CN1942480A - 与高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷相关的SNPs的鉴别 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含染色体区域的核酸分子，该区域促进或指示高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷，其中所述的核酸分子选自：(a)具有或包含SEQ IDNO：1核酸序列的核酸分子，其中所述的核酸具有一个或多个对USF1功能有影响的突变；(b)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的内含子7的3966位包含鸟嘌呤或腺嘌呤残基；和/或(c)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的外显子11的5205位包含胞嘧啶或胸腺嘧啶残基；其中所述的核分子在SEQ ID NO：1核酸分子的5′和/或3′末端延伸最大50000个核苷酸。本发明进一步涉及诊断组合物，该组合物包含编码USF1的核酸或其片断、此处公开的核酸分子、载体、本发明的引物或引物对或USF1的特异性抗体。最后，本发明涉及本发明的核酸分子在制备用于治疗高脂血症、血脂障碍、冠心病、II型糖尿病、代谢综合症、高血压或动脉硬化症的药用组合物中的用途。

Description

与高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷相关的SNPs的鉴别

技术领域

本发明涉及包含染色体区域的核酸分子，该区域促进或指示高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷，其中所述的核酸分子选自：(a)具有或包含SEQ ID NO：1核酸序列的核酸分子，其中所述的核酸具有一个或多个对USF1功能有影响的突变；(b)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的内含子7的3966位包含鸟嘌呤或腺嘌呤残基；和/或(c)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的外显子11的5205位包含胞嘧啶或胸腺嘧啶残基；其中所述的核分子在SEQ IDNO：1核酸分子的5′和/或3′末端延伸最大50000个核苷酸。本发明进一步涉及诊断组合物，该组合物包含编码USF1的核酸或其片断、此处公开的核酸分子、载体、本发明的引物或引物对或USF1的特异性抗体。最后，本发明涉及本发明核酸分子在制备用于治疗高脂血症、血脂障碍、冠心病、II型糖尿病、代谢综合症、高血压或动脉硬化症的药用组合物中的用途。

背景技术

本说明书各处引用了多种文献。这些文献的公开内容，包括制造商的手册和目录，在此引入作为参考。

家族性混合型高脂血症(FCHL)特征在于高血清总胆固醇水平(TC)、高甘油三酯水平(TG)，或两者兼具^1，2。最近，在31个芬兰FCHL家族⁴中鉴别出FCHL的第一个主要基因座在人染色体1q21-q23上。该发现在其它FCHL家族，更多的不同种群，得到重复。此外，在芬兰和荷兰^8-9的研究样本中，基因组范围的扫描已识别出一些其它假定的FCHL基因座。有趣地是，在许多研究中^10-14，包括芬兰人的研究¹⁵，将1q21区域的同一个标记物与II型糖尿病(T2DM)联系起来。在这些FCHL和T2DM研究中，获得的1q21连锁的证据不同，除基于人口和诊断不同外最可能反应了遗传不均一性。然而，重要的是FCHL的许多重要代谢特征，例如高甘油三酯血症和胰岛素抵抗，也代表了T2DM的特征部分。有趣的是，啮齿动物的混合型高脂血症基因座与小鼠染色体3的区域联系起来，可能与人1q21直系同源(参考文献16)。最近，潜在基因，硫氧还蛋白相互作用基因(TXNIP)受到鉴定，为人FCHL提供强位置候选者¹⁷。

如上文所指出，家族性混合型高血脂症(FCHL)特征在于高血清总胆固醇(TC)水平、高甘油三酯(TG)水平，或两者兼具^1，2。这种复合型紊乱是最普通的家族性高脂血症，其在西方人群中的患病率为1％至2％¹。自对约20％小于60岁的冠心病(CHD)患者中进行观察以来³，在动脉粥样硬化中FCHL成为了有力的遗传因素。尽管进行了很多的尝试来辨别潜在FCHL的作用机制，它的病因学仍未知。结果目前不可能诊断或治疗受累于家族性混合型高血脂症(FCHL)的患者。

发明内容

由上文看来，本发明根本的技术问题是提供可准确和方便诊断高脂血症和/或血脂障碍或糖代谢缺陷或这些病症的倾向的手段和方法。

利用权利要求书中描述的实施方案，可得到所述技术问题的解决方案。

因此，本发明涉及包含染色体区域的核酸分子，该区域促进或指示高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷，其中所述的核酸分子选自：(a)具有或包含SEQID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸具有一个或多个对USF1功能有影响的突变；(b)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的内含子7的3966位包含鸟嘌呤或腺嘌呤残基；和/或(c)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的外显子11的5205位包含胞嘧啶或胸腺嘧啶残基；其中所述的核分子在SEQ IDNO：1核酸分子的5′和/或3′末端延伸最大50000个核苷酸。在优选实施方案中，核酸分子在SEQ ID NO：1核酸分子的5′和/或3′末端延伸至多40000个核苷酸或至多25000个核苷酸或至多5000个核苷酸。

术语“高脂血症和血脂障碍”是指与高的清总胆固醇和/或甘油三酯水平，和高低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和/或载脂蛋白B和/或低血清高密度脂蛋白(HDL)胆固醇和/或小致密LDL相关的疾病。根据本发明，这些疾病包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)、家族性血脂障碍高血压(FDH)、高血压、冠心病和动脉粥样硬化。

根据本发明，术语“糖代谢缺陷”是指不耐受葡萄糖和胰岛素抵抗。因此，糖代谢缺陷可以是例如II型糖尿病(T2DM)和代谢综合症等疾病的指征。

术语“促进或指示高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷”是指SNPs和因此所发现的相应核酸分子是病症的指征并可能也是引起这些疾病的原因。因此，该术语必须要求所述位置是该病症的指征。在另一方面，所述的术语并不必要求包含SNP的特定位置是病症的原因或有助于病症。而该术语并不排除是任意一个或两个SNPs的成因作用或贡献作用。

命名为SEQ ID NO：1的核苷酸序列是5687bp的基因组核苷酸序列，代表以数据库登录号为RefSeq NM-007122保存的USF1，其是人USF1 mRNA的基因组序列，人USF1mRNA的相应序列为于2003年7月在UCSC Genome Browseron Human以登录号：＞hg16refGeneNM007122r ange＝chr1：158225833-158231519保存的序列。根据本发明的目的，由该核苷酸序列编码的多肽的活性或功能定义为“野生型USF1蛋白活性”。同样地，如果序列第3966位是腺嘌呤并且序列第5205位是胸腺嘧啶，SEQ ID NO：1可以理解为代表野生型USF1。USF1已知是转录因子，能够与称作E box的识别序列GACGTG结合，并能够调节基因的表达，这些基因例如载脂蛋白CIII(APOC3)、AII(APOA2)、APOE、激素敏感脂肪酶(LIPE)、脂肪酸合成酶(FAS)、葡萄糖激酶(GCK)、胰高血糖素受体(GCGR)、ATP结合盒(ATP-binding cassette)、亚科A(ABCA1)、肾素(REN)和血管紧张素原(AGT)。此外，已知USF1与细胞转录机制的其它因子相互作用，例如USF2。

如此处所指的术语“(聚)肽”可选择指的是多肽或(聚)多肽。多肽通常由最多30个氨基酸残基共价结合起来，而聚多肽(此处也称作“蛋白质”)包含31个或更多的氨基酸残基。

术语“作用于USF1功能的一种或多种突变”是指影响USF1功能的突变。本发明各处术语“功能”和“活性”可替换使用。由于USF1是转录因子，术语“USF1功能”是指它作为转录因子的活性，包括它与基因组DNA上它的靶识别序列的特异性、它的蛋白相互作用序列和它的调节或调控转录的能力。然而，重要的是，注意到也有USF1编码区域外的突变作用于USF1功能。例如，这些突变是在细胞中影响USF1转录量的突变(包括影响启动子活性的突变)或影响剪切或RNA转录的细胞内转运的突变。本发明也包含任意的这些突变。

术语“核酸分子”是指天然和非天然存在的核酸分子。非天然存在的核酸分子包括cDNA及衍生物例如PNA。

如本说明书各处所用的术语“包含SEQ ID NO：核酸序列的核酸分子[…]”是指比所指的SEQ ID NO核酸分子长至少1个核苷酸的核酸分子。同时，这些核酸分子在本发明所指定核酸分子(如SEQ ID NO：1)的5′和/或3′末端延伸最大50000个核苷。

许多先前在哺乳动物上的研究试图鉴别导致家族性混合型高脂血症或与之相关的染色体区域。啮齿动物的家族性混合型高脂血症基因座与小鼠3号染色体联系起来，可能与人1q21直系同源(参考文献16)。最近，潜在基因，硫氧还蛋白相互作用基因(TXNIP)受到鉴定，为人FCHL提供强位置候选者17。令人惊讶地，本发明所公开的结果显示在人USF1的内含子7和外显子11上分别有两个单核苷酸多态性与高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷相关。所公开的多态性可供用于筛选具有或倾向高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的个体。

在此我们研究了非编码SNPs，据报道其特征为与FCHL和代谢综合症的一些组成特点有关的等位基因(Ng，M.C.Y等人，递交的手稿)。我们观察到含有与SNP usf1s2最相关的DNA序列在物种间是保守的，并与核抽提物蛋白结合，如在EMSA试验中产生泳动率变动的能力所显示的。除了该体外证据，我们能看见在19个个体脂肪组织中USF1下游基因的不同表达，这取决于它们是否启动SNP usf1s2的风险或非风险等位基因。

转录因子与非常特异的核苷酸序列结合，这些序列的特征是4-6bp的短核心序列，其侧面具可变数目的简并核甘酸。在内含子7usf1s2附近的序列很好地符合这些标准，显示完美的物种间的5bp保守性。我们EMSA试验强烈地支持关于usf1s2周围序列真实地代表功能元件的发现。我们早先报道了包含该保守DNA基序的268bp片断增强报告基因的表达，并仅在正确的方向上6A。这说明该内含序列强烈的顺式调节作用。对我们的知识而言，这是第一次证实USF1基因的调控元件。EMSA是纯粹的体外试验，其中进行研究的DNA本质上是裸露的，并且在其它的正常细胞环境和所有它的转录装置和宿主的其它调控元件不存在下进行测试。发现这些相互作用元件中的一些具有明显的距离，不可能存在于EMSA中所用的探针。在该体外试验中，任意组织特异性作用也将被完全破坏。然而，我们来自于脂肪中USF1调控基因表达的数据将显示在这些基因表达模式上等位基因的特异性不同，并且将意味着在USF1功能上等位基因特异性的不同。

我们分析了在表达中USF1下游基因可能的变化。由于基因的转录调控通常是相关的多种转录因子和增强子/抑制子(它们取决于组织和不同的激素/环境信号)的良好调谐结果，不能期望任何单因素的变化将产生引人注目的效果。然而，我们发现取决于SNP usf1s2的特异性等位基因，USF-1调节基因APOE(参考文献13A)、ABCA1(参考文献14A)和AGT(参考文献15A)受到明显不同地调控。三种基因都与脂质代谢障碍表型高度相关。通过介导磷脂和胆固醇从巨噬细胞到新生HDL颗粒的溢出^22A，ABCA1涉及胆固醇逆向转运的第一步。ABCA1功能等位基因的缺失显示导致低α-脂蛋白血症(Tangier′sdisease)和家族性低α脂蛋白血病^23A，特征为非常低的HDL水平。其中，通过调节肾吸收水的量，AGT是控制血压和血容量的必需成分。经肝中LDL受体相关蛋白(LRP)介导的细胞内吞作用^24A-26A，APOE有助于从循环系统中去除乳糜微粒和VLDL残余物。APOE对LDL受体具有高度亲和性，并且APOE过度表达导致血浆低密度脂蛋白的显著下降^27A。因此APOE的下降使得富含胆固醇的乳糜微粒和VLDL残余物在循环系统中的累积和驻留时间增加-高致动脉粥样化表型^24A，28A。APOE缺陷也显示导致伴有从血浆中伤害性清除胆固醇和甘油三酯的家族性异常β脂蛋白血症^29A，30A。最近的证据表明APOE在细胞内脂代谢中也起重要的作用。从富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)中APOE的再循环对HDL代谢和胆固醇流出是重要的^31A。在此处显示了在APOE表达上usf1s2风险等位基因显而易见的不利作用，正好符合我们更早时关于与FCHL相关USF1和成分特征的发现^6A。

ACACA的表达与胰岛素水平的相互关系重复了更早时的发现^18A，但另外揭示在两个USF1等位单元型之间在相互关系程度上的重大不同。这种相互关系在保护性单元型组之间尤其强烈。鉴于USF1在介导代谢基因反应方面的作用是众所周知的，该反应是针对胰岛素和葡萄糖水平上的变化^16A，这种对胰岛素不同的转录反应非常令人感兴趣。由于在长链脂肪酸生物合成中其酶催化限速步骤，ACACA在全部脂代谢中占据重要位置^32A。这些发现表明在复杂分子通路中USF1作用导致在FCHL和代谢综合症患者组织中稳定建立胰岛素抵抗。

对USF1区域基因的研究没有显示usf1s2等位基因对它们表达的任何影响，表明作用被包含于USF1基因中。然而，在usf1s2携带不同等位基因的组别之间，F11R的3’附近小段未知EST(AW995043)存在不同表达。ESTs通常代表转录基因的片断，但相比于F11R，由于AW995043受到从相反链的转录，并且没有与任何已知的减切变体重叠，似乎它不是其中的一部分。该EST的不同表达可以是异常的，或它可能代表具有尚未知功能的小的调节RNA分子。在优选实施方案中，本发明的核酸分子是基因组DNA。本发明的这个优选实施方案反应了通常分析是在来自所研究个体的体液、细胞或组织分离的基因组DNA基础上进行的事实。在本发明核酸分子另外优选的实施方案中所述的基因组DNA是基因的一部分。根据本发明，相对于USF1基因，优选至少在3966位包含SNP1的USF1基因内含子7和/或在5205位包含SNP2基因的USF1外显子11受到分析。本发明的重要方面是USF1基因的3966位的鸟嘌呤残基显示与疾病相关等位基因的存在，而USF1基因同一位置腺嘌呤残基是健康等位基因的指征。同样，USF1基因的5205位的胞嘧啶残基显示与疾病相关等位基因的存在，而雄腺嘧啶残基是健康等位基因的指征。

本发明也涉及具有至少20个核苷酸的本发明核苷酸片断，其中所述的片断包括SEQ ID NO：1的3966位和/或5205位的核苷酸。除(半)合成来源外，本发明的核苷酸可以是天然来源。因此，例如片断可以是根据有机化学常规试验设计合成的核酸分子。重要的是，本发明的核苷酸片断包括USF1基因的内含子7的3966位核苷酸或USF1基因的外显子11的5205位核苷酸在这些位置，片断可以是野生型核苷酸或促进或指示高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的核苷酸(也称作“突变”或“疾病相关”序列)。所以，例如本发明的片断可用于区别野生型和突变型序列的试验中。

本发明的片断进一步优选由至少17个核苷酸组成，更优选至少20个核苷酸，以及最优选至少25个核苷酸例如30个核苷酸。然而，优选片断在长度上多达100bp、多达200bp、多达300bp、多达400bp、多达500bp、多达600bp、多达700bp、多达800bp、多达900bp或多达1000bp。

此外，本发明涉及与本发明核酸分子互补的核酸分子以及长度至少为17或至少为20核苷酸的核酸分子。然而，优选互补核酸分子在长度上多达100bp、多达200bp、多达300bp、多达400bp、多达500bp、多达600bp、多达700bp、多达800bp、多达900bp或多达1000bp。

包含至少15或至少20个核苷酸，并且至少覆盖USF1基因的3966位或5205位的本发明实施方案尤其适用于杂交试验中所述位置的遗传方案的分析。因此，例如与野生型序列或与有助于或指示高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的变体精确互补，15mer可用于变体多态性间的区别。这是因为如果选择合适的杂交和冲洗条件，由可检测标记所标记的核酸分子并不与所分析的样本DNA精确互补，将不会引起可检测信号。

在这方面，重要的是注意到除了互补核酸分子，本发明的核酸分子及其片断可以被可检测地标记。可检测标记包括放射性标记(例如³H或³²P)或荧光标记。核酸的标记是本领域所充分了解的，并描述于例如Sambrook等人，“Molecular Cloning，A LaboratoryManual”；ISBN：0879695765，CSHPress，Cold Spring Harbor，2001。

优选在严格或高度严格的条件下进行杂交。对本领域技术人员根据常规试验设计，杂交的“严格或高度严格的条件”是众所周知的并能建立的。对于每个序列合适的严格条件可建立在众所周知的参数上，例如温度、核酸分子的组成、盐情况等：参见例如Sambrook等人，″Molecular Cloning，A LaboratoryManual″；ISBN：0879695765，CSH Press，Cold Spring Harbor，2001和更早的版本Sambrook等人，″Molecular Cloning，A LaboratoryManual″；CSHPress，Cold Spring Harbor，1989或Higgins和Hames(eds.)，″Nucleic acidhybridization，a practical approach″，IRL Press，Oxford 1985(reference54)，尤其参见章节″Hybridization Strategy″by Britten & Davidson，3至15。典型的条件(高度严格)包括在65℃0.5×SSC和0.1％SDS下杂交或在42℃50％甲酰胺4×SSC和0.1％SDS下杂交。杂交后通常冲洗以去除非特异性信号后进行。冲洗条件包括如65℃、0.2×SSC和0.1％SDS或2×SSC和0.1％SDS或0.3×SSC和0.1％SDS在25℃-65℃等条件。杂交也可在较低严格度的条件下进行。这些杂交条件的参数以更多细节描述于Sambrook等人，″MolecularCloning，A LaboratoryManual″；ISBN：0879695765，CSH Press，Cold SpringHarbor，2001。非限定性低严格度杂交条件的实例是在35％甲酰氨、5倍SSC、50mM Tris-HC(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％聚蔗糖、0.2％BSA、100mg/ml变性鲑鱼精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖在40摄氏度下杂交，随后在50摄氏度下以2倍SSC、25mM Tris-HCI(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS一次或多次冲洗。其它可以使用的低严格度条件是本领域众所周知的(例如用于物种间杂交)。参见例如Ausubel等人(eds.)，1993，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley & Sons.NY和Kriegler，1990，GENETRANSFER AND EXPRESSION，A LABORATORY MANUAL，Stockton Press，NY；Shilo和Weinberg，1981，Proc Natl Acad Sci USA 78：6789-6792。

另外，本发明涉及包含如本文上述核苷酸分子的载体。该载体尤其是包含本发明核酸载体的遗传工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒或噬菌体。所述的载体优选是表达载体和/或基因转移或靶载体。得自病毒的表达载体，例如逆转录酶病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳突淋瘤病毒，可将本发明核酸分子传输至靶细胞种群中。可使用本领域技术人员公认的方法来构建重组病毒载体；参见例如Sambrook等人，loc.Cit和A-usuel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWileyInterscience，N.Y.(2001)描述的技术。做为选择，本发明的核酸分子和载体可在用于传输至靶细胞的脂质体中重新受到构建含有本发明核酸分子的载体可利用公知的方法转移至宿主细胞中，该方法根据宿主细胞的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而例如磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔可用于其它细胞宿主；参见前面的Sambrook。

这些载体可进一步包含例如标记基因的基因，其考虑到在合适的宿主细胞中和合适的条件下选择所述的载体。优选，本发明的核酸分子有效地连接于表达调控序列，该序列允许在原核或真核细胞中表达。所述聚核苷酸的表达包括将聚核苷酸转录为可翻译的mRNA。确保在真核细胞(优选哺乳动物细胞)中表达的调控元件是本领域技术人员所公知的。它们通常包括确保转录开始的调控序列，和任选的确保转录终止和转录稳定的poly-A信号，和/或进一步增强所述聚核苷酸表达的内含子。其它的调控元件可包括转录增强子和翻译增强子和/或天然相关或异源启动子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，以及允许真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-或球蛋白内含子。除了负责转录起始的元件，这样的调控元件也包含聚核苷酸下游的转录终止信号，例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。任选地，异源序列可编码包含C-或N-末端等同多肽(Identification peptide)的融合蛋白，该多肽赋予所期望的特性，例如所表达重组产物的稳定化或简化纯化。在该背景下，合适的表达载体是本领域所公知的，例如Okayama-BergcDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3、Echo^TM克隆系统(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCO BRL)或pRevTet-On/pRevTet-Off或pCl(Promega)。

表达调控序列优选是能够转化或转染真核宿主细胞载体中的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的调控序列。

如上所述，本发明的载体也可是转基因载体或基因靶载体。基于利用体外或体内技术将治疗基因引入细胞的基因治疗，是转基因最重要的应用之一。用于体外或体内基因治疗的合适载体和方法描述于文献中，并为本领域技术人员所熟知；参见例如Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Wang，Nature Medicine 2(1996)，714-716；WO94/29469；WO97/00957；Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，635-640或Kay等人(2001)Nature Medicine，7，33-40)和其中引用的参考文献。本发明的聚核苷酸和载体可设计为直接引入或经脂质体或病毒(例如腺病毒、逆转录病毒)载体引入细胞。优选，所述的细胞是胚系细胞、胚细胞或卵细胞或从它们衍生的，最优选所述的细胞是干细胞。考虑基因治疗仅用野生型核酸分子。

本发明也涉及引物或引物对，其中在严格条件下引物或引物对与包含SEQID NO：1第3966和/或5205位核苷酸或它们的互补链的本发明核酸分子进行杂交。在优选实施方案中，所述的引物在USF1序列的3966位相应位置具有腺嘌呤或鸟嘌呤残基。在另一个优选实施方案中，所述的引物在USF1序列的5205位相应位置具有胞嘧啶或胸腺嘧啶残基。引物可结合于DNA双链的编码(+)链或非编码(-)链。

优选，本发明的引物具有至少14个核苷酸的长度，例如17、20或21个核苷酸。事实上，在一个实施方案中引物的靶序列位于SNP的3′端，以确保该引物实际上利于序列分析，即延长的引物序列事实上包含SNP。例如，当进行PCR反应时，通常涉及两种引物，其中一个引物结合于+链SNP的3′端，以及另一个引物结合于-链SNP的3′端。

在一个实施方案中，引物实际上结合于SNP位置。结果，当在严格条件下结合时，由于仅在引物序列和靶序列完全互补下发生结合，这些引物可用于区别不同的多态性变体。进一步优选最大长度24个核苷酸的引物。然而，在特定情形下，可优选使用最大长度30至35个核苷酸的引物。在合适条件下，与包含3966位或525位核苷酸的基因组序列杂交或不杂交的引物与合适的检测方法-如增长反应或扩增反应偶联起来，可用来区分多型变体，并且然后得出关于如受研究个体的高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的倾向的结论。本发明展望两种类型的引物/引物对。一种类型与包含突变体的序列杂交，即与疾病相关序列。换句话说，引物的一个核苷酸与3966位的鸟嘌呤残基(或互补链的胞嘧啶残基)或与5205位的胸腺嘧啶残基(或互补链的腺嘌呤残基)配对。另一种类型的引物与野生型序列精确互补。由于优选所选杂交条件足够严格，将例如与突变序列精确互补的引物同野生型等位基因接触，由于形成错配，将不产生有效的杂交。冲洗后，由于去除引物，没有检测到信号。

此外，本发明涉及用如本文上述的本发明载体转化的非人类宿主。宿主可携带突变体或野生型序列。在育种上等，宿主可以是一种或两种SNP的杂合或纯合。

本发明的宿主可携带本发明的瞬时或稳定地整合于基因组的载体。产生本发明非人类宿主的方法是本领域公知的。例如，描述于Sambrook等人，loc.cit.的常规转染方案可用于产生转化细菌(例如大肠杆菌)或转化酵母。例如，本发明的非人类宿主可用于阐明高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的发作。

在本发明的优选实施方案中，非人类宿主是细菌、酵母细胞、昆虫细胞真菌细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、转基因动物或转基因植物。

鉴于大肠杆菌是优选的细菌，优选的酵母细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。优选真菌细胞是曲霉(Aspergillus)细胞，以及优选昆虫细胞包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。优选哺乳动物细胞是显示表达USF1转录因子的CHO细胞、结肠癌和肝癌细胞系。然而，伴有非常低USF1表达的细胞系，包括HeLa细胞等或成纤维细胞，也可以尤其用于特定试验。

用于产生转基因非人类动物的方法，例如转基因小鼠，包括将前面提到的聚核苷酸或靶载体引入生殖细胞、胚胎细胞、干细胞或卵细胞或它们的衍生细胞。根据此处描述的本发明筛选方法可使用非人类动物。按照描述于例如A.L.JoynerEd.，Gene Targeting，A Practical Approach(1993)，OxfordUniversity Press.的方法，进行转基因胚胎的生产和筛选。使用带有合适互补核酸分子的Southern印迹法(Southern blot)对胚胎的胚膜DNA进行分析；参见上文。制备转基因非人类动物的一般方法在本领域有描述，参见例如WO94/24274。为了制备转基因非人类生物(其包括同源染色体靶向非人类动物)，优选胚胎干细胞(ES细胞)。鼠ES细胞可用于同源染色体基因打靶，例如基本在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A PracticalApproach.E.J.Robertson，ed.(Oxford：IRL Press)，p.71-112)中描述(Robertson，E.J.(1987)的生长于有丝分裂不活跃的SNL76/7细胞进食层的AB-1系(McMahon and Bradley，Cell 62：1073-1085(1990))。其它合适的ES细胞系包括，但不限于，E14细胞系(Hooper等人，Nature 326：292-295(1987))、D3细胞系(Doetschman等人，J.Embryo.Exp.Morph.87：27-45(1985))、CCE细胞系(Robertson等人，Nature 323：445-448(1986))、AK-7细胞系(Zhuang等人，Cell 77：875-884(1994))。从含有特定靶突变的ES细胞产生小鼠系的成功取决于ES细胞的多能性(即，一旦注射入形成胚胎的宿主中，例如胚泡或桑椹胚，它们参与胚胎发生和有助于胚原基细胞发育为所得动物的能力)。含有所注射的ES细胞的胚泡允许在非人类雌性动物的假孕子宫中发育，并以嵌合体小鼠出生。因为细胞内含有期望的核甘酸分子，作为结果而产生的转基因鼠是嵌合体，通过PCR和Southern印迹法对其后代尾活组织DNA检查，将鼠回交和筛选正确靶基因的出现，以便识别转基因小鼠对本发明核酸分子的杂合性。

例如，转基因非人类动物可以是转基因小鼠、大鼠、仑鼠、狗、猴子(类人猿)、兔、猪或牛。优选所述的转基因非人类动物是小鼠。尤其本发明的转基因动物有利于研究本发明核酸和载体的表型表达/结果。而且，本发明的转基因动物有利于研究USF1基因的发育表达，以及该基因在高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的发病作用，例如在啮齿动物肠中。此外，考虑本发明的非人类转基因动物可用于测试治疗药物/组合物或其它可能的用于高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的治疗方法。

本发明也涉及包含USF1或其片断、编码USF1或其片断的核酸分子或USF1的特异性抗体的药用组合物。

本发明药用组合物的组分可与药用可接受载体和/或稀释剂和/或赋形剂组合。优选，USF1是指能够减轻疾病症状的任意USF1。通常，USF1是野生型。然而，特定情形下其也可施用具有一个或多个点突变、插入、删除等并显示增加或降低的功能或活性的突变USF1。本发明也包括化学修饰的分子，其改善多肽的摄取或稳定性。

合适的药用载体的实例是本领域所公知的，并包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂、例如水包油型乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含这些载体的组合物可按照公知的常规方法调制。这些药用组合物可以以合适的剂量给受治疗者施用。合适组合物的施用可利用不同的方式来实现例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、皮内、鼻内或支气管内施用。剂量方案由主治医生和临床因素决定。由于在医学领域众所周知，对任意一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康和同时施用的其它药物。例如，通常剂量为0.001至1000μg用于表达或抑制表达的核酸，然而，可以考虑剂量低于或高于该试验范围，尤其考虑上面提到的因素。剂量可以变化，但优选用于DNA静脉内施用的剂量是约10⁶-10¹²DNA分子拷贝。通过定期评估，可监测进展。本发明的组合物可局部施用或全身施用。通常是肠胃外施用，如静脉内；DNA也可直接施用于靶点，例如通过基因枪技术传输至内部或外部的靶点或通过导管至动脉位点。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、Ringer′s右旋糖、右旋糖和氯化钠、Ringer′s乳酸盐或脂肪油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于Ringer′s右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其它添加剂例如，如抗菌剂、抗氧剂、螯合剂和惰性气体等。

此外，本发明涉及包含编码USF1或其片断的核酸分子、如本文上述的核酸分子，如本文上述的载体、如本文上述的引物或引物对或USF1的特异性抗体的诊断组合物。

诊断组合物用于评估关于他或她发展为高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的倾向或关于急性症状的遗传学状态。诊断组合物的各种可能组分包装于一个或多个玻璃瓶中、溶剂中和其它如冻干形式。如果溶于溶剂中，优选诊断组合物冷却至至少+8℃至+4℃。在其它例子中优选冷冻。

本发明也涉及测试高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，包括分析得自预期患者或得自怀疑携带该倾向的个体的样本，以确定USF1基因野生型或变体等位基因的存在。优选，所述的变体包括在USF1基因3966位或5205位纯合或杂合状态的SNP。在不同实施方案中，可检测野生型序列或突变序列的存在。根据本发明，USF1基因3966位鸟嘌呤显示与疾病相关等位基因的存在，其中在USF1基因相同位置的腺嘌呤残基是健康等位基因的指征。同样的，USF1基因5205位胞嘧啶显示与疾病相关等位基因的存在，其中在USF1基因相同位置的胸腺嘧啶残基是健康等位基因的指征。

本发明的方法用于检测所述患者的遗传结构，以及对所述患者遭受的病症是否是高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷得出合适的结论。作为选择，其可评估一个不受累于病症的人是否携带高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的倾向。关于USF1基因外显子11的5205位，如果只胞嘧啶被发现为纯合或杂合状态，病症将被确诊为高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷或相应的倾向。在另一方面，如果胸腺嘧啶处于纯合状态，那么可得出结论：病人所患有的病症不涉及高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷，并且进一步，患者将不携带发展为该病症的倾向。情况是类似的，并且基本相同的结论可应用于SNP3966位上的分析。关于USF1基因内含子7的3966位，如果只鸟嘌呤被发现为纯合或杂合状态，病症将被确诊为高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷或相应倾向。在另一方面，如果腺嘌呤处于纯合状态，那么可得出结论：病人所患有的病症不涉及高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷，并且进一步，患者将不携带发展为该病症的倾向。

在本发明方法的优选实施方案中，所述的测试包含将本文上述的互补核酸(其与有助于或显示高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的核酸分子互补)或本文上述的核酸(其与(高度)严格条件下作为探针的野生型序列互补)与包含于所述样本中的核酸分子杂交，并检测所述的杂交，其中所述的互补核苷酸分子包括含有SNP位置的序列。

此外，基于所使用的核酸探针，可检测野生型序列或突变序列(即有助于或显示高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷的序列)。可以理解的是，对杂交条件进行选择，这样与野生型序列互补的核酸分子将基本不与或不与野生型序列杂交。同样地，与突变序列互补的核酸分子将不与或基本不与野生型序列杂交。在本发明杂交方法中，为了在得自纯合或杂合基因型结果之间进行区分，例如可在杂交后监测/检测相关检测信号的强度(strength)/强度(intensity)。在本发明杂交方法中，为了在野生型纯合子、杂合子和/或突变纯合子等位基因之间进行区分，分析中将包括相应基因型样本的内部控制。

在进一步的优选方案中，本发明的方法进一步包含用限制性核酸内切酶消化所述的杂交产物或用限制性核酸内切酶使所述的杂交体经受消化，以及分析所述的消化产物。

本发明的优选实施方案允许利用常规方法，区分有效杂交和非有效杂交。例如，如果与3966位或5205位相邻的DNA序列包含限制性核酸内切酶位点，利用合适的限制性酶作用于有效杂交体，杂交产物是可被清除的，而缺乏杂交体将没有双链产物产生或不包含可识别的限制性位点，以及因此将不可被清除。例如，通过使用Webcutter程序可发现合适的限制性酶。利用常规方法可达到消化产物分析的结果，例如利用凝胶电泳，其可任选地与含有如溴化乙锭的核酸染色法组合。也可以考虑与进一步的技术组合例如Southern印迹法(Southern blot)。

例如利用抗DNA双链抗体或使用标记过的寡核苷酸，可达得到多数杂交体检测的结果。可将本发明的方法与印迹技术一起方便地使用，例如Southern印迹法或Northern印迹法或相关技术。例如利用标准实验方案可实现标记，并且包括用放射性标记物、荧光、磷光、化学发光、酶标记等。指示物可位于核酸分子的5′和/或3′末端或位于内部位置。优选的指示物包括，但不限于，荧光染料，例如羧基荧光素(FAM)和6-羧基-X-罗丹明(ROX)、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、放射性标记，例如³²P、³⁵S、³H等。识别物也可是两阶段系统，其中探针与具有高亲和性结合伴侣的生物素、半抗原等相结合，例如亲和素、特异性抗体等，其中结合伴侣与可检测标记物结合。

根据上文，本发明方法中其它优选实施方案，所述探针是可检测标记物，例如利用本文上述的方法和标记物。

仍在本发明方法其它优选实施方案中，所述的测试包括测定本文上述核酸分子至少一部分的核酸序列，所述的部分包括SNP位置。根据常规试验方案，例如Sanger或Maxam/Gilbert试验方案(参见Sambrook等人，loc.cit.，用于进一步指导)，可实现核酸分子的测定。

在本发明方法进一步优选实施方案中，利用固相微测序法可实现对核酸序列的测定。固相微测序法是基于在溶液中对野生型和突变核苷酸的的定量分析。首先，利用带有一个生物素化的和非生物素化的引物通过PCR扩增含有突变的基因组区，其中生物素化引物吸附于抗生蛋白链菌素(SA)包被的平板。PCR产物变性为单链形式，使得微测序引物恰好在突变位点之前结合于该链。氚(H³)或荧光标记的突变型和野生型核苷酸与非标记dNTPs一起加入微测序反应液，并且使用Taq聚合酶测序。结果基于反应液中野生型和突变型核苷酸的量，利用β计数器或荧光器在反应液中测量，并以R比率来表示。也参见Syvanen AC、Sajantila A、Lukka M；Am J Hum Genet 1993：52，46-59和Suomalainen A和Syvanen AC.Methods Mol Biol 1996；65：73-79。

本发明方法的优选实施方案进一步包含，在测定所述的核酸分子序列前，扩增所述核酸分子至少所述部分。优选，通过聚合酶链反应实现扩增。也可使用其它的扩增方法例如连接酶链反应。

在本发明方法的优选实施方案中，所述的测试包括进行扩增反应，其中在所述的扩增反应中，所利用的引物至少一个是如此处描述的引物或属于如此处描述的引物对，包括多扩增产物的含量测定。在该实施方案中，取决于研究者/医生所希望获得的信息，可使用与野生型或突变序列杂交的引物。在特别优选的实施方案中，至少引物之一实际上结合于SNP位置。结果，当在严格条件下进行结合时，这些引物用于区分不同的多态性变体，因为只有当引物序列与靶序列完全互补时，才发生结合。

如果所述的靶序列携带与用于杂交的引物精确互补的序列，本发明的方法将导致仅靶序列的扩增。这是因为在优选(高度)严格条件下，寡核苷酸引物不与野生型/突变序列杂交-取决于所使用的引物类型-(用没有获得扩增产物的序列)但仅与精确匹配的序列杂交。当然，可使用与SNP杂交的引物对的组合。既然这样，对所期望的扩增产物(其可以是无、一个、两个、三个或四个扩增产物，如果对每个部位第二次、无差异引物是相同的)的分析将提供关于3966位合5205位的遗传学状态信息。

在本发明方法的优选实施方案中，实现所述的扩增，或所述扩增是聚合酶链反应(PCR)。在本领域PCR已被稳定建立。根据本发明，所用的典型条件包括例如在50μl容积中总共35次循环，其中在93℃变性3分钟，55℃退火30秒，72℃延伸75秒，并且最后72℃延伸10分钟。

本发明进一步涉及测试高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，包括分析得自人的样本以求所述样本中(a)USF1、(b)ABCA1、(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E的量。利用任意合适的方法可测定USF1的量。优选，利用将样本(即包含于样本的USF1)与抗体或适体或它们的衍生物(其对(a)USF1、(b)ABCA1、(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E有特异性)接触来测定USF1的量。例如，含有USF1的样本可利用Western blot或RIA试验来分析。在该背景下，相比于纯合野生型对照样本(包含两个持续的等位基因)用于本发明抗原存在的较弱染色指示杂合野生型(一个倾向型等位基因和一个疾病相关等位基因)，其中如果使用合适的抗体，可希望纯合疾病状态不显色或减少显色。优选，当对应于所有三种可能的等位基因组合的对照样本作为内部对照存在时，可实施本发明。用与野生型序列具有特异性或对突变序列有特异性的抗体或适体等来进行测试。此外，结合测试涉及标准技术的使用，例如ELISAs，参见例如Harlow和Lane⁵³，loc.cit.。在本发明各处所使用的术语“抗体”是指单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或它们的片断。优选抗体对USF1或野生型或疾病相关USF1具有特异性。抗体可以是双特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、抗体片断，例如Fab、F(ab)₂′，、Fv或scFv片断等，或其任意化学修饰衍生物(所有的以术语“抗体”来包含)。可制备单克隆抗体，例如利用最早描述于Kohler和Milstein，Nature 256(1975)，495，和Galfre，Meth.Enzymol.73(1981)，3的技术，其包含将小鼠骨髓瘤细胞和来自免疫的哺乳动物的脾细胞融合，加上本领域所研发的技术修改。可使用本发明所描述的任意标记物来标记抗体。

在本发明方法的优选实施方案中，所述的抗体或适体受到可检测的标记。其中优选用³H或³²P或荧光标记物放射活性地标记适体，抗体可用相应的方式标记(用¹³¹I作为优选放射标记)或用标签(tag)例如His标签FLAG标签或myc标签来标记。

在本发明方法的进一步优选实施方案中，测试是免疫试验。

本发明进也涉及测试高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，包括分析得自人样本的编码(a)USF1、(b)ABCA1、(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E的RNA的量。可按照本领域技术人员公知的任意方法(例如印记分析)或此处描述的方法进行测试。

在本发明方法的其它优选实施方案中，所述的样品是血、血清、血浆、胎组织、唾液、尿、粘膜组织、粘液、阴道组织、得自阴道的胎组织、皮肤、头发、头发毛囊或其它人体组织。

在本发明方法另外的优选实施方案中，来自所述样品的所述核酸分子固定于固体支撑物。

将核酸分子固定于固体支撑物将使得测试分析易于处理，并且进一步的至少一些固体支撑物(例如芯片、硅薄膜或微滴定板)允许同时分析更大量的样本。理想的，固体支撑物允许自动测试使用，例如机器人装置。

在本发明方法特别优选的实施方案中，所述的固体支撑物是芯片、硅薄膜、珠子或微滴定板。

本发明的方法可在离体(ex vivo)、体外(in vitro)或体内(in vivo)进行。

本发明也涉及编码USF1的核酸分子、如本文上述的核酸分子或USF1多肽在分析高脂血症、血脂障碍和/或糖代谢缺陷中的用途。核酸分子同时允许对病症缺乏或病症倾向进行分析，如上文所详细描述的。在特定情形下，可能使用USF1多肽用于测试。例如，这可能发生，当USF1的表达导致对USF1的自身免疫反应。在这样情形下，通过使用USF1多肽，可用检测直接对抗USF1的抗体来监视患者。例如这些测定可基于western blot技术或进行(放射性)免疫沉淀。

此外，本发明涉及USF1或其片断、编码USF1和/或包含至少USF1内含子7和/或外显子11的野生型序列的核酸分子在制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)和/或家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途。本发明中提及的任意疾病可通过给患者施用足以改善疾病症状的数量和质量的USF1来治疗。例如如果疾病症状是由患者USF1的量减少造成，给患者施用USF1将补偿患者减少的USF1。USF1可以以这样提供给患者，即作为多肽。做为选择，可施用编码USF1的核酸分子。优选，USF1是全长野生型聚蛋白。然而，在特定情形下可施用具有一个或多个点突变、插入、删除等并显示增加或减少的活性或功能的突变型USF1。根据本发明也包含改善多肽摄取或稳定性的化学修饰分子。与本发明载体和此处同样应用有关，上文讨论了基因治疗方法。值得注意的是，根据本发明，如上文所定义的核酸分子片断可应用于基因治疗方法。所述的片断包含USF1基因在3966位或5205位的核苷酸。优选，所述片断包含至少200，至少300，至少400和最优选至少500个核苷酸。在本发明用途的优选实施方案中，所述的基因治疗治疗或预防高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷。

本发明涉及在一个或多个容器中的包含本发明核酸分子、引物/引物对和/或载体的试剂盒。

本发明也涉及USF1表达抑制剂在制备用于制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)和/或家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途，其中所述的抑制剂是(a)包含核苷酸序列的siRNA或反义RNA分子，该核苷酸序列与USF1基因转录区互补，或(b)与USF基因具有特异性的抗体、适体或小抑制分子。

本发明公开的抑制剂可在体内或体外使用。在本发明的一个实施方案中，从表达盒(expression cassette)中表达抑制性RNA分子、适体和抗体。例如该表达盒可用于产生表达此处公开的siRNA的稳定细胞系。例如稳定的细胞系可基于干细胞，干细胞可从需要治疗本发明提及的疾病的患者获得。这些稳定的细胞系可重新输入患者中。在本发明的另一个实施方案中，从病毒载体中表达siRNA。siRNA的表达将导致特定靶基因的下调。

如此处所用，术语“siRNA”是指“短的干扰RNA”。在RNA干扰中，小的干扰RNAs(siRNA)以序列特异性方式与靶mRNA结合，促进它的降解，并因此阻止所编码蛋白质的翻译。例如可通过使用亲脂试剂(它们之中Oligofectamine^TM和Transit-TKO^TM)和也利用电穿孔来获得带有siRNA的转染细胞。

在哺乳动物细胞，同样在人细胞中，小干扰RNA或短发夹RNA稳定表达的方法对本领域技术人员是公知的，并且描述于例如，Paul等人2002(NatureBiotechnology 20：505-508)、Brummelkamp等人2002(Science 296：550-553)、Sui等人2002(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：5515-5520)、Yu等人2002(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：6047-6052)、Lee等人2002(Nature Biotechnology 20：500-505)、Xia等人2002(NatureBiotechnology 20：1006-1010)。通过一些研究已经显示通过设计于疾病相关的突变等位基因的特异性靶的siRNA，并因此选择性沉默突变基因的表达，RNAi方法适合研发为遗传疾病的可能疗法(Miller等人2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：7195-7200；Gonzalez-Alegre等人，2003，Ann.Neurol.53：781-787)。

SiRNA分子基本上是双链的，并且可包含3′或5′悬突。它们也可包含与靶基因不同或基本相同的序列，但这些序列必需位于等同序列的外部。同一性或基本同一性序列至少14个，并更优选至少19个核苷酸长。优选不超过23个核苷酸。任选，siRNA包含两个同一性或基本同一性区域，该区由一非同一性区域点缀。术语“基本同一性”是指具有在作用于靶向mRNA的siRNA的有意义链上一个或两个错配，或在同一性区域中相对于靶向mRNA错配超过siRNA总长的10-15％的区域。所述的错配可能是核苷酸取代、加入、删除或复制等的结果。长于23但不超过40bp的dsDNA也包含三或四个错配。

siRNA对靶向mRNA的干扰具有的作用是转录/翻译至少下降50％，优选至少75％，更优选至少90％，仍更有优选至少95％，例如至少98％和最优选至少99％。

术语“小分子抑制剂”或“小分子化合物”是指具有相对分子量不超过1000D的化合物，优选不超过500D。其可是有机或无机性质。大量商业上可获得的小分子文库，是本领域所公知的。因此，例如小分子抑制剂可以是包含于这些文库的任意化合物或来自包含于这些文库的化合物的修饰化合物。优选，这些抑制剂与靶向蛋白以足够的特异性结合，其中足够的特异性是指优选分离常数(Kd)低于500nM，更优选低于200nM，仍更优选低于50nM，甚至更优选低于10nM以及最优选低于1nM。

术语“反意核酸分子”是指能用于控制基因表达的核酸分子。通过反意DNA或RNA或利用三螺旋形式，潜在技术(underlying technique)、反义术可用于控制基因表达。例如在Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；″Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression.″CRC Press，Boca Raton，FL(1988)或在Philips MI(ed.)，Antisense Technology，Methods in Enzymology，Vol.313，Academic Press，San Diego(2000)中讨论了反义技术。例如在Lee等人在Nucleic AcidsResearch 6：3073(1979)、Cooney等人在Science 241：456(1988)和Dervan等人在Science 251：1360(1991)中讨论了三螺旋形式。这些方法基于靶聚核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如编码USF1的聚核苷酸的5′编码部分可用于设计长度为约10-40个碱基对的反意RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计成与涉及转录的基因区域互补，因此阻止USF1的转录和产生。反意RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交，并阻断mRNA分子翻译为USF1蛋白。

术语“核酶”是指具有催化活性的RNA分子(参见例如Sarver等人，Science 247：1222-1225(1990))；然而DNA催化剂(脱氧核酶)也是已知的。例如Steele等人2003(Am.J.Pharmacogenomics 3：131-144)和Puerta-Fernandez等人2003(FEMS Microbiology Reviews 27：75-97)，讨论了核酶和它们研发为新的治疗工具的可能性。当在特异识别序列位点切割mRNA的核酶用于破坏USF mRNA，优选使用反式作用发夹和双髻鲨核酶。在指示与靶mRNA形成互补碱基对的侧面区域的位置，双髻鲨核酶切割mRNAs。唯一的要求是靶mRNA具有下列两碱基序列：5′-UG-3′。双髻鲨核酶的构建和制备是本领域所公知的，并且更全面的描述于Haseloff和Gerlach，Nature 334：585-591(1988)。在凝血因子XII mRNA的核苷酸序列中有很多潜在的双髻鲨核酶切割位点，这对本领域技术人员是显而易见的。核酶优选是设计的，这样切割识别位点在mRNA的5′末端，即增加和最小化非功能性mRNA转录的细胞内累积。RNAs P是用于选择性抑制病理RNAs的另一种核酶方法。核酶可由修饰过的寡核苷酸组成(例如用于改善稳定性、靶向性等)，并应传输于表达USF1的细胞。利用实际上本领域技术人员所公知的任意方法将编码核酶的DNA构件引入细胞。优选的传输方法包括使用在强组成性启动子(例如，如pol III和pol III启动子)控制下的“编码”核酶的DNA构件，使得转染后的细胞产生足量的核酶以破坏USF1信息并抑制翻译。由于和翻译核苷酸不同，核酶具有催化性，因此对效率而言，需要较低的细胞内浓度。核酶介导的RNA修复是应用核酶技术的另一种治疗选择(Watanabe & Sullenger 2000，Adv.DrugDeliv.Rev.44：109-118)并且用于本发明的目的。

术语“适体”是指相比于单克隆抗体的亲和性和特异性，能以高亲和性和特异性与靶蛋白结合的RNA和DNA分子。获得或区分对所期望靶标的特异性适体的方法为本领域所公知。优选，这些方法基于“指数富集配基的系统进化技术”(SELEX)的方法(Ellington和Szostak，Nature，1990，346：818-822；Tuerk和Gold，1990，Science 249：505-510；Fitzwater & Polisky，1996，MethodsEnzymol′.267：275-301)。多种化学修饰，例如开始文库使用2′-氟嘧啶和将聚乙二醇连锁于适体的5′末端，可用于确保稳定性和增强适体的生物可利用度(参见例如Toulme 2000，Current Opinion in MolecularTherapeutics 2：318-324)。

抑制剂也可是抗体或其片断或衍生物。如本文所使用的，术语“抗体或其片断或衍生物”涉及多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、单链Fv抗体、人抗体、人源化抗体或与USF1特异性结合的Fab片断。

最后，本发明涉及USF1基因表达激活剂在制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)、家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途，其中所述的激活剂是小分子。

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附图说明

图1：1q21相关区域的示意图。在最上部分显示了基因型为SNPs的基因和突出连锁标记物D1S104和D1S1677(Pajukanta等人，1998)的位置。以粗体显示的基因也受到测序。下一个部分显示JAM1和USF1的SNPs基因型(参见表2，距离、rs数目和这些SNPs的LD簇)。第二个至最低部分显示在男子中与TGs相关的SNPs，以及最低部分的SNPs与所有家族成员中与FCHL和TGs相关。

图2：根据对16个上调基因和60个下调基因的功能分类的基因分布，其中可获得对基因本体论(gene ontology，GO)级生物过程的评注信息。只显示了对过度表征具有显著统计学EASE得分(＜0.05)的种类。在增补表3a-b中给出了EASE分析的竞争结果，该结果包括相应EASE得分(p值)EASE分析的全部结果和每个显著分类中基因列表。

图3a：包含60bp序列的USF1内含子7由91个USF1类似基因共享。在USF1内含子7基因重复的AluSx部分(2-61bp和137-196bp)具有与小鼠B1基因重复类似序列。总共91个人类基因，包括USF1，具有位于编码链(43基因)或相反链(48基因)的AluSx 60bp部分。这91个基因列于增补表4。图3b：USF1内含子7的268bp区域的转录效率，其中USF1包含60bp的重要序列和usf1s2 SNP(参见表3a)。来自一个纯合易感性载体(半抗原性1-1)和一个纯合非载体(2-2)的DNA以正向和反向克隆于SEAP报告子系统。单元型载体DNA的HC for和HC rev显示载体的正向和反向结构(1-1)；单元型载体DNA的HNC for和HNC rev显示非载体的正向和反向结构(2-2)。分别将用pSEAP2-基本载体转染细胞的培养基用作阴性对照(Neg)，以及将用pSEAP2-对照载体转染细胞的培养基用作阳性对照(Pos)。在转染后48和72小时进行SEAP蛋白质的监测。均值相关区间代表一个实验作三次的SD。当与阴性对照相比时，其设定为1，区间的大小显示转录活性的增加。

图4a：6.7kb USF1基因的概况图。外显子描绘为瘦框(thick box)，UTR描绘为更瘦的框，以及内含子描绘为线状。用相关SNPs在基因上标记USF1基因型SNPs，其中SNPs用asterixes显示。扩增内含子7的区段以显示该序列的位置(黑色区间)，用于产生用在EMSA试验的20mer探针。用更大的字体和箭头显示近旁的SNPs。

图4b：物种间的保守和EMSA探针。所构建的两个探针都能在EMSA中产生移位；一个长34bp，另一个20bp。34mer探针包含来自内含子7区域所有三个探针，其中20mer探针仅包含重要的usf1s2 SNP。下面显示的是物种间序列的保守性和一致性序列。Y代表嘧啶，R代表嘌呤。特别是在usf1s2本身的核苷酸完全保守，风险等位基因代表祖传的等位基因。

图5a：EMSA结果显示在usf1s2周围34bp和20bp探针都结合从HeLa细胞提取的核蛋白。两种探针装置的不同usf1s2等位变体产生凝胶移位，用箭头标示。相反，代表在3′UTR的usf1s1周围序列的20bp探针的变体都没能产生凝胶移位。

图5b：结合核蛋白的特异性。代表usf1s2周围序列的34bp探针产生强烈的凝胶移位，其在加入高摩尔浓度未标记探针下逐步完成。

图6：鉴别明显不同的受调控USF1控制基因的概图。检查最初列表中的40个基因减少至在脂肪活组织表达的13个。这些中，在携带风险单元型USF1或非风险单元型USF1的个体之间，三个重要的代谢基因以稳定状态不同表达。在没有假定等值变量下p值得自两样本t检验。

图7：USF1转录水平的特异性等位基因调控机制以及USF1蛋白数量可能变化后果的代表图。蛋白质结合USF1基因内含子7的调控序列，并影响转录水平。USF1二聚化(通常与USF2)并和多基因启动子的E-box结合以激活它们转录，来对信号例如葡萄糖和饮食糖份信号作出反应。USF1活性的转录后调控通过二聚体的磷酸化来调节，其排除它与E-box基序16结合。所观察到的下游基因转录水平的下降，如果反应在多肽水平，将导致高度相关的血脂障碍和代谢综合症的变化。

具体实施方式

实施例1：实施例2-5的试验大纲所有受分析的FCHL家族都有患严重CHD和脂质表型的先证者，以及平均5-6个患FCHL的家族成员。对显示极端和定义明确的疾病表型的这些FCHL家族进行分析，以确定1q21上导致FCHL的潜在基因。我们选择了区域候选基因方法，并对4个1q21上的功能相关区域候选基因进行测序。对TXNIP、USF1、维甲酸类X受体γ(RGRG)和载脂蛋白A2(APOA2)基因进行测序，以鉴别所有可能的变体。在这些基因中，TXNIP最初代表最有希望的位置候选基因，因为在小鼠中它已经显示成为混合性高脂血症的基因型的基础¹⁷。基于它们的功能候选资格和对最初峰连锁(Peak linkage)标记物(D1S104和D1S1677)的近位置(close location)(＜2.5Mb)，选择三个另外区域基因进行测序(图1)。平行的，我们使用功能上无偏差遗传学方法，其中峰连锁标记物周围基因SNPs的最初装置受到关联测试1q21上26个基因进行基因分型出总共60个SNPs。这些SNPs中的15个位于5.8Mb内，在D1S104和D1S1677的侧面。在42个FCHL家族的238名家族成员中，将所有60个SNPs进行了基因分型，包括最初连锁研究的的31个家族⁴，和来自60个FCHL家族721名家族成员的扩大的样本中的10个最有希望的SNPs(参见下文)。60个SNPs的结果显示于增补表1。

增补表1：得自两点连锁的60个基因型SNPs的结果和相关分析。总共分析四个特征：所有个体的FCHL和TG特征，和男性患者的FCHL和TG特征。

LOD得分得自于两点连接分析(具体细节参见方法)，以及使用HHRR测试的关联分析的p值。Nf显示在dbSNP或Celara数据库中没有发现。对弈这些SNPs的SNP信息将提交给公众数据库(dbSNP)。用粗体显示的SNPs在60个扩充FCHL家庭中受到基因分型。所有其它结果得自42核FCHL家庭。小于0.05的p值也以粗体显示，其中ns表明没有显著性(p值大于0.05)。

基因	SNP	距离bp	FCHL		TG		FCHL男子		TG男子
											联接Lod	HHRRP值	联结Lod	HHRRP值	联结Lod	HHRRP值	联结Lod	HHRRP值
			TXNIPTXNIPTXNIPTXNIPMUC1MUC1GBANTRK1NTRK1FYCRPKCNJ9KCNJ9KCNJ9KCNJ9KCNJ9ATP1A2ATP1A2PEA15PXFCOPASLAMF1	rs2236567Nfrs9245rs7211rs1611774rs4072037rs1800473rs6334rs6337rs12075rs1130864rs4656876rs2180752rs2737705rs2753268Nfrs2295623Nfrs680083rs10594rs1802778rs1061217	42512723039886906442142263716615292762232635950773736729952170512883023876112474711176627956231276599337887	0.40.30.30.60.20.00.40.20.01.00.00.00.00.00.00.10.00.00.00.40.00.5	nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns	0.00.00.10.10.10.00.00.00.01.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.10.00.0	nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns	0.20.20.40.31.10.00.50.20.21.50.20.40.00.40.20.20.00.00.00.20.00.2									nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns	0.30.00.80.01.40.10.20.10.10.80.30.10.00.61.00.50.00.00.00.40.00.3	nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns

ITLN2FlankingF11RF11R/f11rs1F11R/f11rs2F11R/f11rs3F11R/f11rs4F11R/f11rs5F11R/f11rs6USF1/usf1s1USF1/usf1s2USF1/usf1s3USF1/usf1s4USF1/usf1s5USF1/usf1s6USF1/usf1s7USF1/usf1s8USF1/usf1s9LOC257106LOC257106LNIRLNIRLNIRB4GALT3FCER1GFCER1GAPOA2APOA2APOA2APOA2ATF6RGS5PBX1PBX1

rs1556519rs2246485rs836rs790056rs790055hCV1459766rs4339888rs3766383rs3737787rs2073658rs2516841rs2073657rs2516840rs2073653rs2516839rs2516838rs1556259rs3813609Nfrs1467742rs1556257rs4529727rs6779rs3557rs11421NfNfrs5085rs5082CV67448rs15049rs2275558rs1057756

24927253951361156125608105721246951123912175261443361124927943915724260872832639876594746143259334948117264553311962471412242122535164453

0.91.11.70.90.71.82.20.03.32.01.30.40.70.00.70.10.00.10.10.00.10.00.10.10.10.31.10.10.30.00.00.00.0

nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns

0.10.00.10.00.00.10.10.00.30.00.00.10.00.00.00.00.00.00.10.00.10.00.00.00.00.00.00 00.10.00.10.00.2

nsnsnsnsnsnsnsns0.040.04nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns

1.01.12.80.50.42.73.60.02.11.51.81.10.80.02.10.40.00.80.10.00.00.60.30.00.30.61.50.03.10.00.00.00.2

nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns

1.10.30.91.10.30.40.60.02.01.80.40.40.20.01.20.10.00.10.30.00.00.20.40.00.00.00.00.02.10.00.00.00.1

nsns0.03nsnsns0.02ns0.00090.002nsnsnsnsns0.01nsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsnsns

PBX1RXRGRXRGALOH9A1LMX1A

rs14832rs2134095rs157870rs12670hCV3194556

56144411733242385307375

0.10.30.00.80.9

nsnsnsnsns

0.00.00.00.00.0

nsnsnsnsns

1.31.20.00.90.9

nsnsnsnsns

0.10.20.00.00.1

nsnsnsnsns

实施例2：作为候选基因的USF1基因

我们鉴别了USF1基因的5867bp序列的总共23个SNPs(增补表2)：它们中的3个为外显子中的沉默变体，剩下的位于非编码区和假定的启动子中。23个SNPs中的8个是新的。最初，我们对USF1基因中的SNPs进行基因分型：usf1s1(外显子11)、usf1s2(内含子7)和usf1s7(外显子2)(表2-3给出了已基因分型的SNPs的相应rs数目)。

表1：对usf1s1(＝RS3737787)和usf1s2(＝RS2073658)SNPs的多点HHRR和配子竞争分析

所有的值代表对两个SNPs同时分析的的p值。Ns表明无显著性。第一个出现的p值得自60个扩大的FCHL家族，在括弧中给出的值得自42个核心FCHL家族。仅在60个扩FCHL家族使用至少50,000模拟进行Gene dropping。在上面所有的配体竞争性分析，隔离单元型(segregating competition)是1-1(1表示共同的等位基因)。

	TCHL全部	TG全部	FCHL男子	TG男子
					多重HHRR配子竞争	ns(ns)0.00002(0.005)	0.05(ns)0.00006(0.008)	0.009(ns)0.00040.04)	0.00003(0.003)0.0000009(0.004)
渐进p-值
					配子竞争	0.00004	0.00006	0.0004	0.00001
(基因低下Gene drooping)试验p值

增补表2：TNIX与FCHL的相关和连锁分析

LOD表明使用MLINK程序的参量两点或多点连锁分析的最大Lod得分，以及遗传优势模式(括弧中给出重组分数)；ASP表明得自患病的同胞配对分析的lod得分；GAMETE表明得自配子竞争分析的p值；HHRR和多HHRR p值得自基于单元型的单元型相关风险分析；以及在TXNIP单元型和FCHL特征之间测试的HBAT p值。Ns表明无显著性。对于TG特征，对所有相关分析的相应p值仍无显著性，并且两点或多点lod得分都＜1.5。新SNP2的编号基于2003年7月UCSC Genome Browser上TXNIP区域的基因组序列。在来自60个FCHL家族的721个家族成员的扩大样本中，所有的SNPs进行了基因分型。

方法	单SNPs分析				组合SNPs的分析
						SNP1rs2236567	SNP2-1273bp C-＞T	SNP3rs9245	SNP4rs7211	SNP1-2-3-4
	连锁LOD基于家族关联ASPGAMETEHHRR杂合HBAT	0.4(0.14)0.3nsns0.11	0.3(0.12)0.3nsns0.10	0.3(0.20)0.6nsns0.11	0.6(0.10)0.2nsns0.12						1.9(0.11)nsns

用对FCHL的3.5和2.0，对TGs的3.7和2.0的最高lod得分，Usf1s1和usf1s2提供了在42个FCHL家族中连锁的证据。尽管单独的SNPs结果无显著性，但用FCHL(p＝0.008)和TGs(p＝0.008)的配子竞争测试，这些SNP的组合分析也提供了一些相关性证据(表1)。我们也观察到在患病的男子和未患病的男子之间的等位基因频率存在差异，尤其是用TG特征。在TG患病的男子中Usf1s1次要等位基因的频率是22.0％，在未患病的男性家族成员中是40％。由于这些患病的和非患病的家族成员代表男性非独立组，我们在TG患病的男子中测试了usf1s1和usf1s2，其中使用基于家族相关方法、HHRR和配子竞争测试：在42个核心FCHL家族中，HHRR分析中得到的0.01和0.02，配子竞争测试中得到0.008和0.02的p值(表2)。这些SNPs的组合分析在HHRR检验中得到的p值为0.003，以及在男性TGs的配子竞争测试中得到的p值为0.004(表1)。

表2：男子中对TGs和FCHL的JAM1-USF1区域的单独SNPs的相关性分析

所有结果代表p值，ns表明无显著性，HHRR基于单元型的单元型相关风险分析，以及Gamete配子竞争性测试。在最后栏的LD簇数表明在患高TGs(＞第90年龄-性别百分位数)男性先证者中显示强内标物LD(p≤0.00002)的SNPs簇，即携带相同簇数的SNPs在强配对LD内。在62个扩大FCHL家族中进行了SNPs基因分型，SNPs以粗体标明，以及获得了42个核心FCHL家族的这些SNPs的括弧中的值。所有其它的结果得自42个核心FCHL家族。

SNP	rs数目	距离(bp)	所有家族成员中杂合/稀有等位基因频率	TGsHHRR	TGsGamet	FCHLHHRR	FCHLGamet	LD簇(I-V)
									jam1s1jam1s2jam1s3jam1s4jam1s5jam1s6usf1s1usf1s2usf1s3usf1s4usf1s5usf1s6USF1S7usf1s8usf1s9	rs836rs790056rs790055新rs4339888rs37666383rs3737787rs2073658rs2516841rs2073657rs2516840rs2073653rs2516839rs2516838rs1556259	13611561256081057212469511239121752614433611249279	0.41/0.280.36/0.240.35/0.230.38/0.260.43/0.310.25/0.150.45/0.340.44/0.330.40/0.280.48/0.410.41/0.290.25/0.140.47/0.390.40/0.280.23/0.13	0.03nsns0.060.02ns0.0009(0.01)0.002(0.02)nsnsnsnsns(ns)0.01(0.05)ns	0.0090.03ns0.040.003ns0.00001(0.008)0.00006(0.02)nsnsns0.080.04(ns)0.05(0.03)ns	nsnsnsnsnsns0.04(ns)0.04(ns)nsnsnsnsns(ns)ns(ns)ns	0.03nsnsns0.09ns0.05(ns)ns(ns)nsnsnsnsns(ns)ns(ns)ns	IIIIIIIIIIIIIIIVIIIIIIVVIII

增补表3：在最初连锁研究中的31个FCHL先证者中利用对USF1基因测序所鉴别的变体3

位置	rs数	稀有频率(31样品中)	LD上等位基因频率(31样品中)	特性
					-2167	新	0.02		T/C
-2022	新	0.05		A/C
					-802	新	0.03		C/G

外显子1内含子1＝usf1s9内含子1＝usf1s8内含子1内含子1内含子1/1125bp内含子1/1416bp外显子2＝usf1s7内含子2＝usf1s6内含子3内含子5内含子6内含子6＝usf1s5

rs2516837rs1556259rs2516838rs1556260rs2774273新新rs2516839rs2073653rs2073655rs2774276rs2073656rs2516840

0.040.190.290.160.440.160.160.440.110.230.270.230.32

在全LD中含rs2516839和rs2774273在含1125bp的SNPs全LD中30/31样品中含rs15526259在全LD中含rs2516839和rs2774273在含1416bp的SNPs全LD中30/31样品中含rs15526259在含11125bp的SNPs全LD中30/31样品中含rs15526259在全LD中含rs207365829/31中LD含rs2516840在全LD中含rs2073658

无翻译区C/TA/G无翻译区

内含子6/3411bp内含子6/3519bp内含子7＝usf1s4内含子7＝usf1s3内含子7＝usf1s2内含子9/4445bp外显子11/＝usf1s1

新新rs2073657rs2516841rs2073658新rs3737787

0.050.050.470.310.230.030.03

C/TC/T在AluSx中在AluSx中A/G无翻译区

在FCHL家族中对加下划线的变体进行了基因分型。对于这些SNPs，也显示了在文中和表1-3中所用的usfs1-s9的编号；“新”表示在SNP数据库中没有发现SNP。新SNPs的编号是基于在2003年7月UCSC GenomeBrowser(refGene_NM_007122)上的USF1基因组序列。

接下来，在60个扩大的FCHL家族中的更多研究样本中测定了与SNPs相关的两个基因型，usf1s1和usf1s2。此外，在USF1区域测定了12个另外的基因型(表2，图1)。在通过测序23个已鉴定了SNPs中，我们测定了所有在31名先证者中没有强LD的SNPs的基因型，同时排除了在3个或更少的个体中的6个稀有SNPs(增补表2)。由于在核心研究样本和/或LD模式中它们有希望的结果(表2)，在60个扩大家族中总共测定了4个USF1 SNPs基因型。当在60个扩大的FCHL家族中测定基因型时，两个独立的SNPs，usf1s1和usf1s2，在HHRR测试中得到的p值为0.0009和0.002，以及在人TGs的配子竞争试验中p值为0.00001和0.0006(表2)。两个SNPs的普通等位基因更频繁的遗传给在两个测试中并伴有FCHL和TG特征的患病个体。这两个SNPs组合分析中渐进的p值在HHRR中为0.00003，和在人TGs的配子竞争试验中为0.0000009(表1)。隔离的单倍体型是1-1(1表示普通等位基因)。对所有的受TG影响的家族成员，组合分析也产生了相关性证据及在HHRR分析中0.05的p值、在配子竞争试验中0.00006的p值，同样，隔离的单倍体型是1-1(表1)。

为确保配子竞争结果的确显著并且没有受到如稀疏数据的贡献者的偏离，我们使用至少50,000模拟的基因下垂(参见方法)对包括多重SNPs(表1)的配体竞争分析计算试验p值。所获得的试验p值与配子竞争分析的渐进p值一致(表1)，表明所观察到的结果不是用稀疏数据渐进近似值的人工产物。

在对USF1区域的15个SNPs进行基因分型后，我们鉴定了在患高TGs的男子中至少达到46kb的LD和相关的模式，并从着丝粒结合黏附分子1(JAM1)基因扩展至USF1基因(图1和表2)除了usf1s1和usf1s2，三个其它的SNPs，jam1s1、jam1s4和jam1s5，在42个核心FCHL家族中患高TGs的男子中也显示相关性的证据(表2)。这3个SNPs与usf1s1和usf1s2在强LD(p＜0.00002)内。表2中显示了在JAM1-USF1区域的对SNPs的LD模式，其利用Genepop程序。除了这5个SNPs，USF1的内含子1的一个SNP(usf1s8)也显示一些相关性的证据(表2)。该SNP与任意14个其它SNPs不在LD中(表2)。

在所有的患病的家族成员中，使用FCHL和TG特征，相关性的证据被限制于USF1基因中的usf1s1和usf1s2(表1)。JAM1-USF1区域中剩余的13个已基因分型的SNPs，并没有提供相关性的明显证据。然而，我们观察到在通过测序鉴定的23个SNPs中，两个另外的USF1 SNPs，即内含子3的rs2073655和内含子6的rs2073656，在与usf1s2相关的31个FCHL先证者中也是全LD，并且可能扩展FCHL相关区域至USF1的内含子3。用存在于JAM1-USF1区域外的SNPs没有获得相关性(增补表1)。总之，相关性和LD的证据被限制于FCHL家族所有患病个体中USF1基因的1239bp，但在患高TGs的男子的JAM-USF1区域内，扩展了至少46kb(表2-3，图1)。

Usfs1-usf1s2 SNPs的组合，其导致FCHL和TGs对显著单元型，也用3种另外的定性脂质特征进行测定：高载脂蛋白B(apoB)、高TC和小的低密脂蛋白(LDL)的峰值颗粒大小。对于apoB，在配子竞争分析中对所有患病个体和怀疑单元型1-1的患病个体获得的p值为0.00003和0.0007。对于TC，p值为0.0001和0.007，对于LDL峰值颗粒大小，分别为0.002和0.01。这些结果连同得自FCHL的结果表明潜在的基因不是单独的影响TGs基因，但也是复杂的FCHL表型。

实施例3：JAM-USF1基因区域的单元型分析

使用HBAT程序，我们获得在usf1s1和usf1s2区域共享单元型的证据(表3)。这些观察受到多重HHRR分析的支持(表3)。对于单元型1-1(1表明普通等位基因)，使用-o选择得到p值0.0007。

表3使用HBAT程序在TG受累男子中的单元型分析(下面给出多基因座GENO-PDT和多重HHRR结果用于比较)

表2显示了SNPs jam1s4-s6和usf1s1-s5的内SNP距离和相应的rs数目；1表明普通等位基因；并且ns无显著性。HBAT程序的p值表明，使用选择-o(最优测试)和选择-e(试验测试)，特定单元型被遗传给患病个体的可能性。多基因座GENO-PDT表明全家谱基于基因分型的相关性测试。多重HHRR分析是在遗传的和非遗传的SNPs等位基因之间测试标记等位基因分布同源性的假设。

测试	SNPs的单元型：Jam1s4-6-usf1s1	SNPs的单元型：Usf1s1-2	SNPs的单元型：Usf1s1-5
				HBAT-o	P＝0.03(单元型1-1-1-1-1)	P＝0.0007(单元型1-1)	P＝ns(0.07)(单元型1-1-1-1-1)
对于保护性的单元型2-2 P＝0.004，显著较少地遗传给患病的个体
				HBAT-e	P＝0.009(单元型1-1-1-1-1)	P＝0.02(单元型1-1)	P＝ns(0.07)(单元型1-1-1-1-1)
多基因座GENO-PDT	P＝0.02	P＝0.002	P＝ns(0.7)
				多重HHRR	P＝0.0002	P＝0.00003	P＝0.04

该选择不仅估量敏感单元型对患病者的优先遗传，也估量其对未患病者的较不优先遗传，使得在此处有用，因为在这些扩大的家族中未患病者也包含重要的信息。表3也显示了HBAT-e选择的结果和特定连锁的相关性测试。由于该测试统计了在连锁信息中的隐含条件，其不是较有力，并且导致较小的p值。然而，该测试连同HHRR分析的结果允许我们得出结论：1-1单元型与表型相关(表3)。此外，单元型2-2显著较低地遗传给患病患者(p＝0.004)，表明该等位基因的保护作用。利用对一般家谱的基于基因型的相关性测试(基因型-PDT，其提供相关性的证据(表3))，以及通过配子竞争分析(表1)(其中相同的单元型1-1分开至患有FCHL和TG特征的患病个体中)，这些结果得到进一步支持。

实施例4：脂肪活组织活检的表达概况和最初功能分析

使用Affymetrix，HGU133A探针阵列，我们研究了当与假定保护型单元型2-2(参见上文)同源的4名患病的FCHL家族成员比较时，来自6个患病的FCHL家族成员的脂肪活组织活检的表达概况是否(这些家族成员携带由usf1s1和usf1s2构成的敏感型单元型1-1)显示了不同。我们也特别地研究了USF1是否在脂肪组织中表达，因为它在AffymetrixHGU133A芯片上没有足分地反应。使用RT-PCR，发现USF1在脂肪活组织样品中表达(数据没有显示)。也进行定量实时PCR来测定在带有风险单元型的患病的FCHL家族成员和不携带风险单元型的患病的成员的脂肪组织中USF1的相对表达。可以观察到在USF1表达水平上没有可检测到的差异，表明USF1的FCHL相关等位基因的潜在功能显著性没有经脂肪组织稳态转录水平的直接作用受到传递。

由于可获得样本的有限数目，在单元型组之间统计力在基因表达上对鉴别差异被认为不充足。作为替换，我们因此定义断开阈值(cut-off thresholds)(参见方法)来区分有意义的差别和因试验程序中技术和生物噪音而产生的差别。使用这些标准，我们在敏感型单元型载体中鉴别了25个显示上调的基因和73个下调的基因(在我们网站上将可获得完整的列表，而原始数据可使用GEO accession GSE590在NCBI的Gene Expression Omnibus见到)。为了给这些发现提供生物相关性，使用表达分析系统探索者(Expression AnalysisSystematic Explorer)(EASE)工具，不同表达的基因的列表受到检查用以功能类别的过度代表，如基因本体论(gene ontology，GO)协会所定义的。在上调基因中只有3类被发现统计上过度代表(图2)，主要暗示涉及脂肪代谢的基因。在下调的基因中，观察到免疫反应基因的显著下调(图2)。在增补表3a-b中给出了来自EASE分析的主要结果，包括相应的EASE得分(p值)和显著性功能类别中的基因列表(＝p值＜0.05)。

接下来，我们研究了单元型1-1侧面的基因组序列，并鉴定了在91个如下人类基因中发现的60bp序列元件：形成单元型1-1部分的SNP usf1s2位于邻近306bpAluSx的重复序列(8bp)。AluSx重复的两部分(2-61bp和137-196bp)显示与小鼠B1重复序列相似(图3a)。当与小鼠序列数据库进行同源性序列比较，AluSx的这两部分鉴别出很多ESTs，由于B1元件位于小鼠mRNA的非翻译区。当与人序列数据库进行同源性比较，包括USF1的91个人类基因具有在AluSx的60bp部分，在编码链(43个基因)和在非编码链(48个基因)。从人类到蠕虫，该60bp高度保守，因为其在河豚(pufferfish)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)有发现，而在裁翅对果蝇(Drosophila melanogaster)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中没有发现。在表4中给出了91个人类基因以及它们个体的p值和同一性百分比(83-98％)。91个基因的域注解的分析表明富含涉及蛋白质修饰的域(n＝16)和涉及核酸的域(n＝35)。该发现也受到关于生物过程的可利用的注释的支持，其中主要的基因涉及核酸代谢(n＝18)以及转录和信号转导(n＝33)。

为获得该保守的60bpDNA元件功能显著性的一些证据，我们制造了包含60bp序列以及usf1s2 SNP区域的268bp长的构件，并使用SEAP报告系统测试了它在体外的调节作用(图3b)。来自一个同源性敏感型载体(单元型1-1)和一个同源性非载体(2-2)的基因组DNAs以两个方向克隆于SEAP报告基因的前端。在两个构件中的正向暗示了对报告基因转录上的作用，而反向却导致了与阴性对照相当的转录效率(图3b)。

增补表4A：使用EASE工具²⁷，列表分析单元型和非单元型携带者之间不同表达基因的功能类别过度代表(Over-representation)的结果。增补表4A-B将在我们的网站上显示。请根据功能类别参见这些基因的分布图图2。

功能类别	LH	LT	PH	PT	EASE得分(p值)
						上调基因脂肪酸代谢脂类代谢大分子分解代谢羧酸代谢有机酸代谢细胞运动性分解代谢蛋白质水解和多肽水解蛋白质分解代谢代谢细胞增殖生理过程细胞生长和/或维持蛋白质代谢细胞过程细胞通讯核碱基、核苷和核酸代谢下调基因免疫反应对害虫/病原体/寄生的反应对生物刺激的反应防御反应对伤害的反应对应激的反应炎症反应固有免疫反应	34433343311314649431613171691477	16161616161616161616161616161616166060606060606060	903593952302322535543683744163782637923891512429722381719560379674616222632149151	7689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689	0.01290.03020.03860.07240.07350.08550.08850.1590.1640.2390.460.5160.5210.5890.6790.8580.880.00001410.00002360.00003090.00004350.0002650.0008110.0009260.000926

对外部刺激的反应分解代谢菌落形态学侵袭性生长细胞溶质钙离子浓度升高细胞形态形成细胞黏附大分子代谢脂类代谢蛋白水解和多肽水解蛋白分解代谢与IP3第二信使偶联的G-蛋白信号(磷脂酶C激活)胞饮作用细胞防御反应脂类代谢趋化作用向性抗微生物体液反应体液防御机制(无脊椎动物功能)抗微生物体液反应机制(无脊椎动物功能)囊泡介导转运细胞-细胞支持对化学物质反应乙醇代谢体液免疫反应与信号转到相连的细胞表面受体细胞通讯信号转导细胞死亡死亡生理过程G蛋白偶联受体蛋白信号

171233338837733363333343333820164451

60606060606060606060606060606060606060606060606060606060606060

99255426263234390395503683746672773599090929292214136141149152739223817853133166379

7689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689

0.002560.002880.01670.01670.02480.02770.02870.03050.05610.06170.06570.09090.1050.1180.140.1510.1510.1570.1570.1570.2260.280.2950.3170.3260.3380.3450.3920.4330.4390.439

通路金属离子转运蛋白质代谢磷脂代谢磷代谢转运发育细胞过程形态发生碳水化合物代谢离子转运阳离子转运凋亡程序性细胞死亡细胞组织和生物发生细胞内信号级联细胞生长和/或维持代谢蛋白质氨基酸磷酸化对非生物刺激反应磷酸化器官形成蛋白修饰细胞增殖转录调节，倚赖DNA转录调节转录，倚赖DNA转录核碱基、核苷和核酸代谢

53135510103463343335183133344333333

6060606060606060606060606060606060606060606060606060606060

457216151248748711441165429766926141028828929043759623894163365389393637682782974979108511121716

76897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689768976897689

0.4690.4970.50.5190.5190.5240.5470.5510.5920.60.6160.6550.6560.6580.660.6810.6930.740.7780.8070.8120.8780.9050.9870.9970.9970.9990.9991

1根据基因本体论(gene ontology，GO)分类生物过程41。缩写：LH-列表采样数，LT-列表总数，PH-总体采样数，PT-总体，以及EASE-Expression AnalysisSystematic Explorer⁴²。在我们的网站上将提供每个基因类别的完整基因列表。

增补表4b上面表3a中显著(＝EASE p值＜0.05)功能类别中基因列表。在我们的网站上将显示该增补表4b。

上调基因

脂肪酸代谢

UNIQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					200832_s_at	6319	硬酯酰CoA去饱和酶(δ-9-去饱和酶)	生物过程	内质网；脂肪酸生物合成；细胞膜的完整；结合铁离子；氧化还原酶活性；硬酯酰CoA去饱和酶活性
206930_at	10249	甘氨酸-N-酰基转移酶	生物过程	酰基CoA代谢，酰基转移酶活性；线粒体；对毒素反应
					209600_s_at	51	酰基辅酶A氧化酶1棕榈酰基	生物过程	酰基CoA氧化酶活性；电子供体活性；电子转运；能量通路；脂肪酸β氧化；氧化还原活性；过氧化物酶体；前列腺素代谢

脂类代谢

UNIQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					200832_s_at	6319	硬酯酰CoA去饱和酶	生物过程	内质网；脂肪酸生物合成；细胞膜的完整；结合铁离子；氧化还原酶活性；硬酯酰CoA去饱和酶活性
202118_s_at	8895	copineIII	生物过程	钙依赖性磷脂结合；细胞黏附分子活性；脂质代谢；转运子活性；泡囊介导转运
					206930_at	10249	甘氨酸-N-酰基转移酶	生物过程	酰基CoA代谢；酰基转移酶活性；线粒体；对毒素反应
209600_s_at	51	酰基辅酶A氧化酶1棕榈酰基	生物过程	酰基CoA氧化酶活性；电子供体活性；电子转运；能量通路；脂肪酸β氧化；氧化还原活性；过氧化物酶体；前列腺素代谢

大分子分解代谢

UNIQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					202581_at	3304	热休克70kDa蛋白1B	生物过程	ATP结合；细胞质；热休克蛋白活性；mRNA分解代谢；细胞核
204844_at	2028	谷胺酰基氨基肽酶(氨基肽酶A)	生物过程	细胞增殖；细胞间信号；谷胺酰基氨基肽酶活性，水解酶活性；浆膜完整性；膜内氨酰氨基肽酶活性；金属肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；锌离子结合
					209788_s_at	51752	I型肿瘤坏死因子受体脱落氨基肽酶调节子	生物过程	氨基肽酶活性；膜内氨酰氨基肽酶活性；金属肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；锌离子结合
215271_at	63923	结合腕蛋白N	生物过程	羧基肽酶A活性；细胞生长；细胞迁移；未知细胞组分；未知分子功能；蛋白水解和多肽水解

下调基因

免疫反应

UNIQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201422_at	10437	干扰素，γ诱导蛋白30	生物过程	细胞外；免疫反应；溶酶体；氧化还原酶活性
201952-at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导

202803_s_at	3689	整联蛋白，β2(CD18抗原(p95)，与抗原1相关的淋巴细胞；巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
					202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
					203382_s_at	348	载脂蛋白E	生物过程	胆固醇代谢；循环；发育；肝素结合；免疫反应；脂质结合；脂质代谢脂质转运；脂质转运子活性；受体结合
203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
					204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；

				细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性抗原	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
211799_x_at	3107	I、C类主要组织相容性复合物	生物过程	II类MHC受体活性；I类主要组织相容性复合物抗原；免疫反应；膜完整性
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神

经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对害虫/病原体/寄生虫的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201850_at	822	帽化蛋白(肌动蛋白丝)	生物过程	F肌动蛋白帽化蛋白复合物；肌动蛋白结合；尾部带刺肌动蛋白帽化活性；核；蛋白复合物装配；对害虫/病原体/寄生虫的反应
201952_at	214	活化白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
					202803_s_at	3689	β2整联蛋白(CD18抗原(p95)，与白细胞功能相关抗原1，巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附受体活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
203104_at	1436	集落刺激因子1受体，先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性

204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
					204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性

217028_at

7852

趋化因子(C-C基序)受体4

生物过程

C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对生物刺激的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201422_at	10437	干扰素，γ诱导蛋白30	生物过程	细胞外；免疫反应；溶酶体；氧化还原酶活性
201850_at	822	帽化蛋白(肌动蛋白丝)	生物过程	F肌动蛋白帽化蛋白复合物；肌动蛋白结合；尾部带刺肌动蛋白帽化活性；核蛋白复合物装配；对害虫/病原体/寄生虫的反应
					201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生理过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
202803_s_at	3689	整联蛋白，β2(CD18抗原(p95)，与抗原1相关的淋巴细胞；巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
					202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解

203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
					203382_s_at	348	载脂蛋白E	生物过程	胆固醇代谢；循环；发育；肝素结合；免疫反应；脂质结合；脂质代谢；脂质转运；脂质转运子活性；受体结合
203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
					204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
04446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
					209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信

				号白通路；细胞运动性；细胞繁育反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；浆膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
211799_x_at	3107	I、C类主要组织相容性复合物	生物过程	II类MHC受体活性；I类主要组织相容性复合物抗原；免疫反应；膜完整性
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

防御反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201422_at	10437	干扰素，γ诱导蛋白30	生物过程	细胞外；免疫反应；溶酶体；氧化还原酶活性

201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
					202803_s_at	3689	整联蛋白，β2(CD18抗原(p95)，与抗原1相关的淋巴细胞；巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
					203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
203382_s_at	348	载脂蛋白E	生物过程	胆固醇代谢；循环；发育；肝素结合；免疫反应；脂质结合；脂质代谢；脂质转运；脂质转运子活性；受体结合
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
					204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性

205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
211799_x_at	3107	I、C类主要组织相容性复合物	生物过程	II类MHC受体活性；I类主要组织相容性复合物抗原；免疫反应；浆膜完整性
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体

体4

活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对受伤的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
					204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合

209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因于受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对应激的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201739_at	6446	血清/糖皮质激素调节的激酶	生物过程	ATP结合；凋亡；cAMP倚赖的蛋白激酶活性；蛋白氨基酸磷酸化；蛋白激酶CK2活性；蛋白质丝氨酸/

				苏氨酸激酶活性；钠离子转运；转移酶活性
					201850_at	822	帽化蛋白(肌动蛋白丝)	生物过程	F肌动蛋白帽化蛋白复合物；肌动蛋白结合；尾部带刺肌动蛋白帽化活性；蛋白复合物；信号转导
201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
					202803_s_at	3689	整联蛋白，β2(CD18抗原(p95)，与抗原1相关的淋巴细胞；巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
					204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性

205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞繁育反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形

成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对应激的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201739_at	6446	血清/糖皮质激素调节的激酶	生物过程	ATP结合；凋亡；cAMP倚赖的蛋白激酶活性；蛋白氨基酸磷酸化；蛋白激酶CK2活性；蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性；钠离子转运；转移酶活性
201850_at	822	帽化蛋白(肌动蛋白丝)	生物过程	F肌动蛋白帽化蛋白复合物；肌动蛋白结合；尾部带刺肌动蛋白帽化活性；蛋白复合物；信号转导
					201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
202803_s_at	3689	β2整联蛋白(CD18抗原(p95)，与白细胞功能相关抗原1，巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
					203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性

204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
					204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉
213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；

				分解素活性；溶菌酶活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应类视紫红质受体活性

炎症反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合

209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞繁育反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

固有免疫反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
					205098_at		趋化因子(C-C基序)受	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联

	1230	体1		的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞防御反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

对外来刺激的反应

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201422_at	10437	干扰素，γ诱导蛋白30	生物过程	细胞外；免疫反应；溶酶体；氧化还原酶活性
201850_at	822	帽化蛋白(肌动蛋白丝)	生物过程	F肌动蛋白帽化蛋白复合物；肌动蛋白结合；尾部带刺肌动蛋白帽化活性；蛋白复合物；信号转导
					201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
202803_s_at	3689	β2整联蛋白(CD18抗原(p95)，与白细胞功能相关抗原1，巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
					202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
203104_at	1436	集落刺激因子1受体；先前McDonough猫科肉瘤病毒(v-fms)癌基因同系物	生物过程	ATP结合；抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞增殖；发育；浆膜完整性；巨噬细胞集落刺激因子受体活性；蛋白质氨基酸磷酸化；受体活性；信号转导；转移酶活性；跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路
					203382_s_at	348	载脂蛋白E	生物过程	胆固醇代谢；循环；发育；肝素结合；免疫反应；脂质结合；脂质代谢；脂质转运；脂质转运子活性；受体结合

203650_at	10544	内皮蛋白C受体(EPCR)	生物过程	血液凝固；炎症反应；浆膜完整性；受体活性
					204122_at	7305	TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白	生物过程	细胞防御反应；浆膜完整性；细胞内信号级联；受体信号蛋白活性
204446_s_at	240	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶	生物过程	花生四烯酸酯5-脂质氧化酶活性；电子转运；炎症反应；铁离子结合；白三烯生物合成；脂质氧化酶活性；氧化还原酶活性
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
					209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞繁育反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩
211530_x_at	3135	I、G类HLA-G组织相容性蛋白	生物过程	I类MHC受体活性；内源性抗原的抗原递呈；内源性抗原经I类MHC的抗原处理；细胞防御反应；膜完整性；害虫/病原体/寄生虫的感觉

211799_x_at	3107	I、C类主要组织相容性复合物	生物过程	II类MHC受体活性；I类主要组织相容性复合物抗原；免疫反应；膜完整性
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

分解代谢

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					202295_s_at	1512	组织蛋白酶H	生物过程	组织蛋白酶H活性；水解酶活性；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
					203649_s_at	5320	IIA类磷脂酶A2(滑膜液血小板)	生物过程	钙离子结合；倚赖钙的细胞质体磷脂酶A2活性；倚赖钙的分泌型磷脂酶A2活性；不倚赖钙的细胞质体磷脂酶A2活性；水解酶活性；脂类代谢；细胞膜

203936_s_at	4318	基质金属蛋白酶9(白明胶酶B，92kDa，白明胶酶，92kDa IV型胶原酶)	生物过程	胶原蛋白分解代谢；胶原蛋白酶分解代谢；细胞外基质；细胞外间隙；白明胶酶B活性；水解酶活性；锌离子结合
					206214_at	7941	VII类磷酯酶A2(细胞浆血小板激活因子乙酰水解酶)	生物过程	2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶活性；2-乙酰基-1-烷基磷酸甘油酯酶复合物；细胞外；水解酶活性；炎症反应；脂质分解代谢；磷酯结合
207332_s_at	7037	转铁蛋白受体(p90，CD71)	生物过程	胞饮作用；核内体；细胞外；浆膜完整性；铁离子内环境稳定；铁离子转运；多肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；受体活性；转铁蛋白受体活性
					213274_s_at	1508	组织蛋白酶B	生物过程	组织蛋白酶B活性；水解酶活性；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
213510_s_at	220594	TL132蛋白	生物过程	半胱氨酸型内肽酶；泛素C末端水解酶活性；倚赖泛素的蛋白质分解代谢
					213975_s_at	4069	溶菌酶(肾淀粉样变)	生物过程	碳水化合物代谢；细胞壁分解代谢；细胞溶解；细胞外间隙；水解酶活性；作用于糖基键；炎症反应；分解素活性；溶菌酶活性
214012_s_at	51572	I型肿瘤坏死因子受体脱落氨基肽酶调节子	生物过程	氨基肽酶活性；膜内氨酰氨基肽酶活性；金属肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；锌离子结合
					217983_s_at	8635	核糖核酸酶6前体	生物过程	RNA分解代谢；细胞外；核糖核酸酶活性
35820_at	2760	GM2神经节苷脂激活剂蛋白	生物过程	神经节苷脂分解代谢；神经节苷磷脂分解代谢；溶酶体，神经鞘脂激活蛋白活性；神经鞘脂分解代谢

集落形态学(Colony morphology)

UNQID	LOCUSLI NK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203186_s_at	6275	S100钙结合蛋白A4(钙蛋白，calvasculin代谢，鼠胎盘同系物)	生物过程	钙离子结合；侵袭性生长
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

侵袭性生长

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203186_s_at	6275	S100钙结合蛋白A4(钙蛋白，calvasculin代谢，鼠胎盘同系物)	生物过程	钙离子结合；侵袭性生长
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；

				细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

Cystolic钙离子浓度升高

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
209906_at	719	补体成分3a受体1	生物过程	C3a过敏毒素受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋信号白通路；细胞运动性；细胞繁育反应；趋化作用；循环；补体成分3a受体活性；细胞溶质内钙离子浓度升高；炎症反应；浆膜完整性；磷脂酰肌醇-4，5-二磷酯水解；类视紫红质受体活性，平滑肌收缩

217028_at

7852

趋化因子(C-C基序)受体4

生物过程

C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

细胞形态发生

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					203186_s_at	6275	S100钙结合蛋白A4(钙蛋白，calvasculin代谢，鼠胎盘同系物)	生物过程	钙离子结合；侵袭性生长
205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性
					217028_at	7852	趋化因子(C-C基序)受体4	生物过程	C-C趋化因子受体活性；C-X-C趋化因子受体活性；与受体蛋白偶联的G蛋白信号通路；MAPK的激活；凋亡；趋化作用；复合受体活性；细胞质；细胞溶质钙离子浓度升高；组织形成和器官形成；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；

神经形成；发病机理；对病毒的反应；类视紫红质受体活性

细胞黏附

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					201952_at	214	激活白细胞黏附分子	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；浆膜完整性；膜片断；受体结合；信号转导
202803_s_at	3689	整联蛋白，β2(CD18抗原(p95)，与抗原1相关的淋巴细胞；巨噬细胞抗原1(mac-1)β亚单位)	生物过程	抗微生物体液反应(无脊椎动物功能)；细胞黏附；细胞黏附分子活性；整联蛋白复合物；整联蛋白介导的信号通路
					204438_at	4360	C型1甘露糖受体	生物过程	钙离子结合；嗜异性细胞黏附；浆膜完整性；甘露糖结合；胞饮作用；受体活性；受体介导的细胞包饮作用；糖结合
204620_s_at	1462	线粒体蛋白多糖硫酸酯2(依地酸)	生物过程	钙离子结合；细胞识别；发育；细胞外基质；嗜异性细胞黏附；透明质酸几何；糖结合
					205098_at	1230	趋化因子(C-C基序)受体1	生物过程	C-C趋化因子受体活性；与环核苷酸第二信使偶联的G蛋白信号；细胞黏附；细胞间信号；趋化作用；细胞溶质内钙离子浓度升高；免疫反应；炎症反应；浆膜完整性；侵袭性生长；类视紫红质受体活性

205786_s_at	3684	整合素，αM(补体成分受体3，α；也称作CD11b(p170)，巨噬抗原α多肽)	生物过程	细胞黏附；细胞黏附受体活性；整合素复合物
					212014_x_at	960	CD44抗原(归巢功能和印度血液组系统)	生物过程	细胞黏附受体活性；细胞间黏附；细胞-基质黏附；胶原蛋白结合；透明质酸结合；浆膜完整性；受体活性
216442_s_at	2335	纤维结合素1	生物过程	细胞黏附；细胞黏附分子活性；细胞运动性；细胞外基质；细胞外间隙；信号转导；可溶性片断

大分子代谢

UNQID	LOCUSLINK	基因名	分类	LOCUSLINK分类
					202295_s_at	1512	组织蛋白酶H	生物过程	组织蛋白酶H活性；水解酶活性；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
202901_x_at	1520	组织蛋白酶S	生物过程	组织蛋白酶S活性；水解酶活性；免疫反应；溶酶体；蛋白水解和多肽水解
					203936_s_at	4318	基质金属蛋白酶9(白明胶酶B，92kDa，白明胶酶，92kDa IV型胶原酶)	生物过程	胶原蛋白分解代谢；胶原蛋白酶分解代谢；细胞外基质；细胞外间隙；白明胶酶B活性；水解酶活性；锌离子结合
207332_s_at	7037	转铁蛋白受体(p90，CD71)	生物过程	胞饮作用；核内体；细胞外；浆膜完整性；铁离子内环境稳定；铁离子转运；多肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；受体活性；转铁蛋白受体活性
					213274_s_at	1508	组织蛋白酶B	生物过程	组织蛋白酶B活性；水解酶活性；溶酶体；蛋白水

				解和多肽水解
					213510_s_at	220594	TL132蛋白	生物过程	半胱氨酸型内肽酶；泛素C末端水解酶活性；倚赖泛素的蛋白质分解代谢
214012_s_at	51752	I型肿瘤坏死因子受体脱落氨基肽酶调节子	生物过程	氨基肽酶活性；膜内氨酰氨基肽酶活性；金属肽酶活性；蛋白水解和多肽水解；锌离子结合
					217983_s_at	8635	核糖核酸酶6前体	生物过程	RNA分解代谢；细胞外；核糖核酸酶活性

本试验的目的不是解决是否usf2s2 SNP直接导致FCHL。在得出任何单一非编码SNP的功能意义的结论之前，需要进行更复杂的功能研究。然而，这些与物种间保守性相关的初步数据意味着敏感单元型两侧的DNA区域包含影响转录调节的元件。这些数据也表明该元件更可能是顺式作用型调节子，而不是方向-独立增强子元件。

实施例5：实施例1-4的试验计划-方法

如早先所述^4.9，芬兰的FCHL家族从Helsinki、Turku和Kuopio UniversityCentral Hospitals招募。在参加研究之前，每个受试者提供了签署的知情同意书。根据赫尔辛基宣言，收集所有的样品，以及participating centers的伦理委员会批准的试验设计。FCHL先证者的包括标准如下⁴：1)血清TC和/或TGs＞年龄-性别特定芬兰人群的百分之90⁴，但如果先证者仅有一个高血脂特征，第一程度相关性必需具有组合表型；2)年龄＞30岁并＜55岁的男性和年龄＜65岁的女性；3)冠状动脉造影术中一个或多个冠状动脉至少50％狭窄。FCHL先证者的排除标准是1型糖尿病、肝病或肾病、以及甲状腺功能减退症。利用淋巴细胞培养法⁴通过测定先证者的LDL受体状态，从每个谱系中排除家族性高胆固醇血症。如果全部满足上述标准，至少有2个患病成员的家族被算入本研究中，并且检查所有可接近的家族成员。分析两个特征：FCHL和TGs。对于FCHL特征，家族成员以患病记分，根据我们最初连锁研究中的相同的诊断标准，该研究使用对高TC和高TGs的芬兰年龄-性别百分之九十，可从芬兰国立公共健康研究院(National Public Health Institute，Finland)的网站获得。这些确认标准与最初标准¹相当。为了分析TGs，TG水平≥芬兰年龄-性别特异性人群百分之九十的家族成员以患病进行编码。除了FCHL和TG特征，使用载脂蛋白B(apoB)、LDL峰值颗粒大小和TC特征，也分析了usf1s1和usf1s2的组合，其导致对FCHL和TG特征的显著单元型。对于apoB和TC，使用芬兰年龄-性别特异性人群百分之九十，可公开地从芬兰国立公共健康研究院(National Public Health Institute，Finland)的网站获得。对于LDL峰值颗粒大小，使用25.5nm的切割点来编码患病的、具小LDL颗粒的个体。尽管LDL-C是FCHL的重要成分特征，在芬兰FCHL家族确认中以及形成USF1敏感单元型的SNP的统计分析中血清TC被代替使用。这样做的原因是与FCHL相伴的显著高甘油三酯血症。当TGs过高(400mg/dl，即4.4mmol/l)，其通常是患高甘油三酯血症的FCHL家族成员病例，一般不推荐Friedewald公式。另外，LDL-C的人群百分点不能被估计，当包括该因素时，因为我们目前没有LDL-C的人群百分数。

生化分析

如先前所描述的^4，9，39，测量了血清脂质参数和LDL峰值颗粒大小。在他们的治疗停止4周后，对先证者和使用降脂药物的高脂血症者亲戚进行研究。在60个FCHL家族中，对721个和771个家族成员分别进行了DNA测试和脂质测试。在这60个FCHL家族中，有226个个体患TC＞90％年龄-性别特异性芬兰百分比，220个患TGs＞90％年龄-性别特异性芬兰百分比，以及125个个体TC和TGs分别＞90％年龄-性别特异性芬兰百分比。总共96个男性和124个女性显示高TGs(＞年龄-性别百分之九十)。

测序、鉴定基因型和序列注解

对60个FCHL先证者的TXNIP基因以及在最初连锁研究⁴中31名先证者的APOA2/RXRG和USF1基因进行测序。对TXNIP和USF1，对基因5′末端下游2000bp也进行测序。对USF1，对剩下29个先证者也测定了DNA结合域。对所有的基因，外显子和内含子也进行测序，除了对大的44，261bp RXRG基因，仅对外显子和100bp的内含子和外显子边界处进行测序。进行双向测序以可靠地鉴别杂合子。根据Big Dye Terminator Cycle Sequencing protocol(Applied Biosystems)及较小变化，进行测序，以及用自动DNA测序仪ABI 377X(Applied Biosystems)分离样本。通过使用Sequencher软件(GeneCodes)装配序列重叠群。使用dbSNP和CELEAR数据库来筛选SNPs。将焦磷酸测序(Pyrosequencing)和固相微测序法技术应用于SNP基因分型，如先前所述^4，40。使用PSQ96仪器和SNP试剂盒(Pyrosequencing AB)进行焦磷酸测序。在60个FCHL家族的18个家族中的46个家族成员的亚组中，每一个SNP进行第一次基因分型。如果SNP是多态性(在该亚组中最小等位基因频率＞10％)，在42个FCHL家族的238个家族成员中对SNP进行基因分型，包括最初连锁研究的31个FCHL家族⁴。该策略不应用于TXNIP基因，其变体都具有最小等位基因频率＜10％。使用USUC基因组浏览者(UCSC Genome Browser)测定标记物和基因的物理次序(physical order)。在本研究中表征的新SNP将提交公共数据库(NCBI)。使用Dr.Markus在芬兰国立卫生研究院研发的HWSNP程序，在三组(所有家族成员、先证者和配偶)中对所有SNPs进行测试以找出对HardyWeinberg公式(HWE)可能的违背。从USUC基因组浏览者下载对Alu元件数据的注解，其使用RepeatMasker来筛选散开重复单元的DNA序列。使用BLAST鉴别这些Alu元件中60bp序列的位置。从LocusLink下载其它的注解数据。

脂肪组织的表达阵列分析

筛选6个显示敏感型单元型的患病FCHL家族成员(参见结果)和4个与保护性单元型同源型的患病FCHL家族成员，用以评估基因表达。所有6个敏感单元型携带者来自于6个单独家族。4个同源性保护的单元型携带者是来自两个家族的同胞配对(sibpair)。在局部麻醉下从脐皮下脂肪组织收集50-2000mg脂肪组织进行活组织检查。根据制造商的说明书，使用STAT RNA-60试剂(Tel-Test，Inc.)提取RNA，然后用DNAse.I处理并用RNeasy Mini Kitcolumns(Qiagen)另外纯化。使用RNA 6000 Nano assay在Bioanalyzer(Agilent)中监测核糖体S28/S18比例和降解信号来评估RNA的质量。使用分光光度计测量样品的浓度和A260/A280比例，可接受的比例为1.8-2.2。根据Affymetrix提供的说明书，除了使用60pmol的引物和10μl反应容积，使用SuperScript Choice System(Invitrogen)和T7-寡聚(dT)₂₄引物，然后将2μg总RNA反转录为_cRNA，随后使用EnzoXBioArrayHighYield RNA转录标记试剂盒(Affymetrix)制造生物素标记的_CDNA。在杂交前，_cRNA被片断化以获得50-200碱基大小分布的转录本，之后根据制造商的建议，样本与人基因组U133A阵列杂交并扫描。

用Affymetrix Microarray Suite 5(Affymetrix，Santa Clara，CA)软件分析所扫描的图像，该软件使用统计表达算法(Statistical ExpressionAlgorithm)。所有分析参数置于由Affymetrix推荐的默认值。至100靶强度的球形标度被应用于所有的阵列，但在该点没有进行进一步的标准化。使用GeneSpring 5.0数据分析软件(Silicon Genetics，Redwood City，CA)进一步处理结果输出文件的韵律学，包括换算的信号强度值和以缺席表达的相应要求。对于每个探针阵列，使用每一基因的归一化，这样按照使用所有10个探针阵列计算出的平均强度将信号强度分类。通过用合适值将碱基值分类，该值使用在GeneSpring中执行的Cross Gene Error Model来评估，对每个单元型组，区分低质数据的截止值受到单独测定。为了在两个单元型之间鉴定不同表达基因，计算平均归一化强度的比例。如果所得结果低于平均比例外至少3个标准差，平均比例从比例的log₁₀的分布计算，认为差别具有显著性。为了进一步增加结果说服力，仅包括了存在于所有10个样本中，或不存在或为最低限度在所有病例中和存在于所有对照中(或反之亦然)。生物过程定义的注解信息(每个基因可归于该生物过程)可从分类中重新获得，该分类由基因本体论(gene ontology，GO)协会提供⁴¹。使用表达分析系统探索者(ExpressionAnalysis Systematic Explorer)(EASE)工具，将阈值设定为3，相比于在探针阵列的基因总体上所观察到的比例，进行出现于基因列表上富含基因类型的统计评估。用Fisher′s精确测试计算测试统计值为了稳固最大化，在Fisher精确概率受到调整处计算EASE得分(p值)，这样没有受到基因支持的类型被强烈的处于不利地位。而受到很多基因支持的类型处于的不利地位可忽略不计。低于0.05的EASE得分(p值)认为具有统计显著性。

USF-1的定量实时PCR分析

筛选出显示敏感单元型的两个患病FCHL家族成员和不带有单元型的两个患病FCHL家族成员，以使用SYBR-Green assay(Applied Biosystems)来评估脂肪组织中USF1的表达。根据制造商的建议，使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒，进行两步法RT-PCR。在100μl反应液中总共1μgRNA转化为cDNA，反应液中的1μl用于定量PCR反应。USF1与两个管家基因GAPDH和HPBGD的比例用于数据归一化。除了非模板对照外，使用解离曲线评估反应的特异性。在单独的10μl SYBR-Green反应液中使用下列PCR引物：对于USF1，正向：5′-ATGACGTGCTTCGACAACAG-3′，反向：5′-GGGCTATCTGCAGTTCTTGG-3′。对于GAPDH；正向：5′-CGGAGTCA ACGGATTTGGTCGTAT3′，反向：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。对于HPBGD正向：5′-AACCCTCATGATGCTGTTGTC-3′，反向：5′-TAGGATGATGGCACTGAACTC3′。根据制造商的建议，使用ABI Prism 7900HT Sequence Detection System进行反应三次，并且使用Sequence Detector2.0版本软件分析数据。

最初功能分析

在COS细胞中使用SEAP报告子系统(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)进行最初的功能分析。该系统使用SEAP作为报告分子来监控潜在启动子和增强子序列的活性，SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的分泌形式。构件克隆至pSEAP2-增强子载体中，该载体含有SV40增强子。通过测序证明每个构件中正确的等位基因和定位。在转染后的48h至72h取细胞培养基用以SEAP报告子分析。根据制造商的建议，在荧光测试中使用荧光底物4-甲基繖酮磷酸酯(MUP)来进行对SEAP蛋白的监测。数据是至少两个独立试验的代表。

统计分析

使用如最初连锁研究中相同的程序和参数进行参数连锁和受非参数影响的同胞配对(sibpair)分析⁴。研究了两个特征，FCHL和TG特征。执行ANALYZE软件包⁴⁶，利用LINKAGEpackage⁴³版本FASTLINK 4.1P^44-45的MLINK程序进行参数两点或多点连锁分析。使用ANALYZE软件包⁴⁶的SIBPAIR程序进行ASP分析。对于每个标记物，用DOWNFREQ⁴⁷程序对所有个体评估等位基因频率。

使用HHRR²⁷和配体竞争测试²⁹，对SNPs进行相关性测试。为使进行测试的数量最小化，当分析受TG和FCHL侵染的男性时，为了其相关性，仅使用HHRR²⁷测试对存在于USF1-JAM1区域外的SNPs进行测试。HHRR分析(通过使用HRRLAMB程序⁴⁸进行)测试了遗传和非遗传等位基因之间报告等位基因的同源性。使用一些SNPs，多重HHRR分析测试相同的假说。配子竞争试验是TDT的归纳，并观察标记等位基因作为等位基因间的竞争向患病小孩的遗传，使得全家谱数据的有效使用。配子竞争方法不是纯相关性测试，因为无效的假说没有相关性和连锁，以及因此连锁本身也影响所观察的p值。此外，配子竞争测试易于扩展至两个连接标记，允许在基因中同时多个SNPs分析。当用于计算它们的数据是相对稀疏时，基于渐近近似的P值可被偏移。为证实配子竞争试验结果的确显著，我们也使用基因落下(gene dropping)对包括多重SNPs(表1)的所有分析计算了试验p值。在基因落下(gene dropping)中，假定HWE和连锁平衡(LE)，用估计的等位基因频率指定创立者基因型。假定孟德尔式分离，指定子孙的基因型。因此在无效LE假说和非连锁下进行基因落下(genedropping)。为计算经验p值，多次进行基因落下(gene dropping)。此处对每个分析进行了至少50,000次模拟。来自每个基因落下(gene dropping)重复的可能性比例测试(LRT)统计值与所观察数据的LRT进行比较。试验经验p值与重复成比例，其中基因落下(gene dropping)LRT等于和大于所观察的LRT。一般而言，获得的基因落下(gene dropping)试验经验p值比小样本尺度的渐进p值更保守。

运行HBAT程序，选择最优偏移(-o)和经验测试(-e)来测试单元型和特征之间的相关性⁴⁹。选择-o测量不仅优选敏感单元型向患病者的遗传，而且优选向未患病者的遗传。-e选择导致给定连锁相关性的测试和因此给出变体的经验估计值。这些单元型分析也受到以下事实的影响：在60个扩大的FCHL家族和42个核心FCHL家族的11个SNPs中，对JAM1-USF1区域的15个SNPs进行了基因分型。为了得到选自USF1 SNPs的基因型的组合(表3)，进行了基因型谱系不平衡测试(geno-PDT)⁵⁰，该测试对全谱系提供基于基因型的相关性试验使用Genepop v3.1b程序，选择2，在它们的网站上测试JAM1-USF1区域对SNPs报告基因型之间的LD。该程序中，对基因型LD进行相关性测试，以及无效假说是一个基因座上的基因型独立于其它基因座上的基因型。该程序建立的对每个群体基因座碱基对的可能性表，以及使用Markov链对每个表进行Fisher精确测试。

统一资源定位器(URLs)

在我们的网站可获得增补表1-4和微阵列的进一步详情(www.genetics.ucla.edu/labs/pajukanta/fchl/chr1/)。使用GEO accessionGSE590通过NCBI(www.ncbi.nim.nih.gov/geo)上的Gene ExpressionOmnibus接触成套探针阵列的原始数据。在芬兰国立公共卫生研究院的网站(www.ktl.fi.molbio/wwwpub/fchl/genomescan)可获得对TC和TGs的芬兰年龄-性别90％值。我们用dbSNP(在www.ncbi.nim.nih.Gov获得)和CELERA(www.celera.com)来筛选SNP；UCSC Genome Browser(genome.ucsc.edu)来对基因物理排序和对Alu元件的注解；BLAST(www.ncbi.nim.nih.gov/blast/)来与人或小鼠数据库进行同源性序列分析；LocusLink(www.ncbi.nim.nih.gov/LocusLink/)来下载注解数据；以及Genepop(wbiomed.curtin.edu.au/genepop/index.htmi)来计算内标记LD。

实施例6：实施例7至11的方法

电泳迁移率移位分析(EMSA)

从Proligo定购代表感兴趣区域双链的DNA探针，并使用T4聚核苷酸激酶将[γ-32P]ATP标记在5′末端。根据制造商的说明书使用QIAquick试剂盒(Qiagen)去除过量的未结合标记。细胞核提取物在室温下结合缓冲液(50mMTris-HCI(pH 7.5)，5mM MgCl₂，2.5mM EDTA，2.5mM DTT，2.5mM NaCI，0.25ug/ut聚(dI-dC)-聚(dI-dC)，20％甘油)中温育30分钟，然后在含有0.5MTBE缓冲液的6％聚丙烯酰胺凝胶中电泳。凝胶在-70℃放射自显影。为了测试结合的特异性，提取物与高浓度未标记“冷”双链探针以及非特异性探针赛跑，非特异性探针代表3′-UTR SNP usf1s1周围序列，该序列不产生凝胶移位。

表达阵列分析

基于他们的USF1单元型，我们从我们的FCHL(参考文献6A)和低HDL-C家族中选择19名个体进行脂肪活组织检查。他们包括12名重要SNP usf1s1的风险等位基因的携带者和7名与非风险等位基因同源的个体。他们中的9名已经包含于我们最初的报告^6A。两组的平均年龄为49岁，性别分布接近相等(风险组7女5男对非风险组4女3男)。收集脂肪活组织，如前述提取和定量RNA^6A。如先前所述^6A，利用Affymetrix伴有次要改动，按照标准试验设计进行RNA标记、阵列处理和扫描。

使用Statistical Expression Algorithm，用Affymetrix MicroarraySuite 5(Affymetrix，Santa Clara，′California)软件分析所扫描的图像。在使用GeneSpring 6.1数据分析软件(Silicon Genetics，Re dwood City，California)进行进一步数据处理后，对靶强度100的球形扫描应用于所有阵列。对于每个探针阵列，我们使用每个基因归一化，这样利用使用全部19个探针阵列计算的平均强度来对信号强度分类，有效地集中个体周围的数据。

为在两个单元型之间鉴别不同的表达基因，我们采用包含两次过滤步骤的策略，其与统计分析组合。首先，我们使用Affymetrix检测除去不可信或不一致的数据，要求待记分为“存在”的基因在每个单元型组的超过50％样本中。为了避免丢掉潜在引起注意的属于基因的数据，基因在一组“打开”而在其它组“关闭”，我们也包括在一组的100％样品中记做“不存在”并且在其它组至少50％中记做“存在”的基因。然后在每个单元型组的样本上平均归一化值，以及计算它们的比例。评估比例的分布，并选择1.5倍取舍限将注意力聚焦于最显著和可信赖的表达变化。通过使用两样本的t-检验我们测定到显著变化，允许组间不等变化，其中两侧p值或更低认为是有统计显著性。在阵列上利用多于1个的探针装置的基因，使用与更保守P值相关的测试方法。

统计分析

没有假设等同变体，使用两样本t-检验，我们评估了在所选基因的基因表达上单元型的作用。计算两侧显著性值，并使用5％或更低概率的I类错误来测定统计显著性。为了控制来自于临床相关参数对单元型组之间所观察到的不同可能引起的混淆作用，我们进行共变量分析(ANCOVA)。作为因素的共变体，包含了BMI、胰岛素和甘油三酯水平和HOMA指数，该因素由单元型组测定，以及单独的每个共变体模型用来评估主要和相互作用。我们再次考虑I类错误在概率5％或更低时的统计显著性。通过线性回归分析，进一步审查单元型对基因表达和共变量之间相互关系的作用。研究R、R²和F统计值来评估线性模型。

至于所选基因的基因表达模式，用凝聚运算法则对样本进行未受监督的等级聚类，该运算法则使用未加权的对-组平均连锁、UPGA和融合法则。由Pearsons′关联来测定聚类相似性。通过在系统树上覆盖状态信息和可视地评估潜在的聚类，我们分析了分支模式和性别，受类状态(FCHL或low-HDL)和家族关系之间的可能关联性。

实施例7：与核蛋白结合的关键内含子序列

在9个经鉴定的基因内USF1 SNPs中，两个在编码区代表同义突变，而7个位于内含子(图4a)。对FCHL家族相关性最强的证据是用两个SNPs最初观察到的：3′-UTR的usf1s1和内含子7的usf1s2，分别位于1.24kb以及基本完整LD(D′＝0.98)。我们分析了物种间所有7号内含子SNPs的序列环境来监视系统发育的保守性，该保守性将提供它们功能重要性的线索。内含子7中最强相关性的SNP usf1s2位于以其它方式富含非保守核苷酸的基因组区域中的一段DNA序列内，该序列从人到黑猩猩、狗、小鼠和大鼠完全保守(图4b)。位于这样保守的序列延伸部分中的其它SNP仅是内含子1中的usf1s9，但它没有展现与FCHL或它的构成特征的相关性，我们没有进一步跟进。包含usf1s2的该序列的区域保守性鼓励我们研究是否隐藏了对USF1转录动力学功能上重要的一些元件。

我们首先测定了是否usf1s2区域代表DNA结合蛋白的结合位点。我们构建了两个包含SNPs usf1s2-4的34mer探针(图4b)，并允许它们为usf1s2的两个等位基因而变化。在与HeLa细胞的细胞核提取物蛋白温育后，关键序列变体都在聚丙烯酰胺凝胶上产生电泳迁移率移位(EMS)。为进一步限制可能的功能序列基序，使用更短20mer探针对进行EMS分析，该探针与34mer探针共享关键的最保守核苷酸序列。相比于34bp移位，该探针产生迁移率移位，然而，其中位于USF1 3′UTR的类似20bp探针不产生移位，该探针代表包含其它强相关的SNP usf1s1的序列(图5a)。使用未标记特定探针，但不用非特定探针，可完成探针与核蛋白的结合(图5b)。

实施例8：USF1风险等位基因携带者显示在脂肪中下游基因的不同表达

可期望转录因子(例如USF1)的定性或定量功能变化通过受其控制的基因表达效率或基因模式得以反映。我们假设，如果usf1s2多态性它本身是功能性或作为未知功能元件附近的标记物，我们能够看见携带“风险”或“非风险”等位基因个体脂肪活组织中USF1调节基因的转录情况上的不同。这将雄辩的代表处理潜在敏感多态性的体内方法。我们查询了转录因子数据库(Transfac)并选择它们来进一步分析，不论生物途径或组织特异性上的知识。

表4：在它们的调节中具有报道的USF1参与的基因(GENES WITH REPORTEDINVOLVEMENT OF USF1 IN THEIR REGULATION)

有报道USFs和这些基因的启动子体内或体外结合，以及对一些，有功能证据。经请求可获得参考文献的完整列表。这些基因，在Affymetrix U133A芯片中代表的29个用于本研究。13个以产生可信赖信号的水平在脂肪活组织中表达。在携带usf1s3不同等位基因个体间，统计显著地差异表达了粗体基因。

基因符号	全称	在U133A芯片上	在脂肪活组织中表达
				APOC3APOA2APOA5APOELIPESpot-14FASABCA1ACACAGHRLGCKGCGRRENAGTFSHRHOXB4MHC1HOXB7HBB	载脂蛋白C-III载脂蛋白A2载脂蛋白A5载脂蛋白E激素敏感脂肪酶Spot14蛋白脂肪酸合成酶ATP结合盒，A亚类乙酰CoA羧化酶α生长激素释放多肽葡萄糖激酶胰高血糖素受体肾素血管紧张素原Follice刺激激素受体同源框B4主要组织相容性复合物I同源框B7人β球蛋白	××××××××××××××	×××××××

MAP2K1CCNB1L-PKNCAEFPOPNTRAPBDNFPAI-1FceR1BRCA2DCKPIGRCYP19HTERTPF4CDK4CYP3A4SHP-1FMR-1CYP1A1	分裂素-激活蛋白激酶磷酸化酶细胞周期蛋白B1L型丙酮酸盐激酶非特异性交叉反应抗原雌激素反应指蛋白骨桥蛋白抗酒石酸酸性磷酸酶脑源性神经营养因子I型纤溶酶原激活抑制剂高亲和性IgE受体遗传性脑癌敏感基因2脱氧胞苷酸激酶聚合免疫球蛋白受体细胞色素P450家族19家族人端粒酶逆转录酶血小板因子4细胞周期素依赖的蛋白激酶细胞色素P450家族3A家族多肽4有两个src同源性2域的酪氨酸蛋白磷酸化酶脆性X智力低下细胞色素P450，家族1，亚家族A，多肽1	×××××××××××××××	××××××××
					40	29	13

为研究USF1等位变体在转录情况上可能的作用，我们从来自脂质代谢障碍家族(FCHL和低LDL-C)中的一组的19名个体获得脂肪组织。他们包括与稀少2-2型usf1s2基因型同源的个体(标记为“非风险”单元型)和12名以同源型(8)或异源型(4)形式携带普通1等位基因的个体。在40个列出的USF-1控制基因中，29个在本研究使用的Affymetrix U133A芯片上受到代表，一些基因被多重探针装置代表。我们发现关于产生可信赖信号，受到总共19个探针装置代表的13个基因在脂肪组织中以足够高的水平表达，以及被包括在本研究中(表4)。该表中是一些与脂质和葡萄糖代谢高度相关的基因，以及关联性不是直接明显的一些基因。归一化后，当使用不假设等同变体的两样本t检验进行评估时，在USF1单元型基因组之间的三个基因(被所有一致的总共6个探针装置代表)显著不同地表达(P≤0.05)。所有三个基因与表型高度相关：三磷酸腺苷结合盒亚家族A(ABCA1)(参考文献13A)、血管紧张素原(AGT)(参考文献14A)和载脂蛋白E(APOE)(参考文献15A)(图7)，这三个基因在携带USF1“风险”或“非风险”单元型个体之间不同的表达。

实施例9：ACACA对胰岛素的不同反应

在各种代谢基因的调节中，例如血清胰岛素和葡萄糖等信号是重要的。已知胰岛素影响USF1结合E-box序列的能力，并且因此适应代谢变化参与基因表达调节^16A。为了评估在USF-1控制基因表达上这些因子可能的贡献，我们对数据提供ANCOVA模型。我们也进一步扩展模型来测试体重指数(BMI)、甘油三酯和HOA(稳态模型评估)，基于空腹血清和胰岛素值的胰岛素抗性测试法^17A。对所有，除了被测试基因中的一个，从各种相关变异我们没有观察到显著贡献，因此导致测试统计值基本与样本的两样本t检验的统计值相同。然而，与早先发现一致^18A，我们观察到在乙酰CoA羧化酶α(ACACA)的表达上胰岛素水平的可检测影响(P＝0.05)。使用线性回归，更进一步考察该关系，其证明在ACACA的稳态转录水平和空腹胰岛素水平之间的适当的强烈负相关(R²＝0.453)。单元型组的偏回归附加地证明本质上该相互关系上携带2-2“非风险”单元型个体(R²＝0.956)比携带USF1“风险”单元型的个体强许多(R²＝0.093)。

此外，通过进行个体表达水平的无监督聚类，我们也测试是否像性别或研究股(FCHL或低LDL)应被考虑在我们的研究中。对这些变量而言，对任意所看到的测试方法我们没有检测到效果，如同个体随机聚类所证明的那样。

实施例10：在全部基因组转录本特征中突出的APOE变化

除了对已知USF-1调节基因的分析，在不同USF1单元型携带者之间，对基因变化的转录水平，我们测试了整个阵列数据。这类方法已经成功的用于在不同装置之间鉴别通路和共调节基因的收集^19A。当用明显的表型不同(例如糖尿病对非糖尿病^19A或肿瘤组织对非肿瘤组织)的组进行比较时，这已经被经常做过^20A。在我们的研究中，表达不同≥1.5倍并且达到了两样本t检验中的统计显著性限值(P≤0.05)的变化定义为显著。该方法鉴别了15个基因，其中在携带非风险型单元型的个体中10个被正调节以及5个被负调节(表5)。

表5：全阵列间大部分不同地表达的基因

比较两个单元型(以在usf1s2的等为基因定义)组之间在全阵列上正常基因表达，用以产生最大不同调节基因的列表。表达不同≥1.5倍并且达到了两样本t检验中的统计显著性限值(P≤0.05)的变化定义为显著性变化。尤其在非风险个体中最大上调基因是USF-1调节基因载脂蛋白E。

在非风险个体中被正调节

普通	Genebank ID	倍数变化	P-值
				APOEMBD4GLULESTsCYP4B1VEGFSLC6A8CIDEALY75FLJ20859	N33009AI913365NM_002065AA721025J02871AF022375U17986NM_001279NM_002349NM_022734	2.01.91.81.71.61.61.61.61.51.5	0.01630.02930.04730.04710.02000.01740.01210.02290.02980.0001

在非风险个体中被负调节

普通	Genebank ID	倍数变化	P-值
				TNMDDKFZP761IL6AGTRL1TYRP1	NM_022144N09121 BF435376NM_000600X89271NM_000550	-2.2-1.7-1.6-1.6-1.5	0.00830.00290.00240.01860.0240

接下来，在风险个体的下调基因列表中第一基因是APOE。在携带USF1风险单元型个体的脂肪组织中APOE的表达比携带非风险单元型的个体中的表达低2倍。列表中其它潜在令人感兴趣的基因包括涉及脂肪酸代谢的CYPB1和涉及血管发生、高血压的VEGF，以及VEGF是在血管紧张素II诱导的血管炎症中的基本调节剂^21A。需要试验数据证明是否USF1也在这些基因调节中发挥作用。

实施例11：在区域基因上重要SNP无强作用

最后为了研究是否内含子7上假定调节元件表明强顺式调节元件，以及施加对USF1邻近其它基因表达的控制，我们研究了从5′CD244基因至APOA2(一个392kb的连续区段)所有通路的10个侧面基因的表达水平。这10个基因中，6个从相同的DNA链转录(如USF1)和4个从相反链。取决于个体在usf1s2的等位基因，表达水平显著不同的仅有装置是临近血小板F11受体(F11R)基因的那个(P＝0.013)。由于在FCHL家族中显示相关性的重要染色体间隔到达高甘油三酯男性等位基因的F11R^6A。在U133A阵列中两个探针装置代表F11R，然而在两个USF1单元型组之间仅一个显示显著不同。对基因组上代表序列的更进一步检查，我们注意到显示不同表达的探针装置实际未代表F11R基因，而是代表直接与其相邻的短表达序列标记(EST)(AW995043)，该序列标记在USF1基因的3′一侧43.5kb处。

                        序列表

                    SEQUENCE LISTING

<110>国家公共卫生研究院

<120>与高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷相关的SNPs的鉴别

<130>PIY06179PW-EP/YY

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5687

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>变异

<222>(3966)..(3966)

<223>r＝腺嘌呤(a)或者鸟嘌呤(g)：

     a和野生型相关，g和疾病相关

<220>

<221>变异

<222>(5205)..(5205)

<223>y＝胞核嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)：

     c和野生型相关，t和疾病相关

<400>1

ttgaaaattt tccttggata ggaaaggttt ggaggacctt atgggtagag aatttccaaa    60

aatcttgccc cttttgtgtt gggattatct tattgctttg tactgtgtag ctgtttcttt    120

ctggaggcat gtctgcccag ctctttgttt ttcctgccct ctggctgggt gtcagggtcc    180

taaggcagag cttgtaggtg gattcttccc cctttgtctc ttcttcagaa ccctgttttt    240

ttttttttta ccccttcttg ctcaggctta gttgatttgg agttgtcata gcaacatttt    300

agcaacagtg ttgttctgca ggaaggcttg atgaataaaa tagagaatgc ttgaagagga    360

tccacttggg ctttagggtt tctaacagat tatataaatc tggatacccc aaaacaagag    420

tcctgtcagt agaatggggc ccaaatgcca agtctagtct ttgtggtcag ggatattctt    480

ccagtggtag tgggcttcag atttcctctt cctaggtttg aaaacagaaa tgtcttgatg    540

gacaacatgt ggctgagaaa ctggaagaag catcagtgtc catgacactg tattttttga    600

tggtggggcc aatacatggc ccttcctgat tcccatgaag ctgccatcat ggcaggtcat    660

aatagcttta atgatccatt tagagatgtg ttgttggctg ggtgcggtgg ctcatgcctg    720

taatccaagc actttgggag gccgaggcag gcggatcacc tgaggtcagg agttccagac    780

cagcctggcc aatatggtaa aaccccatct ctactgaaaa tacaaaaatt agctgggcgt    840

ggtggtgggc acctataatc ccagctattc aggaggctga ggcaggagaa tcacttgaac    900

ccaggagatg gaggttgtaa gccgagattg tgccactgca ctccagcctg ggtgacagag    960

caagattctg tctcagaaaa aaaaaaaaaa aaaagaaaga aatgtgttgt ttcggccagg    1020

tgcagtggct cacacctgta atcccagcac tttgggaggc tgccgaggtg gacagatcat    1080

gctctcagga gttcgagacc agccgggcca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat    1140

acaaaaatta gccaggcgtg gtggtgtgca cctgtaatcc cagctactcc ggaggctgag    1200

gcaggagaat cacttgaacc tgggaggcag aggttgcagt gagctgagat cgcgccactg    1260

cactccagcc tgggtgacag agagagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagtg    1320

ttgtttctgt cttccagtat aattatccac tctccaccag gagttggagt gataatggag    1380

ggatggggaa cactatttgt agccttgctt tttcaatcac tgtaggccag tcctcaacat    1440

cagtatggtg gaggctgatt gtcccctgca gatgactggg ttattttcct ggctatgtgt    1500

tcatggaacc taagttctag aaccagagat actgttctgt ttcctaaact cattgcaaac    1560

ttcatgattt ctaccaggac ttagcactca ggcctgtgaa tcaggagata caaagacctc    1620

caaaaaagga ccagttcctc ggatgtgccc cctcacagag agatgaaggg gtgagtgaag    1680

aagaggtagg gtctgggatg aaagatgggt ggcctggaag aatgcaaaat gaccaagagc    1740

actgcctctg gagtcaggca gacctggatt caggttctac tctatcactt actgtgtgat    1800

ttggtttctc tatctataaa atggaagtag tgctatctat ctcgtggtgc tgtttttagt    1860

actaaataag attacatgta atgtacttag cttagtgctt atgtacatag taaacagtaa    1920

acactagttg ttattctaac ctaacccagc ttctgttggg aatgccaatg agtttgcagc    1980

catatgttac tgggccagtg agcttctcat tgacttcttc tcatactctt ccttttgtcc    2040

tttcaccaca aacaggcagc agaaaacagc tgaaacggaa gaggggacag tgcagattca    2100

ggaaggtgag tgctagaaac agaaccaaga ctaagaaccc atcatggcct cccttccttc    2160

cccaccagac catctcctgt gcatcctcct ccttccgtga catgcaaatg gaacgggggt    2220

agaaaggcag ttaactcaca gacttttcct ttgttctttt aattcaggtg cagtggctac    2280

tggggaagac ccaaccagtg tggctattgc cagcatccag tcagctgcca ccttccctga    2340

ccccaacgtc aagtacgtct tccgaactga gaatgggggc caggtaaggg agggggccag    2400

gtggctgcag gtgttatctg gggttgggat tgagggaggt aattgaacat gtcttgggga    2460

gacctggctt ggaggatgag ttgaaagagt ggactgttgc aggggaggga ggtgctaata    2520

ctggagtaga gactggtgtg aggttagatg tatgctgaaa cctctgtgtg gggaaagaag    2580

ggagaatggc tgaatccatg tctctgaagg actttgtttt ggggccctat ccaagggaag    2640

ctttatgagg ggccctagga ttcccaacac ttaatctttt cttctctctt cactccctct    2700

gccttcctct acacttctag gtgatgtaca gggtgatcca ggtgtctgag gggcagctgg    2760

atggccaaac tgagggaact ggcgccatca gtggctaccc tgccactcaa tccatgaccc    2820

aggtacaggg tatgggctgg ggaggtcact agagttctga gaagtaagat gaagaaggga    2880

atcagtagga tgggggtgaa gctaggaaca gtgaggcatc taaggctgcc ttgtcccaaa    2940

gcactaggct ctccttttct ggatgtttct ctctctctct ctctctctct ccaccctacc    3000

taccacccca acggatagaa gctgcagagt ggtgtagtgg gaagaagttt ttgactgtta    3060

ccagaatcag ttttcttgct ccccttccca ggcggtgatc cagggtgctt tcaccagtga    3120

tgatgcagtt gacacggagg ggacagctgc tgagacgcac tatacttact tccccagcac    3180

ggcagtggga gatggggcag ggggtaccac atcggggagt acagctgctg ttgttactac    3240

ccagggctca gaggcactgc tggggcaggc gacccctcct ggcactggtg agatattgca    3300

tgaggatgct ggctgaaagg gctagaatag gctgtgggac atgactggta ggcagtgagc    3360

cttcactcat gactcttagt gatcattaag acctggacag gcagtgagtc tggggctgct    3420

cttctattag catgttcttt ttagaggagg ggaccagggt cttcacctca gggcttggtg    3480

aggttcctac ccatgtcctg acagaaccta ccctgcatct tcacaggtca attctttgtg    3540

atgatgtcac cacaagaagt actgcaggga ggaagccagc gctcaattgc ccctaggact    3600

cacccttatt ccccgtgagt gacccttgtt tcttctcaga ttccgtaagt ggtttttttt    3660

tttttttttt ttttttgaga cagagtcttg ctctgtcacc caggctggag tgcagtggca    3720

tgatctcagc tcactgcaac ctctgcttcc agggttcaag cgtttctcat gcctcagcct    3780

cctgagtagc tggaactaca gacatgtacc accacccctg gctaattttt gtatctttag    3840

tagagacagg gtttcaccat gttggccagg ctggtctcga actcctgacc tcaagtgatc    3900

cgcctgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggtgt gagacaccac acctagctac    3960

cataartggt cctaatacct gctaaatctt gtataattcc ttaaccccaa acttcaatca    4020

tgtattttgt cttcttactc tggccaccct gggctctgtt gtcaggaagt cagaagctcc    4080

ccggacgact cgggatgaga aacgcagggc tcagcataat gaaggtaggt atgatctggg    4140

tggagctaga agctgtctgg tgtgatctca gcagtgatgt ctgaggggag gagggattag    4200

gtaattttac cctgggactt gtggcgagtt ttcactgagt caccttgtcc tccactttgc    4260

cccacagtgg agcgtcgccg ccgagacaag atcaacaact ggatcgtgca gctctccaag    4320

ataatcccag actgctctat ggagagcacc aagtctggcc aggtcatgga aagaccctgg    4380

tagtgggcag gatgcctgaa ttctgcctcc tggtattgtt tccagaaatg gtagagagag    4440

gggcacacat gacagtagtc ttatctctcc ctgaggttcc tgtatccctg ggagatatta    4500

taccaccttc cttagatgaa aatgaggtcc aaagtgtgaa cctacttttg gaaagcaagc    4560

tgggtatctg aaatcctagt tctcattttg ttgaccttat cttgcagagt aaaggtggga    4620

ttctatccaa agcttgtgat tatatccagg agcttcggca gagtaaccac cgcttgtctg    4680

aagaactgca gggacttgac caactgcagc tggacaatga cgtgcttcga caacaggtca    4740

gactcctacc cccagtgcag cccttctcag ttctgctagc cactgaccca gtttgacacc    4800

ctctactttg ttctccatgg agaaggcttc atcttttccc cctcaccagt ggatgtctga    4860

atacattcag gggcttggaa gtgccagctt tactacccat tccctttact gcctccttcc    4920

catgtcaggt ggaagatctt aaaaacaaga atctgctgct tcgagctcag ttgcggcacc    4980

acggattaga ggtcgtcatc aagaatgaca gcaactaact atggggattc aggggctttg    5040

ggcccaagaa ctgcagatag cccaggagca acagcctaat cccgtgcccc tttccttcac    5100

tgccccactt ctggcatggg acagggggaa gttcagaagg tgtgtccttg aactgaggcc    5160

ctgtgatatg gcggcctgca gtggtgtgaa acacacaatg tggaygtgca ctgacagcct    5220

tgcccacccc caccatgcag cccctgggcc cttgtgctcc tctcgcacaa tgcatgtgct    5280

gtctccatgc tggatactgg acacactaaa ctctggggct tgtcctgtgc ttgcttagag    5340

tgcccagcag aggtttgctg acaggtgatg ctctggcttg ccccaggact ctggcacttc    5400

cattggttct tcctttccct ggagctgagg tttagatgtg caacctgtgg ctcaggggag    5460

caagcttaca caagaagtga gggaaggatg tttagcagtg gctggtgccc atgaagagga    5520

gattggccag tgagaagctg aggcctatgc agacatctct ggagccagag agaacaacag    5580

gcaggggccc acttggggcc ttcccccttg tgggggtcgt tttttttttt tcttttcttt    5640

tttttttttt tttttttttt tttttaagat aaaattgttc aaagcca                  5687

Claims (33)

1、核酸分子，包含促进或指示高脂血症、血脂障碍和糖代谢缺陷的染色体区域，其中所述的核酸分子选自：

(a)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸具有一个或多个对USF1功能有影响的突变；

(b)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的内含子7的3966位包含鸟嘌呤或腺嘌呤残基；和/或

(c)具有或包含SEQ ID NO：1的核酸分子，其中所述的核酸特征在于在USF1序列的外显子11的5205位包含胞嘧啶或胸腺嘧啶残基；

其中所述的核分子在SEQ ID NO：1核酸分子的5′和/或3′末端延伸最大50000个核苷。

2、如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于该核酸分子是基因组DNA。

3、如权利要求1或2的所述的至少具有20个核苷酸的核酸分子片断，其特征在于其中所述的片断包括SEQ ID NO：1的3966位或5205位的核苷酸。

4、核酸分子，其特征在于其与根据权利要求1至3任意一项所述的核酸分子互补，且其长度至少20个核苷酸。

5、载体，其特征在于包含根据权利要求权利要求1至4任意一项所述的核酸分子。

6、引物或引物对，其中在严格条件下引物或引物对与权利要求1至4的任意一项的核酸分子或其互补链杂交，该核酸分子包含SEQ ID NO：1的3966位或5205位的核苷酸。

7、非人类宿主，其特征在于该寄主用权利要求5所述的载体转化。

8、如权利要求7所述的非人类宿主，其特征在于该寄主是细菌、酵母细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、转基因动物或转基因植物。

9、药用组合物，其特征在于包含USF1或其片断、编码USF1或其片断的核酸分子，或对USF1特异性的抗体。

10、诊断组合物，其特征在于包含编码USF1或其片断的核酸分子、根据权利要求1至4任意一项所述的核酸分子、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的引物或引物对或对USF1特异性的抗体。

11、检测高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，其特征在于该方法包括分析得自预期患者或得自携带USF1基因野生型或变体等位基因存在倾向的受怀疑个体的样本。

12、如权利要求11所述的方法，其特征在于其中所述的变体包括在纯合或杂合状态下USF1基因在3966位或5205位的SNP。

13、如权利要求11或12所述的方法，其特征在于其中所述的测试包含在严格条件下将权利要求4所述的的互补核酸分子与样品中包含的核酸分子杂交，并检测所述杂交，其中所述的互补核酸分子包扩包含SNP位置的序列。

14、如权利要求11至13任意一项所述的方法，其特征在于该方法进一步包含用限制性内切酶降解所述杂交产物，或用限制性内切酶使所述杂交产物经受降解，以及分析所述降解产物。

15、如权利要求14所述的方法，其特征在于其中所述的探针是可检测标记。

16、如权利要求11至15任意一项所述的方法，其特征在于其中所述的测试包括测定包含权利要求1至4任意一项的至少部分的核酸序列，其中所述的部分包括SNP的位置。

17、如权利要求16所述的方法，其特征在于其中所述的测定核酸序列通过固相微测序法实现。

18、如权利要求17所述的方法，其特征在于该方法进一步包含在测定所述核酸序列之前，扩增所述核酸分子的至少所述部分。

19、如权利要求11至15所述的方法，其特征在于其中所述的测定包括进行扩增反应，其中在所述扩增反应中使用的至少一个引物是权利要求6所述的引物或属于权利要求6所述的引物对，包括测定扩增产物。

20、如权利要求19所述的方法，其特征在于其中所述的扩增通过聚合酶链反应(PCR)实现或所述扩增是聚合酶链反应(PCR)。

21、检测高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，其特征在于该方法包含测定得自人的样本中的(a)USF1、(b)ABCA1或(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E的量。

22、如权利要求21所述的方法，其特征在于其中所述的其中通过使用对(a)USF1、(b)ABCA1或(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E特异性的抗体或适体实现的。

23、如权利要求22所述的方法，其特征在于其中所述的抗体或适体是可检测标记的。

24、如权利要求21至23任意一项所述的方法，其特征在于其中所述的测试是免疫分析。

25、检测高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向的方法，其特征在于该方法包含测定得自人的样本中编码(a)USF1、(b)ABCA1或(c)血管紧张素原或(d)载脂蛋白E的RNA的量。

26、如权利要求11至25任意一项所述的方法，其特征在于其中所述的样本是血、血清、血浆、胎组织、唾液、尿液、粘膜组织、粘液、阴道组织、得自阴道的胎组织、皮肤、头发、毛囊或其它人体组织。

27、如利要求11至26的任意一项所述的方法，其特征在于其中所述的来自样本的核酸分子或蛋白被固定于固体支撑物。

28、如权利要求27所述的组合物，其特征在于其中所述的固体支撑物是芯片、硅薄膜、球珠或微滴定板。

29、如权利要求1至5任意一项所述的核酸分子在分析高脂血症和/或血脂障碍和/或糖代谢缺陷存在或倾向中的用途。

30、USF1或其片段或编码USF1的核酸分子和/或至少包含USF1的内含子7和/或外显子11的野生型序列在制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β酯蛋白血症(hyperapoB)、家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途。

31、试剂盒，其特征在于该试剂盒在一个或多个容器中包含权利要求1至5任意一项所述的核酸分子，权利要求6所述的引物或引物对和/或权利要求7所述的载体。

32、USF1表达抑制剂在制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)、家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途，其特征在于其中所述的抑制剂是(a)包含与USF1基因转录区互补核苷酸序列的siRNA或反义RNA分子，或(b)于USF基因具有特异性的抗体、适体或小抑制剂。

33、USF1表达激活剂在制备用于治疗包括家族性混合型高脂血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、高β脂蛋白血症(hyperapoB)、家族性血脂障碍高血压(FDH)、代谢综合症、II型糖尿病、冠心病、动脉硬化症或高血压的高脂血症和/或血脂障碍的药用组合物中的用途，其特征在于其中所述的激活剂是小分子。

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