DE69731682T2

DE69731682T2 - TAB1 Protein und dafür kodierende DNA

Info

Publication number: DE69731682T2
Application number: DE69731682T
Authority: DE
Inventors: Kunihiro Chikusa-ku Matsumoto; Elsuke Sakyo-ku Nishida
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-04-25
Also published as: DE69731682D1; EP0803571B1; US6140042A; ATE283356T1; US5989862A; ES2230586T3; EP0803571A2; EP0803571A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das TAB1-Protein codiert, das einen Teil des Signaltransduktionsweges des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) bildet.
2. Verwandtes Fachgebiet
TGF-β ist ein multifunktioneller Faktor, der verschiedene zelluläre Funktionen reguliert. Als eine dieser Funktionen ist TGF-β verantwortlich für die Reparatur und Reproduktion von Geweben bei verschiedenen Arten von Verletzung.
Abnormale Produktion von TGF-β in Fällen chronischer Verletzung resultiert manchmal in einem Ungleichgewicht zwischen der Reparatur und der Reproduktion von Geweben und damit in pathologischer Fibrose. Hepatische Fibrose ist als ein Zustand bekannt, der aus einem Ungleichgewicht in der TGF-β-Produktion resultiert. In der Leber beschleunigt TGF-β die Produktion extrazellulärer Matrixproteine, die für Fibrose verantwortlich sind, während es die Synthese katabolischer extrazellulärer Matrixproteinenzyme inhibiert und katabolische Enzyminhibitoren induziert und es wirkt so als ein hauptauslösender Faktor der hepatischen Fibrose.
Eines der bekannten Teile des Signaltransduktionsweges, das zu der TGF-β-Überfamilie gehört, ist das Mitogen-aktivierte Protein Kinase-Kinase-Kinase (MAPKKK)-System.
Der MAPK-Weg ist ein konservierter eukaryoter Signaltransduktionsweg, der Rezeptorsignale in verschiedene Funktionen konvertiert, und das System umfaßt drei verschiedene Proteinkinasen, konkret die oben erwähnte MAPKKK, MAPKK und MAPK, wobei MAPK durch Phosphorylierung durch MAPKK aktiviert wird und MAPKK wiederum durch MAPKKK aktiviert wird (E. Nishida et al., Trends Biochem. Sci. Bd. 18, S. 128 (1993); K. J. Blumer et al., op. cit. Bd. 19, S. 236 (1994); R. J. David op. cit. Bd. 19, S. 470 (1994); C. J. Marchall, Cell, Bd. 80, S. 179 (1995)).
TAK1, welches ein Mitglied der MAPKKK-Familie ist, welches eine Funktion in Signaltransduktionswegen, die zu der TGF-β-Überfamilie gehören, besitzt, wurde von K. Yamaguchi identifiziert (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)).
TGF-β transduziert Signal durch einen heteromeren Komplex aus Typ I und Typ II TGF-β-Rezeptoren, die Transmembranproteine, die cytoplasmatische Serin- und Threonin-spezifische Kinasedomänen umfassen, sind (J. L. Wrana et al., Nature, Bd. 370, S. 341 (1994); D. M. Kingsley et al., Genes Dev., Bd. 8, S. 133 (1994)). Auf dem molekularen Niveau ist jedoch wenig über den Signaltransduktionsmechanismus flußabwärts von den TGF-β-Rezeptoren bekannt und ein Gen, das TAB1-Protein codiert, wurde bisher nicht geklont.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann eine isolierte DNA bereitstellen, die TAB1-Protein codiert, was ein neu entdecktes Mitglied in dem TGF-β-Rezeptor- Signaltransduktionsweg ist und ein Gen, das dieses codiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Screeningverfahren für die Inhibitoren des TGF-β-Signaltransduktionsweges bereit. TAB1 bezieht sich auf ein Protein, das an TAK1 bindet (TAK1-Bindungsprotein).
Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte DNA, die TAB1-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, codiert, eine isolierte DNA, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5, modifiziert durch Substitution, Deletion und/oder Addition von ein oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, codiert und eine biologische Eigenschaft von TAB1-Protein aufweist; ein Protein, worin die 52. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, Arginin ist; eine DNA, die mit der DNA, die die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, aufweist unter Hybridisierungsbedingungen von 60°C, 0,1 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat hybridisieren kann und die eine biologische Eigenschaft von TAB1-Protein aufweist; ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus Aminosäuren von den Aminosäurenpositionen 21 bis 504 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, besteht und eine isolierte DNA, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, die aus den 68 Aminosäuren von den Aminosäurepositionen 437 bis 504 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, besteht, aufweist, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren für die Herstellung von jedem der oben erwähnten Proteine oder Polypeptide bereit, umfassend die Schritte der Kultivierung eines Wirtes, der durch einen Expressionsvektor transformiert wurde, der DNA umfaßt, die das Protein oder Polypeptid codiert, und Rückgewinnung des Proteins oder Polypeptids aus der Kultur.
Die vorliegende Erfindung stellt noch weiter ein Verfahren für die Induktion von Säugetierzellen, irgendeines der oben erwähnten Proteine oder Polypeptide herzustellen, bereit, umfassend den Schritt der Einführung von DNA, die das Protein oder Polypeptid codiert, in Säugetierzellen.
Die vorliegende Erfindung stellt noch weiter einen Expressionsvektor, der die DNA umfaßt, und einen Wirt, der durch den Expressionsvektor transformiert wird, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt noch weiter ein Verfahren für das Screening von Inhibitoren des TGF-β-Signaltransduktionsweges bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Regionen auf dem TAK1-Protein, an das TAB1-Protein bindet. Die schattierten Bereiche zeigen die TAK1-katalytische Domäne an.
2 zeigt Komplementation der Stel1-Deletion durch die gleichzeitige Gegenwart von TAK1 und TAB1 in einem Stel1-Deletionsstamm, in dem Pheromon-aktivierten MAPK-Weg von Hefe.
3 sind die Ergebnisse von Elektrophorese, die in einem Photo gezeigt werden, das die Ergebnisse des In-vitro-Experiments zeigt, und dabei die Verstärkung der TAK1-Aktivität durch TAB1 anzeigt.
4 zeigt die Aminosäuresequenz von TAB1 mit einer Insertion von partieller TAK1-Sequenz zum Vergleich.
5 ist eine Elektropheresediagramm, das die Expression von mRNA, die TAB1 in verschiedenen Organen und Geweben codiert, zeigt.
6 ist ein Immunoblotdiagramm, das die Assoziation von TAB1 und TAK1 in Säugetierzellen zeigt.
7 enthält einen Graph, der die Erhöhung der TAK1-Kinaseaktivität durch TAB1 in Säugetierzellen zeigt (oben) und ein Blot-Diagramm, das vergleichbare Mengen der Produktion von TAK1 und KN-MPK2 zeigt.
8 ist ein Graph, der erhöhte Expression eines Luciferase-Reportergens durch die gleichzeitige Anwesenheit von TAK1 und TAB1 in Säugetierzellen, die durch TGF-β stimuliert wurden, zeigt.
9 ist ein Graph, der die Inhibition der TGF-β-induzierten Luciferase-Reportergenexpression durch TAB1, dem das C-Ende fehlt (TAB1 (1–418)), zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Das TAB1-Protein, das durch DNA gemäß der Erfindung codiert wird, besitzt die Eigenschaft der Aktivierung von TAK1 durch Bindung von TAK1 in dem Signal-Transduktionsweg des transformierenden Wachstumsfaktors-β (TGF-β). Diese und andere Eigenschaften werden ausführlich in den Beispielen 2 bis 4 und 6 bis 10 beschrieben.
Das TAB1-Protein, das durch DNA der Erfindung codiert wird, besitzt die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5), die von der Nukleotidsequenz von cDNA, die durch das Verfahren, das in den Beispielen 1 und 5 beschrieben wird, geklont wurde, abstammt. Es ist jedoch gut bekannt, daß Proteine mit biologischer Aktivität existieren, deren Aminosäuresequenzen durch eine Substitution, Deletion und/oder Addition von ein oder mehreren Aminosäuren modifiziert wurden und die eine biologische Eigenschaft des wilden Proteins behalten. So umfaßt die vorliegende Erfindung DNA, die Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine Substitution, Deletion und/oder Addition von ein oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, modifiziert wurde, und die eine biologische Eigenschaft von TAB1-Protein aufweisen, codiert.
Eine Ausführungsart davon ist ein Protein, worin die 52. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, Arginin ist.
Es ist auch bekannt, daß wenn DNA, die ein spezifisches Protein codiert, einmal geklont wurde, die DNA als eine Sonde verwendet werden kann für das Screenen einer DNA-Bibliothek von Organen oder Gewebe, die sich von den Organen oder Gewebe, von dem das Protein erhalten wurde, unterscheiden oder einer DNA-Bibliothek von anderen Arten, um DNA zu erhalten, die ein Protein, das eine ähnliche biologische Eigenschaft, wenn auch eine verschiedene Aminosäuresequenz aufweist, codiert. So umfaßt die vorliegende Erfindung auch Proteine, die durch DNA codiert werden, die mit DNA mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, unter Hybridisierungsbedingungen von 60°C, 0,1 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat hybridisieren kann und die eine biologische Eigenschaft von TAB1-Protein aufweisen.
Ein Beispiel eines modifizierten Proteins, das durch DNA gemäß der Erfindung codiert wird, ist ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die aus Aminosäuren von den Aminosäure-Positionen 21 bis 504 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, besteht. Dieses Protein besitzt die biologische Eigenschaft von TAB1-Protein. Ein Beispiel für ein modifiziertes Polypeptid gemäß der Erfindung ist ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die aus den 68 Aminosäuren von den Aminosäurepositionen 437 bis 504 der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, besteht.
Dieses Polypeptid besitzt die Eigenschaften der Aktivierung der TAK1-Kinaseaktivität bei der Bindung an TAK1.
Ein anderes Beispiel eines modifizierten Proteins, das durch DNA gemäß der Erfindung codiert wird, ist ein zwischen dem zuvor erwähnten Protein oder Polypeptid und einem anderen Protein fusioniertes Protein, das eine biologische Aktivität von TAB1 aufweist.
Proteine oder Polypeptide, die durch DNA der Erfindung codiert werden, können die tatsächliche physiologische Funktion von TGF-β durch zum Beispiel Aktivierung von TAK1, das wichtig für den TGF-β-Signal-Transduktionsweg ist, imitieren, wie auch die Bindung zwischen TAK1 und TAB1 durch ihre Bindung an TAK1 inhibieren und sie sind daher nützlich für Verfahren des Screenens auf Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten für Zellwachstumssuppression, Immunsuppression und Knochendifferenzierung wirken.
DNA, die ein Protein der Erfindung codiert, ist zum Beispiel DNA, die die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt, codiert. Eine solche DNA kann zum Beispiel durch das Verfahren, das in Beispielen 1 und 5 beschrieben wird, erhalten werden und sie weist die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, auf. Die DNA, die die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, codiert, weist jedoch nicht notwendigerweise die Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, auf, da sie auch aus anderen Codons, die die gleichen Aminosäuren codieren, bestehen kann. Zum Beispiel kann die vom Menschen stammende Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, geändert werden, um ein Codon mit einzuschließen, das effizient in solchen Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefe translatiert wird, und dieses kann unter Verwendung einer gutbekannten Technik wie einer ortsspezifischen Mutagenese mit einem Primer erreicht werden.
DNA gemäß der Erfindung, die ein Protein oder Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine Substitution, Deletion und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, modifiziert wurde, codiert, kann durch ein gut bekanntes Verfahren wie eine ortsspezifische Mutagenese oder die PCR unter Verwendung der DNA mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, als der Matrize hergestellt werden. Alternativ kann man die DNA, die ein Protein oder Polypeptid, bei dem die modifizierte Aminosäuresequenz kürzer ist als bei dem natürlichen Protein, codiert, zum Beispiel durch Einführung eines Tranlations-Startcodons und/oder Translations-Stoppcodons in natürlich auftretender DNA wie cDNA erhalten. Die Einführung dieser Codons kann durch ortsspezifische Mutagenese oder die PCR erreicht werden. Alternativ kann sie durch Spaltung der natürlichen DNA wie cDNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym und Zugabe des gewünschten Oligonukleotids, wenn notwendig, erreicht werden.
Man kann DNA erhalten, die mit DNA mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 der Erfindung gezeigt wird, hybridisiert werden kann, und die ein Protein mit einer biologischen Eigenschaft von TAB1 codiert, indem man eine DNA-Genombibliothek oder cDNA-Bibliothek, die zum Beispiel aus den verschiedenen Geweben und Organen, die in Beispiel 6 erwähnt werden, einschließlich dem Herz, Gehirn, der Plazenta, Leber, der Skelettmuskulatur, der Niere, dem Pankreas, der Milz, dem Thymus, der Prostata, den Hoden, den Ovarien, dem Dünndarm, dem Kolon, den peripheren Leukozyten etc. hergestellt wird, unter Verwendung der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 der Erfindung gezeigt wird, oder eines Teils davon als der Sonde screent. Die DNA-Bibliothek ist nicht auf eine vom Menschen stammende beschränkt und kann von anderen Tieren wie Ratten, Mäusen, Kaninchen, Ziegen, Schafen, Kühen oder Schweinen stammen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Expressionsvektor, der die zuvor erwähnte DNA umfaßt, und einen Wirt, der damit transformiert wird. Der Expressionsvektor unterscheidet sich abhängig von dem Wirt. Die verwendeten Wirtszellen gemäß der Erfindung können von irgendwelchen Prokaryoten- oder Eukaryotenorganismen stammen. Die verwendeten Prokaryotenorganismen können Bakterien sein, zum Beispiel Mikroorganismen, die zu der Gattung Escherichia gehören wie Escherichia coli, Mikroorganismen, die zu der Gattung Bacillus gehören, wie Bacillus subtilis etc. und die Eukaryotenorganismen könne niedere eukaryotische Organismen wie fädige Pilze und Hefe sein.
Fädige Pilze beinhalten Mikroorganismen, die zu der Gattung Aspergillus gehören wie Aspergillus niger und Aspergillus orizae und Mikroorganismen, die zu der Gattung Penicillium gehören, während die Hefe Mikroorganismen sein können, die zu der Gattung Saccharomyces gehören wie Saccharomyces cerevisiae.
Höhere eukaryotische Organismen, die verwendet werden können, beinhalten verschiedene Tier- und Pflanzenzellen, zum Beispiel sich unbegrenzt vermehrende kultivierte Tierzellen wie COS-Zellen, CHO-Zellen und NIH3T3 etc. Insektenzellen wie Sf9, Sf12 etc. können auch verwendet werden.
Der Expressionsvektor der Erfindung beinhaltet zusätzlich zu der DNA, die ein Protein oder Polypeptid der Erfindung codiert, Expression regulierende Sequenzen wie Promotoren, die in dem Wirt funktionsfähig sind.
Promotoren für Bakterien, z. B. E. coli beinhalten T3 und T7, während Promotoren für Hefe glykolytische Enzymgenpromotoren wie GAL1-Promotor und GAL4-Promotor mit einschließen. Der Promotor für Tierzellen kann ein viraler Promotor wie CMV-Promotor oder SV40-Promotor sein.
Die Transformation des Wirtes durch einen Expressionsvektor, die Kultivierung des Wirtes und die Sammlung und Reinigung des Proteins oder Polypeptids der Erfindung aus der Kultur kann gemäß konventionellen Verfahren erreicht werden. Die Isolierung und Reinigung des Proteins oder Polypeptids aus der Kultur kann zum Beispiel unter Verwendung jeden konventionellen Mittels zur Isolierung und Reinigung von Proteinen und Polypeptiden wie Ammoniumsulfatpräzipitation Gelfiltration oder Umkehrphasen-HPLC, entweder allein oder in Kombinationen erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Screeningverfahren für TGF-β-Signal-Transduktionsweginhibitoren. Eine Probe, die TGF-β-Signaltransduktionsweginhibitoren enthält, wir mit Zellen, die ein Protein mit einer biologischen Aktivität TAB1 und TAK1 exprimieren, in Kontakt gebracht oder in diese eingeführt (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (19985)) und die TAK1-Aktivität wird dann gemessen. Das Protein oder Polypeptid mit biologischer Aktivität von TAB1 und TAK1 kann auch mit einem anderen Protein fusioniert werden und die Zellen, die sie exprimieren, können Hefezellen oder Säugetierzellen sein. Diese Screeningsystem kann gemäß dem Verfahren, das in den Beispielen 1, 2, 3, 4, 7, 8 und 9 beschrieben wird, erstellt sein.
Die Probe, die TGF-β-Signal-Transduktionsweginhibitoren enthält, wird mit dem erstellten Screeningsystem in Kontakt gebracht oder in es eingeführt und die TAK1-Kinaseaktivität wird gemessen. Das Verfahren zur Messung der TAK1-Kinaseaktivität kann die Messung der Kinaseaktivität von TAK1 selbst oder die Messung der Kinaseaktivität von MAPKK oder MAPK, die sich flußabwärts von TAK1 in dem Signal- Transduktionsweg befinden und durch TAK1 aktiviert werden, sein. Es kann auch die Aktivität eines Zielgens in dem MAPK-Weg oder eines Reportergens unter der Kontrolle des Zielgenpromotors, basierend auf der Menge mRNA oder der exprimierten Form des Genes gemessen werden.
Das Screeningverfahren für TGF-β-Transduktionsweginhibitoren gemäß der Erfindung erlaubt das Screening auf Substanzen, die die Bindung zwischen TAB1 und TAK1 inhibieren, und kann damit als ein Mittel der Therapie für Erkrankungen, die abnorme Produktion von TGF-β beinhalten, dienen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher durch die folgenden Beispiele erklärt werden.
BEISPIEL 1
Es wurde eine Analyse des TAK1-abhängigen Weges, der für die TGF-β-Signaltransduktion fungiert, unter Verwendung eines Hefe-2-Hybridsystems durchgeführt (S. Frelds et al., Trend Genet. 10, 286 (1994)) und es wurde ein Protein mit direkter Wechselwirkung mit TAK1 gesucht.
Zuerst wurde ein Expressionsvektor durch Kopplung des TAK1-Gens und eines Gens, das die pLexA-DNA-Bindungsdomäne codiert, erstellt. pLexA-TAK1Δ enthält die TAK1ΔN-Codierungssequenz (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)), inseriert im Raster in pBTM116 (A. B. Vojtek et al., Cell, Bd. 74, S. 205 (1993)). Es wurde ein Hefe-2-Hybridsystem verwendet, um ein Protein, das in einer menschlichen Gehirn-cDNA-Bibliothek codiert ist und mit TAK1ΔN interagiert, zu identifizieren.
Die zwei Hybride wurden in Saccharomyces cerevisiae L40 (LYS2:LexA-HIS3), die ein integratives Reporterkonstrukt mit einer Bindungsstelle für LexA-Protein, das stromaufwärts von der Hefe HIS3-Codierungsregion lokalisiert ist, enthalten, exprimiert. Die Wechselwirkung zwischen den zwei Hybridproteinen bewirkt Transaktivierung des Reporterkonstrukts, was das Wachstum der Hefe in der Abwesenheit von Histidin (SC-His) erlaubt.
Das LexA-TAK1ΔN-fusionierte Protein allein verleiht Expression von HIS3 in einer ausreichenden Menge, um Wachstum zu erlauben, ohne daß exogenes Histidin erforderlich ist. Histidinauxotrophie kann jedoch durch Züchten der Zellen in der Gegenwart von 40 mM 3-Aminotriazol (3-AT), das ein chemischer Inhibitor der HIS3-Genprodukt-Imidazolglycerol-Dehydrogenase ist, erreicht werden (G. M. Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. Bd. 57, S. 627 (1988)).
Hefe wurde unter Verwendung eines Köderplasmids (bait plasmid) zusammen mit einem Fischplasmid, das das menschliche Gehirn-cDNA-Expressionsbiliotheks-Klon gekoppelt an das Gen, das die GAL4-aktivierende Domäne (GAD) codiert, enthält, transformiert. Man erhielt ein positives Klon von TAB1-cDNA, das Protein codierend, von ungefähr 1 × 10⁶ Transformanten. Das durch diese isolierte DNA exprimierte GAD-fusionierte Protein wird hier im folgenden als GAD-TAB1 bezeichnet.
BEISPIEL 2
Eine Reihe von LexA-TAK1-Deletionschimären wurde durch das 2-Hybridverfahren getestet, um den Ort in TAK1 zu bestimmen, der verantwortlich für die Wechselwirkung mit TAB1 ist. Es wurde ein Expressionsvektor, der das vollständige TAK1 oder ein Deletionskonstrukt davon codiert, fusioniert an die LexA-DNA-Bindungsdomäne für die simultane Transformation des Hefereporterstammes L40 zusammen mit pGAD-TAB1 verwendet. Die DNA, die jede der TAK1-Deletionskonstrukte codiert, wurde aus DNA, die das vollständige TAK1 codiert, hergestellt.
Das zuvor erwähnte Plasmid pGAD-TAB1 erhielt man durch Klonen von TAB1-cDNA an dem EcoRI-Ort von pBS (W. O. Bullock et al., Biotechniques, Bd. 5, S. 376 (1987)). Die Wechselwirkung zwischen den durch dieses Plasmid exprimierten fusionierten Proteinen wird durch die Fähigkeit des Hefestammes auf einer Platte von SC-HIS-Medium, das 40 mM 3-AT enthält, zu wachsen, angezeigt. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Die rechte Seite dieses Graphen zeigt an, ob TAK1 oder seine Deletionsform mit TAB1 in Wechselwirkung trat (+) oder nicht (–). Diese Ergebnisse zeigen, daß TAB1 mit der N-terminalen Domäne von TAK1 in Wechselwirkung tritt.
BEISPIEL 3
Ein Protein, das mit TAK1 eine Wechselwirkung eingeht, kann sowohl die Kontrollregion stromaufwärts wie auch das Ziel stromabwärts enthalten. Wenn TAB1 eine Rolle bei der Aktivierung von TAK1 spielt, würde dann erwartet werden, daß ihre simultane Expression die Aktivität von TAK1 in Hefe beeinflußt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein System für die Untersuchung der Säugetier-MAPKKK-Aktivität in einem Hefepheromon-induzierten MAPK-Weg offenbart (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995); K. Irie et al., Science, Bd. 265, S. 1716 (1994)). Eine aktivierte Form von TAK1 (TAK1ΔN) kann SteI1-MAPKKK-Aktivität substituieren.
Konkret besteht der Pheromon-aktivierte MAPK-Weg aus Stel1-, Ste7- und Fus3- oder Kss1-Kinasen, die zu MAPKKK, MAPKK bzw. MAPK korrespondieren. Diese Hefeproteinkinasen wirken sequenziell, um Signale zu dem Transkriptionsfaktor Stel2 zu transduzieren, woraufhin Stel2 wiederum die Transkription von paarungsspezifischen Genen wie FUS1 aktiviert (I. Herskowitz, Cell, Bd. 80, S. 187 (1995); D. E. Levin et al., Curr. Opin. Cell Biol., Bd. 7, S. 197 (1995); J. Schultz et al., Jr. Curr. Opin. Gene Dev., Nr. 5, S. 31 (1995)).
Das FUS1p::HIS3-Reportergen umfaßt die FUS1-stromaufwärtsaktivierende Sequenz, gekoppelt an das HIS3 offene Leseraster und die Signalaktivität dieses his3ΔFUS1p::HIS3-Stammes kann durch die Fähigkeit der Zellen auf SC-His-Medium zu wachsen überwacht werden (His^–-Phenotyp).
Stamm his3Δste11ΔFUS1p::HIS3STE7^P368 (Prolin-Substitution an Serin-368) besitzt einen His-Phenotyp (K. Irie et al., Science, Bd. 265, S. 1716 (1994)).
Expression von TAK1ΔN in diesem Stamm verleiht einen His⁺-Phenotyp (K. Yamagucchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)). So kann die aktivierte Form von TAK1 Ste11-Aktivität auf eine Ste7^P368-abhängige Weise substituieren. Die Expression von TAK1 in vollständiger Länge komplementiert jedoch nicht die ste11Δ-Mutation, was darauf hindeutet, daß die Hefe nicht den mutmaßlichen aktivierenden Faktor für TAK1 aufweist (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)).
Die GAD-TAB1-Konstrukte wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die ste11Δ-Mutation in der Gegenwart von TAK1 unter Verwendung des Hefe MAPK-Weges zu komplementieren. Konkret wurde Hefestamm SY1984-P (his3Δste11ΔFUS1p::HIS3STE7^P368) mit pNV11-HU11 (TAK1ΔN) + pGAD10 (GAD) (Clontech), pNV11-HU11F (TAK1) + pGAD10, pNV11-HU11F + pGAD-TAB1 oder pNV11 + pGAD-TAB transformiert und die Transformanten wurden auf eine SC-His-Platte gefaltet und bei 30°C inkubiert.
Der zuvor erwähnte Stamm SY1984-P ist SY1984 (his3Δste11FUS1p::HIS3), transformiert durch Plasmid pNC318-p368, das STE7^P368 enthält, unter der Kontrolle von CYC1-Promotor (K. Irie et al., Science, Bd. 265, S. 1716 (1994)). Die zuvor erwähnten Plasmide pNV11-HU11 bzw. pNV11-HU11F exprimieren das verkürzte TAK1ΔAN (Aminosäuren 21–579) und das TAK1 in voller Länge unter der Kontrolle von TDH3-Promotor (K. Yamaguchi et al, Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)).
Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Das linke Feld zeigt an, ob der getestete Hefestamm TAK1ΔAN oder TAK1 exprimierte und ob GAD-TAB1 simultan exprimiert wurde oder nicht. Das rechte Feld zeigt das Wachstum der Zellen auf der SC-His-Platte. Jeder der Flecke stellt die Ergebnisse für eine unabhängige Transformante dar.
Die GAD-TAB1 und TAK1 simultane Transformante stellte den Effekt der SteI1-Deletion wieder her. Das zeigt an, daß TAB1 die Funktion von TAK1 verstärkt.
BEISPIEL 4
Um zu bestimmen, ob TAK1-Aktivität in TAB1-exprimierender Hefe verstärkt wird, wurde ein Expressions-DNA-Vektor, der TAK1, das das von Hämagglutin (HA)-abstammende C-terminale Epitop und eine katalytisch inaktive TAK1-Mutante [TAK1-K63W, worin Lysin an Position 63 der ATP-Bindungsstelle durch Tryptophan ersetzt ist (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)], trägt, enthält, verwendet, um Hefezellen in der Abwesenheit und in der Gegenwart des TAB1-Gens zu transformieren.
Die DNA-Sequenz, die ein Epitop, das durch den HA-spezifischen monoklonalen Antikörper 12CA5 erkannt wird, codiert, wurde im Raster mit der TAK1-codierenden Sequenz und dem TAK1-K63W-C-Ende durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) verbunden. Alle Konstrukte wurden durch TDH-Promotor exprimiert. Das TAB1-Expressionsplasmid pGAP-HTH9M exprimiert 68 C-terminale Aminosäuren. YEpGAP112 ist ein Multicopy-Plasmid TRP1, das TDH3-Promotor enthält [H. Banno et al., Mol. Cell Bio. 13, 475 (1993)].
Eine Sequenz, die die 68 C-terminalen Aminosäuren von TAB1 codiert, wurde durch die PCR unter Verwendung des 5'-Primers: 5'-GAGAATTCATGCGGCAAAGC-3' (SEQ ID NO: 2), der den EcoRI-Ort und das ATG-Codon enthält und den 3'-Primer: 5'-GGGTCGACTACGGTGC-3' (SEQ ID NO: 3), der den SalI-Ort enthält, amplifiziert. Ein 240 bp EcoRI-SalI-Fragment, hergestellt durch PCR, wurde in die EcoRI-SalI-Lücke von YEpGAP112 eingeführt, um pGAD-HTH9M zu konstruieren.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Wie oben beschrieben, wurde Hefestamm SY1984 mit dem zuvor erwähnten Plasmid, das TAK1-HA codiert und Plasmid, das TAK1-K63W codiert, transformiert und der leere Vektor YEpGAP112(–) oder pGAP-HTH9M(+), der TAB1 codiert, wurde zusätzlich in die Transformante eingeführt. TAK1-HA(–) oder TAK1-K63W-HA(KN) wurde aus jedem der Zellextrakte immumpräzipitiert und die Immunpräzipitate wurden In-vitro-Kinaseassays unterworfen. Konkret ließ man 60 ml einer Hefezellkultur bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm wachsen und ein Zellextrakt wurde mit einer cytolytischen Pufferlösung hergestellt (K. Irie et al., Science, Bd. 265, S. 1716 (1994)) und dann durch Zentrifugation bei 100 000 g für 30 Minuten getrennt.
Der Überstand wurde einer Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen HA unterworfen. Das bedeutet ein Teil (300 μl) des Überstandes wurde mit 2 μl Antikörper und 90 μl Protein-A-Sepharose gemischt und der Immunkomplex wurde dreimal mit einer cytolytischen Pufferlösung gewaschen und für das Kinase-Assay verwendet (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)). Die Immunoblotanalyse von jedem Immunpräzipitat mit dem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper 12CA5 zeigte, daß annähernd die gleiche Menge TAK1-HA oder TAK1-K63W-HA in jeder Probe zurückgewonnen wurde. Das legt nahe, daß die Expression von TAB1 nicht die Menge der TAK1-Expression beeinflußt.
Das immumpräziptierte TAK1 wurde, basierend auf der Fähigkeit rekombinantes XMEK2 (SEK1) zu aktivieren, einem Assay unterworfen, wobei die rekombinante XMEK2 (SEK1)-Aktivität, basierend auf ihrer Fähigkeit, katalytisch inaktives (KN)p38(MPK2) zu phosphorylieren, einem Assay unterworfen wurde (K. Yamaguchi et al., Science, Nr. 270, S. 2008 (1995)). Nach der Elektrophorese wurde die Phosphorylierung von KN-p38 (MPK2) durch Autoradiographie nachgewiesen. Kein Extrakt zeigte einen Kinaseassay-Wert ohne das Enzymextrakt. Dieses Niveau korrespondierte zu der XMEK2-Basalaktivität. Das Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt und ergab jedesmal die gleichen Ergebnisse.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt. Die Ergebnisse des Kinase-Assays für TAK1-HA und TAK1-K36W-TAK1 zeigen an, daß TAB1 die TAK1-Kinaseaktivität erhöht. Die Aktivitätserhöhung wurde nicht für Immunkomplexe aus Zellen, die TAK1-K63WKN und TAB1 exprimieren, beobachtet, was anzeigt, daß die beobachtete Kinaseaktivität TAK1 zuzuschreiben war. Diese Ergebnisse zeigen, daß TAB1 TAK1-Kinaseaktivität durch direkte Bindung an die katalytische Domäne von TAK1 aktiviert.
BEISPIEL 5
Um die vollständige Codierungssequenz für TAB1 zu erhalten, wurde eine menschliche Nierenbibliothek unter Verwendung der zuvor erwähnten partiellen Sequenz von TAB1-cDNA, die man aus dem Hefe-2-Hybridsystem erhält, als Sonde gescreent. Zwei unabhängige Klone trugen 3,1 kb cDNA, die ein einzelnes offenes Leseraster (ORF), beginnend an dem initialen Methionin-Codon, übereinstimmend mit dem Kozak-Consensus, enthält. Das 5'-Ende wurde durch das 5'-RACE-Verfahren unter Verwendung von 5'-RACE-Ready-cDNA (Clontech) identifiziert.
Die vorgeschlagene N-terminale Nukleotidsequenz der codierenden Sequenz (CCAAATGG) korrespondiert zu dem Kozak-Consensus (M. Kozak, J. Cell Biol., Bd. 108, S. 229 (1989)) und das ATG-Codon liegt nicht vor ihr vor.
Die TAB1 Nukleotidsequenz wurde durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchverfahren bestimmt. Eine Aminosäuresequenz wurde von der Nukleotidsequenz der vollständigen TAB1-cDNA abgeleitet. Als ein Ergebnis erhielt man zwei verschiedene Klone mit Cytosin bzw. Adenin als dem 185. Nukleotid. Das Klon mit Cytosin als dem 185. Nukleotid codiert Serin als die 52. Aminosäure und das Klon mit Adenin als dem 185. Nukleotid codiert Arginin als die 52. Aminosäure.
Die Nukleotidsequenz des Clons mit Cytosin als dem 185. Nukleotid wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt und seine Aminosäuresequenz wird in 4 und SEQ ID NO: 5 gezeigt. Die Nukleotidsequenz des Klons mit Adenin als dem 185. Nukleotid wird in SEQ ID NO: 4 gezeigt und seine Aminosäuresequenz wird auch in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Die cDNA des Klons mit Cytosin als dem 185. Nukleotid wurde an den EcoRI- und SmaI-Orten von pBS subkloniert, um Plasmid TABI-f-4 herzustellen, während die cDNA des Klons mit Adenin als dem 185. Nukleotid an dem EcoRI-Ort von pBS subkloniert wurde, um Plasmid pBS-TAB1 herzustellen. E. coli, das Plasmid pBS-TAB1 enthielt, wurde Escherichia coli HB101 (pBS-TAB1) genannt und wurde an dem National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology am 19. April 1996 als FERM BP-5508 hinterlegt. E. coli, das Plasmid TABI-f-4 enthielt, wurde Escherichia coli DH5α (TABI-f-4) genannt, und wurde an dem National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology am 19. Juli 1996 als FERM BP-5599 hinterlegt.
Das folgende Experiment wurde unter Verwendung des Klons mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt wird, durchgeführt.
In 4 A = Ala, C = Cys, D = Asp, E = Glu, F = Phe, G = Gly, H = His, I = Ile, K = Lys, L = Leu, M = Met, N = Asn, P = Pro, Q = Gln, R = Arg, S = Ser, T = Thr, V = Val, W = Trp und Y = Tyr. Die 68 C-terminalen Aminosäuren von GAD-TAB1, die unter Verwendung des Hefe-Hybridsystems isoliert wurden, sind umrahmt.
Die N-terminale Sequenz von TAK1 wird vergleichend angeordnet, um die Region mit Ähnlichkeit zu dem gleichen Segment von TAK1 zu zeigen. Die identischen und konservierten Aminosäuren werden im Hinblick auf diejenigen von TAK1 mit Sternchen bzw. Punkten markiert.
Das ORF legte ein Protein von 504 Aminosäuren mit einer Molekulargröße von 55 kDa ohne klare Ähnlichkeit zu irgendeinem bekannten Protein und ohne irgendein Zeichen, das biologische Funktion anzeigte, nahe.
BEISPIEL 6
Die Expressionsmuster von TAB1 mRNA wurden bei verschiedenen menschlichen Zellen durch Northern Blotting analysiert. Menschliche Gewebeblots (Clontech) von mRNA, die aus 16 Geweben isoliert wurde, wurden mit ³²P-markierter TAB1-cDNA sondiert und Autoradiographie unterworfen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt. Jede der Bahnen enthielt 2 μg mRNA. Die Sonde wurde unter Verwendung eines Multiprime-Labeling-Kits (Amersham) mit [α-³²P]-dCTP markiert und wie durch H. Shibuya et al., Nature, Bd. 357, S. 700 (1992) beschrieben, hybridisiert. Ein Haupttranskriptionsprodukt von ungefähr 3,5 kb wurde in allen getesteten Geweben nachgewiesen.
BEISPIEL 7
Um die Assoziierung von TAB1 und TAK1 in Säugetierzellen zu bestätigen, wurde ein Expressionsvektor, der HA-Epitop-markiertes TAK1 (HA-TAK1) (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)) herstellte, und ein Expressionsvektor, der Myc-Epitop-markiertes TAB1 (Myc-TAB1) herstellte, für die vorübergehende Transfektion von MC3T3-E1-Mäuseosteoblasten verwendet (S. Ohta et al., FEBS Lett, Bd. 314, S. 356 (1992)). Das letztere Plasmid wurde auf die folgende Weise erhalten.
Die vollständige TAB1-cDNA wurde in pCS2MT-Vektor, der 6 Kopien des Myc-Epitops (LEQK-LISEEDLN) (Einbuchstaben-Aminosäurebenennung), erkannt durch den Myc-spezifischen monoklonalen Antikörper 9E10, enthielt, subkloniert (D. L. Tumer et al., Genes Dev., Bd. 8, S. 1434 (1994)). Bei dem so erhaltenen Plasmid, pCS2MT·TAB1, ist die Myc-Epitopmarkierung im Raster mit der DNA-Sequenz verbunden, die mit dem N-Ende von TAB1 korrespondiert. pCSA2MT-TAB1 wurde mit BamHI und XbaI verdaut. Das Fragment wurde isoliert und an dem EcoRI-XbaI-Ort des Säugetierexpressionsvektors pEF eingefügt. Dieses Plasmid ruft die Expression von TAB1 von dem menschlichen Elongationsfaktor 1α (EF1α)-Promotor hervor.
Das Zellextrakt wurde mit dem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper 12CA5 (Bahn 2 in 6), dem Myc-spezifischen monoklonalen Antikörper 9E10 (Bahn 3 in 6) oder einem nicht-immunen Kontroll-IgG (Bahn 4 in 6) einer Immunpräzipitation unterworfen. Der Immunkomplex wurde gewaschen und durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulose für Immunoblotting unter Verwendung des Myc-spezifischen Antikörpers (obere Bahnen von 6) und HA-spezifischen Antikörper (untere Bahnen von 6) übertragen.
Die Zellextrakte wurden dann sofort einer Immunoblotanalyse unterworfen (Bahn 1 von 6). Wie 6 zeigt, wurde eine beträchtliche Menge Myc-TAB1 bei jeder Immunpräzipitation nachgewiesen, was anzeigt, das TAK1 mit TAB1 immunpräzipitiert werden kann. Eine reziprokes Experiment, das das immunpräzipitierte Protein mit dem HA-spezifischen Antikörper blottete, bestätigte die Assoziierung von TAB1 und TAK1. Diese Experimente zeigen an, daß sich TAB1 mit TAK1 in Säugetierzellen wie in Hefe assoziieren kann.
BEISPIEL 8
Es wurde untersucht, ob Überexpression von TAB1 TAK1-Kinaseaktivität aktivieren kann. MC3T3-E1-Zellen wurden vorübergehend mit HA-TAK1 in der Gegenwart von (+)- und in der Abwesenheit von (–)-Myc-TAB1 transfiziert. Die Zellen wurden mit 20 ng/ml TGF-β1 für 10 Minuten behandelt (+) oder nicht behandelt (–) und dann wurde HA-TAK1 auf die Weise wie in Beispiel 3 beschrieben immunpräzipitiert, wonach die Kinaseaktivität analysiert wurde. Konkret wurde ein Teil des Immunpräzipitats mit HA-spezifischem Antikörper immungeblottet. Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt.
Die Aktivität wird als vielfache Zunahme relativ zu der Menge von HA-TAK1 von unstimulierten Zellen angegeben und wird als Mittel ±SEM aus mindestens 3 Experimenten ausgedrückt (oberer Graph in 7). HA-TAK1 phosphorylierte nicht direkt KH-p38(MPK2) (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)). Das mittlere Feld ist das Autoradiogramm, das die Phosphorylierung von KH-p38(MPK2) zeigt. Das untere Feld zeigt Immunoblotanalyse von jedem der Immunpräzipitate mit dem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper 12CA5, wo gesehen wird, daß ungefähr die gleiche Menge von TAK-HA in jeder Probe zurückgewonnen wurde. Die in der Mitte gezeigten Daten und die unteren Felder stammen von typischen Experimenten.
Das In-vitro-Assay der TAK1-Immunpräzipitation legt nahe, daß TAK1-Aktivität in Zellen, die mit TAB1 transfiziert waren, sogar in der Abwesenheit von TGF-β stimuliert wurde. Aktivierung von TAK1 durch Überexpression von TAB1 war vergleichbar mit der Aktivierung, die in Zellen beobachtet wurde, die mit TGF-β, das nur HA-TAK1 exprimierte, stimuliert worden waren.
BEISPIEL 9
TGF-β bewirkt eine schnelle Zunahme der Menge von mRNA, die den Plasminogen-aktivierenden Faktor-Inhibitor-1 (PAI-1) codiert (M. R. Keeton et al., J. Biol. Chem., Bd. 266, S. 23048 (1991)). Überexpression der aktivierten Form von TAK1 (TAK1ΔN) resultiert in einer konstitutiven Aktivierung eines Reportergens, das das Luciferasegen enthält, unter der Kontrolle des TGF-β-induzierbaren PAI-1-Gen-Promotors (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)). Wir untersuchten, ob Überexpression von TAB1 zur Aktivierung des Luciferase-Reportergens führt.
MvILu-Zellen wurden vorübergehend durch das Calciumphosphat-Verfahren (H. Shibuya et al., Nature, Bd. 357, S. 700 (1992)) unter Verwendung eines Reporterplasmids p800neoLUC (M. Abe et al., Analyt. Biochem., Bd. 216, S. 276 (1994)) und des TAB1-exprimierenden Plasmids pEF-TAB1 oder des TAK1-codierenden Expressionsplasmids (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)) transfiziert. Plasmid pEF-TAB1 enthält die vollständige TAB1-codierende Sequenz unter der Kontrolle von EF1α-Promotor und wurde durch Spaltung von pEF mit EcoRI und Insertion des EcoRI-Fragmentes von Plasmid TABI-f-4 aufgebaut.
Das Plasmid TABI-f-4 wurde durch Subklonierung von TAB1-cDNA an den EcoRI- und SmaI-Orten von pBS aufgebaut. Die Zellen wurden für 20 Stunden mit und ohne 30 ng/ml menschlichen TGF-β1 inkubiert, ein Extrakt wurde hergestellt und die Luciferase wurde bestimmt (H. Shibuya et al., Mol. Cell Biol., Bd. 14, S. 5812 (1994)). Die Luciferaseaktivität wurde basierend auf der Expression von β-Galactosidase kompensiert.
Konkret wurde die Transfektioneffizienz durch simultane Transfektion mit pXeX-β-Gal-Vektor (A. D. Johnson et al., Gene, Bd. 147, S. 223 (1994)) in allen Luciferasereporterexperimenten kompensiert. Die Messung von β-Galactosidase wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers (Clontech) unter Verwendung des Zelllysates, das für die Luciferasemessung hergestellt wurde, durchgeführt. Die Luciferaseaktivität wurde als die vielfache Zunahme in Bezug auf die Aktivität von unstimulierten Zellen, die mit dem Vektor transfiziert wurden, angegeben. Alle Transfektions- und Luciferasemessungen wurden mindestens 5-mal mit jedem Experiment in 3-facher Ausfertigung durchgeführt.
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt. Hier zeigt KN das katalytisch inaktive TAK1-K63W an. Die Daten werden als der Mittelwert ±SEM der Luciferaseaktivität von 3-fachen Ausfertigungen eines repräsentativen Experimentes ausgedrückt. Überexpression von sowohl TAK1 wie auch TAB1 induzierte Expression des Reportergens, sogar in der Abwesenheit von TGF-β, aber Überexpression von nur TAK1 oder TAB1 besaß praktisch keinen Effekt auf die konstitutive Menge der Luciferaseaktivität. Diese experimentellen Ergebnisse zeigen an, daß TAB1 die TAK1-Aktivität in Säugetierzellen verstärkt.
Obwohl die Überexpression der TAK1-K63W-Mutante die TGF-β-stimulierte Luciferaseaktivität inhibierte (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)), liegt dies vermutlich an der Sequestrierung von essentiellen Elementen auf dem Weg. Auf der anderen Seite reduziert die Überexpression von TAB1 den inhibierenden Effekt von TAK1-K63W, was die Möglichkeit nahelegt, daß TAB1 durch Überexpression von TAK1-K63W absorbiert wird.
BEISPIEL 10
Die 68 C-terminalen Aminosäuren von TAB1 [TAB1 (437–504)] reichten aus, um an TAK1 zu binden und es zu aktivieren, was nahelegt, daß die N-terminale Domäne von TAB1 eine regulatorische Rolle auf die Funktion von TAB1 ausübt. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde eine verkürzte Form von TAB1, der die C-terminale TAK1-Bindungsdomäne [TAB1 (1–418)] fehlte, aufgebaut. MvILu-Zellen wurden vorübergehend mit p800nedUC-Reporter und einem Expressionsvektor, der TAB1 (1–418) oder TAB1 (vollständig) in den Mengen, die in 9 gezeigt werden, codiert, transfiziert und diese wurden mit dem pEF-Kontrollvektor ergänzt.
Der Expressionsvektor, der TAB1 (1–418) codiert, wurde auf die folgende Weise aufgebaut. Das 1,3 kb EcoRI-HincII-Fragment von Plasmid TABI-f-4 (enthaltend die TAB1 N-terminale Region der Aminosäuren 1–418) wurde in pKT10-Vektor subkloniert, um pKT10-TAB1 (1–418) aufzubauen. pEF wurde mit EcoRI und SalI gespalten und das EcoRI-SalI-Fragment von pKS10-TAB1 (1–418) wurde darin eingefügt, um pEF-TAB1 (1–418) aufzubauen.
Als nächstes wurden die Zellen für 20 Stunden mit und ohne 30 ng/ml menschlichem TGF-β1 inkubiert und das Zelllysat wurde auf Luciferaseaktivität gemessen. Die Werte wurde als vielfache Induktion in Form von 1% in Bezug auf die Kontrollzellen, die mit pEF transfiziert wurden, ausgedrückt. Keine Induktion von Luciferase mit TGF-β (einfache Induktion) korrespondiert zu 0%. Die gesamte Transfektion und Luciferasemessungen wurden mindestens dreimal durchgeführt und eine Reihe von 3 von jedem der Experimente wurde durchgeführt. Die Daten werden ausgedrückt als der Mittelwert ±SEM der Luciferaseaktivitäten von dreifachen Ausführungen eines repräsentativen Experiments.
Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt. Die Überexpression von TAB1 (1–418) in MvILu-Zellen unterdrückte die Aktivität des Reportergens, die durch TGF-β-Stimulation induziert wurde. So wirkt TAB1 (1–418) als der dominante negative Inhibitor auf die durch TGF-β induzierte Genexpression. Diese Ergebnisse zeigen an, daß TAB1 eine Rolle bei der TGF-β-Signalgebung spielt.
Man glaubt, daß der Mechanismus der Induktion der TAK1-Aktivierung durch TAK1 so ist, daß TAB1-Bindung an TAK1 die für die Aktivierung notwendigen Konformationsänderungen induziert. Da die Entfernung der 20 N-terminalen Aminosäuren von TAK1 eine konstitutive Aktivierung der Proteinkinase hervorruft, legt dies nahe, daß die N-terminale Domäne die katalytische Domäne hindert, wodurch Kinaseaktivität inhibiert wird (K. Yamaguchi et al., Science, Bd. 270, S. 2008 (1995)). TAB1 kann die negative Kontrolldomäne von TAK1 von seiner katalytischen Domäne eliminieren. Das C-Ende von TAB1, das als die TAK1-Bindungsstelle fungiert, enthält eine Serin- und Threonin-reiche Region, die ähnlich der Region ist, die an dem N-Ende von TAK1 gefunden wird. Daher ist TAB1 vermutlich ein wichtiges Signalgebungs-Zwischenprodukt zwischen TGF-β und TAK1 MAPKKK.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die TAB1 Protein mit der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz kodiert.
Isolierte DNA, die TAB1 Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Substitution, Deletion und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz modifiziert ist, und sich an TAK1 bindet.
Isolierte DNA, die TAB1 Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Substitution, Deletion und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz modifiziert ist, und sich an TAK1 bindet und es aktiviert.
DNA, die mit DNA mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen von 60°C, 0,1 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat hybridisieren kann und ein Protein kodiert, das sich an TAK1 bindet.
DNA, die mit DNA mit der in SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen von 60°C, 0,1 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat hybridisieren kann und ein Protein kodiert, das sich an TAK1 bindet und es aktiviert.
Isolierte DNA, die ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz hat, die aus den Aminosäuren der Aminosäurepositionen 21 bis 504 der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Isolierte DNA, die ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz hat, die aus den 68 Aminosäuren der Aminosäurepositionen 437 bis 504 der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Isolierte DNA nach Anspruch 2 und 3, wobei die 52. Aminosäure in der in SEQ ID Nr. 5 dargestellten Aminosäuresequenz Arginin ist.
DNA, die ein Fusionsprotein kodiert, das ein Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids, umfassend die folgenden Schritte: Kultivieren eines Wirts, der durch einen Expressionsvektor transformiert ist, umfassend DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9, und Rückgewinnen des genannten Proteins oder Polypeptids von der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der genannte Wirt eine Säugetierzelle oder Hefezelle ist.
Verfahren zum Induzieren von Säugetierzellen zur Produktion eines Proteins oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend das Einführen von DNA, die das genannte Protein oder Polypeptid kodiert, in vitro in Säugetierzellen.
Verwendung von DNA, die das Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert, zur Herstellung eines Mittels zum Induzieren von Säugetierzellen zur Produktion des genannten Proteins oder Polypeptids.
Expressionsvektor, umfassend DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Wirtszelle, die durch einen Expressionsvektor nach Anspruch 14 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die genannte Wirtszelle eine Säugetierzelle oder Hefezelle ist.
Verfahren zum Screenen von TGF-β-Signalstoff-Stoffwechselweg-Inhibitoren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (A) Inkontaktbringen oder Einführen einer Probe, die TGF-β-Signalstoff-Stoffwechselweg-Inhibitoren enthält, mit oder in Zellen, die rekombinant ein durch DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiertes TAB1 Protein oder Polypeptid und TAK1 Protein exprimieren, und (B) Messen der Kinaseaktivität des TAK1 Proteins.