CN1254377A

CN1254377A - 哺乳动物chk1效应物细胞周期关卡蛋白激酶材料与方法

Info

Publication number: CN1254377A
Application number: CN 98801676
Authority: CN
Inventors: A·M·卡尔
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-09-05
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2000-05-24
Also published as: GB9718952D0; WO1999011795A1; EP0960203A1; AU9223198A; CA2270911A1; GB9723231D0; JP2002516577A

Abstract

本发明总的是关于编码对于减数分裂、有丝分裂、和细胞内DNA损伤反应所必需的细胞周期关卡激酶有关的蛋白的基因及各个蛋白。这些激酶在DNA损伤后阻滞细胞周期以使DNA在有丝分裂、减数分裂或DNA复制起始前进行修复。更具体而言,本发明提供了一种新的周期关卡激酶,Chkl,及编码Chkl的多核苷酸序列。还公开了鉴定Chkl调节剂的方法。调节剂在,譬如,化疗与放射治疗中是有用的。

Description

哺乳动物CHK1效应物细胞周期关卡蛋白激酶材料与方法

发明领域

本发明总的是关于周期关卡蛋白激酶，它们对于细胞DNA损伤反应及协调细胞周期阻滞是不可缺少的。关卡激酶在对DNA损伤的监视和反应中发挥作用，这种DNA损伤可因复制错误、DNA错配、辐射处理或化疗而引起。这些关卡激酶在DNA损伤后导向细胞周期阻滞及凋亡的调节途径中是必需的，给细胞一种信号和时间使之在DNA复制起始前或染色体分离前纠正损伤。更具体而言，本发明是关于新的哺乳动物效应物(Chk1)关卡蛋白激酶、编码该酶的寡核苷酸以及测定和调节激酶活性的方法与材料。

背景

细胞周期的基本过程和调节方式在所有真核生物种属间在结构上和功能上是保守的。真核细胞生长和分裂的过程是体细胞(有丝分裂)细胞周期，由4个期构成，即G1期、S期、G2期和M期。M1，S与G2期统称为细胞周期的间期。在G1(gap，间隙)期，细胞进程的生物合成活性处于高速率。S(synthesis，合成)期开始于DNA合成起始之时，而结束于细胞核的DNA含量已得到复制并形成了两套相同的染色体时。然后细胞进入G2(gap，间隙)期，持续直到有丝分裂开始。有丝分裂中，染色体配对、分离、形成两个新核，在胞质分裂中细胞本身分裂成两个子细胞，每个子细胞得到一个核，含有两套染色体中的一套。有丝分裂(细胞周期的M期)之后紧接着发生胞质分裂。胞质分裂结束M期并标志着下一细胞周期的间期的开始。细胞周期中发生事件的顺序受到严格的调节，以使一个细胞周期事件的起始依赖于前一细胞周期事件的完成。这使得一代代体细胞的遗传物质的复制和分离是忠实的。

减数分裂是在高等真核生物中产生生殖细胞的细胞分裂形式。有丝分裂时产生遗传学上相同的细胞，含有每种染色体两个，与之相反，减数分裂所产生的细胞只含有每种染色体的一个拷贝。而且，在减数分裂中同源染色体配对并交换遗传物质。减数分裂由两个期的细胞分裂组成，I与II。在减数分裂I期，母本和父本染色体复制，同源染色体配对在一起(联会)。然后细胞进行分裂，同源成对的两个染色体分离并进入各个细胞，生成两个双倍体的子细胞。子细胞进入减数分裂II期。在II期，染色体不再复制而排列，姊妹染色单体尤如在有丝分裂中那样分离，生成单倍体细胞。在减数分裂I及II中事件的顺序均为间期，前期，中期，后期及末期。

减数分裂I的第一阶段是间期I，此时每个染色体进行复制。复制染色体的两个拷贝称作姊妹染色单体。第一个减数分裂前期可分为连续的5期。在细线期，新复制的姊妹染色单体靠近地并列，使之可以联结并进行重组。在偶线期，在母本姊妹染色单体与父本姊妹染色单体之间形成一种叫联会复合体的蛋白结构，构成二价体(4个染色单体)。在粗线期，两个姊妹染色单体间开始重组(即在母本与父本染色体之间进行遗传物质的交换)。下一期，双线期，的特征是蛋白轴分解，两个姊妹染色单体开始分离。终变期，即最后一期的特征是染色体与核包膜分离，可以清楚地看到每一个二价体含有四个分离的染色单体，每对姊妹染色单体在其着丝粒上相联系。这样，在减数分裂的早期，姊妹染色单体配对，并在某些区域进行交互重组。程序DNA链断裂使重组起始。[Cao et al.，Cell，88：375-384(1997)]。在第一个减数分裂前期所观察到的变化有助于遗传重配、保证遗传活力。

在发生DNA损伤时监测基因组的完整性并阻止细胞周期进行的过程被描述为“细胞周期关卡”[Hartwell and Weinert，Science，246：629-634(1989)；Weinert et al.，Genes and Dev.，8：652(1994)]。细胞周期关卡由信号传导级联系统组成，后者将DNA损伤监测与细胞周期进程相偶联。减数分裂中细胞周期关卡控制程序的DNA断裂，保证一套完整的单倍体染色体很好地分离到每个配子中去。

细胞周期关卡的障碍使个体具有以下疾病倾向或直接引起多种疾病状态，如癌、毛细血管扩张性共济失调症、胚胎异常及各种伴有B和T细胞发育异常的免疫缺陷。后者还伴有一些病理状态，如狼疮、关节炎及自身免疫疾病。因此，对鉴定细胞周期关卡及其功能所必需的蛋白进行了热烈的研究。

文献报导，细胞周期关卡包括至少三种不同种类的多肽，它们对细胞周期信号或染色体机制的缺陷起响应而连续地发挥作用。[Carr A.M.，Science，271：314-315(1996)]。第一类是测出或感知DNA损伤或细胞周期异常的蛋白家族。这些传感器包括Atm与Atr[Keegan et al；Genes andDevel.，10：2423-2437(1996)]。第二类多肽将检测器测知的信号扩大并传递，可以Rad53为例[Alen et al.(1994)Genes Dev.8：2416-2488]。最后，细胞周期关卡引起细胞反应，如通过细胞周期效应物的有丝分裂/减数分裂阻滞，凋亡。

通过对酵母粟酒裂殖酵母及酿酒酵母的遗传学分析鉴定了若干种对电离辐射下有丝分裂阻滞和DNA修复反应很重要的关卡基因。综述见Carr与Hoekstra，Trends in Cell Biology，5：32-40(1995)。在酵母中得到鉴定的一个这种基因对于能引起G2阻滞的DNA损伤关卡以及对一个有关监测DNA合成的完成并实行S期阻滞的关卡是必需的。此基因在粟酒裂殖酵母中命名为rad3[Seaton et al.，Gene，119：83-89(1992)Bentley et al.，(1996)EMBO J.15：6641-6651]，在酿酒酵母中为MEC1/ESR1[Kato and Ogawa，Nuc.Acids.Res.，22(15)：3104-3112(1994)]，不过在下文都归入rad3。具有rad3突变的细胞不能对DNA损伤感知或适当地反应，以后在暴露于致畸变因子或事件时(如，电离辐射，DNA损伤剂及影响染色体完整性的突变)比野生型细胞更快地失去活力。参见Weinert et al.，Genes&Development，8：652-665(1994)及Al-Khodairy et al.，EMBO J.，11(4)：1343-1350(1992)。这样Rad3显示出是DNA损伤的一种关卡探测器(Carr，1996)。此外，rad3还显示出在活体内作为多聚体起作用。[Bentley et al.，1996]。

rad3基因产物是一种约为270 kD的蛋白，是正在增长的高分子量哺乳动物关卡激酶家族的成员。见Hunter，Cell，83：1-4(1995)中关于此激酶家族的讨论。这个家族包括ecll(酿酒酵母)mei-41(黑腹果蝇)，torl(酿酒酵母)，tor2(酿酒酵母)，Frap(人)，tell(酿酒酵母)，DNA-Pk(人)Atr(人)及Atm(人)。基于序列同源性和互补研究这些蛋白被鉴定为一个家族的成员。

rad3的人同源物，Atr(共济失调毛细血管扩张症及rad3有关的)是由Bently等鉴定的，EMBO J.，15：6641-6651(1996)。Bently等指出，重组Atr在粟酒裂殖酵母中表达时能与rad3发生异源多聚化。此外，重组Atr的表达能使酿酒酵母mec1突变株得到互补。

这个激酶家族成员的催化域的一级结构与已鉴定清楚的磷脂酰肌醇激酶关系密切。这种结构关系起初曾提示：这些哺乳动物关卡激酶可能能使脂质磷酸化。然而，当检查哺乳动物关卡激酶的底物特异性时，这些酶似乎起蛋白激酶的作用，其使磷脂酰肌醇磷酸化的作用还需证实。

Atm(Ataxia Telangiectasia Mutated)是此家族的另一个成员，通过分析人的毛细血管扩张性共济失调(AT)综合征得到鉴定[Savitsky etal.，Science，268：1749-1753(1995)Savitsky et al.，Human MolecularGenetics，4(11)：2025-2032(1995)]。AT患者表现多种多样的临床症状，包括多种肿瘤倾向。AT患者的成纤维细胞对辐射敏感，在电离辐射处理后不能发生有丝分裂阻滞。缺乏Atm的突变小鼠表现生殖腺萎缩，减数分裂异常及重度染色体断裂[Ashley et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，93：13084(1996)]。这使人想起rad3缺陷的粟酒裂殖酵母株，这种细胞不能感知DNA损伤并作出适当的反应。

因此这个激酶家族似乎对各种细胞周期转换缺陷起检测器的作用[Carr，1996]。

近来表明哺乳动物Atm和Atr蛋白在减数分裂前期的粗线期与染色体结合，并可能监测在减数分裂染色体联会和重组中发生的链破裂。Atm与Atr激酶的定位显示在偶线期和粗线期位点的互补形式，相应于在监测减数分裂重组时的DNA结构中的不同作用[Keegan et al.，GenesDev.，10：2423(1996)]。

关卡蛋白显然在信号传导级联系统中起作用。检测器Atm和Atr是蛋白激酶，组成信号传导级联系统中的早期步骤。现认为信号被Rad53这样的蛋白激酶放大，Rad53能将信号从检测器传导给效应物。

迄今，p53和粟酒裂殖酵母Chk1与wee1被鉴定为效应物关卡蛋白。

粟酒裂殖酵母Chk1基因已得到分离，是基于其与cdc2.r4等位基因的遗传学相互作用[Al-Khodairy et at.，Mol.Biol.Cell.，5：147-160(1994)]以及对rad27突变株辐射敏感性的互补。cdc2编码一种蛋白激酶亚单位，后者与细胞周期蛋白结合，形成活性蛋白激酶复合物，能诱导经有丝分裂的传代。[Broek at al.Nature，349：388-393(1991)]。粟酒裂殖酵母Chk1看来是在DNA损伤后引起有丝分裂阻滞，而粟酒裂殖酵母Chk1缺失的突变株在照射后不能实行细胞周期阻滞[Walworth etal.，Nature，363：368(1993)，Al-Khodairy et al.，Mol.Biol.Cell.，5：147-160(1994)，Carr，A.M.，Semin.Cell Bid.，6：65-72(1995)]。然而，对于其它关卡蛋白介导的阻断DNA复制的DNA细胞反应，Chk1是不需要的。Walworth与Berards在Science，271：353-356(1996)中阐明，在活体内Chk1的活力受Chk1磷酸化的调节。通过检查具有关卡基因突变的各种粟酒裂殖酵母株的Chk1的磷酸化状况，Walworth与Bernards于Science，271：353-356(1996)中指出，Chk1作用于这些关卡蛋白的下游。在粟酒裂殖酵母rad1，rad3，rad9，rad17及rad26突变株中Chk1的磷酸化消失或大大减少。

此外，粟酒裂殖酵母Chk1看来在有丝分裂的G1和G2期发挥作用。Carr等在Curr.Biol.，5：1179-1190(1995)中表明，Chk1缺陷细胞不能进入S期，说明Chk1是一种G1关卡激酶。O′Connell等在EMBOJournal，16：545-554(1997)还表明，Chk1使weel磷酸化，后者是G2细胞周期阻滞中的一种关卡激酶。

在Sibon et al.，Nature，388：93-97(1997)一文中，粟酒裂殖酵母Chk1的果蝇同源物被鉴定为“Grp”。在中-囊胚转换(MBT)的细胞周期调控中需要Grp，在该转换中DNA复制机器的母本组分使DNA合成减慢，并诱导在胚胎发育细胞周期进程一种关卡依赖的迟延。

Chk1的C.elegans同源物首次报告为一EST，Genbank登录号为U44902。Chk1的酿酒酵母同源物已鉴定可能为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Genbank登录号为585344。

迄今，尚未鉴定出哺乳动物效应物关卡(Chk1)蛋白激酶。因此，需要建立一种鉴定参与细胞周期关卡的哺乳动物效应物蛋白的技术，以发展对具有细胞周期关卡缺陷的人类疾病状态的治疗，还需要分离编码此类蛋白的多核苷酸，这类蛋白本身可能用作治疗药物，或者能发展有治疗作用的多核苷酸编码蛋白的调节剂。

发明概述

本发明提供新的人哺乳动物效应物细胞周期关卡，Chk1，激酶及编码该激酶的多核苷酸。

本发明一方面提供纯化分离的编码人和小鼠效应物细胞周期关卡激酶的多核苷酸(如，DNAs和RNAs，其编码链和非编码链)，以及编码其它哺乳动物关卡激酶的多核苷酸，与编码人Chk1激酶域(SEQID NO.：2中氨基酸14～264)的多核苷酸区域有50％或更高的氨基酸同一性。优选地，多核苷酸编码一种关卡激酶，与SEQ ID NO.：2的氨基酸14～264有70％或更高的氨基酸同一性，更为优选地，多核苷酸编码一种关卡激酶，显示与SEQ ID NO.：2的氨基酸14-264有90％或更高的氨基酸同一性。本发明所计划的多核苷酸包括基因组DNAs，RNAs，cDNAs以及整个或部分地化学合成的DNAs。本发明优选的多核苷酸包括SEQ ID NO.：1的人Chk1 DNA序列，SEQ ID NO.：3的小鼠Chk1 DNA序列，以及在严格条件下与非编码链杂交的DNA序列，或惟不与遗传密码丰余部分杂交的序列。典型的严格杂交条件如下：于65℃，3×SSC，20mM NaPO₄ pH6.8中杂交，65℃，0.2×SSC漂洗。技术熟练者懂得，根据待杂交序列的长度和GC核苷酸碱基成分上述条件可发生变动。为确定准确的杂交条件技术的方案标准是适用的。见Sambrook et al.，9.47-9.51 Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。编码人Chk1的一种多核苷酸载体(质粒pGEMT-Chk1hu)已于1997年8月27日保藏于American Type Cultrue Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，登记号No.ATCC 98520。

本发明提供的DNA序列信息使得用熟知的如上描述的DNA/DNA杂交及多聚酶链反应(PCR)克隆技术来鉴定和分离编码哺乳动物关卡有关分子的DNAs成为可能。作为一组例子，本发明关于编码一种哺乳动物Chk1的cDNA序列的知识使人们可以用DNA/DNA杂交技术分离编码激酶的基因组DNA序列及表达调控序列如启动子，操纵子等。与之相似，一种部分cDNA序列的知识使分离完整的cDNA成为可能。与本发明的DNA序列在严格条件下进行DNA/DNA杂交的方法同样也可期望得以分离DNAs，能编码与哺乳动物Chk1激酶同源的非人类激酶的等位基因变体以及其它结构上关联的蛋白，它们共有一种或多种酶活力，或有与哺乳动物Chk1所参加的细胞周期关卡途径中的成员或调节因子相互作用的能力。本发明的带有可检测的标记的多核苷酸对于在杂交测定中检测哺乳动物细胞合成本发明激酶的能力也是有用的。本发明提供的DNA序列信息也可借同源重组或“敲除”策略[见Capecchi，Science，244：1288-1292(1989)]，使开发不能表达功能性激酶或表达其变异体的啮齿动物成为可能。此类啮齿动物及其细胞对研究活体内小鼠及激酶调节剂的活性是有用的模型。本发明的多核苷酸也可以作为用于鉴定疾病状态下哺乳动物Chk1基因座的遗传学变化的诊断方法的基础。用本发明还可获得一些反义多核苷酸，它们是与通常表达Chk1细胞的Chk1表达调控有关联的。

例如，由Chk1 cDNA设计的引物可用于逆转录酶PCR分析，分析肿瘤细胞的mRNA样品以检测是否有Chk1 mRNA的存在。而且，Chk1基因组克隆的序列信息可用于从肿瘤细胞制备的基因组DNA的单链构象多态性(SSCP)分析以检测Chk1基因的变化或突变。同样，Chk1cDNA和/或Chk1基因组克隆能用于荧光原位杂交(FISH)分析以检测Chk1基因的变化。

本发明也提供自主复制重组子构建物，如结合有本发明多核苷酸的质粒和病毒DNA载体，特别是将多核苷酸有功能地与一内源的或异源的表达控制DNA序列及一转录终止子相连接的载体。

本发明的另一方面，宿主细胞，特别是单细胞的原核和真核宿主细胞，能以本发明DNAs稳定转化或转染，并在其中表达哺乳动物Chk1激酶。本发明的宿主细胞对大规模地生产Chk1的方法特别有用，在该法中细胞生长于适当的培养基中，欲得的酶从细胞或细胞生长的培养基中分离出来。

本发明包括含有SEQ ID NO.：2或SEQ ID NO.：4中部分或全部氨基酸序列的Chk1产品。使用哺乳动物宿主细胞以期提供翻译后修饰(如，豆蔻酰化，糖基化，截短，脂化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，这对本发明的重组子表达产品的最佳生物活性可能是必需的。本发明的酶产品可以是全长多肽、片段或变异体。变异体包括以下Chk1产品，其中一个或更多的特定(即自然编码的)氨基酸缺失了或被替代了，或其中增加了一个或更多的非特定氨基酸：(1)不失去Chk1特异的蛋白激酶活力；或(2)丧失Chk1特异的蛋白激酶活力；或(3)丧失与细胞周期关卡途径中成员或调节剂互相作用的能力。Chk1的底物及与Chk1相互作用的蛋白可用各种测定方法鉴定。

Chk1底物可在激酶活力测定中加入试验化合物来鉴定。Chk1激酶重悬浮于激酶缓冲液中，在有或无试验化合物(如髓鞘碱性蛋白，酪蛋白，组蛋白H1或适宜的底物肽)的条件下温育。被激酶转移给试验化合物的磷酸盐的量用放射自显影或闪烁计数测量。磷酸盐向试验化合物的转移指示该试验化合物是激酶的一种底物。

本发明的另一方面提供一种在生物样品中检测和定量Chk1的诊断方法。一种疑有Chk1的生物样品用于激酶测定。如此所述，Chk1的存在用底物蛋白，如髓鞘碱性蛋白，的磷酸化，或检测自身磷酸化产物来鉴定。激酶反应的磷酸化产物可用，例如，放射自显影或闪烁计数来测定。

相互作用蛋白可用以下测定法鉴定。

本发明设计的第一种测定法是双杂合筛选。双杂合系统是在酵母中研制的[Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991)]，基于在体内对激活报道基因的转录因子进行功能性重建。特别是，一种编码与Chk1相互作用蛋白的多核苷酸借以下步骤得到分离：用一种DNA构建物，其包括一个在启动子控制下、受具有一个DNA结合域和一个激活域的转录因子调节的报导基因，转化或转染适当的宿主细胞；在宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，该序列编码部分或全部Chk1和转录因子的DNA结合域或激活域的第一融合体；在宿主细胞中表达第二杂合DNA序列文库，该序列编码部分或全部推定Chk1结合蛋白和未结合在第一融合体中的转录因子DNA结合域或激活域的第二融合体；在一特定宿主细胞中借检测报道基因产物在宿主细胞中的生成来检测Chk1相互作用蛋白与Chk1的结合；以及从特定宿主细胞中分离编码相互作用蛋白的第二杂合DNA序列。当前优选用于测定的是lexA启动子以驱动报道基因，lacZ报道基因，包括lexADNA结合域和GAL4反式激活域的转录因子，以及酵母宿主细胞。

鉴定Chk1相互作用蛋白的其它测定法包括：固定Chk1或测试蛋白，可检测地标记非固定的结合蛋白，将结合配对体在一起保温以及测定被结合的标记量。被结合的标记表示测试蛋白与Chk1相互作用。

鉴定Chk1相互作用蛋白的另一类测定包括：将Chk1或其片段固定在涂有(或浸透)荧光剂的固体支持物上，用能激发荧光剂的化合物标记测试蛋白，使固化Chk1与标记测试蛋白接触，检测荧光剂的光发射，以及鉴定能使荧光剂发生光发射的测试蛋白为相互作用蛋白。或者，可以在测定中固化推定的相互作用蛋白，而标记Chk1。

本发明还包含抗体产品(如，单克隆和多克隆抗体，单链抗体，嵌合抗体，CDR-移植抗体及其抗原结合片段)和对本发明Chk1激酶特异的其它结合蛋白(如在上文测定中所鉴定的)。用分离的天然或重组酶可以开发结合蛋白。结合蛋白，反过来，对纯化重组和天然存在的酶以及鉴定生成这种酶的细胞是很有用的。对细胞或液体中蛋白的检测方法可包括在一个“三明治”测定形式中用单一抗体物质或多抗体物质对Chk1蛋白水平作出细胞学分析。结合蛋白对调节(即，封闭，抑制，或刺激)酶/底物或酶/调节剂的相互作用也是明显有用的。也包括对哺乳动物关卡激酶结合蛋白特异的抗-独特型抗体。

进一步包括使抗Chk1抗体能用于Atm功能诊断。因为AT患者的Chk1蛋白水平低或缺如，Chk1水平在开发抑制Atm功能的化合物中可用作一种标志。因为AT细胞中Chk1的表达低或不存在，Atm功能抑制会使Chk1表达减少。这种减少可通过检查Chk1表达水平来监视。

本发明预期Chk1基因上引起Chk1基因产物正常功能丧失的突变是累及细胞周期关卡障碍的人类疾病的基础。旨在恢复Chk1活性的基因疗法可用于治疗这些疾病(例如，睾丸癌)。将功能性的Chk1基因给予适当的细胞可借在体内或来自体内使用病毒载体(如腺病毒，腺相关病毒，或逆病毒)实现，或来自体内使用物理的DNA转移方法(如，脂质体或化学处理)实现。关于基因治疗技术综述，见Friedmann，Science，244：1275-1281(1989)；Verma，Scientific American：68-84(1990)；及Miller，Natrue，357：455-460(1992)。或者，预期在其它种类人类疾病中，阻止Chk1的表达或抑制其活力会对治疗有用。预期，反义治疗或基因治疗可应用于Chk1表达的负调控。能与Chk1表达调控序列或Chk1RNA特异结合的反义核酸(优选10～20碱基对的寡核苷酸)被导入细胞(如，经由病毒载体或如脂质体的胶体分散系统)。反义核酸与细胞内Chk1靶序列结合，阻止靶序列的转录或翻译。本发明专门设计了反义寡核苷酸的硫代磷酸盐和甲基磷酸盐用于治疗。反义寡核苷酸还可进一步在5′末端用聚-L-赖氨酸，运铁蛋白聚赖氨酸，或胆固醇组成成分修饰。

关卡信号传导引起转录调控。转录调控的一个例子是MyoD肌调控。Chk1表达抑制MyoD诱导肌基因转录的能力，并抑制MyoD诱导肌细胞生成的能力(见例7)。本发明的另一方面包括调节Chk1水平以影响干细胞的分化与增殖，如同在肌细胞增殖中那样。

调节Chk1蛋白激酶活力的介质可用以下方法鉴定：将测试化合物与从天然表达哺乳动物关卡蛋白激酶细胞免疫纯化所得的Chk1保温，与从表达该酶的重组原核或真核宿主细胞中得到的Chk1、或纯化的Chk1保温，然后测定测试化合物对Chk1蛋白激酶活力的影响。测量关卡蛋白激酶活力可借测定蛋白激酶从γ-³²P-ATP转移到自身(自磷酸化)或外源底物如脂质或蛋白上的³²P-磷酸盐的量来进行。掺入底物中磷酸盐的量用闪烁计数或放射自显影测量。在测试化合物存在下转移到底物上的磷酸盐的量比在没有测试化合物时转移到底物上的磷酸盐量增加则表明测试化合物是Chk1蛋白激酶的激活剂。相反，在测试化合物存在下的磷酸盐转移量比无测试化合物存在时减少表明此调节剂是Chk1蛋白激酶的抑制剂。

在一种当前优选的测定中，与琼脂糖珠相连接的Chk1特异抗体与从表达蛋白激酶宿主细胞制得的裂解物保温。珠经洗涤除去与珠作非特异性结合的蛋白，然后将珠重悬于激酶缓冲液中。加入γ-³²P-ATP及适宜的外源底物如脂质或肽以起始反应。蛋白活性的测量采用测定转移到蛋白激酶自身或加入底物上的³²P-磷酸盐的摩尔数来进行。

在一个优选实施方案中，宿主细胞缺乏内源性的Chk1和/或ATM蛋白激酶活力。对调节Chk1蛋白激酶活性的化合物的选择性可用比较其对Chk1的活性及其对其它已知哺乳动物关卡蛋白激酶的活性来评价。在一系列独立的测定中将本发明的重组Chk1产品与其它重组哺乳动物关卡激酶产品相组合可提供一个开发Chk1选择性调节剂的系统。

而且，组合文库、肽与肽模拟物、确定的化学实体、寡核苷酸及天然产物文库可在如下文描述的测定中筛选其调节剂活性。

例如，鉴定Chk1激酶活性调节剂的方法包括：将Chk1蛋白激酶制剂在激酶缓冲液中与γ-³²P-ATP及一种外源激酶底物保温，在加有或无测试化合物的两种情况下，测定转移到底物上的磷酸盐的量。在测试化合物存在下转移到底物上的磷酸盐的量比在没有测试化合物时转移到底物上的磷酸盐量增加则表明测试化合物是Chk1激酶的激活剂。相反，在测试化合物存在下的磷酸盐转移量比无测试化合物存在时减少表明此调节剂是上述Chk1蛋白激酶的抑制剂。

而且，鉴定能调节Chk1与其它蛋白相互作用的化合物的方法可包括：用一种DNA构建物，其包括一个在启动子控制下并受具有一个DNA结合域和一个激活域的转录因子调控的报道基因，转化或转染适当的宿主细胞；在宿主细胞中表达第一杂合DNA序列，该序列编码部分或全部Chk1与转录因子的DNA结合域或激活域的第一融合体；在宿主细胞中表达第二杂合DNA序列，该序列编码部分或全部与Chk1相互作用的蛋白和未结合于第一融合体内的转录因子的DNA结合域或激活域；评价测试化合物对Chk1与相互作用蛋白间相互作用的效应，通过测量宿主细胞在测试化合物存在或不存在的条件下报道基因产物的生成来检测一特定宿主细胞中相互作用蛋白与Chk1的结合；以测试化合物改变报道基因产物的生成与不存在调节化合物时报道基因产物生成的比较来鉴定调节化合物。当前优选在测定方法中使用的是：lexA启动子以驱动报道基因的表达，lacZ报道基因，包括lexA DNA结合域及GAL4反式激活域的转录因子，以及酵母宿主细胞。

另一种鉴定调节Chk1与相互作用蛋白间的相互作用的化合物的方法包括：固化Chk1或天然的Chk1相互作用蛋白，可检测地标记非固定的结合蛋白，将结合配对体在一起保温以及测定一种测试化合物对被结合的标记量的效应，在测试化合物存在下结合的标记比无测试化合物存在时被结合的标记量低表明测试物是Chk1与蛋白相互作用的抑制剂。相反，在测试化合物存在下比没有化合物存在时的标记结合量增高表明这推定的调节剂是Chk1与蛋白相互作用的激活剂。

本发明还包括鉴定调节Chk1与相互作用蛋白间结合的化合物的另一种方法，包括：将Chk1或其片段固定在涂有(或浸透)荧光剂的固体支持物上，用能激发荧光剂的化合物标记相互作用蛋白，在存在和没有测试化合物的条件下使固化Chk1与标记的相互作用蛋白接触，检测荧光剂的光发射，以及根据测试化合物对荧光剂光发射的影响与不存在测试化合物时的荧光剂光发射相比，鉴定调节化合物。或者，可在测定中固定Chk1相互作用蛋白，而标记Chk1。

Chk1调节剂可影响其蛋白激酶活力，其细胞中定位，及/或其与细胞周期关卡途径中成员的相互作用。Chk1调节剂可配制为包括药学允许的载体的组合物。这种组合物里还可包括化疗制剂。指明的剂量足以产生在体内对Chk1活性的调节。选择性调节剂可包括，例如，与Chk1或Chk1核酸特异结合的肽或多肽，与Chk1或Chk1核酸特异结合的寡核苷酸，以及/或与Chk1或Chk1核酸起特异反应的其它非肽化合物(例如，分离的或合成的有机分子)。本发明也包括影响酶活力或野生型Chk1细胞定位的Chk1突变型。

详述

本发明用以下例子加以说明。例1详述编码哺乳动物Chk1激酶的多核苷酸的分离以及人Chk1 DNA的染色体定位。例2描述编码哺乳动物Chk1的DNAs的重组表达。例3叙述Chk1抗体的制备。显示Chk1的组织和细胞分布的Northern印迹在例4中叙述。例5报告Chk1表达的免疫组织学和Western印迹研究结果。例6描述鼠Chk1的生化和生物学活性。

例1

A.人Chk1 cDNA的分离

通过筛选EST序列与粟酒裂殖酵母Chk1的相似性鉴定了一种Chk1Hu cDNA。与Chk1 COOH^-末端有同源性的EST(H67490)得到鉴定与克隆，并用于构建一个与COOH^-末端120个氨基酸显示有限同源性的毗连群，此毗连群用RACE PCR扩展为一个1735bp的克隆。RACE PCR片段用于探查cDNA文库以产生最终序列。用RACE衍生的序列信息以高严紧度、Exptess杂交液(Clontech)，从人睾丸unizap文库(Clontech)中筛选1×10⁶独立的cDNA克隆，得到11个重叠的序列，用来组装出Chk1Hu的全长。

全长的人Chk1 cDNA亚克隆在pGEMT中。含有全长人cDNA的质粒确定为pGEMT-Chk1HU。pGEMT-Chk1HU已于1997年8月27日保藏于Ametican Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MX 20852，登记号No.ATCC 98520。人Chk1(Chk1Hu)的全长cDNA及推断的氨基酸序列在SEQ ID NOs：2及4中分别提供。人Chk1(Chk1Hu)的全长DNA及推断的氨基酸序列在SEQ ID NOs：1及2中分别提供。

B.鼠Chk1 cDNA的分离

用简并人Chk1特异探针从小鼠睾丸cDNA文库中进行文库筛选鉴定了Chk1Mo。小鼠Chk1(Chk1Mu)的部分cDNA和推导的氨基酸序列分别提供于SEQ ID NO.：3及4。

C.Chk1Hu及Chk1Mu的结构分析

Chk1Hu及Chk1Mu cDNAs编码一种约70 kD的蛋白。Chk1Hu的激酶域是SEQ ID NO.：2的161～264。Chk1Mu的激酶域包括SEQID NO.：4的1～61氨基酸。人和小鼠Chk1的蛋白激酶域公布于此，在氨基酸水平约有90％的同一性。相对于C.elegan，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母Chk1-样蛋白，人蛋白与它们蛋白激酶域的同一性分别为56％，47％及37％。图1比较了人、小鼠、C.elegan，粟酒裂殖酵母及酿酒酵母的Chk1同源物的氨基酸序列。在图1中在各种属间均相同的氨基酸残基打上了框。罗马数字标出同源物中保守的亚域。亚域V～IX包括底物识别位点，含有最大频率的保守残基。这是根据与其它已知激酶的同源性确定的(Hanks et al.，Science 241：42-52，1988)。

D.分离鼠Chk1基因组克隆

编码Chk1的小鼠基因组克隆是用PCR筛选P1小鼠129文库而获得的。用于筛选小鼠129 P1文库的PCR引物为mmChk2(ACG TGGACA AAC TGG TTC AGG)(SEQ ID NO.：5)及mmChk21：(CTGATA GCC CAA CTT CTC GAA SEQ ID NO.：6)。这些引物用于生成一个相当于SEQ ID NO.：4核苷酸X～X的208bp的扩增子。此扩增子用于鉴定一个约81-100kb的克隆。基因组克隆用EcoRI进行限制性消化，限制性酶切产物亚克隆到一个载体内以zeocin作为选择标志。此载体得自Invitreogen p.zero 1.1(2.8kb)。

EcoRI限制消化物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，按标准方法转移到硝酸纤维素上。硝酸纤维素印迹用208bp扩增子探测以肯定一个基因组克隆已得到鉴定。

E.人Chk1基因的染色体作图

用Stanford G3 Radiation Hybrid板对Chk1进行定位作图。用两个从人cDNA文库衍生的Chk1 DNA片段的3′非翻译区内的寡核苷酸，以引物1(Chk1 30 mer3′UT)GGCTCTGGGGAATCCTGGTGAATATAGTGCTGC (SEQ ID NO.：7)及引物2(Chk1 30 mer 3′UT)TCCCCTGAAACTTGGTTTCCACCAGATGAG(SEQ ID NO.：8)进行PCR反应，得到一个单一的扩增子。为了亚定位，分析了从ResearchGenetics(Huntsville，Alabama)得到的染色体11放射杂交DNA样品，结果由RH服务器http：//shgc.stanfbrd.edu/.解码。Chk1Hu定位于标志D1154610处，后者已作用于11q 23.3的端粒区域。此区域已被确定为与卵巢、乳腺、肺、结肠及宫颈癌，黑色素瘤有关的肿瘤抑制基因的位点。[Gabra et.al.，Cancer Research，56：950-954(1996)]。

例2

Chk1在重组子宿主细胞中表达

A.Chk1谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及激酶活力

制备了编码Chk1谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(GST-Chk1Hu)的DNA。利用引入到Chk1Hu中的NdeI SalI限制位点将编码GST-Chk1Hu的DNA克隆到pGEXKGH中，内在的NdeI位点用沉默诱变消除。以GST-Chk1转化的E.coli F Dh5a用于制备重组子蛋白。在200ml培养基中，加入5mM IPTG，细胞在37℃下生长4小时。收集培养物，在STE缓冲液中洗(10mM Tris pH8，150mMNaCl及1mM EDTA)。细胞重悬浮于含1mM PMSF和100mg溶菌酶的6mol STE中。培养物在冰上孵育15分钟，加入5mM DTT和1.5％Sarkosyl，细胞作超声处理。沉淀残渣，上清加Triton X-100至2％。加入谷胱甘肽琼脂糖珠，用台式离心机沉淀珠，结合蛋白用洗脱缓冲液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl，1mM PMSF及10mM谷胱甘肽)洗脱。

激酶测定是将GST-Chk1Hu在含有或不含1mg底物蛋白的激酶缓冲液(25M HEPES，pH7.7，50mM KCl；10mM MgCl₂；0.1％NP-40；2％甘油；1mM DTT，50μM ATP)中孵育，在含有10mCi[g-32P]ATP(3000Ci/mmol)的激酶缓冲液中于37℃保温20分钟。在6％PAGE分离之前用20μl 2×SDS样品缓冲液中止反应。然后将激酶反应物转移到Immobilon上，对片子曝光，然后接着探测沉淀蛋白。

谷胱甘肽亲和纯化融合蛋白能够自身磷酸化并使底物蛋白如髓鞘碱性蛋白磷酸化表明Chk1具有蛋白激酶活性，不依赖于调节亚单位。

例3

对哺乳动物Chk1蛋白特异的抗体按以下方法生成。

A.生成多克隆抗体

多克隆抗体是对抗于小鼠Chk1多肽片段而生成的。CLKETFEKLGYQWKK(SEQ ID NO.：3的氨基酸191～203)经N-末端加上的半胱氨酸与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，给家兔每次注射150mg。为对兔血清进行亲和纯化，脱气TEB(50 mM Tris，5 mMEDTA-Na，pH8.5)平衡过的巯基偶联胶(TCGel Quality Controlled Biochemicals)(St.Louse，Missouri)3ml与1.25mg HPLC纯化肽混合。偶联树脂装到经济柱上(Bio Rad)(Hercules，California)，用10个柱容TEB洗。树脂再用封闭缓冲液(50mM半胱氨酸于TEB缓冲液中/ml凝胶)处理，然后用20柱容的盐缓冲液洗。柱子用20柱容的盐缓冲液(500mMNaCl于50mM NaH₂PO₄中，pH6.5)及10个柱容的磷酸缓冲液(50 mMNaH₂PO₄，pH6.5)洗。20ml的兔血清加载到柱上，用10个柱容的盐缓冲液洗，抗体随甘氨酸缓冲液(100mM甘氨酸-HCL，pH2.5)而洗脱。以1ml的分部收集于50μl 1.0M Tris(pH9.5)中。含有抗体的分部收集在一起，对储存缓冲液(10mM NaH₂PO₄，20mM MgCl，pH7.0)透析，在-20℃储存，称作aChk1#2-3。多克隆抗血清aChk1#2-3能对来自小鼠睾丸提取液中的小鼠Chk1蛋白发生免疫沉淀，如例6所叙，此外，aChk1#2-3识别的重组人Chk1及Chk1Hu谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白在E.coli中得到了表达。

B.单克隆抗体的生成

单克隆抗体的制备是用溶于弗氏完全佐剂(CFA)的Chk1，Gst-Chk1或Chk1片段对Balb/c小鼠经皮下免疫。随后进行CFA中或不完全弗氏佐剂的免疫以增强免疫反应。

无菌取出免疫动物的脾脏，置于两块显微镜玻璃载片的冰冻末端间研磨，制成单细胞悬液，玻片浸在无血清RPMI 1640中，并补充有2 mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100单位/ml青霉素及100mg/ml链霉素(RPMI)(Gibco，Canada)。细胞悬液用无菌的70-目Nitex细胞滤网(Becton Dickinson，Parsippany，New Jersey)过滤，用200g 5分钟离心、重悬沉淀于20ml无血清RPMI的方法洗两次。从Balb/c幼鼠取得的胸腺细胞用同样方法制备。

2×10⁸脾细胞与4×10⁷NS-1细胞(保持在对数期，融合前在含11％胎牛血清(FBS)的RPMI中保持3天)合在一起，离心，吸出上清。取出细胞沉淀，在持续1分钟的搅拌下加入2ml 37℃PEG 1500(75mMHEPES中50％，pH8.0)(BoehringerMannheim)，再在7分钟内加入14ml无血清RPMI。可再增加一些RPMI，细胞以200g离心10分钟。弃上清后，沉淀再悬浮于200ml RPMI中，后者含有15％FBS，100mM次黄嘌呤钠，0.4mM氨基蝶呤，16mM胸腺(HAT)(Gibco)，25单位/mlIL-6(BoehringerMannheim)及1.5×10⁶胸腺细胞/ml。悬液以200μl/孔的量分配到10个96孔平底组织培养板中(Corning，United Kingdom)。细胞于融合后2，4及6天给与饲养，即用18G针头(Becton Dickinson)从每孔吸出100ml，并加入100ml/孔含10U/ml IL-6而不含胸腺细胞的接种培养基。

当细胞生长达到60-80％汇合时(8-10天)，从每孔取出培养上清，用ELISA筛选Chk1活性。ELISA按以下方法进行。将Immulon4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)在4℃下以50ml/孔，100ng/孔的溶于50mM碳酸盐缓冲液pH9.6中的Chk1包被。板用含0.05％Tween20(PBST)的PBS洗，在0.5％鱼皮胶(Fish Skin Gelatia)中封闭，37℃，30分钟。平板如上述洗毕后加入50ml培养上清，在37℃孵育30分钟后，加入与羊抗小鼠IgG(fc)缀合的辣根过氧化物酶50ml(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)[在PBST中以1∶10,000稀释]。平板于37℃温育30分钟，以PBST洗，加入100ml底物，其组成为1mg/ml TMB(Sigma)及0.15ml/ml 30％H₂O₂溶于100mM柠檬酸盐中，pH4.5。加入50ml15％H₂SO₄终止颜色反应。A450在平板读数仪(Dynatech)上读取。

例4

进行Northern分析以测定Chk1在小鼠和人组织中的组织分布。用寡核苷酸mmChk1：GTTGAGACTCCATCATCAAGG(SEQ ID NO.：9)及mmChk1′：TCTGGCTGGGAACTAGAGAAC(SEQ ID NO.：10)生成一个220bp的扩增子，鉴定为mmChk1+1′，mmChk+1′及mmChk2+2′(例1)用作northern分析的探针。PCR的条件如下：一个循环的94℃8分钟，然后40循环的94℃20秒，58℃20秒，72℃20秒。产物用4％琼脂糖凝胶分析。

扩增子以³²P-ATP标记用于Northern分析。尼龙膜含有2 mg按大小分级的多聚(A)⁺RNA，后者来自人与小鼠组织，包括人心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血白细胞，以及小鼠心、脑、脾、肺、肝、骨骼肌、肾和睾丸(Clonetech Laboratories，Palo Alto，California)，按照制造厂商推荐的方法，用标记扩增子探查，只有最后一次洗在55℃进行，以使与相关序列交叉杂交的可能性降到最低。

在小鼠组织中，在肺、脾和睾丸观察到Chk1的表达。在人组织中，表达在胸腺、肺、前列腺及睾丸中见到。无论如何，小鼠和人的睾丸RNA样品比其它组织中的RNA表达水平高出2～4倍。

为测定发育中小鼠胚胎中的Chk1表达，在7、11、15及17天得到的整体胚胎的mRNA以标记的mChk1+1′和mmChk2+2′探查。Northern印迹表明，Chk1的表达高峰是在胚胎发育的11天。

例5

由于Atr和Atm在减数分裂中的作用以及它们与减数分裂染色体的结合，对小鼠睾丸切片用兔免疫组织学鉴定法检查了Chk1Mo蛋白的表达。睾丸中减数分裂前细胞围绕着细精管的表面，对应于减数分裂的后期及精子成熟向小管内腔移行[Moens et al，J.Histochem.Cytochem，25：480(1977)]。

正常及突变小鼠(见下文)的睾丸，按Heiner et al.，Cancer Res.，57：1664-1667(1997)所述取得，并保存于Tissue Tek OCT复合物，一种组织冰冻介质，含有10.24％w/w聚乙烯醇、4.26％w/w聚乙二醇及85.50％w/w惰性成分。野生与突变小鼠都作了检验，用多克隆抗体aChk1#2-3进行免疫组化分析。6微米的冷冻切片置于50℃烘箱中干燥，在4℃丙酮中固定2分钟。载片用1∶100稀释的aChk1#2-3抗血清保温30分。第二抗体，羊抗兔生物素化的抗体以1∶200加到每个切片上，保温37℃15分。第三抗体，羊抗生物素以1∶200加到每个切片，保温37℃15分。每次保温后，载片都用1×TBS淋洗。用DAB辣根过氧化物酶底物检测样品中的阳性信号。反应在水中停止，用Gill’s苏木精复染。

Chk1Mo，atm+/+p53+/+(A)，atm+/+p53+/-(B)atm-/-p53+/+(C)，atm-/-p53+/-(D)，及atm-/-p53-/-(E)的睾丸用抗-Chk1抗血清作免疫组织学鉴定。睾丸的冰冻切片用亲和纯化的抗-Chk1抗血清(aChk1#2-3)及抗-ATR单克隆(224C)染色。通过检验免疫前血清及特异和非特异肽封闭试验肯定染色的特异性。用亲和纯化的Chk1多克隆抗血清(例3的Chk1#2-3)测定定位。

与报告的Atr染色型不同，正常小鼠核染色中Chk1Mo表现暂时的增加和减少。Chk1Mo在初级精母细胞的粗线期表达最高，表明Chk1Mo可能在减数分裂前期作用于Atr功能的下游，在Atr之后，而后者在偶线期作用较早。由于Atm及p53具有关卡性质，可能作用于信号转导相对于Chk1Hu/Mo较早的时相，对atm-/-p53+/+，atm-/-p53-/-及atm-/-p53+/-小鼠用组织学分析测定了Chk1Mo的定位[Done hower etal.，Nature，356：215(1992)；Kuerbitz et al.，Proc，Natl. Acad.Sci.USA，89：7491(1992)；Westphal et al.，Nat.Gen.，16：397-401(1997)]。Chk1Mo的蓄积和定位不依赖于p53状态，但依赖于Atm，说明Chk1Mo也作用于减数分裂前期Atm的下游。

为进一步分析Chk1在哺乳动物减数分裂中的作用，在精母细胞压片上测定了Chk1的时间与空间分布。

为减数分裂制片，制备了15-21日龄小鼠(C57-b1/6)精母细胞的压片，按Ashley et al.，Chromosoma，104：19(1995)描述的方法进行抗体保温和测定。这些方法是Moens et al.，流程的改良，如Ashley等先前所述。因为抗Chk1和Sep3(对照)的抗体都由兔产生，精母细胞标记了，然后成象。检测使用羊-抗兔IgG-罗丹明缀合及羊-抗兔IgG-FITC-缀合(Pierce)的第二抗体。所有制片用4′，6′二氨基-2-苯基吲哚(DPAI，Sigma)复染，置于DABCO(Sigma)抗退色溶液中。用Zeiss Axioskop(63-X及100-X，1.2 Plan Neoflour油浸物镜)检查制片。每一个荧光(FITC，罗丹明及DAPI)象都用计算机支持的冷CCD相机(Photometrics CH220)分别捕捉为8-比特源象，以TimRand[Ried et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：1388(1992)]开发的商业软件将各影象以24比特假着色、吸收。

偶线期精母细胞用抗Scp3抗血清染色，Scp3是在姊妹染色单体间形成的轴要素的组分。这些偶线期精母细胞还用aChk1#2-3标记。Chk1沿联会同源染色体的联会复合体(SC)存在。处于联会过程的染色体具有Chk1染色，但非联会轴要素上观察不到染色。当减数分裂进入粗线期时，Chk1Mo仍以与ATM相似的灶染色型与常染色体联会复合物结合。

一个粗线期母细胞用抗Chk1及小鼠抗Atr单克隆抗体(224C)二者标记。虽然Chk1开始呈现为灶型，而在粗线期Chk1看来沿SCs蓄积。此外，Chk1灶在中粗线期X与Y染色体沿非联会轴要素出现，与Atr在一起。在整个粗线期Chk1保持在SCs上，而当同源染色体在双线期分离时消失。

p53-/-小鼠的减数分裂前期I的进程是正常的。在标记Chk1及Scp3的早期粗线期精母细胞，Chk1沿SCs及性染色体的联会区存在。无论如何，Chk1不出现在早粗线期X染色体的非联会轴要素上。在atm-/-小鼠，当联会后SCs开始断裂时减数分裂的进程受到破坏。虽然同源染色体在atm-/-精母细胞发生联会，沿着联会二价体或分片段的SCs没有测到Chk1。

如此，在正常小鼠，Chk1以灶型出现于偶线期联会同源染色体的联会复合体上，与Atm的形式相似。当减数分裂进入粗线期时，Chk1沿SCs蓄积，在中-粗线期结束前Chk1复盖整个SCs。在早粗线期，Chk1沿XY二价体的联会区存在。然而在中-粗线期前，Chk1灶也沿着X和Y染色体的非联会轴出现，与Atr定位在一起。Atr在早期发现以灶样存在于性染色体的非联会轴上，以后在粗线期复盖整个X与Y轴上。

p53缺陷小鼠的减数分裂看来不受影响，如组织学分析和精母细胞压片对Scp3和Chk1免疫染色所显示。相反，atm-/-小鼠是不育的，这是由于联会后减数分裂染色体进行性断裂引起凋亡的结果。对atm-/-精母细胞Chk1免疫定位表明在SCs上缺乏Chk1，提示在哺乳动物减数分裂中Atm在Chk1下游起作用。为了确定在atm-/-核中Chk1染色的缺乏及减数分裂前期染色质上Chk1Mo蛋白的缺乏是否是Chk1Mo水平的反映，按Keegan et al.，Genes Dev.，10：2423(1996)的方法对睾丸提取物进行Western分析。Chk1蛋白以Atm-依赖的方式存在，提示Chk1Mo的合成或稳定依赖于Atm蛋白。缺乏Atm的小鼠MTE不能染出Chk1说明atm-/l小鼠不表达Chk1。相反，野生型小鼠或p53表达障碍小鼠的MTE显示Chk1染色。

例6

小鼠Chk1的激酶活力及其与Atr结合的能力也得到了证实。

A.鼠睾丸Chk1的激酶活力

用aChk1#2-3抗体从小鼠睾丸提取物(MTE)免疫沉淀Chk1。约30只去包膜睾丸加液氮在研钵中磨碎，磨碎物转移至15ml dounce匀浆器。加入15ml裂解缓冲液(50mM NaPO₄，pH7.2，0.5％Triton X-100，2mM EDTA，2mM EGTA，25mM NaF，25mM 2-甘油磷酸盐，1mMPMSF，1mg/ml亮抑酶肽，1mg/ml抑胃酶肽A及2mM DTT)，将提取物打匀浆，用松研杵打30次，紧研杵打20次。低速离心后，用BCA测上清蛋白浓度。

为免疫沉淀Chk1，400mg MTE提取物或与10mg亲和纯化Chk1#2-3，或与约10mg免疫前血清冰浴30分。加入蛋白A-琼脂糖浆液(Pierce)，混合物在4℃孵育30分。结合免疫复合物的浆液在TSAT中洗三次，激酶缓冲液(25μM HEPES，pH7.7；50mMKCl；10mMMgCl₂；0.1％NP-40；2％甘油；1mM DTT，50％μM ATP)洗一次，在含有10mCi[g-32P]ATP(3000Ci/mmol)的激酶缓冲液中37℃保温20分。在6％PAGE分离前用20μl 2×SDS样品缓冲液终止反应。激酶反应物转移到Immobilon上，对片子曝光，然后用探针检测沉淀蛋白。

为测定从MTE免疫沉淀的Chk1是否能自身磷酸化，在免疫沉淀物中加入2×激酶缓冲液及10mCig³²-P-data(3000Ci/mM)。磷酸化反应物在30℃孵育15分。反应物在6％PAGE凝胶上电泳，转移到Immobilon P，对X光片曝光。印迹表明免疫沉淀Chk1能与Chk1-GST融合蛋白(例2)一样进行自身磷酸化。小鼠IgG及Chk1免疫前血清不能免疫沉淀Chk1Mo。

C.Chk1与Atr的结合

为确定Chk1与Atr是否能在减数分裂细胞内结合，460mg MTE用抗Atr单克隆抗体(aAtr-224C)在上述条件下进行免疫沉淀。Atr免疫沉淀物在6％或8％PAGE上电泳，电印迹到immoblin P膜上，用抗-Chk1抗体(aChk1#2-3)探查。印迹显示，Chk1与Atr共沉淀，表明Atr与Chk1在减数分裂细胞中结合。此外，与Atr免疫共沉淀的Chk1能进行自身磷酸化。

在实施本发明中对于熟练技术者可以有多种多样的改进和变动。本发明仅由所附权利要求书限定。

序列表(1)一般信息：(i)申请人：Medical Research Council(ii)发明名称：哺乳动物CHK1效应物细胞周期关卡蛋白激酶

材料与方法(iii)序列数目：10(iv)通讯地址：

(A)收信人：Medical Research Council

(B)街道：20，Park Crescent

(C)城市：伦敦

(D)州：

(E)国家：UK

(F)ZIP：W1N 4AL(v)计算机阅读形式：

(A)媒体形式：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)现申请数据：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：(2)SEQ ID NO.：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1933碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA

“人Chk1”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)定位：34..1461(xi)序列描述：SEQ ID NO.：1：GCCGGACAGT CCGCCGAGGT GCTCGGTGGA GTC ATG GCA GTG CCC TTT GTG GAA 54

Met Ala Val Pro Phe Val Glu

1 5GAC TGG GAC TTG GTG CAA ACC CTG GGA GAA GGT GCC TAT GGA GAA GTT 102Asp Trp Asp Leu Val Gln Thr Leu Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Glu Val

10 15 20CAA CTT GCT GTG AAT AGA GTA ACT GAA GAA GCA GTC GCA GTG AAG ATT 150Gln Leu Ala Val Asn Arg Val Thr Glu Glu Ala Val Ala Val Lys Ile

25 30 35GTA GAT ATG AAG CGT GCC GTA GAC TGT CCA GAA AAT ATT AAG AAa GAG 198Val Asp Met Lys Arg Ala Val Asp Cys Pro Glu Asn Ile Lys Lys Glu40 45 50 55ATC TGT ATC AAT AAA ATG CTA AAT CAT GAA AAT GTA GTA AAA TTC TAT 246Ile Cys Ile Asn Lys Met Leu Asn His Glu Asn Val Val Lys Phe Tyr

60 65 70GGT CAC AGG AGA GAA GGC AAT ATC CAA TAT TTA TTT CTG GAG TAC TGT 294Gly His Arg Arg Glu Gly Asn Ile Gln Tyr Leu Phe Leu Glu Tyr Cys

75 80 85AGT GGA GGA GAG CTT TTT GAC AGA ATA GAG CCA GAC ATA GGC ATG CCT 342Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Glu Pro Asp Ile Gly Met Pro

90 95 100GAA CCA GAT GCT CAG AGA TTC TTC CAT CAA CTC ATG GCA GGG GTG GTT 390Glu Pro Asp Ala Gln Arg Phe Phe His Gln Leu Met Ala Gly Val Val

105 110 115TAT CTG CAT GGT ATT GGA ATA ACT CAC AGG GAT ATT AAA CCA GAA AAT 438Tyr Leu His Gly Ile Gly Ile Thr His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn120 125 130 135CTT CTG TTG GAT GAA AGG GAT AAC CTC AAA ATC TCA GAC TTT GGC TTG 486Leu Leu Leu Asp Glu Arg Asp Asn Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu

140 145 150GCA ACA GTA TTT CGG TAT AAT AAT CGT GAG CGT TTG TTG AAC AAG ATG 534Ala Thr Val Phe Arg Tyr Asn Asn Arg Glu Arg Leu Leu Asn Lys Met

155 160 165TGT GGT ACT TTA CCA TAT GTT GCT CCA GAA CTT CTG AAG AGA AGA GAA 582Cys Gly Thr Leu Pro Tyr Val Ala Pro Glu Leu Leu Lys Arg Arg Glu

170 175 180TTT CAT GCA GAA CCA GTT GAT GTT TGG TCC TGT GGA ATA GTA CTT ACT 630Phe His Ala Glu Pro Val Asp Val Trp Ser Cys Gly Ile Val Leu Thr

185 190 195GCA ATG CTC GCT GGA GAA TTG CCA TGG GAC CAA CCC AGT GAC AGC TGT 678Ala Met Leu Ala Gly Glu Leu Pro Trp Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys200 205 210 215CAG GAG TAT TCT GAC TGG AAA GAA AAA AAA ACA TAC CTC AAC CCT TGG 726Gln Glu Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Lys Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp

220 225 230AAA AAA ATC GAT TCT GCT CCT CTA GCT CTG CTG CAT AAA ATC TTA GTT 774Lys Lys Ile Asp Ser Ala Pro Leu Ala Leu Leu His Lys Ile Leu Val

235 240 245GAG AAT CCA TCA GCA AGA ATT ACC ATT CCA GAC ATC AAA AAA GAT AGA 822Glu Asn Pro Ser Ala Arg Ile Thr Ile Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg

250 255 260TGG TAC AAC AAA CCC CTC AAG AAA GGG GCA AAA AGG CCC CGA GTC ACT 870Trp Tyr Asn Lys Pro Leu Lys Lys Gly Ala Lys Arg Pro Arg Val Thr

265 270 275TCA GGT GGT GTG TCA GAG TCT CCC AGT GGA TTT TCT AAG CAC ATT CAA 918Ser Gly Gly Val Ser Glu Ser Pro Ser Gly Phe Ser Lys His Ile Gln280 285 290 295TCC AAT TTG GAC TTC TCT CCA GTA AAC AGT GCT TCT AGT GAA GAA AAT 966Ser Asn Leu Asp Phe Ser Pro Val Asn Ser Ala Ser Ser Glu Glu Asn

300 305 310GTG AAG TAC TCC AGT TCT CAG CCA GAA CCC CGC ACA GGT CTT TCC TTA 1014Val Lys Tyr Ser Ser Ser Gln Pro Glu Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu

315 320 325TGG GAT ACC AGC CCC TCA TAC ATT GAT AAA TTG GTA CAA GGG ATC AGC 1062Trp Asp Thr Ser Pro Ser Tyr Ile Asp Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser

330 335 340TTT TCC CAG CCC ACA TGT CCT GAT CAT ATG CTT TTG AAT AGT CAG TTA 1110Phe Ser Gln Pro Thr Cys Pro Asp His Met Leu Leu Asn Ser Gln Leu

345 350 355CTT GGC ACC CCA GGA TCC TCA CAG AAC CCC TGG CAG CGG TTG GTC AAA 1158Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Gln Asn Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys360 365 370 375AGA ATG ACA CGA TTC TTT ACC AAA TTG GAT GCA GAC AAA TCT TAT CAA 1206Arg Met Thr Arg Phe Phe Thr Lys Leu Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln

380 385 390TGC CTG AAA GAG ACT TGT GAG AAG TTG GGC TAT CAA TGG AAG AAA AGT 1254Cys Leu Lys Glu Thr Cys Glu Lys Leu Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser

395 400 405TGT ATG AAT CAG GTT ACT ATA TCA ACA ACT GAT AGG AGA AAC AAT AAA 1302Cys Met Asn Gln Val Thr Ile Ser Thr Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys

410 415 420CTC ATT TTC AAA GTG AAT TTG TTA GAA ATG GAT GAT AAA ATA TTG GTT 1350Leu Ile Phe Lys Val Asn Leu Leu Glu Met Asp Asp Lys Ile Leu Val

425 430 435GAC TTC CGG CTT TCT AAG GGT GAT GGA TTG GAG TTC AAG AGA CAC TTC 1398Asp Phe Arg Leu Ser Lys Gly Asp Gly Leu Glu Phe Lys Arg His Phe440 445 450 455CTG AAG ATT AAA GGG AAG CTG ATT GAT ATT GTG AGC AGC CAG AAG GTT 1446Leu Lys Ile Lys Gly Lys Leu Ile Asp Ile Val Ser Ser Gln Lys Val

460 465 470TGG CTC CCT GCC ACA TGATCGGACC ATCGGCTCTG GGGAATCCTG GTGAATATAG 1501Trp Leu Pro Ala Thr

475TGCTGCTATG TTGACATTAT TCTTCCTAGA GAAGATTATC CTGTCCTGCA AACTGCAAAT 1561AGTAGTTCCT GAAGTGTTCA CTTCCCTGTT TATCCAAACA TCTTCCAATT TATTTTGTTT 1621GTTCGGCATA CAAATAATAC CTATATCTTA ATTGTAAGCA AAACTTTGGG GAAAGGATGA 1681ATAGAATTCA TTTGATTATT TCTTCATGTG TGTTTAGTAT CTGAATTTGA AACTCATCTG 1741GTGGAAACCA AGTTTCAGGG GACATCAGTT TTCCAGCTTT TATACACACG TATCTCATTT 1801TTATCAAAAC ATTTTGTTTA ATTCAAAAAG TACATATTCC ATGTTGATTT AATTCTAAGA 1861TGAACCAATA AAGACATAAT TCTTGTGACT TTTGGACAGT AGATTTATCA GTCTGTGAAG 1921CGAAGCCAGC TT 1933(2)SEQ ID NO.：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：476氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO.：2：Met Ala Val Pro Phe Val Glu Asp Trp Asp Leu Val Gln Thr Leu Gly1 5 10 15Glu Gly Ala Tyr Gly Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Arg Val Thr Glu

20 25 30Glu Ala Val Ala Val Lys Ile Val Asp Met Lys Arg Ala Val Asp Cys

35 40 45Pro Glu Asn Ile Lys Lys Glu Ile Cys Ile Asn Lys Met Leu Asn His

50 55 60Glu Asn Val Val Lys Phe Tyr Gly His Arg Arg Glu Gly Asn Ile Gln65 70 75 80Tyr Leu Phe Leu Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile

85 90 95Glu Pro Asp Ile Gly Met Pro Glu Pro Asp Ala Gln Arg Phe Phe His

100 105 110Gln Leu Met Ala Gly Val Val Tyr Leu His Gly Ile Gly Ile Thr His

115 120 125Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Arg Asp Asn Leu130 135 140Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Phe Arg Tyr Asn Asn Arg145 150 155 160Glu Arg Leu Leu Asn Lys Met Cys Gly Thr Leu Pro Tyr Val Ala Pro

165 170 175Glu Leu Leu Lys Arg Arg Glu Phe His Ala Glu Pro Val Asp Val Trp

180 185 190Ser Cys Gly Ile Val Leu Thr Ala Met Leu Ala Gly Glu Leu Pro Trp

195 200 205Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys Gln Glu Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Lys

210 215 220Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp Lys Lys Ile Asp Ser Ala Pro Leu Ala225 230 235 240Leu Leu His Lys Ile Leu Val Glu Asn Pro Ser Ala Arg Ile Thr Ile

245 250 255Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg Trp Tyr Asn Lys Pro Leu Lys Lys Gly

260 265 270Ala Lys Arg Pro Arg Val Thr Ser Gly Gly Val Ser Glu Ser Pro Ser

275 280 285Gly Phe Ser Lys His Ile Gln Ser Asn Leu Asp Phe Ser Pro Val Asn

290 295 300Ser Ala Ser Ser Glu Glu Asn Val Lys Tyr Ser Ser Ser Gln Pro Glu305 310 315 320Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu Trp Asp Thr Ser Pro Ser Tyr Ile Asp

325 330 335Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser Phe Ser Gln Pro Thr Cys Pro Asp His

340 345 350Met Leu Leu Asn Ser Gln Leu Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Gln Asn

355 360 365Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys Arg Met Thr Arg Phe Phe Thr Lys Leu

370 375 380Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln Cys Leu Lys Glu Thr Cys Glu Lys Leu385 390 395 400Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser Cys Met Asn Gln Val Thr Ile Ser Thr

405 410 415Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys Leu Ile Phe Lys Val Asn Leu Leu Glu

420 425 430Met Asp Asp Lys Ile Leu Val Asp Phe Arg Leu Ser Lys Gly Asp Gly

435 440 445Leu Glu Phe Lys Arg His Phe Leu Lys Ile Lys Gly Lys Leu Ile Asp

450 455 460Ile Val Ser Ser Gln Lys Val Trp Leu Pro Ala Thr465 470 475(2)SEQ ID NO.：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：742碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA

“小鼠Chk1”(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)定位：1..742(xi)序列描述：SEQ ID NO.：3：

GGA GAG TTG CCG TGG GAC CAG CCC AGT GAT AGC TGT CAG GAA TAT CTG48

Gly Glu Leu Pro Trp Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys Gln Glu Tyr Leu

1 5 10 15

ATT GTA AAG AAA AAA AAA ACC TAT CTC AAT CCT TGG AAA AAA ATT GAT96

Ile Val Lys Lys Lys Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp Lys Lys Ile Asp

20 25 30

TCT GCT CCT CTG GCT TTG CTT CAT AAA ATT CTA GTT GAG ACT CCA TCA 144

Ser Ala Pro Leu Ala Leu Leu His Lys Ile Leu Val Glu Thr Pro Ser

35 40 45

TCA AGG ATC ACC ATC CCA GAC ATT AAG AAA GAT AGA TGG TAC AAC AAA 192

Ser Arg Ile Thr Ile Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg Trp Tyr Asn Lys

50 55 60

CCA CTT AAC AGA GGA GCA AAG AGG CCA CGC GCC ACA TCA GGT GGT ATG 240

Pro Leu Asn Arg Gly Ala Lys Arg Pro Arg Ala Thr Ser Gly Gly Met

65 70 75 80

TCA GAG TCT TCT AGT GGA TTC TCT AAG CAC ATT CAT TCC AAT TTG GAC 288

Ssr Glu Ser Ser Ser Gly Phe Ser Lys His Ile His Ser Asn Leu Asp

85 90 95

TTT TCT CCA GTA AAT AAT GGT TCC AGT GAA GAA ACC GTG AAG TTC TCT 336

Phe Ser Pro Val Asn Asn Gly Ser Ser Glu Glu Thr Val Lys Phe Ser

100 105 110

AGT TCC CAG CCA GAG CCG AGA ACA GGG CTT TCC TTG TGG GAC ACT GGT 384

Ser Ser Gln Pre Glu Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu Trp Asp Thr Gly

115 120 125CCC TCG AAC GTG GAC AAA CTG GTT CAG GGC ATC AGT TTT TCC CAG CCT 432Pro Ser Asn Val Asp Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser Phe Ser Gln Pro

130 135 140ACG TGT CCT GAG CAT ATG CTT GTA AAC AGT CAG TTA CTC GGT ACC CCT 480Thr Cys Pro Glu His Met Leu Val Asn Ser Gln Leu Leu Gly Thr Pro145 150 155 160GGA TCT TCA CAG AAC CCC TGG CAG CGC TTG GTC AAA AGA ATG ACG AGG 528Gly Ser Ser Gln Asn Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys Arg Met Thr Arg

165 170 175TTC TTT ACT AAA TTG GAT GCG GAC AAG TCT TAC CAA TGC CTG AAA GAG 576Phe Phe Thr Lys Leu Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln Cys Leu Lys Glu

180 185 190ACC TTC GAG AAG TTG GGC TAT CAG TGG AAG AAG AGT TGT ATG AAT CAG 624Thr Phe Glu Lys Leu Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser Cys Met Asn Gln

195 200 205GTT ACT GTA TCA ACA ACT GAT AGA AGA AAC AAT AAG TTG ATT TTC AAA 672Val Thr Val Ser Thr Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys Leu Ile Phe Lys

210 215 220ATA AAT TTG GTG GAA ATG GAT GAG AAG ATA CTG GTT GAC TTC CGA CTT 720Ile Asn Leu Val Glu Met Asp Glu Lys Ile Leu Val Asp Phe Arg Leu225 230 235 240TCT AAA GGC GAC GGC TAC AAT T 742Ser Lys Gly Asp Gly Tyr Asn

245(2)SEQ ID NO.：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：247氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO.：4：Gly Glu Leu Pro Trp Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys Gln Glu Tyr Leu1 5 10 15Ile Val Lys Lys Lys Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp Lys Lys Ile Asp

20 25 30Ser Ala Pro Leu Ala Leu Leu His Lys Ile Leu Val Glu Thr Pro Ser

35 40 45Ser Arg Ile Thr Ile Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg Trp Tyr Asn Lys

50 55 60Pro Leu Asn Arg Gly Ala Lys Arg Pro Arg Ala Thr Ser Gly Gly Met65 70 75 80Ser Glu Ser Ser Ser Gly Phe Ser Lys His Ile His Ser Asn Leu Asp

85 90 95Phe Ser Pro Val Asn Asn Gly Ser Ser Glu Glu Thr Val Lys Phe Ser

100 105 110Ser Ser Gln Pro Glu Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu Trp Asp Thr Gly

115 120 125Pro Ser Asn Val Asp Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser Phe Ser Gln Pro

130 135 140Thr Cys Pro Glu His Met Leu Val Asn Ser Gln Leu Leu Gly Thr Pro145 150 155 160Gly Ser Ser Gln Asn Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys Arg Met Thr Arg

165 170 175Phe Phe Thr Lys Leu Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln Cys Leu Lys Glu

180 185 190Thr Phe Glu Lys Leu Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser Cys Met Asn Gln

195 200 205Val Thr Val Ser Thr Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys Leu Ile Phe Lys

210 215 220Ile Asn Leu Val Glu Met Asp Glu Lys Ile Leu Val Asp Phe Arg Leu225 230 235 240Ser Lys Gly Asp Gly Tyr Asn

245(2)SEQ ID NO.：5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述 /desc＝“引物”(xi)序列描述：SEQ ID NO.：5：ACGTGGACAA ACTGGTTCAG G(2)SEQ ID NO.：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述 /desc＝“引物”(xi)序列描述：SEQ ID NO.：6：CTGATAGCCC AACTTCTCGA A(2)SEQ ID NO.：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述 /desc＝“引物”(xi)序列描述：SEQ ID NO.：7：GGCTCTGGGG AATCCTGGTG AATATAGTGC TGC(2)SEQ ID NO.：8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述 /desc＝“引物”(xi)序列描述：SEQ ID NO.：8：TCCCCTGAAA CTTGGTTTCC ACCAGATGAG(2)SEQ ID NO.：9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO.：9：GTTGAGACTC CATCATCAAG G(2)SEQ ID NO.：10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO.：10：TCTGGCTGGG AACTAGAGAA C

Claims

1.一种纯化和分离的编码人Chk1激酶的多核苷酸，该激酶的氨基酸序列陈述于SEQ ID NO.：2。

2.一种纯化和分离的编码小鼠Chk1激酶的多核苷酸，该激酶的氨基酸序列陈述于SEQ ID NO.：4。

3.权利要求1或2的多核苷酸，是一种DNA。

4.权利要求3的DNA，是一种cDNA。

5.权利要求3的DNA，是基因组DNA。

6.权利要求3的DNA，是一种全部或部分化学合成的DNA。

7.一种人Chk1 DNA，包含SEQ ID NO.：1所列出的DNA序列。

8.一种小鼠Chk1 DNA，包含SEQ ID NO.：3所列出的DNA序列。

9.权利要求3的DNA的RNA转录物。

10.一种DNA，编码全长的哺乳动物Chk1激酶，选自以下：

(a)一种DNA，在严格条件下与SEQ ID NO.：2 DNA的非编码链杂交；以及

(b)一种DNA，在严格条件下与SEQ ID NO.：4 DNA的非编码链杂交。

11.一种包含权利要求1，2，3或10的DNA的载体。

12.权利要求11的载体，其中所述DNA与一个表达控制DNA序列可操纵地连接。

13.一种宿主细胞，用权利要求1，2，3或10的DNA稳定地转化或转染，其转化或转染方式可使Chk1激酶在该宿主细胞中表达。

14.生产Chk1激酶的方法，该方法包括在适宜的营养培养基中生长权利要求11的宿主细胞及分离Chk1激酶。

15.一种纯化和分离的多肽，包含由SEQ ID NO.：2组成的人Chk1激酶氨基酸序列。

16.一种纯化和分离的多肽，包含由SEQ ID NO.：4组成的小鼠Chk1激酶氨基酸序列。

17.一种多肽或肽，能与哺乳动物Chk1激酶特异地结合。

18.权利要求17的多肽，是一种抗体。

19.权利要求18的抗体，是一种单克隆抗体。

20.一种生产权利要求19的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

21.一种鉴定化合物为哺乳动物Chk1激酶调节剂的方法，包括以下步骤：

a)在存在和不存在该化合物的情况下测定Chk1激酶活力；

b)比较步骤(a)中的激酶活力；以及

c)根据在存在和不存在该化合物的情况下观察到的Chk1激酶活力的差别鉴定该化合物为调节剂。

22.一种鉴定能抑制哺乳动物Chk1的化合物的方法，包括以下步骤：

a)在遗传变化细胞中表达哺乳动物Chk1，因而降低细胞对DNA损伤的敏感性，该敏感性是与基因变化有关联的；

b)在待测试的调节剂化合物存在和不存在的情况下，将步骤(a)的遗传变化细胞暴露于DNA损伤处理；

c)测量细胞对DNA损伤的敏感性；以及

d)将一种恢复细胞对DNA损伤的敏感性的化合物鉴定为Chk1活力的抑制剂。