DE60033146T2

DE60033146T2 - Inhibitorprotein der transkriptionsaktivierung

Info

Publication number: DE60033146T2
Application number: DE60033146T
Authority: DE
Inventors: Tetsu Tama-shi AKIYAMA; Tsutomu Ageo-shi NAKAMURA; Kenichi Annaka-shi TAGO
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: CN1364172A; CA2370292A1; DE60033146D1; US7250488B1; EP1180525B1; EP1180525A1; ATE352562T1; WO2000064933A1; AU4314100A; EP1180525A4; KR20020008165A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines β-Catenin-Komplexes mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird, eine DNA, die das Protein codiert, einen Antikörper, der das Protein erkennt, ein Therapeutikum, das das Protein oder die DNA enthält, und ein Diagnostikum, das den Antikörper enthält.
Bisheriger Stand der Technik
Die nachstehend aufgeführten Abkürzungen werden hier verwendet.

AD:: Transkriptionsaktivierungsdomäne
ADH:: Alkoholdehydrogenase
APC:: Adenomatöse Polypose coli
BD:: DNA-bindende Domäne
β-Catenin/TCF-4:: Komplex zwischen β-Catenin und TCF-4
DCC:: Deletiert im Colorektal-Krebs
dhfr:: Dihydrofolatreduktase
DLG:: Drosophila-Discs Large
DMSO:: Dimethylsulfoxid
EGTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA:: enzymverbundener Immunadsorptions-Test
EST:: exprimierte Sequenzmarkierung
FAP:: familiäre adenomatöse Polypose
FCS:: fötales Kälberserum
FITC:: Fluoresceinisothiocyanat
GST:: Glutathion S-Transferase
GST/ICAT:: Fusionsprotein zwischen GST und ICAT
GSK-3: β: Glycogensynthasekinase-3β
ICAT:: Inhibitor von β-Catenin und TCF
IPTG:: Isopropylthiogalactosid
KLH:: KLHC „Keyhole limpet hemocyanin)
Lef:: Lymphocyten-Enhancer-Bindungsfaktor
LTR:: lange endständige Wiederholung
MBS:: m-Maleimidobenzoyl-N-hydoroxysuccinimid
MEM:: minimales essentielles Medium
PCR:: Polymerasekettenreaktion
PEG:: Polyethylenglycol
RITC:: Rhodaminisothiocyanat
SDS:: Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE:: SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
TCF:: T-Zellfaktor
Tris:: Tris (hydroxymethyl) aminomethan
X-Gal:: 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactosid

Das APC-Gen wurde als ursächliches Gen von FAP isoliert (Kinzler und Vogelstein Cell, 87, 159 (1996)). Jedoch wurde berichtet, dass die Abnormalität des APC-Gens nicht nur bei FAP, sondern auch in 70 bis 80% der Fälle von sporadischem Colonkrebs beobachtet wird. Es wurde in Betracht gezogen, dass die Entstehung von Colonkrebs auf aufeinanderfolgende Mutationen in vielen Genen, einschließlich K-ras, p53, DCC und anderer sowie APC, zurückzuführen ist. Man findet im Vergleich zu anderen Genen Mutationen im frühesten Stadium im APC-Gen, und daher glaubte man, dass die Abnormalität des APC-Gens das Primärereignis für die Entstehung von Colonkrebs ist.
Um den der Karziogenese unterliegenden Mechanismus aufzuklären, der mit der Abnormalität des APC-Gens assoziiert ist, ist es notwendig, die Funktionen des Genprodukts, des APC-Proteins, zu bestimmen. Es wurde berichtet, dass das APC-Protein, das eine Größe von etwa 300 kDa besitzt, an β-Catenin, Glycogensynthasekinase-3β (GSK-3β) sowie DLG in Zellen bindet (Rubinfeld et al., Science, 262, 1731 (1993); Su et al., Science, 262, 1734 (1993); Rubinfeld et al., Science, 272, 1023 (1996); Matsumine et al., Science, 272, 1020 (1996)). Hinsichtlich der Funktionen des APC-Proteins wurde berichtet, dass der β-Catenin-Spiegel schnell sinkt, wenn das Wildtyp-APC-Protein in der Colonkrebszelllinie SW480, die Mutationen im APC-Gen aufweist, exprimiert wird (Munemitsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3046 (1995)). Die zentrale Region, die eine Struktur mit 7 Wiederholungen enthält, ist für die Funktion des APC-Proteins wesentlich und fällt mit einer Region zusammen, in der in vielen Colonkrebszällen Mutationen gefunden werden. Es wurde auch berichtet, dass der β-Catenin-Spiegel in diesen Colonkrebszellen erhöht ist (Munemitsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3046 (1995); Rubinfeld et al., Cancer Res., 57, 4624 (1997)).
β-Catenin ist auch als Membranskelettprotein für das Zelladhäsionsmolekül Cadherin bekannt, und es wird auch darüber berichtet, dass es an der Signalübertragung des nachstehend beschriebenen Wnt-Proteins beteiligt ist (Cadigan & Nusse, Genes Dev., 11, 3286 (1997)). Das Wnt-Gen ist eine große Genfamilie, deren Mitglieder eine Vielfalt von Funktionen bei den Vorgängen der frühen Embryogenese und Morphogenese von Tieren besitzen; die Familie besteht aus etwa 20 Genarten in der Maus, und die Gene sind unter einer Vielzahl von Tieren, einschließlich des afrikanischen Klauenfrosches (Xenopus laevis), der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) und der Nematoden (Caenorhabditis elegans), konserviert. Wenn das Wnt-Protein an einen Frizzled-Rezeptor bindet, wird die Aktivität der Glycogensynthasekinase-3β (GSK-3β) durch ein intrazelluläres Dishvelled-Signalmolekül (Dsh) gehemmt. Da die Phosphorylierung von β-Catenin, die durch GSK-3β vermittelt wird, den Abbau von β-Catenin verursacht, führt die Hemmung der GSK-3β-Aktivität zur Anhäufung von β-Catenin in Zellen. β-Catenin bindet an ein Protein, das zur Lef/TCF-Transkriptionsfaktorfamilie gehört, so dass ein Komplex erzeugt wird und dadurch das Protein, das zur Lef/TCF-Familie gehört, als Transkriptionsfaktor aktiviert wird. Daher führt die Anhäufung von β-Catenin zur Bildung des β-Catenin/TCF-Komplexes, der zum Kern transloziert und daher die Transkription von Zielgenen stimuliert. Unter den Proteinen, die zur Lef/TCF-Familie gehören, wird TCf-4 im Epithel des Colons spezifisch exprimiert, und man glaubt daher, dass bei Colonkrebs β-Catenin hauptsächlich einen Komplex mit TCf-4 bildet (Korinek et al., Science, 275, 1784 (1997)). Außerdem wurde berichtet, dass es einige Colonkrebszellen und Melanomzellen gibt, bei denen das APC-Gen ein Wildtyp- Gen ist, aber das β-Catenin-Gen eine Mutation besitzt und nicht von GSK-3β reguliert wird (Morin et al., Science, 275, 1787 (1997); Rubinfeld et al., Science, 275, 1790 (1997)). Man glaubt, dass sich β-Catenin in diesen Zellen konstant anhäuft, was zur Transkriptionsaktivierung durch den β-Catenin/TCF-Komplex führt.
Basierend auf den vorstehend beschriebenen Befunden kann β-Catenin stark an der Entstehung von Colonkrebs beteiligt sein. Daher kann eine Substanz, die in der Lage ist, die Funktion von β-Catenin durch die Bindung daran zu hemmen, mit der Entstehung von Colonkrebs assoziiert werden, und man sagt daher voraus, dass es für dessen Behandlung, Diagnose und dergleichen nützlich ist. Ein Proteinmolekül, das β-Catenin binden kann und kürzlich gefunden wurde, ist Axin, das die Signalübertragung von Wnt negativ reguliert (Zeng et al., Cell, 90, 181 (1997)). Axin bindet an GSK-3β und stimuliert daher die Phosphorylierung von β-Catenin (Ikeda et al., EMBO J., 17, 1371 (1998)). Ferner wurde berichtet, dass Axin auch an APC und β-Catenin bindet, um den Abbau von β-Catenin zu stimulieren, und daher den β-Catenin-Spiegel in den Zellen senkt (Kishida et al., J. Biol. Chem., 273, 10823 (1998); Rubinfeld et al., Current Biology, 8, 573 (1998); Nakamura et al., Genes to Cells, 3, 395 (1998)). Jedoch gibt es keine bekannten Proteine, die an β-Catenin binden und die Aktivität des β-Catenin/TCF-Komplexes als Transkriptionsfaktor direkt beeinflussen.
Offenbarung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Protein, das die Transkriptionsaktivierung durch den β-Catenin/TCF-Komplex durch Bindung an β-Catenin regulieren kann, eine DNA, die das Protein codiert, einen Antikörper, der das Protein erkennt, ein Therapeutikum, das das Protein oder die DNA enthält, und ein Diagnostikum bereitzustellen, das den Antikörper enthält, wobei alle nützlich sind, Krebs zu diagnostizieren und zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Punkte (1) bis (21):

(1) Ein Protein mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird;
(2) Das Protein von (1), wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst;
(3) Ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst, in der eine oder mehrere Aminosäuren addiert, deletiert oder substituiert sind und mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird.

Die vorstehend erwähnten Aminosäuredeletionen, -Substitutionen oder -Additionen können erreicht werden, indem durch ortsgerichtete Mutagenese ortsgerichtete Mutationen in eine DNA eingeführt werden, die ein Protein codiert, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4, wie in Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) etc. beschrieben.

(4) Eine DNA, die das Protein nach einem der Punkte (1) bis (3) codiert;
(5) Eine DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1, 3, 5 und 6;
(6) Eine DNA, die mit der DNA von (4) oder (5) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und die ein Protein mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, codiert, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird.

Die vorstehend erwähnte „DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisiert und die ein Protein mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, codiert, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird" bezieht sich auf eine DNA, die durch Koloniehybridisierung, Plaquehybridisierung, Southern-Blot-Hybridisierung oder dergleichen unter Verwendung einer DNA mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 und 3 als Sonde erhalten werden kann. Eine derartige DNA schließt insbesondere eine DNA ein, die identifiziert werden kann, indem eine Hybridisierung bei 65°C in Gegenwart von 0,7 bis 1,0 Mol/l NaCl unter Verwendung eines Filters durchgeführt wird, auf dem eine DNA immobilisiert ist, die von einer Kolonie oder einem Plaque stammt, und der Filter unter einer Bedingung von 65°C mit 0,1 × bis 2 × SSC (Salzlösung-Natriumcitrat)-Lösung [1 × SSC-Lösung (150 mMol/l NaCl, 15 mMol/l Natriumcitrat) gewaschen wird; nX bedeutet n-fach höhere Konzentration der Lösung). Die Hybridisierung kann nach einem Verfahren durchgeführt werden, wie in irgendeiner der Versuchshandbücher wie J. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. M. Frederick et al., „Current Protocols in Molecular Biology, Ergänzung 1–38", John Wiley & Sons (1987–1997); D. M. Glover und B. D. Hames „DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Zweite Auflage", Oxford University Press (1995) beschrieben.
Spezifische Beispiele der DNA, die zur Hybridisierung in der Lage ist, schließen eine DNA ein, die mindestens eine 80%-ige oder eine höhere Homologie, vorzugsweise eine DNA mit 95%-iger oder höherer Homologie zur Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 3 zeigt, wenn die Homologie mittels BLAST (J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)), FASTA (Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)) oder dergleichen ermittelt wird.

(7) Eine rekombinante DNA, die erhalten werden kann; indem die DNA nach einem der Punkte (4) bis (6) in einen Vektor eingebaut wird;
(8) Eine nicht-menschliche Transformante, die die rekombinante DNA von (7) enthält;
(9) Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei das Verfahren die Schritte der Züchtung der Transformante von (8) in einem Kulturmedium, die Herstellung und Anhäufung des Proteins nach einem der Punkte (1) bis (3) in einer Kultur und das Gewinnen des Proteins aus der Kultur umfasst;
(10) Ein Therapeutikum für Krebs, wobei das Therapeutikum als Wirkstoff das Protein nach einem der Punkte von (1) bis (3) umfasst;
(11) Ein Therapeutikum für Krebs, wobei das Therapeutikum als Wirkstoff die DNA nach einem der Punkte von (4) bis (6) umfasst;
(12) Einen Vektor zur Krebstherapie, wobei der Vektor die DNA nach einem der Punkte von (4) bis (6) umfasst;
(13) Ein Oligonucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, bestehend aus 5 bis 60 aufeinanderfolgenden Resten aus einer Nucleotidsequenz nach einem der Punkte (4) bis (6), ein Oligonucleotid, umfassend eine Sequenz, die zu derjenigen des Oligonucleotids komplementär ist, oder ein Oligonucleotidanalogon, das davon stammt;
(14) Ein Diagnostikum für Krebs, wobei das Diagnostikum als Wirkstoff das Oligonucleotid von (13) umfasst;
(15) Einen Antikörper, der das Protein nach einem der Punkte (1) bis (3) erkennt;
(16) Ein Verfahren zum immunologischen Nachweis des Proteins nach einem der Punkte von (1) bis (3), wobei das Verfahren den Antikörper von (15) nutzt;
(17) Ein Verfahren zur immunologischen Quantifizierung des Proteins nach einem der Punkte (1) bis (3), wobei das Verfahren den Antikörper von (15) nutzt;
(18) Ein Diagnostikum für Krebs, wobei das Diagnostikum als Wirkstoff den Antikörper von (15) umfasst;
(19) Das Therapeutikum von (10) oder (11), wobei der Krebs Colonkrebs ist;
(20) Den Vektor von (12), wobei der der Krebs Colonkrebs ist; und
(21) das Diagnostikum von (18), wobei der Krebs Colonkrebs ist.

Die vorliegende Erfindung ist nachstehend detailliert beschrieben. In der folgenden Beschreibung wird das Protein der vorliegenden Erfindung mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines β-Catenin-Komplexes mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird, als „Inhibitor von β-Catenin und TCF (hier nachstehend als ICAT abgekürzt)" bezeichnet. Ferner wird eine DNA, die ICAT codiert, als ICAT-DNA abgekürzt. Eine Transformante, wie hier verwendet, bedeutet immer nicht-menschliche Transformante.
1. Herstellung der ICAT-DNA
ICAT-DNA kann von cDNA, die ICAT codiert (hier nachstehend als ICAT-cDNA abgekürzt), durch das Hefe-Zweihybridsystem erhalten werden (S. Fields et al., Nature, 340, 245 (1989)). Mit anderen Worten enthält die ICAT-cDNA typischerweise die nicht-translatierten Regionen, aber die ICAT-DNA der vorliegenden Erfindung enthält nur ihre codierende Region. Die codierende Region kann als Region des offenen Leserahmens (ORF) (Region, die das Initiationscodon bis zum Terminationscodon im Leserahmen umfasst) bestimmt werden, indem die Nucleotidsequenz der ICAT-DNA analysiert wird.
Das Hefe-Zweihybridsystem ist ein Verfahren zum Nachweis der Bindung zwischen einem Protein von Interesse X (das im Allgemeinen in diesem Verfahren als „Köder" bezeichnet wird) und einem Protein Y, wobei der Nachweis durch Verwendung eines Hefe-Transkriptionsfaktors Z wie GAL4 mit einer DNA bindenden Domäne (BD) und einer Transkriptionaktivierungsdomäne (AD) in getrennten Regionen des Proteins erreicht wird. Im ersten Schritt wird ein Plasmid (Köderplasmid) zur Expression des Fusionsproteins zwischen X und der DNA bindenden Domäne von Transkriptionsfaktor Z (hier nachstehend als BD-X bezeichnet) in Wirtshefezellen und ein anderes Plasmid zur Expression von Fusionsprotein zwischen Y und der Transkriptionaktivierungsdomäne von Transkriptionsfaktor Z (hier nachstehend als AD-Y bezeichnet) in Wirtshefezellen hergestellt. Beide Plasmide werden in Wirtshefezellen eingeführt, um BD-X und AD-Y gemeinsam zu exprimieren. Die zu verwendende Wirtshefe ist eine Hefe, die ein Reportergen unter der Regulation eines Promotors exprimieren kann, wobei eine Transkriptionsaktivierung durch die Bindung von Transkriptionsfaktor Z daran erreicht wird. Wenn das Protein Y die Fähigkeit besitzt, an Protein X zu binden, dann kann BD-X an AD-Y binden. Da der sich ergebende Komplex die vom Transkriptionsfaktor Z stammende DNA-bindende Domäne (BD) und die Transkriptionaktivierungsdomäne (AD) besitzt, führt der Komplex wie Transkriptionsfaktor Z zur Expression des Reportergens. Demnach kann die Bindung zwischen den Proteinen X und Y nachgewiesen werden, indem die Expression des Reportergens als Marker verwendet wird. Wenn in dieser Situation anstelle des AD-Y-Expressionplasmids eine cDNA-Genbank, in der jede cDNA als Fusionsprotein mit der Transkriptionaktivierungsdomäne von Z exprimiert werden kann, verwendet wird, ohne Y zu spezifizieren, dann können Transformanten, die codierende cDNA Y enthalten, wobei K an X binden kann, isoliert werden, indem die Transformanten basierend auf der Expression des Reportergens durchmustert werden. Ferner können cDNAs von Interesse durch Isolieren der Plasmide aus den Transformanten cloniert werden.
Ein Verfahren zur Clonierung von ICAT-cDNA unter Verwendung des vorstehend erwähnten Verfahrens ist nachstehend beschrieben, wobei der Köder X eine Armadillo-Domäne von Maus-β-Catenin (hier nachstehend als mβ-Catenin-Arm abgekürzt) ist und der Transkriptionsfaktor Z Hefe-GAL4 ist.
(1) Herstellung des Köderplasmids
In der vorliegenden Erfindung wurde der mß-Catenin-Arm (der der Aminosäuresequenz 141 bis 664 des Maus-β-Catenins entspricht) als Köder verwendet. Um das Köderplasmid herzustellen, ist es notwendig, einen mß-Catenin-Arm codierende DNA (hier nachstehend als mβ-Catenin-Arm-DNA abgekürzt) zu erhalten, der als Köder verwendet werden soll. Da die gesamte Nucleotidsequenz der Maus-β-Catenin-DNA und die darin codierende Region von Maus-β-Catenin dem Fachmann bekannt sind (GenBank-Hinterlegungsnr.: M90364; Science, 257, 1142 (1992)), kann die Nucleotidsequenz, die der mβ-Catenin-Arm-DNA entspricht, leicht erkannt werden. Demnach kann eine mβ-Catenin-Arm-DNA durch das nachstehend dargestellte RT-PCR-Verfahren amplifiziert und isoliert werden (M. J. McPherson et al., „PCR, A practical Approach", Oxford University Press (1991)).
Genauer gesagt, wird RNA aus Maus-Gewebe oder -Zellen isoliert, die β-Catenin exprimieren; die cDNA wird aus der RNA synthetisiert; die PCR erfolgt unter Verwendung der cDNA als Matrize sowie unter Verwendung eines Sense-Primers, der dem 5'-Ende der Nucleotidsequenz der mβ-Catenin-Arm-DNA entspricht, und eines Antisense-Primers, der eine Nucleotidsequenz enthält, die zum 3'-Ende der Nucleotidsequenz komplementär ist. Wenn das 5'-Ende jedes Primers konstruiert wird, so dass es eine Sequenz mit einer Restriktionsenzymerkennungsstelle eines Clonierungsvektors für das Köderplasmid enthält, wie nachstehend beschrieben, dann kann das amplifizierte Fragment effizient in den Clonierungsvektor für das Köderplasmid unter Verwendung der Restriktionsenzymstelle eingebaut werden, wie nachstehend beschrieben. Falls die Primer die Restriktionsenzymerkennungssequenzen zur Clonierung haben sollen, werden die Primer beim Einbau in den Clonierungsvektor so konstruiert, dass die Codons der Transkriptionaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors mit denjenigen des mβ-Catenin-Arms im Leserahmen liegen.
Der Vektor (der vorzugsweise verwendet werden soll, um die durch das vorstehende Verfahren hergestellte mβ-Catenin-Arm-DNA einzubauen) schließt einen Vektor ein, der in der Hefe Saccharomyces cerevisiae replizieren kann und der ein geeignetes Markergen zur Transformation besitzt, z.B. Gene für die Aminosäurebiosynthese wie TRP1 und LEU2, und die DNA bindende Domäne von GAL4 (hier nachstehend als GAL4 BD abgekürzt) unter der Regulation eines Promotors zur Expression in Hefe, z.B. Alkoholdehydrogenase (ADH)-Promotor, exprimieren kann. In derartigen Fällen wird vorzugsweise ein Vektor verwendet, der geeignete Restriktionsenzymstellen am C-terminalen Anteil von GAL4 BD für den Einbau der mβ-Catenin-Arm-DNA besitzt und wird aufgrund der einfachen Handhabung, z.B. um die Vektor-DNA zu reinigen, vorzugsweise ein Vektor verwendet, der in E. coli replizieren kann und wird vorzugsweise ein Vektor verwendet, der einen nachweisbaren Marker zur Transformation in E. coli besitzt, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen. Ein derartiger Vektor schließt pGBT9 (Clontech), pAS1 (T. Durfee et al., Genes & Development, 7, 555 (1993)), pAS2-1 (Clontech) oder dergleichen ein.
Die vorstehend erwähnte, hergestellte mβ-Catenin-Arm-DNA wird isoliert und dann in eine Restriktionsenzymschnittstelle auf der C-terminalen Seite von GAL BD in den Vektor im Leserahmen des Codons eingebaut.
(2) Herstellung einer cDNA-Bank zur Expression des Fusionsproteins mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne.
Um eine cDNA-Genbank zur Expression eines Fusionsproteins mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne von GAL4 herzustellen, kann der Vektor, der verwendet werden soll und der ein geeignetes Markergen zur Transformation besitzt, z.B. Gene für die Aminosäurebiosynthese in Hefe wie TRP1 und LEU2, vorzugsweise in der Hefe Saccharomyces cerevisiae replizieren und kann die Transkriptionsaktivierungsdomäne von GAL4 (hier nachstehend als GAL 4 AD abgekürzt) unter der Regulation eines Promotors zur Expression in Hefe, z.B. Alkoholdehydrogenase (ADH)-Promotor, exprimieren. In derartigen Fällen wird vorzugsweise ein Vektor verwendet, der geeignete Restriktionsenzymstellen am C-terminalen Anteil von GAL4 AD besitzt und wird vorzugsweise aufgrund der einfachen Handhabung, z.B. um die Vektor-DNA zu reinigen, ein Vektor verwendet, der in E. coli replizieren kann und wird vorzugsweise ein Vektor verwendet, der einen nachweisbaren Marker zur Transformation in E. coli besitzt, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen. Ein derartiger Vektor schließt pGAD (C. T.-Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9578 (1991)), pGAD424 (Clontech), pACT (T. Durfee et al., Genes & Development, 7, 555 (1993)), pACT2-1 (Clontech) oder dergleichen ein.
Von Proteinen, die mit β-Catenin in Zellen interagieren können, wird vorhergesagt, dass sie in denselben Zellen und Geweben wie β-Catenin exprimiert werden. Demnach ist es möglich, eine cDNA-Genbank herzustellen, indem cDNA aus Maus-Geweben und -Zellen hergestellt wird, von denen vorhergesagt wird, dass sie β-Catenin exprimieren, und sie an einer Restriktionsenzymstelle auf der C-terminalen Seite von GAL4 AD in den vorstehend erwähnten Vektor für die Expression des Fusionsproteins eingebaut wird. In den Fällen, in denen die cDNA und GAL4 AD dieselbe Orientierung zueinander aufweisen und sich die beiden im Leserahmen befinden, kann das Fusionsprotein zwischen GAL4 AD und dem Protein, das von der cDNA codiert wird, exprimiert werden. Alternativ ist es möglich, eine im Handel erhältliche Genbank zu verwenden, die im Hefe-Zweihybridsystem verwendbar ist, z.B. MATCHMAKER-cDNA-Genbank (Clontech).
(3) Durchmustern von cDNA durch das Hefe-Zwei-Hybridsystem
Eine für die Einführung des in (1) hergestellten Köderplasmids zu verwendende Hefe und die in (2) hergestellte cDNA-Genbank schließen Hefen ein, die zu Saccharomyces cerevisiae gehören, in die das vorstehend erwähnte Köderplasmid und die cDNA-Genbank eingeführt werden können, und ferner ist es erforderlich: (a) dass das zur Transformation in das Plasmid einzuführende Markergen und das Gen im Wirt, das dem in dem Zwei-Hybridsystem verwendeten Gen für den Transkriptionsfaktor GAL4 entspricht, aufgrund von Deletionen oder Mutationen nicht exprimiert werden können; und (b) dass eine Nucleotidsequenz, an die GAL4 BD binden kann, in die Promotorregion eines geeigneten Reportergens eingebaut wurde. In diesem Fall ist es vorzuziehen, ein Reportergen zu verwenden, dessen Transkription leicht nachgewiesen wird, wenn sie durch die Bindung mit dem Köder initiiert wird, beispielsweise Gene für die Aminosäurebiosynthese, z.B. HIS3 etc. (in diesem Fall sollte sich das Gen von demjenigen unterscheiden, das als der Verursacher der Transformation des Köderplasmids verwendet wird), das E. coli β-Galactosidasegen lacZ, das in Hefe nachweisbar ist, oder dergleichen. Beispielsweise schließt die Wirtshefe den Saccharomyces cerevisiae-CG1945-Stamm (Clontech), -Y153-Stamm (Genes & Development, 7, 555 (1993)), -CGY1::171-Stamm (Cell, 51, 121 (1987)), -HF7C-Stamm (Clontech) und andere ein.
Das in (1) hergestellte Köderplasmid und die in (2) hergestellte cDNA-Genbank können in diese Wirtshefe eingeführt werden, um Transformanten zu selektieren, die die cDNA enthalten, die unter Verwendung der Expression des Reportergens als Marker ein Protein codiert, das an den mß-Catenin-Arm bindet. Beispielsweise werden Kolonien ausgewählt, die auf einem Minimalmedium ohne Histidin wachsen, wenn das HIS3-Gen für die Histidinbiosynthese als Reportergen verwendet wird, oder es werden Kolonien verwendet, die blaue Farbe in Gegenwart von X-Gal exprimieren, wenn das E. coli-lacZ-Gen als Reportergen verwendet wird.
Da ausgewählte Kolonien der Transformante beide Plasmidarten, das Köderplasmid und die cDNA-Genbank, enthalten, wird nur das Plasmid der cDNA-Genbank nach dem Verfahren isoliert, wie in der Literatur beschrieben („DNA Cloning 2, Expression Systems, A Practical Approach, Zweite Ausgabe", Oxford University Press (1995); Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 9578 (1991)). Genau gesagt, folgt auf die Isolierung des Plasmids aus der Kolonie die Transformation von E. coli damit. In diesem Fall ist der zu verwendende Wirt E. coli ein Stamm, der das in der cDNA-Genbank enthaltene Markergen nicht exprimiert, so dass die Expression des Gens in dem transformierten Stamm nachgewiesen werden kann. Einige Transformanten, die das in der cDNA-Genbank enthaltene Markergen exprimieren, werden aus den Transformanten ausgewählt, und Plasmid-DNAs werden aus den ausgewählten Transformanten isoliert, um cDNA-Clone zu erhalten.
(4) Analyse der Nucleotidsequenz der cDNA-Clone
Nucleotidsequenzen der in (3) erhaltenen cDNA-Clone können durch ein häufig verwendetes Verfahren zur Analyse der Nucleotidsequenz, z.B. das Didesoxy-Sequenzierverfahren von Sanger et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)) oder durch ein von Perkin Elmer bereitgestelltes DNA-Sequenziergerät etc. unter Verwendung der intakten cDNA-Clone oder alternativ nach Herausschneiden der Fragmente der cDNA-Einheit mit geeigneten Restriktionsenzymen und Subclonieren in geeignete Vektoren, z.B. pUC118 und dergleichen, bestimmt werden.
Es ist möglich, beim Durchsuchen der Nucleotidsequenzdatenbanken wie Genbank, EMBL und DDBJ unter Verwendung eines Programms für die Homologiesuche wie BLAST zu beurteilen, dass die sich ergebende Nucleotidsequenz der cDNA neu ist, indem nachgewiesen wird, dass die Sequenz der cDNA keine signifikante Homologie mit den Nucleotidsequenzen von bekannten Genen zeigt, die in den Datenbanken hinterlegt sind.
Wenn die Nucleotidsequenz neu ist, dann sollte der in (3) erhaltene cDNA-Clon, wie in (2) beschrieben, ein Fusionsprotein codieren, in dem ICAT an den C-Terminus von GAL4 AD im Leserahmen gebunden ist. Demnach kann eine ICAT-Aminosäuresequenz, die von der cDNA codiert wird, durch Translation der offengelegten Nucleotidsequenz der cDNA in eine entsprechende Aminosäuresequenz in demselben Leserahmen wie der Translationsleserahmen von GAL4 AD bis hinunter zum darin liegenden Stopp-Codon abgeleitet werden.
Ferner können bekannte Gene, die Homologie zu dem Protein zeigen, das von der cDNA codiert wird, ausgewählt werden, indem Datenbanken für Aminosäuresequenzen wie Genpept, PIR und Swiss-Prot nach dieser Aminosäuresequenz mit einem Programm für die Homologiesuche wie BLAST, FASTA und FrameSearch durchsucht werden.
Jedoch kann die sich ergebende, erhaltene cDNA nur einen stromabwärts des Initiationscodons gelegenen Teil der ICAT-cDNA der gesamten Länge enthalten, weil, wie nachstehend in Beispiel 11 beschrieben, ICAT sogar mit einer Deletion der N-terminalen 12 Aminosäuren an den mß-Catenin-Arm binden kann. In derartigen Fällen wird die ORF-Region bestimmt, indem derselbe Leserahmen verwendet wird wie der der Aminosäuren von ICAT, die erhalten wurden, um die gesamte Aminosäuresequenz von ICAT zu zeigen, nachdem eine ICAT-cDNA mit der gesamten Länge durch das nachstehend beschriebene Verfahren in (5) erhalten wird; die ORF-Region kann als ICAT-DNA verwendet werden. Außerdem sind die Nucleotidsequenzen der jeweiligen Codons in der ICAT-DNA, sofern sie die gesamte Aminosäuresequenz von ICAT codieren, nicht darauf beschränkt, identisch zu jenen der Codons in der cDNA zu sein, und es ist möglich, alle Nucleotidsequenzen von Codons zu verwenden, die dieselbe Aminosäure codieren.
Die neuen erhaltenen cDNAs, wie vorstehend beschrieben, schließen beispielsweise cDNAs ein, die Proteine codieren, die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 2 und 4 umfassen.
(5) Clonierung der cDNA mit der gesamten Länge
Wenn basierend auf der Nucleotidsequenzanalyse in (4) sowie auf den durch Northern-Blot-Hybridisierung erhaltenen Angaben zur Länge der mRNA, wie nachstehend beschrieben, vorhergesagt wird, dass die Länge der in (3) erhaltenen ICAT-cDNA nicht die gesamte Länge aufweist, kann die ICAT-cDNA mit der gesamten Länge nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
(5-1) Durchmustern der cDNA-Genbank
Die in (2) hergestellte cDNA-Genbank, die das Fusionsprotein exprimiert, oder eine cDNA-Genbank, die aus β-Catenin exprimierenden Geweben oder Zellen hergestellt wird, wobei man annimmt, dass ICAT gemeinsam exprimiert wird, oder Zellen, bei denen, wie nachstehend beschrieben, β-Catenin-mRNA durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen wird, und dergleichen werden durch Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung unter Verwendung der in (3) erhaltenen Gesamt-cDNA oder eines Teils davon als Sonde durchmustert, und dann werden die cDNA-Clone mit der Länge, von der man annimmt, dass sie die gesamte Länge ist, unter den positiven Clonen ausgesucht. Die Herstellung und Hybridisierung der cDNA-Genbank können durch die Verfahren erfolgen, wie bei J. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) oder anderen beschrieben. Alternativ ist es möglich, im Handel erhältliche cDNA-Genbanken von Clontech oder anderen zu verwenden. Es ist möglich, die gesamte Nucleotidsequenz der Maus-ICAT-cDNA durch Bestimmung der Nucleotidsequenz der sich ergebenden cDNA-Clone durch dasselbe Verfahren, wie in (4) beschrieben, zu bestimmen und auch die gesamte Aminosäuresequenz des Maus-ICAT zu bestimmen.
(5-2) RACE
Komplementäre DNAs werden aus Geweben oder Zellen hergestellt, von denen vorhergesagt wird, dass sie ICAT exprimieren, und dann wird ein Adapter-Oligonucleotid an beide Enden der cDNAs hinzugefügt. Komplementäre DNA-Fragmente, die einen Teil enthalten, der in die 5'- oder 3'-Richtung von der in (3) erhaltenen cDNA verlängert wurde, können durch 5'-RACE oder 3'-RACE erhalten werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)), wobei die PCR unter Verwendung eines Primers aus der Nucleotidsequenz dieses Adapters erfolgt und ein Primer konstruiert wird, der auf der Nucleotidsequenz des in (3) erhaltenen cDNA-Clons basiert.
Die ICAT-cDNA mit der gesamten Länge kann auch bereitgestellt werden, indem die Nucleotidsequenzen der sich ergebenden cDNAs auf dieselbe Weise wie in (4) bestimmt werden und dann die erhaltenen cDNAs und der in (3) erhaltene cDNA-Clon, basierend auf der bestimmten Nucleotidsequenz, miteinander verbunden werden.
(5-3) Verwendung der EST-Nucleotidsequenz
Wenn die Nucleotidsequenz der in (4) bestimmten ICAT-cDNA durch Durchsuchen der öffentlichen Nucleotidsequenzdatenbanken auf Homologie analysiert wird, kann man identische Sequenzen zu derjenigen der cDNA unter Teilsequenzen von zufälligen cDNA-Clonen, sogar ESTs finden, wenn es keine identische Nucleotidsequenz unter den bekannten Genen gibt. In derartigen Fällen werden diese ESTs und andere ESTs, die Nucleotidsequenzen enthalten, die zu denjenigen der ESTs und ESTs, die von demselben Clon stammen, identisch sind, alle zusammen als die ESTs gesammelt, die von demselben Gen stammen. Manchmal kann man eine längere Nucleotidsequenz finden, die in die 5'- oder 3'-Richtung im Vergleich zur in (3) erhaltenen cDNA verlängert wurde, indem die Nucleotidsequenzen dieser ESTs, von denen angenommen wird, dass sie von der ICAT-cDNA stammen, zusammengefügt werden. In derartigen Fällen ist es möglich, einen erweiterten Anteil der cDNA, der sich auf der 5'- oder 3'-Seite der in (4) erhaltenen cDNA-Nucleotidsequenz befindet, durch RT-PCR unter Verwendung eines Sense-Primers mit der Nucleotidsequenz des 5'-Endes der Nucleotidsequenz, die aus den zusammengefügten ESTs erhalten wurde, oder unter Verwendung eines Antisense-Primer mit einer zu der Nucleotidsequenz des 3'-Endes davon komplementären Nucleotidsequenz zu erhalten. Komplementäre DNA oder eine cDNA-Genbank, die von Maus-Geweben oder -Zellen stammt, von denen vorhergesagt wird, dass sie ICAT exprimieren, können als Matrize in der RT-PCR verwendet werden. Die Nucleotidsequenz der erhaltenen cDNA wird auf dieselbe Weise bestimmt, wie in (4) beschrieben. Wenn viele ESTs, von denen angenommen wird, dass sie von Maus-ICAT-cDNA stammen, in öffentlichen Nucleotidsequenzdatenbanken erhalten werden, kann die cDNA-Nucleotidsequenz mit der gesamten Länge ohne RT-PCR aufgeklärt werden, indem die gesammelten EST-Nucleotidsequenzen zusammengefügt werden.
Ferner kann, sobald die Nucleotidsequenz der ICAT-cDNA mit der gesamten Länge, wie vorstehend beschrieben, aufgeklärt wurde, die ICAT-cDNA durch PCR unter Verwendung einer Matrizen-cDNA oder einer cDNA-Genbank, die aus Maus-Geweben oder -Zellen, von denen vorhergesagt wird, dass sie ICAT exprimieren, auf dieselbe Weise, wie in (3) beschrieben, hergestellt wurde, sowie unter Verwendung von auf der Nucleotidsequenz der cDNA basierenden Primern erhalten werden. Eine Transformante, die den sich ergebenden ICAT-cDNA-Clon pmICAT, Escherichia coli DH5α/pmICAT enthält, wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6701 im National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566) vom 14. April 1999 an hinterlegt.
Außerdem kann die ICAT-DNA in einem DNA-Synthetisiergerät basierend auf der Nucleotidsequenz der ICAT-cDNA chemisch synthetisiert werden, die, wie vorstehend beschrieben, bestimmt wird. Ein derartiges DNA-Synthetisiergerät schließt das DNA-Synthetisiergerät Modell 392 von Perkin Elmer unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens und dergleichen ein.
(6) Isolierung der DNA, die den menschlichen ICAT codiert
Es ist wichtiger, menschlichen ICAT oder die codierende DNA (hier nachstehend als menschliche ICAT-DNA abgekürzt) als Maus-ICAT zu erhalten, um den Mechanismus zu analysieren, der der Entstehung von menschlichem Colonkrebs unterliegt, sowie den Krebs zu behandeln und zu diagnostizieren. Im Allgemeinen besitzen Proteine von verschiedenen Spezies mit derselben Funktion oft Aminosäuresequenzen, die nicht identisch sind, aber eine Homologie zueinander zeigen. Demnach wird auch vorhergesagt, dass die DNAs, die die Proteine codieren, Homologie zueinander zeigen. Außerdem häufen sich während der Evolution der Organismen Mutationen in Genen an, und daher kann man annehmen, dass je näher die Verwandtschaft der Spezies phylogenetisch ist, desto höher ist die Homologie. Demnach ist es möglich, ICAT-DNA von anderen Säugern, beispielsweise menschliche ICAT-DNA, zu erhalten, indem die Nucleotidsequenz der in (3) erhaltenen Maus-ICAT-DNA nach einem Verfahren genutzt wird, wie nachstehend beschrieben. Ohne Maus-ICAT-DNA zu erhalten, kann menschliche ICAT-DNA direkt durch dieselben Verfahren des Hefe-Zweihybridsystems, wie in (1) bis (5) beschrieben, mit dem Köderplasmid erhalten werden, in dem die Armadillo-Domäne von menschlichem β-Catenin (J. Cell Biol., 127, 2601 (1994)) als Köder und menschliche cDNA-Genbank verwendet werden.
(6-1) Durchmustern der cDNA-Genbank
Da man annehmen kann, dass menschlicher ICAT dieselbe Funktion hat wie Maus-ICAT, wird vorhergesagt, dass menschlicher ICAT in denselben Geweben und Zellen wie Maus-ICAT exprimiert wird. Demnach ist es möglich, cDNA-Clone für menschlichen ICAT von einer cDNA-Genbank wie der cDNA-Genbank, die aus einem menschlichem Gewebe hergestellt wurde, das dem Maus-Gewebe entspricht, in dem der Maus-ICAT exprimiert wird, oder aus Zellen, die von derartigen menschlichem Gewebe stammen, nach demselben Verfahren, wie in (5-1) beschrieben, zu erhalten, oder alternativ aus einer im Handel erhältlichen menschlichen cDNA-Genbank zu erhalten, die von (einem) derartigen menschlichen Gewebe oder Zellen stammt, indem eine Koloniehybridisierung oder Plaquehybridisierung unter Verwendung von Maus-ICAT-DNA, markiert mit Radioisotop, Digoxigenin oder dergleichen, als Sonde erfolgt.
(6-2) Verwendung von EST
Öffentliche Nucleotidsequenzdatenbanken wie GenBank werden unter Verwendung eines Programms für die Homologiesuche durchsucht, um menschliche ESTs zu finden, die Homologie zu der Nucleotidsequenz der in (4) erhaltenen Maus-ICAT-DNA zeigen. Da derartige ESTs Homologie zu einer Maus-ICAT-DNA zeigen, wird angenommen, dass sie von menschlicher ICAT-cDNA stammen, zumindest kann ein Teil der Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-cDNA durch Zusammenfügen der Nucleotidsequenzen der ESTs erhalten werden. Unter den Clonen, die verwendet wurden, um die Nucleotidsequenzen der ESTs zu bestimmen, werden Clone vom Integrated Molecular Analysis of Genome Expression Consortium (I.M.A.G.E. Consortium) sowie von The Institute for Genomic Research (TIGR) von ATCC vertrieben. Es ist auch möglich, einen cDNA-Clon zu erhalten, der die gesamte menschliche ICAT-cDNA abdeckt, indem die erhaltenen cDNA-Clone zusammengefügt werden, von denen man annehmen kann, dass sie das 5'-Ende, 3'-Ende oder einen zentralen Teil der menschlichen cDNA, basierend auf den Nucleotidsequenzen der ESTs, enthalten. Eine Transformante, die den sich ergebenden menschlichen ICAT-cDNA-Clon phlCAT in voller Länge enthält, Escherichia coli DH5α/phtCAT, wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6700 im National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566) vom 14. April 1999 an hinterlegt.
Es ist auch möglich, menschliche ICAT-cDNA durch Amplifizierung mit RT-PCR auf dieselbe Weise, wie in (3) beschrieben, zu erhalten, wobei Primer verwendet werden, die hergestellt werden, so dass sie dem 3'-Ende und dem 5'-Ende der Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-cDNA-Nucleotidsequenz entsprechen, und als Matrize RNA verwendet wird, die aus menschlichen Geweben oder Zellen hergestellt wird, von denen vorhergesagt wird, dass sie ICAT exprimieren.
Die menschliche ICAT-DNA wird als ORF-Region anhand der menschlichen ICAT-cDNA mit der gesamten Länge bestimmt, die nach dem Verfahren, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde. Auch wenn es zahlreiche ORFS gibt, kann ein ORF, der eine Homologie zu dem bestimmten ORF in der Maus-ICAT-DNA aufweist, als menschliche ICAT-DNA ausgewählt werden, da man annimmt, dass Maus-ICAT und menschlicher ICAT eine Homologie in der Aminosäuresequenz aufweisen. Die Aminosäuresequenz des menschlichen ICAT kann als Aminosäuresequenz bestimmt werden, die vom ORF codiert wird.
(7) Herstellung des ICAT-Oligonucleotids
Es ist möglich, ein Oligonucleotid, das eine Teilsequenz der ICAT-DNA nach der vorliegenden Erfindung enthält, oder ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die dazu komplementär ist (hier nachstehend als ICAT-Oligonucleotid abgekürzt) in dem in (5) beschriebenen DNA-Synthetisiergerät herzustellen.
Das ICAT-Oligonucleotid schließt insbesondere eine DNA ein, die dieselbe Sequenz als aufeinanderfolgende 5 bis 60 Nucleotide in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 3 besitzt, oder eine DNA mit einer Sequenz, die zu der DNA komplementär ist. Wenn diese DNAs als Sense- oder Antisense-Primer verwendet werden, sind sie vorzugsweise Oligonucleotide, deren Schmelztemperaturen und Nucleotidanzahl von den anderen nicht beträchtlich abweichen.
Jegliche Analoga der Oligonucleotide (hier nachstehend auch als Oligonucleotidanaloga bezeichnet) sind durch das Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Oligonucleotidanaloga werden beispielhaft veranschaulicht durch Oligonucleotidderivate, in denen die Phophodiesterbindung des Oligonucleotids in eine Phosphothioatbindung umgewandelt wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen die Phophodiesterbindung des Oligonucleotids in eine N3'-P5'-Phosphoramidatbindung umgewandelt wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen die Phophodiesterbindung zwischen der Ribose und dem Phosphat im Oligonucleotid zu einer Peptid-Nucleinsäurebindung umgewandelt wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen Uracil im Oligonucleotid mit C-S-Propinyluracil substituiert wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen Uracil im Oligonucleotid mit C-5-Thiazoluracil substituiert wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen Cytosin im Oligonucleotid mit C-5-Propinylcytosin substituiert wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen Cytosin im Oligonucleotid mit Phenoxazid-modifiziertem Cytosin substituiert wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen die Ribose im Oligonucleotid mit 2'-O-Propylribose substituiert wurde; Oligonucleotidanaloga, bei denen die Ribose im Oligonucleotid mit 2'-Methoxyethoxyribose substituiert wurde, und dergleichen (Cell Technology, 16, 1463 (1997)).
2. Herstellung von ICAT
Der ICAT der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem ICAT-DNA, wie in Abschnitt 1 hergestellt, in Wirtszellen nach einem Verfahren, wie in „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage" (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), „DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Zweite Auflage", (D. M. Glover und B. D. Hames, Oxford University Press (1995)) etc. beschrieben, exprimiert werden.
Genau gesagt kann der ICAT der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem ein rekombinanter Vektor hergestellt wird, in den die ICAT-DNA stromabwärts eines Promotors in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut wurde, wobei der Vektor in Wirtszellen eingeführt wird, um eine ICAT-exprimierende Transformante zu erhalten, und dann die Transformante gezüchtet wird.
Der zu verwendende Expressionsvektor ist ein Vektor, der zur autonomen Replikation in der Lage ist oder in das Chromosom in Wirtszellen integriert wird und einen Promotor enthält, der die Transkription von der ICAT-DNA zur mRNA in Wirtszellen lenkt.
Es können irgendwelche Wirtszellen, einschließlich prokaryontischer Zellen, Hefezellen, tierischer Zellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen usw. verwendet werden, sofern die Zellen das Gen von Interesse exprimieren können. Tiere und Pflanzenkörper sind ebenfalls verwendbar.
Wenn Prokaryonten wie Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, dann ist der zu verwendende ICAT-Expressionsvektor zur autonomen Replikation im Wirtsprokaryonten in der Lage, und die ICAT-DNA wurde stromabwärts eines Promotors eingebaut, der eine Ribosomenbindungsstelle enthält. Der Abstand zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationscodon wurde vorzugsweise entsprechend angepasst (beispielsweise 6 bis 18 Nucleotide für einen Vektor eines E. coli-Wirtes). Vorzugsweise wird eine Transkriptionsterminationssequenz unmittelbar stromabwärts der ICAT-DNA gesetzt, obwohl es in der Erfindung nicht wesentlich ist. Außerdem sollte der Vektor so konstruiert werden, dass er Sequenzen für die Expression des Markergens wie Wirkstoffresistenzgene zur Vereinfachung der Selektion von Transformanten enthält.
Jeder Promotor kann verwendet werden, sofern er die Fähigkeit besitzt, die Expression in Wirtszellen zu lenken. Wenn beispielsweise E. coli als Wirt verwendet wird, schließen die Promotoren Promotoren ein, die von E. coli und dem Phagen stammen, wie den trp-Promotor (Ptrp), lac-Promotor (Plac), P_L-Promotor, T7-Promotor, P_R-Promotor etc. Es ist auch möglich, künstlich konstruierte oder modifizierte Promotoren wie einen Promotor zu verwenden, in dem zwei Ptrp hintereinander miteinander verbunden sind, tac-Promotor, T7-lac-Promotor, let-I- Promotor etc. Wenn Bacillus subtilis als Wirt verwendet wird, schließen die Promotoren Promotoren, die von SPO1 und SPO2 stammen, die Bacillus subtilis-Phagen sind, sowie den PenP-Promotoren ein.
Als Beispiele für einen Expressionsvektor sind beispielsweise pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), pLSA1 (Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)), pGEL1 (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)), pBluescript II SK(–) (Stratagene), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pGEX-5X-3 (Amersham Pharmacia Biotech) und pET14 (Novagen) aufgeführt.
Die Wirtszellen können Mikroorganismen sein, die zur Gattung Escherichia, der Gattung Serratia, der Gattung Bacillus, der Gattung Brevibacterium, der Gattung Corynebacterium, der Gattung Microbacterium, der Gattung Pseudomonas usw. gehören, beispielsweise Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC 1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W 1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nr. 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Pseudomonas sp. D-0110.
Jedes Verfahren zur Einführung rekombinanter Vektoren kann verwendet werden, sofern ein derartiges Verfahren die Fähigkeit besitzt, DNAs in die vorstehend erwähnten Wirtszellen einzuführen. Derartige Verfahren schließen beispielsweise Elektroporation (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)), Verfahren, bei denen Calciumionen verwendet werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)), das Protoplastenverfahren (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung 248394/88) oder andere Verfahren ein, wie in Gene, 17, 107 (1982) oder Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) beschrieben.
Wenn Hefe als Wirtszelle verwendet wird, schließen die zu verwendenden Vektoren Vektoren ein, die einen Promotor, der in der Lage ist, die Transkription in Wirtshefe zu lenken, ICAT-DNA, eine Transkriptionsterminationssequenz und eine Sequenz enthalten, die ein Markergen zur Transformation in Hefe exprimieren kann (z.B. Wirkstoffresistenzgene und Gene für die Aminosäurebiosynthese wie TRP1, HIS3 und LEU2). Ferner wird bevorzugt, einen Expressionsvektor zu verwenden, der zur autonomen Replikation in der Lage ist und ein Wirkstoffresistenzgen exprimieren kann, das als Marker zur Transformation in E. coli zur Erleichterung der Herstellung und Aufrechterhaltung des Vektors verwendet werden kann.
Jeder Promotor kann verwendet werden, sofern er die Fähigkeit besitzt, die Transkription in Hefe zu lenken. Derartige Promotoren schließen beispielsweise Promotoren des Alkoholdehydrogenase-Gens ADH1 und von Genen, die am Galactosemetabolismus beteiligt sind, z.B. GAL1, GAL10 und dergleichen, den Promotor des Gens der sauren Phosphatase PHO5, den Promotor des Phosphoglyceratkinase-Gens PGK, den Promotor des Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Gens GAP, Promotoren der Gene für Hitzeshock-Proteine, den Promotor des α-Paarungsfaktor-Gens MFα1 und den Promotor des Kupfer-Metallothioneingens CUP1, das von Saccharomyces cerevisiae stammt, sowie den Promotor des Alkoholoxidase-Gens AOX1 ein, das von Pichiapastoris stammt.
Die Wirtszellen schließen Hefe-Stämme ein, die zur Gattung Saccharomyces, zur Gattung Schizosaccharamyces, zur Gattung Pichia, zur Gattung Candida usw. gehören, und schließen insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida utilis etc. ein.
Jedes Verfahren zur Einführung rekombinanter Vektoren kann verwendet werden, sofern ein solches Verfahren die Fähigkeit besitzt, DNAs in Hefe einzuführen. Derartige Verfahren schließen beispielsweise Elektroporation (Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)), das Sphäroplastenverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)), das Lithiumacetat-Verfahren (Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983)) etc. ein.
Wenn tierische Zellen als Wirte verwendet werden, schließen die Vektoren, die verwendet werden sollen, Vektoren, die einen Promotor enthalten, der die Transkription in tierischen Wirtszellen lenken kann, ICAT-DNA und Signalsequenzen für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung der Transkripte ein. Ferner wird vorzugsweise ein Expressionsvektor verwendet, der zur autonomen Replikation in der Lage ist und ein Wirkstoffresistenzgen exprimieren kann, das als Marker zur Transformation in E. coli zur Erleichterung der Herstellung und Aufrechterhaltung des Vektors verwendet werden kann. Jeder Promotor kann verwendet werden, sofern er die Fähigkeit besitzt, die Transkription in Tierzellen zu lenken. Derartige Promotoren schließen von Viren stammende Sequenzen ein, wie den frühen SV40-Promotor, Promotor- und Enhancerelemente des menschlichen Cytomegalievirus (sehr frühen) IE-Gens, LTRs, die von Retroviren wie dem Rous-Sarkom-Virus, humanen T-Zell-Leukämie-Virus I, Moloney-Maus-Leukämie-Virus etc. stammen; oder Promotoren aus Genen wie dem Metallothionein-Gen, β-Aktin-Gen, Elongationsfaktor-1 und dergleichen, die von tierische Zellen stammen. Ferner ist es möglich, künstliche Promotoren zu verwenden, in denen mehrere Promotorelemente, wie vorstehend angeführt, miteinander verbunden wurden, z.B. den SRα-Promotor, der durch Verbinden des frühen SV40-Promotors und des LTR aus humanem T-Zell-Leukämie-Virus I erzeugt wurde.
Zellen, in denen ICAT-DNA in die chromosomale Wirts-DNA integriert wurde und die ICAT konstitutiv exprimieren, können ausgewählt werden, indem ein ICAT-Expressionsvektor eingeführt wird, der eine Sequenz für die Expression eines Wirkstoffresistenzgens gegen einen Wirkstoff wie G418 oder Hygromycin in Wirtszellen enthält, und die Zellen in Gegenwart des Wirkstoffs gezüchtet werden. Ferner wird, um die in den Wirtszellen produzierte ICAT-Menge zu erhöhen, ein Vektor für die konstitutive Expression von ICAT, der eine Sequenz zur Expression des Dihydrofolatreduktase (dhfr)-Gens enthält, in Wirtszellen eingeführt, und die Zellen werden gezüchtet, während die Konzentration von Methotrexat als dhfr-Inhibitor erfolgreich erhöht wird; und daher ist es möglich, die Amplifzierung der Kopienzahl der ICAT-DNA zusammen mit derjenigen des dhfr-Gens erfolgreich zu erreichen. Derartige Wirtszellen, in denen die Genamplifizierung unter Verwendung des dhfr-Gens erreicht wird, können Zellen sein, die kein funktionales dhfr-Gen besitzen, beispielsweise CHO/dhfr^– (ATCC: CRL-9096) oder dergleichen.
Vektoren, die zur Herstellung der vorstehend erwähnten ICAT-Expressionsvektoren verwendet werden sollen, schließen insbesondere beispielsweise pAGE107 (japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung 22979/91; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3 (227075/90), pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)), pcDNA3.1(+) (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pBK-RSV (Stratagene), pSVK3 (Amersham Pharmacia Biotech), pcDNA1.1/Amp (Invitrogen), pAMo (J. Biol. Chem., 268, 22782 (1993)) oder dergleichen ein.
Die Wirtszellen schließen Zelllinien wie die vom Menschen stammenden Zellen HeLa und Namalwa sowie die menschliche Nierenzellline 293 (ATCC: CRL-1573); COS-1 und COS-7, die Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze sind, CHO- und BHK-Zellen aus dem Hamster, SP2/0- und NS0-Zellen von Maus-Myelom, Rattenmyelomzelle YB2/0 ein.
Jedes Verfahren zur Einführung rekombinanter Vektoren kann verwendet werden, sofern ein derartiges Verfahren die Fähigkeit besitzt, DNAs in die Tierzellen einzuführen. Derartige Verfahren schließen beispielsweise Elektroporation (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), das Calcium-Phosphat-Verfahren (227075/90), das Lipofektionsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)) etc. ein.
Wenn Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden, kann das Baculovirus-Expressionssystem genutzt werden (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988)). Genau gesagt, nachdem die ICAT-DNA in einen Vektor, der als Transfervektor bezeichnet wird, eingebaut wurde, werden sowohl der Vektor als auch das Baculovirus gleichzeitig in die Insektenzellen eingeführt; die sich ergebende homologe Rekombination stellt ein rekombinantes Baculovirus bereit, in das die ICAT-DNA stromabwärts des Polyhedrin-Genpromoters, der ein hocheffizienter Promotor ist, eingebaut wurde; dann können die Insektenzellen mit dem rekombinanten Baculovirus infiziert werden, so dass die Expression von ICAT erreicht wird.
Ein derartiges zu verwendendes Baculovirus schließt Autographa californica-Kernpolyeder-Virus, Bombyx mori-Kernpolyeder-Virus etc. ein. Die zu verwendenden Insektenzellen können Sf9 und Sf21, die Zellen sind, die von Spodoptera frugiperda stammen (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, New York (1992)), High5 (Invitrogen), die eine Zelle ist, die von Trichoplusia ni stammt, oder dergleichen sein. Alternativ sind auch die Seidenraupenlarven an sich verwendbar. Der Transfervektor enthält den Polyhedrin-Promotor und eine von Baculovirus stammende Sequenz, um die homologe Rekombination zu lenken, sowie Sequenzen zur Aufrechterhaltung und Replikation des Vektors sowie für die Insertion von Fremdgenen (eine Sequenz, die zur autonomen Replikation in E. coli in der Lage ist und eine Sequenz eines Wirkstoffrestistenzgens) und solche zur Erleichterung der Genmanipulation in E. coli. Derartige Vektoren schließen spezifisch pVL1392, pVL1393, pBluebac4 (beide von Invitrogen) etc. ein.
ICAT kann unter Verwendung von nicht menschlichen, tierischen Individuen hergestellt werden. Beispielsweise kann ICAT in einem nicht menschlichen, tierischen Körper hergestellt werden, in den die ICAT-DNA nach einem bekannten Verfahren eingeführt wurde (American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996); American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996); Bio/Technology, 9, 830 (1991)).
Jeder Promotor kann verwendet werden, sofern er die Fähigkeit besitzt, die Expression in nicht menschlichen Zellen zu lenken. Beispielsweise ist es möglich, vorzugsweise den α-Casein-Promotor, β-Casein-Promotor, β-Lactoglobulin-Promotor, Promotor des sauren Weizenproteins usw. zu verwenden, welche Promotoren sind, die für die Brustdrüsenzellen spezifisch sind.
Wenn Pflanzenzellen oder Pflanzenkörper als Wirte verwendet werden, kann ICAT nach einem bekannten Verfahren hergestellt werden (Tissue Culture, 20 (1994); Tissue Culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)).
Jeder Promotor kann für die Expression der ICAT-DNA verwendet werden, sofern er die Fähigkeit besitzt, die Genexpression in Pflanzenzellen zu lenken. Derartige Promotoren schließen beispielsweise den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, Actin-1-Promotor von Reis etc. ein. Ferner kann das Intron 1 des Mais-Alkoholdehydrogenase-Gens und dergleichen zwischen dem Promotor und der zu exprimierenden ICAT-DNA eingebaut werden, um die Effizienz der Expression der ICAT-DNA zu erhöhen.
Die Wirtszellen können Pflanzenzellen sein, die von der Kartoffel, Tabak, Mais, Reis, Raps, Sojabohnen, Tomate, Weizen, Gerste, Roggen, Luzerne Flachs etc. stammen.
Jedes Verfahren zur Einführung rekombinanter Vektoren kann verwendet werden, sofern ein derartiges Verfahren die Fähigkeit besitzt, DNAs in Pflanzenzellen einzuführen. Derartige Verfahren schließen beispielsweise ein Verfahren unter Verwendung von Agrobacterium, Elektroporation (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), Verfahren, bei dem eine Teilchen-Kanone (Genkanone) etc. verwendet wird, ein.
Pflanzenzellen oder Organe, in die ICAT-DNA eingeführt wurde, können in großem Maßstab unter Verwendung eines Gefäßfermenters gezüchtet werden. Es können auch Pflanzenzellen, die eingeführte Gene enthalten, regeneriert werden, so dass Pflanzenkörper (transgene Pflanzen) erzeugt werden, in die ICAT-DNA eingeführt wurde.
Mikroorganismen, tierische Zellen oder von einer Pflanzenzelle stammende Transformanten, die einen rekombinanten Vektor enthalten, der die ICAT-DNA der vorliegenden Erfindung als Insertion enthält, können nach einem typischen Züchtungsverfahren gezüchtet werden, wobei man zulässt, dass ICAT in ihnen akkumuliert wird, und ICAT wird aus der Kultur gewonnen, um ICAT zu produzieren.
Für die Züchtung von Transformanten zu verwendende Medien, die unter Verwendung von tierischen Zellen als Wirte erhalten werden, schließen das häufig verwendete RPMI1640-Medium (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle-MEM (Science, 122, 501 (1952)), DMEM (Virology, 8, 396 (1959)), 199-Medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) und diese Medien ein, die fötales Kälberserum enthalten, und dergleichen. Falls gewünscht, kann dem Medium ein Antibiotikum wie Penicillin oder Streptomycin zugegeben werden. Typischerweise kann die Züchtung 1 bis 7 Tage unter Bedingungen wie bei einem pH-Wert von 6 bis 8 bei 30 bis 40°C in Gegenwart von 5% CO₂ erfolgen.
Für die Züchtung von Transformanten zu verwendende Medien, die unter Verwendung von Insektenzellen als Wirtszellen erhalten werden, schließen das häufig verwendete TNM-FH-Medium (Pharmingen), Sf-900 II-SFM-Medium (Life-Technologies), ExCell400, ExCell405 (beide von JRH Biosciences), Grace-Insektenmedium (Nature, 195, 788 (1962)) ein. Bei einer bevorzugten Kulturbedingung beträgt der pH-Wert 6 bis 7, die Kulturtemperatur beträgt 25 bis 30°C und die Kultur wird typischerweise 1 bis 5 Tage fortgesetzt. Ferner kann, falls gewünscht, dem Medium während der Kultur ein Antibiotikum wie Gentamycin zugegeben werden.
Wenn die nicht-menschliche Transformante ein nicht-menschliches, tierisches Individuum oder ein Pflanzenkörper ist, ist es möglich, ICAT durch Aufzucht oder Züchten nach einem typischen Verfahren herzustellen, wobei man zulässt, dass ICAT darin akkumuliert wird, und ICAT aus dem nicht-menschlichen Tierindividuum oder Pflanzenkörper gewonnen wird.
Insbesondere im Falle des nicht-menschlichen, tierischen Individuums ist es beispielsweise möglich, ICAT zu produzieren, indem ein nicht-menschliches transgenes Tier aufgezogen wird, das ICAT-DNA enthält, so dass der durch die rekombinante DNA codierte ICAT produziert, sich im tierischen Körper anhäufen und ICAT aus dem Tier gewonnen werden kann. In den Produktions- und Akkumulationsort von ICAT in dem Tier ist beispielsweise die Milch oder das Ei des Tieres eingeschlossen.
Im Falle des Pflanzenkörpers ist es beispielsweise möglich, ICAT durch Züchten der transgenen Pflanze, die ICAT-DNA enthält, zu produzieren, so dass der durch die rekombinante DNA codierte ICAT produziert, sich in der Pflanze anhäufen und ICAT aus der Pflanze gewonnen werden kann.
Jedes natürliche und synthetische Medium kann für die Züchtung der Transformante verwendet werden, die erhalten wird, indem als Wirt ein Prokaryont wie E. coli oder ein Eukaryont wie Hefe verwendet wird, solange es eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze usw. enthält, die der Organismus assimilieren kann und die Züchtung der Transformante darin effektiv erreicht wird.
Jede Kohlenstoffquelle, die von dem Organismus assimiliert wird, kann verwendet werden, einschließlich Glucose, Fructose, Saccharose und Melasse, die sie enthalten; Kohlenhydrate wie Stärke und Stärkehydrolysate; organische Säuren wie Essigsäure und Propionsäure; Alkohole wie Ethanol und Propanol.
Die Stickstoffquelle, die verwendet werden kann, schließt Ammoniak, Ammoniumchlorid, anorganische Säuren wie Ammoniumsulfat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat oder Ammoniumsalze der organischen Säure, andere Stickstoff-enthaltende Verbindungen sowie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Caseinhydrolysat, Sojabohnenkuchen und Sojabohnenkuchenhydrolysat, verschiedene Fermentationsmikroorganismen und deren Abbauprodukte ein.
Derartige anorganische Substanzen schließen Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Kupfersulfat, Calciumcarbonat etc. ein.
Das Züchten erfolgt typischerweise unter aeroben Bedingungen wie durch Schüttelkultur oder stark aerober Kultur mit Rühren. Die Kultur erfolgt vorzugsweise bei 15 bis 40°C und typischerweise 16 bis 96 Stunden. Der pH-Wert sollte während der Kultur bei 3,0 bis 9,0 gehalten werden. Die Einstellung des pH-Werts kann unter Verwendung einer anorganischen oder organischen Säure, alkalischer Lösung, Harnstoff, Calciumcarbonat, Ammoniak etc. durchgeführt werden. Fall gewünscht, kann dem Medium während der Kultur ein Antibiotikum wie Ampicillin oder Tetracyclin zugegeben werden.
Im Falle der Züchtung von Mikroorganismen, die mit einem Expressionsvektor der einen induzierbaren Promotor verwendet, transformiert wurden, kann dem Medium, falls gewünscht, ein Induktor zugegeben werden. Beispielsweise kann dem Medium im Falle der Züchtung von Mikroorganismen, die mit einem Expressionsvektor der den lac-Promotor verwendet, transformiert wurden, IPTG oder dergleichen zugegeben werden; und im Falle der Züchtung von Mikroorganismen, die mit einem Expressionsvektor, der den trp-Promotors verwendet, transformiert wurden, kann dem Medium Indolacrysäure oder dergleichen zugegeben werden.
Die folgenden typischen Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Proteine können verwendet werden, um ICAT, das sich in der Kultur der vorstehend erwähnten Transformante angehäuft hat, zu isolieren und reinigen.
Wenn ICAT aus den Zellen sekretiert wird, häuft sich ICAT im Medium an. Demnach kann nach Beendigung der Züchtung Medium allein, aus dem die Zellen entfernt wurden, durch Verfahren wie Trennung durch Zentrifugation gewonnen werden. Es ist möglich, gereinigte Proben aus dem Medium unter Verwendung typischer Verfahren einzeln oder in Kombination für die Isolierung und Reinigung der Proteine zu erhalten; insbesondere Lösungsmittelextraktion, Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder dergleichen, Entsalzen, Präzipitation mit organischen Lösungsmitteln, Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Harzen wie DEAE-Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), Mono-Q (Amersham Pharmacia Biotech) usw., Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Harzen wie SP-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) und dergleichen, hydrophobe Chromatographie unter Verwendung von Harzen wie Butyl-Sepharose, Phenyl-Sepharose, Gelfiltration unter Verwendung eines Molekularsiebes, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, eletrophoretische Verfahren wie isolelektrische Fokussierung etc.
Wenn ICAT nach Beendigung der Züchtung in den Zellen der Transformante angehäuft wird, werden die Zellen der Transformante aus der Kultur durch ein Verfahren wie Zentrifugation gewonnen, anschließend in einem Puffer suspendiert und dann unter Verwendung eines Ultraschallgerätes, der French-Presse und dergleichen zertrümmert, so dass sich ein zellfreier Extrakt ergibt. Wenn ICAT in den Zellen löslich ist, kann die gereinigte Probe aus dem Überstand nach Zentrifugation des zellfreien Extrakts durch dasselbe Verfahren, wie für die Reinigung und Isolierung aus dem vorstehend erwähnten Medium erhalten werden. Wenn ICAT als Einschlusskörper in Zellen vorliegt, wird alternativ der zellfreie Extrakt durch Zentrifugation behandelt und dann können die ICAT-Einschlusskörperchen als präzipitierte Fraktion gewonnen werden. Diese ICAT-Einschlusskörperchen werden durch ein proteindenaturierendes Mittel solubilisiert, und dann wird die sich ergebende Lösung dialysiert, so dass sie kein proteindenaturierendes Mittel enthält, oder so dialysiert oder verdünnt, so dass ein derartig niedriger Spiegel des proteindenaturierenden Mittels das Protein nicht denaturiert, um die normale tertiäre Struktur von ICAT wiederherzustellen. Anschließend kann die gereinigte Probe durch dasselbe Verfahren für die Reinigung und Isolierung erhalten werden, wie vorstehend beschrieben.
Außerdem kann ICAT durch ein in vitro-Transkription-Translationssystem nach einem bekannten Verfahren (J. Biomolecular NMR, 6, 129–134, Science, 242, 1162–1164, J. Biochem., 110, 166–168 (1991)) produziert werden. Genau gesagt wird die ICAT-DNA stromabwärts eines Promotors wie SP6, T7 oder T3 ligiert, eine RNA-Polymerase, die für jeden Promotor spezifisch ist, lässt man zur Synthese einer großen ICAT-RNA-Menge damit in vitro reagieren, und dann kann ICAT von einem zellfreien Translationssystem, z.B. einem Translationssystem, bei dem Kaninchen-Retikulocytenlysat oder Weizenkeimextrakt verwendet wird, produziert werden.
Die Strukturanalyse für den gereinigten ICAT kann durch ein häufig verwendetes Verfahren in der Proteinchemie durchgeführt werden, beispielsweise ein Verfahren, wie in „Protein Structural Analysis for Gene Cloning" (H. Hirano, Tokyo Kagaku Doujin, 1993) beschrieben.
Das Vorhandensein der Bindung von ICAT oder einem Derivat davon, in dem die Aminosäuresequenz Substitutionen, Deletionen oder Additionen aufweist, mit dem Komplex zwischen β-Catenin und einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, kann bestimmt werden, indem abgeschätzt wird, ob die Transkription des Reportergen nachgewiesen wird oder nicht, indem ein Expressionsvektor für ein Fusionsprotein zwischen der Transkriptionsaktivierungsdomäne und jedem der von den DNAs codierten Proteine verwendet wird sowie indem ein Köderplasmid für β-Catenin im Hefe-Zweihybridsystem verwendet wird, wie in Abschnitt 1 gezeigt. Alternativ wird ICAT oder ein Derivat davon direkt mit β-Catenin in vitro gemischt und man lässt ihn/es binden, oder alternativ erfolgt, nachdem ICAT oder ein Derivat davon in Zellen exprimiert wird und die Bindungen in den Zellen erfolgt, die Immunpräzipitation für die Reaktionslösung oder den Zellextrakt unter Verwendung eines Antikörpers gegen β-Catenin. Dann wird das Vorhandensein von ICAT oder einem Derivat davon in dem Präzipitat durch Western-Blot-Analyse oder dergleichen bewertet und so das Vorhandensein der Bindung bestimmt. Anstatt einen Antikörper zu verwenden, wird alternativ ein Fusionsprotein hergestellt, das aus ICAT oder einem Derivat davon und einem Protein oder einem Peptid wie GST zur Erleichterung der Reinigung besteht, und man lässt das Fusionsprotein an β-Catenin binden, das z.B. mit ³⁵S markiert ist; nachdem das ICAT-Fusionsprotein gereinigt ist, wird das Vorliegen von markiertem β-Catenin in gereinigtem Material nachgewiesen, um das Vorhandensein der Bindung zu bestimmen.
Ferner ist es möglich, zu bestimmen, ob ICAT oder ein Derivat davon nicht nur an einen Komplex zwischen β-Catenin und einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, binden kann, sondern auch die Aktivität des Komplexes, die Transkription zu aktivieren, hemmen kann, indem ein Plasmid verwendet wird, in den ein Reportergen wie Luciferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase oder β-Galactosidase stromabwärts eines Promotors eingebaut wurde, der eine TCF-bindende Sequenz enthält, und zwar so, dass die Transkription von einem Komplex zwischen β-Catenin und einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, beispielsweise pTOPFLASH und pTOPCAT, aktiviert wird (Science, 275, 1784 (1997)). Das vorstehend erwähnte Expressionsplasmid mit einem Reportergen wird in tierische Zellen zusammen mit einem Expressionsplasmid für ein mutiertes β-Catenin eingeführt, das ständig an ein Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, binden kann, und daher die Transkription aktivieren kann, beispielsweise ein mutiertes β-Catenin, in dem der Serinrest 33 mit Tyrosin ersetzt wurde; ferner wird ein Expressionsplasmid von ICAT oder einem Derivat davon dazugegeben oder nicht, und dann wird der Spiegel der Reportergenexpression untersucht und zwischen den beiden Fällen verglichen, um zu bestimmen, ob ICAT oder ein Derivat davon die Transkriptionsaktivierung hemmen kann oder nicht.
3. Herstellung des Antikörpers, der ICAT erkennt
(1) Herstellung des polyclonalen Antikörpers
ICAT mit der gesamten Länge oder ein Teilfragment des Proteins, das durch das Verfahren, wie vorstehend in Abschnitt 2 beschrieben, erhalten wurde, kann als Antigen verwendet werden und einem Tier verabreicht werden, um einen polyclonalen Antikörper herzustellen.
Derartige Tiere, die für die Verabreichung verwendet werden können, schließen Kaninchen, Ziege, Ratte, Maus, Hamster etc. ein. Vorzugsweise wird das Antigen in einer Verabreichungsdosis von 50 bis 100 μg/Tier verwendet.
Wenn ein Peptid für diesen Zweck verwendet wird, wird vorzugsweise das Peptid als Antigen verwendet, nachdem es covalent an ein Trägerprotein wie KLH oder Rinder-Thyroglobulin gebunden wurde.
Nach der ersten Gabe wird das Antigen 3- bis 10-mal in 1- bis 2-wöchigen Intervallen verabreicht. Nach jeder Verabreichung wird 3 bis 7 Tage lang Blut vom Venengeflecht der Augenhintergründe abgenommen. Dann wird das Serum auf Reaktivität gegenüber dem für die Immunisierung verwendeten Antigen unter Verwendung eines Enzymimmuntestverfahrens („Methods of Enzyme Immuno-Assay (ELISA)": Igakushoin, 1976; „Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)) etc. getestet.
Es ist möglich, den polyclonalen Antikörper zu erhalten, indem die Seren aus nicht-menschlichen Säugern, die genügend hohe Antikörpertiter in ihren Seren gegen das für die Immunisierung verwendeten Antigen gezeigt haben, gesammelt werden und die Seren getrennt und gereinigt werden.
Derartige Verfahren zur Trennung und Reinigung schließen die Trennung durch Zentrifugation, Aussalzen mit 40 bis 50% gesättigtem Ammoniumsulfat, Präzipitation durch Caprylsäure („Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)) und ein Verfahren zur Verarbeitung ein, in dem chromatographische Verfahren, z.B. DEAE-Sepharose-Säule, Anionenaustausch-Säule, Protein A- oder G-Säule, Gelfiltrationssäule etc., einzeln oder in Kombination verwendet werden.
(2) Herstellung des monoclonalen Antikörpers
(2-1) Herstellung von antikörperproduzierenden Zellen
Ratten, deren Seren genügend hohe Antikörpertiter gegen das für die Immunisierung verwendeten Antigen gezeigt haben, wie vorstehend in (1) beschrieben, werden als Quelle der antikörperproduzierenden Zellen verwendet.
3 bis 7 Tage nach der letzten Verabreichung der Antigensubstanz an die Ratten, die derartige Antikörpertiter gezeigt haben, werden ihre Milzen entfernt.
Die Milzen werden in MEM in kleine Stücke geschnitten und mit der Pinzette zerdrückt. Nach der 5-minütigen Zentrifugation bei 1200 UpM wird der Überstand verworfen.
Die sich ergebende präzipitierte Fraktion der Milzzellen wird 1 bis 2 Minuten mit Tris-Ammoniumchlorid-Puffer (pH 7,65) behandelt, um die roten Blutzellen zu entfernen, dann werden die Milzzellen 3-mal mit MEM gewaschen. Die hergestellten Milzzellen werden als antikörperproduzierende Zellen verwendet
(2-2) Herstellung der Myelomzellen
Die zu verwendende Myelomzelle ist eine Zelllinie, die aus der Maus oder Ratte etabliert wird. Beispielsweise schließen die 8-Azaguanin-resistente Maus (von BALB/c stammende) -Myelom-Zelllinien, die verwendbar sind, P3-X63Ag8-U1(P3-U1) (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976)), SP2/0-Ag14(SP-2) (Nature, 276, 269 (1978)), P3-X63-8653(653) (J. Immunol., 123, 1548 (1979)), P3-X63-Ag(X63) (Nature, 256, 495 (1975)) und dergleichen ein. Zellen dieser Linien werden in 8-Azaguanin-Medium [RPMI1640-Medium, enthaltend 1,5 mMol/l Glutamin, 5 × 10^–5 Mol/l 2-Mercaptomethanol, 10 μg/ml Gentamicin und 10% fötales Kälberserum (CSL) (hier nachstehend als Normalmedium bezeichnet), ferner enthaltend 15 μg/ml 8-Azaguanin] Passagen unterworfen, aber 3 bis 4 Tage vor der Zellfusion werden die Zellen in Normalmedium gezüchtet. 2 × 10⁷ oder mehr Zellen werden für die Fusion verwendet.
(2-3) Herstellung der Hybridome
Die antikörperproduzierenden Zellen, die, wie in (2-1) beschrieben, hergestellt wurden, und Myelomzellen in (2-2) werden gut mit MEM oder PBS (1,83 g Dinatriumphosphat, 0,21 g Kaliumdihydrogenphosphat, 7,65 g Natriumchlorid, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,2) gewaschen, die Zellen werden in einem Verhältnis der Anzahl der antikörperproduzierenden Zellen: Myelom-Zellen = 5 bis 10 : 1 miteinander gemischt. Nachdem das Gemisch einer 5-minütigen Zentrifugation bei 1200 UpM unterzogen wurde, wird der Überstand verworfen.
Die aus der präzipitierten Fraktion hergestellten, gemischten Zellen werden gut dispergiert. Während die Zellen bei 37°C gerührt werden, werden dem Zellgemisch 0,2 bis 1 ml (pro 10⁸ antikörperproduzierender Zellen) einer Lösung aus 2 g PEG-1000, 2 ml MEM und 0,7 ml DMSO zugegeben; dann werden 1 bis 2 ml MEM mehrmals in 1- bis 2-minütigen Intervallen dazugegeben.
Nach der Zugabe werden die Zellen so hergestellt, indem weiter MEM zugegeben wird, so dass das Gesamtvolumen 50 ml beträgt.
Die hergestellte Suspension wird einer 5-minütigen Zentrifugation bei 900 UpM unterzogen, und dann wird der Überstand verworfen.
Die Zellen der sich ergebenden präzipitierten Fraktion werden sanft dispergiert und dann durch sanftes Pipettieren mit einer Messpipette in 100 ml HAT-Medium (ein Medium, dem 10^–4 Mol/l Hypoxanthin, 1,5 × 10^–5 Mol/l Thymidin und 4 × 10^–7 Mol/l Aminopterin zum Normalmedium zugegeben wurden) suspendiert.
In jede Vertiefung einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen wurden 100 μl-Aliquote der Suspension dispergiert. Dann werden die Zellen 7 bis 14 Tage in einem Inkubator mit 5% CO₂ bei 37°C gezüchtet.
Nach Beendigung der Züchtung wird ein Aliquot des Kulturüberstandes für die Auswahl der Hybridome, die auf das für die Immunisierung verwendete Antigen spezifisch reagieren, nach dem Enzym-Immuntest-Verfahren verwendet, wie in „Antibodies – A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 14 (1988)) etc. beschrieben, um die vorstehend erwähnten antikörperproduzierenden Zellen zu erhalten.
Ein spezifisches Beispiel des Enzym-Immuntest-Verfahrens ist wie folgt:
Eine geeignete Platte wird mit einer gereinigten Probe des Proteins mit der gesamten Länge der vorliegenden Erfindung oder einem Teilfragment davon, das als Antigen für die Immunisierung verwendet wird, beschichtet. Man lässt den Hybridom-Kulturüberstand oder den gereinigten Antikörper, der in (2-4) erhalten wird, wie nachstehend beschrieben, als primären Antikörper reagieren, und einen anti-Ratten-Immunglobulinantikörper, der mit Botin, einem Enzym, einer chemischlumineszierender Substanz, einem Radioisotop oder dergleichen markiert ist, lässt man weiter als zweiten Antikörper in der Platte reagieren. Anschließend erfolgt eine Reaktion entsprechend der Markierungssubstanz, und Zellen, die die spezifische Reaktivität gegenüber dem Protein der vorliegenden Erfindung zeigen, werden als Hybridome ausgewählt, die monoclonale Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung zu produzieren.
Die Hybridome werden zweimal durch das begrenzende Verdünnungsverfahren [mit HT-Medium (HAT-Medium ohne Aminopterin) in der ersten Clonierung und mit dem Normalmedium in der zweiten] cloniert. Zellen, die stabil hohe Antikörpertiter zeigen, werden als Hybridomlinien ausgewählt, die monoclonale Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung produzieren.
(2-4) Herstellung des monoclonalen Antikörpers
Die in (2-3) erhaltenen Hybridomzellen, die monoclonale Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung produzieren, werden 8 bis 10 Wochen alten Mäusen oder Nacktmäusen, die einer intraperitonealen Verabreichung von 0,5 ml Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) unterzogen wurden und 2 Wochen aufgezogen wurden, intraperitoneal injiziert (5 bis 20 × 10⁶ Zellen pro Maus). Die Hybridome bilden Asciteskarzinome in 10 bis 21 Tagen.
Die Ascitesflüssigkeit wird von jeder Maus gesammelt, die einen Ascitestumor aufweist, und wird dann einer 5-minütigen Zentrifugation bei 3000 UpM unterzogen, um das feste Material zu entfernen.
Die monoclonalen Antikörper können aus dem sich ergebenden Überstand durch dasselbe Verfahren gereinigt und hergestellt werden, wie für die Herstellung der polyclonalen Antikörper verwendet.
Die Untertypisierung der Antikörper kann unter Verwendung eines Typisierungskits für monoclonale Ratten- oder Mäuse-Antikörper erfolgen. Die Menge des Proteins kann nach dem Lowry-Verfahren oder unter Verwendung der Absorption bei 280 nm berechnet werden.
4. Verwendung der ICAT-DNA, des ICAT-Proteins und der Antikörper, die ICAT erkennen.

(1) Die ICAT-DNA der vorliegenden Erfindung kann als Sonde verwendet werden, um mRNA des ICAT-Gens unter Verwendung von aus dem Gewebe und Zellen extrahierter RNA in einem Gewebe oder Zellen durch Northern-Blot-Hybridisierung nachzuweisen oder zu quantifizieren (J. Sambrook et al. „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Es ist möglich, die Gewebeverteilung der ICAT-Expression durch Vergleich der Expressionsniveaus der mRNA in einer Vielfalt von Geweben zu zeigen.

Ferner kann ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zur Nucleotidsequenz der ICAT-DNA der vorliegenden Erfindung oder zu einer Teilnucleotidsequenz davon identisch oder komplementär ist, als Primer verwendet werden, der für die ICAT-DNA spezifisch ist, um die mRNA in dem Gewebe oder in den Zellen nachzuweisen oder zu quantifizieren, indem eine RT-PCR unter Verwendung von aus dem Gewebe oder den Zellen extrahierter RNA durchgeführt wird.
Ein Oligonucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zur Nucleotidsequenz der ICAT-DNA der vorliegenden Erfindung oder zu einer Teilnucleotidsequenz davon identisch oder komplementär ist, kann als Sonde verwendet werden, um eine in-situ-Hybridisierung der Gewebeabschnitte durchzuführen, so dass detailliertere Informationen über die Expressionsverteilung wie die Identifizierung der ICAT-exprimierenden Zellen in einem Gewebe erhalten werden.
Die durch diese Verfahren gelieferten Informationen darüber, welche Gewebe oder Zellen ICAT exprimieren oder Informationen darüber, welche Stimuli auf die Zellen deren Expressionsspiegel variieren, sind nützlich, um ICAT zu untersuchen, beispielsweise den Mechanismus der durch β-Catenin/TCF-4 vermittelten Signalübertragung, an dem ICAT beteiligt ist. Demnach können diese DNAs als Reagenzien zur Untersuchung von ICAT verwendet werden.
Ferner kann es Krebszellen mit Mutationen geben, die das Expressionsniveau von ICAT senken und nicht mehr länger die Aktivität von β-Catenin/TCF-4 durch die Mutation des ICAT-Gens hemmen, und demnach können diese DNAs als Diagnostika verwendet werden, um auf ICAT-Genexpression in einem derartigen Krebs zu testen.

(2) Es ist möglich, Abnormalitäten wie Deletionen des ICAT-Gens, Variationen der Kopienzahl und chromosomale Translokation und Mutationen in der Nucleotidsequenz des Gens wie Substitutionen, Deletionen, Additionen etc. unter Verwendung eines Oligonucleotids mit einer Nucleotidsequenz, die identisch oder komplementär zur ICAT-DNA ist, oder mit einer Teilnucleotidsequenz der DNA nachzuweisen.

Verfahren, um Abnormalitäten wie Deletionen, Variationen der Kopienzahl und chromosomale Translokation des ICAT-Gens nachzuweisen, schließen Southern-Hybridisierung ein. Genau gesagt kann chromosomale DNA, die mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten wurde, unter Verwendung von ICAT-DNA als Sonde durch Southern-Hybridisierung untersucht werden, um Abnormalitäten wie Deletionen, Variationen der Kopienzahl und die chromosomale Translokation des ICAT-Gens zu bestimmen.
Verfahren, um Mutationen wie Substitutionen, Deletionen, Additionen in der Nucleotidsequenz des ICAT-Gens nachzuweisen, schließen Southern-Hybridisierung, PCR und SSCP (Einzelstrangkonformationspolymorphismus) ein (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2766 (1989)).
Eine Mutation in der Nucleotidsequenz des ICAT-Gens kann durch Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden, wenn eine derartige Mutation, z.B. Substitution, Deletion und Addition, an einer Restriktionsschnittstelle des Gens lokalisiert ist.
Eine Mutation in der Nucleotidsequenz des ICAT-Gens kann durch PCR nachgewiesen werden, bei der das chromosomale ICAT-Gen durch ICAT-Oligonucleotide amplifiziert wird, um die Nucleotidsequenz des amplifizierten Fragments zu bestimmen.
Basierend auf dem Unterschied in der elektrophoretischen Mobilität aufgrund der Änderungen der Nucleotidsequenz, kann ein Unterschied in einem einzigen Nucleotid durch SSCP nachgewiesen werden, bei der einzelsträngige DNAs aus dem durch PCR amplifizierten Fragment einer Elektrophorese in einem nicht-denaturierenden Polyacryamidgel unterzogen werden.
Wenn es eine Mutation gibt, die häufig in Krebszellen gefunden wird, kann die chromosomale DNA durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde analysiert werden, die mit dem Mutationsort hybridisieren kann, um einen derartigen Krebs zu diagnostizieren.

(3) Es ist möglich, den Chromosomenort der ICAT-DNA durch das Strahlungshybrid-Verfahren (Science, 250, 245 (1990)) oder in-situ-Hybridisierung zu bestimmen (Annals of Human Genetics, 45, 135 (1981), Cell, 52, 51 (1988)).

Das Strahlungshybrid-Verfahren ist ein Verfahren zur Spezifizierung des genauen Chromosomenortes, bei dem die PCR durchgeführt wird, um das ICAT-Gen spezifisch in viele DNA-Panels zu amplifizieren, die menschliche Chromosomenfragmente (chromosomale Positionen der Fragmente wurden in den Panels unter Verwendung chromosomaler Marker) wie Genebridge 4 enthalten, und das Ergebnis der Amplifizierung wird analysiert.
In der in-situ-Hybridisierung werden zuerst die Signale nach der Hybridisierung der menschlichen ICAT-DNA nachgewiesen, die als Sonde für eine Probe von menschlichem Chromosom verwendet wird, und dann werden die Signale auf der Probe kartiert. Dies kann zur Identifizierung des physikalischen Ortes des ICAT-Gens auf dem Chromosom sowie zur entsprechenden Chromosomenziffer führen. Die Sonde wurde mit dem Radioisotop ³H oder Biotin markiert. Wenn die ³H-Markierung verwendet wird, dann kann das Signal durch Autoradiographie nachgewiesen werden; wenn alternativ Biotin verwendet wird, kann es mit Avidin, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff FITC markiert ist, nachgewiesen werden.
Wenn man ferner mit einem alternativen Verfahren anstelle des vorstehend erwähnten direkten Nachweisverfahrens des chromosomalen Orts des ICAT-Gens durch Durchsuchen von STS-Datenbanken auf Homologie zu der ICAT-DNA-Nucleotidsequenz herausfindet, dass eine STS (sequenzmarkierte Stelle: die Informationen über Primer, die von Nucleotidsequenzen von einer Vielfalt von ESTs stammen, und chromosomale DNA-Fragmente, die unter Verwendung der Primer amplifiziert werden, sowie Chromosomenorte der Fragmente besitzt eine Nucleotidsequenz umfasst, die mit einem Teil der ICAT-DNA identisch ist, dann kann eine derartige STS dem ICAT-Gen auf dem Chromosom entsprechen, und daher kann man annehmen, dass der Chromosomenort der STS dem Chromosomenort des ICAT-Gens entspricht.
Informationen über den sich ergebenden identifizierten Chromosomenort des ICAT-Gens können nützlich sein, um die Beziehung zwischen Krankheiten und dem ICAT-Gen zu untersuchen. Beispielsweise wurden als krebsassoziierte chromosomale Regionen, in denen das Vorliegen des Tumorsuppressorgens höchstwahrscheinlich ist, Hotspot-Regionen von LOH (Verlust der Heterozygosität: eine Chromosomendeletion, die man in einem Gen eines Genpaares findet) für Krebs identifiziert (ein Tumorsuppressorgen wird durch eine zusätzliche Mutation des Allels auf dem anderen Chromosom inaktiviert, das dem Tumorsuppressorgen in der LOH-Region auf einem Chromosom entspricht, was zur Entstehung einer Krebserkrankung führen kann); wenn eine derartige Region mit dem Chromosomenort des ICAT-Gens zusammenfällt, dann besteht die Möglichkeit, dass ICAT an der Entstehung von Krebs beteiligt ist, der ein LOH in dieser Region aufweist. In derartigen Fällen, wenn die Beteiligung von ICAT an dem Krebs durch Analyse von Mutationen und Expressionsniveaus des ICAT-Gens geklärt ist, können ICAT-DNA und ICAT oder ICAT-Antikörper verwendet werden, um diese Art von Krebs zu diagnostizieren und zu behandeln.

(4) ICAT kann durch das Verfahren, wie in Abschnitt 2 beschrieben, unter Verwendung von ICAT-DNA hergestellt und erhalten werden.
(5) In Krebszellen wie Colonkrebs, in dem das APC-Gen, β-Catenin-Gen oder ICAT-Gen mutiert wurde, glaubt man, dass das Unvermögen, die Transkriptionsaktivierung durch β-Catenin/TCF-4 zu hemmen, mit der Entstehung von Krebs assoziiert ist. Da ICAT die Hemmung der durch β-Catenin/TCF-4 vermittelten Transkriptionsaktivierung durch die Verabreichung von ICAT erreichen kann, kann ICAT als Therapeutikum für diese Krebsarten verwendet werden, bei denen die Hemmung der durch β-Catenin/TCF-4 vermittelten Transkriptionsaktivierung gehemmt wurde.

Für das Therapeutikum, das das vorstehend erwähnte ICAT enthält, kann das Protein allein als Therapeutikum verwendet werden, aber typischerweise wird bevorzugt, das Protein als Arzneimittel bereitzustellen, das durch jedes im Fachgebiet der Pharmazie bekannte Verfahren hergestellt wird, nachdem das Protein mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern gemischt wurde. Vorzugsweise wird eine sterilisierte Lösung verwendet, in der das Protein in Wasser oder in einem wässrigen Träger wie eine wässrige Lösung aus Natriumchlorid, Glycin, Glucose, menschliches Albumin etc. gelöst wurde. Außerdem ist es möglich, pharmazeutisch verträgliche Zusatzstoffe wie puffernde Agentien und isotonische Mittel, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Natriumlactat, Kaliumchlorid, Natriumcitrat etc. zuzugeben, um sich den physiologischen Bedingungen zur Herstellung der Lösung so stark wie möglich anzunähern. Alternativ ist es möglich, es zur Lagerung gefrierzutrocknen und es dann nach Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel zum Verwendungszeitpunkt zu verwenden. Es ist vorzuziehen, einen Verabreichungsweg zu verwenden, durch den die Behandlung am effektivsten erreicht wird, und typischerweise ist ein derartiger effektiver Verabreichungsweg ein parenteraler Weg, beispielsweise ein subkutaner, intramuskulärer, intravenöser, intrabronchialer Weg.

(6) Es ist möglich, Krebs zu behandeln, indem einem Patienten ein Vektor zur Gentherapie, in den ICAT-DNA eingebaut wurde, verabreicht wird und man die ICAT-DNA in Zielzellen exprimieren lässt, anstatt ICAT von außen wie in (5) zu verabreichen
(7) Antikörper, die ICAT erkennen, können durch das Verfahren hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben, wobei ICAT als Antigen verwendet wird.
(8) ICAT kann unter Verwendung eines ICAT erkennenden Antikörpers nachgewiesen werden. Das Verfahren schließt spezifisch ein Nachweisverfahren wie ELISA, bei dem Mikrotiterplatten verwendet werden, das Fluoreszenzantikörperverfahren, die Western-Blot-Analyse oder die immunhistologische Färbung ein.
(9) ICAT kann unter Verwendung eines ICAT erkennenden Antikörpers quantifiziert werden. Derartige Verfahren schließen spezifisch Sandwich-ELISA unter Verwendung von zwei Arten von monoclonalen Antikörpern, die verschiedene Epitope, unter den Antikörpern besitzen und mit ICAT in der flüssigen Phase reagieren können, den Radioimmuntest unter Verwendung von ICAT, das mit einem Radioisotop wie ¹²⁵I markiert ist, und einen Antikörper, der ICAT erkennt, etc. ein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A gibt die Positionen der ORFs in der Maus-ICAT-cDNA und menschlichen ICAT-cDNA an. 1B zeigt den Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen Maus-ICAT und menschlichem ICAT.
2 zeigt die Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse für die ICAT-mRNA in Maus-Geweben. Von links: Hoden; Niere, Skelettmuskel, Leber, Lunge, Milz Gehirn, Herz und Tag-7-, Tag-11-, Tag-15-, Tag-17-Fötus. Die rechts dargestellten Zahlen entsprechen den Positionen der Längenmarker.
3 zeigt ein Ergebnis der Western-Blot-Analyse, die nach der Immunpräzipitation mit anti-ICAT-Antikörper durchgeführt wurde. Die beiden Spuren links enthalten Maus-Gehirnextrakt; die beiden Spuren rechts enthalten die Probe mit COS-7-Zellen, in die ein ICAT-Expressionsvektor eingeführt wurde. Ag+ bedeutet, dass die Spuren Proben enthalten, in denen der anti-ICAT-Antikörper verwendet wurde, nachdem sie mit dem Antigenpeptid behandelt wurden.
4 zeigt die Bindung von ³⁵S-markierten Proteinen mit GST/ICAT oder GST. Von links aus gesehen sind die jeweiligen Proteine β-Catenin, ein N-terminaler Anteil von β-Catenin (Aminosäuresequenz von Rest 1 bis 140), die Armadillo-Domäne von β-Catenin (Aminosäuresequenz der Reste 141 bis 664), ein C-terminaler Anteil von β-Catenin (Aminosäuresequenz der Reste 665 bis 782), DVL-1, GSK-3β, APC, Axin und TCF-4. Das obere Feld zeigt ein Muster der Autoradiographie nach der SDS-PAGE für die in der in-vitro-Translation erhaltenen Produkte; die Pfeile stellen die Positionen der Proteine von Interesse dar. Das mittlere Feld zeigt ein Muster der Autoradiographie nach der SDS-PAGE für Fraktionen, die mit GST/ICAT gebunden haben; das untere Feld zeigt ein Muster der Autoradiographie nach der SDS-PAGE für Fraktionen, die mit GST gebunden haben. Die rechts dargestellten Zahlen entsprechen den Positionen der Molekulargewichtsmarker in kDa.
5 zeigt ein Ergebnis der Western-Blot-Analyse nach der Immunpräzipitation mit dem anti-ICAT-Antikörper oder anti-β-Catenin-Antikörper. Im oberen und unteren Feld sind die Proben Maus-Gehirnextrakt; im mittleren Feld waren die verwendeten Proben COS-7-Zellen, in die ein ICAT-Expressionsvektor eingeführt worden war. Die beiden Spuren links enthalten Immunpräzipitate mit dem anti-ICAT-Antikörper; die beiden Spuren rechts enthalten Immunpräzipitate mit dem anti-β-Catenin-Antikörper. Das obere, mittlere oder untere Feld zeigt Western-Blot-Analysen, wobei jeweils der anti-β-Catenin-Antikörper, anti-ICAT-Antikörper oder anti-TCF-4-Antikörper als primärer Antikörper verwendet wurde.
6 zeigt ein Ergebnis eines Tests auf β-Catenin/TCF-4-vermittelte Transkriptionsaktivierung unter Verwendung eines Luciferase-Reporterplasmids, pTOPtkLuciferase, in 293-Zellen. In den 4 Spuren von oben ausgehend wurde kein mutiertes S33Y-β-Catenin verwendet; mutiertes S33Y-β-Catenin wurde in den restlichen 4 Spuren exprimiert. Die Spuren 1 und 5 enthalten den Kontrollvektor allein; die Spuren 2 und 6 enthalten den eingeführten ICAT-Expressionsvektor; die Spuren 3 und 7 enthalten den eingeführten ICAT(13–81)-Expressionsvektor; die Spuren 4 und 8 enthalten den eingeführten ICAT(E37–39A)-Expressionsvektor.
7 zeigt Ergebnisse des Tests auf β-Catenin/TCF-4-assoziierte Transkriptionsaktivierung unter Verwendung eines Luciferase-Reporterplasmids, pTOPtkLuciferase, in DLD-1-Zellen (oberes Feld) und HCT116-Zellen (unteres Feld). Die linken Felder zeigen die Ergebnisse mit dem ICAT-Expressionsvektor, die mittleren mit dem ICAT(13–81)-Expressionsvektor; die rechten Felder mit dem ICAT(E37–39A)-Expressionsvektor. Von oben ausgehend wurde das Ergebnis mit jeweils 0, 0,1, 0,25, 0,5 oder 1 μg ICAT- oder mutierten ICAT-Expressionsvektor erhalten.
Beste Art und Weise, die Erfindung durchzuführen
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend detailliert unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben.
Beispiel 1 Clonierung der ICAT-DNA
Ein Gen, das ein Protein codiert, das an den Maus-mβ-Cateninarm binden kann, wurde durch das Hefe-Zweihybridsystem cloniert.
(1) Herstellung des Köderplasmids für den mβ-Cateninarm
Die Nucleotidsequenz der Maus-β-Cateninarm-cDNA und die Aminosäuresequenz von Maus-β-Catenin, die von der cDNA codiert wird, sind öffentlich bekannt (GenBank-Hinterlegungsnr.: M90364, Science, 257, 1142 (1992)). Maus-β-Catenin enthält eine Wiederholungssequenz, die als Armadillo-Domäne (mβ-Cateninarm) bezeichnet wird, im Bereich der Reste 141 bis 664 seiner Aminosäuresequenz. Ein DNA-Fragment von Maus-β-Catenin, das diesen Anteil des mβ-Cateninarms codiert, wurde amplifiziert und durch PCR unter Verwendung von cDNA aus Mauszellen als Matrize isoliert. Die PCR-Primer wurden basierend auf der Nucleotidsequenz des Anteils der cDNA konstruiert, die den vorstehend erwähnten mβ-Cateninarm codiert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass es den mβ-Cateninarm codiert, und dann wurde das Fragment in einen pGBT9-Vektor (Clontech) zwischen den BamHI/SalI-Schnittstellen eingebaut, um ein Plasmid für die Expression von GAL4-β-Catenin-Fusionsprotein herzustellen, in dem β-Catenin mit GAL4 BD fusioniert ist.
(2) Durchmustern unter Verwendung des Zweihybridsystems
Das Durchmustern erfolgte mit der MATCHMAKER-Maus-Fötus-cDNA-Genbank (Swiss Webster/NHI-Maus; 17 Tage alter Embryo), die eine für das Zweihybridsystem zu verwendende Genbank ist und von Clontech bereitgestellt wird. Diese cDNA-Genbank enthält den Vektor pGAD10 (Clontech) mit cDNA-Insertion und als Selektionsmarker ein Gen LEU2, das an der Leucinbiosynthese in Hefe beteiligt ist, und kann Fusionsproteine zwischen GAL4 AD und cDNA-codierten Proteinen exprimieren, indem ein ADH1-Promotor verwendet wird. Das spezifische Verfahren für das Durchmustern, das nach der beiliegenden Anleitung zur Genbank von Clontech verwendet wurde, lautet wie folgt.
Genau gesagt wurden sowohl die Maus-Fötus-cDNA-Genbank für das Zweihybridsystem als auch das in (1) hergestellte Plasmid GAL4-β-Catenin in den Saccharomyces cerevisiae HF7C-Hefestamm (Clontech) eingeführt. Der HF7C-Stamm ist ein Hefestamm, der Tryptophan-, Leucin- und Histindin-auxotroph ist und auf dem Chromosom ein Reportergen, ein Gen, das an der Histidinbiosynthese, beteiligt ist, HIS3 das stromabwärts des GAL1-Promotors ligiert wurde, an den GAL4 BD binden kann, sowie das von E. coli stammende β-Galactosidase-Gen LacZ besitzt, das stromabwärts einer Nucleotidsequenz ligiert wurde, an die GAL4 BD binden kann (Gene, 212, 197 (1998)). Eine Transformante, die sowohl das Plasmid GAL4-β-Catenin als auch den cDNA-Clon für das Protein enthält, das an den β-Cateninarm binden kann, und die jeweiligen Fusionsproteine exprimiert, ist für Histidin nicht auxotroph und ist positiv für die β-Galactosidase-Aktivität, da GAL4 BD neben GAL4 AD eingebaut wurde, und die Transkription des HIS3-Gens und des LacZ-Gens aufgrund der Bindung zwischen dem β-Cateninarm und dem Bindeprotein stromabwärts der Nucleotidsequenz, an die GAL4 BD bindet, aktiviert wird. Schließlich wurden vier Clone, die auf einem Medium ohne Leucin, Histidin und Tryptophan gezüchtet wurden, aus 2,3 × 10⁷ Transformanten als Kolonien ausgewählt, die positiv für die β-Galactosidase-Aktivität waren.
Aus diesen Clonen wurden Plasmid-DNAs gewonnen, und die Nucleotidsequenzen wurden für die eingebauten cDNAs bestimmt. Den vier Clonen war dieselbe cDNA-Sequenz gemeinsam. Nucleotidsequenzdatenbanken wurden auf Homologie zu der Nucleotidsequenz durchsucht. Obwohl es einige Nucleotidsequenzen der Maus-ESTs gibt, die identisch zu der Sequenz sind, fand man keine bekannten Gene, die identisch zu den Nucleotidsequenzen waren. Demnach wurde geklärt, dass die vorstehend erwähnte cDNA, die durch das Zweihybridsystem isoliert wurde, eine cDNA war, die von einem neuen Gen stammte. Das von diesem neuen Gen codierte Protein wurde als ICAT bezeichnet.
Unter den gefundenen Nucleotidsequenzen der ESTs waren einige im Vergleich zu den cDNAs, die durch das Zweihybridsystem erhalten wurden, mehr in die 5'-Richtung verlängert. Daher wurde ein Sense-Primer für die PCR hergestellt, der auf der Nucleotidsequenz vom 5'-Ende von einer davon basierte (GenBank-Hinterlegungsnr.: AA017805), und ferner wurde ein Antisense-Primer hergestellt, der auf der Nucleotidsequenz eines Maus-EST (GenBank-Hinterlegungsnr.: AA253623) mit der Nucleotidsequenz basierte, die zur vorstehend erwähnten ICAT-cDNA identisch war. Ein cDNA-Fragment, das eine Nucleotidsequenz enthält, die weiter in die 5'-Richtung verlängert war, wurde durch PCR unter Verwendung dieser Primer und unter Verwendung der fötalen Maus-cDNA-Genbank (Clontech) als Matrize amplifiziert, und dann wurde die Sequenz bestimmt. Die gesamte Nucleotidsequenz der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Maus-ICAT-cDNA wurde durch Zusammenbauen der Nucleotidsequenz des cDNA-Clons erhalten, der durch das Zweihybridsystem hergestellt wurde, und die cDNA-Nucleotidsequenz wurde durch PCR ermittelt. In dieser Nucleotidsequenz gibt es mehrere offene Leserahmen (ORFs). Derartige ORFs, die 50 oder mehr Aminosäuren enthalten, sind die Reste 1 bis 273 (91 Aminosäuren; kein Initiationscodon darin); Reste 167 bis 409 (81 Aminosäuren); Reste 447 bis 647 (67 Aminosäuren); Reste 1122 bis 1304 (61 Aminosäuren) and Reste 1711 bis 2373 (221 Aminosäuren) (1A), aber es war nur basierend auf der Nucleotidsequenz unklar, welcher davon der echte ORF war, der den ICAT codiert. Dann wurde ein ORF mit 81 Aminosäuren vom Initiationscodon das am meisten 5' lag (SEQ ID NO: 6; was den Resten 167 bis 409 in der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 entspricht), als der Anteil, der ICAT codiert, hypothetisch angenommen. Die Aminosäuresequenz dieses ORF ist in SEQ ID NO: 4 als Aminosäuresequenz von Maus-ICAT dargestellt. Es wurde nach der Homologie der Aminosäuresequenz in der Aminosäuresequenzendatenbank gesucht, aber es gab keine Aminosäuresequenz mit hoher Homologie.
(3) Clonierung der menschlichen ICAT-cDNA
Die GenBank-Nucleotidsequenzdatenbank wurde auf menschliche Nucleotidsequenzen mit Homologie zur Nucleotidesequenz von der in (2) erhaltenen Maus-ICAT-cDNA durchsucht, dann wurde gezeigt, dass einige ESTs hohe Homologie zeigten. Ferner wurden ESTs gesammelt, von denen angenommen wurde, dass sie von menschlicher ICAT-cDNA stammten, indem ESTs getestet wurden, die Sequenzen mit diesen ESTs oder ESTs, die von einem identischen Clon stammten, gemeinsam hatten (typischerweise gibt es zwei ESTs mit der Sequenz des 5'-Endes und der Sequenz des 3'-Endes in einem einzelnen cDNA-Clon), und die sich ergebenden ESTs wurden basierend auf den Nucleotidsequenzen analysiert, um zu bestimmen, welchem Teil der menschlichen ICAT-cDNA jeder EST entspricht. Außerdem wurde abgeschätzt, welcher Teil der menschlichen ICAT-cDNA mit der gesamten Länge in dem cDNA-Clon enthalten war, indem bestimmt wurde, ob die Nucleotidsequenzen dieser ESTs auf der 5'-Seite oder der 3'-Seite des cDNA-Clons lokalisiert ist, der für die Bestimmung der Nucleotidsequenz verwendet wurde. Basierend auf dem analytischen Ergebnis wurden ESTs mit den Hinterlegungsnr. AA478738, W73346 und AA428913 in GenBank unter diesen ESTs ausgewählt, und dann wurden die Eltern-cDNA-Clone, die zur Bestimmung dieser Nucleotidsequenz der ESTs verwendet wurden, nämlich die Clone IMAGE75366 (der 5'-seitige EST ist AA478738; man nimmt an, dass der cDNA-Clon das 5'-Ende der menschlichen ICAT-cDNA enthält), IMAGE344405 (der 3' seitige von EST ist W73346; man nimmt an, dass der cDNA-Clon den zentralen Teil der menschlichen ICAT-cDNA enthält) und IMAGE759649 (der 5'-seitige EST ist AA428913; man nimmt an, dass der cDNA-Clon das 3'-Ende der menschlichen ICAT-cDNA enthält), vom I.M.A.G.E.-Konsortium erhalten. Ein phlCAT-cDNA-Clon, der fast die gesamte Länge der menschlichen ICAT-cDNA umfasst, wurde hergestellt, indem in diesen cDNA-Clonen enthaltene cDNAs durch das folgende Verfahren zusammengefügt wurden.
Zuerst erfolgte die PCR unter Verwendung von IMAGE75366 als Matrize und unter Verwendung eines (a) Sense-Primers, der eine hinzugefügte EcoRI-Schnittstelle am 5'-Ende der Nucleotidesequenz neben dem 5'-Ende des cDNA-Anteils besitzt (die genau gesagt eine Nucleotidesequenz ist, die neben dem 5'-Ende von AA478738 liegt und der Sequenz nach dem 9. Nucleotid von SEQ ID NO: 1 entspricht) und unter Verwendung eines (b) Antisense-Primers, der eine am 742. Rest von SEQ ID NO: 1 lokalisierte PstI-Schnittstelle und davon stromabwärts liegende Nucleotidsequenz enthält; das amplifizierte DNA-Fragment von etwa 760 bp wurde mit EcoRI und PstI gespalten, um es zu isolieren. Dann wurde IMAGE759649 mit PstI und EcoRI gespalten, und ein DNA-Fragment, das den Vektor pT7T3D-Pac und einen 3'-Anteil (Anteil nach der PstI-Schnittstelle, die sich am 980. Rest in SEQ ID NO: 1 befindet) der menschlichen ICAT-cDNA enthält, wurde isoliert. Das Plasmid (Sequenz der Reste 747 bis 979 von SEQ ID NO: 1 wird in der cDNA dieses Plasmids deletiert), das hergestellt worden war, indem beide miteinander ligiert wurden, wurde mit PstI gespalten und dann wurden die Phosphatgruppen am Ende, die durch die Spaltung erhalten wurden, entfernt, indem sie mit alkalischer Phosphatase behandelt wurden, um die Ligierung mit sich selbst zu verhindern. Diese DNA wurde mit einem DNA-Fragment von etwa 240 bp ligiert, das nach der Spaltung von IMAGE344405 mit PstI isoliert worden war. Ein Plasmid-Clon, in den das PstI-Fragment in der gewünschten Orientierung eingebaut worden war, wurde als cDNA-Clon ausgewählt, der die menschliche ICAT-cDNA mit fast der gesamten Länge enthielt, indem die Nucleotidsequenz in der Nähe der PstI-Schnittstelle bestimmt wurde, und dann wurde der sich ergebende Clon als phlCAT bezeichnet. Die gesamte Nucleotidsequenz der cDNA in phlCAT wurde für die Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-cDNA bestimmt. In dieser Nucleotidsequenz waren 8 Nucleotide am 5'-Ende der cDNA-Nucleotidsequenz von phlCAT (entspricht den Resten 1 bis 8 in der Nucleotidsequenz von AA478738) während des Herstellungsverfahrens von phlCAT entfernt worden, und daher wird die eine Sequenz, der die Nucleotidsequenz hinzugefügt wurde, in SEQ ID NO: 1 als die Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-cDNA mit der gesamten Länge dargestellt. Wie man in 1A sieht, gab es auch in dieser Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-cDNA mehrere ORFs, die 50 oder mehr Aminosäuren codieren (Reste 2 bis 210 (70 Aminosäuren; es gibt kein Initiationscodon); Reste 274 bis 516 (81 Aminosäuren); Reste 545 bis 709 (55 Aminosäuren); Reste 1206 bis 1388 (61 Aminosäuren); Reste 1822 bis 2025 (68 Aminosäuren) und Reste 2547 bis 2864 (106 Aminosäuren)). Wenn jedoch die Position des ORF in jeder ICAT-cDNA aus dem Menschen und der Maus und ihre Aminosäuren, die von den ORFs codiert werden, miteinander verglichen wurden, zeigte nur ein 81 Aminosäuren codierender ORF, der den Nucleotidresten 274 bis 516 der menschlichen ICAT-cDNA entspricht, Homologie mit der Aminosäuresequenz des Maus-ICAT und er war an einer ähnlichen Position wie diejenige in der Maus-cDNA lokalisiert. Der ORF entsprach dem vermeintlichen ORF, der den in (2) hypothetisch angenommenen Maus-ICAT codiert, und besaß Homologie dazu. Demnach wurde gezeigt, dass die Region, die ICAT codiert, wie hypothetisch angenommen wurde, den Resten 167 bis 409 in SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 6) für Maus-ICAT-cDNA oder der Region der Reste 274 bis 516 in SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 5) für menschliche ICAT-cDNA entspricht. Die Nucleotidsequenz der menschlichen ICAT-DNA ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt und die Aminosäuresequenz des menschlichen ICAT ist in SEQ ID NO: 2 dargestellt. Der Sequenzvergleich zwischen den Aminosäuren des menschlichen ICAT und Maus-ICAT ist in 1B dargestellt. Es gab nur einen Unterschied in 2 Aminosäuren in 81 Aminosäuren zwischen menschlichen und Maus-ICATs.
Beispiel 2 Analyse der Expression des ICAT-Gens durch Northern-Blot-Analyse
Die Northern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung von Maus-ICAT-cDNA, die in Beispiel 1 erhalten worden war, als Sonde durchgeführt durch das Zufallspriming-Markierungsverfahren mit einem MTN-Blot (Clontech) markiert, was ein Filter war, auf dem Poly (A)⁺-RNAs von verschiedenen Organen von ausgewachsenen Mäusen (Herz, Gehirn, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Hoden) und Maus-Föten (Tag-7, Tag-11, Tag-15 und Tag-17) überführt worden waren.
Das Ergebnis ist in 2 dargestellt. Eine 2,6 kb-Spezies der ICAT-mRNA wurde nachgewiesen. Unter Organen der ausgewachsenen Mäuse wurde die mRNA mit hohen Spiegeln im Herz, im Gehirn, in der Leber und im Skelettmuskel exprimiert, und die Spiegel waren niedriger in der Niere, im Hoden, in der Milz und in der Lunge. Die mRNA wurde in allen fötalen Stadien mit demselben Spiegel exprimiert.
Beispiel 3 Herstellung des anti-ICAT-Antikörpers
Ein Peptid (Aminosäuresequenz: Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg Gln), das den Resten 70 bis 81 am C-Terminus der Aminosäuresequenzen der Maus- und menschlichen ICATs entspricht, wurde von einem Peptidsynthetisiergerät synthetisiert. Das Peptid wurde mit KLH unter Verwendung von MBS als Spacer konjugiert und dann als Antigen verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Die Immunisierung erfolgte durch subkutane Injektion von 1 mg Antigen in der ersten Immunisierung, von 0,5 mg Antigen in 10-tägigen Intervallen nach der zweiten Immunisierung. Der Antikörpertiter wurde nach der subkutanen Injektion durch ELISA auf die Reaktivität gegenüber dem vorstehend erwähnten Peptid im Serum getestet, das von Kaninchen seit der dritten Immunisierung gesammelt wurde. Wenn die Titer hoch genug wurden, wurden die Gesamtseren von den Kaninchen gesammelt, um anti-ICAT-Antiseren zu erhalten. Die anti-ICAT-Antiseren wurden der Behandlung mit Ammoniumsulfatpräzipitation unterzogen und dann dialysiert. Der polyclonale anti-ICAT-Antikörper wurde gereinigt und unter Verwendung einer Affinitätssäule aus dem Dialysat erhalten, in der das als Antigen verwendete Peptid auf Träger aus EAH-Sepharose (Amersham-Pharmacia Biotech) immobilisiert worden war. Der gereinigte polyclonale anti-ICAT-Antikörper wird hier nachstehend als anti-ICAT-Antikörper bezeichnet. Es wird nachstehend in den Beispielen 4 bis 7 gezeigt, dass der Antikörper spezifische Reaktivität gegenüber Maus-ICAT besitzt.
Beispiel 4 Expression des rekombinanten ICAT in E. coli und dessen Nachweis
(1) Expression von ICAT in E. coli
Die Maus-ICAT-cDNA wurde zwischen den EcoRI/SalI-Schnittstellen im Glutathion-S-Transferase (GST)-Expressionsplasmidvektor pGEX5X-1 (Amersham-Pharmacia Biotech) für E. coli subcloniert, um ein Expressionsplasmid für das Fusionsprotein herzustellen, in dem ICAT am C-Terminus von GST fusioniert ist (hier nachstehend als GST/ICAT bezeichnet). E. coli wurde mit diesem Plasmid transformiert und dann gezüchtet. Als Kontrolle wurde mit pGEXSX-1 transformierter E. coli (dieser E. coli exprimiert GST allein) ebenfalls gezüchtet.
(2) Nachweis von ICAT durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse
Die in (1) gezüchteten Transformanten wurden gewonnen, und dann wurde Puffer A (Lysepuffer A; Zusammensetzung von Puffer A: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 140 mMol/l NaCl, 1 mMol/l EGTA, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin), enthaltend 1% Triton X-100, dazugegeben, um die Bakterien zu lysieren. Man ließ das Zelllysat mit dem in Beispiel 3 erhaltenen anti-ICAT-Antikörper 1 Stunde bei 4°C reagieren, so dass sich ein Immunkomplex zwischen GST/ICAT und dem Antikörper bildete, und dann wurde der Reaktion Protein G-Sepharose 4B (Amersham-Pharmacia Biotech) zugegeben, das die Eigenschaft besitzt, an IgG zu binden, um den Immunkomplex zu adsorbieren. Nachdem Protein G-Sepharose 4B gut mit Lysepuffer A gewaschen worden war, wurde SDS-PAGE-Probenpuffer dazu gegeben, um den Immunkomplex zu eluieren. Das Eluat wurde als Probe in der SDS-PAGE verwendet und dann auf eine PVDF-Membran (Immobilon P; Millipore) transferiert. Der Nachweis von ICAT erfolgte mit dieser Membran unter Verwendung des anti-ICAT-Antikörpers als primärem Antikörper und unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als sekundärem Antikörper.
Das Ergebnis zeigte, dass eine Bande als Folge der Reaktion zwischen GST/ICAT und dem anti-ICAT-Antikörper in E. coli nachgewiesen wurde, der GST/ICAT exprimiert, aber im Kontroll-E. coli wurde keine Bande nachgewiesen, der GST exprimiert. Demnach wurde gezeigt, dass der in Beispiel 3 erhaltene anti-ICAT-Antikörper ein Antikörper sein kann, der spezifisch mit ICAT reagiert und von der Art ist, dass der Nachweis von ICAT sowohl bei der Immunpräzipitation als auch bei der Western-Blot-Analyse erbracht werden kann.
Beispiel 5 Expression und Nachweis von rekombinantem ICAT in tierischen Zellen
Die Maus-ICAT-cDNA, die in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde zwischen die EcoRI/SalI-Schnittstellen in den Plasmidvektor pMKITneo (Nakamura et al., Genes to Cells, 3, 395 (1998)) zur Expression in tierischen Zellen subcloniert, um ein ICAT-Expressionsplasmid in tierischen Zellen herzustellen. Die Plasmid-DNA wurde mit LipofectAMINE (Life Technologies) in die Affennieren-Zellinie COS-7 (ATCC: CRL-1651) eingeführt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen gewonnen, das Zelllysat wurde auf dieselbe Weise hergestellt wie in Beispiel 4, und dann erfolgte der Nachweis durch Western-Blot-Analyse nach der Immunpräzipitation mit dem anti-ICAT-Antikörper. Wie in 3 dargestellt, zeigte das Ergebnis, dass eine Bande für ein 9 kDa-Protein nachgewiesen wurde. Das Molekulargewicht von 9 kDa ähnelte dem Molekulargewicht, das anhand der Aminosäuresequenz von ICAT abgeschätzt wurde. Wenn man ferner den anti-ICAT-Antikörper zuvor mit dem Teilpeptid von ICAT, der für die Immunisierung verwendet worden war, reagieren ließ und dann die Immunpräzipitationsreaktion erfolgte, wurde die ICAT-Bande nicht nachgewiesen und daher wurde die Reaktion zwischen dem Antikörper und ICAT gehemmt.
Beispiel 6 Synthese von ICAT durch das in-vitro-Translationssystem und dessen Nachweis mit Antikörper
ICAT wurde aus Maus-ICAT-mRNA unter Verwendung des TNT-Retikulocyten-Lysatsystems (Promega) in vitro translatiert und synthetisiert. Der synthetisierte ICAT wurde nach der Immunpräzipitation unter Verwendung des anti-ICAT-Antikörpers auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 einer Western-Blot-Analyse unterzogen, und dann wurde eine ICAT-Bande nachgewiesen. Demnach wurde ICAT, das durch das in-vitro-Translationssystem synthetisiert wurde, auch an den anti-ICAT-Antikörper gebunden und bildete einen Immunkomplex.
Beispiel 7 Nachweis von ICAT im Maus-Gehirn unter Verwendung von Antikörper
Das Gehirn aus einer 49 Tage alten Maus wurde in Lysepuffer A mit einem Dounce-Homogenisator zerdrückt, um ein Lysat herzustellen. Das Lysat wurde nach der Immunpräzipitation unter Verwendung des anti-ICAT-Antikörpers auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 einer Western-Blot-Analyse für den Nachweis unterzogen. Wie in 3 dargestellt, zeigte das Ergebnis, dass eine Bande eines 9 kDa-Proteins nachgewiesen wurde. Da ein 9 kDa-Protein auch in Beispiel 5 nachgewiesen wurde, wird angenommen, dass das ICAT-Genprodukt im Gehirn das 9 kDa-Protein ist. Außerdem wurde gezeigt, dass der in Beispiel 3 erhaltene anti-ICAT-Antikörper ein Antikörper ist, der mit ICAT in Geweben reagiert, und ein derartiger Antikörper ist, so dass der Nachweis von ICAT sowohl bei der Immunpräzipitation als auch bei der Western-Blot-Analyse erbracht werden kann.
Beispiel 8 Analyse der Bindung zwischen ICAT und β-Catenin
(1) Nachweis der direkten Bindung in vitro
Die direkte Bindung von ICAT an β-Catenin wurde wie folgt nachgewiesen.
³⁵S-markiertes β-Catenin wurde aus Maus-β-Catenin-mRNA in vitro translatiert und synthetisiert, indem das ³⁵S-markierte Methionin-TNT-Retikulocyten-Lysatsystem (Promega) verwendet wurde. Der GST/ICAT-exprimierende E. coli sowie der in Beispiel 3 hergestellte GST-exprimierende Kontroll-E. coli wurden gezüchtet, um die jeweiligen Bakterienlysate zu erhalten. Diesen Bakterienlysaten wurde Glutathion-Sepharose 4B (Amersham-Pharmacia Biotech) zugegeben, und GST/ICAT oder GST wurden darauf adsorbiert, um es zu isolieren. Man ließ die GST/ICAT- oder GST-adsorbierte Glutathion-Sepharose 4B mit dem vorstehend erwähnten ³⁵S-markierten β-Catenin in Puffer A, enthaltend 0,1% Triton X-100, 2 Stunden bei 4°C reagieren. Danach wurde die Glutathion-Sepharose 4B gut mit Puffer A gewaschen, und dann wurde der SDS-PAGE-Probenpuffer dazugegeben, um das gebundene Protein in den Probenpuffer zu eluieren. Das Eluat wurde als Probe in der SDS-PAGE verwendet, in der die Gelkonzentration 15% betrug, und dann wurde das Gel durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das Ergebnis zeigte, dass eine Bande mit ³⁵S-markiertem beim GST/ICAT-exprimierenden E. coli nachgewiesen wurde, aber keine Bande beim GST-exprimierenden E. coli nachgewiesen wurde. Demnach wurde nachgewiesen, dass GST/ICAT direkt an β-Catenin in vitro bindet und dass die Stelle, die für die Bindung an β-Catenin verantwortlich ist, innerhalb der ICAT-Einheit von GST/ICAT lokalisiert ist.
(2) Der Bereich von β-Catenin, der für die Bindung mit ICAT verantwortlich ist.
Der Bereich von β-Catenin, der für die Bindung mit ICAT verantwortlich ist, wurde wie folgt bestimmt. DNA-Fragmente, die die Region der Armadillo-Domäne von Maus-β-Catenin codieren (Reste 141 bis 664 in der Aminosäuresequenz), der N-terminale Anteil (Reste 1 bis 140 in der Aminosäuresequenz) und der C-terminale Anteil (Reste 665 bis 782 in der Aminosäuresequenz) wurden durch PCR amplifiziert. Unter Verwendung der DNAs wurden mRNAs synthetisiert und in Gegenwart von ³⁵S-markiertem Methionin durch das TNT-Retikulocyten-Lysatsystem (Promega) in vitro translatiert, um ³⁵S-markierte β-Catenin-Teilproteine zu synthetisieren, die den jeweiligen Regionen entsprechen. Die jeweiligen ³⁵S-markierten β-Catenin-Teilproteine wurden auf die in-vitro-Bindung mit GST/ICAT durch Immunpräzipitation auf dieselbe Weise getestet, wie vorstehend beschrieben. Wie man in 4 sieht, wurde, während man die Bindung mit GST/ICAT beim Armadillo-Domänenanteil findet, beim N-terminalen oder C-terminalen Anteil keine Bindung nachgewiesen. Demnach wurde nachgewiesen, dass ICAT direkt an die Armadillo-Domäne von β-Catenin binden kann. Diese Tatsache stimmt damit überein, dass Maus-ICAT-cDNA als DNA erhalten wurde, die ein Protein codiert, das an die Armadillo-Domäne von Maus-β-Catenin von Beispiel 1 binden kann.
(3) Bindungsspezifität von ICAT an β-Catenin
Der Nachweis, dass ICAT spezifisch an β-Catenin bindet, wurde wie folgt durchgeführt.
APC, DVL-1, GSK-3β, Axin und TCF-4, die zusätzlich zu β-Catenin Proteine waren, wurden in Gegenwart von ³⁵S-markiertem Methionin durch das in-vitro-Translationssystem auf dieselbe Weise wie in (1) synthetisiert (nur die Reste 453 bis 767 der APC-Aminosäuresequenz wurden wie für APC synthetisiert). Die jeweiligen ³⁵S-markierten Proteine wurden auf die in-vitro-Bindung mit GST/ICAT auf dieselbe Weise, wie vorstehend beschrieben, getestet. Das Ergebnis ist in 4 dargestellt. GST/ICAT band nicht an diese Proteine außer an β-Catenin. Demnach wurde gezeigt, dass die Bindung von ICAT für β-Catenin spezifisch ist.
Es wurde berichtet, dass TCF-4 und β-Catenin miteinander binden, so dass sich ein Komplex bildet. Wenn sowohl ³⁵S-markiertes β-Catenin als auch ³⁵S-markiertes TCF-4, die durch das in-vitro-Translationssystem synthetisiert wurden, dem vorstehend erwähnten System zugegeben wurden und man sie mit GST/ICAT reagieren ließ, wurden sowohl β-Catenin als auch TCF-4 zusammen mit GST/ICAT nachgewiesen. Demnach wurde gezeigt, dass ICAT direkt an den β-Catenin/TCF-4-Komplex (hier nachstehend als β-Catenin/TGF-4 bezeichnet) binden kann.
(4) Bindung zwischen ICAT und β-Catenin in Zellen
Im Experiment zum Nachweis von ICAT mit Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse unter Verwendung von in Beispiel 5 hergestellten COS-7-Zellen, die Maus-ICAT exprimieren, erfolgte die Immunpräzipitation anstelle mit dem anti-ICAT-Antikörper mit einem monoclonalen anti-β-Catenin-Antikörper (Transduction Laboratory; das für die Immunisierung verwendete Tier ist die Maus), und die Western-Blot-Analyse erfolgte mit dem anti-ICAT-Antikörper als primären Antikörper für den Nachweis. Das Ergebnis ist im mittleren Feld von 5 dargestellt. Eine ICAT-Bande wurde nachgewiesen, und daher wurde bestätigt, dass ICAT an β-Catenin in Zellen band. Wenn jedoch in diesem Experiment der anti-β-Catenin-Antikörper, der zuvor mit GST/β-Catenin reagiert hatte, in der Immunpräzipitation verwendet wurde, wurde die ICAT-Bande aufgrund der Hemmung der Immunpräzipitation nicht nachgewiesen.
Im Experiment zum Nachweis von ICAT mit Immunpräzipitation und Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Maus-Gehirnlysat in Beispiel 6 erfolgte die Immunpräzipitation mit dem anti-ICAT-Antikörper, und dann erfolgte die Western-Blot-Analyse mit dem monoclonalen anti-β-Catenin-Antikörper (Transduction Laboratory; das für die Immunisierung verwendete Tier ist die Maus) als primären Antikörper für den Nachweis. Wie man im obersten Feld des in 5 dargestellten Ergebnisses sieht, wurde eine β-Catenin-Bande nachgewiesen, und daher wurde nachgewiesen, dass ICAT an β-Catenin auch im lebenden Körper der Maus band. Wenn jedoch in diesem Experiment der anti-ICAT-Antikörper, der zuvor mit GST/ICAT reagiert hatte, in der Immunpräzipitation verwendet wurde, wurde die ICAT-Bande aufgrund der Hemmung der Immunpräzipitation nicht nachgewiesen.
Wenn ferner in demselben Experiment die Western-Blot-Analyse mit dem anti-TCF-4-Antikörper (der ein gereinigter Antikörper ist, der hergestellt wird, indem Kaninchen mit einem Teilpeptid, das eine Aminosäuresequenz enthält, die den C-terminalen 20 Aminosäuren von TCF-4 entspricht, auf dieselbe Weise wie bei der Herstellung des anti-ICAT-Antikörpers immunisiert werden und dann der Titer getestet wird) als primären Antikörper erfolgt, dann wurde die TCF-4-Bande nachgewiesen (im unteren Feld von 5). Da gezeigt wurde, dass ICAT nicht direkt an TCF-4 bindet, wie in (3) dargestellt, glaubt man, dass ICAT im lebenden Mauskörper an β-Catenin/TCF-4 über β-Catenin bindet.
Beispiel 9 Subzelluläre Lokalisierung von ICAT
Für die menschliche Colonkrebs-Zelllinie SW480 wurden ICAT und β-Catenin in den Zellen durch das duale fluoreszierende Antikörperverfahren nachgewiesen. Genau gesagt ließ man die Zellen mit dem anti-ICAT-Antikörper und anti-β-Catenin-Antikörper reagieren, und dann ließ man sie mit einem FITC-markierten anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Cappel; der an den anti-ICAT-Antikörper bindet) und RITC-markierten anti-Maus-IgG-Antikörper (Cappel; der an den anti-β-Catenin-Antikörper bindet) als sekundäre Antikörper reagieren; ICAT und β-Catenin wurden entsprechend in Zellen in einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus; AH2-FL) nachgewiesen. Das Ergebnis zeigte, dass sowohl ICAT als auch β-Catenin im Kern lokalisiert waren.
Beispiel 10 ICAT-vermittelte Hemmung der Transkriptionsaktivierung durch β-Catenin und TCF
Wie in Beispiel 8 dargestellt, wurde geklärt, dass ICAT an β-Catenin/TCF-4 bindet. β-Catenin/TCF-4 besitzt eine Aktivierungsaktivität der Transkription der Zielgene über die Bindung an die Zielgene (die Aktivität wird nachstehend als die Aktivität für die Transkriptionsaktivierung bezeichnet). Daher wurde untersucht, welchen Einfluss ICAT auf die Aktivität der Transkriptionsaktivierung ausübte, die durch β-Catenin/TCF-4 vermittelt wird. Genau gesagt wurde die Studie wie folgt durchgeführt.
β-Catenin kann durch GSK-3β phosphoryliert werden. Mutationen findet man an Stellen im β-Catenin-Gen, die den zu phosphorylierenden Stellen in einigen Colonkrebszelllinien und Melanomzelllinien entsprechen. Es wurde berichtet, dass β-Catenin in diesen Zelllinien kaum abbaubar ist und daher die Aktivität von β-Catenin/TCF-4 für die Transkriptionsaktivierung erhöht ist. Daher wurde ein System konstruiert, um die Aktivität von β-Catenin/TCF-4 auf die Transkriptionsaktivierung zu testen, wenn ein phosphorylierungsfreies, mutiertes β-Catenin in Zellen exprimiert wird, indem ein Reportergen verwendet wird, wie nachstehend dargestellt, und dann wurde die Wirkung von ICAT auf dieses System untersucht.
Zuerst wurde ein Plasmid zur Expression von mutiertem S33Y-β-Catenin (hier nachstehend als S33Y abgekürzt) hergestellt, in dem der von GSK-3β phosphorylierte 33. Rest Serin durch Tyrosin ersetzt wurde. Dann wurden 0,5 μg pTOPtkLuciferase-Plasmid, durch welches das Luciferasegen als Reportergen unter der Regulation eines Promoters exprimiert wird, in den drei TCF-bindende Stellen (Nucleotidsequenz: CCTTTGATC) stromaufwärts des Minimalpromoters der Thymidinkinase eingebaut wurden, der keine regulatorischen Stellen außer dem Promotor enthielt (die Transkriptionsaktivierung von diesem Promotor wird durch β-Catenin/TCF-4 bewirkt), 1,0 μg S33Y-Expressionsplasmid, 2,0 μg MKITneo-Vektor, 0,05 μg Plasmid pRL-TK (Promega), das als Kontrolle als Index für die Effizienz der Geneinführung verwendet wurde, in 6 × 10⁵ Zellen der menschlichen Nierenzellline 293 (ATCC: CRL-1573) gemeinsam transfiziert, und dann wurden die Zellen in einer Kulturschale (60 mm Durchmesser) gezüchtet. Das von dem Promotor gelenkte Transkriptionsniveau wurde geschätzt, indem die Aktivität der Luciferase, die das Reportergenprodukt ist, 40 Stunden nach der Einführung getestet wurde, indem ein von Promegea bereitgestelltes Luciferase-Testsystem-Kit verwendet wurde. Außerdem wurde derselbe Test auf Luciferase-Aktivität gleichzeitig für die Kontrolle durchgeführt, indem 3,0 μg MKITneo anstelle des S33Y-Expressionsplasmids verwendet wurden, um die Transkriptionsniveaus zu vergleichen. In diesem Vergleich wurde das Expressionsniveau von pRL-TK als Effizienz für die Geneinführung verwendet, um die Luciferase-Aktivität zu normalisieren. Wenn das S33Y-Expressionsplasmid eingeführt wurde, wurde bestätigt, dass die Luciferase-Aktivität, d.h. das Transkriptionsniveau im Vergleich zu dem der Kontrolle erhöht war. Demnach wurde nachgewiesen, dass mutiertes S33Y-β-Catenin die Eigenschaft besaß, die Transkription konstitutiv zu aktivieren (6). Derselbe Test auf Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung eines pFOPtkLuciferase-Plasmids, in dem die TCF-bindende Stelle, die in dem vorstehend erwähnten pTOPtkLuciferase-Plasmid enthalten ist, in eine Nucleotidsequenz (CCTTTGGCC) umgewandelt worden war, an die TCF nicht bindet, als Negativkontrolle an Stelle von pTOPtkLuciferase durchgeführt. Unter diesen Bedingungen war das Transkriptionsniveau trotz der Einführung des S33Y-Expressionsplasmids nicht erhöht und daher wurde bestätigt, dass das Transkriptionsniveau durch die TCF-bindende Stelle erhöht wird.
In dem Testssystem für die vorstehend erwähnte β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung wurde das ICAT-Expressionsplasmid in sukzessiv erhöhten Mengen von 0, 0,1, 0,25, 0,5 oder 1 μg gemeinsam eingeführt. Der Mengenanstieg der eingeführten ICAT-Expressionsplasmid-DNA führte zur Hemmung der Erhöhung des Transkriptionsniveaus, und schließlich sank das Transkriptionsniveau auf denselben Spiegel, wie in dem Fall, in dem der MKITneo-Vektor allein eingeführt wurde.
Ein Testsystem, bei dem die Maus-Brustkrebszelllinie C57MG anstelle von 293-Zellen als Wirt verwendet wurde, wurde auch für die β-Catenin/TCF-4-Aktivität zur Transkriptionsaktivierung hergestellt. Man fand heraus, dass das Transkriptionsniveau des Reportergens aufgrund der Einführung des S33Y-Expressionsplasmids auch in diesen System wie im Falle der 293-Zellen erhöht war. In dem vorstehend erwähnten System war das verwendete TCF-4 endogenes TCF-4 in den Zellen. Wenn jedoch das TCF-4-Expressionsplasmid zusätzlich in dieses System eingeführt wurde, war das Transkriptionsniveau weiter erhöht. Wenn das ICAT-Expressionsplasmid in dieses Testsystem eingeführt wurde, um ICAT zu exprimieren, war der Anstieg des Transkriptionsniveaus wie im Falle der 293-Zellen gehemmt. Demnach wurde nachgewiesen, dass die Wirkung von ICAT, die β-Catenin/TCF-4-vermittelte Transkriptionsaktivierung zu hemmen, vom Zelltyp unabhängig war.
Man glaubt, dass die β-Catenin/TCF-4-vermittelte Transkriptionsaktivierung in Colonkrebszelllinien, bei denen die APC-Funktion aufgrund von Mutationen des Gens gehemmt ist, aufgrund der Stabilisierung von β-Catenin konstitutiv auftritt. Daher wurde ein Testsystem für die vorstehend erwähnte β-Catenin/TCF-4-Aktivität zur Transkriptionsaktivierung unter Verwendung der menschlichen Colonkrebszelllinien SW480 (ATCC: CCL-228), DLD-1 (ATCC: CCL-221), SW48 (ATCC: CCL-231) oder HCT116 als Wirtszellen anstelle der 293-Zellen in Abwesenheit des S33Y-Expressionsplasmids (da konstitutiv aktiviertes, endogenes β-Catenin/TCF-4 verwendet wurde) konstruiert. Das ICAT-Expressionsplasmid wurde in diese Systeme eingeführt, um ICAT zu exprimieren, und die Hemmung des Anstiegs des Transkriptionsniveaus wurde wie im vorstehend beschriebenen Fall beobachtet. Das Ergebnis von DLD-1 und HCT116 ist in 7 dargestellt. Wie in 7 zu sehen ist, fand man heraus, dass ICAT auch die Aktivität besaß, die durch konstitutiv aktiviertes β-Catenin/TCF-4 vermittelte Transkription aufgrund des Vorhandenseins der APC-Mutation zu hemmen.
Basierend auf dem vorstehenden Befund glaubt man, dass ICAT die β-Catenin/TCF-4-assoziierte Signalübertragung in Zellen über die Bindung an β-Catenin/TCF-4 in Zellen reguliert und die Transkription hemmt. Ferner im Hinblick auf das vorstehend erwähnte Testsystem die erzwungene Expression von ICAT in dem System, in dem die konstitutive Transkriptionsaktivierung, die durch β-Catenin/TCF-4 vermittelt wird, aufgrund der Mutationen von APC oder β-Catenin zur Hemmung der Transkription führte. Demnach wird in Betracht gezogen, dass die Krebsbehandlung durch Verabreichung von ICAT oder durch erzwungene Expression von ICAT in den Zellen erreicht werden kann, um die Transkription in den Krebszellen zu regulieren, wenn die Krebszellen Mutationen von APC oder β-Catenin aufweisen, und man glaubt, dass die β-Catenin/TCF-4-vermittelte Transkriptionsaktivierung in den Zellen konstitutiv ist.
Beispiel 11 Herstellung von ICAT-Mutanten und Bewertung der Bindungseigenschaften an β-Catenin
(1) Region, die mit der Bindung mit β-Catenin assoziiert ist
Regionen von ICAT, die an der Bindung mit β-Catenin beteiligt sind, wurden bewertet, indem die Bindung zwischen den Deletionsmutanten von ICAT und β-Catenin durch das Zweihybridsystem wie folgt bestimmt wurde.
Die nachstehend gezeigten Plasmide für die Expression der Deletionsmutanten von ICAT, die als GAL4 AD-Fusionsproteine exprimiert werden, die in dem Zweihybridsystem verwendet werden können, wurden hergestellt, indem in den pGAD424-Vektor (Clontech) DNA-Teilfragmente eingebaut wurden, die die jeweiligen durch PCR amplifizierten Maus-ICAT-Mutanten codieren.
(a) ICAT (1–61); (b) ICAT (1–41); (c) ICAT (13–81); (d) ICAT (21–81); (e) ICAT (42–81); (f) ICAT (42–61); (g) ICAT (21–61); (h) ICAT (13–41) und (i) ICAT (13–61): die Zahlen in Klammern entsprechen den Aminosäurezahlen der zu exprimierenden Region in der ICAT-Sequenz; beispielsweise bedeutet ICAT (1–61) ein Derivat von ICAT, das die Aminosäurereste 1 bis 61 von der Sequenz enthält.
Da außerdem alle Regionen, die für die Bindung mit β-Catenin verantwortlich sind, reich an sauren Aminosäuren in anderen Proteinen sind, die β-Catenin binden können, wie Cadherin, APC und TCF-4, wurde DNA, die eine ICAT-Mutante ((j) ICAT (E37–39A)) codiert, deren an den Resten 37, 38 und 39 lokalisiere Glutaminsäurereste in Alanin umgewandelt wurden, durch PCR amplifiziert, indem ein Primer mit einer Nucleotidsequenz verwendet wurde, in der die Adeninnucleotide an der zweiten Position innerhalb der ursprünglichen Codons (GAG oder GAA) für Glutaminsäurereste, die den Resten 37, 38 und 39 entsprechen, in ein Cytosinnucleotid umgewandelt wurden (in GCG oder GCA umgewandelt, die die Codons für Alanin sind). Die DNA wurde in den pGAD424-Vektor (Clontech) eingebaut, um ein Expressionsplasmid für das Fusionsprotein von GAL4 AD und ICAT (E37–39A) herzustellen, das in dem Zweihybridsystem verwendet werden soll.
Jedes dieser Expressionsplasmide für Fusionsproteine von GAL4 AD- und ICAT-Mutanten wurde zusammen mit dem Köderplasmid GAL4-β-Catenin für den mβ-Cateninarm in den Hefestamm HF7C auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 eingeführt, und dann wurde die Bindung jeder ICAT-Mutante mit β-Catenin basierend auf dem Vorliegen der β-Galactosidase-Aktivität in den Transformanten bewertet. Das Ergebnis zeigte, dass (a) ICAT (1–61), (c) ICAT (13–82) und (i) ICAT (13–61) an β-Catenin banden, die restlichen Deletionsmutanten jedoch nicht an den mβ-Cateninarm banden. Demnach wurde vorgeschlagen, dass weder die N-terminalen 12 Aminosäuren noch die C-terminalen 20 Aminosäuren an der Bindung beteiligt waren, und spezifisch, dass die Region mit den Resten 13 bis 61 in der Aminosäuresequenz bei der Bindung von β-Catenin wichtig waren. Außerdem band (j) ICAT (E37–39A) nicht an den mβ-Cateninarm. Daher wurde vorgeschlagen, dass die aufeinanderfolgenden Glutaminsäurereste 37 bis 39 bei der Bindung an β-Catenin wichtig waren.
Ferner wurde ICAT (E37–39A) als GST-Fusionsprotein in E. coli auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 exprimiert, um die in-vitro-Bindung an β-Catenin zu bewerten, und das Ergebnis zeigte, dass es nicht an β-Catenin band. Zusätzlich wurde ein Expressionsplasmid für tierische Zellen, in die ICAT (E37–39A) codierende DNA in den pMKITneo-Vektor subcloniert wurde, auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5 hergestellt, und dann wurde das Plasmid in COS-7-Zellen exprimiert. Die in-vivo-Bindung an β-Catenin wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 bewertet, und das Ergebnis zeigte, dass keine Bindung nachweisbar war. Außerdem konnte ICAT (E37–39A) die β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung (7) in dem Fall, in dem die ICAT (E37–39A)-Mutante anstelle von ICAT im Testsystem für die β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung verwendet wurde, wie in Beispiel 10 hergestellt, nicht hemmen.
(2) Die Wirkung der ICAT (13–81)-Mutante auf die β-Catenin/TCF-4-vermittelte Transkriptionsaktivierung
Die ICAT (13–81)-Mutante wurde anstelle von ICAT im Testsystem für die β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung exprimiert, wie in Beispiel 10 hergestellt. Obwohl diese ICAT (13–81)-Mutante β-Catenin, wie in (1) gezeigt, binden konnte, konnte die Mutante die β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung nicht hemmen (7). Dieses Ergebnis zeigt, dass die N-terminalen 12 Aminosäuren bei der Hemmung der β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung durch ICAT wichtig sind und dass die Bindung an β-Catenin nicht ausreicht, um die Hemmung der β-Catenin/TCF-4-Aktivität für die Transkriptionsaktivierung zu erreichen. Ferner bindet die ICAT (13–81)-Mutante an β-Catenin, aber sie hat im Gegensatz zu ICAT keine Hemmwirkung auf die β-Catenin-vermittelte Transkriptionsaktivierung; und daher wird in Betracht gezogen, dass die Mutante als Antagonist wirkt, der die ICAT-Wirkung hemmt, und somit als Antagonist zu ICAT wirkt, wenn sie in Zellen vorliegt.
Beispiel 12 Stelle in β-Catenin, die mit der Bindung mit ICAT assoziiert ist
Die Bindung zwischen dem mβ-Cateninarm und ICAT wurde in Beispiel 8 bestätigt. Es wurde wie folgt bestimmt, welche Region des mβ-Cateninarms (eine Wiederholungssequenz, die aus 12 Armadillo-Einheiten besteht; hier wird nachstehend jede Wiederholungseinheit als R1 bis R12 bezeichnet) mit der Bindung mit ICAT assoziiert ist.
Zuerst wurden DNAs, die verkürzte Mutanten des mβ-Cateninarms codieren, die nachstehend dargestellt sind (6 Arten von Deletionsmutanten, die eine mβ-Cateninarm-Teilregion enthalten; (a) R1 bis R9, (b) R6 bis R12, (c) R10 bis R12, (d) die letzte Hälfte von R10 bis R12, (e) R10, (f) R11 bis R12), mit PCR hergestellt und wurden dann jeweils in den pGBT9-Vektor eingebaut, um das Köderplasmid für die Deletionsmutante bereitzustellen. Die Mutante wurde zusammen mit dem Expressionsplasmid für das normale Maus-ICAT im Zweihybridsystem in den Hefestamm HF7C eingeführt. Die Bindung zwischen ICAT und den mβ-Cateninarm-Deletionsmutanten wurde basierend auf dem Vorliegen der β-Galactosidase-Aktivität in den Transformanten bewertet. Das Ergebnis zeigte, dass die Bindung an ICAT gefunden wurde, wenn jede der β-Catenin-Regionen von (b) R6 bis R12, (c) R10 bis R12 oder (d) die letzte Hälfte von R10 bis R12 exprimiert wurde, was nahelegte, dass ICAT an die Region der letzten Hälfte von R10 bis R12 des mβ-Cateninarms band, aber R1 bis R9 an der Bindung nicht beteiligt war.
Beispiel 13 Chromosomale Lokalisierung des menschlichen ICAT-Gens
Die Durchsuchung der STS-Datenbank, die auf der Nucleotidsequenz der in Beispiel 1 erhaltenen menschlichen ICAT-cDNA basierte, zeigte, dass STSs von WI-9616, WI-16661 und SHGC-30730 eine Sequenz besaßen, die mit derjenigen von ICAT identisch war. Außerdem zeigte die Durchsuchung der Unigene-Databank für ETSs, dass stSG22813 und stSG2532 STSs in dieser Region waren. Nach den Beschreibungen in den Datenbanken wurde durch einige Verfahren wie das Strahlungshybridverfahren bestätigt, dass alle Chromosomenorte dieser fünf STSs der Region zwischen den Markern D1S214 und D1S244 auf dem menschlichen Chromosom 1 entsprachen. Die Position dieses Markers entspricht 1p36.1. Demnach zog man in Betracht, dass das menschliche ICAT-Gen auf 1p36.1 des menschlichen Chromosoms lokalisiert ist. Es gibt einige chromosomale Deletionen auf 1p35-36 bei Neuroblastom, Melanom, Pheochromocytom, Lungenkrebs, Leberkrebs, Colonkrebs usw. und daher handelt es sich um eine chromosomale Region, in der die Existenz eines Tumorsuppressorgens vorgeschlagen wurde (Genes Chromosomes & Cancer 16, 211, (1996)). Wenn man berücksichtigt, dass ICAT die Aktivität besitzt, die durch β-Catenin/TCF-4 vermittelte Transkriptionsstimulation zu hemmen, kann man in Betracht ziehen, dass ICAT als Tumorsuppressorgen fungiert und daher nützlich für die Diagnose und Gentherapie für Krebs ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Ein Protein mit Bindungsaktivitäten zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines β-Catenin-Komplexes mit einem Protein, das zur TCF/Lef-Familie gehört, induziert wird, eine DNA, die das Protein codiert, ein Antikörper, der das Protein erkennt, ein Therapeutikum, das das Protein oder die DNA enthält, und ein Diagnostikum, das den Antikörper enthält, werden durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer Nucleotidsequenz nach einer der SEQ ID NOs: 1, 3, 5 oder 6; (b) einer Nucleotidsequenz, welche ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 umfasst; und (c) einer Nucleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz gemäß (a) oder (b) hybridisiert und welche ein Protein codiert, das Bindungsaktivität zu β-Catenin und die Aktivität aufweist, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein von der TCF/Lef-Familie induziert wird; mit der Maßgabe, dass die Nucleotidsequenz nicht die Nucleotidsequenz der NCBI-Hinterlegungsnummern AA 023778 und AI 430277 ist.
Rekombinante DNA, umfassend die DNA nach Anspruch 1.
Nicht-menschliche Transformante, enthaltend die rekombinante DNA nach Anspruch 2.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Bindungsaktivität zu β-Catenin und mit der Aktivität, die Transkriptionsaktivierung zu hemmen, die durch die Erzeugung eines Komplexes von β-Catenin mit einem Protein von der TCF/Lef-Familie induziert wird, wobei das Verfahren die Schritte des Züchtens der Transformante nach Anspruch 3 in einem Kulturmedium, des Herstellens und Anreicherns des Proteins in der Kultur und des Gewinnens des Proteins aus der Kultur umfasst.
Protein, das durch die DNA nach Anspruch 1 codiert wird, oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 4.
Therapeutisches Mittel für Krebs, umfassend eine DNA nach Anspruch 1 oder das Protein nach Anspruch 5 als Wirkstoff.
Vektor für die Gentherapie von Krebs, wobei der Vektor die DNA nach Anspruch 1 umfasst.
Oligonucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die aus aufeinanderfolgenden 60 Resten einer Nucleotidsequenz wie beschrieben in Anspruch 1(a) oder 1(c) oder einer Nucleotidsequenz besteht, welche ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder 4 codiert, oder ein Oligonucleotid, umfassend eine Sequenz, welche komplementär ist zu dem Oligonucleotid, mit der Maßgabe, dass die Nucleotidsequenz nicht die Nucleotidsequenz der NCBI-Hinterlegungsnummern AA 023778 und AI 430277 ist.
Oligonucleotid-Analog, welches abgeleitet ist von dem Oligonucleotid nach Anspruch 8, wobei (i) die Phosphodiesterbindung des Oligonucleotids in eine Phosphorothioat-Bindung oder eine N3'-P5'-Phosphoramidat-Bindung umgewandelt wurde; (ii) die Phosphodiesterbindung zwischen der Ribose und dem Phosphat in dem Oligonucleotid in eine Peptid-Nucleinsäure-Bindung umgewandelt wurde; (iii) Uracil durch C-S-Propinyluracil oder C-5-Thiazoluracil ersetzt wurde; (iv) Cytosin durch C-S-Propinyluracil oder Phenoxazin-modifiziertes Cytosin ersetzt wurde; oder (v) Ribose durch 2'-0-Propylribose oder 2'-Methoxyethoxyribose ersetzt wurde.
Antikörper, welches spezifisch das Protein nach Anspruch 5 erkennt.
In vitro-Verfahren zum immunologischen Nachweis oder Quantifizierung des Proteins nach Anspruch 5, wobei das Verfahren den Antikörper nach Anspruch 10 verwendet.
Diagnostisches Mittel für Krebs, wobei das diagnostische Mittel das Oligonucleotid nach Anspruch 8, das Oligonucleotid-Analog nach Anspruch 9 oder den Antikörper nach Anspruch 10 als Wirkstoff umfasst.
Verwendung der DNA nach Anspruch 1 oder des Proteins nach Anspruch 5 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Krebstherapie.
Verwendung des Oligonucleotids nach Anspruch 8, des Oligonucleotid-Analogs nach Anspruch 9 oder des Antikörpers nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Diagnose von Krebs.
Verwendung des Vektors nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Gentherapie von Krebs.
Therapeutisches Mittel nach Anspruch 6, Vektor nach Anspruch 7, diagnostisches Mittel nach Anspruch 12 oder die Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Krebs Dickdarmkrebs ist.