CN1232498A - Rho gtp酶鸟嘌呤交换因子和编码该因子的核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鸟嘌吟交换因子(GEF),例如Rho－GEF,如p115Rho－GEF的所有方面。GEF通过调节GTP酶活性而体外或体内的调节细胞信号传递途径。为了说明,描述了p115Rho－GEF,它调节RhoGTP酶活性。但是,本发明还涉及其他GEF,特别是其他Rho－GEF。本发明具体涉及分离的P115Rho－GEF多肽或其片段,编码p115Rho－GEF的核酸或其片段。所述多肽和核酸的衍生物。本发明还涉及在治疗、诊断中利用所述多肽、核酸、或其衍生物的方法,并作为研究工具。本发明另一方面涉及识别p115Rho－GEF的抗体和其他配体,p115Rho－GEF活性的调节剂,治疗Rho GTP酶相关疾病的方法。

Description

RHO GTP酶鸟嘌呤交换因子和编码该因子的核酸

发明背景

Ras超家族的成员调节不同的信号传递传递途径。该家族的原型Ras与细胞生长和细胞分化的调节有关(1)。Rho亚家族(Rho,Rac,Cdc42)还涉及细胞生长的调节以及控制粘着斑的形成和生长因子刺激后所发生的肌动蛋白细胞骨架方面的改变(2,3,4,5,6,7)。所有Ras家族成员的共同特征是其在无活性(GDP结合的)和活性(GTP结合的)状态之间循环的能力。就此而言，这些GTP酶作为分子开关起作用，能够加工信息并传递信息以控制具体的途径。

这种在GTP和GDP状态之间循环的特性为鉴定和纯化调节Ras和Ras-相关GTP酶之核苷酸状态的蛋白质提供了方法(1)。通过监测GTP水解为GDP的情况，已经表征了Ras家族的许多成员的GTP酶激活蛋白(GAP)(1,8,9)。基于其抑制GDP解离的能力鉴定鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI)。结果表明它们还与GTP状态结合，抑制内在的和GAP刺激的GTP水解(1)。总之，GAP和效应物对于GTP-结合状态有高度的亲和性，而GDI蛋白质与GDP-结合状态结合最紧密。已经研究了这些特性以纯化Cdc42Hs(10,11,12),Ras(13,14)和Rho(15,16)的效应物。一种亲和方法也已与Cdc42Hs-GTP一起使用并表征了IQGAPI，所观察到的Cdc42诱导的细胞骨架过程的一种可能的介导物。

另外，还用这种亲和方法的修饰方法鉴定并纯化了鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。GEF因其优先与G-蛋白的核苷酸-缺失(depleted)状态相互作用的能力而不同于其它调节蛋白(18,19)。通过刺激GDP的解离和随后GTP的结合，GEF在Ras样蛋白质的激活中起重要作用。例如，通过生长因子刺激的Sos运输，Ras被转变成其GTP-结合形式，Ras特异性GEF(20)。表征特异性激活Rho家族成员的GEF将有助于说明其中有这些GTP酶参与的信号传递传递途径。通过将裂解物与核苷酸-缺失的Rho一起保温，我们纯化了Rho特异性GEF并分离了编码115kDa蛋白质的cDNA，该cDNA与dbl(21)和lbc癌基因同源(22)。本发明描述

本发明涉及鸟嘌呤交换因子(GEF)的所有方面，具体地讲，GEF为Rho-GEF，如p115Rho-GEF。在体外和体内，GEF通过调节GTP酶的活性来调节细胞信号传递途径。为了说明，描述了调节RhoA GTP酶活性的p115Rho-GEF。但是，本发明还涉及其它GEF，特别是其它Rho-GEF。本发明具体涉及分离的p115Rho-GEF多肽或其片段，编码p115Rho-GEF的核酸和其片段，该多肽和核酸的衍生物。本发明还涉及例如在治疗、诊断中使用所述多肽、核酸或其衍生物的方法，以及用所述多肽、核酸或其衍生物作为研究工具的方法。本发明的另一方面涉及识别p115Rho-GEF的抗体和其它配体，p115Rho-GEF活性和其它GEF的调节物，以及治疗与Rho GTP酶有关的疾病的方法。本发明还涉及通过测量其对GEF活性的影响，例如对与GTP酶的结合和/或核苷酸交换活性的影响，用于检测和/或鉴定调节GEF之试剂的方法。附图简述

图1是人p115GEF-Rho基因编码之多肽的完整核苷酸序列(SEQID NO:1)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。发明详述

根据本发明，鉴定和分离了一种编码p115Rho-GEF的新多肽和核酸。文中所用p115Rho-GEF指多肽或编码p115Rho-GEF多肽的核酸，该多肽对于G-蛋白的鸟嘌呤核苷酸-缺失状态(具体是RhoA)有特异性结合亲和性，该多肽有鸟嘌呤核苷酸交换活性，癌基因转化活性和致免疫活性。特异性结合亲和性指所述多肽与G-蛋白的核苷酸-缺失状态优先结合，相反，例如其他调节蛋白与G-蛋白的GDP-或GTP-结合状态优先结合。鸟嘌呤核苷酸交换活性指多肽刺激或催化GDP与G-蛋白，例如Rho解离，以及随后与GTP的结合。细胞癌基因转化活性指编码p115Rho-GEF的核酸导入细胞系如NIH3T3细胞后，赋予所述细胞以所转化的表型。通过例如由Eva and Aronosn，自然316:273-276,1985表征和描述的转化灶形成可测量所转化的表型。免疫原性指所述多肽与p115Rho-GEF特异性抗体结合或者能够引发p115Rho-GEF特异性的免疫反应。免疫原性将在下文讨论，例如按下文实施例所述或本领域技术人员已知的方法，可以检测p115Rho-GEF多肽的上述活性。p115Rho-GEF多肽或编码该多肽的相应核酸指可从天然来源分离的多肽。因此，它包括天然正常和突变体等位基因。天然来源包括例如从组织或整个生物体得到的活细胞和培养的细胞系。

人p115Rho-GEF的分子量约为115kDa，含有图1所列的912个氨基酸(SEQ ID NO:2)。可从天然来源分离人p115Rho-GEF或其相应基因。下文和实施例中将描述人p115Rho-GEF的表征。

本发明还涉及p115Rho-GEF的多肽片段。优选所述片段有生物活性。生物活性指多肽片段在活系统内具有活性或含有活系统的组分。生物活性包括：与G-蛋白特别是RhoA之鸟嘌呤核苷酸-缺失状态的特异性结合亲和性，鸟嘌呤核苷酸交换活性，癌基因转化活性，免疫原性，调节Rho-GEF和Rho GTP酶之间的结合，或作为Rho GTP酶活性的激动剂或拮抗剂。例如按上文和下文所述方法可常规检测所述活性。可制备各种片段。例如含有图1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸249-912的多肽(ΔN-p115)具有鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho的特异性结合亲和性，鸟嘌呤核苷酸交换活性，细胞转化活性和免疫原性。有关进一步讨论参见下文实施例。还可选择与p115Rho-GEF相比消除或改变了一种或多种所述活性的片段。如在实施例中所讨论的，例如通过重组方法或分离多肽的蛋白水解裂解可常规制备所述片段，然后检测所需活性。下文表1列出了与各种p115Rho-GEF片段有关的癌基因转化活性。如下所说明的，缺失p115Rho-GEF N-末端1-82氨基酸可形成含有图1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸83-912的多肽，该多肽消除了转化活性。另一方面，较大的缺失(249-912)修复了转化活性(ΔN-p115)。在另一含有N-末端氨基酸和C-末端氨基酸缺失的片段(ΔN-p115Δc)中，与其他片段相比转化活性有所提高。但是，所述N-和C-末端截短基本上不影响鸟嘌呤核苷酸交换活性。

本发明还涉及选自图1(SEQ ID NO:2)所示氨基酸1-912之序列的人p115Rho-GEF特异性氨基酸序列。含所述序列的克隆已于1996年9月10日以No.98164保存于ATCC。p115Rho-GEF特异性氨基酸序列指在所列举的p115Rho-GEF序列中发现的，但在另一氨基酸序列中不存在的确定氨基酸序列。用计算机程序的BLAST设置，通过基因/蛋白质数据库检索即可常规发现特异性氨基酸序列。所述特异性序列包括例如氨基酸803-912。p115Rho-GEF特异性氨基酸序列可用于产生作为抗原的肽，以产生p115Rho-GEF特异性的免疫反应。可将用所述免疫方法得到的抗体作为p115Rho-GEF蛋白的特异性探针用于诊断或研究目的。还可将所述肽用于抑制p115Rho-GEF与Rho的结合以调节细胞疾病。

可用已知方法分析例如含图1(SEQ ID NO:2)所示多肽序列的本发明多肽以鉴定所述多肽的结构和/或功能区域。例如，当用计算机算法分析图1所列序列(SEQ ID NO:2)时，鉴定了含有下列区域的连续编码序列：胶原蛋白-样卷曲螺旋，氨基酸1-410；Dbl同源区域，氨基酸420-637；血小板-白细胞C激酶底物同源区域，氨基酸646-762。可用各种程序分析所述多肽的结构，包括EMBL Protein Predict；Rrost and Sander,Protein,19:55-72,1994；Kyte and Doolittle,J.Mol.Bio.:157:105,1982。

本发明多肽与SEQ ID NO:2所列氨基酸序列有100％或较低的氨基酸序列同一性。为了进行下列讨论：序列同一性指在图1所列序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)中发现的相同核苷酸或氨基酸在相比较序列的相应位置也可以见到。用各种方法，例如通过保守氨基酸可取代与图1所列氨基酸序列有低于100％序列同一性的多肽。有关保守氨基酸取代的实施例见下文。相同和保守残基的总数除以被比较p115Rho-GEF多肽序列中的残基总数等于序列相似百分比。为了计算序列同一性和相似性，可将被比较序列按照任何所需方法，算法，计算机程序等，包括例如FASTA,BLASTA排列和计算。与图1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)有低于100％氨基酸序列同一性的多肽可具有约60,65，优选67,70,78,80,90,92,96,99等同一性。

p115GEF多肽，片段或取代的p115GEF多肽可含有各种修饰，其中所述修饰包括糖基化，共价修饰(例如氨基酸的R基团)，氨基酸取代，氨基酸缺失，或氨基酸增加。可用各种方法，包括重组，合成、化学方法等完成对所述多肽的修饰。

可选择对p115Rho-GEF多肽的突变以具有p115Rho-GEF生物活性，例如对G-蛋白突变是RhoA鸟嘌呤核苷酸-缺失状态的特异性结合亲和性，鸟嘌呤核苷酸交换活性，癌基因转化活性和免疫原性。下文讨论p115Rho-GEF突变的选择和制备。

可以各种方式使用本发明多肽(例如p115Rho-GEF，其片段，其突变体)，例如作为下文所述抗体的免疫原，作为生物活性剂(例如具有一种或多种p115Rho-GEF相关活性)，作为p115Rho-GEF抑制剂。例如，在p115Rho-GEF与Rho结合后，在细胞中引发事件的级联反应，例如促进细胞增殖和/或细胞骨架重排。用p115Rho-GEF的肽片段，例如作为p115Rho-GEF与Rho相互作用(例如结合)之位点的抑制剂的肽片段，可调节Rho-GEF和Rho之间的相互作用。所述片段可用于调节与Rho信号传递途径相关的疾病。通过检测全长p115Rho-GEF重叠片段抑制p115Rho-GEF活性的能力，例如抑制鸟嘌呤核苷酸交换活性、与Rho的鸟嘌呤核苷酸缺失状态的结合和癌基因转化活性的能力，可用常规方法鉴定有用的片段。在下文和实施例中描述了这些活性的测量方法。也可按EP496162所述，鉴定并制备这些肽。所述肽也可以是经化学修饰的，等等。

在自然中没有的，即非天然的排列中，例如在正常p115Rho-GEF基因，或从活生物体如动物，优选哺乳动物，例如人、小鼠或其细胞系的基因组制备的基因组片段中，可将编码p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列或其衍生物或其片段与一个或多个结构区域、功能区域、可检测区域、抗原性区域和/或所需的多肽组合。具有所述特征的多肽是嵌合或融合多肽。所述嵌合多肽可通过各种方法制备，包括化学法、合成法、似合成法和/或重组方法。在例如含内含子、剪接位点、增强子等的连续的或间断的开放阅读框架中，编码所述嵌合多肽的嵌合核酸可含有各种区域或所需多肽。嵌合核酸可用各种方法生产。参见，例如美国专利5439819。区域或所需多肽可具有任何所需的特性，包括生物功能例如催化、信号传递、生长促进、细胞导向功能等，结构功能例如疏水、亲水、跨膜等，受体-配体功能和/或可检测功能，例如与酶、荧光多肽、绿荧光蛋白GFP结合(Chalfie等，1994，科学，263:802；Cheng等1996自然生物技术(Nature Biotechnology),14:606；Levy等，1996，自然生物技术，14:610等)。另外，在导入宿主细胞时，可将p115Rho-GEF核酸或其部分用作选择性标记。例如可将编码本发明氨基酸序列的核酸在框架中与所需的编码序列融合，然后作为用于纯化、筛选或标记目的的标记物起作用。融合区编码裂解位点。

根据本发明，可用表达系统例如体内、体外、无细胞、重组体、细胞融合等生产本发明的多肽。通过所述系统对所述多肽进行的修饰包括糖基化，氨基酸取代(例如使用不同的密码子)，多肽加工例如消化，裂解，内肽酶或外肽酶活性，化学组成成分包括脂质或磷酸酯的连接等。例如，某些细胞系可从表达的多肽中除去末端甲硫氨酸。

按照常规方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，羟磷灰石层析和植物凝血素层析从天然来源、转化的宿主细胞(培养基或细胞)中回收本发明的多肽。在纯化过程中保持低浓度(约0.1-5mM)钙离子是有益的(Price，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)244:917(1969))。根据需要，在完成成熟蛋白质的构型中，可利用蛋白质的再折叠步骤。最后，在最后的纯化步骤中使用高效液相层析(HPLC)。

根据本发明，编码p115Rho-GEF的核酸可含有例如从图1所列氨基酸1至氨基酸912的完整编码序列(SEQ ID NO:1)。本发明核酸还可含有与上文和下文所述的任何核苷酸序列100％互补的核苷酸序列，例如，反义序列。

本发明核酸可从各种不同的来源得到。所述核酸可得自DNA或RNA，例如从组织、细胞或全生物体分离的聚腺苷酸化mRNA。所述核酸可直接得自DNA或RNA，或得自cDNA文库。所述核酸可得自处于特定发育阶段，有所需基因型、表型的细胞(例如癌基因转化的细胞或癌细胞)等。

含编码本发明多肽之核苷酸序列的核酸可仅含有p115Rho-GEF的编码序列；p115Rho-GEF的编码序列和其他编码序列(例如前导肽、分泌肽、导向肽、酶、荧光或其他诊断肽的编码序列)，p115Rho-GEF的编码序列和非编码序列，例如在5’或3’末端的非翻译序列，或分散在编码序列中的非翻译序列，例如内含子。含不中断的编码p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列的核酸指所述核苷酸序列含有p115Rho-GEF多肽的氨基酸编码序列，而且在编码序列中没有非编码核苷酸，例如没有内含子。也可以认为所述核苷酸序列是连续的。

本发明的核酸还可含有与上述核酸有效相连的表达控制序列。“表达控制序列”一词指调节核酸编码之多肽的表达的核酸序列，该核酸序列与编码所述多肽的核酸有效相连。可以在mRNA或多肽水平上调节表达。因此，表达控制序列包括mRNA-相关的元件和蛋白质-相关元件。所述元件包括启动子，增强子(病毒或细胞的)，核糖体结合序列，转录终止子等。当表达控制序列以影响或完成编码序列表达的方式定位时，表达控制序列与核苷酸编码序列有效相连。例如当启动子与编码序列5’有效相连时，所述编码序列的表达受该启动子的控制。表达控制序列可与正常基因异源或是所述正常基因内源的。

可在核酸杂交的基础上筛选本发明核酸。两个单链核酸制品杂交在一起的能力是其核苷酸序列互补性例如核苷酸间的碱基-配对，如A-T,G-C等的测量标准。因此，本发明还涉及含有与图1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)杂交之核酸的核酸。与后一种序列杂交的核苷酸序列应有一互补核酸链，或在存在聚合酶(即适宜的核酸合成酶)的条件下，作为一核酸链的模板起作用。本发明包括核酸的两个链，例如有义和反义链。

可选择杂交条件以便筛选与图1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)有所需核苷酸互补性的核酸。能够与所述序列杂交的核酸优选在序列之间有50％，最佳为70％的互补性。本发明具体涉及在严紧条件下，与图1所列核苷酸序列(SEQ ID NO:1)杂交的DNA序列。文中所用的“严紧条件”指在核酸间有至少约95％，优选97％核苷酸互补性时，可发生杂交的任何条件。所述条件包括例如Northern杂交：在42℃,5XSSPE,10X Denhardts溶液，100μg/ml新鲜的变性和剪切鲑精DNA,50％甲酰胺，2％SDS；用于从cDNA文库中克隆的杂交：在42℃,1X PAM,0.1％SDS,50％甲酰胺。因此，本发明还涉及在例如心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血白细胞中表达的约7kb核酸。本发明还涉及在例如心和骨骼肌中表达，但在上述其他组织中不表达的约7.3kb核酸。

根据本发明，核酸或多肽可在图1所列的核苷酸或氨基酸序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)中有一个或多个不同。对所述核苷酸和/或氨基酸序列的改变或修饰可通过任何现有方法完成，包括直接或随机诱变。

编码本发明p115Rho-GEF的核酸可含有在天然p115Rho-GEF基因中出现的核苷酸，例如天然多态性，正常或突变等位基因(核苷酸或氨基酸)，在哺乳动物例如人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔的天然种群中发现的突变。术语天然指从天然来源，例如动物组织和细胞、体液、组织培养细胞、法医样品得到的核酸。p115Rho-GEF的天然突变可包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基-或羧基-末端)、取代或增加。按照本发明技术人员已知的核酸杂交方法，可检测和分离这些基因。应认识到，与其他癌基因类似，p115Rho-GEF的天然变体包括在宿主细胞和生物体中产生疾病的缺失、取代和增加。

编码本发明p115Rho-GEF多肽的核苷酸序列可含有在天然基因、转录本或cDNA，例如图1所列的序列(SEQ ID NO:1)中所发现的密码子，或者所述核苷酸序列可含有编码相同氨基酸序列的简并密码子。

另外，本发明的核酸或多肽可得自任何所需的哺乳动物生物体，以及非哺乳动物生物体。可用各种方法得到来自哺乳动物和非哺乳动物的同系物。例如按Sambrook等，分子克隆，1989,11章中所述，通过与对p115Rho-GEF有选择性的寡核苷酸杂交，可筛选所述同系物。

SAS06X SAS13:

GAGTCTCTCTGCACCCTCTG/CACGTCTCCGATCTCCTCGA

MH185X SAS11:

GGAACCGGCGGACG/AAGATGTTCTGCAGCTCCTC所述同系物可具有不同量的核苷酸和氨基酸序列同一性和与p115Rho-GEF的相似性。非哺乳动物生物体包括，例如脊椎动物，无脊椎动物，斑马鱼(zebra fish)，鸡，果蝇，酵母(如啤酒酵母)，C.elegans，线虫，原生动物，植物、拟南芥属，病毒等。

可以在从基因数据库例如Genbank,EMBL进行同源性检索的基础上，产生对p115Rho-GEF序列的修饰例如突变。序列同源性检索可用各种方法完成，包括在计算机程序的BLAST家族中描述的算法、Smith-Waterman算法等。例如在不同序列，Dbl,lbc,Ost,lsc,CDC24等之间，可鉴定保守氨基酸。参见，例如Touhara等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),269:10217-10220.1994；Toksoz and Williams，癌基因(Oncogene),9:621-628,1994；Whitehead等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.),271:18643-18650,1996。然后，通过鉴定和排列多肽间的保守氨基酸并修饰在保守或非保守位置的氨基酸，可将突变导入p115Rho-GEF序列中。突变的p115Rho-GEF基因可在例如同源核酸的相应区域间，特别是Dbl同源(DH)和血小板-白细胞C激酶底物同源区域等之间含有保守或非保守氨基酸。例如突变序列可含有来自任何数量的上述同源序列和/或从适宜的检索算法确定的保守或非保守残基。

可在编码p115Rho-GEF多肽之核酸的特定区域，例如在dbl同源区域，例如氨基酸420-637，或血小板-白细胞C激酶底物同源区域，例如氨基酸646-762中进行突变，例如取代所述区域，改变所述区域内的氨基酸序列等，以便分析所述核酸编码之多肽的功能(例如癌基因转化、与G-蛋白的结合、鸟嘌呤核苷酸交换)。例如，缺失从氨基酸646至氨基酸762的血小板-白细胞C激酶底物区域会导致癌基因转化活性的丧失。血小板-白细胞C激酶底物区域还可能与脂质(例如磷酸肌醇)结合，与Rho的结合，鸟嘌呤核苷酸交换活性的激活，所述多肽在细胞中的定位有关。因此可用各种方法诱变该区域，然后检测所述功能的丧失或获得。DH区域可促进从Rho GTP酶的GDP解离。因此，可制备在该区域内的取代或缺失，然后用常规方法检测功能的丧失或获得。可在p115Rho-GEF的这些或其他区域中产生突变，所述区域可影响p115Rho-GEF的磷酸化或蛋白质/脂质相互作用，从而对其生长信号传递途径进行调节。所述突变基因可用于各种方法：在含有所述突变的患者中用于诊断目的，导入作为疾病模型的细胞或动物(转基因的)中。影响GEF活性和转化活性的突变与在Hart等(生物化学杂志269:62-65)中所述Dbl癌基因之DH区域中所产生的突变类似。另外，p115Rho-GEF的其他突变包括：LLQSIG:             560-566，保守取代VRDMEDLLRL:         606-615；和CCREILH:            594-600，缺失

一种失活突变可包括对p115-RhoGEF之第751位残基的色氨酸的改变。由于在含PH区域的许多蛋白质中，该残基是高度保守的，因此，改变该残基，例如可引起不适当折叠，损害其功能。该突变将抑制p115-RhoGEF的转化活性，但不会影响p115-RhoGEF的GEF活性。

本发明的核酸和相应的多肽包括不同于图1之核苷酸序列(SEQ IDNO:1)的，但却是表型沉默的序列。这些序列修饰包括，例如不影响氨基酸序列的核苷酸取代(例如用于相同氨基酸的不同密码子)，用同源或保守氨基酸取代天然氨基酸，所述同源或保守氨基酸例如(以侧链大小和极化程度为基础)小的非极性氨基酸：半胱氨酸、脯氨酸，丙氨酸，苏氨酸；小的极性氨基酸：丝氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺；大的极性氨基酸：谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸；中等极性氨基酸：酪氨酸，组氨酸，色氨酸；大的非极性氨基酸：苯并氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸。所述保守取代也可包括Dayhoff在蛋白质序列和结构图集(Altas of Protein Sequence andStructure)(1978)中和Argos在EMBO J.,8,799-785(1989)中描述的那些。

核酸含有编码具有SEQ ID NO:2所列之氨基酸序列多肽的核苷酸序列，但在所述氨基酸序列中，一个或多个位置可以被保守氨基酸取代；或者核酸编码具有SEQ ID NO:2所列之氨基酸序列的核苷酸序列，但有1,5,10,15或20个取代，例如其中所述取代是保守氨基酸。本发明还涉及由所述核酸编码的多肽。另外，为了优化序列可改变序列中的密码子以便在所需的宿主中表达。

本发明核酸可含有例如DNA、RNA、合成核酸、肽核酸、修饰的核苷酸或混合物。DNA可以是双链或单链。经各种已知的键，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，根据所需的目的，例如对核酸酶如RNase H的抗性，改善体内稳定性等，将含核酸的核苷酸相连。参见，例如美国专利5378825。

对所述核酸可进行各种修饰，例如连接可检测标记(抗生物素蛋白，生物素，放射性元件)，连接改善杂交、检测或稳定性的组成成分。可将所述核酸按照理想的方法与固相例如硝酸纤维素、尼龙、琼脂质糖、重氮化纤维素、乳胶固体微球、聚丙烯酰胺等相连。参见美国专利5470967,5476925,5478893。

本发明的另一方面还涉及寡核苷酸和核酸探针。可用所述寡核苷酸或核酸探针例如检测、定量分析或分离试验样品中的p115Rho-GEF。检测可适用于各种不同的目的，包括研究、诊断和法医用。对于诊断目的，可用所述探针鉴定样品中是否存在p115Rho-GEF核酸序列或鉴定样品中p115Rho-GEF核酸的量，其中所述样品得自组织、细胞、体液等。在优选的方法中，本发明涉及检测p115Rho-GEF核酸的方法，该方法包括在使靶和寡核苷酸之间进行有效杂交的条件下，将试验样品中的靶核酸与寡核苷酸接触；然后检测杂交情况。还可将本发明寡核苷酸用于合成核酸扩增例如PCR，例如Saiki等，1988，科学，241:53；美国专利4683,202。优选的寡核苷酸包括：

SAS06X SAS13:

GAGTCTCTCTGCACCCTCTG/CACGTCTCCGATCTCCTCGA

MH185X SAS11:

GGAACCGGCGGACG/AAGATGTTCTGCAGCTCCTC

本发明的另一方面是p115Rho-GEF独特的核苷酸序列。p115Rho-GEF独特的序列指p115Rho-GEF中，例如图1的核苷酸序列(SEQID NO:1)中核苷酸的确定顺序，但罕见于其他核酸，特别在动物核酸，优选哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠等中不存在。有义和反义核苷酸序列均被包括在内。可用常规方法确定本发明的独特核酸。可将含p115Rho-GEF独特序列的核酸用作杂交探针以便例如在Northern印迹上鉴定含有核酸混合物的样品中是否存在p115Rho-GEF。独特序列包括例如从约核苷酸2340-3150的p115Rho-GEF的C-末端区。可在严紧条件下完成杂交以便筛选与探针有至少95％同一性(即互补性)的核酸，但也可使用较低的严紧条件。可将独特的p115Rho-GEF核苷酸序列在其5’或3’末端与本专利中所提到的各种核苷酸序列在框架中融合，所述各种核苷酸序列包括p115Rho-GEF，酶、GEP等的其他部分的编码序列，表达控制序列等。

根据所需的选择性，例如按Sambrook等，分子克隆，1989中所述，可在不同的条件下完成杂交。例如为了特异性检测p115Rho-GEF，可在其中寡核苷酸仅与p115Rho-GEF杂交的条件下，例如其中所述寡核苷酸与所述靶100％互补的条件下，将寡核苷酸与靶核酸杂交。如果需筛选有低于100％核苷酸互补性，至少约例如99％、97％,95％,90％,70％、67％互补性的靶核酸，可以使用不同的条件。由于p115Rho-GEF基因中的突变可引起疾病，例如癌、良性肿瘤，所以可将本发明寡核苷酸用于诊断目的。例如，利用本发明的寡核苷酸，和其他癌基因寡核苷酸等，例如p53,Rb,p21,Dbl,MTS1,Wt1,Bcl-1,Bcl-2,MDM2等联用，用聚合酶链反应，然后进行DNA测序以检测所述序列是否正常，就可诊断带有癌症或与Rho信号传递途径有关的其他疾病(见下文)之症状的患者是否患有所述疾病。在优选的方法中，本发明涉及诊断癌症的方法，该方法包括在使靶核酸与寡核苷酸有效杂交的条件下，将含所述靶的样品与寡核苷酸接触；检测杂交情况，其中所述寡核苷酸含有p115Rho-GEF的序列，优选p115Rho-GEF的独特序列；然后确定与所述寡核苷酸杂交的靶核酸的寡核苷酸序列。可用各种方法确定所述序列，所述方法包括分离靶核酸，或其DNA，然后按所需的方法确定其序列。

本发明的寡核苷酸可以是任何所需大小的，优选14-16个寡核苷酸长或更长。所述寡核苷酸可以有非天然核苷酸，例如肌苷。根据本发明，寡核苷酸可含有一试剂盒，其中所述试剂盒包括所需的缓冲液(例如磷酸盐，tris等)，检测组合物等。所述寡核苷酸可以是用本领域已知的放射性或非放射性标记标记过的或未被标记过的。

还可由本发明核酸制备反义核酸，优选编码图1之编码序列(SEQID NO:1)的反义序列。可以各种方式使用反义核酸，例如用于调节p115Rho-GEF的表达，例如抑制p115Rho-GEF，以检测其表达或用于原位杂交。为了达到调节p115Rho-GEF表达的目的，可将反义寡核苷酸与表达控制序列有效相连。

可用任何所需的方法标记本发明核酸。用放射性示踪物如³²P、³⁵S、¹²⁵I、³H或¹⁴C标记所述核酸，提到的仅仅是常用的示踪物。可按照任何方法，例如用放射性标记的寡核苷酸、多核苷酸激酶(用磷酸酶进行过或未进行过去磷酸化)或连接酶(根据待标记的末端)在3’或5’末端进行末端标记，即可完成放射性标记过程。也可使用非放射性标记，将本发明核酸与具有免疫特性的残基(抗原、半抗原)，与特定试剂有特异性亲和性的残基(配体)，具有能够进行待完成的酶反应(酶或辅酶，酶底物或与酶反应有关的其他物质)之特性的残基，或具有特征性物理特性例如荧光或所需波长光的发射或吸收等的残基混合。

通过各种技术，包括Northern印迹，PCR，原位杂交等，可将本发明核酸包括寡核苷酸，反义核酸等用于检测全器官、组织、细胞等中p115Rho-GEF的表达。所述核酸可特别用于检测受到扰乱的p115Rho-GEF表达，例如p115Rho-GEF的细胞-特异性和/或亚细胞改变。可单独确定p115Rho-GEF的水平或与其他基因(癌基因如p53,Rb,Wt1等)产物、转录本等一起确定。根据所需的目的，本发明核酸可在各种不同的体外和体内系统中表达。例如，可将核酸插入表达载体，随后导入所需的宿主，然后在有效表达所述核酸所编码之多肽的条件下培养。有效的条件包括适于由宿主生产所述多肽的任何条件，包括有效温度、pH，培养基，用于培养宿主细胞的培养基的添加剂(例如扩增或诱导表达的添加剂，例如丁酸盐，或如果编码核酸与dhfr基因相连时，是氨甲喋呤)，环己酰亚胺，细胞密度，培养皿等。通过任何有效的方法包括例如磷酸钙沉淀、电穿孔、注射、DEAE-Dextran介导的转染、与脂质质体融合和病毒转染，可将核酸导入细胞。已导入本发明核酸的细胞是转化的宿主细胞。所述核酸可作为宿主细胞的染色体外成分或被整合至宿主细胞的染色体中。所述核酸可以是稳定的或暂时的。根据其与宿主细胞的相容性筛选表达载体。宿主细胞包括哺乳动物细胞例如COS-7,CHO,HeLa,LTK,NIH3T3,Rat1成纤维细胞，酵母，昆虫细胞例如Sf9(S.Frugipeda)和果蝇，细菌例如大肠杆菌，链球菌，芽孢杆菌，酵母，真菌细胞，植物、胚胎干细胞(例如哺乳动物，例如小鼠或人)，癌或肿瘤细胞。可按类似Graziani等，癌基因(Oncogene)7∷229-235,1992的方法完成Sf9表达。同样根据宿主相容性和所需的目的，例如高拷贝数，大量，诱导，扩增、控制表达等目的来筛选表达控制序列。可使用的其他序列包括例如；来自SV40,CMV的增强子，可诱导启动子，细胞型特异性元件，或允许进行选择性或特异性细胞表达的序列。

除了p115Rho-GEF核酸外，也可将另一种所需基因导入相同的宿主中，从而调节p115Rho-GEF的表达，阐明p115Rho-GEF的功能或所需基因的功能。所需基因包括其它癌基因，涉及细胞周期的基因等。这种基因可以是正常的基因，或变异如突变、嵌合体、多态性等。

本发明的核酸或多肽可用作核酸或蛋白质电泳、层析等中的大小标记物。通过在序列中搜索限制性位点，计算大小，并进行相应的限制性消化可测定确定的限制性片段。有用的片段包括：

Sac1-BamH1：核苷酸：1454,2332，大小=878个碱基；

Sph1-Sph1：核苷酸：295-1356，大小=1061个碱基；和

Sac2-Rsr2：核苷酸：1696-2462，大小=766个碱基。

p115Rho-GEF多肽也可用作蛋白质凝胶的115kd分子量标记物。

本发明的另一方面涉及有GTP酶参与的生物途径的调节，尤其是病理学状态，如细胞增殖(如癌症)，生长控制，形态发生，应力纤维形成，和整联蛋白-介导的相互作用，如胚胎发育，肿瘤细胞生长和转移，编程性细胞死亡，止血，白细胞归航和激活，骨吸收，血块凝缩，和细胞对机械应力的反应的调节。例见Clark和Brugge，科学，268:233-239,1995；Bussey，科学，272:225-226,1996。因此，本发明涉及调节Rho多肽活性之方法的所有方面，所述方法包括施用有效量的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，有效量的能调节Rho多肽活性的化合物，或有效量的编码p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段的核酸。被调节的Rho活性可包括：GTP结合，GDP结合，GTP酶活性，整联蛋白结合，Rho与受体或效应物样分子(如整联蛋白，生长因子受体，酪氨酸激酶，PI-3K,PIP-5K等)的偶联或结合，例见Clark和Brugge，科学，268:233-239,1995。通过Rho的增加，减少，拮抗，促进等可调节活性。通过常规检测GTP的水解，PI(4,5)二磷酸与p115Rho-GEF的结合等可测定Rho的调节。有效量是施用时可调节Rho活性的任何量。可在原位，体外(试管，固相支持物等)，体内或任何所需的环境中调节细胞，组织，整个生物体中的Rho活性。

使用如鸟嘌呤核苷酸交换活性的GEF活性，与GTP酶之鸟嘌呤核苷酸-缺失位点的结合，或癌基因转化活性，或如GTP水解的GTP酶活性的检测法可鉴定能调节GEF，如p115Rho-GEF和GTP酶之间相互作用的化合物。通常，具有这种体外活性的化合物可在体内用于调节与GTP酶相关的生物途径，如用于治疗与上述生物活性和细胞活性相关的病理学状态。为了说明，在上下文中根据Rho和p115Rho-GEF描述了鉴定GEF调节剂的方法。然而，应理解这种方法一般也可用于其它GEF。

可使用如Hart等，自然，354:311-314,28Nov.1991(尤其是其中的图2说明)所述的鸟嘌呤核苷酸交换检测法检测化合物调节Rho和p115Rho-GEF之间相互作用的能力。例如，用含氚-GDP标记Rho蛋白(重组蛋白，重组融合蛋白，或从天然来源中分离得到的)，然后在可发生核苷酸交换的条件下将经含氚-GDP标记的Rho与p115Rho-GEF和GTP一起保温。通过例如使用BA85滤器将结合的GDP与游离的GDP分离开可测定由Rho保留的含氚-GDP的量。通过在适当时间在保温物中加入化合物(如加入p115Rho-GEF之前，加入p115Rho-GEF之后)并测定所述化合物对核苷酸交换的作用可测定化合物调节相互作用的能力。以此方法可鉴定相互作用的多种激动剂和拮抗剂。

可按如Hart等，生物化学杂志，269:62-65,1994所述的多种方法测定与Rho之鸟嘌呤核苷酸-缺失位点的结合。简单地说，可使用本领域技术人员熟知的多种方法，例如使用Rho抗体、Rho与标记蛋白的融合蛋白如谷胱甘肽蛋白(GST)使Rho蛋白与固相支持物偶联，所述方法如使用Rho抗体，Rho和如谷胱甘肽蛋白(GST)的标记蛋白的融合蛋白，其中融合蛋白经由标记蛋白(如当使用GST时为谷胱甘肽珠)等与固相支持物偶联。Rho蛋白被转变为鸟嘌呤核苷酸缺失的状态(有关有效的条件，例如见Hart等，生物化学杂志，269:62-65,1994)，并与例如GDP,GTPγS和如p115Rho-GEF的GEF一起保温。然后分离固相支持物，并在凝胶中电泳支持物上的所有蛋白质。可在保温过程中的任意时间(如上所述)加入化合物以测定其对GEF与Rho结合的作用。

根据多种已知的方法可测定p115Rho-GEF或其衍生物对癌基因转化活性的调节作用，所述方法如Eva和Aaronson，自然，316:273-275,1985；Hart等，生物化学杂志，269:62-65,1994。可在方法过程中的任意时间(如细胞的预处理；加入GEF之后等)加入化合物以测定其对p115Rho-GEF的癌基因转化活性的作用。也可使用多种细胞系。

根据与本领域已知方法类似的方法也可进行针对Rho-介导的信号转导的其它检测，所述方法描述于美国专利5,141,851；5,420,334；5,436,128；和5,482,954；WO94/16069；WO93/16179；WO91/15582；WO90/00607。另外，根据EP496 162可鉴定和制备能抑制p115Rho-GEF和G-蛋白之间的相互作用如结合作用的肽，如RhoA。

本发明也涉及检测和鉴定能调节鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段之鸟嘌呤核苷酸交换活性，或调节GEF或其生物活性片段和与之结合的GTP酶或其生物活性片段之间的结合的试剂的方法。所述方法包括将GEF和GTP酶与待测试剂接触，然后检测GEF和GTP酶之间结合的存在或结合的量，或检测GEF的活性，如鸟嘌呤核苷酸交换活性。至于调节，意味着加入影响活性或结合的试剂。可通过多种方式实现结合或活性的调节，包括抑制，阻断，制止，增加，增强或促进。无需用特殊的方式得到结合或活性效应，例如经由试剂和GEF或GTP酶之间的交联，所述结合可以是竞争性的，非竞争性的，别构的，位阻的，妨碍性的等等。试剂可对GEF或GTP酶起作用。试剂可以是激动剂，拮抗剂或部分激动剂或部分拮抗剂。可以多种方法测定结合的存在或其量，所述方法如直接或间接检测由GEF促进或抑制的活性，如鸟嘌呤核苷酸交换，GTP水解，癌基因转化等。这种检测法描述于上下文中，也是本领域中已知的方法。可从包括天然和合成的多种来源得到和/或制备试剂。它包括例如氨基酸、脂质、糖类、有机分子、核酸、无机分子或其混合物，例见Hoeprich，自然生物技术(Nature Biotechnology),14:1311-1312,1996，该文献描述了自动合成有机分子的例子。试剂可同时或依次被加入。例如，可在GEF中加入试剂，然后将所得混合物与GTP酶进一步混合。可在液体中分离的组分上，基质(如滤纸，硝酸纤维素，琼脂糖)上，细胞中，组织切片上等进行方法的操作。根据所述方法，GEF可与GTP酶结合，这种结合可调节一些GTP酶的活性。例如，如上下文中所讨论的，p115Rho-GEF与Rho结合，导致鸟嘌呤核苷酸解离。该作用可直接针对GEF和GTP酶之间的结合位点，或者也可以是别构的，或者仅对一个组分(如仅对GEF)起作用。可容易地修饰鸟嘌呤核苷酸解离的检测法以鉴定调节GTP酶活性的试剂。所述方法另外还涉及得到或产生根据上述方法鉴定的试剂。本发明还涉及根据这种方法鉴定的产物，可利用的多种GEF和GTP酶包括p115Rho-GEF,mSOS,SOS,C3G,lsc,Dbl,Dbl-相关蛋白，含有一个或多个DH域的多肽，CDC24,Tiam,Ost,Lbc,Vav,Ect2,Bcr,Abr,Rho(A,B和C),Rac,Ras,CDC42，其嵌合体，其生物活性片段，其突变蛋白等。

因此，本发明还涉及治疗和预防与Rho-介导的信号转导相关的疾病和病理学状态，如癌症、与细胞异常增殖相关的疾病。例如，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括给需要治疗的受试者施用治疗疾病有效量的化合物，其中化合物是p115Rho-GEF基因或多肽表达的调节剂。治疗疾病意味着延迟疾病的发作，延缓疾病的进程，改善或延缓疾病的临床和病理学病征。类似地，所述方法也涉及治疗与炎症，和/或嗜中性白细胞的趋化能力相关的疾病。调节剂化合物或化合物的混合物可以是合成的，天然或它们的联合。调节剂化合物可含有氨基酸，核苷酸，碳氢化合物，脂质，多糖等。优选调节剂化合物是p115Rho-GEF的调节剂，如抑制或增加其mRNA，蛋白质表达，或加工，或其与Rho的相互作用，如鸟嘌呤核苷酸交换。使用不同的试剂可调节表达，所述试剂如选自氨基酸1-912(SEQID NO:2)的多肽或其衍生物，Dbl同源性区域的配体，反义核酸，核酶，aptamer，合成的化合物，或天然化合物。另外，可在细胞中补加p115Rho-GEF或其衍生物。为了治疗疾病，可将化合物或混合物配制成药物组合物，所述组合物含有本领域技术人员熟知的可药用载体和其它赋形剂，例见Remington’s PharmaceuticalScience，第18版，Mack出版公司，1990。这种组合物还可含有有效量的特别用于治疗癌症的其它化合物。

本发明还涉及特异性地识别p115Rho-GEF多肽的抗体。根据任何适当的方法可制备抗体，如多克隆，单克隆，重组的，嵌合的抗体。例如，为了产生单克隆抗体，可将有效量的，含或不含佐剂的图1(SEQ ID NO:2)多肽经皮下和/或腹膜内施用于小鼠，山羊或兔以引发免疫应答。抗体也可以是单链或Fab，抗体可以是IgG，亚型，IgG2a,IgG1等。

特异于p115Rho-GEF的抗体指的是可识别图1(SEQ ID NO:2)之p115Rho-GEF的氨基酸序列之部分或全部氨基酸的确定序列的抗体，因此，如免疫印迹检测法所检测和/或测定的，相对于不同的表位而言，特异的抗体可以较高的亲和力与图1(SEQ ID NO:2)中的氨基酸序列，即表位结合。因此，特异于p115Rho-GEF表位的抗体可用于检测样品，如检测含有p115Rho-GEF基因产物之组织样品中表位的存在，将之与不含表位的样品区分开。如Santa Cruz生物技术公司，研究产品目录中所述，这种抗体是有用的，因此可被配制成例如100μg/ml。

另外，使用例如合成的肽文库，或核酸配体(如Pitrung等，美国专利5,143,854；Geysen等，1987，免疫学方法杂志，102:259-274；Scott等，1990，科学，249:386；Blackwell等，1990，科学，250:1104；Tuerk等，1990，科学，249:505)也可制备与本发明p115Rho-GEF多肽结合的配体或其衍生物。也可制备Dbl同源性区域(420-637)或血小板-白细胞C激酶底物区域(646-762)等的核酸配体。

可以多种方式使用与p115Rho-GEF结合的抗体和其它配体，包括作为治疗剂，诊断剂和商用研究工具，如定量测定动物，组织，细胞等中的p115Rho-GEF多肽水平，鉴定p115Rho-GEF的细胞定位和/或分布，纯化p115Rho-GEF或含有p115Rho-GEF部分的多肽，调节p115Rho-GEF的功能等。p115Rho-GEF的抗体或其衍生物可用于Western印迹，ELIZA，免疫沉淀，RIA等中。本发明涉及所述检测法，用于进行所述检测的组合物和试剂盒等。

可使用本发明的抗体检测多种样品中的p115Rho-GEF多肽或其片段，所述样品包括组织，细胞，体液，血液，尿液，脑脊液。本发明的方法包括在本领域已知的有效条件下接触与SEQ ID NO:2的肽结合的配体以完成结合，检测配体和肽之间的特异性结合。至于特异性结合，意味着配体与SEQ ID NO:2氨基酸序列之部分或全部氨基酸的确定序列或其衍生物结合。也可使用抗体或其衍生物抑制p115Rho-GEF或其片段的表达。p115Rho-GEF多肽的水平可单独被测定，也可与其它基因产物联合被测定。具体地说，可将p115Rho-GEF多肽的量(如其表达水平)与相同或不同样品中的其它多肽，如p21,p53,Rb,WT1等的量相比较(如得到比例)。

p115Rho-GEF的配体可与其它抗体，如识别癌症的肿瘤学标记物(包括Rb,p53,c-erbB-2)，癌基因产物等的抗体联合使用。一般而言，可根据任何适当的方法，如美国专利5,397,712；5,434,050；5,429,947所述，在诊断和/或法医研究中使用特异于p115Rho-GEF的试剂。

本发明也涉及根据适当方法，如美国专利5,434,050所述方法制备的经标记的p115Rho-GEF多肽。经标记的多肽可用于例如结合检测法中以鉴定与p115Rho-GEF结合或附着的物质，示踪p115Rho-GEF在细胞，体外，体内，原位系统等中的移动。

可分离本发明的核酸，多肽，抗体，p115Rho-GEF配体等。术语“分离的”指的是在其原始环境中不存在的物质形式，如更浓缩的，更纯化的，与其它组分分开的等。分离的核酸包括例如具有从活动物染色体DNA中分离的p115Rho-GEF序列的核酸。此核酸可以是载体的一部分或被插入染色体中(通过特定基因-寻靶或通过在非其正常位置的位置处随机整合)，并仍可以以在其天然环境中不存在的物质形式被分离。本发明的核酸或多肽也可基本上被纯化。至于基本上纯化，意味着核酸或多肽被分离，且实质上与其它核酸或多肽脱离，即核酸或多肽是主要的和活性组分。

本发明也涉及含有p115Rho-GEF核酸的转基因动物，如非人动物，如小鼠。根据已知方法可制备转基因动物，所述方法包括例如将重组基因前核注射进1-细胞胚胎的前核中，将人工酵母染色体掺入胚胎干细胞，基因寻靶方法，胚胎干细胞方法学。例如见美国专利4,736,866；4,873,191；4,873,316；5,082,779；5,304,489；5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.,77:7380-7384(1980)；Palmiter等，细胞，41:343-345(1985)；Palmiter等，Ann.Rev.Genet.,20:465-499(1986)；Askew等，分子细胞生物学，13:4115-4124,1993；Games等，自然，373:523-527,1995；Valancius和Smithies，分子细胞生物学，11:1402-1408,1991；Stacey等，分子细胞生物学，14:1009-1016,1994；Hasty等，自然，350:243-246,1995；Rubinstein等，核酸研究，21:2613-2617,1993。本发明的核酸可被导入任何非人哺乳动物，包括小鼠(Hogan等，1986，小鼠胚胎操作：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)，猪(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，绵羊(Hammer等，自然，315:343-345,1985)，牛，大鼠或灵长类动物。例如见Church,1987,Trends inBiotech,5:13-19；Clark等，1987,Trends in Biotech,5:20-24；和DePamphilis等，1988，生物技术(Biotechniques),6:662-680。另外，常规转基因大鼠和小鼠产品可以商购，这些转基因动物可用作癌症模型，例如用于检测药物或作为蛇的食物。

通常，可按美国专利5,501,969；5,506,133；5,441,870；WO90/00607；WO91/15582所述制备和使用本发明的核酸，多肽，抗体等。

至于核酸，多肽，抗体等的其它方面，可参考分子生物学，蛋白质科学和免疫学的教科书。例见Davis等(1986)，分子生物学基本方法，Elsevir科学出版公司，纽约；Hames等(1985)，核酸杂交，IL出版社，分子克隆，Sambrook等，分子生物学最新方法，F.M.Ausubel等编，John Wiley & Sons公司；人类遗传学最新方法，Nicholas C.Dracopoli等编，John Wiley & Sons公司；蛋白质科学最新方法；John E.Coligan等编，John Wiley & Sons公司；免疫学最新方法；John E.Coligan等编，John Wiley & Sons公司。实施例Rho-相关蛋白的鉴定和纯化

为了鉴定Rho相关蛋白，用100μCi/ml³⁵S-甲硫氨酸将6个10cm平皿中的生长至70％汇合的经src-转化的NIH3T3细胞标记过夜。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)将每个平皿洗涤1次，并用1ml20mMTris,pH7.5,100mM NaCl,2.5mM MgCl₂,1mM二硫苏糖醇，30μg/ml亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽，1mM pefabloc和0.6％Triton X-100(v/v)裂解其中的细胞。当裂解缓冲液中含有磷酸酶抑制剂时，加入NaF和NaVO₄，使它们的终浓度分别为20mM和1mM。用GSH琼脂糖预清除之后，将上清液与GSH琼脂糖一起保温，所述琼脂糖偶联了10μg在核苷酸缺失的，GDP或GTPγS状态下制备的由大肠杆菌表达的GST-RhoA(18)。对于核苷酸缺失的条件而言，在裂解液中加入EDTA至终浓度为10mM。4℃下保温2小时之后，用含有0.1％Triton X-100和10mM EDTA(对于核苷酸缺失的条件而言)或5mMMgCl₂(对于GDP/GTPγS条件而言)的磷酸盐缓冲盐水将珠洗涤3次，并用SDS样品缓冲液洗脱珠。通过放射自显影在8％-聚丙烯酰胺SDS凝胶上分析洗脱液。为了纯化，由10个15cm的COS细胞平皿制备10ml胞质溶胶，制法是在低渗裂解缓冲液(20mM Tris,pH7.5,10mMNaCl,2.5mM MgCl₂,1mM二硫苏糖醇，30μg/ml亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽，和1mM pefabloc)中匀浆细胞。离心后，加入Triton X-100至终浓度为0.2％，然后将裂解液分成两等份，用GSH琼脂糖预清除，并与120μg偶联在GSH琼脂糖上的核苷酸缺失的-或GDP-GST-RhoA一起保温，然后按上述进行处理。为了得到p115的肽序列，将200μg偶联在GSH琼脂糖上的核苷酸缺失的GST-RhoA与由25个15cm的COS细胞平皿制备得到的胞质溶胶一起保温。对从珠上洗脱下来的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，从凝胶上切下对应于p115的染色带，并用蛋白酶endolys-C处理(23)。p115的克隆

测定全部6个肽的序列，使用其中的1个肽RQEVISELLVTEAAHV以得到p115的cDNA。应用设计最佳猜测寡核苷酸的规则，产生了下列探针：CGGCAGGAGGTGATCTCTGAGCTGCTGGTGACAGAGGCTGCCCATGT，用多核苷酸激酶末端标记所述探针，使用该探针从Stratagene胎儿脑cDNA文库中筛选到2×10⁶个噬斑(24)。通过此次筛选，分离到3.0kb的cDNA，并发现它编码的蛋白质含有6个分离的肽中的3个。在体外TNT小麦胚凝集素裂解液系统(Promega)中表达被称为EN-p115的此克隆，并发现此克隆编码85kDa的蛋白质。为了发现p115的其余5’编码序列，使用针对EN-p115的5’末端产生的探针筛选DR2和GT11胎儿脑cDNA文库(Clontech)。这些筛选的结果是分离出重叠的0.7,0.8,0.9和3.0kb的cDNA。通过用TAQ聚合酶循环测序从两个方向上对cDNA测序，并在ABI373A DNA测序仪上进行分析。为了制备全长的p115构建体，用EcoRⅠ和Sfi消化0.7和3.0kb的cDNA，并亚克隆至pGEM11Zf(Promega)的EcoRⅠ位点。此构建体被用于在小麦胚凝集素裂解物中体外转录和翻译。cDNA构建体

为了在杆状病毒/SF9系统中表达，将原始cDNA EN-p115作为EcoRⅤ/XbaⅠ片段亚克隆至含有5’glu-glu标记物的pAcO载体的Stu-XbaⅠ位点。按前述进行经glu-glu标记的蛋白质的表达和纯化(24)。为了进行病灶形成试验，将多种p115cDNA,lbc和dbl cDNA亚克隆至EXV myc标记物载体。被称为EN-p115的cDNA编码氨基酸249至912，将它作为EcoRV-XbaⅠ片段亚克隆至EXV-myc载体的互补位点，然后使用此构建体制备EN-p115EDH,其中通过用Sac1和Sac2消化缺失编码DH区域之氨基酸466至547的DNA，然后用T4DNA聚合酶使经切割质粒的末端钝化，将载体重新连接。通过用RsrⅠ和XbaⅠ消化除去编码氨基酸803至912的DNA来制备EN-p115EC。通过用BalⅠ和XbaⅠ消化除去编码氨基酸719至912的序列来制备PH区域被截短的构建体(EN-p115EPH)。用于制备EXV-mycdbl的方法在别处有述(5)。

使用针对lbc癌基因之公开序列(22)产生的引物，从Stratagene心脏cDNA文库中扩增500个碱基对的片段。然后将此片段用作模板以通过聚合酶链反应产生经放射性标记的探针。通过筛选Stratagene心脏cDNA文库得到1.8kb的cDNA。1.8kb的cDNA含有lbc癌基因的序列以及未公开的序列，可能代表原-lbc序列。使用特异性引物，经聚合酶链反应扩增编码氨基酸1至417的DNA序列。设计的引物掺入经扩增DNA的5’和3’末端的EcoRⅤ和XbaⅠ位点，然后被亚克隆至EXV-myc载体。免疫化学检测

在兔中产生针对纯化的重组p115片段的特异于p115的抗体。EN-p115(氨基酸249-912)在杆状病毒昆虫细胞系统中被表达成经glu-glu表位标记的蛋白质，通过在抗glu-glu Sepharose上进行亲和层析(24)来纯化EN-p115。然后将7微克经glu-glu标记的EN-p115与被CNBr-激活的Sepharose偶联，并与注射了EN-p115的兔的10ml血清一起保温，然后用0.2M甘氨酸，pH2.5洗脱抗体并用1M K₂HPO₄中和。为了进行免疫印迹，使用的是经亲和纯化的终浓度为1μg/ml的EN-p115抗体。将印迹保温过夜，用25mM Tris,pH8.0,150mM NaCl,0.05％吐温-20洗涤3次，然后用与HRP缀合的山羊抗兔IgG显色，接着进行ECL检测。所使用的针对磷酸酪氨酸p190-RhoGAP和rasGAP(Transduction Labs,Inc.)的单克隆抗体的终浓度为1μg/ml。用与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG检测免疫印迹上的交叉反应性。p115刺激的与RhoA的解离

比较p115刺激的GDP和GTPγS与RhoA的解离。将数量不断增加的经glu-glu标记的EN-p115(0,0.002,0.075,0.02,0.4,1.0μM)与0.3μM结合有[³H]-GDP或GTP[³⁵S]的RhoA一起保温10分钟，按Hart等人所述(39)测定与RhoA保持结合状态的核苷酸的量。EN-p115刺激的GDP解离的特异性。将数量不断增加的EN-p115(0,0.25,0.5,1.0,2.0μM)与2.0μM与[³H]-GDP预结合的GST-RhoA,GST-Rac1,GST-Cdc42Hs或EE-K-Ras一起保温5分钟，并按A中所述进行分析。复合物形成的Western分析。按Hart等人所述(18)将1μg经glu-glu标记的EN-p115与4μg经杆状病毒表达，与GSH琼脂糖偶联的核苷酸缺失的或GDP状态的GST-Rho,GST-Rac或GST-Cdc42Hs一起保温。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析经洗涤的GSH珠上回收的蛋白质。用经亲和纯化的抗glu-glu单克隆抗体探测印迹，将100ng经glu-glu标记的EN-p115用作阳性对照。经p115催化的GEF对RhoA活性的动力学分析。室温下，在100μM GTP,0.2μM[³²P]GTP和5mM MgCl₂存在下将数量不断增加的与GDP结合的GST-RhoA和50nM p115一起保温5分钟，将GTP掺入Rho的水平/min/pmol EN-p115测定为与硝酸纤维素滤纸结合的GST-RhoA[³²P]GTP。p115-RhoGEF的鉴定和克隆

为了鉴定能与Rho相互作用的蛋白质，将GST-Rho与GSH琼脂糖偶联，制备成以核苷酸缺失的，GDP和GTPγS状态存在的形式，并与经³⁵S-甲硫氨酸代谢标记的被src转化的NIH-3T3细胞的裂解物一起保温，用SDS从琼脂糖珠上洗脱相关的蛋白质，在丙烯酰胺凝胶上电泳并通过放射自显影进行分析。通过使用此方法，鉴定出4个与Rho相互作用的蛋白质：p190,p120,p130和p115，其中的2个蛋白质p190和p120仅与GDP和GTPγS状态相互作用。仅当在磷酸酶抑制剂存在下进行纯化时才能观察到这2个蛋白质。抗磷酸酪氨酸Western分析表明p190和p120都是酪氨酸磷酸化的。接着用特异性的单克隆抗体进行分析，结果表明p190是p190-RhoGAP，而p120是RasGAP。在磷酸酶抑制剂的存在下，p190-RhoGAP对Rho-GDP/GTPγS的亲合力显著增强。还发现RasGAP也与GDP/GTPγS状态相关联，假定是通过它与p190-RhoGAP的相互作用来实现这一目的(25)。另外2个蛋白质p130和p115也与Rho结合，但它们仅与核苷酸缺失(ND)的状态相互作用，仅当裂解缓冲液中含有磷酸酶抑制剂时才能检测到与p130的相互作用，而p115与Rho的相互作用不依赖于磷酸酶抑制剂。借助于p130和p115与Rho之核苷酸缺失之状态结合的能力，这2个蛋白质可以是Rho GTP酶的GEF。

使用这种亲和方法，从GST-Rho(ND)柱上的COS细胞的胞质溶胶中纯化p115。凝胶纯化的数量足够进行p115的氨基酸微量测序，对p115进行蛋白酶裂解消化。分离出6个肽并进行测序。使用基于1个肽之序列的核苷酸探针，从胎儿脑cDNA文库中分离出3.0kbcDNA，随后进行的筛选鉴定出3个重叠的0.7,0.8,0.9和3.0kbcDNA。对这些序列进行排列，结果表明连续的3.2kb cDNA含有编码推定的104kDa蛋白质的开放阅读框架。对p115表达的Northern分析鉴定出2个占优势的转录物，其大小分别为7.0和3.4kb。p115似乎在人组织中遍在表达，但在外周血白细胞，胸腺和脾脏中表达量最高。当p115 3.2kb的cDNA在体外被表达时，蛋白质产物以115kDa的分子量迁移。针对p115氨基酸249-912产生的经亲和纯化的多克隆抗体可识别COS和猪动脉内皮细胞(PAE)细胞中相同分子量的蛋白质。在很多人肿瘤细胞系中也检测到p115，所述细胞系如DLD-1,HCT116,HTB177,SW480,SW620,MIA,Panc-1,HT1080,C33A,H522,A549和BXPC3。

蛋白质同源性检索表明p115含有Dbl同源性(DH)区域，接着是血小板-白细胞C激酶底物同源性(PH)区域。p115的DH区域与Lfc,Lbc和Dbl癌基因中的类似区域分别为33.5％,32.3％和22.9％相同。p115的PH区域与Lfc和Lbc中的PH区域最类似(29.5％和26.6％相同)，仅与Dbl的PH区域有9％相同。N-末端氨基酸序列与含有卷曲螺旋的蛋白质，如胶原蛋白是同源的。生化鉴定

由于p115含有与Dbl和Lbc交换因子同源的区域，下一步进行的实验旨在鉴定p115的潜在GEF活性。将Rho预先与³H-GDP或GTp³⁵S结合，并与p115缺乏氨基末端序列的纯化重组形式(EN-p115)一起保温。EN-p115能促进GDP和GTPγS与RhoA的解离，但对前者更加有效，EN-p115不能促进GDP与Cdc42Hs,Rac1或K-Ras的解离。在适当条件下，1μM EN-p115将GDP与RhoA的内源性解离刺激了10倍。GEF活性的特异性与EN-p115同核苷酸缺失状态的GST-Rho物理结合的能力相关。EN-p115不与GST-Cdc42,GST-Rac或K-Ras相互作用。经p115-催化的对Rho的GEF活性的动力学分析表明Rho的KM为1.35μM,Vmax为每分钟每pmol EN-p115掺入0.031pmol GTP。转化潜力

由于大量能激活Rho的Dbl类蛋白质(Dbl,Lbc,Ost)(18,26,27)已显示出可以转化，我们检测了多种经myc标记的p115构建体，lbc和dbl的转化潜力(表1)。根据用抗-myc标记物单克隆抗体进行Western分析测定的蛋白质表达水平，使NIH-3T3细胞中病灶形成试验所用的DNA量正常化。几乎全长形式的p115(氨基酸83-912)不能转化，然而，当进一步地截短N-末端时，EN-p115能在NIH-3T3细胞中诱导病灶形成。如果此p115构建体被进一步截短至PH区域的C-末端，EN-p115EC变得更加易转化。当DH区域内部有缺失(EN-p115EDH)或如果PH区域部分被截短(EN-p115EPH)时，EN-p115不再转化(表1)。这些数据与以前的观察结果，即Dbl-类蛋白质需要完整的DH和PH区域以维持其转化活性(18,26,28)是一致的。同时还检测了经myc-标记的lbc和经myc-标记的dbl的转化潜力，这些实验的结果表明dbl比p115和lbc更加易转化。

rho,rho V14的激活形式也诱导NIH3T3细胞中的病灶形成，这些病灶的形态学与ras-诱导的病灶有所不同(29,30)。这种差别可能源于Ras转化途径下游的分叉(31)。与此解释相一致的是，经由rho V14激活途径的一个分支与使用raf,raf-CAAX的激活形式激活第二个分支有协同作用(30)。由EN-p115诱导的病灶的表型类似于经rho V14和lbc诱导的病灶表型。这些病灶含有圆形，紧密堆积的细胞。ras或raf-CAAX诱导的病灶的形态学为旋涡模式，含有纺锤形细胞(30)。当rhoV14或EN-p115被raf-CAAX共同转染时，这些病灶中的大多数所具有的形态学介于对rhoV14或EN-p115表达和raf-CAAX表达所观察的结果之间。由rhoV14/rafCAAX和p115/rafCAAX共转染形成的病灶在中间密集，外周为纺锤形。与rhoV14类似，在病灶形成试验中EN-p115可与结构上具有活性的raf-CAAX协同作用。这些结果与p115在体内作为Rho的GEF起作用是一致的。结果讨论

Rho GTP酶调节肌动蛋白细胞骨架结构的形成和其它对调节细胞生长至关重要的事件。Rho已显示出可诱导应力纤维的形成，并参与介导LPA和生长因子促进应力纤维形成和病灶粘附形成的能力(6)。Rho似乎也能控制整联蛋白粘附复合物的装配，所述复合物参与B-淋巴细胞之细胞-细胞聚集作用(32)和化学引诱剂-激活的白细胞粘附作用(33)。另外，Rho作为LPA和AlF₄激活之转录的介导物起作用(3)，并可通过细胞周期G1相加快进程以调节细胞生长(7)。Rho诱导细胞内变化的方式目前仍是未知的，然而，最近鉴定的Rho潜在的效应物(ROK,PKN,Rhophilin和磷脂酶-D(15,16,34,35))可介导Rho对细胞形态学和转录激活的所观察到的作用。

使用亲和方法，我们也能检测到4个蛋白质与特异性核苷酸状态的Rho的结合。当在缺乏磷酸酶抑制剂的情况下制备裂解物时，p190-RhoGAP能与GTPγS状态的Rho相互作用，然而，如果裂解缓冲液中含有磷酸酶抑制剂，与GTPγS以及GDP状态的Rho结合的p190的量显著增加。在这些条件下，也发现可能与p190复合的RasGAP可与GTPγS以及GDP状态的Rho结合。p190对Rho亲和力显著增加的机制仍是未知的。也许是RasGAP与p190的结合增加了其对Rho的亲和力。McGlade等人进行的实验(36)可提供支持此想法的体内证据。RasGAP N-末端(GAP-N，含有SH3和2个SH2区域)的表达导致与p190形成稳定的复合物。表达GAP-N的细胞呈递被打乱的应力纤维，与纤连蛋白微弱结合，对病灶的粘附能力降低。在这些细胞中，GAP-N与p190稳定的相互作用可促进其RhoGAP活性，导致由Rho激活作用正常诱导的细胞骨架结构消失。最近，Chang等人(37)阐明用EGF治疗过量表达c-Src的细胞，可诱导肌动蛋白应力纤维的快速分解和p190及RasGAP在核周围的arc-样结构中出现。这表明身为c-Src优选底物的p190(38)负责EGF诱导的应力纤维的减少。这些结果与酪氨酸磷酸化和RasGAP结合可激活p190的RhoGAP活性的模式是一致的。

与GST-Rho亲和柱结合的其它2个蛋白质是p115和p130，这2个蛋白质仅与核苷酸缺失状态的Rho相互作用。由克隆自胎儿脑cDNA文库的COS细胞裂解物纯化p115，发现它编码含有Dbl同源性区域之蛋白质的生长家族新成员。因此，p115之N-末端截短的形式(EN-p115)刺激GDP与Rho解离，而不与Cdc42,Rac或K-Ras解离。当在磷酸酶抑制剂存在下制备裂解物时，还鉴定出第2个蛋白质p130。p130可能代表另一种Rho-GEF，它仅当磷酸化时才行使其功能。或者，p130也可通过以依赖于磷酸化的方式与p115偶联而间接地与Rho相互作用，p130不是p115的超磷酸化形式，因为抗p115产生的抗体不与p130交叉反应。

由于最初发现Dbl致癌-蛋白质作为Cdc42Hs的GEF起作用(39)，大量蛋白质和癌基因已显示出含有Dbl同源性(DH)区域。含有DH的所有蛋白质的共同特征是血小板-白细胞C激酶底物区域紧接DH区域的C-末端。血小板-白细胞C激酶底物家族的成员与异源三聚体G-蛋白的β亚单位(40)或酸性磷脂(41,42)相互作用。IRS-1PTB区域在结构上与PH区域相似，它可与酪氨酸磷酸化的肽相互作用(43)。因此，PH区域可能具有很多种细胞配体，所述配体可提供将Dbl-类蛋白质定位于膜的机制。Lbc和Lfc PH区域之间高度的同源性表明它们可能拥有共同的配体，而p115PH区域与这些序列有很大程度的不同，这表明它可能与不同于上述配体的其它配体结合。对于DH区域也有类似的结论。相对于p115的DH区域而言，贯穿此区域，Lbc和Lfc互相之间享有更高的序列同源性。因此，将Lbc/Lfc和p115作为Rho-特异性GEF的两个不同亚类来考虑较为恰当。由本文进行的转化试验可以明显看出相对于p115而言，dbl更易转化。这可以反映出PH区域配体的差异，GEF效力的差异，或或许是对Rho家族成员特异性的差异。

在此研究中，检测了多种p115构建体的转化潜力，几乎全长形式的p115(氨基酸83-912)不能转化，然而，在NIH-3T3细胞中，N-末端进一步被截短之形式(EN-p115)的表达能促进病灶形成，所述病灶的表型类似于由rhoV14诱导的病灶表型，EN-p115也与rhoV14类似，在病灶形成试验中可与raf-CAAX协同作用。当EN-p115在C-末端被截短(EN-p115EC)时，p115的转化潜力进一步增加，这表明在细胞中，N-和C-末端可负调节p115的功能。检测EN-p115和EN-p115EC的GEF活性，发现它们具有相同水平的内在的GEF活性，因此，C-末端的截短可通过更彻底地暴露其PH区域，使PH区域与特异性配体更有效地相互作用来增加p115的转化潜力。由于未检测全长p115的GEF活性，因此不可能讨论是否其不能转化细胞的原因为缺乏GEF活性或未暴露的，位阻的PH区域。然而，其转化潜力的缺乏表明p115可能需要重要的调节信号以在细胞中成为具有完整功能性的Rho-特异性GEF。

含有多个结构基元之Dbl-类蛋白质数目的不断增加表明可能存在选择性调节GEF的特殊机制。很多这些基元参与蛋白质-蛋白质的相互作用(44)。例如，原-Vav含有SH2和SH3区域(45)；涉及Aarskog-Scott综合征的FGD1(46)具有2个潜在的SH3结合位点，克隆自人不成熟的骨髓细胞系(KG1)cDNA文库(17)的ORFP(登记号为#D25304)具有SH3区域。通过与其它蛋白质偶联，这些基元可提供集中Rho-类GTP酶以在特殊的细胞环境中行使功能的机制。Rho已显示出可参与受体酪氨酸激酶途径以及激活异源三聚体G-蛋白的途径，如LPA和fMLP。由于p115可在很多培养的细胞系中被表达，p115代表开始致力于研究调节Rho-型GEF之机制的理想候选对象。考虑到Lbc的组织分布相当有限(22)，有趣的是可推测p115在很多细胞类型中能介导Rho-依赖型作用。将来的研究会致力于测定p115参与的信号传递途径，p115如何被调节？p115可结合的蛋白质或脂质。

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无需进一步详述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述，最大程度地利用本发明。因此，前文优选的具体实施方案只是阐明本发明，而不会在任何程度上以任何方式限制公开内容的其余部分。

上文和图中提及的所有专利和出版物的全部公开内容通过参考文献列入本文。

由上文的描述，本领域技术人员易于确定本发明的必要技术特征，且在不背离本发明精神和范围的情况下，可对本发明作出多种改变和修饰以使之适应多种应用和条件。

表1．p115构建体，lbc和dbl促进NIH3T3细胞中病灶形成之能力的比较

   构建体^×     每个10cm平皿上病灶的平均数目^××1．p115(83-912)                02．ΔN-p115                   9^±13．ΔN-p115ΔC              106^±54．ΔN-p115ΔPH               1^±15．ΔN-p115ΔDH                06．lbc                      123^±47．dbl                      318^±8

^×使用了下列量的质粒DNA:1)p115(83-912),5μg2)EN-p115,0.2μg3)EN-p115EC,0.2μg4)EN-p115EPH,0.5μg5)EN-p115EDH,2μg6)lbc,0.2μg7)dbl,0.1μg。

^××显示的病灶数目表示3个独立实验的平均值，每个实验进行双份。按Qiu等人所述(31)进行病灶形成试验。

                   序列表(1)一般资料：

(ⅰ)申请人：Hart,Matthew J.

(ⅱ)发明题目：涉及RHP GTP酶鸟嘌呤交换因子的新核酸和多肽

(ⅲ)序列数：2

(ⅳ)通讯地址：

   (A)收件人：ONYX Pharmaceuticals,Inc.

   (B)街道：3031Research Drive

   (C)城市：Richmond

   (D)州：CA

   (E)国家：USA

   (F)邮政编码：94806

(ⅴ)计算机可读形式：

   (A)介质类型：软盘

   (B)计算机：IBM PC可兼容机

   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30

(ⅵ)目前的申请资料：

   (A)申请号：US未知

   (B)申请日：05-NOV-1996

   (C)分类号：单一性

(ⅷ)代理人/代理资料：

   (A)姓名：Giotta,Gregory

   (B)登记号：32,028

   (C)资料/文档号：ONYX1023GG

(ⅸ)通讯资料：

   (A)电话：(510)262-8710

   (B)传真：(510)222-9758(2)SEQ ID NO:1的资料：

(ⅰ)序列特征：

   (A)长度：3150个碱基对

   (B)类型：核酸

   (C)链型：双链

   (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅲ)假设：无

(ⅳ)反义：无

(ⅸ)特征：

   (A)名称/关键词：CDS

   (B)位置：55..2790

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:GGGCGCCCCG CCGGTCACTT CCGCGCGGAC ACCAGCCTTG CAGAGCCCAG GGAG ATG        57

                                                        Met

                                                          1GAA GAC TTC GCC CGA GGG GCG GCC TCC CCA GGC CCC TCC CGG CCT GGC       105Glu Asp Phe Ala Arg Gly Ala Ala Ser Pro Gly Pro Ser Arg Pro Gly

          5                  10                  15CTG GTT CCC GTC AGC ATC ATC GGG GCT GAG GAT GAG GAT TTT GAG AAC       153Leu Val Pro Val Ser Ile Ile Gly Ala Glu Asp Glu Asp Phe Glu Asn

     20                  25                  30GAG CTG GAG ACA AAC TCA GAA GAG CAA AAC AGC CAG TTC CAG AGC CTG       201Glu Leu Glu Thr Asn Ser Glu Glu Gln Asn Ser Gln Phe Gln Ser Leu

 35                  40                  45GAG CAG GTG AAG CGG CGC CCA GCC CAC CTC ATG GCC CTC CTG CAG CAC       249Glu Gln Val Lys Arg Arg Pro Ala His Leu Met Ala Leu Leu Gln His50                  55                  60                  65GTG GCC CTG CAG TTT GAG CCA GGA CCC CTG CTT TGC TGT CTG CAT GCC       297Val Ala Leu Gln Phe Glu Pro Gly Pro Leu Leu Cys Cys Leu His Ala

             70                  75                  80GAC ATG CTG GGC TCA CTG GGC CCC AAG GAG GCC AAG AAG GCC TTC CTG       345Asp Met Leu Gly Ser Leu Gly Pro Lys Glu Ala Lys Lys Ala Phe Leu

         85                  90                  95GAC TTC TAC CAC AGC TTC CTG GAG AAG ACA GCG GTT CTC CGG GTG CCG       393Asp Phe Tyr His Ser Phe Leu Glu Lys Thr Ala Val Leu Arg Val Pro

    100                 105                 110GTC CCT CCC AAC GTC GCC TTT GAA CTT GAC CGC ACT AGG GCT GAC CTC       441Val Pro Pro Asn Val Ala Phe Glu Leu Asp Arg Thr Arg Ala Asp Leu

115                 120                 125ATC TCC GAG GAT GTC CAG CGG CGG TTC GTG CAG GAG GTG GTG CAA AGC       489Ile Ser Glu Asp Val Gln Arg Arg Phe Val Gln Glu Val Val Gln Ser130                 135                 140                 145CAG CAG GTA GCC GTG GGC CGG CAG CTG GAG GAC TTC CGT TCC AAG CGG       537Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Gln Leu Glu Asp Phe Arg Ser Lys Arg

            150                 155                 160CTC ATG GGC ATG ACG CCC TGG GAG CAG GAG CTG GCC CAG CTG GAG GCT       585Leu Met Gly Met Thr Pro Trp Glu Gln Glu Leu Ala Gln Leu Glu Ala

        165                 170                 175TGG GTT GGG CGG GAC CGA GCC AGC TAC GAG GCC CGG GAG CGG CAC GTG       633Trp Val Gly Arg Asp Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Glu Arg His Val

    180                 185                 190GCG GAG CGG CTG CTC ATG CAC CTG GAG GAG ATG CAA CAT ACC ATC TCT       681Ala Glu Arg Leu Leu Met His Leu Glu Glu Met Gln His Thr Ile Ser

195                 200                 205ACC GAC GAA GAA AAG AGT GCT GCC GTG GTC AAC GCC ATT GGG CTG TAC       729Thr Asp Glu Glu Lys Ser Ala Ala Val Val Asn Ala Ile Gly Leu Tyr210                 215                 220                 225ATG CGC CAC CTT GGG GTG CGG ACC AAG AGT GGA GAC AAG AAG TCG GGG       777Met Arg His Leu Gly Val Arg Thr Lys Ser Gly Asp Lys Lys Ser Gly

            230                 235                 240AGG AAC TTC TTC CGG AAA AAG GTG ATG GGG AAC CGG CGG TCG GAC GAC       825Arg Asn Phe Phe Arg Lys Lys Val Met Gly Asn Arg Arg Ser Asp Asp

        245                 250                 255CCT CCC AAG ACC AAG AAG GGG CTG AGC AGC ATC CTG GAT GCC GCC CGC       873Pro Pro Lys Thr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Ile Leu Asp Ala Ala Arg

    260                 265                 270TGG AAC CGG GGA GAG CCC CAG GTT CCA GAT TTT CGA CAC CTC AAA GCA       921Trp Asn Arg Gly Glu Pro Gln Val Pro Asp Phe Arg His Leu Lys Ala

275                 280                 285GAG GTT GAT GCC GAG AAG CCA GGT GCT ACA GAC CGG AAG GGA GGC GTG       969Glu Val Asp Ala Glu Lys Pro Gly Ala Thr Asp Arg Lys Gly Gly Val290                 295                 300                 305GGG ATG CCC TCT CGG GAC CGG AAT ATC GGG GCT CCT GGG CAG GAC ACC      1017Gly Met Pro Ser Arg Asp Arg Asn Ile Gly Ala Pro Gly Gln Asp Thr

            310                 315                 320CCT GGA GTC TCT CTG CAC CCT CTG TCC CTG GAC AGC CCA GAC CGG GAA      1065Pro Gly Val Ser Leu His Pro Leu Ser Leu Asp Ser Pro Asp Arg Glu

        325                 330                 335CCA GGT GCT GAC GCC CCC CTG GAG CTG GGG GAC TCA TCC CCG CAG GGC      1113Pro Gly Ala Asp Ala Pro Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ser Pro Gln Gly

    340                 345                 350CCA ATG AGC CTG GAG TCC TTG GCG CCC CCA GAG AGT ACC GAC GAG GGG      1161Pro Met Ser Leu Glu Ser Leu Ala Pro Pro Glu Ser Thr Asp Glu Gly

355                 360                 365GCC GAA ACC GAG AGC CCC GAG CCT GGA GAT GAG GGG GAG CCG GGG CGG      1209Ala Glu Thr Glu Ser Pro Glu Pro Gly Asp Glu Gly Glu Pro Gly Arg370                 375                 380                 385TCG GGA CTG GAG CTT GAA CCA GAA GAG CCT CCC GGC TGG CGG GAA CTC      1257Ser Gly Leu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Gly Trp Arg Glu Leu

            390                 395                 400GTC CCC CCA GAC ACC CTG CAC AGC CTG CCC AAG AGC CAG GTG AAG CGG      1305Val Pro Pro Asp Thr Leu His Ser Leu Pro Lys Ser Gln Val Lys Arg

        405                 410                 415CAG GAG GTC ATC AGC GAG CTG CTG GTG ACA GAG GCG GCC CAC GTG CGC      1353Gln Glu Val Ile Ser Glu Leu Leu Val Thr Glu Ala Ala His Val Arg

    420                 425                 430CTG TTC TTC CCC TTG GAG GAG CTG CAG AAC ATC TTC CCC AGC CTG GAC      1449Leu Phe Phe Pro Leu Glu Glu Leu Gln Asn Ile Phe Pro Ser Leu Asp450                 455                 460                 465GAG CTC ATC GAG GTG CAT TCC CTG TTC CTC GAT CGC CTG ATG AAG CGG      1497Glu Leu Ile Glu Val His Ser Leu Phe Leu Asp Arg Leu Met Lys Arg

            470                 475                 480AGG CAG GAG AGT GGC TAC CTC ATC GAG GAG ATC GGA GAC GTG CTG CTG      1545Arg Gln Glu Ser Gly Tyr Leu Ile Glu Glu Ile Gly Asp Val Leu Leu

        485                 490                 495GCC CGG TTT GAT GGT GCT GAG GGC TCC TGG TTC CAG AAA ATC TCC TCC      1593Ala Arg Phe Asp Gly Ala Glu Gly Ser Trp Phe Gln Lys Ile Ser Ser

    500                 505                 510CGC TTC TGC AGC CGC CAG TCA TTT GCC TTA GAG CAG CTC AAA GCC AAG      1641Arg Phe Cys Ser Arg Gln Ser Phe Ala Leu Glu Gln Leu Lys Ala Lys

515                 520                 525CAA CGC AAG GAC CCT CGG TTC TGT GCC TTC GTG CAG GAA GCT GAG AGC      1689Gln Arg Lys Asp Pro Arg Phe Cys Ala Phe Val Gln Glu Ala Glu Ser530                 535                 540                 545CGC CCG CGG TGC CGC CGC CTG CAG CTG AAG GAC ATG ATC CCC ACG GAG      1737Arg Pro Arg Cys Arg Arg Leu Gln Leu Lys Asp Met Ile Pro Thr Glu

            550                 555                 560ATG CAG CGG CTG ACC AAG TAC CCC CTG CTC CTG CAG AGC ATC GGG CAG       1785Met Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Gln Ser Ile Gly Gln

        565                 570                 575AAC ACA GAA GAG CCC ACA GAA CGG GAG AAA GTG GAG CTG GCA GCC GAG       1833Asn Thr Glu Glu Pro Thr Glu Arg Glu Lys Val Glu Leu Ala Ala Glu

    580                 585                 590TGC TGC CGG GAA ATT CTA CAC CAC GTC AAC CAA GCC GTG CGT GAC ATG       1881Cys Cys Arg Glu Ile Leu His His Val Asn Gln Ala Val Arg Asp Met

595                 600                 605GAG GAC CTG CTG AGG CTC AAG GAC TAT CAG CGG CGC CTG GAC TTG TCC       1929Glu Asp Leu Leu Arg Leu Lys Asp Tyr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Ser610                 615                 620                 625CAC CTT CGG CAG AGC AGC GAC CCT ATG CTG AGC GAG TTC AAG AAC CTG       1977His Leu Arg Gln Ser Ser Asp Pro Met Leu Ser Glu Phe Lys Asn Leu

            630                 635                 640GAC ATC ACC AAG AAG AAA TTG GTC CAC GAG GGC CCA CTG ACG TGG CGG       2025Asp Ile Thr Lys Lys Lys Leu Val His Glu Gly Pro Leu Thr Trp Arg

        645                 650                 655GTG ACT AAG GAC AAG GCA GTG GAG GTG CAT GTG CTG CTG CTG GAC GAC       2073Val Thr Lys Asp Lys Ala Val Glu Val His Val Leu Leu Leu Asp Asp

    660                 665                 670CTG CTG CTG CTG CTC CAG CGC CAG GAC GAG CGG CTG CTG CTC AAG TCC       2121Leu Leu Leu Leu Leu Gln Arg Gln Asp Glu Arg Leu Leu Leu Lys Ser

675                 680                 685CAT AGC CGG ACA CTG ACG CCC ACG CCC GAT GGC AAG ACC ATG CTG CGG       2169His Ser Arg Thr Leu Thr Pro Thr Pro Asp Gly Lys Thr Met Leu Arg690                 695                 700                 705CCC GTG CTG CGG CTC ACC TCC GCC ATG ACC CGC GAG GTG GCC ACC GAT       2217Pro Val Leu Arg Leu Thr Ser Ala Met Thr Arg Glu Val Ala Thr Asp

            710                 715                 720CAC AAA GCC TTC TAC GTC CTT TTT ACC TGG GAC CAG GAG GCC CAG ATA       2265His Lys Ala Phe Tyr Val Leu Phe Thr Trp Asp Gln Glu Ala Gln Ile

        725                 730                 735TAC GAG CTG GTG GCA CAG ACT GTG TCG GAG CGG AAA AAC TGG TGT GCT       2313Tyr Glu Leu Val Ala Gln Thr Val Ser Glu Arg Lys Asn Trp Cys Ala

    740                 745                 750CTC ATC ACT GAG ACT GCC GGA TCC CTG AAA GTC CCT GCC CCT GCC TCT       2361Leu Ile Thr Glu Thr Ala Gly Ser Leu Lys Val Pro Ala Pro Ala Ser

755                 760                 765CGC CCT AAG CCC CGG CCC AGG CCG AGC AGC ACC CGA GAA CCC CTC CTC       2409Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro Ser Ser Thr Arg Glu Pro Leu Leu770                 775                 780                 785AGC AGC TCT GAG AAC GGG AAT GGT GGC CGA GAG ACG TCT CCA GCT GAT       2457Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asn Gly Gly Arg Glu Thr Ser Pro Ala Asp

            790                 795                 800GCC CGG ACC GAG AGA ATC CTC AGT GAC CTC CTG CCC TTC TGC AGA CCA       2505Ala Arg Thr Glu Arg Ile Leu Ser Asp Leu Leu Pro Phe Cys Arg Pro

        805                 810                 815GGC CCC GAG GGC CAG CTC GCT GCC ACG GCC CTT CGG AAA GTG CTG TCC       2553Gly Pro Glu Gly Gln Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Lys Val Leu Ser

    820                 825                 830CTG AAG CAG CTT CTG TTT CCG GCG GAG GAA GAC AAT GGG GCG GGG CCT       2601Leu Lys Gln Leu Leu Phe Pro Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ala Gly Pro

835                 840                 845CCT CGA GAT GGG GAT GGG GTC CCA GGG GGC GGG CCC CTG AGC CCA GCA       2649Pro Arg Asp Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Pro Ala850                 855                 860                 865CGG ACC CAG GAA ATC CAG GAG AAC CTG CTC AGC TTG GAG GAG ACC ATG       2697Arg Thr Gln Glu Ile Gln Glu Asn Leu Leu Ser Leu Glu Glu Thr Met

            870                 875                 880AAG CAG CTG GAG GAG TTG GAG GAG GAA TTT TGC CGC CTG AGA CCC CTC       2745Lys Gln Leu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Phe Cys Arg Leu Arg Pro Leu

        885                 890                 895CTG TCT CAG CTT GGG GGG AAC TCT GTC CCC CAG CCT GGC TGC ACT           2790Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asn Ser Val Pro Gln Pro Gly Cys Thr

    900                 905                 910TGAGGTTCCC GCCCAGGAAG GCCTTTTGCA AGAAGGAGAG GAATGGGGGA GAGGACGTGA     2850GGGACCACCC CCACCCACAC AGCTGCCGCA GCATCTCACA CCCCGAGGGC CTGAGGAGAG     2910GGAGCTGTGG GCCACGCCTG GGAGGGGCCC AGCTGGGGTT ACTGCCCCCG CATGAGCCTC     2970GGCCATCTCT CCCTCCTGCC CTCTGCTTGG GGGACTCAGG GCTCCATTCT GGAGGGCACC     3030ACGGTGACCC GGGCCATCTC AGTATTGCCT GTGGGGGCCA CCCCTCCACC CCCACCCCCA     3090AGTGCCTTCG CTCTGTTTTT ATACCCTGAA TTGGAGGGTT TATTTTTTAA TATATATTAT     3150(2)SEQ ID NO:2的资料：

(ⅰ)序列特征：

    (A)长度：912个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白质

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:Met Glu Asp Phe Ala Arg Gly Ala Ala Ser Pro Gly Pro Ser Arg Pro1               5                  10                  15Gly Leu Val Pro Val Ser Ile Ile Gly Ala Glu Asp Glu Asp Phe Glu

         20                  25                  30Asn Glu Leu Glu Thr Asn Ser Glu Glu Gln Asn Ser Gln Phe Gln Ser

     35                  40                  45Leu Glu Gln Val Lys Arg Arg Pro Ala His Leu Met Ala Leu Leu Gln

 50                  55                  60His Val Ala Leu Gln Phe Glu Pro Gly Pro Leu Leu Cys Cys Leu His65                  70                  75                  80Ala Asp Met Leu Gly Ser Leu Gly Pro Lys Glu Ala Lys Lys Ala Phe

             85                  90                  95Leu Asp Phe Tyr His Ser Phe Leu Glu Lys Thr Ala Val Leu Arg Val

        100                 105                 110Pro Val Pro Pro Asn Val Ala Phe Glu Leu Asp Arg Thr Arg Ala Asp

    115                 120                 125Leu Ile Ser Glu Asp Val Gln Arg Arg Phe Val Gln Glu Val Val Gln

130                 135                 140Ser Gln Gln Val Ala Val Gly Arg Gln Leu Glu Asp Phe Arg Ser Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Met Gly Met Thr Pro Trp Glu Gln Glu Leu Ala Gln Leu Glu

            165                 170                 175Ala Trp Val Gly Arg Asp Arg Ala Ser Tyr Glu Ala Arg Glu Arg His

        180                 185                 190Val Ala Glu Arg Leu Leu Met His Leu Glu Glu Met Gln His Thr Ile

    195                 200                 205Ser Thr Asp Glu Glu Lys Ser Ala Ala Val Val Asn Ala Ile Gly Leu

210                 215                 220Tyr Met Arg His Leu Gly Val Arg Thr Lys Ser Gly Asp Lys Lys Ser225                 230                 235                 240Gly Arg Asn Phe Phe Arg Lys Lys Val Met Gly Asn Arg Arg Ser Asp

            245                 250                 255Asp Pro Pro Lys Thr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Ile Leu Asp Ala Ala

        260                 265                 270Arg Trp Asn Arg Gly Glu Pro Gln Val Pro Asp Phe Arg His Leu Lys

    275                 280                 285Ala Glu Val Asp Ala Glu Lys Pro Gly Ala Thr Asp Arg Lys Gly Gly

290                 295                 300Val Gly Met Pro Ser Arg Asp Arg Asn Ile Gly Ala Pro Gly Gln Asp305                 310                 315                 320Thr Pro Gly Val Ser Leu His Pro Leu Ser Leu Asp Ser Pro Asp Arg

            325                 330                 335Glu Pro Gly Ala Asp Ala Pro Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ser Pro Gln

        340                 345                 350Gly Pro Met Ser Leu Glu Ser Leu Ala Pro Pro Glu Ser Thr Asp Glu

    355                 360                 365Gly Ala Glu Thr Glu Ser Pro Glu Pro Gly Asp Glu Gly Glu Pro Gly

370                 375                 380Arg Ser Gly Leu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Pro Pro Gly Trp Arg Glu385                 390                 395                 400Leu Val Pro Pro Asp Thr Leu His Ser Leu Pro Lys Ser Gln Val Lys

            405                 410                 415Arg Gln Glu Val Ile Ser Glu Leu Leu Val Thr Glu Ala Ala His Val

        420                 425                 430Arg Met Leu Arg Val Leu His Asp Leu Phe Phe Gln Pro Met Ala Glu

    435                 440                 445Cys Leu Phe Phe Pro Leu Glu Glu Leu Gln Asn Ile Phe Pro Ser Leu

450                 455                 460Asp Glu Leu Ile Glu Val His Ser Leu Phe Leu Asp Arg Leu Met Lys465                 470                 475                 480Arg Arg Gln Glu Ser Gly Tyr Leu Ile Glu Glu Ile Gly Asp Val Leu

            485                 490                 495Leu Ala Arg Phe Asp Gly Ala Glu Gly Ser Trp Phe Gln Lys Ile Ser

        500                 505                 510Ser Arg Phe Cys Ser Arg Gln Ser Phe Ala Leu Glu Gln Leu Lys Ala

    515                 520                 525Lys Gln Arg Lys Asp Pro Arg Phe Cys Ala Phe Val Gln Glu Ala Glu

530                 535                 540Ser Arg Pro Arg Cys Arg Arg Leu Gln Leu Lys Asp Met Ile Pro Thr545                 550                 555                 560Glu Met Gln Arg Leu Thr Lys Tyr Pro Leu Leu Leu Gln Ser Ile Gly

            565                 570                 575Gln Asn Thr Glu Glu Pro Thr Glu Arg Glu Lys Val Glu Leu Ala Ala

        580                 585                 590Glu Cys Cys Arg Glu Ile Leu His His Val Asn Gln Ala Val Arg Asp

    595                 600                 605Met Glu Asp Leu Leu Arg Leu Lys Asp Tyr Gln Arg Arg Leu Asp Leu

610                 615                 620Ser His Leu Arg Gln Ser Ser Asp Pro Met Leu Ser Glu Phe Lys Asn625                 630                 635                 640Leu Asp Ile Thr Lys Lys Lys Leu Val His Glu Gly Pro Leu Thr Trp

            645                 650                 655Arg Val Thr Lys Asp Lys Ala Val Glu Val His Val Leu Leu Leu Asp

        660                 665                 670Asp Leu Leu Leu Leu Leu Gln Arg Gln Asp Glu Arg Leu Leu Leu Lys

    675                 680                 685Ser His Ser Arg Thr Leu Thr Pro Thr Pro Asp Gly Lys Thr Met Leu

690                 695                 700Arg Pro Val Leu Arg Leu Thr Ser Ala Met Thr Arg Glu Val Ala Thr705                 710                 715                 720Asp His Lys Ala Phe Tyr Val Leu Phe Thr Trp Asp Gln Glu Ala Gln

            725                 730                 735Ile Tyr Glu Leu Val Ala Gln Thr Val Ser Glu Arg Lys Asn Trp Cys

        740                 745                 750Ala Leu Ile Thr Glu Thr Ala Gly Ser Leu Lys Val Pro Ala Pro Ala

    755                 760                 765Ser Arg Pro Lys Pro Arg Pro Arg Pro Ser Ser Thr Arg Glu Pro Leu

770                 775                 780Leu Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asn Gly Gly Arg Glu Thr Ser Pro Ala785                 790                 795                 800Asp Ala Arg Thr Glu Arg Ile Leu Ser Asp Leu Leu Pro Phe Cys Arg

            805                 810                 815Pro Gly Pro Glu Gly Gln Leu Ala Ala Thr Ala Leu Arg Lys Val Leu

        820                 825                 830Ser Leu Lys Gln Leu Leu Phe Pro Ala Glu Glu Asp Asn Gly Ala Gly

    835                 840                 845Pro Pro Arg Asp Gly Asp Gly Val Pro Gly Gly Gly Pro Leu Ser Pro

850                 855                 860Ala Arg Thr Gln Glu Ile Gln Glu Asn Leu Leu Ser Leu Glu Glu Thr865                 870                 875                 880Met Lys Gln Leu Glu Glu Leu Glu Glu Glu Phe Cys Arg Leu Arg Pro

            885                 890                 895Leu Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asn Ser Val Pro Gln Pro Gly Cys Thr

        900                 905                 910

Claims (55)

1．分离的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段。

2．权利要求1的分离的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，其中所述多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性，对鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho具有特殊的结合亲和力，或具有细胞癌基因转化活性。

3．权利要求1的分离的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段来源于人。

4．权利要求1的分离的p115Rho-GEF含有图1所示的氨基酸1至氨基酸912。

5．权利要求1的p115Rho-GEF的分离的生物活性片段，所述片段含有图1的氨基酸序列。

6．权利要求1的分离的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段是基本上纯化的。

7．含有编码p115Rho-GEF多肽之核苷酸序列的分离的核酸。

8．权利要求7的分离的核酸，其中所述编码的多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性，对鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho具有特殊的结合亲和力，或具有细胞癌基因转化活性。

9．权利要求7的分离的核酸来源于人。

10．权利要求7的分离的核酸，其中核酸序列编码图1所示的氨基酸1至氨基酸912。

11．权利要求7的分离的核酸，其中核苷酸序列与表达控制序列有效相连。

12．权利要求7的分离的核酸，其中核酸含有天然核苷酸序列。

13．权利要求7的分离的核酸，其中核酸不间断地编码所述多肽。

14．权利要求7的分离的核酸，其中核酸是DNA或RNA。

15．权利要求7的分离的核酸，其中核酸进一步含有可测的标记物。

16．权利要求7的分离的核酸，除了一个或多个氨基酸位置被取代或缺失，或既取代又缺失外，由核酸编码的多肽是有生物活性的。

17．权利要求16的分离的核酸，其中生物活性是鸟嘌呤核苷酸交换活性，对鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊结合亲和力，或细胞癌基因转化活性。

18．权利要求16的分离的核酸，其中一个或多个被取代的氨基酸位置被保守的氨基酸取代。

19．权利要求16的分离的核酸，其中一个或多个被取代的氨基酸位置位于Dbl同源性区域或血小板-白细胞C激酶底物同源性区域。

20．分离的核酸，所述核酸含有在严紧条件下其或其核酸互补物能与图1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

21．权利要求20的分离的核酸，所述核酸含有与图1所示核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列。

22．权利要求20的分离的核酸，其中所述核酸编码的多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性，对鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊结合亲和力，或细胞癌基因转化活性。

23．分离的核酸，所述核酸含有p115Rho-GEF独特的核苷酸序列。

24．分离的核酸，所述核酸含有在严紧条件下其或其核酸互补物能与权利要求23独特的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

25．权利要求24的分离的核酸，其编码的多肽具有鸟嘌呤核苷酸交换活性，对鸟嘌呤核苷酸缺失的Rho的特殊结合亲和力，或细胞癌基因转化活性。

26．在被转化的宿主细胞中表达由核酸编码的p115Rho-GEF多肽的方法，所述方法包括在能有效表达多肽的条件下培养含有权利要求7之核酸的经转化的宿主细胞。

27．在被转化的宿主细胞中表达由核酸编码的多肽的方法，所述方法包括在能有效表达多肽的条件下培养含有权利要求20之核酸的经转化的宿主细胞。

28．权利要求26的方法，另外包括分离多肽。

29．权利要求26的方法，另外包括调节多肽的表达。

30．由权利要求26的方法产生的分离的多肽。

31．由权利要求27的方法产生的分离的多肽。

32．含有权利要求7的核酸的经转化的宿主细胞。

33．含有权利要求20的核酸的经转化的宿主细胞。

34．含有权利要求7的核酸的载体。

35．含有权利要求20的核酸的载体。

36．调节Rho多肽活性的方法，所述方法包括施用有效量的p115Rho-GEF多肽或其生物活性片段，或有效量的能调节p115Rho-GEF活性的化合物。

37．权利要求36的方法，其中p115Rho-GEF或其生物活性片段含有对鸟嘌呤核苷酸缺失状态的所述Rho具有特殊结合活性的氨基酸序列。

38．调节Rho多肽活性的方法，所述方法包括在所述核酸能在所述细胞中以有效量被表达以调节Rho的所述活性的条件下，将权利要求21的核酸导入所述细胞。

39．权利要求38的方法，其中所述核酸致癌转化所述细胞。

40．分离与鸟嘌呤核苷酸缺失状态的Rho多肽结合的分子的方法，所述方法包括：

在所述分子能与所述Rho多肽有效结合的条件下，将Rho多肽与含有所述分子的介质接触；和

从所述介质中分离结合有所述分子的所述Rho多肽。

41．权利要求40的方法，其中所述分子是p115Rho-GEF。

42．权利要求40的方法，其中所述分子的分子量约为130kDa。

43．权利要求40的方法，另外包括将所述分子与所述Rho多肽分开。

44．调节GTP酶活性的方法，所述方法包括：

施用有效量的鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段，或有效量的能调节鸟嘌呤核苷酸交换因子活性的化合物。

45．权利要求44的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子或其生物活性片段含有对鸟嘌呤核苷酸缺失状态的所述GTP酶具有特殊结合活性的氨基酸序列。

46．检测调节鸟嘌呤核苷酸交换因子之鸟嘌呤核苷酸交换活性之试剂的方法，所述方法包括：

将(a)含有鸟嘌呤核苷酸交换因子的多肽或其生物活性片段，和(b)可与交换因子结合的，含有GTP酶的多肽或其生物活性片段的混合物与试剂接触；和

检测鸟嘌呤核苷酸交换活性的存在或数量。

47．权利要求46的方法，其中GTP酶是RhoA。

48．权利要求46的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子是p115-RhoGEF。

49．权利要求46的分离的产物。

50．检测调节鸟嘌呤核苷酸交换因子和GTP酶之间的结合的试剂的方法，所述方法包括：

将(a)含有鸟嘌呤核苷酸交换因子的多肽或其生物活性片段，和(b)可与交换因子结合的，含有GTP酶的多肽或其生物活性片段的混合物与试剂接触；和

检测鸟嘌呤核苷酸交换因子多肽或其生物活性片段和GTP酶之间的结合的存在或数量。

51．权利要求50的方法，其中GTP酶是RhoA。

52．权利要求50的方法，其中鸟嘌呤核苷酸交换因子是p115-RhoGEF。

53．权利要求50的分离的产物。

54．特异于p115-RhoGEF的分离的抗体。

55．权利要求54的分离的抗体，所述抗体与图1所示氨基酸1至氨基酸912的氨基酸序列结合。