mM Imidazol enthielt, gefolgt von einer Äquilibrierung mit 20 ml Puffer A. Das säulengebundene Smac wurde mit 250 mM Imidazol in Puffer A eluiert. Das eluierte Smac-Protein wurde in mehreren Aliquots bei –80°C aufbewahrt.
III. Protokoll für den Polypeptid-Antikörper-Bindungsinterferenz-Assay mit hohem Durchsatz.
A. Reagenzien:

– Neutralite-Avidin: 20 μg/ml in PBS.
– Blockierpuffer: 5 % RSA, 0,5 % Tween 20 in PBS; 1 Stunde bei Zimmertemperatur.
– Assay-Puffer: 100 mM KCl, 20 mM HEPES pH 7,6, 1 mM MgCl₂, 1 % Glyzerin, 0,5 % NP-40, 50 mM b-Mercaptoethanol, 1 mg/ml RSA, Cocktail von Proteaseinhibitoren.
– ³³P-Smac-Polypeptid – 10 × Vorratslösung: 10^–8–10^–6 M „kaltes” Polypeptid, ergänzt mit 200 000-250 000 cpm markierten Polypeptids (Beckman Counter). Während des Screening in die Microfridge mit 4°C platzieren.
– Proteaseinhibitorcocktail (1000×): 10 mg Trypsin-Inhibitor (BMB #109894), 10 mg Aprotinin (BMB #236624), 25 mg Benzamidin (Sigma #B-6506), 25 mg Leupeptin (BMB #1017128), 10 mg APMSF (BMB #917575) und 2 mM NaVO₃ (Sigma #S-6508) in 10 ml PBS.
– Antikörper: 10^–7-10^–5 M biotinylierter Antikörper in PBS.

B. Zubereitung der Assay-Platten:

– Mit 120 μl Vorratslösung N-Avidin pro Loch über Nacht bei 4°C beschichten.
– 2-mal mit 200 μl PBS waschen.
– Mit 150 μl Blockierpuffer blockieren.
– 2-mal mit 200 μl PBS waschen.

C. Assay:

– 40 μl Assay-Puffer/Loch hinzugeben.
– 10 μl Verbindung oder Extrakt hinzugeben.
– 10 μl ³³P-Polypeptid (20-25 000 cpm/0,1-10 pmol/Loch = 10^–9- 10^–7 M Endkonz.) hinzugeben.
– 15 Minuten lang bei 25°C schütteln.
– Zusätzliche 45 Minuten bei 25°C inkubieren.
– 40 μM biotinylierten Antikörper (0,1-10 pmol/40 μl in Assay-Puffer) hinzugeben.
– 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubieren.
– Die Reaktion durch 4-maliges Waschen mit 200 μM PBS anhalten.
– 150 μM Szintillationscocktail hinzugeben.
– In Topcount zählen.

D. Kontrollen für alle Assays (auf jeder Platte befindlich):

a. Nicht spezifische Bindung
b. Löslich (nichtbiotinylierter Antikörper) bei 80 % Inhibition

Assays, die beispielhafte Polypeptide, welche SEQ ID NO:2 beinhalten, und Deletionsmutanten davon verwenden, gewährleisten die Erkennung von spezifischen Antikörpern dafür. Analog gewährleisten Gegen-Assays, die beispielhafte Polypeptide, welche CDRs beinhalten, die für Sequenzen spezifisch sind, welche aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:2 und Fragmenten davon, ausgewählt sind, verwenden, die Erkennung von Polypeptiden, die derartige entsprechende Sequenzen beinhalten. SEQUENCE LISTING

Claims

Ein isoliertes Smac-Protein (Smac = second mitochondria-derived activator of caspase (zweiter, aus Mitochondrien stammender Aktivator der Kaspase)), das SEQ ID NO:2 beinhaltet und das Kaspase-3 ohne exogenes ATP aktiviert und durch seine Translokation aus den Mitochondrien ins Zytosol einen Marker für Apoptose bereitstellt, oder ein Polypeptid-Fragment davon mit einer Länge von mindestens 8 zusammenhängenden Aminosäuren, wobei das Fragment einen für ein derartiges Smac-Protein spezifischen Antikörper hervorruft.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment eine Länge von mindestens 12 Aminosäuren aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: SEQ ID NO:2, Reste 1-8; SEQ ID NO:2, Reste 176-184; SEQ ID NO:2, Reste 4-13; SEQ ID NO:2, Reste 183-191; SEQ ID NO:2, Reste 7-17; SEQ ID NO:2, Reste 192-200; SEQ ID NO:2, Reste 13-24; SEQ ID NO:2, Reste 201-208; SEQ ID NO:2, Reste 18-27; SEQ ID NO:2, Reste 209-216; SEQ ID NO:2, Reste 35-49; SEQ ID NO:2, Reste 215-222; SEQ ID NO:2, Reste 47-54; SEQ ID NO:2, Reste 223-231; und SEQ ID NO:2, Reste 71-78; SEQ ID NO:2, Reste 232-239.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das SEQ ID NO:2, Reste 56-217 beinhaltet.
Ein rekombinantes Polynukleotid, das ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 kodiert.
Ein rekombinantes Polynukleotid, das SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, ein entgegengesetztes Komplement von einem von beiden oder ein Fragment von einem davon mit einer Länge von mindestens 24 Nukleotiden beinhaltet, wobei das Polynukleotid spezifisch mit einer Smac-Protein kodierenden cDNA (SEQ ID NO:1) hybridisiert, wobei das Smac-Protein Kaspase-3 ohne exogenes ATP aktiviert und durch seine Translokation aus den Mitochondrien ins Zytosol einen Marker für Apoptose bereitstellt.
Polynukleotid gemäß Anspruch 6, wobei das Fragment eine Länge von mindestens 36 Nukleotiden aufweist.
Polynukleotid gemäß Anspruch 6, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgendem besteht: SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-24; SEQ ID NO:1, Nukleotide 575-598; SEQ ID NO:1, Nukleotide 18-42; SEQ ID NO:1, Nukleotide 624-648; SEQ ID NO:1, Nukleotide 45-69; SEQ ID NO:1, Nukleotide 644-669; SEQ ID NO:1, Nukleotide 75-92; SEQ ID NO:1, Nukleotide 649-672; SEQ ID NO:1, Nukleotide 116-141; SEQ ID NO:1, Nukleotide 654-677; SEQ ID NO:1, Nukleotide 166-199; SEQ ID NO:1, Nukleotide 665-688; SEQ ID NO:1, Nukleotide 211-234; SEQ ID NO:1, Nukleotide 687-710; und SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-548; SEQ ID NO:1, Nukleotide 697-720.
Polynukleotid gemäß Anspruch 6, das SEQ ID NO:1, Nukleotide 166-651 beinhaltet.
Ein rekombinantes erstes Polynukleotid, das eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 36 Nukleotiden beinhaltet, wobei die Sequenz in der Sequenz Ähnlichkeit mit einem zweiten Polynukleotid aufweist, das aus SEQ ID NO:1, Nukleotiden 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotiden 525-720, einem entgegengesetzten Komplement von einem von beiden besteht, so dass die Sequenz und das zweite Polynukleotid unter einer Hybridisierungsbedingung, die aus Nr. 1 bis 10 aus Tabelle C ausgewählt ist, spezifisch hybridisieren, wobei das Polynukleotid mit einer Smac-cDNA (SEQ ID NO:1) spezifisch hybridisiert, wobei die Smac-cDNA ein Smac-Protein kodiert, das Kaspase-3 ohne exogenes ATP aktiviert und durch seine Translokation aus den Mitochondrien ins Zytosol einen Marker für Apoptose bereitstellt.
Polynukleotid gemäß Anspruch 10, wobei die Sequenz eine Länge von mindestens 96 Nukleotiden aufweist.
Ein Antikörper, der ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 spezifisch bindet.
Ein Verfahren zum Erkennen einer spezifischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz mit einer spezifischen Antikörper- oder Polynukleotidsonde, das den Schritt des Erkennens einer Sequenz von Folgendem beinhaltet: mindestens eines von SEQ ID NO:2 oder einem Fragment davon mit einer Länge von mindestens 8 Aminosäuren; oder mindestens eines von SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, einem entgegengesetzten Komplement von einem von beiden oder einem Fragment von einem davon mit einer Länge von mindestens 24 Nukleotiden, wobei die Sequenz ein Smac-Protein oder eine Smac-Protein kodierende cDNA-Sequenz ist, wobei das Smac-Protein Kaspase-3 ohne exogenes ATP aktiviert und durch seine Translokation aus den Mitochondrien ins Zytosol einen Marker für Apoptose bereitstellt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, das das Erkennen eines spezifischen Polypeptids oder Polynukleotids beinhaltet, das den Schritt des Erkennens von Folgendem beinhaltet: eines Polypeptids, das mindestens eines von SEQ ID NO:2 oder einem Fragment davon mit einer Länge von mindestens 8 Aminosäuren beinhaltet; oder eines Polynukleotids, das mindestens eines von SEQ ID NO:1, Nukleotide 1-234 oder SEQ ID NO:1, Nukleotide 525-720, einem entgegengesetzten Komplement von einem von beiden oder einem Fragment von einem davon mit einer Länge von mindestens 24 Nukleotiden beinhaltet.
Ein Verfahren zum Screening für einen Wirkstoff, der die Bindung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 moduliert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet: Inkubieren einer Mischung, die Folgendes beinhaltet: ein isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, ein Bindungsziel des Polypeptids und einen Wirkstoffkandidaten; unter Bedingungen, durch die sich das Polypeptid außer in der Gegenwart des Wirkstoffes mit einer Referenzaffinität spezifisch an das Bindungsziel bindet; Erkennen der Bindungsaffinität des Polypeptids für das Bindungsziel, um eine wirkstoffbeeinflusste Affinität zu bestimmen, wobei ein Unterschied zwischen der wirkstoffbeeinflussten Affinität und der Referenzaffinität anzeigt, dass der Wirkstoff die Bindung des Polypeptids an das Bindungsziel moduliert.