CN1364172A - 转录激活抑制蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛋白质,其能与β－连环蛋白结合,因而能抑制转录激活,所述转录激活是由β－连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的,本发明还涉及编码该蛋白质的DNA,识别该蛋白质的抗体,含有所述蛋白质或DNA的治疗剂,和含有所述抗体的诊断试剂。

Description

转录激活抑制蛋白

                        技术领域

本发明涉及一种蛋白质，其具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的，本发明还涉及编码该蛋白质的DNA，识别该蛋白质的抗体，含有所述蛋白质或DNA的治疗剂，和含有所述抗体的诊断试剂。

                        背景技术

本文使用下列缩写：

AD：转录激活结构域

ADH：醇脱氢酶

APC：结肠腺癌(adenomatous poliposis coli)

BD：DNA-结合结构域

β-连环蛋白/TCF-4：β-连环蛋白和TCF-4的复合物

DCC：结直肠癌中的缺失

dhfr：二氢叶酸还原酶

DLG：Drosophila Discs Large

DMSO：二甲亚砜

EDTA：乙二胺四乙酸

ELISA：酶联免疫吸附试验

EST：表达序列标签

FAP：家族性结肠腺癌

FCS：胎牛血清

FITC：异硫氰酸荧光素

GST：谷胱甘肽S-转移酶

GST/ICAT：GST和ICAT的融合蛋白

GSK-3β：糖原合酶激酶-3β

ICAT：β-连环蛋白和TCF的抑制剂

IPTG：异丙基硫代半乳糖苷

KLH：匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)

Lef：淋巴细胞增强子-结合因子

LTR：长末端重复序列

MBS：间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺

MEM：极限必需培养基

PCR：聚合酶链反应

PEG：聚乙二醇

RITC：异硫氰酸罗丹明

SDS：十二烷基硫酸钠

SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

TCF：T细胞因子

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷

X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

已分离到作为FAP致病基因的APC基因(Kinzler和Vogelstein，细胞，87，159(1996))。然而，据报道，不仅可在FAP中观察到APC基因异常，也可在70至80％的偶发性结肠癌病例中观察到APC基因异常。据认为，结肠癌的发生是由很多基因的连续突变引起的，所述基因包括K-ras，p53，DCC等，也包括APC。与其它基因相比，APC基因中的突变发生得最早，因此，据信APC基因的异常是结肠癌发生的主要事件。

为了阐明与APC基因异常相关的癌症发生机制，必须测定基因产物APC蛋白的功能。据报道，大小约为300kDa的APC蛋白与细胞中的β-连环蛋白，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)以及DLG结合(Rubinfeld等，科学，262，1731(1993)；Su等，科学，262，1734(1993)；Rubinfeld等，科学，272，1023(1996)；Matsumine等，科学，272，1020(1996))。关于APC蛋白的功能，据报道，当在具有APC基因突变的结肠癌细胞系SW480中表达野生型APC蛋白时，β-连环蛋白的水平快速降低(Munemitsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，3046(1995))。含有7个重复结构的中心区域是APC蛋白的功能所必需的，该区域与很多结肠癌病例中存在有突变的区域一致。另外，据报道在这些结肠癌细胞中，β-连环蛋白水平升高(Munemitsu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，3046(1995)；Rubinfeld等，癌症研究，57，4624(1997))。

另外，还已知β-连环蛋白是细胞粘着分子钙粘着蛋白的膜-骨架蛋白，据报道，它还参与下述Wnt蛋白的信号转导(Cadigan & Nusse，Genes Dev.，11，3286(1997))。Wnt基因是一个大基因家族，其成员在动物早期胚胎发生和形态发生过程中具有多种功能；在小鼠中，该家族由约20种基因组成，这些基因在多种动物中是保守的，所述动物包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)，果蝇(Drosophila melanogaster)和线虫(Caenorhabditis elegans)。当Wnt蛋白结合受体Frizzled时，通过细胞内信号分子Dishvelled(Dsh)抑制糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性。由于GSK-3β介导的β-连环蛋白磷酸化导致β-连环蛋白降解，因此，抑制GSK-3β活性可导致细胞中积累β-连环蛋白。β-连环蛋白结合属于转录因子Lef/TCF家族的蛋白以形成复合物，从而将属于Lef/TCF家族的蛋白激活为转录因子。因此，β-连环蛋白的积累导致β-连环蛋白/TCF复合物的形成，所述复合物转运至核中，从而刺激靶基因的转录。在属于Lef/TCF家族的蛋白中，TCf-4在结肠上皮细胞中特异性表达，因此，据信在结肠癌中，β-连环蛋白主要与TCf-4形成复合物(Korinek等，科学，275，1784(1997))。另外，据报道在有些结肠癌细胞和黑素瘤细胞中，APC基因为野生型，但β-连环蛋白基因具有突变，且不受GSK-3β调节(Morin等，科学，275，1787(1997)；Rubinfeld等，科学，275，1790(1997))。据估计，在这些细胞中，β-连环蛋白不断积累，导致由β-连环蛋白/TCF复合物引起的转录激活。

根据上述发现，β-连环蛋白在结肠癌的发生中起着举足轻重的作用。因此，可将能通过与β-连环蛋白结合而抑制其功能的物质与结肠癌的发生相联系，这预示着该物质可用于治疗，诊断结肠癌。最近发现能结合β-连环蛋白的蛋白质分子是Axin，Axin能负调节Wnt的信号转导(Zeng等，细胞，90，181(1997))。Axin与GSK-3β结合，从而刺激β-连环蛋白的磷酸化(Ikeda等，EMBO J.，17，1371(1998))。另外，据报道，Axin也结合APC和β-连环蛋白以刺激β-连环蛋白的降解，进而降低细胞中的β-连环蛋白水平(Kishida等，生物化学杂志，273，10823(1998)；Rubinfeld等，当代生物学，8，573(1998)；Nakamura等，Genes to Cells，3，395(1998))。然而，目前已知的蛋白质无一能与β-连环蛋白结合，并直接影响β-连环蛋白/TCF复合物作为转录因子的活性。

                 发明内容

本发明的目的是：提供一种能通过结合β-连环蛋白来调节β-连环蛋白/TCF复合物所致转录激活的蛋白质，编码该蛋白质的DNA，识别该蛋白质的抗体，含有所述蛋白质或DNA的治疗剂，和含有所述抗体的诊断试剂，它们都可用于治疗和诊断癌症。

本发明涉及下列主题(1)至(21)：

(1)一种蛋白质，其具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的；

(2)(1)所述的蛋白质，其中蛋白质含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列；

(3)一种蛋白质，其含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被添加，缺失或取代，所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的；

通过按核酸研究，10，6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)；基因，34，315(1985)；核酸研究，13，4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，488(1985)等所述，经定点诱变在编码含有SEQ ID NO：2或4之氨基酸序列的蛋白质的DNA中导入定点突变，即可实现上述氨基酸缺失，取代或添加。

(4)编码(1)至(3)中任一项所述蛋白质的DNA；

(5)一种DNA，其含有选自SEQ ID NO：1，3，5和6的核苷酸序列；

(6)一种DNA，其在严紧条件下能与(4)或(5)的DNA杂交，并且能编码一种蛋白质，所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的。

上述的“在严紧条件下能与(4)或(5)的DNA杂交，并且能编码一种蛋白质(所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导)的DNA”指的是：将具有SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列的DNA用作探针，经菌落杂交，噬斑杂交，Southern印迹杂交等方法可以获得的DNA。具体地说，所述DNA包括可通过下列方法鉴定的DNA，所述方法为在65℃，0.7至1.0mol/LNaCl的存在下，使用其上固定有得自菌落或噬斑的DNA的滤膜进行杂交，然后在65℃的条件下，用0.1x至2xSSC(柠檬酸钠盐水)溶液[1xSSC溶液(150mmol/LNaCl，15mmol/L柠檬酸钠)；nX指的是n倍于此溶液浓度]洗涤滤膜。可根据任何实验手册中所述的方法进行杂交，所述实验手册如J.Sambrook等，“分子克隆，实验室手册，第2版”，冷泉港实验室出版社(1989)；F.M.Frederick等，“最新分子生物学方法，附录1-38”，JohnWiley & Sons(1987-1997)；D.M.Glover和B.D.Hames“DNA克隆1：核心技术，操作方法，第2版”，牛津大学出版社(1995)。

能杂交的DNA的具体例子包括：与SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列具有至少80％或更高同源性的DNA，优选为具有95％或更高同源性的DNA，此时，同源性是通过BLAST(分子生物学杂志，215，403(1990))，FASTA(酶学方法，183，63(1990))或类似方法计算出的。

(7)重组DNA，所述DNA是通过将(4)至(6)中任一项所述DNA插入载体而得到的；

(8)含有(7)所述重组DNA的转化子；

(9)生产(1)至(3)中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养(8)所述的转化子，在培养物中产生并积累(1)至(3)中任一项所述的蛋白质，从培养物中回收蛋白质；

(10)癌症治疗剂，其中治疗剂含有(1)至(3)中任一项所述的蛋白质作为有效成分；

(11)癌症治疗剂，其中治疗剂含有(4)至(6)中任一项所述的DNA作为有效成分；

(12)用于癌症基因治疗的载体，其中载体含有(4)至(6)中任一项所述的DNA；

(13)含有由(4)至(6)中任一项所述DNA之核苷酸序列中的连续5至60个残基组成的核苷酸序列的寡核苷酸，含有与该寡核苷酸序列互补之序列的寡核苷酸，或这些寡核苷酸的衍生物；

(14)癌症诊断试剂，其中诊断试剂含有(13)所述的寡核苷酸作为有效成分；

(15)能识别(1)至(3)中任一项所述蛋白质的抗体；

(16)免疫检测(1)至(3)中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法利用了(15)所述的抗体；

(17)免疫定量(1)至(3)中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法利用了(15)所述的抗体；

(18)癌症诊断试剂，其中诊断试剂含有(15)所述的抗体作为有效成分；

(19)(10)或(11)所述的治疗剂，其中癌症是结肠癌；

(20)(12)所述的载体，其中癌症是结肠癌；和

(21)(18)所述的诊断试剂，其中癌症是结肠癌。

以下将详细描述本发明。在下列描述中，本发明的蛋白质被称为“β-连环蛋白和TCF的抑制剂(以下简称为ICAT)”，所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的。另外，将编码ICAT的DNA简称为ICAT DNA。

I.制备ICAT DNA

可通过酵母双-杂种体系(S.Fields等，自然，340，245(1989))，由编码ICAT的cDNA获得ICAT DNA。换句话说，ICAT cDNA一般含有非翻译区域，但本发明的ICAT DNA仅含有其编码区。可通过分析ICAT cDNA的核苷酸序列将编码区测定为开放阅读框(ORF)区域(覆盖框内起始密码子至终止密码子的区域)。

酵母双-杂种体系是检测目的蛋白质X(在此方法中一般称其为“诱饵”)和蛋白质Y之间的结合的方法，其中利用酵母转录因子Z，例如在蛋白质分开的区域内具有DNA-结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)的GAL4完成检测。第一步制备的是用于在宿主酵母细胞中表达X和转录因子Z的DNA-结合结构域的融合蛋白(以下称之为BD-X)的质粒(诱饵质粒)，和另一种用于在宿主酵母细胞中表达Y和转录因子Z的转录激活结构域的融合蛋白(以下称之为AD-Y)的质粒。将这两种质粒导入宿主酵母细胞中以共表达BD-X和AD-Y。所用宿主酵母是可在启动子的调节下表达报道基因的酵母，其中通过转录因子Z与启动子的结合来实现转录激活。当蛋白质Y能与蛋白质X结合时，BD-X则能与AD-Y结合。由于所得复合物具有衍生自转录因子Z的DNA-结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)，复合物与转录因子Z一样，可导致报道基因的表达。因此，通过使用报道基因的表达作为标记即可检测蛋白质X和Y之间的结合。当在这种情况下，使用其中的每种cDNA(而不仅仅是Y)都能被表达成与Z的转录激活结构域的融合蛋白的cDNA文库来替代AD-Y表达质粒，则可通过基于报道基因的表达筛选转化子来分离含有cDNA的转化子，所述cDNA编码能与X结合的蛋白质Y。此外，通过从转化子中分离质粒，可以克隆到所需的cDNA。

下文将描述通过使用上述方法克隆ICAT cDNA的方案，其中诱饵X是小鼠β-连环蛋白的犰狳结构域(下文简称为mβ-连环蛋白臂区)，而转录因子Z是酵母GAL4。

(1)制备诱饵质粒

在本发明中，将mβ-连环蛋白臂区(对应于小鼠β-连环蛋白的氨基酸序列141至664)用作诱饵。为了制备诱饵质粒，必须得到编码用作诱饵的mβ-连环蛋白臂区的DNA(下文简称为mβ-连环蛋白臂区DNA)。由于本领域技术人员已知小鼠β-连环蛋白DNA的完整核苷酸序列和其中的小鼠β-连环蛋白编码区(GenBank登录号：M90364；科学，257，1142(1992))，因此，可以容易地识别对应于mβ-连环蛋白臂区DNA的核苷酸序列。因此，可通过下文所述的RT-PCR法(M.J.McPherson等，“PCR，操作方法”，牛津大学出版社(1991))扩增和分离mβ-连环蛋白臂区DNA。

具体地说，从表达β-连环蛋白的小鼠组织或细胞中分离RNA；由RNA合成cDNA；使用cDNA为模板，并使用对应于mβ-连环蛋白臂区DNA核苷酸序列5’末端的有义引物，和含有与核苷酸序列3’末端互补的核苷酸序列的反义引物进行PCR。当将每种引物的5’末端设计成具有克隆载体的限制性酶识别位点序列以用于下文所述的诱饵质粒时，即可通过利用限制性酶位点，将扩增片断有效插入克隆载体以用于下文所述的诱饵质粒。如果想使引物具有可用于克隆的限制性酶识别序列，可设计引物，使得转录因子的转录激活结构域的密码子插入克隆载体时可与mβ-连环蛋白臂区的相应密码子位于同一读码框内。

载体(优选在其中插入通过上述方法制备的mβ-连环蛋白臂区DNA)包括能在酿酒酵母中复制的载体，其具有转化所用的适当标记基因，例如氨基酸生物合成基因，如TRP1和LEU2，并可在酵母表达用启动子，如醇脱氢酶(ADH)启动子的调节下表达GAL4的DNA-结合结构域(下文简称为GAL4 BD)。在这种情况下，优选使用具有下列特征的载体，所述载体在GAL4 BD的C末端部分具有可插入mβ-连环蛋白臂区DNA的适当限制性酶位点，并且能在大肠杆菌(因其便于操作，例如便于纯化载体DNA)中复制，另外还具有转化大肠杆菌所用的可测标记，例如氨苄青霉素-抗性基因。这类载体包括pGBT9(Clontech)，pAS1(T.Durfee等，基因&发育，7，555(1993))，pAS2-1(Clontech)等。

分离上文所制备的mβ-连环蛋白臂区DNA，然后在密码子框内将其插入载体中GAL4 BD C-末端的限制性酶位点。

(2)制备cDNA文库以表达与转录激活结构域的融合蛋白

为了制备cDNA文库以表达与GAL4转录激活结构域的融合蛋白，可优选在酿酒酵母中复制所用载体，所述载体具有转化所用的适当标记基因，例如酵母氨基酸生物合成基因，如TRP1和LEU2，并可在酵母表达用启动子，如醇脱氢酶(ADH)启动子的调节下表达GAL4的转录激活结构域(下文简称为GAL4AD)。在这种情况下，优选使用具有下列特征的载体，所述载体在GAL4 AD的C末端部分具有适当限制性酶位点，并且能在大肠杆菌(因其便于操作，例如便于纯化载体DNA)中复制，另外还具有转化大肠杆菌所用的可测标记，例如氨苄青霉素-抗性基因。这类载体包括pGAD(C.T.Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，9578(1991))，pGAD424(Clontech)，pACT(T.Durfee等，基因&发育，7，555(1993))，pACT2-1(Clontech)等。

据推测，能与细胞中的β-连环蛋白相互作用的蛋白质能在表达β-连环蛋白的细胞和组织中表达。因此，可以通过以下方法制备cDNA文库，即由据推测可表达β-连环蛋白的小鼠组织和细胞制备cDNA，并将其插入用于表达融合蛋白的上述载体中的GAL4 AD C末端限制性酶位点。在这种情况下，当cDNA和GAL4AD的方向彼此相同，并且位于同一读码框中时，即可表达GAL4AD与cDNA所编码蛋白质的融合蛋白。或者，可以使用能在酵母双-杂种体系中使用的商用文库，例如MATCHMAKER cDNA文库(Clontech)。

(3)通过酵母双-杂种体系筛选cDNA

用于导入(1)中制备的诱饵质粒和(2)中制备的cDNA文库的酵母包括属于酿酒酵母的酵母，其中导入了上述诱饵质粒和cDNA文库，另外，它还需要：(a)导入的质粒中用于转化的标记基因和宿主中对应于双-杂种体系所用转录因子GAL4基因的基因由于缺失或突变而不能被表达；和(b)已将与GAL4 BD结合的核苷酸序列插入适当报道基因的启动子区域。在此情况下，优选使用一种报道基因，当通过与诱饵结合来启动所述基因的转录时，易于检测到这种转录，所述基因如氨基酸生物合成的基因，如HIS3等(在此情况下，基因应该不同于用作转化诱饵质粒所用标记的基因)，可在酵母中检测的大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ等。例如，宿主酵母包括酿酒酵母CG1945菌株(Clontech)，Y153菌株(基因&发育，7，555(1993))，CGY1∷171菌株(细胞，51，121(1987))，HF7C菌株(Clontech)等。

可将(1)中制备的诱饵质粒和(2)中制备的cDNA文库导入该宿主酵母，以通过使用报道基因的表达作为标记选择含有cDNA的转化子，所述cDNA编码能与mβ-连环蛋白臂区结合的蛋白质。例如，当将用于组氨酸生物合成的HIS3基因用作报道基因时，可选择在不含组氨酸的基础培养基上生长的菌落，或者，当将大肠杆菌lacZ基因用作报道基因时，可选择在X-gal的存在下表现为蓝色的菌落。

由于所选择的转化子菌落含有两种类型的质粒，即诱饵质粒和cDNA文库，根据参考文献(“DNA克隆2，表达系统，操作方法，第2版”，牛津大学出版社(1995)；Proc.Natl.Acad.Sci.，88，9578(1991))所述的方法仅分离cDNA文库质粒。具体地说，从菌落中分离质粒，然后用该质粒转化大肠杆菌。此时，所用宿主大肠杆菌是不表达cDNA文库中所含标记基因，因而在经转化的菌株中可检测到基因表达的菌株。从转化子中选择表达cDNA文库中所含标记基因的一些转化子，从选择的转化子中分离质粒DNA以获得cDNA克隆。

(4)分析cDNA克隆的核苷酸序列

通过使用完整的cDNA克隆，或者在用适当限制性酶切下cDNA组成成分的片断，并将其亚克隆至适当克隆载体，如pUC118之后，用常用的分析核苷酸序列的方法，例如Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977))的双脱氧-测序法或Perkin Elmer等提供的DNA测序仪，即可测定(3)中所得cDNA克隆的核苷酸序列。

通过在使用同源性检索程序，如BLAST检索核苷酸序列数据库，如GenBank，EMBL和DDBJ时证实cDNA序列未与数据库中存储的已知基因的核苷酸序列表现出显著的同源性，可以认为所得cDNA的核苷酸序列是新的。

如果核苷酸序列是新的，那么，如(2)中所述，(3)中所得的cDNA克隆应该编码融合蛋白，其中ICAT与GAL4AD的C-末端在框内相连。因此，通过在与GAL4 AD的翻译读码框相同的框内，在终止密码子的下游将所揭示的cDNA的核苷酸序列翻译成相应的氨基酸序列，即可推导出由cDNA编码的ICAT氨基酸序列。

另外，通过用同源性检索程序，例如BLAST，FASTA和FrameSearch在氨基酸序列数据库，例如Genpept，PIR和Swiss-Prot中对该氨基酸序列进行检索，可以选择出与cDNA所编码的蛋白质具有同源性的已知基因。

然而，所得cDNA可仅含有全长ICAT cDNA的起始密码子的下游部分，因为如下文实施例11所述，甚至当ICATN-末端的12个氨基酸缺失时，ICAT也可与mβ-连环蛋白臂区结合。在这种情况下，在通过用下文(5)中所述的方法获得全长ICAT cDNA之后，通过使用与所得ICAT的氨基酸相同的读码框测定出ORF区域，从而揭示出完整的ICAT氨基酸序列；可将ORF区域用作ICAT DNA。另外，只要它们能编码ICAT的完整氨基酸序列，ICATDNA中的各个密码子的核苷酸序列并不局限于与cDNA中的密码子相同，它可以使用任何编码相同氨基酸的密码子的核苷酸序列。

按上述所得的新cDNA包括例如：编码含有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的蛋白质的cDNA。

(5)克隆全长cDNA

当根据(4)中的核苷酸序列分析，以及按下文所述用Northern印迹杂交得到的mRNA的长度信息推测出(3)中所得ICAT cDNA的长度不是全长时，可通过下列方法制备全长ICAT cDNA。

(5-1)筛选cDNA文库

将(3)中所得的完整cDNA或其部分用作探针，通过菌落杂交或噬斑杂交筛选出(2)中制备的，表达融合蛋白的cDNA文库，或者由表达β-连环蛋白，据信还同时表达ICAT的组织或细胞制备的cDNA文库，或者按下文所述用Northern印迹可检测到β-连环蛋白mRNA的细胞制备的cDNA文库，然后在阳性克隆中选择据信为全长的cDNA克隆。通过J.Sambrook等，“分子克隆，实验室手册，第2版”，冷泉港实验室出版社(1989)所述的方法或其它方法可进行cDNA文库的制备和杂交。或者，可以使用来自Clontech或其它公司的商用cDNA文库。通过按照与(4)中所述相同的方法测定所得cDNA克隆的核苷酸序列，可以揭示出小鼠ICAT cDNA的完整核苷酸序列，并且揭示出小鼠ICAT的完整氨基酸序列。

(5-2)RACE

由据推测可表达ICAT的组织或细胞制备互补DNA，然后在cDNA的两个末端添加衔接子寡核苷酸。通过5’-RACE或3’-RACE(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998(1988))可得到互补的DNA片断，该片断含有(3)中所得cDNA的延伸至5’或3’方向的部分，其中使用来自所述衔接子的核苷酸序列的引物，和根据(3)中所得cDNA克隆的核苷酸序列设计的引物进行PCR。

也可以按照与(4)相同的方法，通过测定所得cDNA的核苷酸序列，然后基于所测定的核苷酸序列，将所得cDNA和(3)中所得cDNA克隆彼此相连，籍此提供全长ICAT cDNA。

(5-3)使用EST核苷酸序列

当通过在公共核苷酸序列数据库中检索同源性来分析(4)中测定的ICAT cDNA的核苷酸序列时，即使在已知基因中没有相同的核苷酸序列，在随机cDNA克隆的部分序列EST中仍可发现与所述cDNA序列相同的序列。此时，将这些EST和其它含有与该EST相同的核苷酸序列的EST，以及得自同一克隆的EST全部集中到一起，作为得自同一基因的EST。有时，通过装配这些据信得自ICAT cDNA的EST的核苷酸序列，可以发现与(3)中所得的cDNA相比在5’或3’方向延伸得更长的核苷酸序列。在这种情况下，通过RT-PCR即可获得位于(4)中所得cDNA核苷酸序列5’或3’方向的cDNA延伸部分，所述PCR使用了具有得自经装配EST的核苷酸序列的5’末端核苷酸序列的有义引物，或具有与所述EST 3’末端的核苷酸序列互补的核苷酸序列的反义引物。在RT-PCR中，可将互补DNA或得自据推测可表达ICAT的小鼠组织或细胞的cDNA文库用作模板。按照与(4)中所述相同的方法测定所得cDNA的核苷酸序列。当在公共核苷酸序列数据库中得到很多据信得自小鼠ICAT cDNA的EST时，无需使用RT-PCR，通过装配收集的EST核苷酸序列即可揭示出小鼠ICAT的全长cDNA核苷酸序列。

另外，一旦按上述揭示出ICAT cDNA的全长核苷酸序列，可按照与(3)中所述相同的方法，将制备自据推测可表达ICAT的小鼠组织或细胞的cDNA或cDNA文库用作模板，并使用根据cDNA的核苷酸序列设计的引物进行PCR，从而获得ICAT cDNA。已于1999年4月14日将含有所得小鼠ICAT cDNA克隆pmICAT的转化子大肠杆菌DH5α/pmICAT保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城县茨城市1-1-3，邮编305-8566)，保藏号为FERM BP-6701。

另外，可以根据按上述测定的ICAT cDNA的核苷酸序列，在DNA合成仪中化学合成ICAT DNA。所述DNA合成仪包括购自Perkin Elmer的，利用亚磷酰胺法的392型DNA合成仪等。

(6)分离编码人ICAT的DNA

为了分析人结肠癌发生的机理以及为了治疗和诊断癌症，更重要的是获得人ICAT或编码DNA(下文简称为人ICAT DNA)，而不是小鼠ICAT。一般说来，得自不同物种，但具有相同功能的蛋白质经常具有不同的氨基酸序列，但这些序列之间表现出同源性。因此，据信编码蛋白质的DNA之间也会表现出同源性。另外，在生物进化过程中，突变在基因中积累，因此，可以设想物种的系统发育谱系越近，同源性就会越高。因此，通过根据下文所述的方法，利用(3)中所得的小鼠ICAT DNA的核苷酸序列，即可从其它哺乳动物，例如人ICATDNA中获得ICATDNA。无需获得小鼠ICATDNA，也可按照与(1)至(5)所述相同的方法直接获得人ICAT DNA，所述方法为具有诱饵质粒和人cDNA文库的酵母双-杂种体系，其中人β-连环蛋白的犰狳结构域(细胞生物学杂志，127，2601(1994))被用作诱饵。

(6-1)筛选cDNA文库

由于人ICAT被设想为与小鼠ICAT具有相同的功能，据推测，人ICAT与小鼠ICAT在相同的组织和细胞中表达。因此，可以根据与(5-1)所述相同的方法，通过使用经放射性同位素，地高辛配基等标记的小鼠ICAT DNA为探针，进行菌落杂交或噬斑杂交，从cDNA文库，例如制备自等同于表达小鼠ICAT的小鼠组织的人组织，或制备自得自这种人组织的细胞的cDNA文库，或者从可商购的，得自所述人组织或细胞的人cDNA文库中获得人ICAT的cDNA克隆。

(6-2)使用EST

使用同源性检索程序检索公共核苷酸序列数据库，如GenBank，以寻找与(4)中所得小鼠ICAT DNA的核苷酸序列表现出同源性的人EST。据认为，这种与小鼠ICAT DNA表现出同源性的EST得自人ICAT cDNA，因此，通过装配EST的核苷酸序列，至少可获得人ICAT cDNA的部分核苷酸序列。在用于测定EST核苷酸序列的克隆中，得自基因组表达聚生体的整合分子分析(I.M.A.G.E.Consortium)以及基因组研究所(TIGR)的克隆来自ATCC。通过装配根据EST的核苷酸序列，被认为含有人ICAT cDNA的5’末端，3’末端或中间部分的所得cDNA克隆，也可获得覆盖整个人ICAT cDNA的cDNA克隆。已于1999年4月14日将含有所得全长人ICAT cDNA克隆phICAT的转化子大肠杆菌DH5α/phICAT保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城县茨城市1-1-3，邮编305-8566)，保藏号为FERMBP-6700。

通过按照与(3)中所述相同的方法进行RT-PCR扩增，也可以获得人ICAT cDNA，所述PCR使用了对应于人ICAT cDNA核苷酸序列的3’末端和5，末端的引物，并且使用了制备自据推测可表达ICAT的人组织或细胞的RNA作为模板。

将人ICAT DNA测定为根据上述方法获得的全长人ICAT cDNA的ORF区域。即使存在很多ORF，仍可将与小鼠ICAT cDNA中的确定ORF具有同源性的ORF选择为人ICAT DNA，原因是小鼠ICAT和人ICAT具有氨基酸序列同源性。可将人ICAT的氨基酸序列测定为由ORF编码的氨基酸序列。

(7)制备ICAT寡核苷酸

可在(5)中所述的DNA合成仪中制备寡核苷酸，所述寡核苷酸含有本发明ICAT DNA的部分序列，或具有与该序列互补的核苷酸序列(下文简称为ICAT寡核苷酸)。

具体地说，ICAT寡核苷酸包括具有与SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列中的连续5至60个核苷酸相同之序列的DNA，或具有与所述DNA互补之序列的DNA。当用作有义引物或反义引物时，优选这些DNA是解链温度和核苷酸数目相差不大的寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸包括寡核苷酸的任何衍生物(下文也称寡核苷酸衍生物)。寡核苷酸衍生物的例子有：寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键已被转变为硫代磷酸酯键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的磷酸二酯键已被转变为N3’-P5’氨基磷酸酯键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中位于核糖和磷酸之间的磷酸二酯键已被转变为肽-核酸键；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶已被C-5丙炔基尿嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的尿嘧啶已被C-5噻唑尿嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶已被C-5丙炔基胞嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的胞嘧啶已被经吩恶嗪-修饰的胞嘧啶所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖已被2’-O-丙基核糖所取代；寡核苷酸衍生物，其中寡核苷酸中的核糖已被2’-甲氧基乙氧基核糖所取代(细胞技术，16，1463(1997))。

2.产生ICAT

通过根据“分子克隆，实验室手册，第2版”(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社(1989))，“DNA克隆1：核心技术，操作方法，第2版”(D.M.Glover和B.D.Hames，牛津大学出版社(1995))等所述的方法，在宿主细胞中表达按照第1节的内容制备的ICAT DNA，即可产生本发明的ICAT。

具体地说，通过制备重组载体(其中已将ICAT DNA插入适当表达载体的启动子下游)，将该载体导入宿主细胞以得到表达ICAT的转化子，然后培养转化子，即可生产本发明的ICAT。

所用表达载体是能自我复制，或整合至宿主细胞染色体中，并含有能在宿主细胞中介导ICAT DNA转录为mRNA的启动子的载体。

可以使用任何宿主细胞，包括原核细胞，酵母细胞，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞等，只要细胞可表达所需基因即可。也可以使用动物个体和植物体。

当将原核细胞，例如细菌用作宿主细胞时，所用ICAT表达载体应能在宿主原核细胞中自我复制，其中已将ICAT DNA置于含有核糖体-结合序列的启动子的下游。优选已适当调节核糖体-结合序列与起始密码子之间的距离(例如，对大肠杆菌宿主而言为6至18个核苷酸)。优选将转录终止序列置于紧接ICAT DNA下游的位置，但在本发明中这并不是必需的。另外，载体应该被设计成含有表达标记基因，如药物抗性基因所需的序列以便于选择转化子。

可使用任何启动子，只要它能介导宿主细胞中的表达即可。例如，当宿主为大肠杆菌时，启动子包括得自大肠杆菌和噬菌体的启动子，例如trp启动子(Ptrp)，lac启动子(Plac)，P_L启动子，T7启动子，P_R启动子等。也可以使用人工设计的或经修饰的启动子，例如两个Ptrp彼此串联的启动子，tac启动子，T7-lac启动子，let I启动子等。当宿主为枯草芽孢杆菌时，启动子包括得自枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1和SPO2的启动子以及PenP启动子。

表达载体的例子有pSE280(Invitrogen)，pGEMEX-1(Promega)，pQE-8(QIAGEN)，pKYP200(农业生物化学，48，669(1984))，pLSA1(农业生物化学，53，277(1989))，pGEL1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985))，pBluescript II SK(-)(Stratagene)，pKK223-3(Amersham Pharmacia Biotech)，pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)和pET14(Novagen)。

宿主细胞可以是属于埃希氏菌属，沙雷氏菌属，芽孢杆菌属，短杆菌属，棒状杆菌属，微杆菌属，假单胞菌属的微生物，例如大肠杆菌XL1-Blue，大肠杆菌XL2-Blue，大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000，大肠杆菌KY3276，大肠杆菌W1485，大肠杆菌JM109，大肠杆菌HB101，大肠杆菌No.49，大肠杆菌W3110，大肠杆菌NY49，无花果沙雷氏菌，居泉沙雷氏菌，液化沙雷氏菌，粘质沙雷氏菌，枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，产氨短杆菌，Brevibacterium immariophilum ATCC14068，解糖短杆菌ATCC 14066，谷氨酸棒杆菌ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC14067，谷氨酸棒杆菌ATCC13869，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，嗜氨微杆菌ATCC15354，假单胞菌菌株D-0110。

可以使用任何导入重组载体的方法，只要这种方法能将DNA导入上述宿主细胞即可。所述方法包括例如电穿孔(核酸研究，16，6127(1988))，使用钙离子的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972))，原生质体法(日本公开未审专利申请248394/88)或基因，17，107(1982)或分子&普通遗传学，168，111(1979)中所述的其它方法。

当酵母被用作宿主细胞时，所用表达载体包括含有以下组成元件的载体：即含有能介导宿主酵母中的转录的启动子，ICAT DNA，转录终止序列和能在酵母中表达转化用标记基因(例如药物抗性基因和氨基酸生物合成基因，如TRP1，HIS3和LEU2)的序列。另外，优选使用能自我复制并能表达药物抗性基因的表达载体，所述药物抗性基因可用作转化大肠杆菌的标记，以便于制备和维持载体。

可使用任何启动子，只要它能介导酵母中的转录即可。所述启动子包括例如醇脱氢酶基因ADH1和参与半乳糖代谢的基因，如GAL1，GAL10等的启动子，酸性磷酸酶基因PHO5的启动子，磷酸甘油酸激酶基因PGK的启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAP的启动子，热激蛋白基因的启动子，α-交配因子基因MFα1的启动子，和得自酿酒酵母的铜-金属硫蛋白基因CUP1的启动子以及得自巴斯德毕赤氏酵母的醇氧化酶基因AOX1的启动子。

宿主细胞包括属于糖酵母属，裂殖糖酵母属，毕赤氏酵母属，假丝酵母属等的酵母菌株，具体包括酿酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德毕赤氏酵母，产朊假丝酵母等。

可以使用任何导入重组载体的方法，只要所述方法能将DNA导入酵母即可。所述方法包括例如电穿孔(酶学方法，194，182(1990))，原生质球方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4889(1984))，醋酸锂法(细菌学杂志，153，163(1983))等。

当将动物细胞用作宿主时，所用表达载体包括含有以下组成元件的载体：即含有能介导宿主动物细胞中的转录的启动子，ICAT DNA，用于转录终止和转录物聚腺苷酸化的信号序列。另外，优选使用能自我复制并能表达药物抗性基因的表达载体，所述药物抗性基因可用作转化大肠杆菌的标记，以便于制备和维持载体。可使用任何启动子，只要它能介导动物细胞中的转录即可。所述启动子包括得自病毒的序列，例如SV40早期启动子，人巨细胞病毒IE(即早期)基因的启动子和增强子元件，源自逆转录病毒，如Rous肉瘤病毒，人T细胞白血病病毒I，Moloney鼠白血病病毒等的LTR；或得自动物细胞的基因的启动子，所述基因如金属硫蛋白基因，β-肌动蛋白基因，延伸因子-1等。另外，还可以使用将如上所述的多个启动子元件连接在一起而形成的人工启动子，例如通过将SV40早期启动子和人T细胞白血病病毒I的LTR相互连接而形成的SRα启动子。

通过将ICAT表达载体导入宿主细胞，其中所述载体含有用于表达抗药物(如G418或潮霉素)的药物抗性基因的序列，并在药物的存在下培养细胞，即可选择出其中ICAT DNA已整合至宿主染色体DNA，并且能组成型表达ICAT的细胞。另外，为了增加宿主细胞中所产生的ICAT的量，可将组成型表达ICAT的载体导入宿主细胞，所述载体含有能表达二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的序列，培养细胞，同时连续增加作为dhfr抑制剂的氨甲碟呤的浓度；因此，可以成功地扩增ICAT DNA以及dhfr基因的拷贝数。利用dhfr基因已达到基因扩增目的的宿主细胞可以是含无功能的dhfr基因的细胞，例如CHO/dhfr-(ATCC：CRL-9096)等。

用于制备上述ICAT表达载体的载体具体包括例如pAGE107(日本公开未审专利申请22979/91；细胞技术，3，133(1990))，pAS3-3(227075/90)，pCDM8(自然，329，840(1987))，pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，pREP4(Invitrogen)，pBK-RSV(Stratagene)，pSVK3(Amersham Pharmacia Biotech)，pcDNA1.1/Amp(Invitrogen)，pAMo(生物化学杂志，268，22782(1993))等。

宿主细胞包括细胞系，例如得自人的细胞，HeLa和Namalwa以及人肾细胞系293(ATCC：CRL-1573)；非洲绿猴肾细胞COS-1和COS-7；仓鼠CHO和BHK细胞；小鼠骨髓瘤的SP2/0和NS0细胞，大鼠骨髓瘤细胞YB2/0。

可使用任何导入重组载体的方法，只要所述方法能将DNA导入动物细胞即可。所述方法包括例如电穿孔(细胞技术，3，133(1990))，磷酸钙法(日本公开未审专利227075/90)，脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987))等。

当将昆虫细胞用作宿主细胞时，可利用杆状病毒表达系统(杆状病毒表达载体，实验室手册，W.H.Freeman和Company，纽约(1992)，生物技术，6，47(1988))。具体地说，将ICAT DNA插入被称为转移载体的载体之后，同时将载体和杆状病毒导入昆虫细胞；所得同源重组提供了重组杆状病毒，其中ICAT DNA已插入多角体基因启动子的下游，所述启动子是高效启动子；然后将重组杆状病毒转染至昆虫细胞，从而获得ICAT表达。

所用杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，家蚕核型多角体病毒等。所用昆虫细胞可以是得自草地夜蛾的细胞Sf9和Sf21(杆状病毒表达载体，实验室手册，纽约(1992))，得自粉蚊夜蛾的细胞High5(Invitrogen)等。或者，也可以使用幼蚕本身。转移载体含有多角体蛋白启动子和得自杆状病毒，用于介导同源重组的序列，以及用于维持和复制载体及插入外源基因的序列(能在大肠杆菌中自我复制的序列和药物抗性基因的序列)，和便于在大肠杆菌中进行基因操作的序列。具体地说，所述载体包括pVL1392，pVL1393，pBluebac4(皆得自Invitrogen)等。

通过使用动物个体可产生ICAT。例如，可在已根据已知方法(美国临床营养杂志，63，639S(1996)；美国临床营养杂志，63，627S(1996)；生物技术，9，830(1991))导入ICAT DNA的动物体中生产ICAT。

可使用任何启动子，只要该启动子能介导动物中的表达即可。例如，可优选使用乳腺细胞特异性的启动子，如α-酪蛋白启动子，β-酪蛋白启动子，β-乳球蛋白启动子，乳清酸性蛋白启动子等。

当将植物细胞或植物体用作宿主时，可根据已知方法(组织培养，20(1994)；组织培养，21(1995)；生物技术趋势，15，45(1997))生产ICAT。

可使用任何能表达ICAT DNA的启动子，只要该启动子能介导植物细胞中的基因表达即可。所述启动子包括例如花椰菜花叶病毒35S启动子，水稻肌动蛋白-1启动子等。另外，可将玉米醇脱氢酶基因的内含子1插入启动子和待表达的ICAT DNA之间以增加ICAT DNA的表达效力。

宿主细胞可以是得自马铃薯，烟草，玉米，水稻，油菜，大豆，番茄，小麦，大麦，黑麦，苜蓿，亚麻等的植物细胞。

可以使用任何能导入重组载体的方法，只要所述方法能将DNA导入植物细胞即可。所述方法包括例如，使用农杆菌，电穿孔(细胞技术，3，133(1990))的方法，使用微粒枪(基因枪)的方法等。

可使用发酵罐大规模培养其中已导入ICAT DNA的植物细胞或器官。也可以再生含有导入基因的植物细胞，以产生其中已导入ICAT DNA的植物体(转基因植物)。

可根据一般的培养方法培养含有重组载体的微生物，动物细胞或得自植物细胞的转化体，所述重组载体含有本发明的ICAT DNA作为插入物，ICAT可以在这些细胞中积累，从培养物中回收ICAT以生产ICAT。

用于培养通过使用动物细胞作为宿主而获得的转化子的培养基包括常用的RPMI1640培养基(美国医学协会杂志，199，519(1967))，Eagle MEM(科学，122，501(1952))，DMEM(病毒学，8，396(1959))，199培养基(生物药物学会会议汇编，73，1(1950))，和含有胎牛血清的这些培养基等。必要时，可在培养基中加入抗生素，例如青霉素或链霉素。通常，可在例如5％CO₂的存在下，于30至40℃，pH6至8的条件下培养1至7天。

用于培养通过使用昆虫细胞作为宿主细胞而获得的转化子的培养基包括常用的TNM-FH培养基(Pharmingen)，Sf-900 II SFM培养基(Life-Technologies)，ExCell400，ExCell405(皆得自JRH Biosciences)，Grace昆虫培养基(自然，195，788(1962))。在优选的培养条件下，pH是6至7；培养温度是25至30℃，培养一般持续1至5天。另外，必要时，可在培养过程中在培养基中加入抗生素，如庆大霉素。

当转化子是动物个体或植物体时，可以根据一般方法，通过饲养或培育转化子，使ICAT在其中积累并从动物个体或植物体中回收ICAT来生产ICAT。

具体地说，对动物个体而言，例如，可以通过饲养含有ICAT DNA的非-人转基因动物，在动物体中产生并积累由重组DNA编码的ICAT，并从动物中回收ICAT来生产ICAT。动物中生产和积累ICAT的位点包括例如动物的乳汁或卵。

对植物体而言，例如，可以通过培育含有ICAT DNA的转基因植物，在植物中产生并积累由重组DNA编码的ICAT，并从植物中回收ICAT来生产ICAT。

任何天然培养基和合成培养基都可用于培养以诸如大肠杆菌的原核生物或诸如酵母的真核生物为宿主而获得的转化子，只要所述培养基含有碳源，氮源，无机盐等生物可同化的物质，转化子可在其中有效培养即可。

可以使用任何生物可同化的碳源，包括葡萄糖，果糖，蔗糖和含有它们的糖蜜；诸如淀粉和淀粉水解物的碳水化合物；诸如乙酸和丙酸的有机酸；诸如乙醇和丙醇的醇类。

可以利用的氮源包括氨，无机酸的铵盐，如氯化铵，硫酸铵，醋酸铵，磷酸铵或有机酸的铵盐，其它含氮化合物，以及蛋白胨，肉提取物，酵母提取物，玉米浸膏，酪蛋白水解物，豆饼和豆饼水解物，多种发酵微生物及其消化物。

所述无机物质包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠，硫酸铁，硫酸锰，硫酸铜，碳酸钙等。

一般在需氧条件下进行培养，例如通过振荡培养或深度-需氧搅拌培养。优选在15至40℃进行培养，一般培养16至96小时。在培养过程中应将pH维持在3.0至9.0。通过使用无机或有机酸，碱溶液，尿素，碳酸钙，氨等进行pH的调节。必要时，可在培养过程中，在培养基中加入抗生素，如氨苄青霉素或四环素。

在培养被使用诱导型启动子的表达载体转化的微生物时，必要时，可在培养基中加入诱导物。例如，当培养被使用lac启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中加入IPTG等；当培养被使用trp启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中加入吲哚乙酸等。

可使用下列分离和纯化蛋白质的一般方法分离和纯化上述转化子培养物中积累的ICAT。

当细胞分泌ICAT时，培养基中积累了ICAT。因此，在培养完成之后，可通过诸如离心分离的技术仅回收已除去细胞的培养基。通过单独或联合使用分离和纯化蛋白质的一般方法，可从培养基中获得纯化的样品；具体地说，可使用溶剂提取，使用硫酸铵等进行盐析，脱盐，有机-溶剂沉淀，使用诸如DEAE Sepharose，DIAION HPA-75(三菱化成)，Mono-Q(AmershamPharmacia Biotech)等树脂的阴离子交换层析，使用诸如SPSepharose(Amersham Pharmacia Biotech)等树脂的阳离子交换层析，使用诸如丁基-Sepharose，苯基-Sepharose的树脂的疏水层析，使用分子筛的凝胶过滤，亲和层析，层析聚集，诸如等电聚焦等的电泳技术。

当ICAT在转化子细胞中积累时，在培养完成之后，通过离心等技术从培养物中回收转化子细胞，随后悬浮于缓冲液中，然后使用超声发生器，弗氏细胞压碎器等破碎细胞，产生无-细胞提取物。当ICAT可溶于细胞时，可按照与从上述培养基中纯化和分离蛋白质所用方法相同的方法，在离心无细胞提取物之后，从上清液中获得纯化的样品。或者，当ICAT以包涵体的形式存在于细胞中时，可以通过离心来处理无细胞提取物，然后回收作为沉淀组分的ICAT包涵体。用蛋白质变性剂溶解所述ICAT包涵体，然后透析所得溶液，使其不含蛋白质变性剂，或者进行透析或稀释，以使如此低水平的蛋白质变性剂不能变性蛋白质，从而恢复ICAT的天然三级结构。随后，通过按照与上述相同的分离和纯化方法获得纯化的样品。

另外，根据已知方法(生物分子NMR杂志，6，129-134，科学，242，1162-1164，生物化学杂志，110，166-168(1991))，通过体外转录-翻译系统生产ICAT。具体地说，将ICAT DNA连接至启动子(如SP6，T7或T3)的下游，使特异于每个启动子的RNA聚合酶与所述启动子反应，以在体外合成大量ICAT RNA，然后通过无细胞反应系统，如利用兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽提取物的翻译系统生产ICAT。

可通过蛋白质化学中常用的方法，例如“基因克隆的蛋白质结构分析”(平野久著，东京化学同人发行，1993)中所述的方法进行纯化ICAT的结构分析。

通过在第1节所述酵母双-杂种体系中使用融合蛋白表达载体(所述融合蛋白为转录激活结构域与所述DNA编码的每种蛋白的融合蛋白)，以及通过使用β-连环蛋白的诱饵质粒，可评价是否检测到了报道基因的转录，从而测定由ICAT或ICAT衍生物(有氨基酸序列的取代，缺失或添加)与β-连环蛋白和TCF/Lef家族的蛋白的复合物的是否进行了结合。或者，在体外直接将ICAT或其衍生物与β-连环蛋白混合，让它们相互结合，或者在细胞中表达ICAT或其衍生物并使它们在细胞中结合，然后通过使用抗β-连环蛋白的抗体对反应溶液或细胞提取物进行免疫沉淀；再通过Western印迹等评价沉淀物中ICAT或其衍生物的存在，从而测定结合的存在。或者，不使用抗体，而制备融合蛋白，所述融合蛋白由ICAT或其衍生物和诸如GST的蛋白质或肽组成以便于纯化，使融合蛋白与经标记(如经35S标记)的β-连环蛋白结合；纯化ICAT融合蛋白之后，检测纯化物中经标记β-连环蛋白的存在以测定结合的存在。

另外，通过使用质粒可以测定是否不仅仅有ICAT或其衍生物能结合β-连环蛋白和属于TCF/Lef家族的蛋白质的复合物，并且也能抑制转录激活复合物的活性，所述质粒中的报道基因，如萤光素酶，氯霉素乙酰转移酶或β-半乳糖苷酶基因被置于启动子的下游，所述启动子含有TCF结合序列，使得转录能被β-连环蛋白和属于TCF/Lef家族的蛋白质的复合物激活，所述质粒如pTOPFLASH和pTOPCAT(科学，275，1784(1997))。将上述具有报道基因的表达质粒与突变β-连环蛋白的表达质粒一起导入动物细胞，所述突变β-连环蛋白总能与属于TCF/Lef家族的蛋白质结合，因此可以激活转录，例如其中的丝氨酸残基33已被酪氨酸取代的突变β-连环蛋白；进一步加入或不加ICAT或其衍生物的表达质粒，然后分析报道基因的表达水平，并比较这两种情况，从而测定ICAT或其衍生物是否能抑制转录激活。

3.制备识别ICAT的抗体

(1)制备多克隆抗体

可将通过上文第2节所述方法获得的全长ICAT或蛋白质的部分片段用作抗原，并施用于动物以制备多克隆抗体。

可用于免疫接种的动物包括兔，山羊，大鼠，小鼠，仓鼠等。优选以50至100μg/每只动物的接种剂量使用抗原。

当使用肽进行免疫接种时，优选与诸如KLH或牛甲状腺球蛋白的载体蛋白共价相连之后，再将肽用作抗原。

在第一次接种之后，以1至2周的间隔施用抗原3至10次。每次接种后3至7天，从眼底静脉丛采集血液。然后通过使用酶免疫测定法(“酶免疫测定法(ELISA)”：医学书院，1976；“抗体：实验室手册”，冷泉港实验室出版社(1988))等来检测血清与免疫用抗原的反应性。

从非-人哺乳动物中收集血清，所述哺乳动物的血清中表现出足够高的抗免疫用抗原的抗体滴度，分离并纯化血清，即可获得多克隆抗体。

用于分离和纯化的方法包括离心分离，用40至50％饱和的硫酸铵盐析，用辛酸沉淀(“抗体：实验室手册”，冷泉港实验室出版社(1988))，和单独或联合使用层析方法进行处理的方法，例如，使用DEAE-Sepharose柱，阴离子交换柱，A蛋白或G蛋白柱，凝胶过滤柱等。

(2)制备单克隆抗体

(2-1)制备抗体生成细胞

将血清中表现出针对(1)中所述免疫所用抗原的足够高抗体滴度的大鼠被用作抗体生成细胞的来源。

给已表现出上述抗体滴度的大鼠最后一次施用抗原物质之后3至7天，取出大鼠的脾脏。

将脾脏切成小块，置于MEM中，用镊子将脾脏压碎。以1200rpm离心5分钟，然后弃去上清液。

用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理所得的脾细胞沉淀组分1至2分钟以除去红血细胞，然后用MEM将脾细胞洗3次。将所制备的脾细胞用作抗体生成细胞。

(2-2)制备骨髓瘤细胞

所用骨髓瘤细胞是由小鼠或大鼠建立的细胞系。例如，可以使用的8-氮鸟嘌呤抗性小鼠(由BALB/c衍生得到)骨髓瘤细胞系包括P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(微生物学和免疫学最新观点，81，1(1978)；欧洲免疫学杂志，6，511(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(自然，276，269(1978))，P3-X63-8653(653)(免疫学杂志，123，1548(1979))，P3-X63-Ag(X63)(自然，256，495(1975))等。在8-氮鸟嘌呤培养基[含有1.5mmol/L谷氨酰胺，5×10-5mol/L2-巯基甲醇，10μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清(CSL)的RPMI1640培养基(下文称之为普通培养基)+15μg/ml 8-氮鸟嘌呤]中传代这些细胞系的细胞，但在细胞融合之前的3至4天，在普通培养基中培养细胞。将2×10⁷或更多的细胞用于融合。

(2-3)制备杂交瘤

用MEM或PBS(1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1L蒸馏水；pH7.2)充分洗涤按(2-1)所述制备的抗体生成细胞和(2-2)中的骨髓瘤细胞，以抗体生成细胞数目：骨髓瘤细胞数目＝5至10∶1的比例将细胞相互混合。以1200rpm离心混合物5分钟，弃去上清液。

充分分散制备自沉淀组分的混合细胞。于37℃搅拌细胞，同时在细胞混合物中加入0.2至1ml(每10⁸个抗体生成细胞)由2g PEG-1000，2ml MEM和0.7ml DMSO组成的溶液；然后以1至2分钟的间隔，在其中几次加入1至2ml MEM。

加入之后，进一步加入MEM以制备细胞直至总体积为50ml。

以900rpm离心所制备的悬浮液5分钟，然后弃去上清液。

小心分散所得沉淀组分中的细胞，然后用测量用的移液管小心吸取，将细胞悬浮于100ml HAT培养基(在普通培养基中加入10^-4mol/L次黄嘌呤，1.5×10^-5mol/L胸腺嘧啶和4×10^-7mol/L氨基碟呤的培养基)。

将100μl悬浮液的等分试样分散于96孔培养板的每个孔中。然后在含5％CO2的37℃温箱中将细胞培养7至14天。

培养完成之后，根据“抗体-实验室手册”(冷泉港实验室出版社，第14章(1988))中所述的酶免疫测定法，取培养物上清液的等分试样来选择与免疫所用抗原特异性反应的杂交瘤，以获得上述抗体生成细胞。

酶免疫测定法的具体例子如下：

用作为免疫用抗原的本发明全长蛋白质或其部分片段的纯化样品包被适当的培养板。在培养板中，将杂交瘤培养物上清液或按照下文(2-4)所述得到的纯化抗体作为第一抗体进行反应，再将经生物素，酶，化学发光物质，放射性化合物等标记的抗-大鼠免疫球蛋白抗体作为第二抗体进行反应。随后，根据标记物进行反应，将表现出与本发明蛋白质的特异反应性的细胞选定为能生产抗本发明蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤。

通过有限稀释法将杂交瘤克隆两次[第一次克隆用HT培养基(不含氨基碟呤的HAT培养基)，第二次克隆用普通培养基]。将稳定表现出高抗体滴度的细胞选定为能生产抗本发明蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

(2-4)制备单克隆抗体

将(2-3)中所得的能生产抗本发明蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞腹膜内注射(5至20×10⁶个细胞/每只小鼠)至8-10周龄的小鼠或裸鼠，在此之前，已给所述小鼠或裸鼠腹膜内注射过0.5ml降植烷(2，6，10，14-四甲基五癸烷)并饲喂了2周。在10至21天后，杂交瘤形成腹水瘤。

从具有腹水瘤的每只小鼠体内收集腹水，然后以3000rpm离心5分钟以除去固体物。

通过与制备多克隆抗体相同的方法，从所得上清液中纯化和制备单克隆抗体。

使用小鼠或大鼠单克隆抗体分型试剂盒进行抗体亚型的分型。根据Lowry法或通过使用280nm处的光吸收值即可计算出蛋白质的量。

4.使用ICAT DNA，ICAT蛋白质和识别ICAT的抗体

(1)可将本发明的ICAT DNA用作探针，通过使用提取自组织和细胞的RNA进行Northern印迹杂交(J.Sambrook等，“分子克隆，实验室手册，第2版”，冷泉港实验室出版社(1989))，籍此检测或定量组织或细胞中ICAT基因的mRNA。通过比较多个组织中mRNA的表达水平，可以揭示出ICAT表达的组织分布。

另外，可将具有与本发明ICAT DNA的核苷酸序列或其部分核苷酸序列相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸用作特异于ICAT DNA的引物，以通过使用提取自组织或细胞的RNA进行RT-PCR来检测或定量组织或细胞中的mRNA。

可将具有与本发明ICAT DNA的核苷酸序列或其部分核苷酸序列相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸用作探针以进行组织切片的原位杂交，给出与表达分布相关的更详细的信息，例如鉴定出组织中表达ICAT的细胞。

通过这些方法提供的，有关何种组织或细胞表达ICAT的信息或有关何种细胞刺激物能改变细胞表达水平的信息可用于研究ICAT，例如涉及ICAT的，由β-连环蛋白/TCF-4介导的信号传导机制。因此，这些DNA可用作研究ICAT的试剂。

另外，具有突变的癌症细胞因ICAT基因的突变而降低了ICAT表达水平，并且不再能抑制β-连环蛋白/TCF-4的活性，因此，这些DNA可用作诊断试剂以分析所述癌症中的ICAT基因表达。

(2)通过使用具有与ICAT DNA或其部分核苷酸序列相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸，可以检测异常，例如ICAT基因的缺失，拷贝数的变化，染色体易位，和基因核苷酸序列中的突变，如取代，缺失，添加等。

检测诸如ICAT基因的缺失，拷贝数变化和染色体易位之类的异常的方法包括Southern杂交。具体地说，可将ICAT DNA用作探针，通过Southern杂交研究经适当限制性酶消化的染色体DNA，以测定异常，例如ICAT基因的缺失，拷贝数变化和染色体易位。

检测ICAT基因核苷酸序列中的取代，缺失和添加突变的方法包括Southern杂交，PCR和SSCP(单链构象多态性)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766(1989))。

当如取代，缺失和添加的突变位于基因的限制性酶位点时，可通过Southern杂交检测ICAT基因核苷酸序列中的突变。

可通过PCR检测ICAT基因核苷酸序列中的突变，在所述PCR中，通过ICAT寡核苷酸扩增染色体ICAT基因以测定扩增片段的核苷酸序列。

根据因核苷酸序列改变而引起的电泳迁移率差异，可通过SSCP检测单个核苷酸的差异，其中在非-变性的聚丙烯酰胺凝胶中电泳得自PCR扩增片段的单链DNA。

当存在一般出现于癌症细胞的突变时，可使用能与突变位点杂交的寡核苷酸探针，通过Southern杂交分析染色体DNA以诊断这种癌症。

(3)可通过辐射-杂合体法(科学，250，245(1990))或原位杂交(人类遗传学年刊，45，135(1981)，细胞，52，51(1988))测定ICAT DNA的染色体位置。

辐射-杂合体法是指定精确染色体位置的方法，其中进行PCR以将ICAT基因特异性地扩增为很多组含有人染色体片段(通过使用染色体标记已鉴定出实验组片段的染色体位置)的DNA，例如Gene-Bridge 4，并分析扩增结果。

在原位杂交中，首先，使用作探针的人ICAT DNA与人染色体样品杂交，然后检测信号，将信号作图于样品上。这样就可以鉴定出ICAT基因在染色体上的物理位置以及相应的染色体编号。探针已被放射性同位素³H或生物素标记。当使用³H标记时，可通过放射自显影检测信号；或者，当使用生物素标记时，可用经荧光染料FITC标记的抗生物素蛋白检测信号。

另外，当用另一种方法替代上述直接检测ICAT基因染色体位置的方法时，通过在STS数据库中检索与ICAT DNA核苷酸序列的同源性，发现STS(序列-标记位点：其具有与衍生自多种EST的核苷酸序列的引物，使用引物扩增的染色体DNA片段，以及片段的染色体位置相关的信息)含有与ICAT DNA的一部分相同的核苷酸序列，该STS可对应于染色体上的ICAT基因，因此，可以认为STS的染色体位置对应于ICAT基因的染色体位置。

与所获得的经鉴定的ICAT基因染色体位置相关的信息可用于研究疾病和ICAT基因之间的关系。例如，LOH(杂合性缺失：在成对基因之一中发现的染色体缺失)的热点区域，作为很可能存在肿瘤抑制基因的癌症相关染色体区域，已在其中鉴定出癌症(一个肿瘤抑制基因已通过另一染色体上对应于该LOH区中肿瘤抑制基因的等位基因的额外突变而灭活，这导致癌症的发生)；当所述区域与ICAT基因的染色体位置恰好重合时，ICAT就可能参与在该区域具有LOH的癌症的发生。此时，当通过分析ICAT基因的突变和表达水平，证实ICAT参与癌症发生时，可以使用ICAT DNA和ICAT或ICAT抗体来诊断和治疗这种类型的癌症。

(4)通过第2节中所述的方法，使用ICAT DNA可产生和获得ICAT。

(5)在APC基因，β-连环蛋白基因或ICAT基因已突变的癌症细胞，如结肠癌中，据认为不能抑制β-连环蛋白/TCF-4所致的转录激活与癌症的发生有关。由于通过施用ICAT，ICAT可抑制由β-连环蛋白/TCF-4介导的转录激活，因此可将ICAT用作这些癌症的治疗剂，在所述癌症中，对β-连环蛋白/TCF-4介导的转录激活的抑制作用已经受损。

对于含有上述ICAT的治疗剂而言，蛋白质可单独作为治疗剂被施用，但一般优选先将蛋白质与一种或多种可药用的载体混合，再以通过制药学技术领域中任何众所周知的方法制备的药物制品形式提供蛋白质。优选使用无菌溶液，其中蛋白质已溶解于水或含水载体，如氯化钠，甘氨酸，葡萄糖，人白蛋白等的水溶液中。另外，可以添加可药用的添加剂，如尽可能与制品溶液的生理条件接近的缓冲试剂和等渗试剂，例如，醋酸钠，氯化钠，乳酸钠，氯化钾，柠檬酸钠等。或者，可以冻干保存，使用时将其溶解于适当溶剂中，然后再用。优选使用能最有效地进行治疗的给药途径，通常，这种有效的给药途径是非肠道途径，例如皮下，肌内，静脉内，支气管内途径等。

(6)除了按照(5)所述，从外部施用ICAT外，可替代地，还可通过给患者施用已插入ICAT DNA的基因治疗载体，并使ICAT DNA在靶细胞中表达来治疗癌症。

(7)可通过第3节中所述的方法，使用ICAT作为抗原，生成能识别ICAT的抗体。

(8)通过使用识别ICAT的抗体可检测ICAT。具体地说，该方法包括以下检测方法：如使用微滴板的ELISA，荧光抗体法，Western印迹或免疫组织染色。

(9)通过使用识别ICAT的抗体可定量ICAT。具体地说，该方法包括：夹心ELISA，所述ELISA使用了两类能与液相中的ICAT反应，并具有不同表位的单克隆抗体；放射-免疫测定法，该方法使用了经放射性同位素，如¹²⁵I标记的ICAT和识别ICAT的抗体等。

附图简述

图1A显示了小鼠ICAT cDNA和人ICAT cDNA中的ORF位置。图1B显示了小鼠ICAT和人ICAT之间的氨基酸序列比较。

图2显示了小鼠组织中ICAT mRNA的Northern印迹结果。从左开始为：睾丸，肾脏，骨骼肌，肝脏，肺，脾脏，脑，心脏；和第7天，第11天，第15天，第17天胎儿。右边显示的数字对应于链长标记的位置。

图3显示了用抗-ICAT抗体免疫沉淀之后进行的Western印迹结果。左边的两个泳道含有小鼠脑提取物；右边的两个泳道含有COS-7细胞样品，所述细胞中已导入了ICAT表达载体。Ag+意味着泳道含有样品，其中在用抗原肽处理之后使用了抗-ICAT抗体。

图4显示了经³⁵S-标记的蛋白质与GST/ICAT或GST的结合。自左边起，各个蛋白质是β-连环蛋白，β-连环蛋白的N末端部分(残基1至140的氨基酸序列)，β-连环蛋白的犰狳结构域(残基141至664的氨基酸序列)，β-连环蛋白的C末端部分(残基665至782的氨基酸序列)，DVL-1，GSK-3β，APC，Axin和TCF-4。最上方的一组实验显示了对体外翻译中所得产物进行SDS-PAGE后的放射自显影模式；箭头表示目的蛋白质的位置。中间的一组实验显示了对与GST/ICAT结合的组分进行SDS-PAGE后的放射自显影模式；最下方的一组实验显示了对与GST结合的组分进行SDS-PAGE后的放射自显影模式。右边的数字表示以kDa计的分子量标记的位置。

图5表示用抗-ICAT抗体或抗-β-连环蛋白抗体免疫沉淀之后的Western印迹结果。最上方和最下方实验组的样品是小鼠脑提取物，中间一组实验使用的样品是COS-7细胞，其中已导入了ICAT表达载体。左边两个泳道含有与抗-ICAT抗体的免疫沉淀物；右边两个泳道含有与抗-β-连环蛋白抗体的免疫沉淀物。在上方，中间或下方实验组中，分别将抗-β-连环蛋白抗体，抗-ICAT抗体或抗-TCF-4抗体用作第一抗体，这些实验组中显示出Western印迹。

图6显示了在293细胞中使用萤光素酶报道质粒pTOPtkLuciferase检测β-连环蛋白/TCF-4-介导的转录激活的结果。上方4个泳道中不使用S33Y突变β-连环蛋白；其余4个泳道表达了S33Y突变β-连环蛋白。泳道1和5仅含有对照载体；泳道2和6含有导入的ICAT表达载体；泳道3和7含有导入的ICAT(13-81)表达载体；泳道4和8含有导入的ICAT(E37-39A)表达载体。

图7显示了在DLD-1细胞(上方的一组实验)和HCT116细胞(下方的一组实验)中使用萤光素酶报道质粒pTOPtkLuciferase检测与β-连环蛋白/TCF-4-相关的转录激活的结果。左边一组显示了ICAT表达载体的实验结果；中间一组显示了ICAT(13-81)表达载体的实验结果；右边一组显示了ICAT(E37-39A)表达载体的实验结果。从上往下，是使用0，0.1，0.25，0.5或1μg各种ICAT或突变ICAT的表达载体所获得的结果。

实施本发明的最佳模式

以下将参照实施例详细描述本发明。

实施例1克隆ICAT cDNA

通过酵母双-杂种体系克隆编码能结合小鼠mβ-连环蛋白臂区的蛋白质的基因。

(1)制备mβ-连环蛋白臂区的诱饵质粒

小鼠β-连环蛋白cDNA的核苷酸序列和由该cDNA编码的小鼠β-连环蛋白的氨基酸序列是公知的(GenBank登录号为M90364，科学，257，1142(1992))。小鼠β-连环蛋白在其氨基酸序列的残基141至664区域含有被称为犰狳结构域的重复序列(mβ-连环蛋白臂区)。通过使用小鼠细胞的cDNA为模板进行PCR，扩增并分离编码该mβ-连环蛋白臂区部分的小鼠β-连环蛋白DNA片段。根据编码上述mβ-连环蛋白臂区的cDNA部分的核苷酸序列设计PCR引物。测序经扩增的DNA片段，以证实其编码mβ-连环蛋白臂区，然后将该片段插入载体pGBT9(Clontech)的BamHI/SalI位点之间，以制备表达GAL4-β-连环蛋白融合蛋白的质粒，其中β-连环蛋白与GAL4BD融合。

(2)使用双-杂种体系进行筛选

用MATCHMAKER小鼠胚胎(Swiss Webster/NIH小鼠；17天龄的胚胎)cDNA文库进行筛选，所述文库是用于双-杂种体系的文库，是由Clontech提供的。该cDNA文库含有具有cDNA插入物的载体pGAD10(Clontech)，所述载体含有参与酵母亮氨酸生物合成的基因LEU2作为选择标记，通过利用ADH1启动子，所述载体可表达GAL4AD和cDNA-编码蛋白质的融合蛋白。根据购自Clontech的文库中所附手册所用的具体筛选方法如下：

具体地说，将双-杂种体系所用的小鼠胎cDNA文库和(1)中制备的质粒GAL4-β-连环蛋白导入酿酒酵母HF7C菌株(Clontech)。HF7C菌株是色氨酸-，亮氨酸-和组氨酸-营养缺陷型的酵母菌株，在其染色体上，具有参与组氨酸生物合成的基因HIS3作为报道基因，所述基因已被连接至可结合GAL4 BD的GAL1启动子的下游，还具有得自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ，该基因已被连接至可结合GAL4 BD的核苷酸序列的下游(基因，212，197(1998))。含有质粒GAL4-β-连环蛋白和能结合mβ-连环蛋白臂区的蛋白质的cDNA克隆，并能表达各个融合蛋白的转化子为非组氨酸营养缺陷型，并且为β-半乳糖苷酶活性阳性，这是因为mβ-连环蛋白臂区和结合蛋白质之间的结合使得GAL4 BD被置于与GAL4 AD相邻的位置，位于可结合GAL4 BD的核苷酸序列下游的HIS3基因和lacZ基因的转录因而被激活。最后从2.3×10⁷个在不含任何亮氨酸，组氨酸和色氨酸的培养基上生长的转化子中选择4个β-半乳糖苷酶活性阳性克隆。

从这些克隆中回收质粒DNA，测定插入cDNA的核苷酸序列。这4个克隆享有相同的cDNA序列。在核苷酸序列数据库中检索与该核苷酸序列的同源性。尽管有一些小鼠EST的核苷酸序列与该序列相同，但未发现有已知的基因与该核苷酸序列相同。因此，可以证实通过双-杂种体系分离的上述cDNA是得自新基因的cDNA。由该新基因编码的蛋白质被称为ICAT。

在所发现的EST核苷酸序列中，一部分序列与通过双-杂种体系获得的cDNA相比，在5’侧延长。因此，根据其中一个EST(GenBank登录号为AA017805)的5’末端的核苷酸序列制备PCR有义引物，再根据小鼠EST(GenBank登录号为AA253623)的核苷酸序列制备反义引物，所述小鼠EST具有与上述ICAT cDNA相同的核苷酸序列。使用这些引物，并使用小鼠胎cDNA文库(Clontech)为模板，经PCR扩增含有在5’侧延长的核苷酸序列的cDNA片段，然后测序。通过连接经双-杂种体系制备的cDNA克隆的核苷酸序列和经PCR揭示的cDNA核苷酸序列，得到SEQ ID NO：3所示的小鼠ICAT cDNA的完整核苷酸序列。在该核苷酸序列中有多个开放阅读框(ORF)。含有50或更多个氨基酸的这种ORF是残基1至273(91个氨基酸；其中不含起始密码子)；残基167至409(81个氨基酸)；残基447至647(67个氨基酸)；残基1122至1304(61个氨基酸)和残基1711至2373(221个氨基酸)(图1A)，但仅根据核苷酸序列，仍不清楚哪一个是真正编码ICAT的ORF。最靠近5’-端起始密码子的81个氨基酸的ORF(SEQ ID NO：6；对应于SEQ ID NO：1核苷酸序列中的残基167至409)被假设为编码ICAT的部分。SEQ ID NO：4中将该ORF的氨基酸序列显示为小鼠ICAT的氨基酸序列。在氨基酸序列数据库中检索该氨基酸序列的同源性，但未找到具有高同源性的氨基酸序列。(3)克隆人ICAT cDNA

在GenBank核苷酸序列数据库中检索与(2)中所得小鼠ICAT cDNA的核苷酸序列具有同源性的人核苷酸序列，结果表明一些EST表现出高同源性。另外，通过检测与这些EST或得自同一克隆的EST(在单个cDNA克隆中，一般有两个EST，即5’末端序列和3’末端序列的EST)共享序列的EST，来收集据认为得自人ICAT cDNA的EST，根据核苷酸序列分析所得EST以测定每个EST对应于人ICAT cDNA的哪一部分。另外，通过测定这些EST的核苷酸序列是否位于测定核苷酸序列所用cDNA克隆的5’方向或3’方向，可以估计出cDNA克隆含有全长人ICAT cDNA的哪一部分。根据分析结果，在这些EST中选择GenBank登录号为AA478738，W73346和AA428913的EST，然后从I.M.A.G.E.consortium获得用于测定这些EST核苷酸序列的亲代cDNA克隆，即克隆IMAGE75366(5’方向EST是AA478738；假设该cDNA克隆含有人ICAT cDNA的5’末端)，IMAGE344405(3’方向EST是W73346；假设该cDNA克隆含有人ICAT cDNA的中间部分)和IMAGE759649(5’方向EST是AA428913；假设该cDNA克隆含有人ICATcDNA的3’末端)。通过按下述方法装配这些cDNA克隆中所包含的cDNA，可制备出几乎覆盖了全长人ICAT cDNA的cDNA克隆phICAT。

首先进行PCR，所述PCR使用IMAGE75366为模板，并使用(a)有义引物，其中在与cDNA部分的5’末端相邻的核苷酸序列(具体地说，是与AA478738的5’末端相邻的核苷酸序列，并对应于SEQ ID NO：1的第9个核苷酸后面的序列)的5’方向添加了一个EcoRI位点，和(b)反义引物，其含有位于SEQ ID NO：1第742位的PstI位点及其下游核苷酸序列；用EcoRI和PstI消化约为760bp的扩增DNA片段以分离该片段。然后用PstI和EcoRI消化IMAGE 759649，分离含有载体pT7T3D-Pac和人ICAT cDNA 3’部分(在位于SEQ ID NO：1第980位残基的PstI之后的部分)的DNA片段。用PstI消化通过连接这两个部分而制备的质粒(在该质粒的cDNA中缺失了SEQID NO：1的残基747至979的序列)，然后通过用碱性磷酸酶处理，除去消化所产生的末端磷酸基团以防止自身连接。将该DNA与用PstI消化IMAGE344405之后分离的约240bp的DNA片段连接。通过测定PstI位点附近的核苷酸序列，将在所需方向上已插入PstI片段的质粒克隆选定为几乎含有全长人ICAT cDNA的cDNA克隆，然后将所得克隆称为phICAT。测定phICAT中cDNA的完整核苷酸序列以确定人ICAT cDNA的核苷酸序列。在该核苷酸序列中，在制备phICAT的过程中，已除去phICAT cDNA核苷酸序列5’末端的8个核苷酸(对应于AA478738核苷酸序列中的残基1至8)，因此，其中已添加了该段核苷酸序列的一个核苷酸序列在SEQ IDNO：1中被表示为全长人ICAT cDNA的核苷酸序列。如图1A所示，在这一人ICAT cDNA的核苷酸序列中，有几个编码50或更多个氨基酸的ORF(残基2至210(70个氨基酸；不含起始密码子)；残基274至516(81个氨基酸)；残基545至709(55个氨基酸)；残基1206至1388(61个氨基酸)，残基1822至2025(68个氨基酸)；和残基2547至2864(106个氨基酸))。然而，当比较得自人和小鼠的每个ICAT cDNA中ORF所处的位置及其由ORF编码的氨基酸序列时，只有编码对应于人ICAT cDNA的核苷酸残基274至516的81个氨基酸的ORF表现出与小鼠ICAT氨基酸序列的同源性，该ORF与小鼠cDNA中的ORF位于相似的位置。该ORF对应于(2)中假设的编码小鼠ICAT的推定ORF，并与后者具有同源性。因此揭示出编码ICAT的区域正如所假设的那样，是SEQ ID NO：3所示小鼠ICAT cDNA的残基167至409(SEQ IDNO：6)区域，或SEQ ID NO：1所示人ICAT cDNA的残基274至516(SEQ IDNO：5)区域。人ICAT DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：5，人ICAT的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。人ICAT和小鼠ICAT氨基酸序列之间的序列比较示于图1B。人和小鼠ICAT之间唯一的差别是81个氨基酸中的2个氨基酸。

实施例2通过Northern印迹分析ICAT基因的表达

使用经随机引物标记法标记的，实施例1中所得小鼠ICAT cDNA为探针，对MTN BLOT(Clontech)进行Northern印迹，MTN BLOT是印迹有得自多个成年小鼠器官(心脏，脑，脾脏，肺，肝脏，骨骼肌，肾脏和睾丸)和小鼠胎(第7，11，15，17天)的poly(A)⁺RNA的滤膜。

结果示于图2。检测到2.6kb的ICAT mRNA片断。在成年小鼠器官中，mRNA在心脏，脑，肝脏和骨骼肌中以高水平表达，而在肾脏，睾丸，脾脏和肺中的表达水平较低。在整个胎儿阶段，mRNA以相同的水平表达。

实施例3制备抗-ICAT抗体

通过肽合成仪合成肽(氨基酸序列：Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu AspArg Arg Gln)，所述肽对应于小鼠和人ICAT氨基酸序列C末端的第70至81位残基。通过使用MBS为间隔将肽与KLH偶联，然后将其用作抗原来免疫兔。免疫方法如下：第一次免疫时皮下注射1mg抗原，第二次免疫之后，以10天为间隔皮下注射0.5mg抗原。自第三次免疫起，从兔体内收集血清，通过ELISA检测该血清与上述肽的反应性，从而测定皮下注射后的抗体滴度。当滴度足够高时，从兔中收集全血清，以得到抗-ICAT的抗血清。对抗-ICAT血清进行硫酸铵沉淀处理，然后透析。通过利用亲和柱从透析液中纯化并得到抗-ICAT多克隆抗体，在所述亲和柱中，用作抗原的肽已被固定在EAH-Sepharose(Amersham-Pharmacia Biotech)载体上。下文将纯化的抗-ICAT多克隆抗体称为抗-ICAT抗体。下文实施例4至7中表明该抗体对小鼠ICAT具有特定的反应性。

实施例4在大肠杆菌中表达重组ICAT并进行检测

(1)在大肠杆菌中表达ICAT

将小鼠ICAT cDNA亚克隆至大肠杆菌谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达质粒载体pGEX5X-1(Amersham-Pharmacia Biotech)的EcoRI/SalI位点之间，以制备融合蛋白表达质粒，其中ICAT在GST的C末端融合(下文简称为GST/ICAT)。用该质粒转化大肠杆菌，然后进行培养。为了进行对照，同时还培养用pGEX5X-1转化的大肠杆菌(该大肠杆菌仅表达GST)。

(2)通过免疫沉淀和Western印迹检测ICAT

回收(1)中培养的转化子，然后在其中加入含有1％Triton X-100的缓冲液A(裂解缓冲液A；缓冲液A的组成：10mM Tris-HCl(pH8.0)，140mmol/LNaCl，1mmol/L EGTA，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽)以裂解细菌。于4℃，使细胞裂解物与实施例3中所得的抗-ICAT抗体反应1小时，以在GST/ICAT和抗体之间形成复合物，然后在反应溶液中加入具有结合IgG之特性的G蛋白-Sepharose 4B(Amersham-Pharmacia Biotech)以吸附免疫复合物。用裂解缓冲液A充分洗涤G蛋白-Sepharose 4B之后，加入SDS-PAGE样品缓冲液以洗脱免疫复合物。将洗脱液用作SDS-PAGE的样品，然后转移至PVDF膜(Immobilon P；Millipore)。通过使用抗-ICAT抗体作为第一抗体，并使用与碱性磷酸酶缀合的抗-兔IgG抗体(山羊)作为第二抗体，用上述膜检测ICAT。

结果表明：在表达GST/ICAT的大肠杆菌中，GST/ICAT和抗-ICAT抗体之间发生反应，结果可检测到一条带，而在表达GST的对照大肠杆菌中未检测到条带。由此揭示出实施例3中所得的抗-ICAT抗体可能就是能与ICAT特异性反应的抗体，正因为它是这样一种抗体，因而才能在免疫沉淀和Western印迹中都能检测到ICAT。

实施例5在动物细胞中表达和检测重组ICAT

将实施例1中所得的小鼠ICAT cDNA亚克隆至动物细胞表达质粒载体pMKITneo(Nakamura等，Genes to Cells，3，395(1998))的EcoRI/SalI位点之间，以制备动物细胞中的ICAT表达质粒。用Lipofect-AMINE(LifeTechnologies)将质粒DNA导入猴肾细胞系COS-7(ATCC：CRL-1651)。48小时之后，回收细胞，按照与实施例4中相同的方法制备细胞裂解物，然后在用抗-ICAT抗体免疫沉淀之后，通过Western印迹进行检测。如图3所示，结果显示出检测到9-kDa的蛋白质带。9kDa的分子量类似于由ICAT的氨基酸序列估计出的分子量。另外，当预先使抗-ICAT抗体与免疫所用的ICAT部分肽反应，然后再进行免疫沉淀反应时，就检测不到ICAT带，因此抗体和ICAT之间的反应受到抑制。

实施例6通过体外翻译系统合成ICAT并用抗体进行检测

在体外，通过使用TNT-网织红细胞裂解物系统(Promega)，由小鼠ICATmRNA翻译并合成ICAT。在按照与实施例4所述相同的方法，使用抗-ICAT抗体进行免疫沉淀之后，对合成的ICAT进行Western印迹，检测到ICAT带。因此，由体外翻译系统合成的ICAT也能与抗-ICAT抗体结合，并与之形成免疫复合物。

实施例7使用抗体检测小鼠脑中的ICAT

在裂解缓冲液A中，使用Dounce匀浆仪破碎49天龄小鼠的大脑以制备裂解物。在按照与实施例4所述相同的检测方法，使用抗-ICAT抗体进行免疫沉淀之后，对裂解物进行Western印迹。如图3所示，结果表明检测到9-kDa的蛋白质带。由于实施例5中也检测到9-kDa的蛋白质，因此大脑中的ICAT基因产物被认为是9-kDa的蛋白质。另外，由此揭示出实施例3中所得的抗-ICAT抗体是能与组织中的ICAT反应的抗体，正因为它是这样一种抗体，因而才能在免疫沉淀和Western印迹中都能检测到ICAT。

实施例8分析ICAT和β-连环蛋白之间的结合

(1)体外检测直接结合

按下述证实ICAT和β-连环蛋白的直接结合。

在体外，通过使用³⁵S-标记的甲硫氨酸TNT-网织红细胞裂解物系统(Promega)，由小鼠β-连环蛋白mRNA翻译并合成35S-标记的β-连环蛋白。培养实施例3中制备的表达GST/ICAT的大肠杆菌以及表达GST的对照大肠杆菌，得到各自的细菌裂解物。在这些细菌裂解物中加入谷胱甘肽-Sepharose 4B(Amersham-Pharmacia Biotech)，GST/ICAT或GST吸附于其上，对其进行分离，于4℃，在含有0.1％Triton X-100的缓冲液A中，使吸附有GST/ICAT或GST的谷胱甘肽-Sepharose 4B与上述经³⁵S-标记的β-连环蛋白反应2小时。用缓冲液A充分洗涤谷胱甘肽-Sepharose 4B，然后在其中加入SDS-PAGE样品缓冲液以将结合的蛋白质洗脱至样品缓冲液中。将洗脱液用作凝胶浓度为15％的SDS-PAGE的样品，然后通过放射自显影肉眼观察凝胶。结果表明：在表达GST/ICAT的大肠杆菌中，检测到经³⁵S-标记的β-连环蛋白带，而在表达GST的大肠杆菌中未检测到该带。由此证实GST/ICAT在体外与β-连环蛋白直接结合，负责结合β-连环蛋白的位点位于GST/ICAT的ICAT组成成分内。

(2)负责与ICAT结合的β-连环蛋白区域

按下述测定负责与ICAT结合的β-连环蛋白区域。通过PCR扩增编码小鼠β-连环蛋白的犰狳结构域(氨基酸序列中的残基141至664)，N末端部分(氨基酸序列中的残基1至140)和C末端部分(氨基酸序列中的残基665至782)区域的DNA片断。通过使用DNA，合成mRNA，并在经35S-标记的甲硫氨酸的存在下，通过TNT-网织红细胞裂解物系统(Promega)体外翻译所述mRNA，以合成对应于各个区域的经³⁵S-标记的部分β-连环蛋白。通过按照与上述相同的方法进行免疫沉淀，检测各个经³⁵S-标记的部分β-连环蛋白与GST/ICAT的体外结合情况。如图4所示，用犰狳结构域部分观察到与GST/ICAT的结合，但用N末端或C末端部分未检测到结合。由此证实ICAT可直接结合β-连环蛋白的犰狳结构域。这一事实与实施例1中小鼠ICATcDNA作为编码能与小鼠β-连环蛋白的犰狳结构域结合的蛋白质的DNA被获得的事实相符。

(3)ICAT与β-连环蛋白的结合特异性

按下述方法证实ICAT特异性结合β-连环蛋白。

按照与(1)中相同的方法，在经³⁵S-标记的甲硫氨酸的存在下，通过体外翻译系统合成除β-连环蛋白外的蛋白质APC，DVL-1，GSK-3β，Axin和TCF-4(对APC而言，仅合成APC氨基酸序列的残基453至767)。按照与上述相同的方法，检测各个经³⁵S-标记的蛋白质与GST/ICAT的体外结合情况。结果示于图4。GST/ICAT不能结合除β-连环蛋白外的这些蛋白质。因此，可以证明ICAT与β-连环蛋白的结合具有特异性。

据报道，TCF-4和β-连环蛋白相互结合形成复合物。当将通过体外翻译系统合成的经³⁵S-标记的β-连环蛋白和经³⁵S-标记的TCF-4加入上述系统，并与GST/ICAT反应时，能同时检测到β-连环蛋白，TCF-4和GST/ICAT。由此证明ICAT可直接结合β-连环蛋白/TCF-4复合物(下文称之为β-连环蛋白/TCF-4)。

(4)细胞中ICAT和β-连环蛋白之间的结合

在使用实施例5制备的，表达小鼠ICAT的COS-7细胞进行免疫沉淀和Western印迹以检测ICAT的实验中，用抗-β-连环蛋白单克隆抗体(Transduction Laboratory；用于免疫的动物是小鼠)替代抗-ICAT抗体进行免疫沉淀，用抗-ICAT抗体作为第一抗体进行Western印迹以进行检测。结果示于图5的中间一组图。检测到ICAT条带，由此证实在细胞中ICAT能与β-连环蛋白结合。然而，在此实验中，在免疫沉淀中使用了预先已与GST/β-连环蛋白反应的抗-β-连环蛋白抗体，由于对免疫沉淀的抑制作用，因而检测不到ICAT条带。

在使用实施例6中的小鼠脑裂解物进行免疫沉淀和Western印迹以检测ICAT的实验中，用抗-ICAT抗体进行免疫沉淀，然后用抗-β-连环蛋白单克隆抗体(Transduction Laboratory；用于免疫的动物是小鼠)作为第一抗体进行Western印迹以进行检测。结果示于图5上方的一组图，检测到β-连环蛋白条带，由此证实在小鼠活体中ICAT也能与β-连环蛋白结合。然而，在此实验中，在免疫沉淀中使用了预先已与GST/ICAT反应的抗-ICAT抗体，由于对免疫沉淀的抑制作用，因而检测不到β-连环蛋白条带。

另外，当在相同的实验中，使用抗-TCF-4抗体(通过按照与制备抗-ICAT抗体相同的方法，用含有对应于TCF-4 C末端20个氨基酸的氨基酸序列的部分肽免疫兔，然后测定滴度而制备的纯化抗体)作为第一抗体进行Western印迹时，可检测到TCF-4条带(图5下方的一组图)。由于已揭示出如(3)中所示，ICAT不能直接结合TCF-4，据认为，在小鼠活体中，ICAT经由β-连环蛋白与β-连环蛋白/TCF-4结合。

实施例9 ICAT的亚细胞定位

通过双重荧光抗体法检测人结肠癌细胞系SW480中的ICAT和β-连环蛋白。具体地说，使细胞与抗-ICAT抗体和抗-β-连环蛋白抗体反应，然后，与作为第二抗体的经FITC-标记的抗-兔IgG抗体(Cappel；能与抗-ICAT抗体结合)和经RITC-标记的抗-小鼠IgG抗体(Cappel；能与抗-β-连环蛋白抗体结合)反应；在荧光显微镜(奥林巴斯；AH2-FL)中分别检测细胞中的ICAT和β-连环蛋白。结果表明ICAT和β-连环蛋白都位于核中。

实施例10由ICAT介导的对β-连环蛋白和TCF所致转录激活的抑制作用

如实施例8所示，已阐明ICAT能与β-连环蛋白/TCF-4结合。β-连环蛋白/TCF-4具有经由与靶基因结合而激活靶基因转录的活性(下文将该活性称为转录激活活性)。因此，研究了ICAT对β-连环蛋白/TCF-4所介导的转录激活活性的影响。具体按下述进行研究。

β-连环蛋白可被GSK-3β磷酸化。在一些结肠癌细胞系和黑素瘤细胞系中，在β-连环蛋白基因内的位点发现了突变，所述位点对应于被磷酸化的位点。据报道，这些细胞系中的β-连环蛋白很难被降解，因此，β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性升高。当通过利用下述报道基因在细胞中表达无磷酸化的突变β-连环蛋白时，可构建一个系统来检测β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性，然后再研究ICAT对此系统的作用。

首先，制备质粒以表达突变的β-连环蛋白S33Y(下文简称为S33Y)，其中被GSK-3β磷酸化的第33位残基丝氨酸已被酪氨酸取代。然后，将0.5μg质粒pTOPtkLuciferase，1.0μg S33Y表达质粒，2.0μg载体MKITneo，0.05μg质粒pRL-TK(Promega)共转染至6×10⁵个人肾细胞系293(ATCC：CRL-1573)的细胞，然后在培养皿(直径为60mm)中培养细胞，其中通过pTOPtkLuciferase，可在启动子(此启动子所致的转录激活受β-连环蛋白/TCF-4的影响)的调节下表达作为报道基因的萤光素酶基因，在所述启动子中，3个TCF-结合位点(核苷酸序列为CCTTTGATC)被插入胸苷激酶基本启动子的上游，在所述基本启动子中，除了启动子外不含调节位点，质粒pRL-TK被用作对照，作为基因导入效率的指标。使用由Promega提供的萤光素酶检测系统试剂盒导入40小时后，通过检测报道基因产物，即萤光素酶的活性，测定由启动子介导的转录水平。另外，通过使用3.0μg MKITneo替代S33Y表达质粒，同时对对照进行相同的萤光素酶活性测定以比较转录水平。在此比较中，pRL-TK的表达水平被用作基因导入的效率以使萤光素酶活性标准化。当导入S33Y表达质粒时，与对照相比，萤光素酶活性，即转录水平有所提高。由此表明突变型β-连环蛋白S33Y具有组成型激活转录的特性(图6)。使用质粒pFOPtkLuciferase而不是pTOPtkLuciferase作为阴性对照，进行相同的萤光素酶活性检测，在pFOPtkLuciferase中，上述pTOPtkLuciferase中所含的TCF结合位点已转变为TCF不能结合的核苷酸序列(CCTTTGGCC)。在此条件下，尽管导入了S33Y表达质粒，也未提高转录水平，因此，可以证实转录水平是通过TCF结合位点提高的。

在上述β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性检测系统中，以连续增加的量，即0，0.1，0.25，0.5或1μg同时导入ICAT表达质粒。导入的ICAT表达质粒DNA量的增加导致对转录水平升高的抑制作用，最终，转录水平降低至与仅导入载体MKITneo时相同。

制备使用小鼠乳腺癌细胞系C57MG而不是293细胞作为宿主的检测系统，以测定β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性。与在293细胞中的情形相同，在此系统中导入S33Y表达质粒也会使报道基因的转录水平提高。在上述系统中，所用TCF-4是细胞内源性TCF-4。然而，当在此系统中再导入TCF-4表达质粒时，能进一步提高转录水平。当在此检测系统中导入ICAT表达质粒以表达ICAT时，与在293细胞中的情形一样，转录水平的增加受到抑制。由此说明ICAT抑制β-连环蛋白/TCF-4介导的转录激活的作用不依赖于细胞类型。

在因基因突变致使APC功能受损的结肠癌细胞系中，据认为由于β-连环蛋白的稳定化，组成型出现β-连环蛋白/TCF-4介导的转录激活。因此，在缺乏S33Y表达质粒时，使用人结肠癌细胞系SW480(ATCC：CCL-228)，DLD-1(ATCC：CCL-221)，SW48(ATCC：CCL-231)或HCT116，而不是293细胞作为宿主细胞(因为利用了组成型激活的内源性β-连环蛋白/TCF-4)，来构建上述β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性检测系统。在这些系统中导入ICAT表达质粒以表达ICAT，与上述情况相同，观察到对转录水平增加的抑制作用。DLD-1和HCT116的结果示于图7。如图7所示，发现ICAT也具有抑制转录的活性，所述转录是由因APC突变的存在而被组成型激活的β-连环蛋白/TCF-4介导的。

根据上述发现，认为ICAT可经由与细胞中的β-连环蛋白/TCF-4结合并抑制转录来调节细胞中与β-连环蛋白/TCF-4相关的信号传导。另外，关于上述检测系统，在因APC或β-连环蛋白发生突变而由β-连环蛋白/TCF-4介导组成型转录激活的系统中，强行表达ICAT导致对转录的抑制作用。因此，可以认为当癌细胞具有APC或β-连环蛋白突变，细胞中由β-连环蛋白/TCF-4介导的转录激活为组成型时，通过施用ICAT或通过在细胞中强行表达ICAT，以调节癌细胞中的转录即可治疗癌症。

实施例11制备ICAT突变体并评价它与β-连环蛋白的结合特性

(1)与同β-连环蛋白的结合相关的区域

按下述通过双-杂种体系测定ICAT缺失突变体和β-连环蛋白之间的结合，从而估计出参与结合β-连环蛋白的ICAT区域。

通过将经PCR扩增的，编码各个小鼠ICAT突变体的部分DNA片段插入载体pGAD424(Clontech)，制备可被双-杂种体系利用的，用于表达下述ICAT缺失突变体的质粒，所述突变体被表达成GAL4 AD融合蛋白。

(a)ICAT(1-61)；(b)ICAT(1-41)；(c)ICAT(13-81)；(d)ICAT(21-81)；(e)ICAT(42-81)；(f)ICAT(42-61)；(g)ICAT(21-61)；(h)ICAT(13-41)和(i)ICAT(13-61)：括号中的数字对应于在ICAT序列中被表达的区域的氨基酸编号；例如，ICAT(1-61)表示含有序列的第1至61位氨基酸残基的ICAT衍生物。

另外，由于负责与β-连环蛋白结合的所有区域富含其它能与β-连环蛋白结合的蛋白质，如钙粘着蛋白，APC和TCF-4中的酸性氨基酸，通过PCR扩增编码ICAT突变体((j)ICAT(E37-39A))的DNA，其中，位于第37，38和39位残基的谷氨酸残基被转变为丙氨酸，在所述PCR利用的引物中，对应于第37，38和39位残基的谷氨酸残基原始密码子(GAG或GAA)中第2位的腺嘌呤核苷酸被转变为胞嘧啶核苷酸(转变为丙氨酸的密码子GCG或GCA)。将此DNA插入载体pGAD424(Clontech)，以制备GAL4 AD与ICAT(E37-39A)的融合蛋白的表达质粒，所述质粒可用于双-杂种体系。

按照与实施例1相同的方法，将这些GAL4 AD-ICAT突变体融合蛋白表达质粒中的每一个与mβ-连环蛋白臂区的诱饵质粒GAL4-β-连环蛋白一起导入酵母HF7C菌株，然后根据转化子中β-半乳糖苷酶活性的存在来评价每种ICAT突变体与β-连环蛋白的结合。结果表明：(a)ICAT(1-61)，(c)ICAT(13-81)和(i)ICAT(13-61)与β-连环蛋白结合，但其余的缺失突变体不与mβ-连环蛋白臂区结合。因此说明N末端的12个氨基酸和C末端的20个氨基酸都不参与结合，具体地说，氨基酸序列中的残基13至61区域对于与β-连环蛋白的结合而言是至关重要的。另外，(j)ICAT(E37-39A)不与mβ-连环蛋白臂区结合。因此说明连续的谷氨酸残基37至39对于与β-连环蛋白的结合而言是至关重要的。

另外，按照与实施例8相同的方法，在大肠杆菌中将ICAT(E37-39A)表达为GST融合蛋白，以评价与β-连环蛋白的体外结合，结果表明它不与β-连环蛋白结合。另外，按照与实施例5相同的方法制备动物细胞表达质粒，在所述质粒中，编码ICAT(E37-39A)的DNA被亚克隆至载体pMKITneo，然后在COS-7细胞中表达该质粒。按照与实施例8相同的方法评价与β-连环蛋白的体内结合，结果表明未检测到结合。此外，当在按实施例10所述制备的β-连环蛋白/TCF-4转录激活活性检测系统中，使用ICAT(E37-39A)突变体替代ICAT时，ICAT(E37-39A)也不能抑制β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性(图7)。

(2)ICAT(13-81)突变体对β-连环蛋白/TCF-4-介导的转录激活的作用

在按实施例10所述制备的β-连环蛋白/TCF-4转录激活活性检测系统中，表达ICAT(13-81)突变体以替代ICAT。尽管如(1)中所示，该ICAT(13-81)突变体能结合β-连环蛋白，但该突变体不能抑制β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性(图7)。该结果表明N末端的12个氨基酸对于ICAT对β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性的抑制作用是至关重要的，与β-连环蛋白的结合不足以抑制β-连环蛋白/TCF-4的转录激活活性。此外，ICAT(13-81)突变体与β-连环蛋白结合，但与ICAT不同，它不具有抑制由β-连环蛋白介导的转录激活的作用；因此，可认为当存在于细胞中时，该突变体作为与ICAT拮抗的，抑制ICAT作用的拮抗剂起作用。

实施例12β-连环蛋白中与同ICAT的结合相关的位点

实施例8中证实了mβ-连环蛋白臂区和ICAT之间的结合。按下述测定mβ-连环蛋白臂区(由12个犰狳单位组成的重复序列；下文将每个重复单位用R1至R12表示)的哪个区域与同ICAT的结合相关。

首先，通过PCR制备编码下述mβ-连环蛋白臂区缺失突变体(6种含有mβ-连环蛋白臂区的一部分的缺失突变体；(a)R1至R9，(b)R6至R12，(c)R10至R12，(d)R10的后一半至R12，(e)R10，(f)R11至R12)的DNA，然后将每种DNA插入载体pGβT9以提供缺失突变体的诱饵质粒。将该突变体与双杂种体系中的小鼠正常ICAT表达质粒一起导入酵母HF7C菌株。根据转化子中β-半乳糖苷酶活性的存在来评价ICAT与mβ-连环蛋白臂区缺失突变体之间的结合。结果表明当表达了(b)R6至R12，(c)R10至R12，或(d)R10的后一半至R12的各个β-连环蛋白区域时，发现了与ICAT的结合，这说明ICAT与mβ-连环蛋白臂区中R10的后一半至R12区域结合，而R1至R9不参与结合。

实施例13人ICAT基因的染色体位置

根据实施例1所得的人ICAT cDNA的核苷酸序列检索STS数据库，揭示出编号为WI-9616，WI-16661和SHGC-30730的STS具有与ICAT相同的序列。另外，在Unigene数据库中检索EST，揭示出stSG22813和stSG2532是该区域的STS。根据数据库中的描述，通过一些诸如辐射-杂合体法的方法，证实这5个STS的所有染色体位置对应于人染色体1上的标记D1S214和D1S244之间的区域。该标记的位置对应于1p36.1。因此，可认为人ICAT基因位于人染色体1p36.1。在成神经细胞瘤，黑素瘤，嗜铬细胞瘤，肺癌，肝癌，结肠癌等中，在1p35-36上有一些染色体缺失，因此，这是据认为存在肿瘤抑制基因的染色体区域(基因染色体&癌症16，211(1996))。当考虑到ICAT能抑制由β-连环蛋白/Tcf-4介导的转录刺激活性这一事实时，可以认为ICAT作为肿瘤抑制基因起作用，因此可用于癌症的诊断和基因治疗。

                   工业实用性

本发明提供了一种蛋白质，其具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的，本发明还涉及编码该蛋白质的DNA，识别该蛋白质的抗体，含有所述蛋白质或DNA的治疗剂，和含有所述抗体的诊断试剂。

                          序列表<110>协和发酵工业株式会社(KYOWA HAKK0 KOGYO CO.，LTD)<120>转录激活抑制蛋白<130>11207WO1<140><141><150>JP 99/120266<151>1999-4-27<160>6<170>PatentIn 2.0<210>1<211>2997<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(274)..(516)<400>1ggccgctcct gctgctgcta ctgccgccgc cgcagcggct gctcgggctg agcacgcccc 60ggaacaggcc gccgcgcgct gcgcgccgga cccgctgccc ctgccggccc ggccgggtcg 120ggcggcccag ggaccgacag acttgacaac ggtgacagca ctggggcggc accttcctac 180ttctgcccag ccacagccct cccctcacag ttgagcacct gtttgcctga agttaatttc 240cagaagcagg agtccccaga gccaggcagg ggg atg aac cgc gag gga gct ccc  294

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             60                  65                  70tcc agg tcg gag acg gaa gac cgg agg cag tagctgcaaa gcccttggaa     536Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg Gln

         75                  80caccctggat gctgttgaag ggccaagaga tctgtgtggc tcctgggccg gctgaatggc 596agcagccccc cttgccccac ctcccccttc cctacccaac cctgccctgc cccaccccac 656ctcacagcta ctcagtgggg ctggcatcaa gggagacacc agtggtgcgt ttataattgg 716cttaaaggga tggacttgtg attggctgca ggaagaaact tttttatttt ttaaatcttg 776accaacagaa accttttatt tttatttctg actcttattt tttaaaaaat ttgcgcctcg 836gtatctggct tccctggaag ctctccgagc tctggtgctt tagttaggtc atttttttag 896aaatgtgaag aggtctgatt ggctgcttaa actggaaagg gactgtgatt ggctggttaa 956tgggaaacgg tttttttctt tggctgcagg tgttctgctg atatcaacag cttccctatt 1016ttgaatgcag aaaacagggt ctgggacatt agtcgttata tttgacttga aaagaaagaa 1076accaagtgcg ctttgcaata tttattacac aaagaacttg ctgctgcctt cacatttggg 1136gtttgtgttt gattggcttt cgatgcgtgt gtttggtttc ccattggttc acctgtgact 1196cctgttgcca tggattcacc cccctctgct gccggctctg ggcctgaggg tccacctgga 1256gagtacattt gctttaatga gtgcacctgc ctccaccagc aaggggaccc cgagaaccct 1316gagcagggtc cacagctgga aagttgggcc cctgaggagc tttgtgtcgt cttgaacgag 1376cagcccaggg cctagaggta accgttaggc gggatttatg tgcactgcct gcatgagctg 1436gcaaccagcc agcgtccctt ggtgagaaag ggattgctga ggcaccgtcc aggccccacc 1496ggccaggccg cgcccagcag aggcgtacta cccagctctg tcctcttggc catccttctg 1556tgtaccactt cctgaggcct cattttgggg gtcatcttgg aaaggggagg agcttctccc 1616agtgtgagac cccaaagact ctggaggtca tctggcggag gtctctggga gcccagaacc 1676cacataaaag ccccagcttg gctcacaagg cccaggagac ctccagctaa acaccaaccc 1736ctgacctacc ccagccaggc tcctacctgt ctgctgccag cacagtaggt cccggccagc 1796tctggagttc tctcatcgga ggcccatgcc ctccactcca ctgcctttgg aagggtctct 1856ctccaggtca gcctggaagg gacagtatcg tttgtttatg aaatgccact gggacagctg 1916gctgggcctt caccaagcaa gtcccttcag actggccctt aagccaaact caggcccaga 1976attgcagttc agaatggcag tcctggaggc agggggtgag gggcaggtct agtgttcctg 2036caccaaacct aagtccttcc acctgccacc cccttccctg ggagggaggt ggtcctccta 2096tctccctggc tcactggcag gtgtgggatc tggggagagc ggctggagaa agatgcagtc 2156ctcaggaagg gggccgccac cctcccctat gctggtagat gctgaggccc ctaggtgccc 2216agggccagtg ggaccctctc agaaccaaat ctttcccctt tctcggggct tggggctcgg 2276gccgtagggg ctcctgagtg tcatgaagtg cacaggagcc aaatgaccga gccctggaga 2336gccccatggt gggtaggtgg ttcgtgctgt gctctggcac catcagcctg ttccagaagg 2396aggattcgag catcaggcta agaccctgtg tcctccacca tgcactcacc cctagccctg 2456gttagctgac agtcagctgt ggggaacaca gctacaaccc taccctggca gggacctgag 2516agcatctcag gaggggcagc gcatgtgtgc atgtgctgtg tgagtgagca cacccgtgtg 2576cacactcata cacatgtgca cacacacgca ctctccccgc tcaggggcct ggaggtctgg 2636ctgagcccct ggggaaaggt gagttctttc atctccctcc tccaggtcgg agtgcctgga 2696gtcaggtgtc gaggccacat tgctggctgc cccctctttg tagctcctat aaagggccca 2756cacctggtgg atacctggtt gagcgtgtgg tctctgcccc agcctgtcct tgtcacgatc 2816acaggccttg cttttgtaac aatgatgacc ccggcctgtc tcatcttctg aagaggaaaa 2876gtcaaagtgt tgctgtggct ccatatttca actaaaaata tatctgttgg agaaagaaat 2936taacaataaa gaattttcat aggttaaaaa aaaaaaanaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa 2996a                                                                 2997<210>2<211>81<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1               5                  10                  15Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn

         20                  25                  30Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val

     35                  40                  45Asn Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Pro His Ser Ile Asp Gln Gly Ala

 50                  55                  60Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65                  70                  75                  80Gln<210>3<211>2606<212>DNA<213>小鼠(Mouse musculus)<220><221>CDS<222>(167)..(409)<400>3caggccgccg cgctccggac ccgcagcccc cggcgccgcg cgttcgggcg gcccagggcg 60gcaccttgct atttcttctc aggcgcggtc ctccccttag agttgagcat ctgtttgcct 120gaagtgaatt tccagaagca ggtgtcccca gaactgggcc aggggg atg aac cgc    175

                                               Met Asn Arg

                                                 1gag gga gca ccc ggg aag agt ccg gag gag atg tac att caa cag aag   223Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile Gln Gln Lys

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             40                  45                  50ctc agc cag ctg cca cag cac tcc atc gac cag ggt gca gag gac gtg   367Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala Glu Asp Val

         55                  60                  65gtg atg gcg ttt tcc aga tcg gag acg gaa gac cgg agg cag           409Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg Gln

     70                  75                  80tagctggaag cccctcggaa ctccctggaa gctgcagatg gccaagagat ctgtgtggct 469cctctgccgg ttgagtggta gcaaaccacc gtcttcttac cctttgcacc ccttacccca 529tccgaccctc cccacccagc cgccactcag cagggctggc atcaaggtgg tttgtgattg 589gcttaaaggg atggacttga gattggctgc aggaagaaac ctttttattt ttaaatcttg 649actaacggaa accttttatt tttatttctg actctttatt tttttaaaca tttgcgcctc 709ggtatctggc ttccccggaa gctctccgag ctctggtgct ttatttaggt catttttagg 769aatgtgaaga ggcctgattg gttgcttaaa ctggaaaagg gttatgattg gctggctagt 829gggacgtggt cttttctttg attggctata ggtgttctgt tcacatcacc gacttcctct 889gttctgaaag cagaaaacgg ggtttgggat attgttatat ttgacttgaa aaaaaaaaaa 949aaagaaagaa atgaagtgag ctttgcaata tttattacac aaagagctgg ctgctgcctt 1009cacgtagtgg gtttgtgttt ggatttgatt ggcagtaaga tgcgggtttg gtttcccatt 1069ggctcacccc tgactcccgt tgctatggtc tttcttccac tctgctggtt acatgaggcc 1129tgagggtaca cctggagaat gcacgtgctt taatgaccac acctgcctcc accagcgaag 1189ggaccccagg gacgcgagcg cgagcggggt ccacagctgg agaacaggcc cccaaggggc 1249tttgtgttct cctgagccag cagcccagag ctcaggggtg accgggaggc aggattgatg 1309tactcagttc taagagctgg cagccagcca gtttcctgga gcgaatggat tgtgcagagc 1369tcttcaggcc tttctggcca gcccatgcta agtacaggag tgttgaccgg cagctccagc 1429ctctctgctg ccccctgtgt ctcacttccc caggtcttgg catccccaga tcctgaaggt 1489tatgaggggt ctttactgga gccttgaacc caagcagata ccccagtttc acttctagaa 1549ccccagaggt ttcaaacttg gctccaagca caacctagcc aggcttccca gggtccattg 1609ccagtggctg tagttcccgg atagcagatg tgttctacct gagcccaggc ccccattaca 1669ccgtgtatca ccctgtgtgt cagcatagaa gggggagtag catggcttat ttattaggaa 1729gcacccactt ggaagaccag ctagactttc acacagtagg ccccacaggc tactcagatc 1789cagcccaagg gtcacatttt agagcagcga ctgagaagaa agatatgggt ggtcgtccca 1849tgcccaccat gccttccctg ggagtgagag aaacggtgac ggccctttct ggtcctgggc 1909accatgatcc ggaaaacact ggagcatctt ttcccttctt ggggcttcgg cctcccgtgt 1969ggcagggagt gtgcaggatg ccagtgccag caggtcttga gttcaagccc tggggcacct 2029ccctgttggt ggacggttca agcttcccag acatgtccca ggaggagaat gtgaacatct 2089ggtccctcag cacatcggcc ctgttagctg acagtaacat gctcgctttg gccattgagc 2149tccagggagc aaggacagtg gagaatcagc tccgccaacc ccagcctgac cagcaagagc 2209ctgagaggag agcgtcattg ctggggagga gcagcgtgtg tgagcaggca cggtatgagc 2269tcacactgac tgacagacgc gtgcttgttc tgctggcgca gtgtggcctg gagatgtggc 2329tgggcccgtg ggcagagatg gggtcattca gtcttcctcc cctgtgagat tgtatctaaa 2389gtccggtgtt gccagcttca gttggttcct gtgactgcct cgaggccaag ccctggtgat 2449ggtgtgtgct ctgtcttagc agtggttctc ggctcagcct ctgagggaaa aagatgcaag 2509tatcgatgtg gcttcttatt ctaactgaaa gtctatctaa tggagaaaaa aaataacaat 2569aaagattttt cacagctaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                          2606<210>4<211>81<212>PRT<213>小鼠(Mouse musculus)<400>4Met Asn Arg Glu Gly Ala Pro Gly Lys Ser Pro Glu Glu Met Tyr Ile1               5                  10                  15Gln Gln Lys Val Arg Val Leu Leu Met Leu Arg Lys Met Gly Ser Asn

         20                  25                  30Leu Thr Ala Ser Glu Glu Glu Phe Leu Arg Thr Tyr Ala Gly Val Val

     35                  40                  45Ser Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala

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     35                  40                  45agc agc cag ctc agc cag ctg cca cag cac tcc atc gac cag ggt gca   192Ser Ser Gln Leu Ser Gln Leu Pro Gln His Ser Ile Asp Gln Gly Ala

 50                  55                  60gag gac gtg gtg atg gcg ttt tcc aga tcg gag acg gaa gac cgg agg   240Glu Asp Val Val Met Ala Phe Ser Arg Ser Glu Thr Glu Asp Arg Arg65                  70                  75                  80cag                                                               243Gln

Claims (21)

1.一种蛋白质，其具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的。

2.权利要求1的蛋白质，其中该蛋白质含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列。

3.一种蛋白质，其含有SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列且其中一个或多个氨基酸被添加，缺失或取代，所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的。

4.编码权利要求1至3中任一项所述蛋白质的DNA。

5.一种DNA，其含有选自根据SEQ ID NO：1，3，5和6的核苷酸序列的核苷酸序列。

6.一种DNA，其在严紧条件下能与权利要求4或5的DNA杂交，并且能编码一种蛋白质，所述蛋白质具有与β-连环蛋白结合并抑制转录激活的活性，所述转录激活是由β-连环蛋白与属于TCF/Lef家族的蛋白质形成复合物而诱导的。

7.重组DNA，所述DNA可通过将权利要求4至6中任一项所述DNA插入载体而得到。

8.含有权利要求7所述重组DNA的转化子。

9.生产权利要求1至3中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法包括以下步骤：在培养基中培养权利要求8所述的转化子，在培养中产生并积累权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，从培养物中回收蛋白质。

10.癌症治疗剂，其中所述治疗剂含有权利要求1至3中任一项所述的蛋白质作为有效成分。

11.癌症治疗剂，其中所述治疗剂含有权利要求4至6中任一项所述的DNA作为有效成分。

12.用于癌症基因治疗的载体，其中所述载体含有权利要求4至6中任一项所述的DNA。

13.含有权利要求4至6中任一项所述DNA的核苷酸序列中连续5至60个残基组成的核苷酸序列的寡核苷酸，含有该寡核苷酸序列的互补序列的寡核苷酸，或这些寡核苷酸的衍生物。

14.癌症诊断试剂，其中所述诊断试剂含有权利要求13所述的寡核苷酸作为有效成分。

15.能识别权利要求1至3中任一项所述蛋白质的抗体。

16.免疫检测权利要求1至3中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法利用了权利要求15所述的抗体。

17.免疫定量权利要求1至3中任一项所述蛋白质的方法，其中所述方法利用了权利要求15所述的抗体。

18.癌症诊断试剂，其中所述诊断试剂含有权利要求15所述的抗体作为有效成分。

19.权利要求10或11所述的治疗剂，其中所述癌症是结肠癌。

20.权利要求12所述的载体，其中所述癌症是结肠癌。

21.权利要求18所述的诊断试剂，其中所述癌症是结肠癌。

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