DE69433902T2

DE69433902T2 - Neuartige tyrosinkinase

Info

Publication number: DE69433902T2
Application number: DE69433902T
Authority: DE
Inventors: Seiji Fuji-shi SAKANO
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Kasei Chemicals Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Kasei Chemicals Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2014-08-26
Also published as: EP0732398B1; DE69433902D1; AU7508694A; ATE271125T1; CA2170384C; AU679556B2; WO1995006113A1; EP0732398A4; EP0732398A1; US5834208A; CA2170384A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Tyrosinkinase und eine Desoxyribonucleinsäure (DNA), die für dieselbe codiert. Insbesondere befasst sich die vorliegende Erfindung mit einer neuen cytoplasmatischen Tyrosinkinase, welche mit Bezug auf die Expressionsmenge derselben in Übereinstimmung mit der Differenzierung der Blutzellen ansteigt, und befasst sich auch mit einer DNA, die für dieselbe codiert. Die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden für das Screenen chemischer Substanzen, die die Fähigkeit haben, die Tyrosinkinase-Aktivität von wenigstens der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu regulieren. Deshalb ist die vorliegende Erfindung auch mit einem Verfahren zum Screenen von solchen chemischen Substanzen befasst. Die vorliegende Erfindung ist auch befasst mit einem replizierbaren rekombinanten DNA-Molekül, umfassend einen replizierbaren Expressionsvector und, funktional in den Vector insertiert, eine DNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert; einem Mikroorganismus oder einer Tierzelle, die mit dem replizierbaren rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind; und einem Antikörper, welcher spezifisch ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung, erkennt.
Erörterung verwandter Technik
Menschliches Blut enthält verschiedene Arten von Blutzellen, und jede von diesen spielt eine physiologisch wichtige Rolle. Beispielsweise transportieren Erythrocyten Sauerstoff in einem menschlichen Körper, blockieren Thrombocyten die Blutung, und bilden Leukocyten ein Immunsystem, um einen menschlichen Körper gegen Infektion zu schützen. Diese verschiedenen Arten von Blutzellen stammen aus hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark ab.
Jüngste Untersuchungen zeigen, dass sich hämatopoietische Stammzellen in verschiedene Arten von Blutzellen, Osteoclasten, Mastzellen und dergleichen differenzieren, wenn sie durch verschiedene hämatopoietische Stimulierungsfaktoren oder verschiedene Umweltfaktoren stimuliert werden. Jedoch ist der Mechanismus der Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen bis jetzt noch nicht vollständig aufgeklärt worden. Jüngste Untersuchungen zeigen auch, dass eine Tyrosinkinase stark an der Entwicklung und Differenzierung von Körpern von Tieren und Insekten beteiligt ist. Es wurde angenommen, dass eine Tyrosinkinase auch stark an der Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen beteiligt ist. Beispielsweise wurde berichtet, dass c-kit, welches eine Rezeptor-Tyrosinkinase ist, auf den Oberflächen von hämatopoietischen Stammzellen exprimiert wird, und als ein Rezeptor für einen hämatopoietischen Wachstumsfaktor und einen Mastzellen-Wachstumsfaktor fungiert (siehe Witte, Cell 63: 5, 1990). Diese Rezeptor-Tyrosinkinase steuert die Differenzierung von hämatopoietischen Stammzellen.
Tyrosinkinasen sind Enzyme, welche Tyrosinreste eines Proteins phosphorylieren, und die physiologisch aktiven Zentren derselben bestehen jeweils aus etwa 250 Aminosäureresten. Tyrosinkinasen haben jeweils eine Vielzahl von gut konservierten Aminosäuresequenzen (siehe Hanks et al., Science 241: 42, 1988). Ein Tyrosinkinase-Genfragment kann erhalten werden, indem eine DNA hergestellt wird, die der konservierten Aminosäuresequenz entspricht, und eine reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung der hergestellten DNA als einem Primer durchgeführt wird (siehe Wilks, Methods in Enzymology 200: 533, 1991).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass eine Tyroskinkinase eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Transkription und bei der Signalübertragung spielt, und dass eine Mutation des Gens, das für eine Tyrosinkinase codiert, oder eine virale Infektion, eine maligne Veränderung der Zellen verursachen kann.
Tyrosinkinasen werden in zwei Klassen eingeteilt, d. h. jene vom Rezeptortyp und jene vom cytoplasmatischen Typ. Eine cytoplasmatische Tyrosinkinase wurde im Vergleich zu einer Rezeptortyrosinkinase bis jetzt nicht aufgeklärt, so dass es stark erwünscht war, die Eigenschaften der cytoplasmatischen Tyrosinkinase klarzumachen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue cytoplasmatische Tyrosinkinase bereitzustellen, von welcher angenommen wird, dass sie die Differenzierung der Blutzellen steuert.
Der gegenwärtige Erfinder hat extensive und intensive Untersuchungen mit einem Blick auf die Entwicklung einer neuen cytoplasmatischen Tyrosinkinase gemacht. Insbesondere hat der gegenwärtige Erfinder eine Klonierung des Gens, das für eine Tyrosinkinase codiert, welche an der Differenzierung der menschlichen Megakaryoblasten-Leukämiezelllinie UT-7 beteiligt ist (siehe Komatsu et al., Cancer Res. 51: 341, 1991) (UT-7 ist erhältlich von Dr. Norio Komatsu, Dozent am Department of Hematology, Jichi Medical School, Japan) unter Verwendung des RT-PCR-Verfahrens ausgeführt. Als ein Ergebnis hat der gegenwärtige Erfinder unerwartet ein Genfragment einer neuen Tyrosinkinase gefunden, deren mRNA nahezu nicht in undifferenzierten UT-7 exprimiert wird, aber mit Bezug auf die Expressionsmenge derselben in Übereinstimmung mit der Differenzierung von UT-7 ansteigt. Der gegenwärtige Erfinder hat dieses Genfragment als eine Sonde verwendet, um eine cDNA zu erhalten, die für die gesamte Tyrosinkinase aus der cDNA-Bibliothek von UT-7 codiert, und die Nucleotidsequenz der erhaltenen cDNA bestimmt. Ferner hat der gegenwärtige Erfinder von der erhaltenen cDNA nicht-codierende DNA und RNA und Antikörper, die mit der Tyrosinkinase reagieren, hergestellt, Zellen mit der cDNA transformiert und ein Screening von chemischen Substanzen ausgeführt. So wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZLISTEN
In jeder der SEQ ID NOs. 1 bis 5 sind das linke Ende und das rechte Ende der Aminosäuresequenz der N-Terminus bzw. C-Terminus. In jeder der SEQ ID NOs. 6 bis 11 sind das linke Ende und das rechte Ende der Nucleotidsequenz das 5'-Ende bzw. 3'-Ende.
SEQ ID NO. 1 ist die Aminosäuresequenz einer SH3-Domäne (welche unten erklärt wird), welche der 7. bis 70. Aminosäure in SEQ ID NO. 4 und der 48. bis 111. Aminosäure in SEQ ID NO. 5 entspricht, wobei sowohl SEQ ID NO. 4 als auch 5 die Aminosäuresequenzen der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung sind.
SEQ ID NO. 2 ist die Aminosäuresequenz einer SH2-Domäne (welche unten erklärt wird), die der 81. bis 155. Aminosäure in SEQ ID NO. 4 und der 122. bis 196. Aminosäure in SEQ ID NO. 5 entspricht, wobei sowohl SEQ ID NO. 4 als auch 5 Aminosäuresequenzen der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung sind.
SEQ ID NO. 3 ist die Aminosäuresequenz einer Tyrosinkinase-Domäne (welche unten erklärt wird), welche der 192. bis 437. Aminosäure in SEQ ID NO. 4 und der 233. bis 478. Aminosäure in SEQ ID NO. 5 entspricht, wobei sowohl SEQ ID NO. 4 als auch 5 Aminosäuresequenzen der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung sind.
SEQ ID NO. 4 ist die Aminosäuresequenz von einem Bereich, welcher die gesamte SH3-Domäne, SH2-Domäne und Tyrosinkinase-Domäne enthält. Die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4 wird durch den Translationsbereich codiert, der mit dem Startcodon bei den Nucleotiden 331 bis 333 der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 beginnt.
SEQ ID NO. 5 ist die Aminosäuresequenz eines weiteren Bereichs, der die gesamte SH3-Domäne, SH2-Domäne und Tyrosinkinase-Domäne enthält. Die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 wird durch den Translationsbereich codiert, der mit dem Startcodon bei den Nucleotiden 208 bis 210 der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 beginnt, und die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4 enthält.
SEQ ID NOs. 6 bis 10 sind die jeweiligen Nucleotidsequenzen von Fragmenten der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 11. Die Nucleotidsequenzen SEQ ID NOs. 6 bis 10 sind Beispiele für Nucleotidsequenzen, die für die jeweiligen Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOs. 1 bis 5 codieren.
SEQ ID NO. 11 ist die vollständige Nucleotidsequenz der cDNA, die für die neue Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität bereitgestellt, umfassend eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5. Außerdem wird eine isolierte Desoxyribonucleinsäure bereitgestellt, die für das Polypeptid codiert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein replizierbares rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, umfassend einen replizierbaren Expressionsvector und, funktional in den Vector insertiert, eine Desoxyribonucleinsäure, die für ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 und SEQ ID NO. 5 umfasst. Außerdem wird ein Mikroorganismus oder Tierzellen bereitgestellt, die mit dem replizierbaren rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind.
In einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Screenen einer chemischen Substanz auf Aktivität zur Regulation der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst, bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:

(i) das Messen der Tyrosinkinase-Aktivität eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4 und 5;
(ii) das Kontaktieren eines Probenmaterials, das die chemische Substanz umfasst, mit dem Polypeptid;
(iii) das Messen der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids in der Gegenwart des Probenmaterials;
(iv) das Bewerten der Aktivierung oder Inhibition der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids durch das Probenmaterial, wobei die Aktivierung oder Inhibition als die Differenz zwischen den jeweiligen in Schritten (i) und (iii) gemessenen Tyrosinkinase-Aktivitäten angezeigt wird; und
(v) das Isolieren der chemischen Substanz, die die Aktivität zur Regulation der Tyrosinkinase-Aktivität hat, aus dem Probenmaterial.

In noch einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper bereitgestellt, welcher spezifisch ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität erkennt, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst.
Der Ausdruck „Tyrosinkinase-Aktivität" bedeutet in der vorliegenden Erfindung nicht nur die Enzymaktivität, einen Tyrosinrest zu phosphorylieren, sondern auch die Aktivität der SH2-Domäne der Tyrosinkinase, einen phosphorylierten Tyrosinrest von anderen Proteinen zu erkennen und an den Rest zu binden, und die Aktivität der SH3-Domäne der Tyrosinkinase, die Aminosäuresequenz eines Prolin-reichen Bereichs von anderen Proteinen zu erkennen und an den Bereich zu binden.
Bei der vorliegenden Erfindung können verschiedene Verfahren gemäß den in Standardlaborhandbüchern beschriebenen Verfahren ausgeführt werden, wie z. B. Herstellung einer cDNA, welche für das Klonieren benötigt wird, Bewertung der Expression einer RNA durch Northern-blot, Screenen durch Hybridisierung, Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, Bestimmung einer Nucleotidsequenz einer DNA und Herstellung einer cDNA-Bibliothek. Bezüglich des erläuterten Verfahrens kann beispielsweise auf Molecular Cloning, A laboratory manual, herausgegeben von Maniatis (1989, Hrsg., Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press), verwiesen werden.
Die Herstellung eines PCR-Primers, der der Aminosäuresequenz entspricht, welche charakteristisch für eine Tyrosinkinase ist, und die nachfolgende Ausführung der PCR, kann gemäß dem von Wilks in der Literatur beschriebenen Verfahren ausgeführt werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1603, 1989). Veranschaulichend erklärt, ein Oligonucleotid wird mittels eines kommerziell erhältlichen DNA-Synthesizers synthetisiert. Das synthetisierte Oligonucleotid wird gereinigt und dann einer PCR unterworfen, so dass der spezifische Bereich, der für die Kinase-Domäne der Tyrosinkinase codiert und etwa 210 Basenpaare hat, amplifiziert wird. Das resultierende DNA-Fragment, erhalten durch PCR, wird isoliert, beispielsweise durch Agarose-Gelelektrophorese, und das isolierte DNA-Fragment wird gereinigt. Das gereinigte DNA-Fragment wird in verschiedene Vectoren subkloniert, gefolgt von der Bestimmung der Nucleotidsequenz derselben. Aus dem Vergleich der bestimmten Nucleotidsequenz mit den Nucleotidsequenzen der verschiedenen Arten von bekannten Tyrosinkinasen, kann die Klonierung des Nucleotidfragments einer neuen Tyrosinkinase bestätigt werden.
Um einen Klon zu erhalten, der die vollständige Nucleotidsequenz enthält, die für die neue Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, wird das durch das vorstehende Verfahren klonierte Nucleotidfragment Isotopen- oder nicht-Isotopenmarkiert, und eine cDNA-Bibliothek von UT-7 wird mit dem markierten Nucleotidfragment gescreent, beispielsweise durch Hybridisierung. Beispiele für Verfahren zur Markierung eines Nucleotidfragments mit einem Isotop umfassen ein Verfahren, in welchem der Terminus des Nucleotidfragments mit [³²P]γ-ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase markiert wird, einem Nick-Translationsverfahren, und einem Primerextensionsverfahren. Alternativ kann ein Klon, enthaltend die gesamte Nucleotidsequenz, die für die neue Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, durch das PCR-Verfahren erhalten werden, basierend auf der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11.
SEQ ID NO. 11 ist eine cDNA-Nucleotidsequenz, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert. Die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 besteht aus dem 5'-nicht-codierenden Bereich von 207 Nucleotiden, dem Bereich von 1521 Nucleotiden, der für die neue Tyrosinkinase codiert, und dem 3'-nicht-codierenden Bereich von 214 Nucleotiden.
SEQ ID NOs. 4 und 5 sind die Aminosäuresequenzen der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung. Jedes der Polypeptide von SEQ ID NOs. 4 und 5 enthält eine SH2-Domäne, eine SH3-Domäne und eine Tyrosinkinase-Domäne, die jeweils ähnliche Aminosäuresequenzen zu Teilaminosäuresequenzen bekannter cytoplasmatischer Tyrosinkinasen haben [diese drei Arten von Domänen sind bekannt, in vielen Arten von bekannten cytoplasmatischen Tyrosinkinasen vorhanden zu sein, z. B. c-src (siehe Koch et al., Science 252: 668, 1991)]. Ferner wurde berichtet, dass die SH2-Domäne und die SH3-Domäne auch in Signalüberträgern vorhanden sind, wie z. B. Phospholipase C-γ, IP3-Kinase und ras-GAP, und dass diese zwei Arten von SH-Domänen wichtige Rollen in intrazellulären Signalübertragungswegen spielen (siehe Pawson und Gish, Cell, 71: 359, 1992). In der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung hat die SH3-Domäne die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 1, die SH2-Domäne hat die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2 und die Tyrosinkinase-Domäne hat die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3. In der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4, umfassend die Aminosäuresequenzen der SH3-Domäne, SH2-Domäne und Tyrosinkinase-Domäne, entspricht die SH3-Domäne den Aminosäuren 7 bis 70, die SH2-Domäne entspricht den Aminosäuren 81 bis 155 und die Tyrosinkinase-Domäne entspricht den Aminosäuren 192 bis 437. Ferner entspricht in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5, ebenfalls umfassend die Aminosäuresequenzen der SH3-Domäne, SH2-Domäne und Tyrosinkinase-Domäne, die SH3-Domäne den Aminosäuren 48 bis 111, die SH2-Domäne entspricht den Aminosäuren 122 bis 196 und die Tyrosinkinase-Domäne entspricht den Aminosäuren 233 bis 478. SEQ ID NO. 6 ist ein Beispiel für die Nucleotidsequenzen von cDNAs, die für das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 1 codieren. SEQ ID NO. 7 ist ein Beispiel für die Nucleotidsequenzen von cDNAs, die für das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2 codieren. SEQ ID NO. 8 ist ein Beispiel für die Nucleotidsequenzen von cDNAs, die für das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3 codieren.
Es ist bekannt, dass es die Funktion einer SH2-Domäne ist, ein Protein, enthaltend einen phosphorylierten Tyrosinrest, zu erkennen und an den phosphorylierten Tyrosinrest zu binden (siehe Songyang et al., Cell 72: 767, 1993), und es die Funktion einer SH3-Domäne ist, einen Prolin-reichen Bereich des Austauschfaktors SOS für ein Protooncogen, wie z. B. ras, zu erkennen und an den Prolin-reichen Bereich zu binden (siehe Egan et al., Nature 363: 45, 1993). Es wird angenommen, dass diese individuellen SH2- und SH3-Domänen allein, oder einem durch Kombination dieser SH2- und SH3-Domänen künstlich hergestellten Peptid, eine ähnliche Funktion wie die Funktion der SH2-Domäne oder/und der SH3-Domäne haben. Zur Bewertung der Aktivität der Tyrosinkinase ist es nützlich und wichtig, die folgenden DNA-Fragmente und RNA-Fragmente zu verwenden, welche aus den jeweiligen Nucleotidsequenzen hergestellt werden, die für die SH2-Domäne und die SH3-Domäne codieren: eine codierende DNA, eine nicht-codierende DNA, eine codierende RNA, eine nicht-codierende RNA, oder ein Derivat derselben, wie z. B. eines, welches durch Methylierung, Methyl-Phosphorylierung, Desaminierung oder Thiophosphorylierung der vorstehenden codierenden DNA, nicht-codierenden DNA, codierenden RNA oder nicht-codierenden RNA erhalten wird.
Die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 ist stark homolog zu der von CSK, welche eine bekannte cytoplasmatische Tyrosinkinase mit einer SH2-Domäne, einer SH3-Domäne und einer Kinase-Domäne ist (bezüglich CSK siehe Nada et al., Nature 351: 60, 1991). Die Homologie zwischen der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 und der Aminosäuresequenz von CSK ist bezüglich der gesamten Aminosäuresequenz der Tyrosinkinase 53,9, 57,4 nur bezüglich der SH2-Domäne, 40,5 nur bezüglich der SH3-Domäne und 58,9 nur bezüglich der Kinase-Domäne. CSK hat die Aktivität, die C-terminalen Tyrosinreste von Expressionsprodukten der Gene der src-Familie spezifisch zu phosphorylieren, um dadurch die Aktivierung der Expressionsprodukte der Gene der src-Familie zu unterdrücken. Eine neuere Untersuchung von CSK-Gen-defizienten Mäusen, welche durch Gen-Targeting erzeugt werden, zeigt, dass alle Mäuse in ihren frühen embryonalen Stadien aufgrund von Defekten in der Bildung der Neuralrohre sterben, wenn die Expressionsprodukte der Gene der src-Familie fortwährend in Mäusen aktiviert sind (siehe Imamoto & Soriano, Cell 73: 1117, 1993; und Noda et al., Cell 73: 1125, 1993). Die Expression des CSK-Gens ist in verschiedenen Organen feststellbar.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass die Expression des Gens, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, hauptsächlich in Hirnzellen und im Stadium der frühen Differenzierung von Blutzellen (siehe Beispiel 8 unten) feststellbar ist, scheint die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung jedoch eine von der Rolle der CSK verschiedene physiologische Rolle zu spielen.
Tyrosinkinasen können generell die Tyrosinreste eines Enolaseproteins und eines synthetischen Peptids als Substrate phosphorylieren, wobei beide eine Tyrosin-reiche Sequenz haben. Bezüglich der Substrate, auf welche Tyrosinkinasen in Zellen einwirken, gibt es jedoch unterschiedliche Substrate, die spezifisch für die jeweiligen Tyrosinkinasen sind. Deshalb wird angenommen, dass ein Substrat für die neue Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung auch spezifisch ist und unterschiedlich von den Substraten für die üblichen bekannten Tyrosinkinasen. Ferner zeigt eine kürzliche Untersuchung an einer SH3-Domäne und einer SH2-Domäne unter Verwendung einer synthetischen Peptidbibliothek, enthaltend phosphorylierte Tyrosine, dass die SH3-Domäne und die SH2-Domäne individuell bestimmte Aminosäuresequenzen spezifisch erkennen und an diese binden.
Deshalb wird angenommen, dass nicht nur der gesamte Bereich der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung, sondern auch die SH3-Domäne, die SH2-Domäne und die Tyrosinkinase-Domäne derselben jeweils spezifische Substrate und Bindungsproteine dafür haben, welche unterschiedlich von jenen für die üblichen bekannten Tyrosinkinasen sind.
Es ist bekannt, dass eine mRNA mit einer Vielzahl von Startcodons (AUG) trotz einer festgelegten Nucleotidsequenz derselben in verschiedene Polypeptidfragmente translatiert werden kann, wie in der Literatur in allgemeinen Äußerungen von M. Kozak erwähnt (J. Cell Biol. 115: 887, 1991). In der vorliegenden Erfindung hat die cDNA von SEQ ID NO. 11 zwei Startcodons, an der Position der Nucleotide 208 bis 210 bzw. an der Position der Nucleotide 331 bis 333, so dass zwei unterschiedliche Polypeptidfragmente, gezeigt in SEQ ID NOs. 5 und 4, durch Expression der cDNA erhalten werden können. SEQ ID NO. 9 ist ein Beispiel für cDNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 4 codieren. SEQ ID NO. 10 ist ein Beispiel für cDNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 codieren.
In der vorliegenden Erfindung können die jeweiligen homologen Varianten der Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs. 4 und 5 durch Standardverfahren hergestellt werden, ohne die Tyrosinkinase-Aktivität zu beeinträchtigen.
In der vorliegenden Erfindung können die jeweiligen DNAs, die für die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs. 4 und 5 codieren, und die DNA von SEQ ID NO. 11, verschiedene Formen annehmen, wie z. B. einer cDNA, einer chromosomalen DNA mit Introns und Exons, und einer künstlichen DNA, welche durch Ligation synthetisierter Oligonucleotide, hergestellt durch ein bekanntes DNA-Syntheseverfahren, an die cDNA oder chromosomale DNA erhalten wird. Es ist bekannt, dass durch die Degeneration des genetischen Codes ein bestimmtes Polypeptid durch unterschiedliche Nucleotidsequenzen codiert werden kann. Es ist auch bekannt, dass der 5'-nicht-codierende Bereich und der 3'-nicht-codierende Bereich einer DNA nicht an der Bildung der Aminosäuresequenz des durch die DNA codierten Polypeptids beteiligt sind, so dass diese nicht-codierenden Bereiche wahrscheinlich mutieren.
Wie aus dem unten beschriebenen Beispiel 8 ersichtlich ist, ist die Menge der mRNA des Gens, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, klein in undifferenzierten UT-7, aber nimmt in Übereinstimmung mit der Differenzierung der UT-7 in Megakaryocyten oder Erythroblasten zu. Deshalb wird angenommen, dass die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung eine wichtige Rolle in der Differenzierung von Blutzellen spielt.
Für ein Verfahren zur Herstellung eines replizierbaren rekombinanten DNA-Moleküls, umfassend einen replizierbaren Expressionsvector und, funktional in den Vector insertiert, einen Teil der oder die gesamte DNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, und für ein Verfahren zur Transformation eines Mikroorganismus oder von Tierzellen mit dem vorstehenden replizierbaren rekombinanten DNA-Molekül kann beispielsweise auf die in nachfolgendem Beispiel 10 beschriebenen Verfahren verwiesen werden. Die Mikroorganismen oder Tierzellen, die mit einem Gen, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, transformiert sind, können in grundlegenden Untersuchungen von Tyrosinkinasen, Untersuchungen zum Wirkstoffdesign, und der Arzneimittelentwicklung verwendet werden. Beispiele für solche Arzneimittel umfassen ein carcinostatisches Mittel, welches spezifisch ein von der Tyrosinkinase vermitteltes Signalübetragungssystem steuert, und ein Mittel zur Steuerung der Differenzierung von Blutzellen.
Die nicht-codierende DNA und die nicht-codierende RNA, welche hergestellt werden, indem ein Teil der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 verwendet wird, können in Untersuchungen zur Differenzierung von Blutzellen und der Entwicklung von Arzneimitteln, wie z. B. einem Mittel zur Steuerung der Differenzierung von Blutzellen, verwendet werden. Es ist auch möglich, die Genexpression in Zellen durch Verwendung eines DNA-Fragments oder eines RNA-Fragments zu regulieren, welches komplementär zu oder entsprechend zu wenigstens einem Teil der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11 ist, wie z. B. eine codierende DNA, eine nicht-codierende DNA, eine codierende RNA, eine nicht-codierende RNA, oder ein Derivat derselben, welches erhalten wird durch Methylierung, Methyl-Phosphorylierung, Desaminierung oder Thiophosphorylierung der codierenden DNA, nicht-codierenden DNA, codierenden RNA oder nicht-codierenden RNA. Wie in Beispiel 8 unten gezeigt, hat die nicht-codierende DNA die Fähigkeit, spezifisch an die mRNA des Gens zu binden, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert und deshalb kann die nicht-codierende DNA vorteilhaft zum Nachweis der Expression des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wie in Beispiel 9 unten gezeigt, kann die nicht-codierende RNA außerdem auch vorteilhaft in einer vergleichbaren Weise zum Nachweis der Expression des Tyrosinkinasegens der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Größe von jeder von der codierenden DNA, der nicht-codierenden DNA, der codierenden RNA, der nicht-codierenden RNA und den Derivaten derselben ist wenigstens ein 12-mer, vorzugsweise 14-mer bis 16-mer.
Beispiel 11 (welches unten beschrieben ist) zeigt ein Beispiel für Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers unter Verwendung eines Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung. Der hergestellte Antikörper kann vorteilhaft für verschiedene Zwecke verwendet werden, wie z. B. dem Nachweis der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine chemische Substanz mit der Aktivität, die vorstehend definierte Tyrosinkinase-Aktivität zu regulieren, durch Screenen erhalten werden, welches die Schritte umfasst:

Insbesondere ist es möglich, eine chemische Substanz zu screenen, die die Aktivität hat, die Tyrosinkinase-Aktivität von wenigstens der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu regulieren. Es ist auch möglich, durch Screenen eine chemische Substanz zu erhalten, die die Aktivität hat, die von der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung vermittelte intracelluläre Signalübermittlung zu regulieren, wobei die Inhibition der Funktionen der SH2-Domäne und der SH3-Domäne der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung, ihre jeweiligen Erkennungsstellen zu erkennen und daran zu binden, als ein Kriterium für den Nachweis verwendet wird (wie vorstehend erwähnt, erkennt SH2 spezifisch einen phosphorylierten Tyrosinrest eines Proteins, und SH3 erkennt spezifisch den Prolin-reichen Bereich des Austauschfaktors SOS für ein Protooncogen, wie z. B. ras). Wie in Beispiel 13 unten gezeigt, kann z. B. Erbstatin mit der Aktivität, die Tyrosinkinase-Aktivität zu inhibieren (bezüglich Erbstatin, siehe Umezawa et al., J. Antibiot. 39: 170, 1986), durch Screenen nachgewiesen und isoliert werden, wobei die Inhibition der Tyrosinkinase-Aktivität für den Nachweis bewertet wird. Es wird erwartet, dass eine neue Substanz nach diesem Verfahren isolierbar wäre. Dieses Verfahren kann auch zur Entwicklung von nützlichen Arzneimitteln verwendet werden, wie z. B. einem carcinostatischen Mittel, und einem Mittel zur Inhibition oder Förderung der Proliferation einer Zelle.
Die cDNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, kann aus anderen Zelllinien als UT-7 erhalten werden, wie z. B. humanen mononuklearen peripheren Blutzellen (wie z. B. T-Zellen und NK-Zellen), humaner akut-myeloischer Leukämie-Zelllinie KG1a (siehe Blood 62: 709, 1983), Zelllinie KMT-2, etabliert aus humanem Nabelschnurblut (siehe Blood 76: 501, 1990), und humaner chronischer-myeloischer Leukämie-Zelllinie K562 (siehe Blood 45: 321, 1975)(ATCC-Zugangs-Nr. CCL243), im Wesentlichen auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 1 bis 7.
BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele, welche jedoch nicht als limitierend für den Umfang der vorliegenden Erfindung aufgefasst werden sollten, erklärt.
Beispiel 1 [Herstellung einer poly(A)⁺RNA der humanen Blutzelllinie UT-7]
Zelllinie UT-7 (Komatsu et al., Cancer Res. 51 : 341, 1991)(UT-7 ist erhältlich von Dr. Norio Komatsu, Dozent am Department für Hämatologie, Jichi Medical School, Japan) wird kultiviert und passagiert nach einem Verfahren, bei welchem humaner Granulocyten-Monocyten-Kolonie-stimulierender Faktor (hGM-CSF) zu Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM), enthaltend 10% fötales Kälberserum (FCS), zugegeben wird, so dass die Konzentration von hGM-CSF 2 ng/ml beträgt, und die UT-7-Zellen werden in dem resultierenden Kulturmedium inoculiert und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Kultivierte UT-7-Zellen werden erhalten.
Die Differenzierung von UT-7-Zellen in Megakaryocyten wird auf die folgende Weise ausgeführt. Die kultivierten UT-7-Zellen in dem Kulturmedium werden mit demselben Kulturmedium verdünnt, so dass die Konzentration der Zellen 2 × 10⁵ Zellen/ml beträgt. Dann wird hGM-CSF zu den resultierenden verdünnten Zellen zugegeben, so dass die Konzentration von hGM-CSF 2 ng/ml beträgt, und Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) wird dazu zugegeben, so dass die Konzentration von PMA 10 ng/ml beträgt. Dann werden die Zellen für 3 Tage inkubiert und die resultierenden Megakaryocyten werden gewonnen.
Andererseits wird die Differenzierung von UT-7-Zellen in Erythroblasten auf die folgende Weise ausgeführt. Die kultivierten UT-7-Zellen in dem Kulturmedium werden mit demselben Kulturmedium verdünnt, so dass die Konzentration der Zellen 2 × 10⁵ Zellen/ml beträgt. Humanes Erythropoietin (hEPO) wird zu den resultierenden verdünnten Zellen zugegeben, so dass die Konzentration von hEPO 1 Unit/ml beträgt, und Buttersäure wird dazu zugegeben, so dass die Konzentration von n-Buttersäure 1,3 mM beträgt. Dann werden die Zellen für 3 Tage inkubiert und die resultierenden Erythroblasten werden gewonnen.
Mit Bezug auf jeden dieser drei Zelltypen, d. h. Zellen von nicht-stimulierten UT-7, Megakaryocyten und Erythroblasten, werden 1 × 10⁸ Zellen gesammelt und dreimal mit PBS (–) gewaschen, und werden für die Extraktion von RNA auf die folgende Weise verwendet.
Aus den gesammelten Zellen wird Gesamt-RNA nach dem Lithiumchlorid/Harnstoff-Verfahren extrahiert (Eur. J. Biochem. 107: 303, 1980). Dann wird eine poly(A)⁺RNA isoliert und aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von Oligotex-dT 30 (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gereinigt.
Beispiel 2 [Konstruktion eines spezifischen Primers für das Tyrosinkinase-Gen]
Die PCR wird wie folgt gemäß dem Verfahren von Wilks (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1603, 1989) ausgeführt, wobei zwei Arten von Mixed-Primern verwendet werden, die komplementäre Sequenzen zu Subdomänen 7 bzw. 9 der Tyrosinkinase haben, und ihre jeweiligen Restriktionsschnittstellen einligiert haben, d. h. codierender Primer PTKI: 5'-TTGTCGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)G-3' (27-mer mit Sall-Stelle als einer Restriktionsschnittstelle), und nicht-codierender Primer PTKII: 3'-CT(AG)CA(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTTAAGGT-5' (24-mer mit EcoRI-Stelle als einer Restriktionsschnittstelle).
Ein synthetisches Oligonucleotid wird mittels eines automatischen DNA-Synthesizers unter Verwendung eines Festphasenverfahrens konstruiert. Als automatischer DNA-Synthesizer wird 391PCR-MATE (hergestellt und vertrieben von APPLIED BIOSYSTEMS, INC., USA) verwendet. Nucleotide, ein Träger mit davon unterstütztem 3'-Nucleotid, eine Lösung, und ein Reagens werden gemäß der dem Synthesizer beiliegenden Anleitung verwendet. Eine Kupplungsreaktion wird ausgeführt, um ein Oligonucleotid in einem Zustand zu synthetisieren, dass es von einem Träger unterstützt wird. Eine Schutzgruppe am 5'-Terminus des Oligonucleotids wird durch Anwendung von Trichloressigsäure auf das Oligonucleotid entfernt, und das Oligonucleotid wird in eine konzentrierte Ammoniaklösung gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunden stehen gelassen, wodurch das Oligonucleotid von dem Träger freigesetzt wird. Anschließend wird die konzentrierte Ammoniaklösung, enthaltend das von dem Träger freigesetzte Oligonucleotid, bei 55°C für mehr als 14 Stunden in einem geschlossenen Gefäß stehen gelassen, um dadurch sowohl die Schutzgruppen von der Nucleinsäure als auch Phosphat von dem Oligonucleotid zu entfernen. Das erhaltene Oligonucleotid, von welchem der Träger und die Schutzgruppen entfernt worden sind, wird mittels einer OPC-Kartusche (hergestellt und vertrieben von APPLIED BIOSYSTEMS, INC., USA) gereinigt, und unter Verwendung von 2% Trifluoressigsäure detrityliert, wodurch ein gereinigter Primer erhalten wird. Der gereinigte Primer wird in entionisiertem Wasser gelöst, so dass die Konzentration des Primers 1 μg/μl beträgt, und die erhaltene Lösung wird in der unten beschriebenen PCR verwendet.
Beispiel 3 [Synthese einer cDNA]
Eine cDNA wird unter Verwendung der in Beispiel 1 erhaltenen poly(A)⁺RNA synthetisiert. Präziser werden 2 μg der poly(A)⁺RNA in 12,3 μl entionisiertem Wasser gelöst, wodurch eine Lösung erhalten wird. Zu der erhaltenen Lösung werden 2 μl von 10 × Puffer [enthaltend 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, und 0,01 Gelatine], 4 μl dNTP (2,5 mM), 1 μl des für Tyrosinkinase spezifischen oben erwähnten nicht-codierenden Primers PTKII (1 μg/μl), 0,2 μl reverse Transkriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus (hergestellt und vertrieben von Life Science Laboratories, USA: 32 U/μl), und 0,5 μl von RNase-Inhibitor (hergestellt und vertrieben von Boehringer-Mannheim GmbH, Deutschland: 40 U/μl) zugegeben. Die resultierende Mischung wird bei 37°C für 75 Minuten stehen gelassen, und ferner bei 65°C für 10 Minuten stehen gelassen.
Beispiel 4 [PCR unter Verwendung von für das Tyrosinkinase-Gen spezifischen Primern]
Die Amplifikation der cDNA durch PCR wird wie folgt ausgeführt: Zu 20 μl der in Beispiel 3 erhaltenen cDNA-Lösung werden 8 μl von 10 × Puffer [enthaltend 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, und 0,01% Gelatine], 6,4 μl dNTP (2,5 mM), 1,5 μl des für Tyrosinkinase spezifischen oben erwähnten codierenden Primers PTKI (1 μg/μl), und 0,2 μl Taq DNA-Polymerase (AmpliTaq: hergestellt und vertrieben von Perkin Elmer Cetus Co., Ltd., USA: 5 U/μl) zugegeben. Zu der resultierenden Mischung wird entionisiertes Wasser zugegeben, so dass das Gesamtvolumen 100 μl beträgt. Das PCR-Verfahren wird zuerst bei 94°C für 1 Minute, dann bei 37°C für 2 Minuten, und dann bei 72°C für 3 Minuten ausführt. Dieses Verfahren wird 40 mal wiederholt und dann wird die Reaktionsmischung bei 72°C für 7 Minuten stehen gelassen. Ein Teil des resultierenden PCR-Produkts wird auf einem 2% Agarosegel elektrophoretisch getrennt. Anschließend wird das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und unter ultraviolettem Licht beobachtet, um dadurch zu bestätigen, dass eine cDNA mit etwa 210 bp Nucleotiden amplifiziert worden ist.
Beispiel 5 [Klonierung und Sequenzierung des PCR-Produkts]
Die gesamte Menge des verbliebenen PCR-Produkts wird auf einem 2% Agarosegel, bestehend aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, elektrophoretisch getrennt. Anschließend wird das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und eine Bande, die etwa 210 bp entspricht, wird unter ultraviolettem Licht bestätigt, und ein Gelteil mit der Bande, enthaltend cDNA, wird ausgeschnitten. Die so erhaltene cDNA wird vom Gel gereinigt. Die gereinigte cDNA wird mit Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut und ein Teil der verdauten cDNA wird auf einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt, um ein cDNA-Fragment zu erhalten, welches in einen Vector insertiert werden soll.
Als Vector wird pBluescript II KS (hergestellt und vertrieben von Toyobo Co., Ltd., Japan) verwendet. Bevor das hergestellte cDNA-Fragment von oben in den Vector eingeführt wird, wird der Vector mit Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut, und die Enden des verdauten Vectors werden mit alkalischer Phosphatase (CIAP: hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) dephosphoryliert. Der erhaltene verdaute Vector und die oben erwähnte cDNA werden miteinander in einem molaren Verhältnis von 1 : 5 gemischt, und die cDNA wird unter Verwendung von T4-Ligase (hergestellt und vertrieben von New England Bio Labs, USA) in den Vektor ligiert. Der resultierende pBluescript Vector mit der darin insertierten cDNA wird in E. coli Stamm JM109 eingeführt, und der Stamm wird auf eine Platte mit halbfestem L-Kulturmedium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, aufgetragen, und für 12 Stunden bei 37°C stehen gelassen. Von den erschienenen Kolonien werden zufällig Kolonien ausgewählt und mit Restriktionsenzymen EcoRI und SalI verdaut, um dadurch zu bestätigen, dass eine cDNA mit etwa 210 bp durch den Verdau ausgeschnitten werden kann. So wird bestätigt, dass die gewünschte cDNA in die ausgewählten Klone eingeführt worden ist. Die Nucleotidsequenz der cDNA von jedem der bestätigten Klone wird mit Hilfe des Fluoreszenzsequenzermodells 373A (hergestellt von APPLIED BIOSYSTEMS, INC., USA) bestimmt. Als ein Ergebnis wird erhalten, dass mit Bezug auf die Klone, die die unter Verwendung der aus den nicht-stimulierten UT-7-Zellen stammenden poly(A)⁺RNA hergestellte cDNA aufweisen, dass Tyrosinkinase-Gen der vorliegenden Erfindung nur in 1 Klon von 98 Klonen nachgewiesen wird; in Bezug auf die Klone, die die cDNA aufweisen, die unter Verwendung der poly(A)⁺RNA, stammend aus den Megakaryocyten, die sich aus den UT-7-Zellen differenziert haben, hergestellt wurde, wird das Tyrosinkinase-Gen der vorliegenden Erfindung in 8 Klonen von 51 Klonen nachgewiesen; und in Bezug auf die Klone, die die cDNA aufweisen, die unter Verwendung der poly(A)⁺RNA, stammend aus den Erythroblasten, die sich aus den UT-7-Zellen differenziert haben, hergestellt wurde, wird das Tyrosinkinase-Gen der vorliegenden Erfindung in 7 Klonen von 53 Klonen nachgewiesen. Dies weist darauf hin, dass das Tyrosinkinase-Gen der vorliegenden Erfindung weit häufiger in differenzierten Zellen als in undifferenzierten Zellen vorkommt. Das Gen der vorliegenden Erfindung entspricht den Nucleotiden 1276 bis 1421 der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 11.
Beispiel 6 [Herstellung einer cDNA-Bibliothek, und Klonierung des gesamten Bereichs des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung]
Unter Verwendung der poly(A)⁺RNA der nicht-stimulierten UT7-Zellen, welche gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert und gereinigt worden ist, wird eine cDNA-Bibliothek hergestellt. Für die Herstellung einer cDNA-Bibliothek wird der pCDM8-Vector cDNA-Bibliothek-Konstruktionskit (hergestellt und vertrieben von Invitrogen, Niederlande) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung verwendet.
Danach wird unter Verwendung des Kolonie-Hybridisierungsverfahrens ein cDNA-Klon, der für den gesamten Bereich des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung codiert, aus Kolonien in der oben hergestellten cDNA-Bibliothek, enthaltend etwa 5 × 10⁵ Zellen, gesucht. Die Hybridisierung wird auf die folgende Weise ausgeführt. Die Zellkolonien werden auf einen Nylonfilter (Hybond N⁺: hergestellt und vertrieben von Amersham International, GB) transferiert. Der Nylonfilter mit den Zellen darauf wird mit Lauge behandelt (indem der Nylonfilter für 7 Minuten auf einem Filterpapier belassen wird, welches, darin absorbiert, 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH enthält), zweimal neutralisiert (indem der Nylonfilter für 3 Minuten auf einem Filterpapier belassen wird, welches, darin absorbiert, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 7,2 und 1 mM EDTA enthält), gewaschen, indem er für 5 Minuten in SSPE mit 2-facher Konzentration (0,36 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat pH 7,7, 2 mM EDTA) geschüttelt wird, und an Luft getrocknet. Dann wird der so behandelte Nylonfilter für 20 Minuten auf einem Filterpapier belassen, welches, darin absorbiert, 0,4 M NaOH enthält, gewaschen, indem er für 5 Minuten in SSPE mit 5-facher Konzentration geschüttelt wird, und an Luft getrocknet. Der getrocknete Filter wird einem Screening unterzogen, indem eine mit dem Radioisotop ³²P-markierte cDNA-Sonde verwendet wird. Das Screening wird auf die folgende Weise ausgeführt.
Eine mit dem Radioisotop ³²P-markierte cDNA-Sonde wird wie folgt hergestellt. Der pBluescript mit dem darin insertierten cDNA-Fragment, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, welcher in Beispiel 5 erhalten wird, wird mit den Restriktionsenzymen SalI und EcoRI verdaut, um dadurch das cDNA-Fragment auszuschneiden, und in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt elektrophoretisch getrennt. Dann wird das cDNA-Fragment abgetrennt und aus dem Gel gereinigt, und das gereinigte cDNA-Fragment wird mit Hilfe eines DNA-Markierungskits (Megaprime DNA-Markierungssystem: hergestellt und vertrieben von Amersham International, GB) markiert. Präzise wird die Markierung wie folgt ausgeführt. Zu 25 ng des DNA-Fragments werden 5 μl einer Primerlösung und entionisiertes Wasser zugegeben, so dass das Gesamtvolumen 33 μl beträgt, und die resultierende Mischung wird in einem kochenden Wasserbad für 5 Minuten erhitzt. Zu der Mischung werden dann 10 μl eines Reaktionspuffers, enthaltend dNTP, 5 μl α-³²P-dCTP, und 2 μl einer DNA-Polymeraselösung zugegeben, und die resultierende Mischung wird in einem Wasserbad bei 37°C für 10 Minuten erhitzt. Aus der erhitzten Mischung wird die DNA unter Verwendung einer Sephadex-Säule (Quick Spin-Säule Sephadex G-50: hergestellt und vertrieben von Boehringer-Mannheim GmbH, Deutschland) gereinigt. Die gereinigte DNA wird in einem kochenden Wasserbad für 5 Minuten erhitzt, und in einem Eisbad für 2 Minuten abgekühlt.
Der oben erwähnte Nylonfilter, der die zu screenenden Zellen trägt, wird in eine Vorhybridisierungslösung, bestehend aus SSPE mit 5-facher Konzentration, Denhardt's-Lösung mit 5-facher Konzentration, 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat), und 10 mg/ml Lachssperma-DNA, denaturiert in einem kochenden Wasserbad, eingetaucht, wobei die Konzentration von jeder Komponente eine Endkonzentration ist, wie in der Vorhybridisierungslösung bestimmt. Der Filter wird in der Vorhybridisierungslösung bei 65°C für 2 Stunden geschüttelt. Die Hybridisierung wird ausgeführt, indem der Filter bei 65°C für 16 Stunden in einer Hybridisierungslösung geschüttelt wird, welche dieselbe Zusammensetzung wie die vorstehend erwähnte Vorhybridisierungslösung hat, außer, dass sie zusätzlich die oben erhaltene ³²P-markierte cDNA-Sonde enthält.
Der Filter wird dann zweimal gewaschen, indem er unter Schütteln in eine SSPE-Lösung, enthaltend 0,1% SDS bei 65°C eingetaucht wird, und weitere 4 mal bei 65°C in einer Lösung, erhalten durch 10-fache Verdünnung einer SSPE-Lösung, enthaltend 0,1% SDS mit Wasser, gewaschen wird. Der gewaschene Filter wird einer Autoradiographie unterzogen, indem ein empfindlicher Schirm verwendet wird. Klone werden von einer stark leuchtenden Kolonie aufgenommen und erneut angeimpft, um dadurch Kolonien wachsen zu lassen, und ein Screening wird auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben ausgeführt, wodurch ein gewünschter Klon erhalten wird.
Gemäß dem in dem oben erwähnten Laborhandbuch von Maniatis et al. beschriebenen Verfahren, wird Plasmid pCDM8 aus den erhaltenen Klonen gereinigt. Das gereinigte Plasmid wird mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, um dadurch eine cDNA zu erhalten. Die cDNA wird durch Elektrophorese in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt, und die gereinigte cDNA wird in Plasmid pBluescript insertiert. Die Nucleotidlänge der gereinigten cDNA beträgt etwa 2 kbp.
Beispiel 7 [Bestimmung der Nucleotidsequenz des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung]
Die cDNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, erhalten in Beispiel 6, wird unter Verwendung von ALFDNA-Sequencer (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und dem Markierungskit für den ALF-Sequencer (dieser Markierungskit wird von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden, hergestellt und vertrieben) gemäß den dem Sequencer und dem Kit beiliegenden Anleitungen sequenziert. Präzise wird eine Deletionsmutante unter Verwendung eines Deletionsmutanten-Kits für eine Kilosequenz (hergestellt und vertrieben von Takara Shuzo Co., Ltd., Japan) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung hergestellt. Unter Verwendung der Deletionsmutante wird die gesamte Nucleotidsequenz der cDNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in beiden Richtungen bestimmt.
Beispiel 8 [Nachweis der Produktion der mRNA, welche für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in verschiedenen Arten von Gewebezellen durch Northern-Blot]
Zum Nachweis der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in humanen Gewebezellen und Blutzellen, werden die folgenden Filter verwendet:
Kommerziell erhältliche Filter, die mRNAs von verschiedenen Arten von Gewebezellen tragen, präzise, Human Multiple Tissue Northern Blot, Human Multiple Tissue Northern Blot II, Human Fetal Multiple Tissue Northern Blot und Human Brain Multiple Tissue Northern Blot (alle hergestellt und vertrieben von Clontech, USA) und ein Filter, der durch ein Verfahren hergestellt wird, in welchem die durch das in Beispiel 1 gezeigte Verfahren erhaltene mRNA in einem Agarosegel elektrophoretisch getrennt wird und auf Zeta-Prob (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) transferiert wird. Zunächst wird die cDNA, die für den gesamten Bereich der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, mit SmaI verdaut, wodurch ein Fragment von etwa 800 bp erhalten wird. Das erhaltene Fragment wird mit ³²P markiert, indem der oben erwähnte DNA-Markierungskit (MegaPrime DNA-Markierungssystem, hergestellt und vertrieben von Amersham International, GB) verwendet wird, und das markierte Fragment mit den mRNAs, die von den oben erwähnten Filtern getragen werden, umgesetzt wird, um dadurch das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, zu prüfen.
In Bezug auf die Gewebezellen eines erwachsenen Menschen wurde als ein Ergebnis gefunden, dass die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, nicht in der Gesamt-mRNA der Herz-, Plazenta-, Leber-, Skelettmuskel-, Nieren-, Pankreas-, Prostata-, Hoden-, Eierstock- und Dünndarmzellen nachweisbar ist. Wohingegen gefunden wurde, dass die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in der Gesamt-mRNA der Hirn-, Milz-, Dickdarmzellen und in der Gesamt-mRNA der peripheren Blut-Lymphocyten nachweisbar ist. Es wurde auch gefunden, dass in der Gesamt-mRNA der Lungen- und Thymuszellen die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, nachweisbar ist, obwohl die Menge der mRNA gering ist. Andererseits wurde in Bezug auf Gewebezellen eines menschlichen Fötus gefunden, dass die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, nicht in der Gesamt-mRNA der Herz-, Lungen-, Leber- und Nierenzellen nachweisbar ist, aber nachweisbar in der Gesamt-mRNA der Hirnzellen. Betreffend die Hirngewebezellen eines erwachsenen Menschen wird die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in der Gesamt-mRNA der Mandel-, Nucleus caudatus-, Corpus callosum-, Hippocampus-, Hypothalamus-, Substantia nigra-, subthalmischer Nucleus- und Thalamuszellen nachgewiesen.
Die mRNA, die für die Thyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, ist auch in den jeweiligen Gesamt-mRNAs der humanen akut-myeloischen Leukämie-Zelllinie KG1a (siehe Blood 62: 709, 1983), der aus humanem Nabelschnurblut etablierten Zelllinie KMT-2 (siehe Blood 76: 501, 1990), der humanen chronisch-myeloischen Leukämie-Zelllinie K562 (siehe Blood 45: 321, 1975) (ATCC Zugangs-Nr. CCL243) und der vorstehend erwähnten myeloischen Megakaryoblasten Leukämie-Zelllinie UT-7 nachweisbar. Ferner wurde mit Bezug auf die Zelllinien K562 und UT-7 gefunden, dass die Menge der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, zunimmt, wenn sie durch Stimulation mit PMA zur Differenzierung in Megakaryocyten induziert werden.
Deshalb wird angenommen, dass die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, spezifisch in Hirnzellen und Blutzellen produziert wird, und dass die Produktion dieser mRNA in Blutzellen in Übereinstimmung mit der Differenzierung der Blutzellen ansteigt.
Die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, ist in lymphocytischen Zellen nicht nachweisbar, wie z. B. der hepatocellulären Krebszelllinie Hep3B (Nature 282: 615, 1979), der fötalen Lungenfibroblastenlinie MRC-5 (Nature 227: 168, 1970) und der akut-lymphocytischen Leukämiezelllinie MOLT-4 (J. Nat. Cancer Inst. 49: 891, 1972).
Beispiel 9 [Nachweis der Produktion der mRNA, welche für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in peripheren Blutzellen durch das Verfahren der in situ Hybridisierung]
Die mRNA, die in peripheren Blut-Lymphocyten für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, ist wie folgt nachweisbar. Mononukleare Zellen werden durch Verwendung von Ficoll-Paque (Warenzeichen)(hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) aus dem peripheren Blut eines erwachsenen Menschen isoliert. Die isolierten mononuklearen Zellen werden auf einem Objektträger mit Hilfe von Cytospin 3 (hergestellt und vertrieben von Shandon Inc., GB) fixiert. Die mononuklearen Zellen werden für 15 Minuten einer Fixierungsbehandlung mit 4% Paraformaldehyd PBS unterzogen. Anschließend wird der Objektträger mit den darauf fixierten Zellen für 15 Minuten in eine Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA und 10 μg/ml Pronase K, eingetaucht. Die an dem Objektträger fixierten Zellen werden für 15 Minuten einer weiteren Fixierungsbehandlung mit 4% Paraformaldehyd PBS unterzogen, einmal mit PBS gewaschen, für 10 Minuten in 0,2 M HCl eingetaucht, einmal mit PBS gewaschen, und für 1 Minute in 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0) eingetaucht. Anschließend werden die Zellen für 10 Minuten in eine Lösung, enthaltend 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0) und 0,25 Acetaldehyd, eingetaucht und mit PBS gewaschen. Dann werden die Zellen nacheinander für 15 Sekunden in 70% Ethanol, für 15 Sekunden in 80% Ethanol, für 15 Sekunden in 90% Ethanol und für 15 Sekunden in 100 Ethanol eingetaucht, um dadurch die Zellen vollständig zu dehydrieren. Dann werden die dehydrierten Zellen an Luft getrocknet. Alle vorstehend erwähnten Behandlungslösungen wurden vor ihrer Verwendung auf 4°C abgekühlt. Die durch das vorstehende Verfahren fixierten Zellen werden für die in situ Hybridisierung verwendet, welche unten beschrieben wird.
Eine Digoxigenin-markierte RNA-Sonde zur Verwendung bei der in situ Hybridisierung wird auf die folgende Weise hergestellt. Ein SmaI-Fragment der cDNA, die für den gesamten Bereich der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, welches dasselbe Fragment ist, wie das im Northern-Blot in Beispiel 8 verwendete, wird in die SmaI-Stelle des pBluescript mit dephosphorylierten Enden ligiert, um dadurch einen Vector für die in situ Hybridisierung zu erhalten. Der erhaltene Vector wird unter Verwendung einer Plasmidreinigungssäule (hergestellt und vertrieben von QUIAGEN, Deutschland) gereinigt, und mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut. Aus den durch den Verdau erhaltenen Nucleotidfragmenten werden eine nicht-codierende RNA-Sonde und eine codierende RNA-Sonde (als Kontrolle) zum Nachweis der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, unter Verwendung von T3- oder T7-RNA-Polymerase und DIG RNA-Markierungskit (hergestellt und vertrieben von Boehringer-Mannheim GmbH, Deutschland) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung hergestellt. Diese Sonden werden für den Nachweis der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung in peripheren mononuklearen Blutzellen codiert, verwendet.
Eine Hybridisierungslösung [enthaltend 50% Formamid, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 200 μg/ml tRNA, 1-fache Denhardt's-Lösung, 10% Dextransulfat, 600 mM NaCl, 0,25 SDS und 1 mM EDTA (pH 8,0)] wird erhitzt auf und für 10 Minuten bei 85°C gehalten. Die codierenden RNA-Sonden und die nicht-codierenden RNA-Sonden werden individuell zu der erhitzten Lösung zugegeben, so dass die Konzentration von jeder der RNA-Sonden 10 μg/ml beträgt, und jede der resultierenden Mischungen wird für weitere 3 Minuten bei 85°C gehalten, um dadurch die RNA-Sonden zu denaturieren. Die resultierenden Hybridisierungslösungen, enthaltend die denaturierten RNA-Sonden, werden individuell, tropfenweise zu den oben erwähnten luftgetrockneten Zellen auf dem Objektträger zugegeben. Die Zellen werden mit Parafilm abgedeckt und bei 50°C für 16 Stunden stehen gelassen, um dadurch eine Hybridisierung auszuführen.
Nach Beendigung der Hybridisierung werden die Zellen auf dem Objektträger bei 50°C in 5 × SSC eingetaucht, um dadurch den Parafilm von den Zellen zu entfernen, und dann für 30 Minuten bei 60°C in eine Mischung aus 2 × SSC und 50% Formamid eingetaucht. Dann werden die Zellen für 10 Minuten bei 37°C in eine Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 500 mM NaCl und 1 mM EDTA, eingetaucht, für 30 Minuten bei 37°C in eine Lösung eingetaucht, wobei die Lösung hergestellt wurde, indem RNase A zu derselben oben erwähnten Lösung zugegeben wird, so dass die Konzentration von RNase A 20 μg/ml beträgt, und ferner für 10 Minuten bei 37°C in dieselbe Lösung wie oben erwähnt, welche keine RNase A enthält, eingetaucht. Dann werden die Zellen für 20 Minuten bei 50°C in 2 × SSC eingetaucht, und ferner zweimal für 20 Minuten bei 50°C in 0,2 × SSC eingetaucht, um dadurch die Zellen zu waschen.
Zellen, die die mRNA enthalten, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, werden unter Verwendung eines DIG Nucleinsäureassaykits, enthaltend einen mit alkalischer Phosphatase markierten DIG Antikörper (hergestellt und vertrieben von Boehringer-Mannheim GmbH, Deutschland) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung gefärbt. Ferner werden die Zellen auch mit Hematoxylin gefärbt, um dadurch die Zellen, die die mRNa enthalten, morphologisch zu identifizieren. Folglich wird bestätigt, dass die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, in einer großen Menge in lymphocytischen Zellen produziert wird.
Um die lymphocytischen Zellen, die die mRNA enthalten, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, präziser zu identifizieren, werden humane mononukleare periphere Blutzellen gefärbt, wobei individuell FITC-markierter anti-CD3 Antikörper (Leu 4, hergestellt und vertrieben von BECTON DICKINSON AND COMPANY, USA), FITC-markierter anti-CD19 Antikörper (Leu 12, hergestellt und vertrieben von BECTON DICKINSON AND COMPANY, USA) und FITC-markierter anti-CD56 Antikörper (Leu 19, hergestellt und vertrieben von BECTON DICKINSON AND COMPANY, USA) verwendet wird, wobei diese Antikörper fähig sind, spezifisch mit einer T-Zelle, einer B-Zelle bzw. einer NK-Zelle zu reagieren. Die gefärbten mononuklearen Zellen werden durch Verwendung des Durchflusscytometers EPICS Elite (hergestellt und vertrieben von Coulter Corp., GB) gemäß dem Typ des Antikörpers, mit dem die Zellen reagiert haben, in drei Gruppen eingeteilt. In Bezug auf die drei Zellgruppen wird das Vorhandensein oder die Abwesenheit der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, durch das oben beschriebene Verfahren geprüft. Als ein Ergebnis wird gefunden, dass etwa 5% bis 20% der Zellen, welche mit anti-CD3 Antikörper reagiert haben, und etwa 30% bis 70% der Zellen, welche mit anti-CD56 Antikörper reagiert haben, die mRNA enthalten, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, wohingegen nahezu alle Zellen, welche mit anti-CD19 Antikörper reagiert haben, die mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, nicht enthalten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung eine wichtige Rolle in der Differenzierung, Proliferation und Funktion von T-Zellen und NK-Zellen spielt.
Beispiel 10 [Herstellung eines transformierten Zellstamms, der das Tyrosinkinase-Gen der vorliegenden Erfindung darin eingeführt hat]
DNAs, die die Sequenzen von SEQ ID NOs. 9 bzw. 10 haben, werden individuell durch das PCR-Verfahren synthetisiert, basierend auf der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 11, d. h. des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung. Ein früher Promotor des SV40-Virus wird stromaufwärts von jeder der synthetisierten DNAs ligiert und ein Stop-Codon (TGA in der DNA-Sequenz), ein poly(A)⁺-Signal des SV40-Virus und das Gen der Dihydrofolsäurereduktase werden in dieser Reihenfolge stromabwärts von jeder der synthetisierten DNAs ligiert, um dadurch Plasmidexpressionsvectoren zur Verwendung bei der Produktion der Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs. 4 bzw. 5, herzustellen.
Jedes der hergestellten Plasmide wird gereinigt. 20 μg von jedem der gereinigten Plasmide wird individuell in CHO-Zellen, suspendiert in einer Glucoselösung, eingeführt. Das Einführen der Plasmide in die CHO-Zellen wird durch Anlegen einer Spannung von 600 V an die Zellsuspension unter Verwendung eines Gene-Pulser (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) ausgeführt. Die so behandelten CHO-Zellen werden für 2 Tage in einem Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, kultiviert. Dann werden die CHO-Zellen in einem Medium [Dulbecco's MEM, enthaltend 10% dialysiertes fötales Kälberserum und Methotrexat (MTX)] weiter kultiviert, um dadurch Zellen auszuwählen, welche transformiert worden sind. Die mRNA wird aus den ausgewählten Zellen extrahiert, und poly(A)⁺RNA wird durch Verwendung einer Oligo-dT-Gelsäule aus der mRNA isoliert. Ein Filter zur Verwendung im Northern-Blot wird hergestellt, indem die poly(A)⁺RNA gemäß dem in Beispiel 8 gezeigten Verfahren verwendet wird. Unter Verwendung des Filters wird der Northern-Blot auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 ausgeführt, um dadurch das Vorhandensein der mRNA, die für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, zu bestätigen. Folglich wird bestätigt, dass die transformierten Zellen fähig sind, die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu produzieren.
DNAs mit den Sequenzen von SEQ ID NOs. 6, 7 bzw. 8 werden individuell hergestellt, indem das PCR-Verfahren verwendet wird. Jede der hergestellten DNAs wird individuell in die SmaI-Restriktionsschnittstelle eines pGEX-4T-2 Expressionsvectors (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), welcher für die Produktion eines fusionierten Proteins, enthaltend Glutathion S Transferase, verwendet werden kann, ligiert, um dadurch Plasmidexpressionsvectoren zu erhalten, die für die Produktion der Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenzen SEQ ID NOs. 1, 2 bzw. 3, verwendet werden können. Jeder der so erhaltenen Plasmidexpressionsvectoren, die jeweils die Sequenzen von SEQ ID NOs. 6, 7 bzw. 8 enthalten, wird individuell in E. coli Stamm DH5α eingeführt, und die resultierenden Zellen werden auf einem Selektionsmedium, enthaltend Ampicillin, kultiviert, um dadurch transformierte Zellstämme auszuwählen, die jeweils die oben erwähnten Plasmidexpressionsvectoren besitzen.
Beispiel 11 [Produktion des Tyrosinkinase-Peptids der vorliegenden Erfindung]
Zunächst wird ein polyklonaler Antikörper, der für die Bestätigung der Produktion des Tyrosinkinase-Peptids der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, wie folgt produziert. Es wird ein Peptid synthetisiert, welches eine solche Struktur hat, dass Cystein an den N-Terminus eines Peptids, enthaltend die Aminosäuren 488 bis 507 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 5 (wobei die Aminosäuresequenz 488–507 von SEQ ID NO. 5 dem C-terminalen Teil der Aminosäuresequenz entspricht, die aus der Nucleotidsequenz des Tyrosinkinase-Gens der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist) gebunden wird. Präzise wird ein Peptid mit der Aminosäuresequenz: Cys Pro Ala Ser Val Ser Gly Gln Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ser Pro Arg Ser Gln Glu Pro mit Hilfe eines Peptidsynthesizers synthetisiert. Das erhaltene Peptid wird durch eine Thiolgruppe mit KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gekuppelt, wodurch ein KLH-gekuppeltes Peptid erhalten wird. Das KLH-gekuppelte Peptid wird als ein Immunogen verwendet. Präzise wird das KLH-gekuppelte Peptid mit Freund's Adjuvans gemischt, und ein Kaninchen wird mit der resultierenden Mischung immunisiert. Aus dem immunisierten Kaninchen wird Antiserum erhalten.
Jeder der in Beispiel 10 erhaltenen transformierten Zellstämme, der jeweils die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs. 4 bzw. 5 produzieren kann, wird individuell mit RIPA-Puffer [enthaltend 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdeoxycholat, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM PMSF und 0,2 U/ml Aprotinin] in Lösung gebracht, und der Proteingehalt der Zelle wird quantitativ bestimmt. Dann wird das aus der Zelle stammende Protein einer thermischen Denaturierung mit SDS und dann einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Protein auf einen PVDF-Filter (hergestellt und vertrieben von Bio-Rad Laboratories, USA) geblottet, und der resultierende Filter mit dem geblotteten Protein wird mit jedem oben erwähnten Antiserum und Serum, das vor der Immunisierung aus dem Kaninchen erhalten wurde, individuell umgesetzt, und dann mit einem Peroxidase-markierten monoklonalen Maus-Antikörper gegen Kaninchen-Antikörper umgesetzt. Anschließend kann das auf den Filter geblottete Protein, welches mit dem Peroxidase-markierten monoklonalen Antikörper umgesetzt worden ist, mit Hilfe eines ECL-Western-Blot-Nachweissystems (hergestellt und vertrieben von Amersham International, GB) Fluoreszenz emittieren und die Fluoreszenz wurde auf einem photosensitiven Film aufgenommen, wodurch das Protein nachgewiesen wird. Durch den Vergleich der Ergebnisse, die bezüglich des Antiserums erhalten werden, mit den Ergebnissen, die bezüglich des Serums vor der Immunisierung erhalten werden, wird bestätigt, dass das Tyrosinkinase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung produziert worden ist und ein Molekulargewicht von etwa 55 Kilodalton hat.
Die in Beispiel 10 erhaltenen Zellstämme, die jeweils die Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID NOs. 1, 2 bzw. 3 produzieren können, werden individuell in einem Flüssigmedium für E. coli, welches Ampicillin enthält, angeimpft und über Nacht inkubiert. Anschließend werden die inkubierten Zellen mit demselben Flüssigmedium 10-fach verdünnt und für weitere 2 Stunden inkubiert, und IPTG wird dazu zugegeben, so dass die Endkonzentration von IPTG 1 mM beträgt, wodurch die Produktion des Proteins induziert wird, gefolgt von einer Inkubation für 5 Stunden. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und in PBS, enthaltend 1% Triton X-100, suspendiert. Die suspendierten Zellen werden mit Hilfe einer Ultraschall-Zellaufschlussvorrichtung (hergestellt und vertrieben von Taitec Corporation, Japan) unter Eiskühlung aufgeschlossen, und die aufgeschlossenen Zellen werden einer Zentrifugation unterzogen, wodurch ein Überstand erhalten wird. Der Überstand wird auf dieselbe Weise wie vorstehend erwähnt einem SDS-PAGE unterzogen, wodurch ein Protein erhalten wird. Das erhaltene Protein wird auf einem PVDF-Filter geblottet und mit einem anti-GST-Ziegenantikörper (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) umgesetzt und ferner mit einem Peroxidase-markierten Kaninchen-Antikörper gegen Ziegen-Antikörper umgesetzt, und der Nachweis des Proteins wird auf dieselbe Weise wie oben erwähnt unter Verwendung des ECL Western-Blot-Nachweissystems ausgeführt. Folglich wird bestätigt, dass die Zellstämme ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 33 Kilodalton und einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 1, ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 35 Kilodalton und einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 2 bzw. ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 63 Kilodalton und einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3 produziert haben. Danach werden diese mit GST-fusionierten drei Typen von Tyrosinkinase-Peptiden von den aufgeschlossenen Zellen unter Verwendung einer Glutathion-Sepharosesäule (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) gemäß der der Säule beiliegenden Anleitung abgetrennt und gereinigt. Die so erhaltenen gereinigten Peptide werden einem SDS-PAGE und einer Coomassie-Färbung unterzogen, um dadurch die jeweiligen Molekulargewichte von diesen Peptiden, bestimmt durch den vorstehenden Western-Blot, zu bestätigen.
Beispiel 12 [Bestätigung der Enzymaktivität der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung]
Jeder der in Beispiel 10 erhaltenen transformierten Zellstämme, der jeweils Polypeptide mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs. 4 bzw. 5 produzieren kann, wird individuell in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gegeben, und RIPA-Puffer wird zu den Zellen zugegeben, um die Zellen dadurch in Lösung zu bringen. Protein G-Sepharosegel (hergestellt und vertrieben von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) wird zu den in Lösung gebrachten Zellen zugegeben, und die resultierende Mischung wird sanft bei 4°C über Nacht gerührt, um dadurch eine Umsetzung zu bewirken. Anschließend wird die resultierende Reaktionsmischung einer Zentrifugation unterzogen, wodurch das Protein G-Sepharosegel und Substanzen, welche unspezifisch mit dem Protein G reagiert haben, präzipitieren, gefolgt von der Entfernung derselben. So wird eine aufgeschlossene Zellsuspension erhalten, die das Tyrosinkinase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält. Der in Beispiel 11 erhaltene polyklonale anti-Tyrosinkinase-Antikörper wird zu der aufgeschlossenen Zellsuspension zugegeben, und eine Umsetzung wird bei 4°C für 1 Stunde ausgeführt. Anschließend wird Protein G Sepharose dazu zugegeben und sanft bei 4°C für 1 Stunde gerührt, um dadurch eine Umsetzung zu bewirken. Dann wird eine Zentrifugation ausgeführt, um das Protein G Sepharosegel, welches die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung adsorbiert hat, als eine präzipitierte Fraktion abzutrennen. Die abgetrennte Fraktion wird mit dem oben erwähnten RIPA-Puffer gewaschen, und dann auf die gleiche Weise, wie vorstehend beschrieben, einer Zentrifugation unterzogen. Dieser Arbeitsgang wird dreimal ausgeführt. So wird das Tyrosinkinase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung, welches an Protein G Sepharosegel adsorbiert worden ist, erhalten.
Mit Bezug auf jedes oben erhaltene an das Gel adsorbierte Tyrosinkinase-Polypeptid und das in Beispiel 11 erhaltene Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3, wird die Enzymaktivität der Tyrosinkinase unter Verwendung eines Tyrosinkinase-Assaykits, der von einem nicht-radioaktiven Typ ist (hergestellt und vertrieben von Boehringer-Mannheim GmbH, Deutschland), bewertet. Der Assay wird gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung ausgeführt. Folglich wird bestätigt, dass beide Polypeptide die Enzymaktivität von Tyrosinkinase haben.
Beispiel 13 [Screenen chemischer Substanzen durch Verwendung der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung]
Unter Verwendung des Tyrosinkinase-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, welches durch das in Beispiel 12 beschriebene Verfahren gereinigt worden ist, und das Tyrosinkinase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung, welches durch das in Beispiel 11 beschriebene Verfahren gereinigt worden ist, wird mit Bezug auf Kulturüberstände von verschiedenen Actinomyceten-Zelllinien eine Substanz mit der Fähigkeit gesucht, die Tyrosinkinase-Aktivität der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu inhibieren, unter Verwendung der vorstehend erwähnten Fähigkeit als ein Nachweiskriterium, und die gefundene Substanz wird aus dem Kulturüberstand isoliert und gereinigt, und identifiziert.
Präzise werden etwa 1.000 Actinomyceten-Zelllinien individuell kultiviert, um Kulturüberstände zu erhalten. Die Überstände werden individuell einer Filtration unterzogen, um Filtrate zu erhalten, und zu jedem Überstand wird das gleiche Volumen an Butylacetat zugegeben, um dadurch eine Extraktion zu bewirken. Die extrahierten 1.000 Substanztypen werden individuell in vacuo getrocknet, um die Substanzen in einer Pulverform zu erhalten.
Substanzen, welche Tyrosinkinase-Aktivitäten inhibieren, werden aus den oben erhaltenen pulverigen Substanzen durch ein Untersuchungsverfahren gescreent, in welchem der in Beispiel 12 beschriebene Tyrosinkinase-Assaykit und eines der Polypeptide mit den jeweiligen Seqenzen von SEQ ID NOs. 4 bzw. 5 verwendet werden, um Substanzen herauszufinden, welche die mit Bezug auf das Tyrosinkinase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung gemessene Absorption verringern. Anschaulicher, die erhaltenen 1.000 unterschiedlichen pulverigen Substanzen werden mit Bezug auf die Fähigkeit untersucht, die Absorption um 30% oder mehr zu verringern, basierend auf der Absorption, wie sie mit Bezug auf das Tyrosinkinase-Polypeptid ohne Zugabe der pulverigen Substanz gemessen wurde, zu verringern. Als ein Ergebnis werden etwa 50 unterschiedliche pulverige Substanzen gefunden, die diese Fähigkeit haben.
Von diesen Substanzen wird eine pulverige Substanz ausgewählt und Aliquots der ausgewählten pulverigen Substanz werden in Chloroform, Methanol bzw. destilliertem Wasser gelöst. Die resultierenden Lösungen werden individuell einer Filtration unterzogen, und die resultierenden Filtrate werden individuell in vacuo getrocknet, um dadurch pulverige Materialien zu erhalten. Jedes der erhaltenen pulverigen Materialien wird auf die gleiche Weise wie oben erwähnt untersucht und, folglich wird bestätigt, dass das pulverige Material, das aus den Methanollöslichen stammt, eine inhibitorische Aktivität für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung hat. Die Methanollöslichen werden in einer Säule mit reverser Phase durch Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie fraktioniert. Ein Peak von jeder von diesen Fraktionen wird unter Verwendung eines Fraktionensammlers gesammelt. Jede der gesammelten Fraktionen wird auf die gleiche Weise wie vorstehend erwähnt weiter untersucht und, als ein Ergebnis wird gefunden, dass eine der Fraktionen eine inhibitorische Aktivität für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung hat. Die Fraktion wird in vacuo getrocknet, um dadurch ein Pulver zu erhalten, und das Pulver wird durch Massenspektrometrie, NMR und IR analysiert. Als ein Ergebnis wird gefunden, dass die Molekularformel der Substanz der obigen Fraktion C₉H₉NO₃ ist. Wenn eine Datenbank chemischer Substanzen durchsucht wird, um die Substanz, basierend auf den durch NMR erhaltenen chemischen Verschiebungen und den durch IR erhaltenen Spektren, zu identifizieren, wird gefunden, dass die Substanz mit Erbstatin (siehe Umezawa et al., J. Antibiot. 39: 170, 1986) identisch ist. Erbstatin ist als ein spezifischer Inhibitor für eine Tyrosinkinase bekannt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren zum Screenen chemischer Substanzen unter Verwendung der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung effektiv ist für den Nachweis nützlicher chemischer Substanzen mit der Fähigkeit, Tyrosinkinaseaktivität zu inhibieren oder zu aktivieren.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft zum Screenen chemischer Substanzen, die die Aktivität haben, die Tyrosinkinase-Aktivität von wenigstens der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu regulieren, verwendet werden. Ferner kann die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung und das für diese codierende Gen vorteilhaft zur Abschätzung oder Steuerung der Differenzierung von Blutzellen verwendet werden. Das Gen, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, kann für die Bewertung verschiedener Arzneimittel und zur Kultivierung von Blut-Stammzellen, ohne eine Differenzierung derselben hervorzurufen, verwendet werden. Ferner wird erwartet, dass das Gen, das für die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung codiert, zur Entwicklung eines carcinostatischen Mittels und für Gentherapie verwendet werden kann.
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität, umfassend eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5.
Isolierte Desoxyribonucleinsäure, die für ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst.
Replizierbares recombinantes DNA-Molekül, umfassend einen replizierbaren Expressionsvector und, funktional in den Vector insertiert, eine Desoxyribonucleinsäure, die für ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst.
Mikroorganismus oder Tierzelle, transformiert mit einem replizierbaren recombinanten DNA-Molekül, umfassend einen replizierbaren Expressionsvector und, funktional in den Vector insertiert, eine Desoxyribonucleinsäure, die für ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst.
Verfahren zum Screenen einer chemischen Substanz auf Aktivität zur Regulation der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 4 oder SEQ ID NO. 5 umfasst, welches die folgenden Schritte umfasst: (i) das Messen der Tyrosinkinase-Aktivität eines Polypeptids, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4 und 5; (ii) das Kontaktieren eines Probenmaterials, das die chemische Substanz umfasst mit dem Polypeptid; (iii) das Messen der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids in der Gegenwart des Probenmaterials; (iv) das Bewerten der Aktivierung oder Inhibition der Tyrosinkinase-Aktivität des Polypeptids durch das Probenmaterial, wobei die Aktivierung oder Inhibition als die Differenz zwischen den jeweiligen in Schritten (i) und (iii) gemessenen Tyrosinkinase-Aktivitäten angezeigt wird; und (v) das Isolieren der chemischen Substanz, die die Aktivität zur Regulation der Tyrosinkinase-Aktivität hat, aus dem Probenmaterial.
Antikörper, welcher spezifisch ein Polypeptid mit Tyrosinkinase-Aktivität erkennt, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 4 oder SEQ ID No. 5 umfasst.