EP1114157A2 - Regulatorisches protein aus humanen keratinozyten - Google Patents

Regulatorisches protein aus humanen keratinozyten

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Publication number
EP1114157A2
EP1114157A2 EP99969420A EP99969420A EP1114157A2 EP 1114157 A2 EP1114157 A2 EP 1114157A2 EP 99969420 A EP99969420 A EP 99969420A EP 99969420 A EP99969420 A EP 99969420A EP 1114157 A2 EP1114157 A2 EP 1114157A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
nucleic acid
pke
sequence
keratinocytes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99969420A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Kramer
Michael Bechtel
Jeanette Reinartz
Birgit Schäfer
Reinhard Wallich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1114157A2 publication Critical patent/EP1114157A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders

Definitions

  • the invention relates to an isolated polypeptide which is similar to or similar to a protein which occurs naturally in human keratinocytes and which is expressed more strongly in the activated state of the keratinocytes.
  • the protein also relates to an isolated nucleic acid which is such a polypeptide which is typical of human keratinocytes or protein encoded, and the use of this polypeptide and this nucleic acid for detecting, in particular diagnostic, and / or for therapeutic purposes or the use of reagents, in particular recombinant vector molecules and antibodies, against such molecules
  • drugs with a broad spectrum of activity such as locally or systemically administered glucocorticoids, vitamin A
  • glucocorticoids such as glucocorticoids, vitamin A
  • epidermal disorders such as the autoimmune dermatoses “Pemphigus vulgaris” and “Bulloses Pemphigoid” Acid derivatives, antimetabolites and cytostatics, or it is treated with more or less unspecific measures such as “dye therapy” or "light therapy”.
  • the known active substances or measures all have the disadvantage that they are not very specific and therefore naturally cause numerous side effects
  • the provision of more specific active ingredients has so far failed due to the fundamental problem that has existed for a long time in dermatology, that the number of cellular target molecules (target structures, targets), which act as a point of attack for a (specific) influence on the cellular metabolism - especially under medical or also cosmetic Viewpoints - could serve in epidermal keratinocytes is narrowly limited
  • the object of the present invention is therefore to provide new target structures in epidermal keratinocytes which can serve as a point of attack for diagnostics, therapeutics, cosmetics or in general for influencing the cellular metabolism
  • One solution to this problem is to provide a protein of the type mentioned at the outset, which upregulates activated keratinocytes, ie is expressed or produced more and is kept at a higher concentration level, and that either in the sequence listing SEQ ID NO: 2 or in the sequence listing SEQ ED NO: 3 amino acid sequence shown or an allele or derivative formed by amino acid substitution, deletion, insertion, or inversion from one of these two amino acid sequences.
  • the polypeptide with the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is shown in hereinafter also referred to as protein pKe # 122
  • a further solution to this problem consists in the provision of an isolated nucleic acid which encodes a protein which is similar to or similar to a protein which occurs naturally in human keratinocytes and which is expressed more intensely in the activated state of the keratinocytes, and which is either that described in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 4 or a nucleotide sequence complementary to one of these two or a partial sequence of one of these two shown or complementary nucleotide sequences or a nucleotide sequence hybridizing wholly or partially with one of the aforementioned nucleotide sequences, with these two sequence listing instead of "T” can also stand for "TJ".
  • This group of nucleic acids or nucleotide sequences according to the invention also includes, in particular, splice variants and sense or antisense oligonucleotides which correspond to those in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or with hybridize the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 4, preferably identical to or complementary to at least one of these two
  • the invention consequently also includes proteins or polypeptides of the type mentioned at the outset, which have an amino acid sequence which results from such a splice variant, in particular from the splice variant of an mRNA which corresponds to that in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or in the sequence listing SEQ ID NO: 4 indicated nucleotide sequence is identical or complementary to it
  • the sense or antisense oligonucleotides according to the invention comprise at least 6, preferably 8 to 25 nucleotides
  • hybridized refers to the hybridization methods known in the prior art under customary, in particular under highly stringent hybridization conditions, the person skilled in the art chooses the specific hybridization parameters based on the nucleotide sequence used and his general specialist knowledge (see Current Protocols in Molecular Biology, Vol 1, 1997, John Wiley & Sons Ine, Suppl 37, Cha ⁇ ter 4 9 14)
  • nucleic acid (s) according to the invention can be obtained both from a natural source and also synthetically or semi-synthetically. In practice, their implementation as cDNA has proven particularly effective
  • the polypeptide which has the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 and which is encoded by the nucleic acid shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or in the sequence listing SEQ ID NO: 4, and which is hereinafter referred to as protein pKe # 122, is upregulated in human epidermal keratinocytes, namely expressed more (produced) and kept at a concentration level that is significantly higher than in the initial state when these cells are in the "activated” state, ie in the state of proliferation and / or among other things Migration, eg after an accident-related skin injury or in the autoimmunologically triggered bullose dermatoses "Pemphigus vulgaris" (triggered by autoantibodies against desmosomes) and "Bulloses pemphigoid” (triggered by autoantibodies against hemidesmosomes)
  • the activated state of Human epidermal keratinocytes are also expressed in an increased expression of the known activation markers
  • the pKe # 122 protein has a serine / threonine kinase motif, several (four) tyrosine kinase phosphorylation motifs and a kinase domain with an ATP binding site. It is obviously involved in signaling processes, is very likely to have a serine / threonine kinase function and is active a presumed role in the formation of cell-cell and / or cell-matrix connections and / or of desmosomes and / or of hemidesmosomes
  • Serine / threonine kinases also play an important role in the formation of hemidesmosomes (cf. Mainiero F, Pepe A, Wary KK, Spinardi L, Mohammadi M, Schlessinger J Giancotti FG, 1995 Signal transduction by the alpha6beta4 integrm: distinct beta4 subunit sites mediale recruitment of Shc / Grb2 and association with the cytoskeleton of hemidesmosomes.EMBO J 14 4470-4481)
  • the invention further relates to recombinant DNA vector molecules which comprise a nucleic acid according to the invention and which have the ability to express in a prokaryotic a protein which occurs in human keratinocytes and is expressed in the activated state of the keratinocytes, in particular the pKe # 122 protein or eukaryotic cell.
  • the DNA vector molecules are preferably the plasmid pUEX-1 and / or the plasmid pGEX-2T and / or the plasmid pBK-CMV and / or the plasmid pHR 2 (a derivative of Bluescript KS [Stratagene, Heidelberg], contains the human keratin 14 promoter), since these vectors have proven to be very suitable in practice
  • Particularly suitable eukaryotic cells are cells from cell cultures, for example COS cells, but the cell in question can equally well be part of a living organism, for example a transgenic mouse
  • the invention therefore also encompasses transformed host cells which contain a nucleic acid according to the invention which is coupled to an activatable promoter which is contained in these cells naturally or as a result of recombination and which (as a result) has the ability to express a keratinocyte in human protein that occurs and is increasingly expressed in the activated state of the keratinocytes, in particular the protein pKe # 122
  • the invention further relates to the use of a nucleic acid according to the invention or a vector molecule according to the invention for the production of transgenic mammals, in particular mice or rats
  • the transfectants according to the invention open up the possibility for research and development work with regard to a further elucidation of the changes in cell morphology induced by the protein pKe # 122 and cellular basic functions such as proliferation, adhesion, migration and differentiation, in particular with a view to answering the questions Question whether the protein pKe # 122 itself has a "pathogenic" activity
  • the present invention also relates to a reagent for the indirect detection of a protein which occurs in human keratinocytes and which is expressed more strongly in the activated state of the keratinocytes, in particular the protein pKe # 122, this reagent being characterized in that it comprises at least one nucleic acid according to the invention.
  • the protein pKe # 122 and the polypeptides related to it that is to say with the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 2 or in the sequence listing SEQ ID NO: 3, namely the polypeptides which are obtained by substitution, deletion, insertion and / or inversion of a these amino acid sequences can be derived according to SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or which have an amino acid sequence which results from a splice variant of an mRNA which corresponds to the nucleotide sequence according to the sequence listing SEQ ID NO: 1 or to the nucleotide sequence according to the sequence listing SEQ ID NO: 4 or with a partial sequence of these nucleotide sequences is identical or complementary to it, or at least hybridized, offer diverse application possibilities in the field of dermatological research and development.
  • antibodies against these polypeptides that is to say with the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 2 or in the sequence listing SEQ ID NO: 3, namely the polypeptides which are
  • the invention consequently also includes the use of such a protein or polypeptide for the production of an (monoclonal, polyclonal or recombinant) antibody against this polypeptide, said antibody itself and also its use for the diagnostic and / or therapeutic treatment of dermatological diseases, for cosmetic purposes Treatment of the epidermis and for the diagnostic, therapeutic and / or cosmetic treatment of other tissues or organs expressing the protein pKe # 122
  • sense and / or antisense oligonucleotides are also suitable as active ingredients for pharmacotherapy (cf. G Hartmann et al 1998 antisense
  • the present invention therefore also relates to the use of sense or antisense oligonucleotides according to the invention for diagnostic and / or therapeutic purposes Treatment, in particular of dermatological diseases, or for cosmetic treatment, in particular of the epidermis
  • a technically and economically important possibility of using a polypeptide according to the invention or a nucleic acid according to the invention is that with the aid of such a molecule, a very large number of available substances can be selected from a very large number of available substances in a screening process, which are specific to the nucleic acid in question or that Binding the relevant polypeptide These substances can then serve as the starting material (lead structure) for the development of pharmacologically usable substances and thus offer the prerequisites for the development of alternative pharmaceuticals for diagnosis and therapy, in particular the dermatological diseases mentioned at the beginning
  • the invention also relates to the use of a polypeptide according to the invention or a nucleic acid according to the invention for the identification of pharmacologically usable substances which bind to the polypeptide or the nucleic acid and thereby influence its or its function and / or expression, in particular have an inhibiting or activating effect
  • A) Obtaining or producing a polynucleotide. encoding the protein pKe # 122 Human epidermal keratinocytes of a cell culture or a cell culture model served as the polynucleotide source, which is described in the publication by Schafer BM, Reinartz J, Bechtel MJ, Inndorf S, Lang E, and Kramer MD, 1996 dispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res 228, S 246-253, is described in detail.
  • uPA urokinase-type plasminogen activator
  • uPA-R urokinase-type plasminogen activator
  • this cell culture model is characterized in that it allows keratinocytes to be destroyed by enzymatic destruction of the cell / matrix contacts, ie by means of a dispase-induced detachment of the keratinocytes from the culture matrix, from the resting [uPA ⁇ 7uPA-R ⁇ ] to the activated [uPA + / uPA-R + ] state.
  • the induction of the activated state is reversible the (renewed)
  • NHEK normal human epidermal keratinocytes
  • the uPA / uPA-R upregulation was detectable from the incubated using known techniques such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in-situ hybridization and immunofluorescence Cells were extracted using the guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction method known in the prior art (cf. Chromczynski P and Sacchi N, 1986 single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem 162 156-159) the entire RNA obtained ("RNA-Clean" kit from AGS from Heidelberg) From the total -RNA, the mRNA was isolated by binding to poly-T-coated spheres. This mRNA served as the starting material for the next process section of subtraction cloning
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • mRNA was isolated from adherent keratinocyte sheets according to the same procedure as described above, except for the difference that for the duration of the dispase treatment, a dispase inhibitor, for example phosphoramidon (100 ⁇ g / ml), was used in addition to the dispase. was applied
  • a gene bank which preferably contained cDNA of the dyshasions-induced genes, ie those genes which were increasingly expressed in these (or their cells) after detachment of the keratinocyte sheets.
  • the mRNA obtained from the cells of the adherent keratinocyte sheets was generated again bound to poly-T-coated spheres, rewritten thereon into single-stranded cDNA and then hybridized against the mRNA of detached, ie non-adherent, keratinocyte sheets.
  • Those mRNA molecules which only express in the non-adherent state, ie after dyshasion were and as a result found no hybridization partner remained in the supernatant. They were rewritten into cDNA and chlorinated into the cloning vector pUEX-1
  • the resulting gene library was then subjected to a Southern blot method with [ 32 P] -labeled cDNA-adherent and non-adherent keratinocyte sheets for the purpose of checking. That cDNA or rather the host cell clones containing it - here the E coli strain MC 1061 - which after dyshasion one showed clear upregulation, were then cultivated overnight at 30 ° C. under normal culture conditions or increased.
  • the plasmid DNA (pUEXl cDNA) was excised from these E coli clones, and the cDNA fragments cut out from the pUEXl vector were analyzed by random -priming [ 32 P] -labeled
  • the labeled cDNA was used as a probe in Northern blots with RNA from adherent and non-adherent keratinocyte sheets.
  • the clones which contained cDNA when used as a probe in the Northern blot method, had little or no signal with the RNA adherent keratinocytes, on the other hand a clear signal with RNA non-adherent kerat inocyte sheets were selected for the subsequent process step of the sequencing
  • the nucleotide sequence of the gene pKe # 122 contains a stop codon at the 3 'end at position 2373-2375 according to SEQ ID NO: 1 and accordingly at position 2472-2474 according to SEQ ID NO: 4, which specifies the putative location of the transcription end and the like exactly 28 nucleic acids before the poly-A site follows a sequence very similar to the so-called "polyadenylation site" (AATAAA), namely AATAA
  • this gene or polynucleotide has the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ IN NO: 1 or the sequence listing SEQ IN NO: 4 or has a partial sequence of one of these two nucleotide sequences or comprises or consists of a nucleotide sequence that is complementary to one of the nucleotide sequences shown or one of its partial sequences, or that this gene or polynucleotide is wholly or partly identical to that described in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or im Sequence listing SEQ ID NO: 4 hybridized with a partial sequence of one of these two nucleotide sequences or with a sequence complementary to these shown nucleotide sequences or their partial sequences, wherein in the sequence listing SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 instead of "T" can also be a "U", and that from this gene or polynucleotide has the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ IN NO: 1 or the sequence listing SEQ IN NO: 4 or has
  • amino acid sequence from positions 40 to 63 corresponds to known protein kinase motifs with an ATP binding site
  • amino acid sequence from positions 152 to 164 corresponds to known serine / threonine protein kinase motifs
  • TLR amino acid sequences from positions 238 to 240 (TLR), from positions 475 to 477 (TGR), from positions 485 to 487 (STR) and from positions 600 to 603 (TTR) according to SEQ D3 NO: 2 and from positions 271 to 273 (TLR), from positions 508 to 510 (TGR), from positions 518 to 520 (STR) and from positions 633 to 635 (TTR) according to SEQ D3 NO: 3 correspond to known phosphorylation sites for protein kinase C,
  • the amino acid sequence from positions 138 to 156 (WQILSAVEYCHDHHIVHRD) according to SEQ ID NO: 2 and accordingly from positions 171 to 189 according to SEQ ID NO: 3 represents the pKe # 122-l peptide against which the anti-peptide antibody " Anti- pKe # 122-1 "was produced in the rabbit (see Example 2),
  • amino acid sequence from positions 481 to 499 (LAEVSTRLSPLTAPCINNS) according to SEQ ID NO: 2 and accordingly from positions 514 to 532 according to SEQ ID NO: 3 represents the pKe # 122-2 peptide against which the anti-peptide antibody " Anti-pKe # 122-2 "was produced in the rabbit (see Example 2),
  • amino acid sequence from position 339-352 (NHFAAIYYLLLERL) according to SEQ ID NO: 2 and accordingly from position 372-385 according to SEQ ID NO: 3 represents the pKe # 122-3 peptide against which the anti-peptide antibody " Anti-pKe # 122-3 "was produced in the rabbit (see Example 2),
  • FIGS. 2A and 14A show the protein kinase motif with ATP binding sites, the serine / threonine protein kinase motif and the four phosphorylation sites for protein kinase C
  • Figures 2B and 14B show the sequence segments against which anti-peptide antibodies were raised in rabbits
  • Example 2 Use of the amino acid sequence of the protein pKe # 122 for the production of polyclonal anti-peptide antibodies
  • the postimmune sera were first subjected to an ammonium sulfate precipitation and thereby the IgG fraction Enriched with this enriched IgG fraction Immunoaffinity chromatography performed
  • the four peptides pKe # 122-1 to -4 used for immunization were immobilized on Sepharose 4B and these peptide-Sepharose-4B conjugates were used in immunoaffinity chromatography.
  • the polyclonal anti-peptide antibody pKe # 122-1 was also tested with the recombinant ca 100 kD GST-pKe # 122 fusion protein (fraction 85 in FIG. 10 B) described here in Example 5 using the immunoblot method.
  • the polyclonal anti-peptide - Antibody pKe # 122-1 reacted with the fusion protein This positive reaction was confirmed by comparison with control experiments in which an anti-GST antibody or normal rabbit IgG was used instead of the anti-peptide antibody pKe # 122-1
  • the results are shown in Table 1 and in FIG. 4. Lane “a” in FIG. 4 shows the control batch with goat normal IgG, lane "b" in FIG.
  • FIG. 4 shows the batch with goat anti-GST IgG, lane " c "in FIG. 4 shows the approach with rabbit normal IgG and lane” d "in FIG. 4 shows the approach with rabbit anti-pKe # 122-1
  • Example 3 Use of the protein pKe # 122 or against the protein or against the mRNA of the pKe # 122-directed reagents for the detection of the activated state of human epidermal keratinocytes
  • PBS normal serum of the species from which the second antibody originates, here goat normal serum
  • the sections are incubated in PBS containing 5 ⁇ g / ml anti-peptide pKe # 122-1 for 1 hour at room temperature.
  • the sections are then incubated in PBS containing 0.2 % (Weight / volume) of bovine serum albumin. This is followed by incubation with an antibody from goat, for example biotin-labeled and directed against rabbit IgG (1,500 diluted in PBS / 0.2% BSA, 30 minutes at room temperature) a further washing step and the application of a streptavidin labeled with the fluorescent dye Cy3 (1 1 000 diluted in PB S / 0.2% BSA).
  • FIG. 5 A The anti-pKe # 122-1 IgG antibody stains keratinocytes on normal skin sections in the area of the epidermal basement membrane zone (FIG. 5 A).
  • FIG. 5 B When staining biopsies of lasional skin due to the diseases Pemphigus vulgaris (FIG. 5 B), bullous pemphigoid (FIG. 5 C) or psoriasis vulgaris (FIG. 5 D), there is a strikingly strong staining in epidermal keratinocytes, particularly in the area of epidermal lesions. Accordingly, there has been increased expression and an obvious upregulation of the protein pKe # 122
  • FIG. 3 shows the detection of the pKe # 122 protein by means of the Westemblot method using anti-pKe # 122-1.
  • the proteins were analyzed using a standard method Blotted nitrocellulose membrane To block unspecific binding sites, an incubation with 5% by weight milk powder / TBS buffer was carried out.
  • the (protein) strips with the designation "anti- 122-1" were then added in 3% milk powder / TBS buffer with the addition of anti-pKe # 122-1 antibodies (1 ⁇ g / ml) and the (protein) strips labeled “rblgG” in 3% milk powder / TBS buffer with the addition of rabbit normal IgG (1 ⁇ g / ml ) incubated at 4 ° C for approx. 18 hours (overnight).
  • the nitrocellulose membrane was then washed with TBS / Tween and TBS buffer and with an enzyme-labeled anti-rabbit IgG antibody in 3% milk powder / TBS - Buffer incubated After washing again with TBS / Tween and TBS, the bound antibodies were made visible with a peroxidase-specific luminescent substrate (here, for example, the ECL system from Amersham-Buchler) and also represented by autoradiography. An alternative label with chromogenic substrate was also shown aten is well possible The cell lysates can also be blotted directly onto a nitrocellulose membrane without prior electrophoretic separation and further treated as described above
  • Microtiter plates are coated with recombinant pKe # 122 / GST fusion protein in different concentrations (10-0 ng / ml). Unspecific binding sites are blocked by treatment with 0.1% by weight gelatin in PBS (PB S / gelatin). Then the coated wells are blocked incubated with anti-pKe # 122-1 IgG (1 ⁇ g / ml) for 1 hour at room temperature (see FIG. 6 A, closed circles) The control mixture is carried out with rabbit normal IgG in the same concentrations (see FIG.
  • FIG. 6.A shows that the color concentration of the amount of the pKe # 122 fusion protein bound to the plate It is proportional from this that when samples of known antigen concentrations, so-called standards, are used, it is possible to quantify an unknown amount of antigen by comparison
  • a sandwich ELISA For the quantification of the pKe # 122 protein in complex solutions, the implementation of a sandwich ELISA (FIG. 6 B) is preferred.
  • a microtiter plate with an antibody directed against pKe # 122 eg rabbit anti-pKe # 122 / GST fusion protein, 1 ⁇ g / Nertie Stahl
  • the remaining unspecific binding sites of the microtiter plate are blocked with PB S / gelatin.
  • the microtiter plate is mixed with different concentrations of the pKe # 122 / GST protein (10 - 0 ng / ml).
  • peroxidase-labeled anti-pKe # 122 antibody eg peroxidase-labeled rabbit anti-pKe # 122-1 (peptide) antibody
  • Peroxidase here stands for practically any labeling of the antibody, for example with enzymes, fluorescent molecules or luminescent molecules
  • Example 4 Detection of pKe # 122-specific mRNA in cells by means of a reverse polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • This cDNA was subjected to a PCR in which a partial fragment of ⁇ 350 kb was amplified from the pKe # 122-specific cDNA
  • 10 ng of cDNA with 10 ⁇ M primer each were used together with a mixture of heat-stable DNA polymerase, ATP, TTP, GTP, CTP and polymerase buffer (cf. e.g. Current protocols in Molecular Biology, Vol.
  • Lane 1 molecular weight marker
  • lane 2 NHEK T0
  • lane 3 NHEK T2
  • Lane 4 NHEK T4
  • Lane 5 NHEK T8
  • Lane 6 HaCaT
  • Lane 7 free
  • Lane 8 positive control (pUEX-1; with pKe # 122 as insert)
  • Lane 9 negative control (approach with cDNA without primer)
  • Lane 10 kit-specific positive control for checking the functionality of the PCR
  • lane 11 negative control (approach with primer without cDNA)
  • lane 12 molecular weight marker.
  • a PCR product of the expected size of 350 kb was detected in lanes 3, 4, 5, 6 and 8, that is to say: pKe # 122-specific mRNA was found in cells of keratinocyte sheets at time 2 (T2), 4 (T4 ) and 8 (T8) hours after dispase-induced detachment and also in HaCaT cells.
  • This technique enables the detection of pKe # 122 expression even in cases in which the detection of pKe # 122 protein is not possible due to the expression level being too low using immunohistological methods, the ELISA, dot blot or western emblot method.
  • Example 5 Production of vector molecules with the ability to express the protein pKe # 122 in prokaryotic or eukaryotic cells
  • pKe # 122-gluthathione-S-transferase (GST) fusion proteins ⁇ Ke # 122 / GST-I and pKe # 122 / GST-II, (vector pGEX; see FIG. 8) were used for the purpose of expression in Bacteria (E. coli DH5 ⁇ ) are produced.
  • GST pKe # 122-gluthathione-S-transferase
  • the pKe # 122-gluthathione-S-transferase (GST) fusion proteins were expressed in E. coli (DH5 ⁇ ) by LPTG induction. After the induction, the bacterial lysate was examined in a western emblot with anti-GST antibodies, in comparison to pKe # 122-gluthathione-S-transferase (GST) vector-bearing, non-induced bacterial lysate and to lysate of bacteria that exclusively GST expressed. The product of this western emblot is shown in Fig.
  • Lane (a) shows the control transfectant (GST without insert) before LPTG induction
  • lane (b) shows the control transfectant (GST without insert) after LPTG induction
  • Lane (c) shows pKe # 122 / GST-I before LPTG induction
  • lane (d) shows pKe # 122 / GST-I after LPTG induction
  • lane (e) shows ⁇ Ke # 122 / GST-II before LPTG- Induction
  • lane (f) shows pKe # 122 / GST-II after LPTG induction.
  • the highest molecular band had an apparent molecular weight of approx. 100 kD (see Fig. 10 B, fraction 85). This allows the conclusion that the 100 kD pKe # 122-GST fusion protein consists of the GST protein and an approximately 70-75 kD fragment of the Protein pKe # 122 exists (see also FIG. 4 and the associated description in Example 2)
  • the pBK-CMV-pKe # 122 vector (FIG. 9) was transformed into so-called Cos cells, ie into cells of the Cos cell line which is generally known in the prior art.
  • the Cos cells were removed by treatment with DEAE by standard methods -Dextran / chloroquine brought to take up the plasmid DNA.
  • the transformed cells were then incubated for two days under standard conditions (37 ° C. and 7% CO 2 ).
  • the Cos cells were lysed and analyzed in the immuno-blot method using an antibody against the FLAG epitope or the anti-peptide antibody anti-pKe # 122-1 IgG.
  • Lane 11 shows the product of the immunoblot
  • Lane a shows the non-transfected Cos cells
  • lane b shows a FLAG control protein
  • lane c shows pKe # 122-FLAG vector construct transfected Cos cells.
  • Lane c has a band with an approximate molecular weight of 80 kD, which was stained by the anti-FLAG antibody.
  • Lane b shows a FLAG-labeled control protein which is functional itat the anti-FLAG antibody demonstrated
  • Antisense nucleotides are taken up by cells, including keratinocytes (cf. G Hartmann et al 1998 antisense oligonucleotides, Inc. Cardiol actin, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12 (cf. G Hartmann et al 1998 antisense oligonucleotides, Inc 24, C1 115-C1119) and bind to the mRNA present in the cell and inhibit its translation and thus its translation Expression (cf.
  • Suitable antisense oligonucleotides were identified the pKe # 122-specific nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4) was prepared. They were adjusted to a concentration of 100 ⁇ M with a suitable buffer medium (so-called “oligo buffer”). HaCaT cells were at 37 ° C.
  • the cells were trypsinized (10 minutes 0.2% EDTA, 5-10 minutes 0.1% trypsin) and adjusted to a concentration of 25,000 cells / ml. 100 ⁇ l of cell suspension (corresponding to 2,500 cells) were pipetted into each well of a 96-well plate The cells were incubated for 1 hour, followed by the addition of the antisense oligonucleotide (2 ⁇ l of a 100 ⁇ M solution) and a further incubation of 24-48 hours. Cell batches were used as a negative control, to which oligonucleotide with the same base distribution but a randomly selected sequence were added
  • FIG. 12 a shows subconfluent HaCaT cultures which contain pKe # 122-specific antisense oligonucleotides
  • 12 b shows subconfluent HaCaT cultures which have been treated with control oligonucleotides
  • FIG. 13 a shows confluent HaCaT cultures which have been treated with pKe # 122-specific antisense oligonucleotides
  • FIG. 13 b shows confluent HaCaT cultures which have been treated with control oligonucleotides
  • FIG. 13 c shows a detail from FIG. 13 a
  • the microscopic examination results demonstrate that, in comparison to control oligonucleotides, the number of cells in the cultures treated with the specific antisense oligonucleotide is significantly reduced. This suggests a decrease in cellular proliferation caused by the antisense oligonucleotide in the HaCaT cultures treated with antisense oligonucleotides, greatly enlarged cells which were not found in the cultures treated with control oligonucleotides. These large cells correspond in their morphology to differentiated keratinocytes. The finding suggests that pKe # 122- specific antisense oligonucleotides treated cells have an increased tendency to differentiate

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich (d.h. in Funktion und Wirkung gleich) ist. Sie betrifft ausserdem eine isolierte Nukleinsäure, die ein solches für humane Keratinozyten typisches Polypeptid bzw. Protein kodiert, sowie die Verwendung dieses Polypeptids und dieser Nukleinsäure für nachweisende, insbesondere diagnostische, und/oder für therapeutische Zwecke bzw. die Verwendung von Reagenzien, insbesondere rekombinanten Vektormolekülen und Antikörpern, gegen solche Moleküle. Das erfindungsgemässe Protein weist entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:2 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:3 dargestellte Aminosäuresequenz oder ein durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion oder -inversion daraus entstandenes Allel oder Derivat dieser Aminosäuresequenz auf, und die erfindungsgemässe Nukleinsäure weist entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:4 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Nuleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer der vorgenannten Nukleotidsequenzen hybridisierenden Nukleotidsequenz auf.

Description

Regulatorisches Protein aus humanen Keratinozyten
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ahnlich (d h in Funktion und Wirkung gleich) ist Sie betrifft außerdem eine isolierte Nukleinsäure, die ein solches für humane Keratinozyten typisches Polypeptid bzw Protein kodiert, sowie die Verwendung dieses Polypeptids und dieser Nukleinsäure für nachweisende, insbesondere diagnostische, und/oder für therapeutische Zwecke bzw die Verwendung von Reagenzien, insbesondere rekombi- nanten Vektormolekulen und Antikörpern, gegen solche Moleküle
Nach dem gegenwartigen Stand der Technik werden in der Dermatotherapie zur Beeinflussung epidermaler Störungen wie z B der Autoimmundermatosen "Pemphigus vulgaris" und "Bulloses Pemphigoid" im wesentlichen Medikamente mit breitem Wirkungsspektrum eingesetzt, wie z B lokal bzw systemisch applizierte Glukokorti- koide, Vitamin-A-Saure-Derivate, Antimetabolite und Zytostatika, oder es wird mit mehr oder weniger unspezifischen Maßnahmen wie z B der sog "Farbstofftherapie" oder der "Lichttherapie" behandelt Die bekannten Wirkstoffe bzw Maßnahmen haben jedoch allesamt den Nachteil, daß sie wenig spezifisch sind und damit naturgemäß zahlreiche Nebenwirkungen hervorrufen
Die Bereitstellung spezifischerer Wirkstoffe scheiterte bislang an dem in der Derma- tologie seit langem bestehenden grundsatzlichen Problem, daß die Zahl der zellularen Zielmolekule (Zielstrukturen, Targets), die als Angriffspunkt für eine (spezifische) Beeinflussung des zellularen Stoffwechsels — insbesondere unter medizinischen oder auch kosmetischen Gesichtspunkten — dienen konnten, in epidermalen Keratinozyten eng begrenzt ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue Zielstrukturen in epidermalen Keratinozyten bereitzustellen, die als Angriffspunkt für Diagnostika, Therapeutika, Kosmetika oder allgemein für die Beeinflussung des zellularen Stoffwechsels dienen können
Eine Losung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Proteins der eingangs genannten Art, das bei aktivierten Keratinozyten aufreguliert, d h vermehrt exprimiert bzw produziert und auf einem höheren Konzentrationsspiegel gehalten wird, und das entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:2 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ED NO: 3 dargestellte Aminosauresequenz oder ein durch Aminosauresubstitution, - deletion, -insertion, -oder -inversion aus einer dieser beiden Aminosauresequenzen entstandenes Allel oder Derivat aufweist Das Polypeptid mit der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 wird im folgenden auch mit Protein pKe#122 bezeichnet
Eine weitere Losung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäure, die ein Protein kodiert, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ahnlich ist, und die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine zu einer dieser beiden komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden dargestellten oder komplementären Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser vorgenannten Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist, wobei in diesen beiden Sequenzprotokollen anstelle von "T" auch "TJ" stehen kann Zu dieser erfindungsgemaßen Gruppe von Nukleinsäuren bzw Nukleotidsequenzen gehören insbesondere auch Splice- Varianten und Sense- oder Antisense-Oligonukleotide, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleotidsequenz hybridisieren, vorzugsweise identisch mit bzw komplementär zu wenigstens einer dieser beiden sind Die Erfindung umfaßt infolgedessen auch Proteine bzw Polypeptide der eingangs genannten Art, die eine Aminosauresequenz aufweisen, welche aus einer solchen Splice- Variante resultiert, insbesondere aus der Splice- Variante einer mRNA, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 4 angegebenen Nukleotidsequenz identisch oder komplementär dazu ist
Die erfindungsgemaßen Sense- oder Antisense-Oligonukleotide umfassen mindestens 6, vorzugsweise 8 bis 25 Nukleotide
Der Begriff "hybridisiert" bezieht sich auf die im Stand der Technik bekannten Hybridi- sierungsverfahren unter üblichen, insbesondere unter hoch stringenten Hybridisierungs- bedingungen Die konkreten Hybridisierungsparameter wählt der Fachmann anhand der eingesetzten Nukleotidsequenz und seines allgemeinen Fachwissens (vgl Current Protocols in Molecular Biology, Vol 1, 1997, John Wiley & Sons Ine , Suppl 37, Chaρter 4 9 14)
Die erfindungsgemaße(n) Nukleinsaure(n) kann (können) sowohl aus einer naturlichen Quelle als auch synthetisch oder halbsynthetisch gewonnen werden In der Praxis hat sich besonders ihre Ausführung als cDNA bewahrt
Das Polypeptid, das die Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 aufweist und von der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleinsäure kodiert wird, und das im folgenden als Protein pKe#122 bezeichnet ist, wird in humanen epidermalen Keratinozyten aufreguliert, nämlich verstärkt exprimiert (produziert) und auf einem im Vergleich zum Ausgangszustand signifikant höheren Konzentrationsspiegel gehalten, wenn sich diese Zellen im "aktivierten" Zustand befinden, d h unter anderem im Zustand der Proliferation und/oder Migration, z B nach einer unfallbedingten Hautverletzung oder bei den autoimmunologisch ausgelosten bullosen Dermatosen "Pemphigus vulgaris" (ausgelost durch Autoantikorper gegen Desmosomen) und "Bulloses Pemphigoid" (ausgelost durch Autoantikorper gegen Hemidesmosomen) Der aktivierte Zustand der humanen epidermalen Keratinozyten äußert sich auch in einer im Vergleich zum Ruhezustand (Ausgangszustand) erhöhten Expression der bekannten Aktivierungsmarker uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und uPA-R (Rezeptor für Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und kann anhand dieser Marker qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden (Vgl Schafer B M , Reinartz J , Bechtel M J , Inndorf S , Lang E , und Kramer M D , 1996 Dispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urok nase-type plasminogen acüvator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. CellRes 228, S 246-253)
Das Protein pKe#122 weist ein Serin/Threonin-Kinase-Motiv, mehrere (vier) Tyrosinkinasephosphorylierungsmotive und eine Kinase-Domane mit ATP- Bindungsstelle auf Es ist offensichtlich in Signalubertragungsvorgange eingebunden, hat sehr wahrscheinlich eine Serin/Threonin-Kinase -Funktion und spielt eine mutmaßliche Rolle bei der Ausbildung von Zeil-Zeil- und/oder von Zell-Matrix-Verbindungen und/oder von Desmosomen und/oder von Hemidesmosomen
Im Stand der Technik ist es bekannt, daß Serin/Threonin-Kinasen in Keratinozyten die Funktion von Zeil-Zeil- und Zell-Matrix-Kontakten beeinflussen Von S Blum und Koautoren wurde gezeigt, daß die Lokalisation bestimmter Zellkontakt-Molekule der Zonula adhaerens durch Aktivierung bzw Inaktivierung der Serin/Threonin Kinase des Typs "Proteinkinase C (PKC)" beeinflußt werden kann (vgl Blum S , Ness W , Petrow W , Achenbach F , 1994 Localization of protein kinase C in primary cultures of human keratinocytes in relation to cell contact proteins. Cell Sig 6 157-165) Und M Serres und Koautoren haben gezeigt, daß die Behandlung von Keratinozyten in Zellkultur (HaCaT-Zellen) mit den Serin/Threonin-Phosphatase-Inhibitoren Okadainsaure, Calyculin und Pefabloc™ einerseits zu einem Verlust der Zeil-Zeil- Verbindungen und andererseits zu einer verstärkten Serin/Threonin Phosphorylierung des in die Zelladha- sion involvierten Linkerproteins ß-Catenin führt (vgl Serres M , Grangeasse C , Haftek M , Durocher Y , Duclos B , Schmitt D , 1997 Hyperphosphorylation of ß- Catenin on serine-threonine residues and loss of cell-cell-contacts induced by calyculin A and okadaic acid in human epidermal cells. Exp. Cell. Res. 231 163-172) Diese in- vitro-Befunde wurden an epidermalen Keratinozyten explantierter humaner Haut bestätigt nach Applikation von Okadainsaure (2 μM, 24 Std ) trat eine deutliche Störung epidermaler Zell/Zell-Verbindungen mit Akantholyse auf Weder PKC-Aktivatoren (wie z B Bryostatin-1 oder TPA = PMA= Phorbol Myristat Azetat) und PKC-Inhibitoren (Sphingosin, Staurosporin, Chelerythrine, H7 = l-(5-Isoquinolinylsulfonyl)-2-methyl- piperazine) noch Inhibitoren oder Aktivatoren der Proteinkinase A (PKA), noch Tyrosin- Kinase- und Phosphatase-Inhibitoren oder weniger spezifische Phosphatase-Inhibitoren hatten einen derartigen Effekt auf die Zellen
Auch bei der Ausbildung von Hemidesmosomen spielen Serin/Threonin-Kinasen eine wichtige Rolle (vgl Mainiero F , Pepe A , Wary K K , Spinardi L , Mohammadi M , Schlessinger J Giancotti F G , 1995 Signal transduction by the alpha6beta4 integrm: distinct beta4 subunit Sites mediale recruitment of Shc/Grb2 and association with the cytoskeleton of hemidesmosomes. EMBO J 14 4470-4481)
Mit der isolierten Bereitstellung des Proteins pKe#122, nämlich mit der Beschreibung von Nukleotidsequenzen, die dieses Protein kodieren, und mit der Angabe (einer) seiner Aminosauresequenz(en) ist es möglich, den Stoffwechsel von physiologisch aktiven bzw aktivierten Keratinozyten — und selbstverständlich auch von anderen das Protein pKe#122 exprimierenden Zellen — gezielt zu beeinflussen, insbesondere zu Zwecken der medizinischen und kosmetischen Therapie
Die Erfindung betrifft desweiteren rekombinante DNS-Vektormolekule, die eine erfin- dungsgemaße Nukleinsäure umfassen, und die die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, in einer prokaryon- tischen oder eukaryontischen Zelle aufweisen Bei den DNS-Vektormolekulen handelt es sich vorzugsweise um das Plasmid pUEX-1 und/oder um das Plasmid pGEX-2T und/oder um das Plasmid pBK-CMV und/oder um das Plasmid pHR 2 (ein Abkömmling von Bluescript KS [Firma Stratagene, Heidelberg], enthalt den humanen Keratin-14- Promotor), da sich diese Vektoren in der Praxis als sehr gut geeignet erwiesen haben Als eukaryontische Zelle kommen insbesondere Zellen aus Zellkulturen, z B COS- Zellen, in Betracht, ebensogut kann die betreffende Zelle aber auch Bestandteil eines lebenden Organismus, z B einer transgenen Maus, sein
Die Erfindung umfaßt deshalb auch transformierte Wirtszellen, die eine erfindungsgema- ße Nukleinsäure enthalten, die mit einem aktivierbaren Promotor gekoppelt ist, der in diesen Zellen natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthalten ist, und die (infolgedessen) die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, besitzen
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer erfindungsgemaßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemaßen Vektormolekuls zur Herstellung transgener Saugetiere, insbesondere Mause oder Ratten
Die erfindungsgemaßen Transfektanten eröffnen die Möglichkeit für Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Hinblick auf eine weitergehende Aufklarung der durch das Protein pKe#122-induzierten Veränderungen der Zellmorphologie und zellularen Basis- fünktionen wie Proliferation, Adhäsion, Migration und Differenzierung, insbesondere im Hinblick auf die Beantwortung der Frage, ob das Proteins pKe#122 selbst eine "pathogene" Aktivität besitzt
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Reagenz zum indirekten Nachweis eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, wobei dieses Reagenz dadurch charakterisiert ist, daß es wenigstens eine erfindungs- gemaße Nukleinsäure umfaßt " Zum indirekten Nachweis" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß tatsachlich die das Protein kodierende mRNA direkt nachgewiesen wird — und somit das Protein nur indirekt (vermittels dieser mRNA) Das Protein pKe#122 und die damit, d h mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:2 oder im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:3 dargestellten Aminosauresequenz, verwandten Polypeptide, nämlich die Polypeptide, die durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Inversion von einer dieser Aminosauresequenzen gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO:3 ableitbar sind, oder die eine Aminosauresequenz aufweisen, die aus einer Splice- Variante einer mRNA resultiert, welche mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO:l oder mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO:4 oder mit einer Teilsequenz dieser Nukleotidsequenzen identisch oder komplementär dazu ist oder zumindest hybridisiert, bieten vielfaltige Anwendungsmoglichkeiten auf dem Gebiet der dermatologischen Forschung und Entwicklung Insbesondere können Antikörper gegen diese Polypeptide bzw Proteine hergestellt werden, die dann mit entsprechender Modifikation entweder als Diagnostika oder als Therapeutika oder auch als Kosmetika ("cosmeceuticals") einsetzbar sind
Die Erfindung umfaßt folglich auch die Verwendung eines solchen Proteins bzw Poly- peptids zur Herstellung eines (monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten) Antikörpers gegen dieses Polypeptid, den besagten Antikörper selbst und ebenso seine Verwendung zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von dermatologischen Erkrankungen, zur kosmetischen Behandlung der Epidermis und zur diagnostischen, therapeutischen und/oder kosmetischen Behandlung von anderen das Protein pKe#122 exprimierenden Geweben oder Organen
Auch Sense- und/oder Antisense-Oligonukleotide kommen nach neueren wissenschaftlichen Erkenntnissen als Wirkstoffe für eine Pharmakotherapie in Betracht (vgl G Hartmann et al 1998 Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Arzteblatt 95, Heft 24, C1 115-C1119) — und überdies als Wirkstoffe mit einem in der Pharmakotherapie grundsatzlich neuen Wirkprinzip
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung erfindungsgemaßer Sense- oder Antisense-Oligonukleotide zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung, insbesondere von dermatologischen Erkrankungen, oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis
Eine technisch und wirtschaftlich bedeutende Einsatzmoglichkeit eines erfindungsgemaßen Polypeptids oder einer erfindungsgemaßen Nukleinsäuren besteht nicht zuletzt auch darin, daß mit Hilfe eines solchen Moleküls in einem Screening- Verfahren aus einer sehr großen Anzahl bereitstehender Stoffe solche herausselektiert werden können, die spezifisch an die betreffende Nukleinsäure oder das betreffende Polypeptid binden Diese Stoffe können dann als Ausgangsmaterial (Leitstruktur) für die Entwicklung pharmakologisch einsetzbarer Substanzen dienen und bieten damit die Vorraussetzungen für die Entwicklung alternativer Pharmazeutika zur Diagnose und Therapie, insbesondere der eingangs erwähnten dermatologischen Erkrankungen
Im Hinblick darauf betriff die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemaßen Polypeptids oder einer erfindungsgemaßen Nukleinsäure zur Identifizierung von pharmakologisch einsetzbaren Substanzen, die an das Polypeptid bzw die Nukleinsäure binden und dadurch dessen bzw deren Funktion und/oder Expression beinflussen, insbesondere inhibierend oder aktivierend wirken
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen naher erläutert
Beispiel 1: Herstellung des Proteins pKe#122
A) Gewinnung bzw Herstellung eines Polynukleotids. das das Protein pKe#122 kodiert Als Polynukleotid-Quelle dienten humane epidermale Keratinozyten einer Zellkultur bzw eines Zellkulturmodells, das in der Publikation von Schafer B M , Reinartz J , Bechtel M J , Inndorf S , Lang E , und Kramer M D , 1996 Dispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res 228, S 246-253, ausführlich beschrieben ist Auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrucklich Bezug genommen Diese Zellkultur bzw dieses Zellkulturmodell zeichnet sich dadurch aus, daß sie/es erlaubt, Keratinozyten durch enzymatische Zerstörung der Zell/Matrix-Kontakte, d h durch eine beispielsweise Dispase-induzierte Ablösung der Keratinozyten von der Kulturmatrix, vom ruhenden [uPA~7uPA-R~] in den aktivierten [uPA+/uPA-R+] Zustand zu überführen Die Induktion des aktivierten Zustande ist reversibel die (erneute) Ausbildung eines konfluenten (= maximal dicht gewachsenen), mehrschichtigen Zellverbands aus differenzierten Keratinozyten führt zur Abregulierung von uPA und uPA-R, d h zur Drosselung der Produktion und Einstellung auf einem niedrigeren Konzentrationsspiegel (siehe dazu die Publikation von Schafer B M , Stark H J , Fusenig N E , Rodd R F , Kramer M D , 1996 Differential expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA), its receptor (uPA-R), and mhibitor type-2 (PAI-2) during differentiation of keratinocytes in an organotypic coculture system, Exp Cell Res 220 415-423)
Die Zellen dieser Zellkultur bzw dieses Zellkulturmodells werden im folgenden auch als NHEK (= "normale humane epidermale Keratinozyten") bezeichnet
Für die Bereitstellung der Zellkultur bzw des Zellkulturmodells wurden folgende Maßnahmen durchgeführt Mittels Hautbiopsie erhaltene humane epidermale Keratinozyten wurden über Nacht bei 4 °C trypsiniert und anschließend nach der "feeder- layer"-Technik von J G Rheinwald und H Green (1975, Cell 6, 331-334) in Petrischalen oder 175 cm2 Kulturflaschen für die Dauer von 8 Tagen in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) mit einem Gehalt von 10% (Vol /Nol ) fetalem Kalberserum (FCS) und Zusätzen an Adeninhemisulfat, Insulin, Transferrin, Trijodthyronin, Hydrocortison, Forskolin, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamycin) unter Differenzierungsbedingungen, nämlich erhöhten Kalziumspiegeln, kultiviert (37 °C, 7 % CO2) Die Kultivierung erfolgte damit gemäß herkömmlicher und im Stand der Technik gelaufigen Bedingungen Unter diesen Bedingungen bilden Keratinozyten konfluente zwei- bis dreischichtige sog "Epidermisaquivalente" oder Keratinozyten-" Sheets" aus
Diese Epidermisaquivalente oder Keratinozytensheets wurden durch eine 30-minutige Behandlung mit Dispase II (2,4 mg/ml in DMEM ohne FCS) von der Kulturmatrix abgelost, zweimal in DMEM gewaschen und anschließend für die Dauer von 4 bzw 8 Stunden in komplettem, konditioniertem DMEM inkubiert Die Inkubation in konditioniertem DMEM erfolgte, um den Einfluß von frischem FCS auszuschließen Wahrend der Inkubation fand in diesen flotierenden Keratinozytensheets eine Aufregulierung der Expression der bekannten Aktivierungsmarker uPA und uPA-R sowie des hierin erstmals beschriebenen Proteins pKe#122 statt Die uPA/uPA-R-Aufregulierung war mittels bekannten Techniken wie Enzyme-Linked- Immunosorbent- Assay (ELISA), In-situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz nachweisbar Aus den inkubierten Zellen wurde mittels der im Stand der Technik bekannten Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode (vgl Chromczynski P and Sacchi N , 1986 Single-step method of RNA Isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem 162 156-159) die gesamte RNA gewonnen (Kit "RNA-Clean" der Firma AGS aus Heidelberg) Aus der Gesamt-RNA wurde die mRNA mittels Bindung an poly-T-beschichtete Kugelchen isoliert Diese mRNA diente als Ausgangsmaterial für den nächstfolgenden Verfahrensabschnitt der Subtraktionsklonierung
Für den Einsatz in Kontrollversuchen bzw für Vergleichspraparate wurde mRNA von adharenten Keratinozytensheets isoliert, und zwar nach dem gleichen Verfahrensmuster wie vorstehend beschrieben, ausgenommen der Abweichung, daß für die Dauer der Dispasebehandlung zusatzlich zu der Dispase ein Dispasehemmer, z B Phosphoramidon (lOOμg/ml), appliziert wurde
Nach dem Prinzip der Subtraktionsklonierung wurde eine Genbank erstellt, die vorzugsweise cDNA der dyshasionsinduzierten Gene enthielt, d h solcher Gene, die nach Ablösung der Keratinozytensheets vermehrt in diesen (bzw deren Zellen) exprimiert wurden Zu diesem Zweck wurde die aus den Zellen der adharenten Keratinozytensheets gewonnene mRNA erneut an poly-T-beschichtete Kugelchen gebunden, auf diesen in einzelstrangige cDNA umgeschrieben und anschließend gegen die mRNA von abgelösten, d h nicht-adharenten Keratinozytensheets hybridisiert Diejenigen mRNA- Molekule, die lediglich im nicht-adharenten Zustand, d h nach Dyshasion exprimiert wurden und infolgedessen keinen Hybridisierungspartner fanden, verblieben im Überstand Sie wurden in cDNA umgeschrieben und in den Klonierungsvektor pUEX-1 kloruert
Die daraus resultierende Genbank wurde zwecks Überprüfung anschließend noch einem Southernblot- Verfahren mit [32P]-markierter cDNA adharenter und nicht-adharenter Keratinozytensheets unterworfen Diejenige cDNA oder vielmehr die sie enthaltenden Wirtszellklone - hier der E coli Stamm MC 1061 -, die nach Dyshasion eine deutliche Aufregulation zeigten, wurden anschließend über Nacht bei 30 °C unter üblichen Kulturbedingungen kultiviert bzw vermehrt Aus diesen E coli-Klonen wurde die Plasmid- DNA (pUEXl-cDNA) herausprapariert, und die aus dem pUEXl -Vektor herausgeschnittenen cDNA-Fragmente wurden mittels Random-priming [32P]-markiert Die markierte cDNA wurde als Sonde in Northernblots mit RNA aus adharenten und nicht- adharenten Keratinozytensheets eingesetzt Die Klone, die cDNA enthielten, die bei Verwendung als Sonde im Northernblot- Verfahren kein oder nur ein geringes Signal mit der RNA adharenter Keratinozyten, dagegen ein deutliches Signal mit RNA nicht- adharenter Keratinozytensheets erkennen ließen, wurden für den nachfolgenden Verfahrensabschnitt der Sequenzierung ausgewählt
Bei der Sequenzierung der betreffenden Klone mittels des "nicht-radioaktiven Cycle- Sequencing", das eine Modifikation der Sequenzierungsmethode nach Sanger darstellt und mittlerweile eine im Stand der Technik gelaufige Methode ist, wurde das Gen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:l und SEQ ID NO: 4 gefunden Dieses Gen und das zugehörige Protein erhielten die Bezeichnung pKe#122 Nähere Untersuchungen der zu dem Gen pKe#122 gehörigen d h pKe#122-spezifischen mRNA (aus abgelösten, d h nicht-adharenten Keratinozytensheets) lieferten die Informationen, daß diese mRNA eine Große von etwa 4,8 kb aufweist und nach Dispase-induzierter Ablösung eine Aufregulation zeigt Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines Northernblots, der mit mRNA aus Keratinozytensheets (a) direkt nach bzw (b) vier Stunden nach Dispase-induzierter Ablösung und mit [32P] -markierter pKe#122-cDNA durchgeführt wurde Dieses Ergebnis beinhaltet die Aussage, daß direkt nach der Ablösung wenig pKe#122-mRNA vorhanden oder jedenfalls nachweisbar war, vier Stunden spater dagegen große Mengen vorlagen (eine breitere, farbintensivere Bande), und zwar in der Molekulargewichtszone von etwa 4,8 kb
Die Nukleotidsequenz des Gens pKe#122 enthalt am 3'-Ende an Position 2373-2375 gemäß SEQ ID NO:l und dementsprechend an Position 2472-2474 gemäß SEQ ID NO: 4 ein Stopcodon, das den mutmaßlichen Ort des Transkriptionsendes vorgibt, und dem genau 28 Nukleinsäuren vor der poly-A-Site eine der sog "Polyadenylation site" (AATAAA) sehr ahnliche Sequenz, nämlich AATAA, folgt
Damit ergibt sich für die Gesamtstruktur des pKe#122 -Gens bzw verallgemeinert eines Polynukleotids, welches für das Protein pKe#122 kodiert, daß dieses Gen bzw Polynukleotid die im Sequenzprotokoll SEQ IN NO:l oder die im Sequenzprotokoll SEQ IN NO:4 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen aufweist oder eine Nukleotidsequenz umfaßt oder daraus besteht, die zu einer dieser dargestellten Nukleotidsequenzen oder einer deren Teilsequenzen komplementär ist, oder daß dieses Gen bzw Polynukleotid ganz oder teilweise mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:l oder der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:4 dargestellten Nukleotidsequenz oder mit einer Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen oder mit einer zu diesen dargestellten Nukleotidsequenzen oder deren Teilsequenzen komplementären Sequenz hybridisiert, wobei in den Sequenzprotokollen SEQ ID NO:l und SEQ ID NO:4 anstelle von "T" auch ein "U" stehen kann, und daß von diesem Gen bzw Polynukleotid eine mRNA abgelesen wird, die einer cDNA von ca 4,8 kb entspricht bzw homolog ist
B) Ableitung der Aminosaurenabfolge und Charakterisierung des Proteins pKe#122 anhand des dafür kodierenden Polynukleotids (pKe#122 -Gens) Anhand des genetischen Codes wurde mit Hilfe eines computergestutzten Verfahrens (Programm HUSAR = Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources, Version 4 0, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, 1997) von der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO:l und SEQ ID NO:4 jeweils eine Aminosauresequenz abgeleitet, die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:2 bzw und SEQ ID NO:3 dargestellt ist Die strukturelle Analyse dieser Aminosauresequenzen gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 mit eben diesem Programm lieferte die folgenden Informationen, die für beide Aminosauresequenzen gültig sind
- die Aminosaureabfolge von Position 40 bis 63 (LGKGNFAWKLARHRVTK TQVAIK) gemäß SEQ ID NO:2 und dementsprechend von Position 73 bis 96 gemäß SEQ ID NO:3 entspricht bekannten Proteinkinase-Motiven mit ATP-Bindungsstelle,
- die Aminosaureabfolge von Position 152 bis 164 (IVHRDLKTENLLL) gemäß SEQ ID NO:2 und dementsprechend von Position 185 bis 197 gemäß SEQ ID NO:3 entspricht bekannten Serin/Threonin-Proteinkinase-Motiven,
- die Aminosaureabfolgen von Position 238 bis 240 (TLR), von Position 475 bis 477 (TGR), von Position 485 bis 487 (STR) und von Position 600 bis 603 (TTR) gemäß SEQ D3 NO:2 und von Position 271 bis 273 (TLR), von Position 508 bis 510 (TGR), von Position 518 bis 520 (STR) und von Position 633 bis 635 (TTR) gemäß SEQ D3 NO:3 entsprechen bekannten Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C,
- die Aminosaureabfolge von Position 138 bis 156 (WQILSAVEYCHDHHIVHRD) gemäß SEQ ID NO:2 und dementsprechend von Position 171 bis 189 gemäß SEQ ID NO:3 stellt das pKe#122-l-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikorper "Anti- pKe# 122-1 " im Kaninchen hergestellt wurde (vgl Beispiel 2),
- die Aminosaureabfolge von Position 481 bis 499 (LAEVSTRLSPLTAPCINNS) gemäß SEQ ID NO:2 und dementsprechend von Position 514 bis 532 gemäß SEQ ID NO:3 stellt das pKe#122-2-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikorper "Anti-pKe# 122-2" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl Beispiel 2),
- die Aminosaureabfolge von Position 339 - 352 (NHFAAIYYLLLERL) gemäß SEQ ID NO: 2 und dementsprechend von Position 372 - 385 gemäß SEQ ID NO: 3 stellt das pKe#122-3-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid-Antikorper "Anti-pKe# 122-3" im Kaninchen hergestellt wurde (vgl. Beispiel 2),
- die Aminosaureabfolge von Position 614 - 625 (GLARQVCQVPAS) gemäß SEQ ID NO:2 und dementsprechend von Position 647 - 658 gemäß SEQ ID NO:3 stellt das pKe#122-4-Peptid dar, gegen das der anti-Peptid- Antikörper "Anti-pKe#122-4"im Kaninchen hergestellt wurde (vgl Beispiel 2)
In Fig. 2 ( für SEQ ID NO:2 ) und in Fig. 14 ( für SEQ ID NO:3 ) sind diese Strukturdaten des Proteins pKe#122 schematisch dargestellt Fig 2A und Fig 14A zeigen das Proteinkinase-Motiv mit ATP-Bindungsstellen, das Serin/Threonin- Proteinkinase-Motiv und die vier Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C , und Fig 2B und Fig 14B zeigen die Sequenzabschnitte, gegen die anti-Peptid-Antikorper in Kaninchen hergestellt wurden
Beispiel 2: Verwendung der Aminosäuresequenz des Proteins pKe#122 zur Herstellung polyklonaler Anti-Peptid-Antiköper
Mittels computergestutzter Antigenizitatsanalyse unter Verwendung des in Beispiel 1 genannten Computerprogramms wurden Bereiche aus der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 ausgewählt, die zur Produktion polyklonaler Anti-Peptid-Antikorper geeignet erschienen Diese Bereiche wurden nach dem bekannten "Multiple-Antigenic- Peptide"- Verfahren ( vgl Posnett D N , Tarn J P , 1989: Multiple antigenic peptide method for producing antipeptide site-specific antibodies. Methods-Enzymol 1998, 178 739-746) in Form separater Peptide (pKe#122-l bis -4, vgl Abb 2) mit einem Molekulargewicht von ca 10-15 kD synthetisiert Diese Peptide wurden ohne Zusatz einer Tragersubstanz zur adjuvanzunterstutzten Immunisierung von Kaninchen eingesetzt Die Details dieses Peptid-Herstellungsverfahrens und dieses Immunisierungsverfahrens sind im Stand der Technik allgemein gelaufig Die Pra- und Postimmunseren wurden mit dem allgemein bekannten Enzyme-Linked-Immunosorbent- Assay (ELISA) auf die Reaktivität mit den jeweils zur Immunisierung verwendeten Peptiden und Vergleichspeptiden getestet Es war eine deutliche Immunisierung gegen die Peptide pKe# 122-1, -122-2 und -122-4 nachweisbar Zur Aufreinigung der polyklonalen Antikörper wurden die Postimmunseren zunächst einer Ammoniumsulfatfallung unterworfen und dadurch die IgG-Fraktion angereichert Mit dieser angereicherten IgG-Fraktion wurde anschließend eine Immunaffinitatschromatograpie durchgeführt Hierfür wurden jeweils die vier zur Immunisierung verwendeten Peptide pKe# 122-1 bis -4 an Sepharose 4B immobilisiert und diese Peptid-Sepharose-4B-Konjugate in der Immunaffinitatschromatographie eingesetzt Es resultierten drei weitgehend reine anti-Peptid-IgG-Fraktionen, nämlich anti-Peptid pKe# 122-1, anti-Peptid pKe# 122-2 und anti-Peptid pKe# 122-4 Diese drei affinitatsgereinigten Antikorperfraktionen zeigten eine eindeutige Immunreaktion mit dem jeweils korrespondierenden Antigen-Peptid In Tabelle 1 sind diese Ergebnisse dargestellt
Mit dem Immunserum gegen das Peptid pKe# 122-1, dem polyklonalen Antikörper anti- pKe# 122-1 , wurden außerdem Zellysate der Keratinozytenlime HaCaT und der Keratinozytensheets 8 Stunden nach Ablösung mit Dispase (= nicht-adharente Keratinozytensheets) im Westemblot- Verfahren auf die Expression des Proteins pKe#122 getestet Sowohl in den HaCaT-Zellen als auch in den Zellen der abgelösten (nicht-adharenten) Keratinozytensheets wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von ca 70 - 85 kD nachgewiesen Der zum Experiment zugehörige Westemblot ist in Beispiel 3B(2) ausführlich beschrieben und in Fig. 3 dargestellt Er zeigt sowohl in HaCaT-Zellen als auch in den nicht-adharenten Keratinozytensheets ein Protein der Große ca 70 - 85 kD
Der polyklonale Anti-Peptid-Antikorper pKe# 122-1 wurde daruberhinaus mit dem hier in Beispiel 5 beschriebenen rekombinanten ca 100 kD GST-pKe#122-Fusionsprotein (Fraktion 85 in Abb 10 B) im Immunoblot- Verfahren ausgetestet Der polyklonale Anti- Peptid- Antikörper pKe# 122-1 reagierte mit dem Fusionsprotein Diese positive Reaktion wurde durch Vergleich mit Kontrollversuchen bestätigt, bei denen anstelle des Anti- Peptid- Antikörpers pKe# 122-1 ein anti-GST- Antikörper, oder aber normales Kaninchen- IgG eingesetzt wurde Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und in Fig. 4 dargestellt Spur "a" in Fig 4 zeigt den Kontrollansatz mit Ziege-Normal-IgG, Spur "b" in Fig 4 zeigt den Ansatz mit Ziege-anti-GST-IgG, Spur "c" in Fig 4 zeigt den Ansatz mit Kaninchen- Normal-IgG und Spur "d" in Fig 4 zeigt den Ansatz mit Kaninchen-anti-pKe# 122-1 Beispiel 3: Verwendung des Proteins pKe#122 bzw. gegen das Protein oder gegen die mRNA des pKe#122-gerichtete Reagenzien zum Nachweis des aktivierten Zustands humaner epidermaler Keratinozyten
A Verwendete Keratinozyten
Als Versuchszellen bzw Targetzellen (=Zielobjektzellen) dienten HaCaT-Zellen und humane epidermale Keratinozyten der Zellkultur bzw des Zellkulturmodells (NHEK), das in der Publikation B M Schafer und Koautoren (a a O ) ausführlich beschrieben und hier im Beispiel 1 (A) kurz zusammengefaßt ist Auf den Inhalt dieser Publikation wird auch an dieser Stelle ausdrucklich Bezug genommen Desweiteren wurden Hautbiopsien auf die Expression des pKe#122-Proteins untersucht
B) Nachweisverfahren, die auf der Anwendung der gegen das Protein pKe#122 gerichteten Antikörper beruhen
1. Immunhistologie
Mit Hilfe eines Kryotoms werden 5 μm-dicke Gefrierschnitte von Geweben aus Hautbiopsien von klinisch unauffälliger Normalhaut und klinisch auffalliger, lasionaler Haut infolge der Erkrankungen Pemphigus vulgaris, Bulloses Pepmphigoid und Psoriasis vulgaris hergestellt Diese werden bei Raumtemperatur getrocknet und in 100% Azeton fixiert (anstelle von Azeton kann ebensogut auch 100% Methanol, 100% Ethanol oder 4%-iges Paraformaldehyd verwendet werden) Danach werden die Schnitte gemäß im Stand der Technik bekannter sog "Blockierungsverfahren" behandelt, um unspezifische Bindungsstellen für den Antikörper zu blockieren Im vorliegenden Beispielfall wurden zwei Blockierungsschritte durchgeführt (1 ) eine Blockierung mit Avidin/Biotin und (2 ) eine Blockierung mit Normalserum Im ersten Blockierungsschritt wurde die Avidin/Biotin-Blockierung unter Verwendung des Avidin-Biotin-Blockierungskits der Firma Vector-Laboratories nach Herstellervorschrift durchgeführt, d h es wurde bei Raumtemperatur zunächst 15 Minuten mit der Avidin-Fertiglosung und nachfolgend 15 Minuten mit der Biotin-Fertiglosung inkubiert Anschließend wurden die Schnitte mit 10 Vol -% Normalserum in PBS (Normalserum der Spezies, aus der der Zweit- Antikorper stammt, hier Ziege-Normalserum, PBS = Phosphate buffered saline = Phosphat-gepufferter Kochsalzlosung, pH 7,2-7,4 ) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert
Im Anschluß an die Blockierung werden die Schnitte in PBS mit einem Gehalt an 5μg/ml anti-Peptid-pKe# 122-1 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert Zur Entfernung des nichtgebundenen Antikörpers werden die Schnitte anschließend in PBS mit einem Gehalt an 0,2 % (Gewicht/Volumen) bovinem Serumalbumin gewaschen Es folgt die Inkubation mit einem beispielsweise Biotin-markierten und gegen Kaninchen-IgG- gerichteten Antikörper aus der Ziege (1 500 verdünnt in PBS/ 0,2% BSA, 30 Minuten bei Raumtemperatur), ein weiterer Waschschritt sowie die Aufbringung eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 -markierten Streptavidins (1 1 000 in PB S/0,2 % BSA verdünnt) Anstelle von Cy3 kann auch ein anderer Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung des Streptavidins verwendet werden, z B FITC Nach einem letzten Waschschritt werden die Schnitte mit Eindeckmedium, z B Elvanol oder Histogel, eingedeckt und im Fluoreszenzmikroskop untersucht und ausgewertet In Fig.5 sind die Ergebnisse eines derart durchgeführten Immunfluoreszenznachweises gezeigt Der anti- pKe# 122-1 IgG Antikörper färbt auf Normalhautschnitten Keratinozyten im Bereich der epidermalen Basalmembranzone an (Fig 5 A) Bei Färbung von Biopsien lasionaler Haut infolge der Erkrankungen Pemphigus vulgaris (Fig 5 B), Bullosem Pemphigoid (Fig 5 C) oder Psoriasis vulgaris (Fig 5 D) zeigt sich eine auffallig starke Färbung in epidermalen Keratinozyten, insbesondere im Bereich epidermaler Lasionen Dort hat demnach eine verstärkte Expression und eine offensichtlichen Aufregulation des Proteins pKe#122 stattgefunden
2. Immuno-Blot ("Western-Blot") und Dotblot
In Fig. 3 ist der Nachweis des pKe#122-Proteins mittels Westemblot- Verfahren unter Verwendung von anti-pKe# 122-1 dargestellt Hierfür wurden Zellysate der Keratino- zytenlinie HaCaT (Proben "HaCaT") und von Keratinozytensheets 8 Stunden nach Dispasebehandlung (Proben "NHEK 8h") elektrophoretisch in einem SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt Die Proteine wurden nach Standardverfahren auf eine Nitrozellulosemembran geblottet Zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurde eine Inkubation mit 5 Gew -% Milchpulver/TBS-Puffer durchgeführt Anschließend wurden die (Protein-) Streifen mit der Bezeichnung "anti- 122-1 " in 3 %- Milchpulver/TBS-Puffer unter Zusatz von anti-pKe# 122-1 -Antikörpern (1 μg/ml) und die (Protein-)Streifen mit der Bezeichnung "rblgG" in 3 %-Milchpulver/TBS-Puffer unter Zusatz von Kaninchen-Normal-IgG (1 μg/ml) jeweils bei 4°C für ca 18 Stunden (über Nacht) inkubiert Die Nitrozellulosemembran wurde danach mit TBS/Tween- und TBS-Puffer gewaschen und mit einem Enzym-markierten Anti-Kaninchen-IgG- Antikorper in 3 %-Milchpulver/TBS -Puffer inkubiert Nach erneutem Waschen mit TBS/Tween und TBS wurden die gebundenen Antikörper mit einem peroxidase- spezifischen Lumineszenzsubstrat (hier beispielsweise das ECL-System der Firma Amersham-Buchler) sichtbar gemacht und autoradiographisch dargestellt Auch eine alternative Markierung mit chromogenen Substraten ist gut möglich Die Zellysate können auch ohne vorhergehende elektrophoretische Auftrennung direkt auf eine Nitrozellulosemembran geblottet und wie vorstehend beschrieben weiterbehandelt werden
3. Enzyme-linked- immunosorbent-assay (ELISA)
Mikrotiterplatten werden mit rekombinantem pKe#122/GST-Fusionsprotein in unterschiedlichen Konzentrationen (10 - 0 ng/ml) beschichtet Unspezifische Bindungsstellen werden durch Behandlung mit 0,1 Gew -% Gelatine in PBS (PB S/Gelatine) blockiert Anschließend werden die beschichteten Vertiefungen mit anti-pKe# 122-1 IgG (1 μg/ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert (siehe Fig 6 A, geschlossene Kreise) Der Kontrollansatz erfolgt mit Kaninchen Normal-IgG in gleichen Konzentrationen (siehe Fig 6 A, offene Kreise) Nach einem Waschschritt mit 0,05 Vol -% Tween-20 in PBS (PBS/Tween) erfolgt eine Inkubation mit Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Kaninchen IgG (1 10 000 in PBS/Tween) Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper wird das farblose Peroxidase- Substrat Ortho- Phenylendiamin zugesetzt, welches durch die Peroxidase in ein farbiges Produkt umgewandelt wird Anstelle von Ortho-Phenylendiamin sind auch andere Peroxidasesubstrate mit Farbumschlag einsetzbar Die Quantifizierung der Farbbildung und damit des gebundenen Antikörpers erfolgt durch Absorptionsmessung in einem Mikrotiterplattenphotometer bei 490 gegen 405 nm (Ordinate) Das Ergebnis eines solchen Versuchs ist in Fig. 6.A dargestellt Es zeigt, daß die Farbkonzentration der Menge des an die Platte gebundenen pKe#122-Fusionsproteins proportional ist Daraus folgt, daß bei Einsatz von Proben bekannter Antigenkonzentrationen, sog Standards, durch Vergleich die Quantifizierung einer unbekannten Antigenmenge möglich ist
Zur Quantifizierung des pKe#122-Proteins in komplexen Losungen wird die Durchführung eines Sandwich-ELISA (Fig 6 B) bevorzugt Hierzu wird eine Mikrotiterplatte mit einem gegen pKe#122 gerichteten Antikörper (z B Kaninchen anti-pKe#122/GST- Fusionsprotein, 1 μg/Nertiefüng) beschichtet Dann werden die noch verbliebenen unspezifischen Bindungsstellen der Mikrotiterplatte mit PB S/Gelatine blockiert Anschließend wird die Mikrotiterplatte mit unterschiedlichen Konzentrationen des pKe#122/GST-Proteins (10 - 0 ng/ml) in Ansatz gebracht Nach einem Waschschritt mit PBS/Tween wird die Platte mit einem zweiten Peroxidase-markierten anti-pKe#122- Antikorper (zB peroxidase-markiertem Kaninchen anti-pKe# 122-1 (Peptid)- Antikörper) inkubiert (z B eine Stunde unter Schuttein bei Raumtemperatur) "Peroxidase" steht hier stellvertretend für praktisch jede beliebige Markierung des Antikörpers, z B mit Enzymen, Fluoreszenzmolekulen oder Lumineszenzmolekulen Nach einem weiteren Waschschπtt zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper wird das farblose Peroxidase-Substrat Ortho-Phenylendiamin zugesetzt, welches durch die Peroxidase- Aktivität in ein farbiges Produkt umgewandelt wird Die Quantifizierung der Farbbildung erfolgt durch Absorptionsmessung in einem Mikrotiterplattenphotometer bei 490 gegen 405 nm (Ordinate) Das Ergebnis eines solchen Versuchs ist in Fig. 6.B dargestellt Es zeigt, daß die Farbkonzentration der Menge des an die Platte gebundenen pKe#122 proportional ist Durch dieses Testverfahren ist folglich eine Quantifizierung der unbekannten Menge des pKe#122 in einer Probe möglich Dabei steht die Substanz Ortho-Phenylendiamin hier stellvertretend für jedes beliebige Peroxidase-Substrat, das infolge der Peroxidase-Aktivitat seine Farbe nachweisbar ändert Anstelle des hier beispielhaft verwendeten polyklonalen Antikörpers "anti-pKe# 122-1 " können ebensogut monoklonale Antikörper, die gegen das Protein pKe#122 gerichtet sind, eingesetzt werden, und zwar sowohl im einfachen ELISA (= Enzyme linked immunosorben assay) als auch im Sandwich-ELISA.
Beispiel 4: Nachweis pKe#122-spezifischer mRNA in Zellen mittels reverser Polymerasekettenreaktion
Mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde pKe#122-spezifische RNA in Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) nach Dispasebehandlung und in HaCaT-Zellen nachgewiesen Hierfür wurde RNA aus Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) nach Dispasebehandlung und unterschiedlich langer weiterer Inkubationszeiten und aus HaCaT-Zellen jeweils mit Standardmethoden (Guanidinium-Thiocyanat-Phenol- Chloroform-Extraktionsmethode, siehe auch Beispiel 1A ) isoliert und in cDNA nach Standardmethoden umgeschrieben Diese cDNA wurde einer PCR unterzogen, bei der aus der pKe#122-spezifischen cDNA ein Teilfragment von « 350 kb amplifiziert wurde Als Primer-Paar wurde eine Kombination aus den Primern "pKe#122-forward 3" (tgagcaggcgctgggtatcatgcag) und "pKe#122-reverse 2" (tcaccgggaacaagaagggccacct) eingesetzt. Es wurden 10 ng cDNA mit je 10 μM Primer zusammen mit einem Gemisch aus hitzestabiler DNA-Polymerase, ATP, TTP, GTP, CTP und Polymerasepuffer (vgl z B Current protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Ine, Suppl. 37, Chapter 15), hier im Beispiel in Form des im Handel gebrauchsfertig erhältlichen "PCR-Master-Mix" der Firma Clontech, in Ansatz gebracht. Zusatzlich wurden folgende Kontrolluntersuchungen durchgeführt: 1 der vorstehend beschriebene Ansatz mit dem Plasmid pUEX-l/pKe#122 anstelle der cDNA, 2 die Kit-interne Positivkontrolle, 3. der vorstehend beschriebene Reaktionsansatz ohne Zusatz von cDNA (Negativkontrolle 1), 4. der vorstehend beschriebene Ansatz mit cDNA aus Zellen von Keratinozytensheets (NHEK) 2 Stunden nach Dispasebehandlung, ohne Zusatz von Primem (Negativkontrolle 2). Die Reaktionsprodukte der PCR-Reaktion wurden im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Fig. 7 zeigt das Ergebnis dieser Auftrennung Es gilt: Spur 1 = Molekulargewichts-Marker, Spur 2 = NHEK T0, Spur 3 = NHEK T2, Spur 4 = NHEK T4, Spur 5 = NHEK T8, Spur 6 = HaCaT, Spur 7 = frei, Spur 8 = Positivkontrolle (pUEX-1 ; mit pKe#122 als Insert), Spur 9 = Negativkontrolle (Ansatz mit cDNA ohne Primer), Spur 10 = Kit-spezifische Positivkontrolle zur Funktionskontrolle der PCR, Spur 11 = Negativkontrolle (Ansatz mit Primer ohne cDNA), Spur 12 = Molekulargewichts-Marker. Ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von « 350 kb wurde in den Spuren 3, 4, 5, 6 und 8 nachgewiesen, das heißt: pKe#122- spezifische mRNA wurde in Zellen von Keratinozytensheets zum Zeitpunkt 2 (T2), 4 (T4) und 8 (T8) Stunden nach dispase-induzierter Ablösung und ebenso in HaCaT-Zellen nachgewiesen.
Diese Technik ermöglicht den Nachweis der pKe#122-Expression auch in den Fällen, in denen der Nachweis des pKe#122-Proteins aufgrund zu niedrigen Expressionsspiegels mit immunhistologischen Methoden, dem ELISA-, Dotblot- oder Westemblot- Verfahren nicht gelingt.
Beispiel 5: Herstellung von Vektormolekülen mit der Fähigkeit zur Expression des Proteins pKe#122 in prokaryontischen bzw. eukaryontischen Zellen
Zur Herstellung bzw. Expression des rekombinanten pKe#122-Proteins wurden zwei Wege beschritten. Zum einen wurden zwei pKe#122-Gluthathion-S-Transferase (GST)- Fusionsproteine, ρKe#122/GST-I und pKe#122/GST-II, (Vektor pGEX; siehe Fig. 8) zu dem Zweck der Expression in Bakterien (E. coli DH5α) hergestellt. Zum anderen wurde ein pKe#122-FL AG-Fusionsprotein (Vektor pBK-CMV; siehe Fig. 9) zu dem Zweck der Expression in eukaryontischen Zellen (cos-Zellen) hergestellt.
Die pKe#122-Gluthathion-S-Transferase-(GST)-Fusionsproteine wurden in E. coli (DH5α) durch LPTG-Induktion zur Expression gebracht. Nach der Induktion wurde das bakterielle Lysat im Westemblot mit anti-GST-Antikörpern untersucht, und zwar im Vergleich zu pKe#122-Gluthathion-S-Transferase (GST)-Vektor tragendem, nicht- induziertem Bakterienlysat sowie zu Lysat von Bakterien, die ausschließlich GST exprimierten. Das Produkt dieses Westemblots ist in Fig. 10.A abgebildet: Spur (a) zeigt die Kontroll-Transfektante (GST ohne Insert) vor LPTG-Induktion, Spur (b) zeigt die Kontroll-Transfektante (GST ohne Insert) nach LPTG-Induktion, Spur (c) zeigt pKe#122/GST-I vor LPTG-Induktion, Spur (d) zeigt pKe#122/GST-I nach LPTG- Induktion , Spur (e) zeigt ρKe#122/GST-II vor LPTG-Induktion, und Spur (f) zeigt pKe#122/GST-II nach LPTG-Induktion.
Wie aus der Abbildung ersichtlich, war ein Gemisch unterschiedlich großer GST- positiver Banden nachweisbar und zwar ausschließlich nach LPTG-Induktion. Die höchstmolekulare Bande hatte ein Molekulargewicht von ca. 100 kD (Fraktion 85), die niedrigstmolekulare Bande von ca. 26 kD, was dem Molekulargewicht des reinen GST- Proteins entspricht. Die genannten Daten weisen darauf hin, daß es in E. coli zu einem Abbau des rekombinanten pKe#122-GST-Fusionsproteins kommt. Die exprimierten Fusionsproteine (Spur d) lagen als unlösliche Proteinaggregate in den sog. "inclusion bodies" vor, weshalb eine Aufreinigung mittels Prep-Cell durchgeführt wurde. Die Fraktionen dieser PrepCell-Reinigung wurden dann mittels Standardverfahren elektro- phoretisch aufgetrennt und mittels des bereits oben beschriebenen Immuno-Blot Verfahrens mit anti-GST- Antikörpern analysiert. Das Produkt dieses Aufreinigungsverfahrens ist in Fig. 10 B abgebildet. Die Aufreinigung ergab ein Gemisch unterschiedlich großer GST-Fusionsproteine. Die stärkste Bande, d.h. die Mehrzahl der GST- Fusionsproteine, wies ein apparentes Molekulargewichtsmarker von 65 kD auf. Das erlaubt den Schluß, daß das 65 kD pKe#122-GST-Fusionsprotein aus dem GST-Protein und einem ca. 40 kD großen Fragment des Proteins pKe#122 besteht. Das 65 kD pKe#122/GST-Fusionsprotein wurde zur Herstellung eines polyklonalen Antiserums in Kaninchen herangezogen. Die Herstellung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte wie in Beispiel 2 für die anti-Peptid- Antikörper beschrieben
Die höchstmolekulare Bande hatte ein apparentes Molekulargewicht von ca. 100 kD (vgl. Abb. 10 B, Fraktion 85). Das erlaubt den Schluß, daß das 100 kD pKe#122-GST- Fusionsprotein aus dem GST-Protein und einem ca 70-75 kD großen Fragment des Proteins pKe#122 besteht (vgl auch Fig 4 und dazugehörige Beschreibung in Beispiel 2)
Im eukaryontischen System wurde der pBK-CMV-pKe# 122- Vektor (Fig 9) in sog Cos-Zellen, d h in Zellen der im Stand der Technik allgemein bekannten Cos-Zellinie, transformiert Die Cos-Zellen wurden nach Standardverfahren durch Behandlung mit DEAE-Dextran/Chloroquin zur Aufnahme der Plasmid-DNA gebracht Danach wurden die transformierten Zellen zwei Tage unter Standardbedingungen (37 °C und 7 % CO2) inkubiert Die Cos-Zellen wurden lysiert und im Immuno-Blot- Verfahren analysiert unter Verwendung eines Antikörpers gegen das FLAG-Epitop bzw des anti-Peptid- Antikorpers anti-pKe# 122-1 IgG Fig. 11 zeigt das Produkt des Immuno-Blots Spur a zeigt die nichttransfizierten Cos-Zellen, Spur b zeigt ein FLAG-Kontrollprotein und Spur c zeigt mit pKe#122-FLAG Vektorkonstrukt transfizierte Cos-Zellen Die Spur c weist eine Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht von 80 kD auf, die von dem anti- FLAG-Antikorper angefärbt wurde Spur b zeigt ein FLAG-markiertes Kontrollprotein, das die Funktionalitat des anti-FLAG- Antikörpers demonstriert
Beispiel 6: Beeinflussung von Keratinozyten durch pKe#122-spezifische Antisense-Oligonukleotide
Antisense-Nukleotide werden von Zellen, auch Keratinozyten, aufgenommen (vgl G Hartmann et al 1998 Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Arzteblatt 95, Heft 24, C1 115-C1119) und binden an die in der Zelle vorliegende mRNA und hemmen deren Translation und damit die Expression (vgl Y -S Lee, et al 1997 Definition by specific antisense oligonucleotides of a role for protemkinase Ca in expression of differentiation markers in normal and neoplastic mouse epidermal keratinocytes, Molecular Carcinogenesis 18, S 44-53) Geeignete Antisense-Oligonukleotide wurden anhand der pKe#122-spezifischen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO:l bzw SEQ ID NO:4) hergestellt Sie wurden mit geeignetem Puffermedium (sog "Oligopuffer") auf eine Konzentration von 100 μM eingestellt HaCaT-Zellen wurden bei 37 °C und 7 % CO2 bis zu einer Konfluenz von 70 - 80 % kultiviert Die Zellen wurden abtrypsiniert (10 Minuten 0,2 % EDTA, 5 - 10 Minuten 0,1 % Trypsin) und auf eine Konzentration von 25 000 Zellen/ml eingestellt Pro Vertiefung einer 96-well-Platte wurden 100 μl Zellsuspension (entspricht 2 500 Zellen) einpipettiert Die Zellen wurden 1 Stunde inkubiert, danach erfolgte die Zugabe des Antisense-Oligonukleotids (2 μl einer 100 μM-Losung) und eine weitere Inkubation von 24-48 Stunden Als Negativkontrolle dienten Zellansatze, denen Oligonukleotid mit der gleichen Basenverteilung aber zufallig ausgewählter Sequenz zugegeben wurden
Die solcherart behandelten Zellen wurden mit Hilfe eines Mikroskops hinsichtlich phanotypischer Veränderungen in den Zellen untersucht Das Ergebnis der mikroskopischen Analyse ist in Fig. 12 und Fig. 13 dargestellt Fig 12 a zeigt subkonfluente HaCaT-Kulturen, die mit pKe#122-spezifischen Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig 12 b zeigt subkonfluente HaCaT-Kulturen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig 13 a zeigt konfluente HaCaT-Kulturen, die mit pKe#122-spezifischen Antisense-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig 13 b zeigt konfluente HaCaT-Kulturen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelt worden sind, und Fig 13 c zeigt einen Detailausschnitt aus Fig 13 a
Die mikroskopischen Untersuchungsergebnsisse demonstrieren, daß im Vergleich zu Kontroll-Oligonukleotiden die Anzahl der Zellen in den mit dem spezifischen Antisense- Oligonukleotid behandelten Kulturen deutlich reduziert ist Das laßt auf eine durch das antisense-Oligonukleotid verursachte Verminderung der zellularen Proliferation schließen Nach Erreichen der Konfiuenz fanden sich in den mit antisense-Oligo- nukleotiden behandelten HaCaT-Kulturen stark vergrößerte Zellen, die in den mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelten Kulturen nicht zu finden waren Diese großen Zellen entsprechen in ihrer Morphologie differenzierten Keratinozyten Der Befund laßt darauf schließen, daß mit pKe#122-spezifischen antisense-Oligonukleotiden behandelte Zellen eine vermehrte Tendenz zur Differenzierung aufweisen
Zusammengefaßt führt die Behandlung mit pKe#122-spezifischen Oligonukleotiden zu einer deutlichen Beeinflussung der Proliferation und Differenzierung

Claims

A n s p r ü c h e
Isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ahnlich ist, und das die im Sequenzprotokoll SEQ LD NO 2 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 3 dargestellte Aminosauresequenz oder ein durch Aminosauresubstitution, -deletion, -insertion, -oder -inversion aus einer dieser beiden Aminosauresequenzen entstandenes Allel oder Derivat aufweist
Isolierte Nukleinsäure die ein Protein codiert, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ahnlich ist, die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ LD NO 1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder die zu einer dieser beiden komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden dargestellten oder komplementären Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser vorgenannten Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure aus einer naturlichen, synthetischen oder halbsynthetischen Quelle gewonnen ist Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure eine cDNA ist
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid ist, das mindestens 6, vorzugsweise 8 bis 25 Nukleotide umfaßt und mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ LD NO 4 dargestellten Nukleotidsequenz oder Teilsequenzen davon hybridisiert
Isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß diese Nukleinsäure eine Splice- Variante ist, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ LD NO 1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ LD NO 4 dargestellten Nukleotidesquenz hybridisiert
Isoliertes Polypeptid , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aminosauresequenz aufweist, die aus einer Splice- Variante einer mRNA resultiert, welche entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 1 oder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO 4 dargestellte Nukleotidsequenz oder die zu einer dieser beiden komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden dargestellten oder komplementären Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser vorgenannten Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist Rekombinantes DNS-Vektormolekul, das eine Nukleinsäure nach einem der
Ansprüche 2 bis 6 umfaßt, und das die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle aufweist
Rekombinantes DNS-Vektormolekul nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Vektormolekul das Plasmid pUEX-1 oder pGEX-2T oder pBK-CMV oder pHR 2 ist
Transformierte Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 6 enthalt, welche mit einem aktivierbaren Promotor gekoppelt ist, der in der Wirtszelle natürlicherweise oder als Folgen einer Rekombination enthalten ist, und die die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins ρKe#122, aufweist
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der Zytokeratin-14-Promotor und die Wirtszelle ein Keratinozyt ist, oder daß der Promotor der CMV-Promotor und die Wirtszelle eine Cos-Zelle ist
Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder eines Vektormolekuls nach Anspruch 8 zur Herstellung transgener Saugetiere, insbesondere Mause oder Ratten Verwendung eines Polypeptids nach Anspmch 1 oder Anspmch 7 zur Herstellung eines Antikörpers gegen dieses Polypeptid und/oder damit verwandte Proteine
Verwendung nach Anspmch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von insbesondere dermatologischen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis eingesetzt wird
Antikörper, der spezifisch mit einem Polypeptid gemäß Anspmch 1 oder Anspmch 7 reagiert
Verwendung eines Antikörpers nach Anspmch 15 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von dermatologischen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung der Epidermis.
Reagenz zum indirekten Nachweis eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und in aktivierten Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#122 , dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz wenigstens eine Nukleinsäure nach einem der Anspmche 2 bis 6 oder ein Polypeptid gemäß Anspmch 1 oder Anspmch 7 umfaßt
Verwendung eines Sense- oder Antisense-Oligonukleotids nach Anspmch 5 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von insbesondere dermatologischen Erkrankungen oder zur kosmetischen Behandlung insbesondere der Epidermis
9. Verwendung eines Polypeptids nach Anspmch 1 oder Anspmch 7 oder einer
Nukleinsäure nach Anspmch 2 zur Identifiziemng von medizinisch, kosmetisch oder pharmakologisch einsetzbaren Substanzen, die an das Polypeptid bzw. die Nukleinsäure binden und dadurch dessen/deren Funktion und/oder Expression beeinflussen, insbesondere als Inhibitoren oder Aktivatoren wirken.
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US20020025931A1 (en) * 2000-03-24 2002-02-28 Rachel Meyers 3714, 16742, 23546, and 13887 novel protein kinase molecules and uses therefor
GB0400122D0 (en) * 2004-01-06 2004-02-11 Badrilla Ltd Method of quantifying binding
US6946028B1 (en) * 2004-09-07 2005-09-20 Kerr-Mcgee Chemical Llc Surface-treated pigments
JP2015072226A (ja) * 2013-10-03 2015-04-16 住友ベークライト株式会社 検査方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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