DE69732228T2

DE69732228T2 - Die p110-delta katalytische untereinheit der phosphatidylinositol-3-kinase

Info

Publication number: DE69732228T2
Application number: DE69732228T
Authority: DE
Inventors: H. David CHANTRY; F. Merl HOEKSTRA; A. Douglas HOLTZMAN
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1996-11-25
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2017-11-26
Also published as: EP0891428B1; US5985589A; CA2243944A1; AU5458798A; EP0891428A1; US5858753A; US5882910A; ATE286980T1; DK0891428T3; EP1522584A3; ES2236834T3; PT891428E; WO1998023760A1; DE69732228D1; JP2000505653A; EP1522584A2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Identifizierung und Isolierung einer neuen Lipidkinase, und insbesondere die Entdeckung einer neuen katalytischen Untereinheit im Zusammenhang mit einer Phosphatidylinositol-3-Kinase, hier als p110δ bezeichnet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Eine Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3-Kinase) wurde ursprünglich als eine Aktivität identifiziert, die mit viralen Onkoproteinen und Wachstumsfaktorrezeptor-Tyrosinkinasen, die Phosphatidylinositol (PI) und phosphorylierte Derivate von PI an der 3'-Hydroxygruppe des Inositolrings phosphoryliert, im Zusammenhang steht [Panayotou et al., Trends in Cell Biol. 2: 358–360 (1992)]. Die erste Reinigung und molekulare Klonierung einer PI3-Kinase ergab, daß es sich um ein Heterodimer handelt, das aus p85- und p110-Untereinheiten besteht [Otsu et al., Cell 65: 91–104 (1992); Hiles et al., Cell 70: 419–429 (1992)).
Die p85-Untereinheit wirkt, um die PI3-Kinase in der Plasmamembran zu lokalisieren durch die Interaktion ihrer SH2-Domaine mit phosphorylierten Tyrosinresten (die in einem entsprechenden Sequenzkontext vorhanden sind) in Zielproteinen [Rameh et al., Cell 83: 821–830 (1995)]. Es sind zwei Isoformen von p85 identifiziert worden, p85α, die ubiquitär exprimiert wird, und p85β, die vorrangig im Gehirn und in lymphoiden Geweben aufgefunden wird [Volinia et al., Oncogene 7: 789–793 (1992)].
Die p110-Untereinheit enthält die katalytische Domäne der PI3-Kinase, und es sind bisher drei Isoformen (α, β und γ) von p110 identifiziert worden. p110α und β assoziieren mit p85, während p110γ, die durch G-Protein-βγ-Untereinheiten aktiviert wird, dies nicht tut [Stoyanov et al., Science 269: 690–693 (1995)]. Die Klonierung von p110γ zeigte eine zusätzliche Komplexität innerhalb dieser Familie von Enzymen. p110γ ist eng verwandt mit p110α und β (45–48% Identität in der katalytischen Domäne), macht jedoch keinen Gebrauch von p85 als von p85 als einer zielenden Untereinheit, statt dessen enthält p110γ eine zusätzliche Domäne, die als Pleckstrin-Homologie-Domäne bezeichnet wird, in der Nähe ihres Aminoterminus. Diese Domäne ermöglicht eine Interaktion mit den βγ-Untereinheiten von heterotrimeren G-Proteinen, und es scheint, daß es diese Interaktion ist, die ihre Aktivität reguliert [Stoyanov et al., 1995]. Folglich werden PI3-Kinasen durch ihre Aminosäureidentität oder ihre Aktivität definiert. Zusätzliche Mitglieder dieser wachsenden Gen-Familie schließen weiter entfernt verwandte Lipid- und Proteinkinasen ein, einschließlich Vps34, TOR1 und TOR2 von Saccharomyces cerevisiae (und ihre Säugetier-Homologe, wie etwa FRAP und mTOR), das Ataxia telangiectasia-Genprodukt und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase. [Siehe allgemein den Überblick von Hunter, Cell 83: 1–4 (1995)].
Die Menge an Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphophat (PIP₃), dem Primärprodukt einer PI3-Kinase-Aktivierung, nimmt nach Behandlung von Zellen mit einer breiten Vielfalt von Agonisten zu. Es wird deshalb angenommen, daß eine PI3-Kinase-Aktivierung an einer Reihe zellulärer Antworten, einschließlich Zellwachstum, Differenzierung und Apoptose, beteiligt ist [Parker et al., Current Biology 5: 577–579 (1995); Yao et al., Science, 267: 2003–2005 (1995)]. Die stromabwärts gelegenen Ziele der phosphorylierten Lipide, die im Anschluß an eine PI3-Kinase-Aktivierung erzeugt werden, sind nicht gut charakterisiert worden. In vitro werden einige Isoformen der Proteinkinase C (PKC) direkt durch PIP₃ aktiviert, und es ist gezeigt worden, daß die PKC-verwandte Proteinkinase PKB durch die PI3-Kinase mittels eines bisher unbestimmten Mechanismus aktiviert wird [Burgering and Coffer, Nature 376: 599–602 (1995)].
Es scheint auch, daß die PI3-Kinase an einer Reihe von Aspekten der Leukozytenaktivierung beteiligt ist. Es ist gezeigt worden, daß eine p85-assoziierte PI3-Kinase-Aktivität physikalisch mit der zytoplasmatischen Domäne von CD28, einem für die Aktivierung von T-Zellen als Antwort auf ein Antigen wichtigen co-stimulatorischen Molekül, assoziiert ist [Pages et al., Nature 369: 327–329 (1994); Rudd, Immunity 4: 527–534 (1996)]. Eine Aktivierung von T-Zellen durch CD28 erniedrigt den Schwellenwert für eine Aktivierung durch ein Antigen und steigert das Ausmaß und die Dauer der proliferativen Antwort. Diese Wirkungen sind mit Steigerungen der Transkription einer Reihe von Genen, einschließlich dem T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin 2 (IL-2), verknüpft [Fraser et al., Science 251: 313–316 (1992)]. Eine Mutation von CD28, derart, daß das Molekül nicht länger mit PI3-Kinase interagieren kann, führt dazu, daß das Auslösen einer IL-2-Produktion versagt, was eine entscheidende Rolle der PI3-Kinase bei der T-Zell-Aktivierung nahelegt [Pages et al. 1994]. Auf der Grundlage von Studien, welche den PI3-Kinase-Inhibitor Wortmannin verwenden, gibt es einen Hinweis darauf, daß die PI3-Kinase(n) auch für einige Aspekte der Leukozyten-Signaltransduktion über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erforderlich ist/sind [Thelen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 4960–4964 (1994)].
Deshalb besteht auf dem Fachgebiet eine Notwendigkeit für weitere Einblicke in die Natur, Funktion und Verteilung der PI3-Kinase fort, wodurch Mittel zum Bewirken einer vorteilhaften Modulation von PI3-Kinase-Wirkungen verfügbar werden.
In Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid verfügbar gemacht, das die Aminosäuresequenz von p110δ, dargestellt in SEQ ID NO: 2, kodiert. Die vorliegende Erfindung macht weiterhin einen Vektor verfügbar, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung umfaßt, zusammen mit einer Wirtszelle, die damit stabil transformiert oder transfiziert worden ist. In einem weiteren Aspekt wird ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid verfügbar gemacht, das die p110δ-Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfaßt. Es wird auch ein Antikörper, der spezifisch mit dem Polypeptid der vorliegenden Erfindung immunreaktiv ist, und eine Hybridomzellinie, die einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung exprimiert, verfügbar gemacht.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht neue gereinigte und isolierte Polynukleotide (d.h. DNA und RNA, sowohl Sinn-(„sense") als auch Antisinn-(„antisense")Stränge) verfügbar, die ein bisher unbekanntes katalytisch wirksames Mitglied der PI3-Kinase-Familie kodieren, bezeichnet als p110δ, das vorrangig in Leukozyten expremiert wird und deshalb wahrscheinlich eine Rolle bei der PI3-Kinase-vermittelten Signaltransduktion im Immunsystem spielt. Bevorzugte DNA-Sequenzen der Erfindung schließen genomische und cDNA-Sequenzen ebenso wie vollständig oder teilweise chemisch synthetisierte DNA-Sequenzen ein. Die DNA-Sequenz, die p110δ kodiert, wird in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
Von der Erfindung ebenfalls berücksichtigt werden biologische Replikas (d.h. Kopien von isolierten DNA-Sequenzen, die in vivo oder in vitro hergestellt wurden) von DNA-Sequenzen der Erfindung. Autonom replizierende rekombinante Konstruktionen, wie etwa ein Plasmid und virale DNA-Vektoren, die p110δ-Sequenzen aufgenommen haben, und insbesondere Vektoren, bei denen DNA, die p110δ kodiert, operativ mit einer endogenen oder exogenen Expressionskontroll-DNA-Sequenz und einem Transkriptionsterminator verknüpft ist, werden ebenfalls verfügbar gemacht. Der Fachmann wird die verschiedenen Bestandteile von Vektoren [z.B. ein oder mehrere Promotor(en), ein oder mehrere selektionsfähige(r) Marker, ein oder mehrere Replikationsursprünge, eine oder mehrere multiple Klonierungsstelle(n), etc.], Verfahren zum Manipulieren von Vektoren und die Verwendungen von Vektoren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen (prokaryotisch oder eukaryotisch) sowie das Exprimieren von p110δ der vorliegenden Erfindung verstehen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung sind prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen stabil oder transient mit DNA-Sequenzen der Erfindung auf eine Weise transformiert, welche die Expression von p110δ erlaubt. Wirtszellen, die p110δ oder p110δ gemeinsam mit einem ihrer Bindungspartner exprimieren, können einer Vielfalt von nützlichen Zwecken dienen. Derartige Zellen bilden eine wertvolle Immunogen-Quelle für die Entwicklung von Antikörpersubstanzen, die mit p110δ spezifisch immunreaktiv sind. Wirtszellen der Erfindung sind auch nützlich bei Verfahren zur Herstellung von p110δ im Großmaßstab, wobei die Zellen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen gelassen werden und die gewünschten Polypeptidprodukte aus den Zellen oder aus dem Medium, in dem die Zellen wachsen gelassen werden, durch beispielsweise Immunaffinitätsreinigung isoliert werden.
Wie hier beschrieben, ist p110δ ein Polypeptid, das katalytische Kinaseaktivität besitzt.
In einem Aspekt macht die vorliegende Erfindung p110δ-Polypeptide verfügbar, welche die Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2 umfassen. Die katalytische Domäne des p110δ-Polypeptids (Aminosäurereste 723–1044 von SEQ ID NO: 2) zeigt eine mehr als 72%ige Identität mit der katalytischen Domäne von p110δ. Die Polypeptide dieser Erfindung zeigen mit der katalytischen Domäne von p110β eine Identität von 75% oder mehr.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung macht Polypeptidfragmente oder Analoga von p110δ verfügbar. Die Fragmente von p110δ sind zum Modulieren der Bindung von p110δ und einem Bindungspartner (z.B. p85, Ras und Wachstumsfaktorrezeptoren) nützlich. Analoga sind Polypeptide, bei denen Additionen, Substitutionen, einschließlich konservativen Substitutionen, oder Deletionen bei Aminosäureresten vorgenommen wurden, um die Bindungsaffinität des Analogons oder eines Bindungspartners zu steigern oder zu vermindern. Diese Analoga von p110δ können zum Modulieren (d.h. Blockieren, Hemmen oder Stimulieren) der Interaktion zwischen p110δ und einem Bindungspartner nützlich sein.
Die Polypeptide dieser Erfindung können modifiziert werden, um den Übertritt in die Zelle zu erleichtern, wie etwa durch Konjugation mit einer lipidlöslichen Gruppe. Beispielsweise kann p110δ (oder Fragmente oder Analoga davon) mit Myristinsäure konjugiert werden. Die Peptide können durch Standardtechniken, wie bei Eichholtz et al., J. Biol. Chem. 268: 1982–1986 (1993) beschrieben und hier durch Bezugnahme aufgenommen, mit Myristinsäure versehen werden. Alternativ können die Peptide in Liposomen verpackt werden, die mit Zellmembranen fusionieren können und die Peptide an die Zellen abgeben. Eine Einkapselung der Peptide in Liposomen kann ebenfalls durch Standardtechniken, wie in den US-Patenten Nr. 4,766,046, 5,169,637, 5,180,713, 5,185,154, 5,204,112 und 5,252,263 sowie der PCT-Patentanmeldung Nr. 92/02244 allgemein beschrieben, wobei jedes Dokument hier durch Bezugnahme aufgenommen ist, durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung macht Antikörpersubstanzen verfügbar (z. B. polyklonale und monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, Einzelkettenantikörper, Chimäre Antikörper, CDR-gepfropfte Antikörper, humanisierte Antikörper und derartiges), die speziell mit p110δ immunreaktiv sind. Antikörpersubstanzen können durch Standardtechniken unter Verwendung von isolierter, natürlich vorkommender oder rekombinanter p110δ hergestellt werden. Ein speziell veranschaulichender monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper, der durch die Hybridomzellinie 208F hergestellt wird, die bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, am 8. Oktober 1996 hinterlegt wurde und dem die Zugangsnummer HB12200 zugeordnet wurde. Die Antikörpersubstanzen sind nützlich beim Modulieren (d.h. Blockieren, Hemmen oder Stimulieren) der Bindung zwischen p110δ und ihrem Bindungspartner. Antikörpersubstanzen sind auch nützlich zur Reinigung von p110δ, und sie sind auch nützlich zum Nachweisen und Quantifizieren von p110δ in biologischen Proben durch bekannte im- p110δ in biologischen Proben durch bekannte immunologische Verfahren. Zusätzlich werden Zellinien (z.B. Hybridome) oder Zellinien, die mit rekombinanten Expressionskonstrukten transformiert wurden, die Antikörpersubstanzen der Erfindung herstellen, berücksichtigt.
In einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Identifizieren eines Modulators, der die Kinaseaktivität von p110δ hemmt oder aktiviert, berücksichtigt. In einem bevorzugten Verfahren wird die Kinaseaktivität von p110δ in Gegenwart oder Abwesenheit einer potentiellen Modulatorverbindung bestimmt und verglichen. Eine Reduktion der Kinaseaktivität, die in Gegenwart der Testverbindung beobachtet wird, zeigt, daß die Testverbindung ein Inhibitor ist. Ein Anstieg der Kinaseaktivität, die in Gegenwart der Testverbindung beobachtet wird, zeigt, daß die Testverbindung ein Aktivator ist.
In einem weiteren Aspekt macht die Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Modulators verfügbar, der die Bindung von p110δ und einem Bindungspartner (z.B. p85, Ras und Wachstumsfaktorrezeptoren) beeinflußt und dabei die wirksame spezifische subzelluläre Konzentration von p110δ erhöht oder erniedrigt. Bei diesem Verfahren wird p110δ und ihr Bindungspartner in Gegenwart oder Abwesenheit eines putativen Modulators unter Bedingungen, die für eine Bindung geeignet sind, inkubiert. Die beobachtete Bindung in Gegenwart oder Abwesenheit der Modulatorverbindung wird verglichen. Eine Reduktion der beobachteten Bindung zeigt, daß die Verbindung eine Bindung hemmt. Ein Anstieg der beobachteten Bindung zeigt, daß die Verbindung die Bindung verstärkt. Diese Modulatoren sind nützlich zum Beeinflussen der Lokalisation von p110δ an einen spezifischen subzellulären Ort.
Die Erfindung macht weiterhin ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von p110δ in einer biologischen Probe verfügbar. Das Verfahren umfaßt, daß ein p110δ-spezifischer Antikörper einer biologischen Probe, die untersucht werden soll, ausgesetzt wird. Die Bindung des p110δ-spezifischen Antikörpers an p110δ in der biologischen Probe wird durch gut bekannte Mittel nachgewiesen. Beispielsweise wird ein sekundärer Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) konjugiert ist, der anti-p110δ-Antikörper spezifisch erkennt, verwendet, um anti-p110δ-Antikörper nachzuweisen. Eine positive Farbreaktion, die durch HRP katalysiert wird, zeigt, daß p110δ in der biologischen Probe vorhanden ist.
Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung macht ein diagnostisches Reagenz zum Nachweisen des Vorhandenseins von Polynukleotiden verfügbar, die p110δ in biologischen Proben kodieren. Das diagnostische Reagenz ist ein nachweisbar markiertes Polynukleotid, das einen Teil der oder alle Aminosäurereste von p110δ, dargestellt in SEQ ID NO: 2, kodiert. Das Vorhandensein des Polynukleotids in der biologischen Probe wird durch Hybridisierung des Diagnosereagenzes mit dem Polynukleotid, das p110δ kodiert, bestimmt. Beispielhafte biologische Proben schließen Chromosomen und chromosomale DNA ein. Das Diagnosereagenz ist nachweisbar markiert mit gut bekannten Markierungen, einschließlich radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie etwa Avidin/Biotin und Fluoreszenz-Anhängen ("tags"), die in der Lage sind, ein nachweisbares Signal verfügbar zu machen.
Die DNA-Sequenzinformation, die durch die vorliegende Erfindung verfügbar gemacht wird, macht durch homologe Rekombination oder "Knockout"-Strategien [siehe z.B. Capecchi, Science 244: 1288–1292 (1989)] auch die Entwicklung von Säugetieren möglich, welche darin versagen, ein funktionelles p110δ zu exprimieren, oder die eine analoge Variante von p110δ exprimieren. Die nicht-menschlichen Säugetiere der vorliegenden Erfindung umfassen ein gestörtes p110δ-Gen oder ein gestörtes Homolog des p110δ-Gens. Die allgemeine Strategie, die verwendet wird, um die nicht-menschlichen Säugetiere der vorliegenden Erfindung herzustellen, schließt die Herstellung eines zielenden Konstrukts, das DNA-Sequenzen umfaßt, die zu dem endogenen Gen, das gestört werden soll, homolog sind, ein. Das zielende Konstrukt wird dann in nicht-menschliche embryogene Stammzellen (ES-Zellen) eingeführt, wobei es sich in das endogene Gen oder das Homolog davon integriert und dieses stört. Nach einer Selektion von Zellen, welche die gewünschte Störung einschließen, werden die ausgewählten ES-Zellen in einen nicht-menschlichen Embryo im Bastozystenstadium implantiert. Beispielhafte Säugetiere schließen Kaninchen und Nagetierarten ein.
Es wird auch erwartet, daß Polynukleotide der Erfindung bei chromosomalen Lokalisierungsstudien nützlich sind, die potentiell beim Nachweis einer fehlerhaften Expression und/oder Überexpression von p110δ in abnormalen Zelltypen nützlich sind.
Durch die Erfindung ebenfalls verfügbar gemacht werden antisense-Polynukleotide, die für das Regulieren der Expression von p110δ durch solche Zellen, die dasselbe exprimieren, von Bedeutung sind.
Eine Vielzahl zusätzlicher Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung beispielhafter Ausführungen der Erfindung offensichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt einen Abgleich der vorhergesagten katalytischen Domäne von p110δ mit der korrespondierenden Domäne von anderen Mitgliedern der PI3-Kinase-Familie dar. Der Abgleich wurde unter Verwendung von Genworks (Intelligenetics, Inc., Mountain View, CA) durchgeführt.
2 stellt einen Abgleich der vorhergesagten regulatorischen Ras-Region von p110δ mit der korrespondierenden Region anderer Mitglieder der PI3-Kinasefamilie dar. Das konservierte Lysin, das für die Interaktion mit Ras unbedingt erforderlich ist, wird durch das Symbol # unterhalb der Konsensus-Linie angegeben.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Beispiel 1 beschreibt die Klonierung und Charakterisierung von cDNA, die p110δ kodiert. p110δ wurde durch Kombinieren von drei separaten cDNA-Klonen, welche die Vollänge-cDNA von p110δ überspannt, erhalten. Beispiel 2 beschreibt die Expression und die Kinaseaktivität von rekombinanter p110δ. Beispiel 3 beschreibt die Isolierung eines genomischen p110δ-Klons aus der Maus. Eine Baculovirus-Expression von p110δ wird im Beispiel 4 beschrieben. Beispiel 5 bestimmt die Fähigkeit von rekombinanter p110δ, mit p85 in transfizierten Säugetierzellen zu assoziieren. Die Expression von p110δ in verschiedenen menschlichen Geweben wird in Beispiel 6 offenbart. Beispiel 7 macht monoklonale Antikörper, die für p110δ spezifisch sind, verfügbar. Beispiel 8 beschreibt Experimente, die auf die chromosomale Lokalisierung von p110δ gerichtet sind. Beispiel 9 beschreibt Experimente, welche mit der Assoziierung von p110δ und Wachstumsfaktorrezeptoren zusammenhängen. Beispiel 10 diskutiert die Verwen- Beispiel 10 diskutiert die Verwendung von transgenen Tieren, die mit dem Ziel, eine Störung im p110δ-Gens aufzuweisen, entwickelt wurden.
Beispiel 1
Degenerierte Oligonukleotid-Primer wurden zur Verwendung in einer PCR-Reaktion auf der Grundlage von Sequenzen, die in der katalytischen Domäne von bekannten PI3-Kinasen konserviert waren, entworfen. Der sense-Primer wies die Sequenz GCAGAC GGATCCGGIGAYGAYHKIAGRCARGA (SEQ ID NO: 3) auf, welche die Sequenz GDDLRQD (SEQ ID NO: 4) kodiert, und der antisense-Primer wies die Sequenz GCAGACGAATTCRWRICCRAARTCIRYRTG (SEQ ID NO: 5) auf, welche die Aminosäuresequenz HIDFGH (SEQ ID NO: 6) kodiert. Bam HI- und Eco RI-Restriktionsstellen sind unterstrichen. Die PCR-Reaktionsansätze bestanden aus 100 ng cDNA-Matrize [aus humanen periphären Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) die für 18 Stunden mit 10 ng/ml Phorbolmyristat und 250 ng/ml Kalziumionophor (Sigma) aktiviert worden waren], 10 μg/ml Oligonukleotid-Primer, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl pH 8,4, 1,5 mM MgCl₂, 200 mM dNTPs und 1 U Taq-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Die Reaktionen wurden unter Verwendung einer Denaturierung für 1 Minute bei 94°C, einem Abkühlen („Annealing") bei 60°C für 2 Minuten und einer Verlängerung bei 72°C für 1 Minute über 3 Zyklen durchgeführt. Das Verfahren wurde dann unter Verwendung einer Annealing-Temperatur von 56°C über 3 Zyklen, einer Annealing-Temperatur von 52°C über 3 Zyklen und einer Annealing-Temperatur von 50°C über 30 Zyklen wiederholt. Die amplifizierten Produkte wurden auf einem Gel gereinigt, mit Bam HI und Eco RI verdaut und in den Vektor pBSSKII+ (Stratagene, La Jolla, CA) zur Sequenzierung subkloniert. Die gesamte DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard Miniprep DNA Purification System (Promega, Madison, WI) präpariert. Die Sequenzierung wurde mit dem automatischen Sequenziergerät Applied Biosystems Modell 373 durchgeführt. Datenbankrecherchen wurden unter Verwendung des BLAST-Programms durchgeführt, und Protein- und DNA-Abgleiche wurden unter Verwendung des Programms Genworks (Intelligenetics Inc. Mountain View, CA) durchgeführt. Ein Klon enthielt ein 399 bp großes Insert, das ein 133 Aminosäuren großes offenes Leseraster kodierte, das Ähnlichkeit mit p110β zeigte. Dieser Klon war ein Teilklon einer neuen katalytischen Untereinheit der PI3-Kinase, die als p110δ bezeichnet wurde.
Um eine cDNA zu identifizieren, die p110δ kodiert, wurden spezifische Ologonukleotid-Primer auf der Grundlage der Sequenz des 399 bp großen PCR-Produkts entworfen. Der Vorwärts-Primer wies die Sequenz CATGCTGACCCTGCAGATGAT (SEQ ID NO: 7) auf, und der reverse Primer wies die Sequenz AACAGCTGCCCACTCTCTCGG (SEQ ID NO: 8) auf. Diese Primer wurden verwendet, um eine cDNA-Bibliothek von menschlichen PBMC, die mit PMA und Ionomycin (wie oben beschrieben) stimuliert wurden, in dem Säugetier-Expressionsvektor pRcCMV durchzumustern. Aufeinanderfolgende PCR-Runden wurden anfänglich mit Pools von 100 000 Klonen und anschließend mit kleineren Pools durchgeführt, bis ein Einzelklon, der als PBMC Nr. 249 bezeichnet wurde, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung des PCR-Produkts als einer Sonde, das durch Random priming markiert worden war, isoliert wurde. Diese cDNA war keine Vollänge-cDNA. Um längere cDNA-Klone zu identifizieren, wurde deshalb der selbe Ansatz verwendet, um eine cDNA-Bibliothek von menschlichen Makrophagen (ebenfalls in dem Vektor pRcCMV) durchzumustern. Dies führte zur Isolierung eines zusätzlichen cDNA-Klons (M Nr. 928), was die cDNA-Sequenz um 1302 bp verlängerte.
Das verbleibende 5'-Ende der cDNA, welche die p110δ kodierte, wurde durch 5'-RACE-PCR (Clonetech, Palo Alto, CA) erhalten. Zwei genspezifische antisense-Oligonukleotid-Primer wurden auf der Grundlage des 5'-Endes der cDNA M Nr. 928 für RACE-PCR-Reaktionen entworfen. Der primäre RACE-Primer wies die Sequenz GGGCCACATGTAGA GGCAGCGTTCCC (SEQ ID NO: 9) auf, der RACE-Primer für eine „nested PCR" wies die Sequenz GGCCCAGGCAATGGGGCAGTCCGCC (SEQ ID NO: 10) auf. Marathon-RACE-Reaktionen wurden unter Verwendung von einer Marathon-cDNA-Fertigmatrize aus menschlichen Lymphozyten und dem Advantage Core PCR Reaction Kit (Clonetech, Palo Alto, CA) durchgeführt, wobei das Protokoll des Herstellers nachvollzogen wurde. Die Zyklisierungsbedingungen einer „Touchdown-PCR" wurden modifiziert, um die Spezifität der primären Marathon-RACE-PCR-Primärreaktion wie folgt zu verbessern: Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 5 Zyklen einer Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden und Annealing und Verlängerung bei 72°C für 3 Minuten, 5 Zyklen einer Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden und Annealing und Verlängerung bei 70°C für 3 Minuten, und 25 Zyklen einer Denaturierung bei 94°C bei 30 Sekunden und Annealing und Verlängerung bei 68°C für 3 Minuten.
Die amplifizierten Produkte wurden als Matrizen in einer „nested PCR"-Reaktion unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zyklisierungsparameter verwendet. Die amplifizierten Produkte wurden dann durch Southern blotting unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden, die für p110δ spezifisch waren, analysiert. Die Sonden (jeweils 100 ng) wurden mit ³²P-γATP endmarkiert und unter Standardbedingungen hybridisiert und gewaschen (Frisch and Sambrook). Die beiden Sonden wiesen die Sequenzen GATGCGGAACGGCTGCTCCAGGG (SEQ ID NO: 11) und CCAGGGACCACAGGGACACAGAG (SEQ ID NO: 12) auf.
Die spezifischen 5'-RACE-PCR-Produkte, die auf diese Weise identifiziert wurden, wurden auf einem Gel gereinigt und in dem TA-Vektor PCRII (Invitrogen, San Diego, CA) nach Anweisungen des Herstellers subkloniert. Drei unabhängige Klone wurden sequenziert, um die Wahrhaftigkeit der 5'-Sequenz sicherzustellen.
Eine Vollängen-cDNA für p110δ wurde aus den Klonen Nr. 249, M Nr. 928 und den 5'-RACE-PCR-Produkten zusammengesetzt. Das 5'-RACE-Produkt wurde in der PCR als eine Matrize unter Verwendung des 5'-Primers AGTTACGGATCCGGCACCATG (GACTACAAGGACGACGATGACAAG)CCCCCTGGGGTGGACTGCCC (SEQ ID NO: 13) und des 3'-Primers CCACATGTAGAGGCAGCGTTCC (SEQ ID NO: 14) verwendet. Der 5'-Primer schließt eine Bam HI-Stelle (unterstrichen) und Sequenzen, welche die FLAG-Peptidsequenz DYKDDDDK (SEQ ID NO: 15) (dargestellt in Klammern), welche durch den monoklonaren anti-FLAG-Antikörper M2 (Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) erkannt wird, ein. Das sich ergebende PCR-Produkt wurde mit Bam HI und Af1 II verdaut und gemeinsam mit einem Af1/Pvu I-Fragment, das aus dem Klon M Nr. 928 stammte, und einem Pvu II/Xba I-Fragment, das aus dem PBMC-Klon Nr. 249 stammte, in die Bam HI/Xba I-Schnittstellen des Säugetier-Expressionsvektors pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. Der Vektor, welcher die mit FLAG markierte zusammengesetzte p110δ-cDNA enthielt, wird als pcDNA3:p110δFLAG bezeichnet. In dem mit FLAG-markiertem p110δ wird die FLAG-Markierung unmittelbar nach dem Start-Methionin angeordnet.
Eine zusammengesetzte Vollänge-cDNA, die p110δ kodiert, wird in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Sequenz von p110δ schließt ein offenes Leseraster von 3135 Nukleotiden ein, für das vorhergesagt wird, daß es ein Protein von ungefähr 114 kD kodiert. Zusätzlich sind 197 bp einer untranslatierten 5'-Sequenz sowie 1894 bp einer untranslatierten 3'-Sequenz vorhan vorhanden. Die Sequenz um das vorhergesagte Start-Methionin herum stimmt gut mit derjenigen überein, die für einen optimalen Translationsstart erforderlich ist [Kozak, M., J. Cell Biol. 115: 887–992 (1991)], und das Vorhandensein eines Stop-Codons in der untranslatierten 5'-Sequenz stimmt mit der Isolierung der vollständigen kodierenden Region von p110δ überein.
Ein Vergleich der deduzierten Aminosäuresequenz von p110δ (SEQ ID NO: 2) mit anderen PI3-Kinasen zeigt, daß sie am engsten mit p110β verwandt ist. Ähnlich wie 110β wird die katalytische Domäne von p110δ am C-Terminus des Proteins gefunden, und es wird angenommen, daß sie sich innerhalb der Aminosäurereste 723–1044 von SEQ ID NO: 2 befindet. Ein Abgleich der vorhergesagten, carboxyterminalen katalytischen Domänen der PI3-Kinase-Familie (einschließlich der p110δ-Reste 723 bis 1044 in SEQ ID NO: 2) wird in 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt die Identität von p110δ mit anderen Mitgliedern der PI3-Kinase-Familie. p110δ ist in dieser Region zu 72% identisch mit p110β, ist jedoch weniger eng mit p110α (49%) und p110γ (45%) verwandt. Tabelle 1 zeigt auch, daß p110δ eine geringe Identität mit cpk/p170 und dem Hefeprotein Vps 34 zeigt, nämlich 31 bzw. 32%.
TABELLE 1
Eine Dendrogramm-Analyse zeigte, daß p110β und p110δ einen distinkten Unterast der PI3-Kinase-Familie bilden. Das entfernt verwandte ATM-Gen und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase sind zum Vergleich aufgenommen worden.
Es ist gezeigt worden, daß die PI3-Kinase einen wichtiges Zwischenschritt auf dem Ras-Pfad darstellt [Hu et al. 1993; Rodriguez-Viciana et al., EMBO Journal 15: 2442–2451 (1996)]. Es ist gezeigt worden, daß eine konstitutiv aktive Form der PI3-Kinase die Transkription des c- fos-Gens steigert, die Proteinkinase Raf aktiviert und die Oozyten-Reifung stimuliert [Hu et al., 1995]. Die Wirkungen der PI3-Kinase in diesen Systemen können durch Co-Expression einer dominant negativen Form von Ras unterbunden werden, was darauf hinweist, daß die PI3-Kinase stromaufwärts von Ras wirkt. Zusätzliche Studien haben gezeigt, daß Ras physikalisch mit der PI3-Kinase in vitro interagieren und ihre Kinaseaktivität stimulieren kann [Rodriguez-Viciana et al., 1996]. Folglich kann die PI3-Kinase entweder als ein Effektor der Ras-abhängigen Signaltransduktion wirken oder direkt durch eine Interaktion mit Ras aktiviert werden. Eine spezielle Region am Aminoterminus der p110-Untereinheiten, bezeichnet als die Ras-regulatorische Domäne, ist für diese Interaktion verantwortlich [Rodriguez-Viciana et al., 1996]. Ein Vergleich der Sequenz von p110δ mit anderen p110-Untereinheiten zeigt, daß diese Region auch in p110δ, einschließlich einem Lysinrest, für den gezeigt worden ist, daß er für die physikalische Assoziierung mit Ras unbedingt erforderlich ist [Rodriguez-Viciana et al., 1996], konserviert ist. Folglich ist es wahrscheinlich, daß p110δ mit dem Ras-Pfad interagiert. 2 stellt einen Abgleich der vorgeschlagenen Ras-Bindungsstellen von vier p110-Untereinheiten, einschließlich der p110δ-Reste 141 bis 310 von SEQ ID NO: 2 dar.
Beispiel 2
Die mit FLAG markierte p110δ wurde exprimiert, indem pcDNA3:p110δFLAG in COS-Zellen unter Verwendung von DEAE-Dextran transfiziert wurde. Drei Tage nach der Transfektion wurde die Expression von p110δ durch Immunpräzipitationen und Western blotting unter Verwendung des monoklonaren Antikörpers M2 (Kodak Scientific Imaging Systems) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die PI 3-Kinaseaktivität wurde bestimmt, wie beschrieben [Hu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 7677–7688 (1993)].
Um die PI3-Kinaseaktivität von p110δ zu bestimmen, wurden 5 μl immunpräzipitierte p110δ mit 1 μl PI/EGTA gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert [PI/EGTA ist 10 mg/ml PI (Sigma) in CHCl₃, das unter Vakuum getrocknet, in 20 mg/ml DMSO in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen des PI3-Kinase-Inhibitors Wortmannin resuspendiert und 1:10 in 5 mM EGTA verdünnt wurde], und es wurden 1 μl 10 × HM-Puffer (200 mM HEPES pH 7,2, 50 mM MnCl₂), 0,5 μl γ³²P-ATP (10 mCi/ml 300 Ci/mmol), 1 μl 100 μM ATP und 1,5 μl H₂O zugegeben, und der Reaktionsansatz wurde 15 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μl M HCl abge abgestoppt. Die Lipide wurden mit 200 μl CHCl₃/MeOH (1:1) durch Vortexen für 1 Minute, gefolgt von einer Zentrifugation bei 16 000 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Die Lipide wurden weiter mit 80 μl 1 M HCl/MeOH (1:1) durch Vortexen für 1 Minute, gefolgt von einer Zentrifugation bei 16 000 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Die Lipide wurden unter Vakuum getrocknet, in 10 μl CHCl₃/MeOH (1:1) resuspendiert und 2 cm vom unteren Ende einer trockenen Silikagel 60-Chromatographieplatte (VWR) entfernt, die mit 1% K₂C₂O₄ in H₂O vor-imprägniert wurde, aufgetropft. 250 μg rohe Phosphoinositide (Sigma) wurden als Marker aufgetropft. Die Produkte wurden durch Chromatographie für 2 Stunden in CHCl₃/MeOH/4 N NH₄OH (9:7:2) aufgetrennt, die Platten wurden trocknen gelassen und 5 Minuten in einen Tank mit Ioddampf gestellt, um die rohen Standards sichtbar zu machen. Die Position des Standards wurde mit einem Bleistift markiert, und die Platte wurde autoradiographiert.
In den Kinasetests wurden phosphorylierte Lipide erzeugt. Das Hauptprodukt war Phosphatidylinositolphosphat (PIP). Weiterhin wurde die Erzeugung dieser phosphorylierten Lipide dosisabhängig durch Wortmannin gehemmt (bei 100 nM Wortmannin wurden ungefähr 50% der Aktivität gehemmt), was zeigt, daß es sich bei P110δ um eine funktionelle PI3-Kinase handelt.
Beispiel 3
Ein genomischer Klon aus der Maus, der p110δ kodierte, wurde wie unten beschrieben isoliert. Eine genomische 129 SvEv-Bibliothek aus der Maus (Stratagene, La Jolla, CA) wurde unter Verwendung eines Fragments des menschlichen cDNA-Klons für p110δ (entsprechend den Aminosäuren 739 bis 1044 von SEQ ID NO: 2), das mit hoher spezifischer Aktivität (ca. 1 × 10⁹ dpm/μg DNA) durch Random priming unter Verwendung des Random Primed DNA labelling Kit (Boehringer Mannheim) markiert wurde, durchgemustert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42°C in Puffer, der 50% Formamid, 5 × SSC, 5 × Denhardts, 0,05 M Natriumphosphat und 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthielt, durchgeführt. Die Filter wurden in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Ein Einzelklon wurde isoliert. Gereinigte Phagen-DNA wurde mit Not I verdaut, und die Inserts wurden in den Vektor pBSSKII+ (Stratagene, La Jolla, CA) zur Sequenzierung subkloniert. Dieser Klon war ungefähr 16 kb groß und enthielt die gesamte katalytische Region von p110δ.
Beispiel 4
Rekombinante p110δ kann in SF9-Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems exprimiert werden.
Wie in Beispiel 1 diskutiert, sind mit FLAG markierte Sequenzen, die p110δ kodieren, beim Exprimieren der Kinasen dieser Erfindung nützlich. Nach der Expression in den Insektenzellen wird ein monoklonarer Antikörper, der die FLAG-Markierung (Eastman Kodak, Rochester, New York) erkennt, verwendet, um große Mengen des FLAG-PIK-verwandten Kinase-Fusionsproteins zu reinigen. Infizierte Insektenzellen werden 48 Stunden inkubiert und in Lysepuffer (25 mM 2-Glycerinphosphat, 50 mM Natriumphosphat pH 7,2, 0.5% Triton X-100, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 25 mM Natriumfluorid, 100 μM Natriumvanadat, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 1 mM Benzamidin und 2 mM DTT) lysiert. Exprimierte FLAG-Fusionsproteine werden an einer Säule, die anti-FLAG-Antikörper-M2-Affinitätsharz (Eastman Kodak) enthält, gereinigt. Die Säule wird mit 20 Säulenvolumen Lysepuffer, dann 5 Säulenvolumen 0,5 M Lithiumchlorid, 50 mM Tris pH 7,6, 1 mM DTT gewaschen und dann entweder mit 0,1 M Glycin pH 3,0, gefolgt durch sofortige Neutralisierung, oder durch kompetitive Elution mit dem FLAG-Peptid eluiert. Bei Histidin-markierten Proteinen wird Ni-NTA-Agarose (Qiagen) zur Proteinreinigung verwendet.
Plasmide zur Expression von p85 und p110δ im Baculovirus-Expressionssystem wurden wie folgt hergestellt.
Das Plasmid pcDNA3:p85DNA, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde mit Bam HI und EcoRI verdaut, und die 2,5 kb große FLAG-p85-Bande, welche die gesamte p85-kodierende Region mit der FLAG-Markierung enthielt, wurde auf einem Gel gereinigt und in die BamHI-EcoRI-Schnittstelle von pFastbac Dual (Gibco BRL) eingefügt. Die Ligationsmischung wurde in E. coli XL-1 blue (Stratagene) transformiert und auf einer Ampicillin enthaltenden Platte ausplattiert. Ein Klon wurde gereinigt, der das pFastbac Dual-p85-Plasmid trug.
Das pFastbac Dual-p85-Plasmid wurde in E. coli DH 10 Bac-Zellen transformiert, und es wurden weiße Kolonien auf Platten, die Kanomycin, Gentamycin, Tetracyclin, X-Gel und IPTG enthielten, selektiert. Eine weiße Kolonie wurde erneut auf einer ähnlichen Platte zur weiteren Reinigung ausgestrichen. Rekombinante p85-bacmid-DNA wurde aus diesem Klon gereinigt.
Das Plasmid pcDNA3:p110δ, welches die gesamte p110δ-kodierende Region mit der FLAG-Markierung enthielt, wurde mit Bam HI und XbaI verdaut, auf einem Gel gereinigt und in die Bam HI-XbaI-Schnittstelle von pFastbac HTb (Gibco BRL) eingefügt, derart, daß sich die kodierende Region des FLAG-markierten p110δ im Leseraster der kodierenden Sequenzen der Histidin-Markierung, die im Vektor vorhanden war, befand. Die Ligationsmischung wurde dann in E. coli XL-1 blue (Stratagene) transformiert. Ein Klon, der pFast bac Htb p110δ trug, wurde isoliert, und die Plasmid-DNA wurde isoliert, und die Plasmid-DNA wurde gereinigt. Es wurde p110δ-bacmid-DNA durch Transformieren von E. coli DH 10 bac-Zellen, wie für p85-bacmid beschrieben, hergestellt.
Um Virus-Stammansätze herzustellen, wurden das p85-bacmid und die p110δ-bacmid-DNAs getrennt in SF9-Zellen nach dem von Gibco BRL vorgeschlagenen Protokoll transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden das SF9-Zellpellet und das Baculovirus, das durch die transfizierten Zellen hergestellt worden war, geerntet. Das Virus wurde bei 4°C in Grace-Komplettmedium, das 10% FBS, Penicillin-Streptomycin und Gentamycin enthielt, gelagert. Diese Viruspräparation wurde verwendet, um einen Virus-Stammansatz (P2) mit hohem Titer herzustellen. Der P2-Stammansatz wurde verwendet, um eine 50 ml-Kultur von SF9-Zellen zu infizieren. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion gesammelt und bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Zellen ohne Lyse zu pelletieren. Das Zellpellet wurde 24 Stunden vor der Lyse bei –20°C gelagert. Die Zellen wurden in 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl, 1% NP-40; 100 μM PMSF) lysiert. Die Expression von p85 und p110δ wurde durch einen Immuno blot unter Verwendung des anti-FLAG-Antikörpers M2 als einer Sonde bestätigt. Die transfizierten SF9-Zellen erzeugten ein ungefähr 85 kDa großes Protein und ein 110 kDa großes Protein, die mit den anti-FLAG-Antikörpern immunreaktiv waren.
Der P2-Virus-Stammansatz wurde auch verwendet, um eine 2 l-Kultur von SF9-Zellen zu co-infizieren. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion gesammelt, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Zellen ohne Lyse zu pelletieren, und bei –20°C gelagert. Ein Zellpellet aus 150 ml dieser Kultur wurde in 7,5 ml Lysepuffer (50 mM NaPO₄ pH 7,2, 0.5% NP-40, 10 mM Imidazol, 25 mM NaF, 100 μM Na₃VO₄, 0,5 mM AEBSF, 1 μg/ml Leu- μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin A) lysiert und auf Eis 15 Minuten inkubiert. Das Lysat wurde dann 30 Minuten bei 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und jede DNA in dem Lysat, die aus aufgebrochenen Nuklei hervorging, wurde durch Aufziehen durch eine 20 gauge-Nadel geschert. Partikuläres Material wurde dann durch Filtrieren durch ein 0,8 micron-Filter, gefolgt von einem 0,2 micron-Filter entfernt. Das geklärte Lysat wurde dann entsprechend eingestellt, so daß es 5 mM β-Mercaptoethanol und 0,4 M NaCl enthielt. Eine 1 ml-Ni-NTA-Agarose-Säule (Qiagen) wurde in Puffer A (0,4 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,1% Triton X-100, 50 mM NaPO₄, 10 mM Imidazol, 25 mM NaF, 100 μM Na₃VO₄, 0,5 mM AEBSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin A) äquilibriert, bevor sie mit dem geklärten Lysat beladen wurde. Die Probe wurde bei einer Flußrate von 0,25 ml/Minute beladen, mit 5 ml Puffer A gewaschen und dann mit 10 ml eines Gradienten von 50 bis 500 mM Imidazol in Puffer A eluiert.
Beispiel 5
Die Fähigkeit von p110δ, mit p85 zu assoziieren, wurde durch Western blot-Analyse untersucht. COS-Zellen wurden transient mit p110δ (siehe Beispiel 2) transfiziert und die Assoziierung mit endogenem p85 wurde durch Co-Immunpräzipitation bestimmt. Als Kontrollen wurden Zellen auch mit FLAG-markierter p85-DNA oder einem leeren Vektor transfiziert. Die cDNA, welche die p85-Untereinheit kodierte, wurde aus menschlicher Leukozyten-cDNA durch Marathon-RACE-PCR isoliert. Die cDNA-Sequenz von p85 wurde in Otsu, Cell, 65: 91–104 (1992) beschrieben. Die p85-cDNA wurde zur Expression als ein FLAG-markiertes Protein (pcDNA3:p85) auf eine Weise modifiziert, die ähnlich ist, wie hier in den Protokollen für p110δ beschrieben.
COS-Zellen wurden in 3 ml Puffer R (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EGTA, 0,5% NP-40, 0,2 mM Na₃VO₄, 0,2 mM PMSF, 1 × Aprotinin, 1 × Leupeptin, 1 × Pepstatin A) lysiert. Nach 10 Minuten bei 4°C wurden die Lysate geschert, indem sie mehrfach durch eine 27G-Nadel gezogen wurden. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 16 000 × g 10 Minuten bei 4°C geklärt und 2 Stunden bei 4°C mit entweder 1 μg anti-p110β (Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), 1 μg anti-FLAG-M2 (Eastman Kodak) oder 1 μg anti-p85 (Santa Cruz Laboratories) immunpräzipitiert. Immunkomplexe wurden an 60 μl Protein G-Sepharose (Pharmacia) 30 Minuten bei 4°C gebunden, dann 3 mal in 300 μl Puffer R gewaschen und in 25 μl PAN (100 mM NaCl, 100 mM PIPES pH 7,0, 20 μg/ml Aprotinin) resuspendiert. 5 μl von jedem Immunpräzipitat wurden durch 8%ige SDS-PAGE (Novex) aufgetrennt, auf Immobilon-P (Millipore) übertragen, eine Stunde bei Raumtemperatur in 5% fettfreier Trockenmilch in TBS blockiert und durch Western blotting unter Verwendung von entweder polyklonalen anti-p85-Kaninchen-Antikörpern (Santa Cruz Laboratories) in einer Konzentration von 1 μg/ml, gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Boehringer), oder einem monoklonalen anti-FLAG-Antikörper M2 in einer Konzentration von 10 μg/ml, gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (Boehringer), nachgewiesen.
Die Western blots zeigten, daß der anti-FLAG-Antikörper M2 Immunkomplexe einschließlich FLAG-markiertem p85 und FLAG-markiertem p110δ erkannte.
Beispiel 6
Während die Aktivierung der PI3-Kinase in einer großen Anzahl von biologischen Systemen ausführlich untersucht worden ist, ist im Hinblick auf die Zelltyp-spezifische Expression von speziellen p110-Isoformen wenig bekannt. Die Expression von p110δ in Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur, Niere, Pankreas, Milz, Thymus, Prostata, den Testes, Uterus, Dünndarm, Kolon und den PBMC des Menschen wurde durch Northern blot-Analyse bestimmt.
³²P-markierte cDNA-Sonden wurden durch PCR unter Verwendung von 10 ng einer Plasmid-DNA-Matrize, die p110δ kodierte, hergestellt, wie früher beschrieben [Godiska et al, J. Neuroimmun. 58: 167–176 (1995)]. Der Vorwärts-Primer wies die Sequenz CTGCCATGTTGCTCTTGTTGA (SEQ ID NO: 16) auf, und der reverse Primer wies die Sequenz GAGTTCGACATCAACATC (SEQ ID NO: 17) auf. Die Reaktionsansätze wurden 4 Minuten bei 94°C erhitzt, gefolgt durch 15 Zyklen einer Denaturierung für eine Minute bei 94°C, einem Annealing für eine Minute bei 55°C und einer Verlängerung für 2 Minuten bei 72°C.
Nicht eingebaute Nukleotide wurden entfernt, indem der Reaktionsansatz über eine Sephadex G50-Säule (Boehringer Mannheim Biochemicals) geschickt wurde. Ein Multiple Tissue Northern Blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit der Sonde behandelt und unter stringenten stringenten Bedingungen nach den Empfehlungen des Herstellers gewaschen. Die Autoradiographie wurde 1–4 Tage bei –80°C Intensivierungsschirmen ausgesetzt.
Die Northern blot-Analyse zeigte ein einzelnes Transkript von ungefähr 5,4 kb Größe (was mit der Größe der zusammengesetzten cDNA übereinstimmte). Die höchsten Werte einer Expression wurden bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und in der Milz und dem Thymus beobachtet. Nach verlängerter Exposition der Autoradiographie konnte eine Expression von p110δ auch in den Testes, dem Uterus, Kolon und Dünndarm nachgewiesen werden, nicht jedoch in anderen untersuchten Geweben, einschließlich Prostata, Herz, Gehirn und Leber. Im Gegensatz dazu wird p110β in hohem Maß im Gehirn, in Herz, Niere und Leber exprimiert, kann jedoch in lymphoiden Geweben, wie etwa der Milz, nicht leicht nachgewiesen werden. p110β wird in hohem Maß in der transformierten Jurkat-T-Zellinie exprimiert [Hu et al., 1993]. Die Expression der p110α-Isoform ist nicht gut dokumentiert worden.
Es ist gezeigt worden, daß sich die p110-Isoformen im Hinblick auf ihre bevorzugten Substratspezifitäten unterscheiden [Stephens et al., Current Biology 4: 203–214 (1994)]. Im Hinblick auf ihr Potential für eine Interaktion mit einem gemeinsamen p85-Adapter-Protein ist es wahrscheinlich, daß die Natur der phosphorylierten Lipide, die als Antwort auf einen bestimmten Agonisten erzeugt werden, mindestens teilweise durch die Zell/Gewebe-spezifische Expression von verschiedenen Isoformen der enzymatischen Kinaseaktivität reguliert werden kann. Die häufige Expression von p110δ in PBL und lymphoiden Geweben, wie etwa der Milz und dem Thymus, legt nahe, daß diese Isoform an Aspekten der Leukozytenaktivierung beteiligt sein kann.
Beispiel 7
Es wurden monoklonale Antikörper gegen den carboxyterminalen Teil von p110δ (Aminosäuren 740–1044 von SEQ ID NO: 2), die als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) (Pharmacia, Alameda, CA) exprimiert wurden, hergestellt. Fünf Balb/c-Mäuse (Charles River Biotechnical Services, Inc., Wilmington, Massachusetts, IACUC Nr. 901103) wurden subkutan mit 30 μg Antigen in komplettem Freund-Adjuvanz (Complete Freund's adjuvant, CFA) (Sigma) immunisiert, eine zweite Immunisierung mit 30 μg Antigen in inkomplettem Freund-Adjuvanz (Incomplete Freund's adjuvant, IFA) (Sigma) wurde am Tag Tag 22 vorgenommen. Eine dritte Immunisierung mit 30 μg Antigen in IFA wurde am Tag 44 vorgenommen. Immunserum wurde durch retro-orbitale Blutentnahme am Tag 55 gewonnen und durch Western blotting untersucht, um die Reaktivität gegenüber p110δ zu bestimmen. Alle Tiere zeigten eine Reaktivität gegenüber dem Immunogen und wurden ein viertes Mal am Tag 66 mit 30 μg Antigen in IFA immunisiert. Immunserum wurde durch retro-orbitale Blutentnahme am Tag 76 gewonnen und durch Western blotting untersucht, um seine Reaktivität zu bestimmen. Das Tier Nr. 2321 zeigte die stärkste Immunreaktivität und wurde für die Fusion ausgewählt. Am Tag 367 und 368 wurden der Maus Nr. 2321 intraperitoneal 50 μg Antigen in PBS injiziert, und eine Fusion wurde am Tag 371 durchgeführt.
Die Milz wurde steril entfernt, und es wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt, indem die Milz zwischen den vereisten Enden von 2 Mikroskopobjektträgern aus Glas zerrieben und in serumfreies RPMI 1640, das mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 units/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (RPMI) (Gibco, Kanada) supplementiert war, überführt wurde. Die Zellsuspension wurde durch ein steriles 70 mesh-Nitex-Zellsieb (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) filtriert und zweimal durch Zentrifugieren bei 200 g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 20 ml serumfreiem RPMI gewaschen. Thymozyten, die 3 naiven Balb/c-Mäusen entnommen wurden, wurden auf die gleiche Weise hergestellt.
Zwei × 10⁸ Milzzellen wurden mit 4 × 10⁷ NS-1-Zellen (gehalten in der log-Phase in RPMI mit 11% fötalem Rinderserum (FBS) drei Tage vor der Fusion) kombiniert, zentrifugiert und der Überstand wurde abgesaugt. Das Zellpellet wurde abgelöst, indem das Röhrchen geklopft wurde, und 2 ml 37°C warmes PEG 1500 (50% in 75 mM Hepes pH 8,0) (Boehringer Mannheim) wurden unter Rühren im Verlauf von einer Minute zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 14 ml serumfreiem RPMI über 7 Minuten. Weitere 16 ml RPMI wurden zugesetzt, und die Zellen wurden bei 200 g 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurde das Pellet in 200 ml RPMI, das 15% FBS, 100 mM Natriumhypoxanthin, 0,4 mM Aminopterin, 16 mM Thymidin (HAT) (Gibco), 25 units/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) und 1,5 × 10⁶ Thymozyten/ml enthielt, resuspendiert. Die Suspension wurde in Flachboden-Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen („Wells") (Corning, Vereinigtes Königreich) in Portionen von 200 μl/Well verteilt. Die Zellen wurden am Tag 2, 4 und 6 nach der Fusion gefüttert, indem 100 μl aus jedem Well mit einer 18 G-Nadel (Becton Dickinson) abgesaugt Dickinson) abgesaugt und 100 μl/Well Ausplattiermedium, das 10 U/ml IL-6, aber keine Thymozyten enthielt, zugesetzt wurden.
Wenn das Zellwachstum 60–80% Konfluenz erreicht hatte (Tag 8–10), wurden die Kulturüberstände in jedem Well abgenommen und auf eine Reaktivität gegenüber p100δ durch ELISA durchgemustert. Immulon 4-Platten (Dynatech, Cambridge, Massachusetts) wurden bei 4°C mit 100 ng/Well p100δ:GST oder GST in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, in einem Volumen von 50 μl/Well beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS mit 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen und 30 Minuten bei 37°C mit 0,5% Fischhautgelatine blockiert. Die Platten wurden wie oben beschrieben gewaschen, und es wurden 50 μl Kulturüberstand zugesetzt. Nach einer Inkubation bei 35°C für 30 Minuten wurden 50 μl Meerrettichperoxidasekonjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG(fc) (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) (1:10 000 in PBST verdünnt) zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C 30 Minuten inkubiert, viermal mit PBST gewaschen, und es wurden 100 μl Substrat, bestehend aus 1 mg/ml TMB (Sigma) und 0,15 ml/ml 30%iges H₂O₂ in 100 mM Citrat, pH 4,5, zugegeben. Die Farbreaktion wurde nach 3 Minuten durch die Zugabe von 50 ml 15%ige H₂SO₄ abgestoppt. Der Wert der A₄₅₀ wurde auf einem Plattenlesegerät (Dynatech) abgelesen.
Sechsunddreißig Wells zeigten eine bevorzugte Reaktivität gegenüber p110δ im Vergleich zu GST. Die Überstände dieser Wells wurden dann auf eine Reaktivität gegenüber rekombinanter p100δ durch Western blotting durchgemustert. Zehn Wells (208A, 208B, 208C, 208D, 208E, 208F, 208G, 208H, 208I und 208J) zeigten eine Reaktivität im Western blot und wurden zweimal durch „Limiting dilution" kloniert. Die ausgewählten Wells wurden 7–10 Tage später durch ELISA untersucht. Die Aktivität blieb in allen 10 Linien erhalten. Monoklonale Antikörper, die durch die Zellinien hergestellt wurden, wurden durch ELISA-Test isotypisiert. 208A, 208C, 208D, 208E, 208G, 208H, 208I waren IgG_2a, während 208J IgG₁ war und 208B IgG_2b war. Ein beispielhafter monoklonaler Antikörper, der durch die Hybridomzellinie 208F (ATCC HB 12200) hergestellt wurde, zeigte eine hohe Reaktivität mit p110δ und erkannte ein 110 kD großes Protein in PBMC durch Western blot-Analyse. Das Molekulargewicht des 110 kD-Proteins stimmt mit dem Molekulargewicht von p110δ überein.
Beispiel 8
Erhöhte Werte von 3'-phosphorylierten Phosphoinositiden sind in Zellen nachgewiesen worden, die mit viralen Oncoproteinen transformiert worden waren. Diese Beobachtung legt nahe, daß PI3-Kinasen eine Rolle bei der Karzinogenese spielen könnten. Eine Chromosomenlokalisierung von p110δ macht Einblicke in die Rolle der PI3-Kinase bei der Karzinogenese verfügbar. Studien zur Chromosomenlokalisierung von p110δ in Krebszellen könnten eine fehlerhafte Expression und/oder eine Überexpression von p110δ identifizieren.
Beispielsweise tritt in 90–95% der Fälle von chronischer myeloischer Leukämie eine reziproke Chromosomentranslokation auf, die zum Transfer der Tyrosinkinase c-ab1 von Chromosom 9 in das ber-Gen auf Chromosom 22 führt. Die daraus resultierende fehlerhafte Expression der c-ab1-Tyrosinkinase-Aktivität ist für die Zelltransformation und die Tumorgenese bedeutsam. Eine Chromosomenlokalisierung von p110δ wird durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung der vollständigen cDNA für p110δ als einer Sonde bestimmt. Auf diese Weise wird die Rolle von p110δ bei der Chromosomentranslokationen, die während einer Tumorgenese (z.B. Leukämogenese) beobachtet wird, identifiziert.
Beispiel 9
Es ist berichtet worden, daß die PI3-Kinase-Aktivität mit einer Reihe von Wachstumsfaktorrezeptoren im Zusammenhang steht. Zusätzlich ist beobachtet worden, daß die PI3-Kinase-Aktivität nach einer Zellaktivierung zunimmt. Die in Beispiel 5 offenbarten Antikörper gegen p110δ werden verwendet, um durch Western blotting und Immunpräzipitation die Natur der Rezeptoren zu bestimmen, mit denen p110δ assoziiert. Diese Antikörper sind nützlich, um die Regulation der enzymatischen PI-3-Kinase-Aktivität und die zelluläre Lokalisation während einer Zellaktivierung zu erhellen. Im Hinblick auf das hohe Ausmaß einer Expression von p110δ im Immunsystem ist es wahrscheinlich, daß Wachstumsfaktorrezeptoren, die an einer Immunaktivierung beteiligt sind, mit p110δ assoziieren oder von p110δ reguliert werden können. Diese Rezeptoren schließen die T-Zell-Rezeptoren CD28 und CD2 und Cytokinrezeptoren, wie etwa IL-1 und IL-4, sowie Tyrosinkinase-gekoppelte Rezeptoren, wie etwa CSF-1R, ein.
Beispiel 10
Um die funktionelle Rolle von p110δ in vivo zu bestimmen, wird das p110δ-Gen in der Keimbahn von Säugetieren durch homologe Rekombination inaktiviert. Tiere, bei denen ein endogenes Gen durch homologe Rekombination inaktiviert worden ist, sind auch als „Knockout"-Tiere bekannt. Beispielhafte Säugetiere schließen Kaninchen und Nagetierarten, wie etwa Mäuse, ein. „Knockout"-Tiere können durch homologe Rekombinationsverfahren unter Verwendung des genomischen Klons p110δ aus Beispiel 3 erzeugt werden.
Diese „Knockout"-Tiere ermöglichen die Bestimmung der Rolle von p110δ bei Immun- und proliferativen Antworten. Die Rolle von p110δ bei einer Immun- und proliferativen Antwort wird durch die Analyse der Entwicklung des Immunsystems in diesen Tieren (bestimmt durch FACS-Analyse von Zellpopulationen in verschiedenen Entwicklungsstadien), Charakterisierung der Effektorfunktion der reifen lymphoiden Populationen dieser Tiere sowohl in vivo (wie durch Antkörper-Antworten auf injizierte Antigene, cytotoxische T-Zell-Antworten auf Viren und/oder injiziierte Tumorzellinien und die Fähigkeit, Allografts abzustoßen) und in vitro (wie durch Proliferation von Lymphozyten als Antwort auf ein Alloantigen, eine polyklonale Aktivierung durch Mitogene/Superantigene und die Fähigkeit, Cytokine herzustellen) bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes und isoliertes Polynukleotid, welches die in der SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz von p110δ kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer genomischen DNA, einer cDNA und einer chemisch synthetisierten DNA.
Polynukleotid nach Anspruch 2, welches die in der SEQ ID NO: 1 dargelegte DNA-Sequenz umfaßt.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.
Vektor, welcher eine DNA nach Anspruch 2 umfaßt.
Vektor nach Anspruch 6, wobei die DNA funktionsfähig an eine Expressionskontroll-DNA-Sequenz gebunden ist.
Wirtszelle, welche mit einer DNA nach Anspruch 2 stabil transformiert oder transfiziert ist.
Verfahren zum Herstellen von p110δ, welches die Schritte Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 8 in einem geeigneten Nährmedium und Isolieren des exprimierten Polypeptids aus der Zelle oder dem Nährmedium umfaßt.
Gereinigtes und isoliertes Polypeptid, welches die p110δ-Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt.
Antikörpersubstanz, die gegenüber dem Polypeptid nach Anspruch 10 spezifisch immunreaktiv ist.
Antikörpersubstanz nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridomzellinie, welche den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 12 produziert.
Hybridomzellinie 208F (HB 12200).
Monoklonaler Antikörper, welcher durch die Hybridomzellinie nach Anspruch 14 hergestellt wird.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 11.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die ein Modulator von p110δ, welche die in der SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, ist, welches die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bestimmen der Kinaseaktivität der p110δ in der Abwesenheit und Gegenwart der Verbindung; (b) Vergleichen der in Schritt (a) beobachteten Kinaseaktivitäten; und (c) Identifizieren der Verbindung als einen Modulator der p110δ, wobei ein Unterschied in der Kinaseaktivität in der Gegenwart und Abwesenheit der Verbindung beobachtet wird.
Verfahren zum Ermitteln der Gegenwart von p110δ, die die in der SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, in einer biologischen Probe, welches die folgenden Schritte umfaßt: (a) Aussetzen eines p110δ-spezifischen Antikörpers einer biologischen Probe; und (b) Nachweisen der Bindung des p110δ-spezifischen Antikörpers an die p110δ in der biologischen Probe.
Diagnosereagenz, welches ein nachweisbar markiertes Polynukleotid, das einen Teil oder die Gesamtheit der in der SEQ ID NO: 2 dargelegten p110δ-Aminosäuresequenzen kodiert, umfaßt.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die ein Modulator der Bindung zwischen p110δ, die eine in der SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, und einem Bindungspartner ist, welches die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bestimmen des Ausmaßes der Bindung zwischen der p110δ und dem Bindungspartner in der Abwesenheit und Gegenwart der Verbindung; (b) Vergleichen des Ausmaßes der in Schritt (a) beobachteten Bindung; und (c) Identifizieren der Verbindung als einen Modulator der Bindung zwischen der p110δ und dem Bindungspartner, wobei ein Unterschied in der Bindung in der Gegenwart und Abwesenheit der Verbindung beobachtet wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Bindungspartner p85 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Bindungspartner Ras ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Bindungspartner ein Wachstumsfaktorrezeptor ist.