CN1334875A - 新颖的细胞信号多肽和核酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的SRK多肽、其生物学活性多肽片段和编码它的核酸。这种多肽在调节细胞发信号和信号转导途径中具有多种活性,例如包括蛋白激酶活性;自磷酸化活性;细胞存活促进活性;HAX－1结合活性;编程性细胞死亡抑制活性;MAPKK刺激活性;转录调制活性;和SRK特异性致免疫活性。本发明涉及SRK或其同系物的所有方面,包括调制剂、活化剂、配体等的测定法。本发明也涉及胞质或可溶性HAX－1,当在细胞内被表达时,它引起编程性细胞死亡。

Description

新颖的细胞信号多肽和核酸

发明背景

促细胞分裂剂活化的蛋白激酶(MAPK)途径介导各种调节从酵母到哺乳动物的生物体细胞生长和分化以及应激反应的信号(Lewis等《癌症研究进展》74：49-139，1998)。这些途径由激酶级联组成：丝氨酸/苏氨酸激酶MAPKKK，它磷酸化和活化双特异性激酶MAPKK，后者进而能够将磷酸根转移到第三种酶MAPK的苏氨酸和酪氨酸上。MAPK随后磷酸化和活化转录因子，其中包括各种底物。在哺乳动物中，原型MAP激酶级联是由Ras开始的(Howe等《细胞》71：335-342，1992)，包括Raf、MEK和ERK(Lewis等《癌症研究进展》74：49-139，1998)。在酿酒酵母中，最具特征的MAP激酶级联是响应交配信息素的级联。在该系统中，Ste11是MAPKKK，它活化Ste7，后者是MEK的副本，进而活化两种功能上多余的MAPK，即Fus3(Elion等《细胞》60：649-664，1990)和KSS1(Courchesne等《细胞》58：1107-1119，1989)。我们和其他人(Freed等《科学》265：1713-1716，1994；Irie等《癌症研究进展》265：1716-1719，1994)以前已经指出，由该系统基因失效所致Ste11的丧失在功能上能够得到活性哺乳动物Raf蛋白及其底物MEK的补充。该杂合MAP激酶途径与交配信息素的刺激作用没有联系，响应Raf或MEK活化剂，后者具有可在缺少组氨酸的培养基上生长的HIS3基因表达。

附图的简要说明

图1是阐述用于鉴定和克隆SRK的策略的图解。

图2显示编码人SRK的核苷酸和氨基序列。

图3A和图3B显示使用SRK cDNA所进行的RNA印迹分析。

图4显示SRK突变体降低Ras导致转化灶的能力。

图5是HAX-1的不同片段图解。

图6是显示在HAX-1复合体中发现SRK-WT和SRK-KA的数据。

图7显示HAX-1的氨基酸和核苷酸序列。

发明的详细说明

新颖的核酸和多肽序列已被鉴定，它们编码存活调节激酶(以下称之为“SRK”)，这是一类参与细胞信号转导途径的蛋白质，例如促细胞分裂剂活化的蛋白激酶途径。SRK、其片段和其衍生物具有一种或多种下列生物活性，包括但不限于：蛋白激酶活性；自磷酸化活性；细胞生长调节活性；细胞存活促进活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK活化或刺激活性；核导向活性；和SRK特异性致免疫活性。

蛋白激酶活性例如指SRK、其片段或其衍生物能够催化这样一种反应，其中磷酸基从磷酸供体转移到磷酸受体氨基酸残基上，优选地转移到丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链上。SRK蛋白激酶活性的底物例如包括自身、MBP和BAD。SRK的蛋白激酶活性类似于MAPKKK的活性，例如Raf(Bonner等《核酸研究》14(2)：1009-1015，1986)、Muk(Hirai等《癌基因》12：641-650，1996)、TAK1(Irie《科学》165：1716-1719，1994)和MLK(Dorow《欧洲生物化学杂志》213：701-710，1993)。蛋白激酶活性能够用常规方法鉴定，例如公开在Bagrodia等《生物化学杂志》270：27995-27998，1995；Coso等《细胞》81：1137-1146，1995和下面的实施例中。术语“自磷酸化”指SRK能够在蛋白激酶反应中兼任催化剂和底物。

SRK也具有对HAX-1(与HS1缔合的X-1蛋白)类蛋白质的结合活性。这种活性能够用任何适当的方式加以测量。例如，可以利用一种体内测定法，其中采用酵母双杂种筛选，以检测SRK与HAX-1之间的结合活性。例如参见Braselmann和McCormick《欧洲分子生物学组织杂志》14：4839-4848，1995；Chien等《美国国家科学院院报》88：9578-9582，1991；Fields和Song《自然》340：245-246，1989。结合活性也能够用体外方法检测。SRK、其片段或其衍生物能够在有效发生结合的条件下与HAX-1肽(全长HAX-1或其生物学活性片段)结合。SRK或HAX肽能够在可检测的水平上加以标记。测定法可以在液相中完成，其中在珠粒上分开结合的和游离的配体，或者根据需要，测定法也可以在固相中完成。固相测定法可以利用免疫荧光等进行。

SRK所具有的另一种功能是编程性细胞死亡抑制活性。编程性细胞死亡中，细胞经历特征性形态学改变，其中的细胞及其核皱缩、凝结并频繁地断裂。SRK、其片段和其衍生物能够抑制编程性细胞死亡。“抑制”指SRK降低、减少、缩小、阻断、抑制等给定种群中在SRK不存在的情况下将经历编程性细胞死亡的细胞的数量。因此，SRK还具有细胞存活促进活性。

编程性细胞死亡抑制活性能够用基于细胞的不同测定法加以测量，例如在细胞正常地经历编程性细胞死亡的条件下将SRK多肽(或其衍生物)对细胞给药，观察多肽对编程性细胞死亡的表型作用。可观察到的编程性细胞死亡表型例如包括DNA断裂、凝聚染色质结块、核被膜解体、细胞与核皱缩等。可以采用任何被编程经历编程性细胞死亡的细胞类型，例如Il-3依赖性细胞，如FL5.12细胞(例如IL-3的撤出导致编程性细胞死亡)，造血细胞，果蝇细胞，和线虫细胞。另参见下文。编程性细胞死亡抑制活性也可以在已被设计经历编程性细胞死亡的细胞内加以测量，设计方法例如引入细胞死亡基因，包括可溶性Hax-1(克隆104；参见实施例)、ced-9等。因此，如实施例所述，向细胞引入细胞死亡基因引起编程性细胞死亡；SRK多肽或其衍生物对细胞给药抑制表型。

SRK、其片段和其衍生物还能够表现细胞转化活性。当SRK在致瘤性ras、例如RasV12的存在下被表达时，则显示这种活性。这种活性例如指当SRK被适当的刺激物活化时，在宿主细胞内发生表型改变，导致其以失控的方式增殖，与在癌细胞内所观察到的缺陷相似。转化活性可以通过任何适合的方法加以测量，这些方法测定正常生长控制力的丧失，例如增殖测定法、转化灶形成测定法等。

SRK还能够活化MAPKK多肽，即MAPKK刺激活性。这种活性可以是直接的，例如直接作用于MAPKK(例如使其磷酸化)，或者可以是间接的，其中的活化作用是通过作用于一种或多种中间体、后者然后刺激MAPKK的活性而实现的。MAPKK刺激活性例如指SRK及其多肽活化或刺激MAPKK蛋白激酶的活性。MAPKK刺激活性可以体内或体外测量，如实施例所述。被SRK刺激或活化的MAPKK蛋白例如包括MEK和Ste7。在一种类型的测定法中，SRK在细胞内与MAPKK被共同表达，分离MAPKK，然后利用一种适当的底物测定激酶活性，例如，当使用MEK时，底物是ERK；当使用Ste7时，底物是Fus3或KSS1。刺激活性的量可以通过测量来自用与不用SRK转染的细胞的MAPKK激酶活性加以测定。MAPKK刺激活性也可以用基于细胞的测定法测量。例如，当用SRK转化时，MAPKKK活性有缺陷的细胞系、例如缺少Raf或Ste11的细胞系的细胞生存能力得到救助。参见下文实施例，供进一步指导。

SRK是细胞信号转导途径的一员，该途径的活性之一是活化基因的转录。表达分析可以按常规方法进行。例如，可以设计高密度寡核苷酸碎片阵列，以监测表达。这种碎片可以含有所有的人基因组或人基因组的子集。例如参见Anderson等《Topics in Current Chemistry》194卷117-129页，1998；Southern《Current Biology》7：85-88，1996；Marshall和Hodgson《Nature Biotechnology》16：27-31，1998。

术语“SRK特异性致免疫活性”指SRK多肽引起对SRK具有选择性的免疫应答。这种应答可以是细胞的或体液的。因此，选自哺乳动物、例如如图2所示的人SRK多肽的SRK氨基酸序列对抗体、T-细胞、巨噬细胞、B-细胞、树突细胞等的刺激作用是特异性致免疫活性。这些应答可以用常规方法测量。例如参见下文，其中SRK特异性抗体是针对C-端肽产生的。

哺乳动物SRK、例如人SRK是具有这样一种氨基酸序列的哺乳动物多肽，该序列可从天然来源获得，并且具有一种或多种所述活性。它可以具有图2所示的序列，该序列具有开始于起始密码子并结束于终止密码子的可译框架。它可以包含这种序列的片段，可以具有上述和下述生物活性。因此它包括天然产生的正常的、突变的、多形的等序列。天然来源例如包括活细胞(例如是从组织或整个生物体得到的)、培养后的细胞系(包括原代和无限增殖化细胞系)、活组织检查后的组织等。

本发明的人SRK和有关形式被至少三种不同的RNA信息编码，分别约为7.5Kb、3.8Kb和1.6Kb。图2显示被约7.5kb mRNA编码的SRK的氨基酸与核苷酸序列和约2kb的cDNA克隆(“J42”)。也鉴定了编码3.8kb mRNA信息的cDNA。这种cDNA约为2.4kb(“J207”)，含有与J42相同的激酶结构域，不过在其羧基末端是有区别的。图2中的箭头表示为SRK和J207所共有的序列的末端。

本发明也涉及哺乳动物SRK的片段。片段优选是“在生物学上是活性的”。“在生物学上是活性的”意味着多肽片段在活体系统内具有活性，或者对活体系统的组分具有活性。生物活性包括所述的那些，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；细胞生长调节活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK活化活性；和SRK特异性致免疫活性。片段可以按照任何所需的方法加以制备，包括化学合成、基因工程、裂解产物等。见下。SRK的生物片段包括氨基酸序列已被除去或者在蛋白质的羧基或氨基末端已被修饰的SRK，例如从其原型加工成“成熟”的SRK。

本发明也涉及具有如图2所示1至455氨基酸的推断序列的人SRK。455个氨基酸的多肽具有约51千道尔顿的分子量。它包含下列结构域：位于约氨基酸23-250的激酶结构域(如下文所讨论的，在该区域内的突变影响激酶活性，例如位于氨基酸45、46和133)，位于约氨基酸287-322的亮氨酸拉链区域和位于约氨基酸430-455的酸性结构域。

本发明的SRK多肽(例如具有如图2所示的氨基酸序列)，可以通过可获得的方法加以分析，以鉴定多肽中的其它结构和/或功能结构域，包括膜跨越区域、疏水性区域。例如，SRK多肽可以通过下面公开的方法加以分析，例如Kyte和Doolittle《分子生物学杂志》157：105，1982；EMBL Protein Predict；Rost和Sander《蛋白质》19：55-72，1994。

其它来自哺乳动物和非哺乳动物来源的SRK同系物可以按照各种方法获得。例如，可以采用与选自人SRK核苷酸序列的寡核苷酸杂交的方法，以从其它种类中选择同系物，例如Sambrook等《分子克隆》第11章，1989所述。相对SRK而言，这样的同系物可以具有不同程度的核苷酸和氨基酸序列的同一性和相似性。哺乳动物例如包括啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、猴、猪、牛等。非哺乳动物例如包括脊椎动物、无脊椎动物、斑马鱼(zebra fish)、小鸡、果蝇、C.elegans、爪蟾属、酵母(例如S.pombe、酿酒酵母)、蛔虫、原核生物、植物、拟南芥属、病毒等。

本发明也涉及SRK特异性氨基酸序列，例如，定义的氨基酸序列，它是在图2特定人群中、而不是在来自非SRK多肽的其它氨基酸序列中发现的。相关蛋白质之间的比较可用于选择对SRK呈特异性的序列。特异性氨基酸序列可以用常规方法找到，例如利用BLAST计算机程序组检索基因/蛋白质数据库。SRK特异性氨基酸序列可用于制备肽，作为抗原用于产生对其呈特异性的免疫应答。通过这种免疫作用所得抗体可作为哺乳动物SRK蛋白的特异性探针，用于诊断或研究的目的。SRK特异性氨基酸序列例如包括氨基酸AKQNSSKTTSKRRG，如图2所示。

如上所述，本发明的多肽可以包含SRK的各种氨基酸序列(例如具有如图2所示的起始和终止密码子)、成熟氨基酸序列(即，此处SRK多肽是作为前体加以制备的，再将前体加工为成熟多肽，这种肽的加工类似于Ras(例如Gelb《科学》275：1750-1751，1997))或其片段。有用的片段例如包括这样的片段，它们包含任意上述结构域和SRK特异性氨基酸序列或者基本上由这些组成。

可以对SRK多肽的片段加以选择，使其具有特异性生物活性，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；细胞生长调节活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK活化或刺激活性；转录调制活性；SRK特异性致免疫活性等。有用的片段可以用常规方法加以鉴定，通过对所需的活性进行试验。有用的片段例如包括下列图2片段：1-250、1-23、23-250、251-455、1-286、287-322、1-322、323-455、1-429、430-455等。

这些活性的测量方法描述在下文和实施例中。这些肽也可以如EP496 162所述加以鉴定和制备。有用的片段可以包含例如大约九个邻接的氨基酸或者基本上由它们组成，优选为图2的大约10、15、20、30、40个等邻接的氨基酸。

相对图2所示氨基酸序列而言，本发明的多肽也可以具有100％或以下的氨基酸序列同一性。为便于以下的讨论，序列的同一性是指在所比较序列的对应位置，核苷酸或氨基酸与图2所示序列相同。相对图2所示氨基酸序列而言具有小于100％的序列同一性的多肽可以含有来自天然来源序列的各种取代，包括同源的和非同源的氨基酸取代。参见下文同源氨基酸取代的实施例。同一与同源残基之和除以与SRK多肽进行比较的序列中的残基总数等于序列相似性百分率。为了计算序列的同一性和相似性，可以将所比较的序列进行对比，按照任何所需的方法、算法、计算机程序等进行计算，例如包括FASTA、BLASTA。相对图2氨基酸序列而言具有小于100％的氨基酸序列同一性的多肽可以具有大约99％、98％、97％、95％、90％、70％或者低达53％的序列同一性。优选的氨基酸序列同一性为大约87％或以上，例如大约88％、89％。参见下文关于突变或突变蛋白的讨论。

本发明也涉及SRK多肽突变蛋白，即氨基酸序列不同于可从天然来源获得的氨基酸序列的任何多肽(哺乳动物SRK的片段与天然来源的SRK在氨基酸序列上没有区别)。因此，SRK突变蛋白包含氨基酸的取代、插入和缺失，包括非天然来源的氨基酸。

本发明的SRK氨基酸序列的突变蛋白也可以在同源检索的基础上加以制备，检索针对基因数据库进行，例如Genbank，EMBL。序列同源性检索可以采用各种方法，包括BLAST类计算机程序所述算法、Smith-Waterman算法等。通过鉴定和对比在多肽之间是同一和/或同源性的结构域内的氨基酸，然后根据这样的对比结果修饰氨基酸，可以将突变蛋白引入序列。例如，SRK与Raf激酶共享33％(Bonner等《核酸研究》14(2)：1009-1015，1986)、与Muk共享37％(Hirai等《癌基因》12：641-650，1996)、与TAK1共享39％(Irie《科学》265：1716-1719，1994)、与MLK蛋白共享44％的同一性(Dorow《欧洲生物化学杂志》213：701-710，1993)。这些序列对比揭示彼此相同和不同的氨基酸位置，提供关于氨基酸取代的信息，这种取代预期将减少、降低或消除SRK的生物活性。例如，序列对比揭示保存在两个或多个结构域之间的相同氨基酸，而氨基酸的除去或取代预期将对其生物活性带来不利影响。

通过将一种同源氨基酸替换为另一种，可以进行氨基酸的取代。同源氨基酸可以根据侧链大小和极化程度加以定义，包括小的、非极性的：半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸；小的、极性的：丝氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺；大的、极性的：谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸；中间极性的：酪氨酸、组氨酸、色氨酸；大的、非极性的：苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。同系酸也可以如下分类：不带电的极性R类：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；酸性氨基酸(带负电的)：天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸(带正电的)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸。同源氨基酸也包括下述那些：Dayhoff《蛋白质序列和结构图谱》5，1978和Argos《欧洲分子生物学组织杂志》8，779-785，1989。

根据本发明的突变蛋白包括这样的氨基酸序列，其中SRK序列中的残基被来自上述蛋白质的对应激酶结构域的同源残基替换。因此，本发明涉及图2的SRK核苷酸序列，其中所述核酸编码多肽，并且一个或多个氨基酸位置是取代的或缺失的，或者二者皆是，并且被核酸编码的多肽具有激酶活性。例如，SRK多肽突变蛋白及其对应的核苷酸编码序列可以具有如图2所示的氨基酸序列，但是其中一个或多个位置被同源氨基酸取代，例如有1、5、10、15或20个取代。本发明也涉及突变蛋白多肽和编码这类多肽的突变蛋白核酸。修饰如何影响所述活性可以按照上述和下述方法加以测量，这些方法是本领域技术人员已知的。

如上所述，氨基酸取代也可以根据与相关蛋白质的相似性加以进行，例如其它MAPKKK蛋白，包括Raf、Ste11、Muk、TAK1、MLK等。例如，在45位和46位的一个或两个连续的赖氨酸替换为丙氨酸(SRK-K45A或SRK-KA；SRK-45AK46A或SRK-KKAA)，得到具有有缺陷的激酶活性的显性失活等位基因或显性干扰基因。类似地，在氨基酸133位的天冬氨酸取代为丙氨酸(SRK-D133A或SRK-DA)，得到具有有缺陷的激酶活性的显性失活等位基因或显性干扰基因。这种突变蛋白的用途如下所述。也可以按照常规方法选择其它突变，方法是，对SRK加以修饰或突变，例如通过按照下述方法和实施例测量激酶活性，选择影响一个或多个活性的那些突变。

哺乳动物SRK多肽、片段或取代的多肽也可以包含各种修饰，其中这样的修饰包括脂质修饰、甲基化、磷酸化、糖基化、共价修饰(例如氨基酸R-基的共价修饰)、氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸添加。可以按照各种方法实现对多肽的修饰，包括重组的、合成的、化学的方法等。

本发明多肽(例如人SRK、其片段、其突变体)可以以不同方式使用，例如用在测定法中，作为抗体的免疫原，如下所述，作为生物活性的试剂(例如具有一种或多种与SRK有关的活性)。

编码SRK的多肽、其衍生物或其片段可以与一种或多种结构域、功能结构域、可检测的结构域、抗原结构域和/或所需的多肽结合，排列方式不是自然存在的，也就是非自然存在的，例如在人或SRK基因中，是从活生物体基因组制备的基因组片段，活生物体例如动物，优选为哺乳动物，例如人、小鼠，或其细胞系。包含这些特征的多肽是嵌合或融合多肽。这样一种嵌合多肽可以按照不同方法加以制备，包括化学的、合成的、准合成的和/或重组的方法。编码嵌合多肽的嵌合核酸可以在连续的(例如具有多个N-端结构域，以稳定或增强活性)或间断的可译框架内含有不同结构域或所需多肽，例如含有内含子、剪接位点、增强子等。嵌合核酸可以按照不同方法加以制备。例如参见美国专利No.5,439,819。结构域或所需多肽可以具有任何所需的性质，包括生物学功能，例如发信号、促进生长、靶向细胞(例如信号序列、导向序列，例如导向内质网或核)等；结构功能，例如疏水性、亲水性、跨膜性等；受体-配体功能和/或可检测的功能，例如与酶、荧光多肽、绿荧光蛋白结合(Chalfie等《科学》263：802，1994；Cheng等《天然生物工程》14：606，1996；Levy等《天然生物工程》14：610，1996)等。另外，在引入宿主细胞时，多肽或其部分可以用作可选择的标记物。例如，编码根据本发明的氨基酸序列的核酸可以框架内融合为所需的编码序列，充当纯化、选择或标记目的的标识。融合区域可以编码裂解位点，有利于表达、分离、纯化等。

按照本发明，根据本发明的多肽可以在表达系统内产生，例如体内、体外、不含细胞、重组体、细胞融合等。对来自该系统的多肽的修饰包括糖基化、氨基酸取代(例如不同的密码子选择)、多肽加工，例如消化、裂解、肽链内切酶或肽链外切酶活性、化学部分(包括脂质和磷酸盐)的连接等。

按照常用方法，根据本发明的多肽可以从天然来源、转化的宿主细胞(培养基或细胞)回收，包括洗涤剂提取(例如CHAPS、辛基葡糖苷)、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱。必要时在完成成熟蛋白质的构型时可以采用蛋白质重折叠步骤。最后，可以采用高效液相色谱(HPLC)用于纯化步骤。SRK多肽也可以按照对其它MAPKKK蛋白所述的方法加以分离，这些方法将是技术人员已知的。

哺乳动物SRK核酸或其片段是具有可从天然来源获得的核苷酸序列的核酸。见上。因此，它包括自然存在的、正常的、突变的、多形的等位基因等。天然来源例如包括从组织和整个生物体获得的活细胞、培养的细胞系，包括原代和无限增殖化细胞系。

已经讨论过，人SRK表达为多种mRNA。例如，使用来自激酶结构域的cDNA探针进行RNA印迹分析，鉴定了7.5Kb的优势带和3.8Kb与1.6Kb的次丰富带。来自J42克隆3’端的特异性探针鉴定该大的转录物为J42 mRNA，而来自J207克隆3’端的探针识别3.8Kb信息。mRNA分布的分析显示，J42和J207在正常组织中是无所不在地被表达的，不过在骨骼肌和心脏中是最为丰富的。这些克隆在3’端有区别；例如J42含有酸性区域，而J207没有。使克隆在序列上有分支的区域在图2中用箭头表示。因此，从这些区域衍生的探针(既是核酸也是抗体)可用于区分它们，例如在组织切片、样本等中的印迹上，具有不同的表现。

本发明的核酸序列可以含有从氨基酸1至氨基酸455的完整编码序列、其简并序列及其片段。根据本发明的核酸也可以包含与任意上述与下述核苷酸序列100％互补的、例如反义的核苷酸序列。

根据本发明的核酸可以从多种不同来源获得。可以从DNA或RNA获得，例如多聚腺苷酸化的mRNA，例如从组织、细胞或整个生物体分离得到。核酸可以直接从DNA或RNA获得，或者从cDNA文库中获得。核酸可以从处于特定发育阶段的细胞或组织(例如胚胎或成人心脏或骨骼细胞或组织)中获得，它们具有所需的遗传型、表型等。

如上关于SRK多肽所述，包含编码根据本发明的多肽的核苷酸序列的核酸可以包括仅有的编码序列；编码序列和另外的编码序列(例如编码前导的、分泌的、靶向的、酶的、荧光的或其它诊断肽的序列)；编码序列和非编码序列，例如在5’或3’端未翻译的序列，或分散在编码序列中的序列，例如内含子。包含不间断编码多肽的核苷酸序列的核酸意味着该核苷酸序列含有SRK的氨基酸编码序列，没有非编码核苷酸中断或插入该编码序列，例如不存在内含子。这样一种核苷酸序列也可以被描述为“连续的”。编码人或其它哺乳动物SRK等的基因组DNA可以按照常规方法获得。

根据本发明的核酸也可以包含表达控制序列，可操纵地连接在上述核酸上。措辞“表达控制序列”是指这种核酸序列，它调节被与其可操纵地连接的核酸编码的多肽的表达。表达可以在mRNA或多肽的水平上加以调节。因此，表达控制序列包括与mRNA有关的元件和与蛋白质有关的元件。这些元件包括启动子、增强子(病毒的或细胞的)、核糖体结合序列、转录终止子等。表达控制序列与核苷酸编码序列可操纵地连接，此时该表达控制序列处于这样一种位置，它实现或完成编码序列的表达。例如，当启动子可操纵地连接在编码序列5’上时，编码序列的表达被启动子所驱动。相对正常基因而言，表达控制序列可以是异源的或内源的。

根据本发明的核酸可以在核酸杂交的基础上加以选择。两个单链核酸制剂杂交在一起的能力是它们的核苷酸序列互补性的量度，例如核苷酸之间的碱基配对，例如A-T、G-C等。本发明因此也涉及核酸和它们的补体，这些补体与包含图2所示核苷酸序列的核酸杂交。与后者序列杂交的核苷酸序列将具有互补的核酸链，或者在聚合酶(即适当的核酸合成酶)的存在下充当一种序列的模板。本发明包括核酸的两个链，例如有义链和反义链。

通过选择杂交条件，可以选择具有所需的与图2所示核苷酸序列的核苷酸互补性程度的核酸。能够与这样的序列杂交的核酸优选地具有在二者序列之间的例如大约85％、更优选为90％、92％、进而更优选为95％、97％或100％的互补性。本发明特别涉及在严格性差或严格性强的条件下与图2所示核苷酸序列杂交的核酸序列。

与SRK序列杂交的核酸可以按不同方式加以选择。例如，可以按照已知程序，将印迹(即含有核酸的基质)、碎片阵列(chip arrays)和其它包含目的核酸的基质在预杂交溶液(6X SSC、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑精DNA、5X Denhardt氏溶液和50％甲酰胺)中、在30EC下培养过夜，然后与可检测的SRK探针(见下)在杂交溶液(例如6X SSC、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑精DNA和50％甲酰胺)中、在42EC下杂交过夜。印迹可以在严格性强的条件下洗涤，例如使bp错配率低于5％(例如在0.1％SSC与0.1％SDS中、在65EC下洗涤30分钟两次)，即选择具有95％或以上序列同一性的序列。严格性强的条件的其它非限制性例子包括在65EC下、在含有30mM NaCl与0.5％SDS的含水缓冲液中的最终洗涤。另一个严格性强的条件的例子是在7％SDS、0.5M NaPO₄，pH 7、1mM EDTA中、在50EC下杂交，例如过夜，然后用1％SDS溶液在42EC下洗涤一次或多次。在上述严格性强的条件下，这里所述的活化SRK和显性失活SRK序列与图2所示野生型核酸序列及其寡核苷酸探针杂交。严格性强的洗涤可以使错配率不到5％，而宽松或严格性差的洗涤条件(例如在0.2％SSC与0.5％SDS中、在37EC下洗涤30分钟两次)可使错配率高达20％。严格性差的条件的另一个非限制性例子包括在42EC下、在含有30mM NaCl与0.5％SDS的缓冲液中的最终洗涤。洗涤和杂交也可以按Sambrook等《分子克隆》1989第9章所述方法进行。

如Sambrook等所述，杂交也可以基于探针与其目标之间所形成的杂交体解链温度(Tm)的计算结果。一般地，短寡核苷酸(含有18个核苷酸或以下)从其目标序列解链的温度Tm是由下列方程给出的：T_m＝(A与T数)x 2℃+(C与G数)x 4℃。对更长的分子来说，T_m＝81.5+16.6log₁₀[Na⁺]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na⁺]是钠离子的摩尔浓度，％GC是GC碱基对在探针中的百分率，N是长度。可以在比该温度低几度的温度下进行杂交，以确保探针与目标能够杂交。进一步降低温度可以发生错配。

可以选择严格条件来分离序列和它们的补体，这些补体例如具有在探针(例如SRK的寡核苷酸)与目标核酸(SRK突变蛋白或同系物)之间的至少大约95％、优选为97％的核苷酸互补性。

按照本发明，核酸或多肽可以在图2所示核苷酸或氨基酸序列中包含一种或多种差异。对核苷酸和/或氨基酸序列的改变或修饰可以通过任何可利用的方法加以实现，包括定向或随机诱变。

根据本发明的编码人SRK的核酸可以包含存在于自然存在的SRK基因中的核苷酸，例如自然存在的多形体、正常的或突变的等位基因(核苷酸或氨基酸)、在自然哺乳动物群体中发现的突变，例如人、猴、猪、小鼠、大鼠或兔。术语“自然存在的”意味着该核酸是可从天然来源获得的，例如动物组织和细胞、体液、组织培养细胞、法医样本。自然存在的突变可以包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基或羧基末端)、取代、倒位或添加。按照本领域技术人员已知的方法，这些基因可以通过核酸杂交加以检测和分离。本发明的编码人SRK多肽的核苷酸序列可以含有在自然存在的基因、转录物或cDNA中发现的密码子，例如图2所示，或者它可以含有编码相同氨基酸序列的简并密码子。例如，可能需要改变序列中的密码子，以优化用于在所需宿主内表达的序列。

根据本发明的核酸例如可以包含DNA、RNA、合成的核酸、肽核酸、修饰的核苷酸或混合物。DNA可以是双链的或单链的。包含核酸的核苷酸可以通过各种已知的键连接，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，这因所需的目的而异，例如为了耐受核酸酶的作用，如RNA酶H，也为了提高体内稳定性等。例如参见美国专利No.5,378,825。

可以对核酸进行各种修饰，例如连接可检测的标记物(抗生物素蛋白、生物素、放射性元素)、改善杂交、检测或稳定性的部分。按照所需的方法，核酸也可以连接到固体载体上，例如硝基纤维素、磁性或顺磁性微球体(例如美国专利No.5,411,863、No.5,543,289所述，例如包含铁磁性、超磁性、顺磁性、超顺磁性、氧化铁和多糖)、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、胶乳固体微球体、聚丙烯酰胺等。例如参见美国专利No.5,470,967、No.5,476,925、No.5,478,893。

本发明在另一方面涉及寡核苷酸或核酸探针。这种寡核苷酸或核酸探针例如可用于检测、量化或分离试样中的哺乳动物SRK核酸，或者用于鉴定SRK同系物。在一个优选的实施方式中，核酸例如可用作差示PCR中的寡核苷酸探针，与cDNA文库、表达文库等结合。检测可以是各种不同目的所需要的，包括研究、诊断和法医鉴定。关于诊断目的，可能需要鉴定样本中核酸序列的存在或含量，其中该样本是从组织、细胞、体液等获得的。在一个优选的方法中，本发明涉及检测核酸的方法，包括使试样中的目标核酸与寡核苷酸在有效实现目标与寡核苷酸之间的杂交的条件下接触；然后检测杂交。根据本发明的寡核苷酸也可用于合成核酸的扩增，例如PCR(例如Saiki等《科学》241：53，1988；美国专利No.4,683,202；《PCR方案：方法和应用指导》Innis等编，Academic Press，New York，1990)；差示(例如参见Liang等《核酸研究》21：3269-3275，1993；美国专利No.5,599,672；WO97/18454)。

检测可以与其它基因的寡核苷酸结合进行，例如参与信号转导、生长、癌症、编程性细胞死亡的基因，或者任何上述或下述的基因等。寡核苷酸也可用于试验突变，例如采用错配DNA修复技术，如下所述：美国专利No.5,683,877；美国专利No.5,656,430；Wu等《美国国家科学院院报》89：8779-8783，1992。

本发明的寡核苷酸可以包含任何图2的连续核苷酸序列或其补体。根据本发明的这些寡核苷酸(核酸)可以是任意所需大小的，例如约10-200个核苷酸，12-100个、优选为12-50个、12-25个、14-16个，至少约15个，至少约20个等。寡核苷酸可以具有非自然存在的核苷酸，例如肌苷、AZT、3TC等。相对图2序列而言，寡核苷酸可以具有100％的同一性或互补性，或者它可以具有错配或核苷酸取代，例如1、2、3、4或5个取代。按照本发明，寡核苷酸可以构成试剂盒，其中该试剂盒包括所需的缓冲液(例如磷酸盐、tris等)、检测组合物等。寡核苷酸可以是被标记的或未标记的，其中放射性或非放射性标记物是本领域已知的。

本发明的另一方面是人SRK独有的核苷酸序列。SRK独有的序列指具有明确顺序的核苷酸，它存在于SRK中，例如存在于图2的核苷酸序列中，但是在其它核酸中是罕见的或少见的，尤其是在动物核酸，优选为哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠等中罕见的。独有的核苷酸序列包括编码氨基酸AKQNSSKTTSKRRG的序列或其补体。该序列可作为探针，用于任何本文或参考文献所述的方法。有义和反义核苷酸序列都包括在内。根据本发明的独特核酸可以按照常规方法测定。包含这样一种独特序列的核酸可用作杂交探针，用于鉴定包含核酸混合物的样本中例如人或小鼠SRK的存在，例如利用RNA印迹法。杂交可以在严格性强的条件(见上)下进行，以选择相对探针而言具有至少95％同一性(即互补性)的核酸(和它们的可以含有编码序列的补体)，不过也可以采用不太严格的条件。独特的SRK核苷酸序列也可以在其5’或3’端被框架内融合为本专利通篇所提到的各种核苷酸序列，包括用于编码SRK的其它部分、酶、GFP等的序列、表达控制序列等。

已经讨论过，杂交可以在不同条件下进行，这取决于所需的选择性，例如Sambrook等《分子克隆》1989所述。例如，为了特异性地检测人或小鼠SRK，寡核苷酸可以在仅与目标核酸杂交的条件下与其杂交，例如其中的寡核苷酸与目标是100％互补的。如果需要选择具有低于100％的核苷酸互补性的目标核酸，则可以采用不同的条件，互补性例如至少约为99％、97％、95％、90％、70％、67％。

也可以从根据本发明的核酸制备反义核酸，优选从反义于图2的编码序列。反义核酸可以按各种方式加以使用，例如调节或调制SRK的表达，例如抑制之，检测它的表达或用于原位杂交。这些寡核苷酸可以类似于美国专利No.5,576,208所述方法加以使用。出于调节或调制SRK表达的目的，反义核苷酸可以可操纵地连接在表达控制序列上。

根据本发明的核酸可以按照任何所需的方法加以标记。核酸可以用放射性示踪剂加以标记，例如³²P、³⁵S、¹²⁵I、³H或¹⁴C，以及其它一些常用的示踪剂。放射性标记可以按照任意方法进行，例如使用放射标记的核苷酸、多核苷酸激酶(用或不用磷酸酶进行脱磷酸化作用)或连接酶(取决于所要标记的末端)在3’或5’端进行末端标记。也可以采用非放射性标记，使本发明的核酸与具有免疫学性质的残基(抗原、半抗原)、对某些试剂具有特殊亲和性的残基(配体)、具有能够完成可检测的酶反应的残基(酶或辅酶、酶底物或其它参与酶反应的物质)或具有特有的物理性质的残基(例如荧光，或者在所需波长下发射或吸收光)等结合。

包括寡核苷酸、反义核酸等在内的根据本发明的核酸可用于检测全器官、组织、细胞等内的SRK表达，检测采用不同的技术，包括RNA印迹、PCR、原位杂交等。这些核酸特别可用于检测紊乱的SRK表达，例如细胞特异性和/或亚细胞改变。可以单独或与其它基因产物结合测定SRK的水平，尤其是心、骨骼和细胞死亡特异性基因产物，或其它参与细胞信号和调节的基因产物。根据本发明的核酸可以在各种不同的系统内被表达，体外的和体内的，因所需目的而异。例如，核酸可以插入到表达载体中、引入到所需的宿主中和在有效实现被核酸编码的多肽的表达的条件下培养。有效条件包括任何适合于宿主细胞产生多肽的培养条件，包括有效的温度、pH、培养基、向培养宿主细胞的培养基中加入的添加剂(例如扩增或诱导表达的添加剂，例如丁酸盐，如果编码核酸邻近dhfr基因，则为氨甲蝶呤)、环己酰亚胺、细胞密度、培养皿等。核酸可以通过任何有效的方法引入到细胞内，例如包括裸露DNA、磷酸钙沉淀、电穿孔、注射、DEAE-葡聚糖介导的转染、与脂质体融合、与增强细胞摄取的试剂缔合、病毒转染。引入本发明核酸的细胞是转化的宿主细胞。核酸可以在染色体外，或者整合在宿主细胞染色体内。它可以是稳定的或瞬变的。选择与宿主细胞具有相容性的表达载体。宿主细胞包括哺乳动物细胞(例如COS、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、293、PAE、人、人成纤维细胞、人初生肿瘤细胞、睾丸细胞)、昆虫细胞(例如Sf9(S.frugipeda)和果蝇)、细菌(例如大肠埃希氏菌、链球菌、芽孢杆菌)、酵母(例如酵母属、酿酒酵母(例如cdc突变体cdc25、细胞周期与分裂突变体，如ATCC Nos.42563、46572、46573、44822、44823、46590、46605、42414、44824、42029、448258、44826、42413、200626、28199、200238、74155、44827、74154、74099、201204、48894、42564、201487、48893、28199、38598、201391、201392)、YRG2)、真菌细胞、植物细胞、胚胎干细胞(例如哺乳动物的，如小鼠或人)、成纤维细胞、肌细胞、心细胞、T-细胞(辅助细胞、CD4、CD8)、B-细胞、巨噬细胞、造血细胞、淋巴细胞、Th1、Th2等。

在选择表达控制序列时类似地出于宿主相容性和所需的目的，例如复制数量高、含量高、诱导、扩增、控制表达。其它可以采用的序列包括例如来自SV40、CMV、RSV的增强子、诱导启动子、细胞类型的特殊元件、或允许选择性或特异性细胞表达的序列。可用于驱动其表达的启动子例如包括内源性启动子、细胞信号转导途径中其它基因的启动子、用于细菌宿主的MMTV、SV40、trp、lac、tac或T7启动子、或α因子、醇氧化酶或用于酵母的PGH启动子。

另一种有关基因可以引入到相同的宿主中，例如出于调制SRK功能的目的。这样的基因可以是正常的基因，或变体，例如突变体、嵌合体、多形体等。这样的基因例如包括相同或有关信号途径的成员，例如Ras族、RasV12、Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich综合征蛋白、FTases、STEl4、p53、Rb、Mtase、GTPases亚单位、Dbl、lbc、Ost、Lsc、STATS、Raf、src、Jun、fos、elk、MEK、Ste11、Ste7等。

本发明的核酸或多肽在核酸或蛋白质电泳、色谱等中可用作大小标记物。明确限制的片段可以这样测定，扫描序列的限制位点、计算大小、进行相应的限制消化。如图2所示的SRK cDNA在核酸电泳中可用作分子量标记物。

本发明在另一方面涉及有SRK基因参与的生物途径的调节，确切地说，该途径是编程性细胞死亡(例如涉及各种细胞类型的维持和存活，包括免疫、骨骼和心细胞)、细胞发信号、信号转导、配体活化的应答、病理学状态，例如癌症、心肺疾病、自体免疫疾病(多发性硬化、狼疮、类风湿性关节炎等)。例如，已经观察到抑制性T细胞的缺失或编程性细胞死亡可以介导耐受性。例如参见Chen等《自然》376：177-180，1995。因此，SRK的编程性细胞死亡抑制活性或细胞存活促进活性的抑制剂可用于治疗耐受性已被破坏的自体免疫疾病。一般来说，本发明涉及调节生物学反应的方法，在该生物学反应中SRK或其同系物参与了引起最终细胞反应的生物化学途径，例如作为参与者。例如，本发明在一方面涉及调制有SRK参与的信号转导的方法。由于这种信号转导能够引起各种生物学反应，包括某些基因的转录活化，因此本发明涉及通过调制SRK活性来控制这些基因的表达的方法。按照本发明，可以采用任意例如描述在美国专利Nos.5,767,075、5,753,446、5,728,536、5,667,314和5,459,036中的方法，例如使用SRK、其生物活性片段或其同系物。被SRK介导的信号转导可以通过各种试剂的给药加以调制，包括抗SRK抗体、显性失活SRK基因(参见实施例)、其多肽模拟物、反义物等。

本发明涉及检测SRK多肽或其生物活性多肽片段中蛋白激酶活性的方法。SRK多肽的蛋白激酶活性的检测可以采用任意适合的方式完成，包括体外的、体内的，或它们的组合。例如，激酶测定可以如Bagrodia等《生物化学杂志》270：27995-27998，1995或Coso等《细胞》81：1137-1146，1995所述方法进行。通常，检测SRK多肽中激酶活性的方法包括使人SRK多肽或其生物活性多肽片段与底物在对所述SRK多肽磷酸化所述底物有效的条件下反应；然后检测所述底物的所述磷酸化作用。有效的条件例如包括适当的底物、³²P-ATP、pH、缓冲液、辅因子等。关于SRK激酶测定，底物例如可以是MBP，它被SRK直接磷酸化；SRK或其片段；MAPKK，例如MEK；BAD。检测可以采用各种方式实现，包括凝胶色谱、液相色谱、与放射自显影法结合，例如在使用放射性ATP的情况下。上面已经讨论过，激酶活性例如意味SRK将磷酸基从磷酸供体(例如ATP)转移到磷酸受体(例如MBP)的能力。

本发明也涉及鉴定SRK激酶活性底物的方法。SRK可以与供试底物在有效发生磷酸化作用的条件下接触，接触是体内的或体外的。经过适当的时间，可以分离底物，探查磷酸残基的存在。如上所述，检测磷酸化作用的优选方法是采用放射性ATP。不过，也可以采用任何适合的检测方案。参见下列关于进一步指导的实施例。

本发明也涉及鉴定调制人SRK多肽或其生物活性多肽片段的MAPKK刺激活性的试剂的方法，包括将供试试剂对细胞给药，该细胞表达(1)人SRK多肽或其生物活性多肽片段，和(2)MAPKK多肽，是在对所述SRK多肽刺激所述MAPKK多肽的蛋白激酶活性有效的条件下进行的；检测所述蛋白激酶活性；通过比较在有和没有供试试剂的存在下的激酶活性量，鉴定供试试剂是否调制所述SRK多肽的所述刺激活性。已经解释过，MAPKK刺激性例如意味SRK本身活化MAPKK激酶活性的能力。这种刺激作用可以是直接的或间接的，例如SRK刺激一种因子，该因子依次刺激MAPKK。该刺激作用对MAP激酶级联来说是相对特异性的；JNK1很少被SRK所刺激。

一般地，术语“有效的条件”例如意味达到所需效果的环境。这样一种环境例如包括缓冲剂、氧化剂、还原剂、pH、辅因子、温度、离子浓度、所用细胞的适合的细胞寿命和/或阶段(例如细胞周期的特定部分，或者在特定的发育阶段，其间特定的基因被表达)、培养条件(包括底物、氧、二氧化碳等)。

术语“调制”意味着任何所述活性例如被增加、增强、增加、激动(充当激动剂)、促进、降低、减少、抑制、阻断或拮抗(充当拮抗剂)。调制可以增加活性超过基线值的1倍、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍等。调制也可以降低其活性至基线值以下。

本文所用的术语“给药”例如意味任意适合的释放技术，该技术对放置该试剂在能够发挥作用的位置来说是适合的。例如，给药可以意味使细胞或宿主以有效的方式与有关试剂接触，该试剂从而能够调制有关活性。因此试剂可以这样给药：以脂质体的方式、作为核酸、与聚合物结合、以包封试剂的形式、在适合的载体内等。

SRK多肽能够刺激各种MAPKK激酶，包括MEK和Ste7。其它能够被SRK刺激的MAPKK激酶可以用常规方法鉴定，例如实施例所述方法。

上述方法中，SRK和MAPKK多肽在细胞内被表达。本文所用的术语“表达”意味着细胞适量产生多肽，其中SRK对MAPKK的刺激活性是可以被调制的。可以使用任意适合的细胞系，包括正常产生蛋白质的细胞系、已被诱导产生蛋白质的细胞系、已经基因工程化处理而产生SRK和/或MAPKK的细胞系等。在优选的实施方式中，SRK多肽和MAPKK多肽被引入细胞系的核酸编码。核酸可以包含表达控制序列，包括启动子(例如诱导型和组成型启动子)、增强子、多聚腺苷酸化信号、剪接序列和其它实现表达所必要的或增强表达的元件。各种细胞系都适合作为宿主，包括COS细胞(用于瞬时表达)、人293细胞、酵母细胞等。另见上文关于其它表达方法。

检测蛋白激酶活性可以用常规方法实现。在优选的实施方式中，上述本发明方法进一步包括这些步骤，例如溶解包含所述被表达的SRK多肽和MAPKK多肽的所述细胞；分离所述MAPKK；检测所述分离的MAPKK中的激酶活性。该方法中，细胞的溶解或破碎可以在SRK多肽有机会刺激MAPKK多肽之后进行。溶解可以用常规方法实现，例如洗涤剂、超声、匀化等处理。供试试剂是否调制刺激活性可以通过分离MAPKK和试验其激酶活性加以测定。MAPKK可以按常规方式加以分离，例如色谱、抗体、结合配体等。抗体可以是针对MAPKK本身制备的，或者是针对被表达的MAPKK(它已经连接有表位，优选为多肽表位)；关联抗体然后可用于捕获MAPKK。更优选的实施方式包括：使所述胞溶物与抗表位抗体接触，接触是在对所述抗体与所述表位结合形成复合体有效的条件下进行的；然后测定该复合体的激酶活性。核酸可以包含编码MAPKK肽的序列，该肽与编码任意适合表位的序列是框架内融合的，包括例如KT3、Glu、myc或血凝素。这些表位是本领域所熟知的。抗体可以连接于任何所需的底物，包括固体载体，例如96孔板、硝基纤维素、磁性或顺磁性微球体(例如美国专利No.5,411,863、5,543,289所述；例如包含铁磁性、超磁性、顺磁性、超顺磁性、氧化铁和多糖)、尼龙、琼脂糖、重氮化纤维素、胶乳固体微球体、聚丙烯酰胺等。

在本文所述的这种和其它方法中，可以在有和没有供试试剂的存在下测量活性。目的是确定基线活性，例如作为对照，以测定供试试剂是否有效。对照或基线值可以在试验试剂作用的同时、之前、之后、顺序地等获得。术语“比较”例如意味测定试剂是否影响所需的活性。一般地，这种“比较”是在供试试剂存在和供试试剂不存在时获得活性数值而进行的；不过也可以采用其它适合的方法。为了测定供试试剂是否对活性(例如编程性细胞死亡、激酶、MAPKK刺激活性)有影响，一般可以在有或没有试剂的存在下观察细胞表型(例如编程性细胞死亡、转化)或活性。观察不必在同时、顺序地或者甚至在同一天内进行。例如，一旦建立有活性或表型发生的试验条件，在没有化合物的存在下不必再次重复该条件。这对所有上述和下述方法来说都是如此。

本发明也涉及与SRK多肽在调节细胞转化中的作用有关的方法。已经讨论过，细胞转化例如发生在正常静止细胞被刺激增殖的时候。细胞转化可以通过任意适合的方法加以测量，包括转化灶形成(参见实施例，其中检查塑性或其它底物上细胞转化灶的数量和/或大小)、软琼脂中的生长、细胞周期S-相的细胞比例等。这些方法是本领域已知的。

在本发明的优选实施方式中，鉴定调制被Ras和SRK介导的细胞转化的试剂的方法可以通过利用对转化敏感的细胞系结合缺少激酶活性的SRK多肽(例如SRK-KA、SRK-KKAA、SRK-DA和其它显性失活作用的SRK多肽)加以实现。在优选的实施方式中，使用当活化Ras基因(例如RasV12，例如Schafer等《分子细胞生物学》5(12)：3617-3620，1985；或RasL61)引入其中时变为转化的细胞系，例如使用含有其可操纵地连接于适当启动子的编码序列的核酸。见上关于表达元件和方法。转化可以按上文讨论的方法加以测量。适合的细胞系例如包括NIH3T3、COS、BHK、CHO、人293等。缺少激酶活性的SRK多肽的、作为核酸以及在适当启动子等的控制下的表达也引入细胞内。它在这类细胞内的表达抑制活化Ras的转化灶形成活性，例如减少、抑制、干扰通过转化灶形成作用测量到的活化Ras的转化活性。该方法也可以这样进行，通过鉴定细胞在软琼脂中的生长能力，测定转化作用。上述方法可以鉴定各种类型的试剂，包括直接修饰SRK的那些，例如通过引起构象改变，赋予缺少激酶的突变蛋白以激酶活性。试剂也可以这样补充SRK的缺陷：充当SRK模拟物、作用于Ras途径中SRK的下游底物(例如刺激MAPKK)、引起内源性SRK基因或SRK替代物转录等。

在鉴定调制由Ras和SRK介导的细胞转化作用的试剂的有关方法中，使用表达活化Ras的细胞系；不过，不采用缺少激酶活性的SRK。这种方法包括将供试试剂对表达活化Ras的细胞给药，例如RasV12多肽，给药是在活化Ras有效引起转化的条件下，例如是在转化灶形成测定法或软琼脂生长测定法中所检测到的；通过在有或没有所述供试化合物的存在下比较转化细胞的数量，鉴定供试试剂是否调制活化Ras转化活性；测定所述供试化合物是否调制人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的活性。因此在本发明的这种实施方式中，一旦鉴定了干扰Ras转化的试剂，则将该试剂对SRK进行试验，以测定它是否调制SRK的活性，例如蛋白激酶活性；自磷酸化活性；细胞转化活性；细胞生长调节活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK活化活性；转录调制活性等。这些活性可以按照上文讨论的方法加以测量。

本发明也涉及SRK的存活调节活性，例如在预防编程性细胞死亡中。编程性细胞死亡的预防作用可用于治疗自体免疫疾病等。本发明也涉及鉴定调制SRK存活调节活性的试剂的方法，例如它在抑制编程性细胞死亡中的活性。这种活性可以以任何适当的方式加以测量。

正如实施例所确立的，可溶性HAX-1产生细胞内的编程性细胞死亡，例如当在哺乳动物细胞内被表达时，例如COS细胞。SRK的表达逆转这种作用。因此在本发明的一种实施方式中，该方法包括：将供试试剂对表达可溶性HAX-1多肽和人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的细胞给药，其中所述可溶性HAX-1多肽导致所述细胞内的编程性细胞死亡；在有和没有所述供试化合物的存在下检测所述细胞内的编程性细胞死亡。实施例中使用的是HAX-1克隆104，不过可以采用任何其它片段，只要它导致编程性细胞死亡即可。其它有用的HAX-1片段可以按照常规方法加以测定，例如遵循下列实施例，其中HAX-1核酸在细胞内被表达，使用FACS分类的DAPI检测编程性细胞死亡。可以将可溶性HAX-1、HAX-1多肽(或其它编程性细胞死亡诱导剂，包括基因和蛋白质)、SRK和SRK片段以任何适当的方式对细胞给药，只要HAX-1有效导致编程性细胞死亡即可。可以使用任何所述的释放手段，包括转染(磷酸钙、电穿孔、脂质体、DEAE等)或其它引入编码所需多肽或等价物的核酸的手段；直接将多肽引入细胞内(例如使其与配体缀合，细胞与之结合并使之内在化，通过胞饮作用等)。可以同时或按顺序将HAX-1和SRK对细胞给药。例如，细胞可以用编码序列共转染。核酸序列如上文和下文的讨论，可以可操纵地连接于表达控制序列。使用适当的启动子可以诱发表达，或者表达可以是组成型的。这些和其它适当条件可以按常规方法加以测定，例如遵循下列实施例，测定诱导编程性细胞死亡的有效条件和编程性细胞死亡被SRK抑制的有效条件。然后可以将试剂以任何适当的方式对表达HAX-1和SRK的细胞给药。观察可以在任何时间进行，包括连续观察或按预定间隔观察。编程性细胞死亡可以按照任何已知的方法加以检测，包括目测观察、用DAPI或其它染色体染剂染色并寻找DNA断裂、碘化丙锭染色和FACs(例如参见Mohr等《美国国家科学院院报》95：5045-5050，1988；下列实施例)。如同其它方法那样，可以鉴定调制SRK活性的试剂，例如抑制、增强等。

因此，本发明在另一方面涉及胞质形式的HAX-1多肽、优选为哺乳动物HAX-1、更优选为人HAX-1。参见Suzuki等《免疫学杂志》158(6)：2737-2744，1997，关于与膜结合的人HAX-1。如下实施例7所示，当在哺乳动物细胞系、例如COS细胞内被表达时，Hax-1的胞质形式可以导致编程性细胞死亡。这种导致编程性细胞死亡的作用、即编程性细胞死亡活性可以在各种方法中是有用的，例如包括治疗肿瘤(例如通过导致细胞死亡)、治疗自体免疫疾病、在测定法中鉴定调制编程性细胞死亡的试剂(例如参见实施例7)等。术语“胞质性”意味着多肽不是与膜结合的，也不是与膜缔合的，而是存在于细胞的细胞质内。

实施例7中使用了胞质性HAX-1的一个例子。这种特定的胞质形式的HAX-1含有HAX-1的氨基酸104-279，如图7所示。其它胞质性HAX-1形式可以按常规方法加以测定，例如制备嵌套缺失组、将克隆转染到细胞系内、定位从克隆产生的多肽。定位作用可以按常规方法完成，例如使用如实施例所述的表位标记、使用抗HAX-1选定部分的抗体、使用与HAX-1结合并包含可检测标记的分子。其它可溶形式的HAX-1包括HAX-1的大约氨基酸104-279，即其中来自HAX-1或另一种多肽的1、2、5、10个氨基酸包括在它的N-或C-端。胞质性HAX-1可以在上述和下述各种细胞系内被表达，类似于SRK的情况(例如与表达控制操纵性连锁等)。包含氨基酸104-279的人胞质HAX-1不包括图7所示全长序列，这是因为这种全长序列不是可溶性的，而是与膜结合的。人胞质HAX-1可以基本上由氨基酸104-107组成，并且可以进一步包含多肽表位(例如S-肽、myc等)。这样一种多肽表位不影响胞质HAX-1的活性，但是采用抗多肽表位抗体，可以使其定位在免疫沉淀等的细胞内。

上述方法也可以这样进行，在发生编程性细胞死亡的条件下，将供试试剂对细胞系给药。在下列实施例中，将SRK对细胞系给药，细胞系依存活的细胞分裂素而定，例如需要IL-3的FL5.12细胞。撤去IL-3大约18小时导致编程性细胞死亡。这样一种方案是发生编程性细胞死亡的条件的一个例子。还可以采用其它细胞系，例如Jurkat细胞，并使用如Zhou等《美国国家科学院院报》95：6785-6790，1998所述条件；巨噬细胞，并使用如Mohr等《美国国家科学院院报》95：5045-5050，1998所述的氧化氮条件；各种造血细胞和它们的促进存活的关联CSF(例如粒细胞/巨噬细胞和GM-CSF、G-CSF和M-CSF)。例如参见Alberts等《细胞分子生物学》第3版1994，1169-1175页。当将SRK对这些细胞给药时，可以抑制编程性细胞死亡。如同其它方法那样，可以鉴定调制这种活性的试剂。SRK的抑制作用可以是特别有用的，这是在需要编程性细胞死亡的情况下，例如在自体免疫疾病中。

另一种可以调制SRK功能的方式是调节参与其表达的途径，例如调制它的转录(诱导之)、mRNA稳定性、翻译、翻译后修饰、加工(例如在内部裂解位点裂解)等。表达可以利用不同的试剂加以调节，例如反义核酸、核酶、aptamer、合成化合物或自然存在的化合物。因此，本发明也涉及鉴定诱导细胞内SRK表达的试剂的方法。这种试剂可以按上述方式加以鉴定，即使用注定发生编程性细胞死亡(按正常程序或作为人工条件的结果)的细胞，但是不引入SRK。因此细胞可以培养在发生编程性细胞死亡的条件下，但是不引入SRK。该方法可以进一步包括：将抑制编程性细胞死亡的试剂给药；检测SRK的表达。表达可以利用SRK抗体、SRK核探针等加以检测。

本发明也涉及鉴定其转录被SRK调制的基因的方法。例如，可以将活化SRK引入到细胞内，可以在有和没有SRK的存在下分析它们的表达/转录模式。表达分析可以按常规方法进行。例如，可以设计高密度寡核苷酸碎片阵列，以监测表达。这种碎片可以含有所有的人基因组或人基因组的子集。例如参见Anderson等《Topics in CurrentChemistry》194：117-129，1998；Southern《Current Biology》7：85-88，1996；Marshall和Hodgson《Nature Biotechnology》16：27-31，1998。

本发明也涉及鉴定调制SRK的天然配体和信号的方法。例如，可以使表达SRK的细胞与各种细胞产物接触，然后测定有SRK参与的信号途径的活化作用。在一种实施方式中，异源SRK在细胞内被表达；使该细胞与已经用cDNA文库转化的细胞或其产物接触。SRK的活化作用按本文所述的常规方法加以测量(例如通过激酶的活性等)。如果转化的细胞或其产物引起SRK的活化，那么分离并鉴定在该转化细胞内表达的cDNA。

在任意上述测定法中鉴定的化合物可用于调制细胞、组织、完整生物体、原位、体外(试管、固体载体等)、体内或任何所需环境内的SRK活性。一般来说，具有这样一种体外活性的化合物也将可用于体内调制与SRK有关的生物途径，例如细胞周期紊乱、自体免疫疾病、编程性细胞死亡、有丝分裂发生、分化、酵母感染(例如在调制酵母SRK同系物时)、生育疾病、心脏病、癌症、转移、肿瘤发生、自体免疫疾病、血液疾病等。这些试剂可以是激动剂或SRK模拟物、或拮抗剂，依所需作用而定。

在治疗疾病时，化合物或混合物可以配制成药物组合物，其中包含1药学上可接受的载体和其它赋形剂，这对技术人员来说都是显而易见的。例如参见《Remington氏药物科学》第18版，Mack PublishingCompany，1990。这样的组合物可以另外含有有效量的其它化合物。

本发明也涉及特异性识别SRK的抗体。SRK特异性抗体意味着该抗体识别包括SRK或包括在SRK内的明确的氨基酸序列，例如图2的人序列。因此，特异性抗体一般将以高于与不同表位的亲和性与氨基酸序列、即图2中的表位结合，其检测和/或测量方法例如免疫印迹测定法或其它常规的免疫测定法。因此，人SRK表位特异性抗体可用于检测样本中表位的存在，例如含有人SRK基因产物的组织样本，以区分它与不存在表位的样本。这种抗体是有用的，如Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Research Product Catalog所述，可以相应地配制成例如100mg/ml。可以按照任何所需的方法制备抗体，例如多克隆的、单克隆的、重组的、嵌合的、人源化的。另参见筛选重组免疫球蛋白文库(Orlandi等《美国国家科学院院报》86：3833-3837，1989；Huse等《科学》256：1275-1281，1989)；淋巴细胞群的体外刺激作用；Winter和Milstein 《自然》349：293-299，1991。例如，关于单克隆抗体的产生，可以将根据图2的多肽对小鼠、山羊或兔皮下和/或腹膜内给药，加入或不加入佐剂，给药量有效引起免疫应答。抗体也可以是单链的或FAb片段。抗体可以是IgG、亚型、IgG2a、IgG1等。抗体和免疫应答也可以通过将裸露的DNA给药而产生。例如参见美国专利Nos.5,703,055、5,589,466、5,580,859。

用于诱导抗体的SRK或其片段不必具有生物活性；不过，它们必须具有致免疫活性，单独的或者与载体结合。用于诱导SRK特异性抗体的肽可能具有由至少五个氨基酸组成的氨基酸序列，优选为至少10个氨基酸。SRK氨基酸的短段、例如五个氨基酸可与另一种蛋白质、例如匙孔血蓝蛋白或另一种有用的载体的那些融合，该嵌合分子用于抗体的产生。

所述若干不同的方法可用于制备SRK特异性抗体。例如，在一种方法中，从纯化SRK(例如通过反相HPLC分离纯化)获得高达75mg的变性SRK。利用标准方案，这种变性蛋白可用于致小鼠或兔免疫；对小鼠的免疫来说大约100微克是足够的，而致兔免疫可能需要高达1mg。关于鉴定小鼠杂交瘤，变性蛋白可以被放射性碘标记，用于筛选产生抗体的潜在鼠B-细胞杂交瘤。这种程序仅需要少量的蛋白质，例如20mg就足以标记和筛选几千种克隆。

在另一种方法中，分析从cDNA推导的SRK氨基酸序列，以测定高致免疫性区域。合成包含这些区域的多肽，用在适当的免疫方案中，以产生抗体。Ausubel FM等描述了用以选择适当表位的分析法(1989，《Current Protocols in Molecular Biology》第2卷John Wiley&Sons)。最适合免疫的氨基酸序列通常在多肽的C-端、N-端和中间的亲水性区域，当蛋白质处于其天然构象时，这些区域可能暴露于外部环境中。通常，利用fmoc化学，采用APPlied Biosystems 431A型肽合成仪合成所选择的肽，长度约为15个残基，再通过与M-马来酰亚氨基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS：参见Ausubel FM等，出处同上)的反应偶联到匙孔血蓝蛋白(KLH，Sigma)上。如果必要的话，可以在肽的N-端引入半胱氨酸，以便与KLH偶联。用含有肽-KLH复合体的完全弗氏佐剂使兔获得免疫。试验所得抗血清的抗肽活性，方法是使肽与塑料结合，用1％BSA封闭，与抗血清反应，洗涤，与(放射性或荧光)标记的、亲和性纯化的、特异性山羊抗兔IgG反应。

也可以制备杂交瘤，利用标准技术筛选。通过用标记的SRK筛选，检测所针对的杂交瘤，以鉴定产生具有所需特异性的单克隆抗体的融合物。在典型的方案中，将平皿(FAST，Becton-Dickinson，Palo Alto，Calif)的孔涂以10mg/ml亲和性纯化的、特异性兔抗小鼠(或适当的抗Ig种)抗体。将涂后的孔用1％BSA封闭，洗涤，与杂交瘤上清液接触。培养后，使孔与1mg/ml标记的SRK接触。产生抗体的克隆将与一定量标记的SRK结合，后者在背景上是可检测的。扩大这些克隆，按有限的稀释比(1个细胞/3个孔)进行2个周期的克隆。将克隆后的杂交瘤注射到原来的小鼠内，产生腹水，通过蛋白质A亲和色谱法从小鼠腹水纯化单克隆抗体。亲和性为至少10⁸M、优选为10⁹至10¹⁰或更强的单克隆抗体通常按照标准程序加以制备，如Harlow和Land(1988)《抗体：实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory或Goding(1986)《单克隆抗体：原理和实践》第2版Academic Press N.Y.所述。

可用于产生抗体的序列包括AKQNSSKTTSKRRG。尤其有用的序列包括图2箭头后所指示的那些。抗这些序列的抗体可用于区分不同的SRK转录物。见上。

特定的SRK抗体可用于病理学状态和慢性或急性疾病的诊断，这些疾病以SRK的量或分布差异为特征。SRK的诊断试验包括采用抗体和标记检测人(或小鼠等，如果使用小鼠等的话)体液、组织或组织提取物中SRK的方法。

本发明的多肽和抗体在使用时可以进行或不进行修饰。经常，多肽和抗体将通过它们以共价或非共价方式与提供可检测的信号的物质连接而被标记。已知有多种标记和缀合技术，广泛见诸科学和专利文献。适合的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性粒子等。涉及这些标记用途的专利包括美国专利Nos.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。而且，还可以产生重组免疫球蛋白，如美国专利No.4,816,567所示，引用在此作为参考文献。

本领域已知各种用于测量可溶性或与膜结合的SRK的方案，它们使用SRK特异性单克隆或多克隆抗体。例子包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫测定法(RIA)和荧光激活细胞分类术(FACS)。优选的是双位点单克隆类免疫测定法，使用对EC上两个非干扰性表位具有反应性的单克隆抗体，但是也可以采用竞争性结合测定法。这些测定法尤其描述在Maddox，Del.等(1983)《实验医学杂志》158：1211。

抗体和其它与SRK结合的配体可以按各种方式使用，包括作为治疗、诊断和商业研究的工具，例如量化动物、组织、细胞等中的SRK多肽水平，鉴定细胞定位作用和/或其分布，纯化它或包含其一部分的多肽，调制它的功能，用在蛋白质印迹、ELIZA、免疫沉淀、RIA等中。本发明涉及这样的测定法、进行这些方法的组合物和试剂盒等。利用这些和其它方法，根据本发明的抗体可用于检测各种样本中的SRK多肽或其片段，样本包括组织、细胞、体液、血液、尿、脑脊液。本发明的方法包括：a)在本领域已知有效实现结合的条件下，接触与图2肽结合的配体，和b)检测配体与肽之间的特异性结合。特异性结合意味着配体连接在明确的氨基酸序列上，例如包括图2氨基酸序列或其衍生物或包括在其中。

使用SRK特异性抗体，天然或重组SRK可以按免疫亲和色谱法加以纯化。一般来说，通过将抗SRK抗体与活化色谱树脂共价偶联，构造免疫亲和柱。

多克隆免疫球蛋白是从免疫血清中制备的，方法是用硫酸铵沉淀，或在固定化蛋白质A(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)上纯化。同样，单克隆抗体是从小鼠腹水中制备的，也是通过硫酸铵沉淀或固定化蛋白质A色谱。部分纯化的Ig共价连接到色谱树脂上，例如CnBr活化的Sepharose(Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)。将抗体与树脂偶联，将树脂封闭，按照厂商说明洗涤衍生树脂。

在SRK的纯化中采用免疫亲和柱，通过制备含有SRK的细胞部分进行纯化。这种制备可以是将通过加入洗涤剂进行差示离心所获得的全细胞或亚细胞部分进行增溶，或者是本领域熟知的其它方法得到的。或者，含有信号序列的可溶性SRK可以以有用的量分泌到细胞在其中生长的培养基中。

使含有SRK的可溶性制剂通过免疫亲和柱，柱子例如在这样的条件下洗涤，例如在洗涤剂存在下的高离子强度缓冲液，以便SRK的优先吸收。然后，柱子在破坏抗体/SRK结合的条件(例如pH 2-3的缓冲液，或高浓度离液剂，例如尿素或硫氰酸根离子)下洗脱，收集SRK。

另外，与根据本发明的SRK多肽或其衍生物结合的配体例如可以利用合成肽文库或aptamer加以制备(例如Pitrung等，美国专利No.5,143,854；Geysen等《免疫学方法杂志》102：259-274，1987；Scott等《科学》249：386，1990；Blackwell等《科学》250：1104，1990；Tuerk等《科学》249：505，1990)。

抗体或其衍生物也可用于抑制SRK或其片段的表达。SRK多肽水平可以单独或结合其它基因产物加以测定。确切地说，可以将SRK多肽的量(例如其表达水平)与相同或不同样本中其它多肽、例如肌动蛋白的量进行比较(例如作为比例)。一般来说，按照任何所需的方法，SRK特异性试剂可用在诊断和/或法医研究中，例如美国专利Nos.5,397,712、5,434,050、5,429,947。

本发明也涉及SRK多肽，它是按照所需方法制备的，例如公开在美国专利No.5,434,050中的方法。标记后的多肽例如可用在结合测定法中，例如用于在体外、体内、原位系统等中鉴定与SRK结合或连接的物质、跟踪SRK在细胞内的运动等。

根据本发明的核酸、多肽、抗体、SRK、配体等可以被分离。术语“分离”意味着物质处于其原始环境中或自然形式中不能存在的形式中，例如更浓缩、更纯净、从组分中分离等。分离后的核酸例如包括具有从活动物染色体DNA分离的SRK序列的核酸，例如作为完整的基因、转录物或cDNA。这种核酸可以是载体的一部分，或者可以插入到染色体内(通过特异性基因靶向或随机整合在除正常位置以外的位置)，并且也仍是分离的形式，即不是在其自然环境中的形式。本发明的核酸或多肽也可以是基本上纯净的。基本上纯净意味着核酸或多肽是分离的，基本上不含其它核酸或多肽，也就是说核酸或多肽是主要的活性成分。

本发明也涉及包含SRK的转基因动物，例如非人哺乳动物，例如小鼠。转基因动物可以按照已知方法制备，例如包括将重组基因原核注射到1-细胞胚胎的原核内、向胚胎干细胞内掺入人工酵母染色体、基因靶向方法、胚胎干细胞方法学。例如参见美国专利Nos.4,736,866、4,873,191、4,873,316、5,082,779、5,304,489、5,174,986、5,175,384、5,175,385、5,221,778；Gordon等《美国国家科学院院报》77：7380-7384，1980；Palmiter等《细胞》41：343-345，1985；Palmiter等《Ann.Rev.Genet.》20：465-499，1986；Askew等《分子细胞生物学》13：4115-4124，1993；Games等《自然》373：523-527，1995；Valancius和Smithies《分子细胞生物学》11：1402-1408，1991；Stacey等《分子细胞生物学》14：1009-1016，1994；Hasty等《自然》350：243-246，1995；Rubinstein等《核酸研究》21：2613-2617，1993。可以将根据本发明的核酸引入任何非人哺乳动物，包括小鼠(Hogan等《利用小鼠胚胎：实验室手册》ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1986)、猪(Hammer等《自然》315：343-345，1985)、绵羊(Hammer等《自然》315：343-345，1985)、牛、大鼠或灵长类。例如也参见Church，1987《生物技术趋势》5：13-19；Clark等《生物技术趋势》5：20-24，1987)；和DePamphilis等《生物技术》6：662-680，1988。另外，定制的转基因大鼠和小鼠是商业上可得到的。这些转基因动物是有用的动物模型，可用于试验SRK的功能、作为蛇的饲料、作为检测菌株起源的遗传标记(即其中SRK或其片段已被插入)等。这些转基因动物可以进一步包含其它转基因。转基因动物(例如SRK失效)可以按照美国专利申请Nos.08/866,058和09/000,846加以制备和使用。含有SRK突变体(例如显性干扰性SRK)或SRK失效的转基因动物可以结合其它基因突变，例如涉及相同或相似信号途径的基因失效或突变。这样的基因包括：Cdc42Hs、Racs、Rhos、PAKS、JNK、Jun、WASP、IQGAP、POSH、POR1、p67-phox、MLK3、MAP激酶、NCK、SOS、ERKs、p38、GEFs、GAPs、GDIs、Wiskott-Aldrich综合征蛋白、FTases、STE14、p53、Rb、Mtase、GTP酶亚单位、Dbl、1bc、Ost、Lsc、Ste7，优选为Ste11、Fus3、KSS1、Ras、活化Ras突变蛋白、Raf、MEK等，以及上文、下文或本文引用的参考文献中提到的任何基因等。动物可以是纯合的或杂合的，依所需用途和表型而定。

一般地，本发明的核酸、多肽、抗体等可以如美国专利Nos.5,501,969、5,506,133、5,441,870和WO 90/00607、WO 91/15582所述加以制备和使用。

关于核酸的其它方面，请参考分子生物学的标准教科书。例如参见Davis等《分子生物学中的基本方法》Elsevir Sciences Publishing，Inc.，New York，1986；Hames等《核酸杂交》IL Press，1985；Sambrook等《分子克隆》CSH Press，1989；Howe《基因克隆和操作法》Cambridge University Press，1995。

                      实施例

实施例1：SRK的克隆

为了鉴定新颖的影响MAP激酶途径的信号转导分子，我们采用一种酵母系统，其中表达哺乳动物Raf和MEK蛋白，以补充酵母Ste11蛋白(Freed等《科学》265：1713-1716，1994)。表达Raf和MEK的菌株SY1984(SY1984 R-L M-T)响应于Raf的活化，借助酵母MAP激酶Kss1和Fus3发信号而实现活化。后者激酶的活化诱导HIS3基因从FUS1启动子转录，引起在没有外源性组氨酸的存在下的生长(图1)。将细胞用从Jurkat细胞制备的人cDNA文库转化，分离在没有组氨酸的存在下生长的菌落。分离每个菌落的cDNA，再对四种不同的菌株进行试验：原来用于筛选的菌株(SY1984 R-L M-T)、缺少Raf的菌株(SY1984 M-T)、缺少MEK的菌株(SY1984 R-L)和无Ste7菌株(SY1943-L21)，以鉴定它们的功能靶特征。

筛选得到若干活化Raf、MEK或酵母MEK、Ste7的基因。分离不同的Ras和14-3-3克隆作为Raf活化剂，它们在没有组氨酸的存在下且仅当存在Raf时刺激生长。在MEK活化剂中，获得涵盖这些基因的激酶结构域的MEKK1和MEKK2部分克隆。另外，分离到两种新颖的基因，是Ste7的活化剂。它们允许SY1984菌株(具有野生型STE7)在缺少组氨酸的培养基上生长，但是不允许SY1493-L21菌株(STE7缺失)生长。这些克隆J42和J207编码相同的激酶结构域，在3’序列中有分支(图2)，提示了它们可能代表相同基因的剪接变体。这些基因的激酶结构域与Raf激酶共享33％(Bonner等《核酸研究》14：1009-1015，1986)、与Muk共享37％(Hirai等《癌基因》12：641-650，1996)、与TAK1共享39％(Irie《癌症研究进展》265：1716-1719，1994)、与MLK蛋白共享44％的同一性(Dorow《欧洲生物化学杂志》213：701-710，1993)，所述均为MAPKKK家族的成员。与MLK蛋白相似，J42激酶结构域后接亮氨酸拉链区，它也存在于J207克隆中。J42基因具有独特的3’区，它编码强酸性结构域。分离的J42 cDNA具有编码51KDa计算MW蛋白质的能力。

使用来自激酶结构域的cDNA探针进行RNA印迹分析，鉴定了7.5kb的优势带和3.8kb与1.6kb的次丰富带。来自J42 3’端的特异性探针鉴定该大的转录物为J42 mRNA，而来自J207 3’端的探针识别3.8kb信息(图3A)。mRNA分布的分析显示，J42和J207在正常组织中是无所不在地被表达的，不过在骨骼肌和心脏中是最为丰富的(图3B)。因为J42特异性信息在三种形式RNA中是最主要的，我们主要对J42克隆进行下列研究。我们将J42基因称为“存活调节激酶”或“SRK”。

其它克隆可以按常规方法从cDNA文库中加以分离，例如富集更大转录物、例如大于5kb的转录物的文库。由于7.5kb SRK转录物在心脏和骨骼肌中是丰富的，文库可以按常规方法从分离自这些组织的mRNA加以制备。mRNA可以富集更长的转录物，方法是在凝胶上走mRNA，切除含有7.5kb转录物的凝胶区域，从大小富集的mRNA制备cDNA。一旦准备好文库，可以按常规方法进行筛选，例如使用标记的激酶结构域、标记的J42等。也可以通过聚合酶链反应进行筛选。

实施例2：重组SRK具有体内和体外激酶活性

为了试验这种新颖的激酶是否影响哺乳动物细胞内的MEK活性，我们将COS细胞用SRK-KT3标记构建物和Glu-标记的MEK质粒进行共转染。随后，重组MEK用抗Glu抗体进行免疫沉淀，并在重组ERK的存在下进行体外激酶反应。当与SRK共表达时，经过免疫沉淀的MEK能够体外磷酸化MAP激酶，说明它被体内活化。不过，当SRK从COS细胞中被免疫沉淀出来并与重组无激酶活性MEK(MEK-B)进行体外反应时，它不能磷酸化和活化MEK，尽管对于MBP具有非常强的活性。相反，重组MEK被MEKK1相当充分地磷酸化和活化。另外，SRK也显示强烈的自磷酸化作用。该结果提示，SRK对MEK的体内活化作用是间接的。与这种假设一致的是，当在细胞内共表达时，SRK对ERK2产生弱的活化作用。SRK也仅微弱地刺激JNK1。这些观察结果以及序列同源性和对酵母系统所作的研究都支持了这样的假设：SRK可能代表新颖的MAP激酶途径中的一员。

实施例3：抗SRK特异性抗体鉴定51KDa蛋白质是细胞内内源性SRK的主要形式

为了测定内源性SRK蛋白的大小，我们引起兔抗肽抗体，这种肽是从SRK独有的羧基末端序列衍生的(图2)。将抗血清在肽亲和柱上纯化，所得抗体4-1-1用在对COS和293细胞溶胞产物所进行的蛋白质印迹分析中。250KDa带与7.5Kb SRK转录物的编码潜力是一致的。不过，在细胞溶胞产物中始终观察到更占优势的表观分子量约为51KDa的带。即使当细胞在高浓度蛋白酶抑制剂的存在下或在SDS的存在下溶解时也检测到这条带。较小形式的大小非常接近于从我们在原来的筛选中所鉴定的cDNA表达的重组SRK蛋白。重组蛋白的缓慢移动性可能是由KT3标记所导致的，加入该标记用于鉴定。随后的试验使用了针对重组SRK产生的抗体，确认了~51kDa内源性蛋白质具有组成型激酶活性。另外，内源性51kDa SRK和重组蛋白质的有限蛋白水解作用都产生相似模式的肽片段。

实施例4：SRK的激酶缺陷型突变体具有显性干扰性质

大多数激酶在活性位点都具有保守的赖氨酸，这对激酶活性来说是必需的。SRK在这个区域具有两个连续的赖氨酸，在45位和46位。我们将这些位点之一或者两者都突变为丙氨酸，以及133位的天冬氨酸，后者在cdc2菌肉中表现为显性失活。分别产生SRK-K45A(SRK-KA)、SRK-K45AK46A(SRK-KKAA)和SRK-D133A(SRK-DA)。为了试验这些突变是否使激酶失活，我们将各种突变的蛋白质表达在酵母以及COS细胞中。这些突变体没有一个能够支持酵母菌株SY1984在缺少组氨酸的培养基上生长。同样，利用在COS细胞内表达的这些蛋白质既没有观察到自磷酸化作用，也没有观察到MBP磷酸化作用(数据没有显示出来)。为了试验无激酶活性的SRK突变体是否表现为显性失活突变体，我们将它们在酵母内与野生型J207共表达，后者在该系统内具有相同的表型，并确定SRK突变体是否干扰J207向Ste7发信号的能力。这些蛋白质的共表达不影响在组氨酸存在下(+His)的细胞生长，说明缺乏对细胞的非特异性毒性。不过，当在没有组氨酸的存在(-His)下使突变体在复制平皿上表达以试验MAP激酶途径的活化作用时，观察到菌落数量较少(10-20％)。当野生型SRK被表达时，在两种培养基上没有观察到菌落数量差异。这些结果说明，无激酶活性的SRK突变体非生产性地与Ste7结合，在酵母中以显性失活方式发挥作用。

实施例5：SRK-KA降低Ras的转化潜力，抑制293细胞在软琼脂中和在塑料上的生长

为了鉴定SRK的功能，我们在转化灶形成测定法中测定了它的激酶活性是否是致癌基因RasV12转化NIH3T3细胞所必需的。为此，我们将RasV12以及无激酶活性的SRK构建物一起共表达，后者可能在哺乳动物细胞以及酵母中充当显性干扰突变体。图4显示SRK突变体减少Ras引起转化灶的能力，这与显性失活MEK和RacN17的情况一样。为了将这种观察结果延伸到人细胞系，我们创建了稳定的人胚胎肾293细胞系，它们表达蜕皮素可诱导的SRK-KA构建物。用muristerone A诱导后，在不同的克隆中观察到不同水平的SRK-KA表达。SRK-KA在这些细胞内的诱导作用以剂量依赖性方式影响它们的生长。高表达克隆的生长比低表达克隆受到更多影响，也就是说在表达更大量SRK-KA的克隆中观察到比表达更低量的克隆更多的生长抑制作用。有趣的是，即使在非诱导性条件下，也在一些克隆中观察到对细胞生长的一定影响。这种影响与这些克隆中没有muristerone A存在的背景表达水平有相互关系。有趣的是，一种显示最紧密表达模式的克隆在其生长性质上不能区别于没有诱导作用存在的对照细胞。不过，这种克隆在SRK-KA表达的诱导作用之后受到严重影响。我们随后试验这些克隆在软琼脂中生长的能力，这是一种与转化表型有关的性质。我们发现，SRK-KA表达对软琼脂中的菌落形成具有显著影响，这种影响的程度也与突变SRK蛋白的表达水平有相互关系。综上，这些观察结果提示，SRK在生长调节和转化中具有重要的功能，用显性失活突变体阻断它的信号途径则干扰细胞转化。

实施例6：SRK激酶与HAX-1结合

为了描绘SRK激酶的下游途径，我们用SRK-WT或SRK-KKAA进行了酵母双杂交筛选。在两者情况下，仅使用激酶和亮氨酸拉链结构域作为诱饵，因为SRK的C-端结构域是强酸性的，它主动诱导反式激活作用(数据没有显示出来)。将携带一种或另一种诱饵的YRG2菌株用从U937细胞衍生的cDNA文库转化。总计9.3×10⁶个转化体，其中2.6×10⁶个为SRK-WT，6.7×10⁶个为SRK-KKAA，分析发现318个克隆在-His上的生长为阳性。由于YRG2菌株不产生-半乳糖苷酶表型，候选物在YGH1菌株中重新试验蓝色。用SRK-WT和SRK-KKAA获得相似的克隆。总计18个阳性克隆，其中5个编码不同的HAX-1基因片段。该基因编码与Bcl-2类蛋白共享一定同源性的蛋白质，定位于线粒体(Suzuki等《免疫学杂志》158：2736-2744，1997)。图5显示克隆和它们的-gal表型。有趣的是，用缺少蛋白质N-端一半的克隆104观察到最强烈的相互作用，说明Hax-1的C-端区域对与SRK结合来说是足够的。与SRK的相互作用是特异性的，因为用Gal-4 DNA结合结构域或其它三种诱饵Bcl2、p53或BCR-PH则观察到没有相互作用。为了确认哺乳动物细胞中的相互作用，将SRK激酶在COS细胞内与重组S-标记的Hax-1共表达。图6显示在S-Hax-1复合体中发现了SRK-WT和SRK-KA。还发现被克隆104编码的短型Hax-1可用两种形式的SRK共沉淀。

免疫荧光研究确认，全长Hax-1(克隆102)主要定位于线粒体，前人有所报道(Suzuki等《免疫学杂志》158：2736-2744，1997)。有趣的是，有相当一部分重组SRK共定位于该相同的细胞器。这种定位作用在固定之前的细胞的透化作用之后是明显的，使重组SRK的胞质可溶性部分从细胞内漏出，揭示了该部分通过Hax-1固定于线粒体。除了线粒体定位作用以外，还在核内检测到了SRK。

实施例7：Hax-1的可溶形式导致编程性细胞死亡

当Hax-1的C-端一半(克隆104、Hax-104)在COS细胞内被表达时，它不定位于线粒体，尽管在蛋白质的C-端存在公认的疏水性跨膜结构域。用与重组Hax-1上的S-肽标记特异性结合的S-蛋白所进行的亚细胞荧光定位作用显示，这种截短的蛋白是胞质的。固定之前的细胞透化作用引起重组Hax-104的全体丧失。DAPI染色说明Hax-104表达导致染色体缩合，这是经历编程性细胞死亡的细胞的典型特征。用全长Hax-1蛋白没有观察到这种表型，提示它在编程性细胞死亡的抑制中发挥作用(Suzuki等《免疫学杂志》158：2736-2744，1997)。截短的Hax-1的毒性提示这种片段能够充当显性失活突变体。这种部分蛋白可以结合在不适当的位置，隔离必需因子，引起细胞死亡。有趣的是，这种作用被SRK共表达所抑制，说明SRK可以在编程性细胞死亡的调节中发挥作用。

实施例8：SRK-激酶抑制IL-3-依赖性细胞的编程性细胞死亡

为了探究SRK是否可以抑制其它系统中的细胞死亡，我们选择FL5.12细胞进行研究，这种细胞为了存活而对IL-3的依赖性特征已被广泛地描述过(McCubrey等《癌基因研究》4：97-109，1989)。将细胞用SRK或Bcl2瞬时转染，再使其恢复24小时。随后，撤去IL-3达18小时，对细胞进行加工用于FACS分析。SRK表达减少了细胞的sub-G1群，这代表细胞经历DNA断裂，而后者是编程性细胞死亡的结果。这种减少作用类似于在相同实验中用Bcl2所观察到的结果。因此，在这种系统中SRK也充当编程性细胞死亡的抑制剂。

实施例9：J42体外磷酸化BAD

磷酸化作用使原编程性细胞死亡蛋白BAD体内失去活性，磷酸化作用发生在两个位点Ser1112和Ser136，这促进这种蛋白质与14-3-3蛋白的结合，并防止它与存活蛋白Bcl-X发生相互作用。已经显示PKB负责磷酸化Ser136，不过，还没有鉴定出体内磷酸化Ser112的激酶。既然J42是丝氨酸/苏氨酸激酶，并且我们指出它涉及编程性细胞死亡的抑制作用，因此我们试验它是否能够磷酸化BAD。我们首先试验了BAD的体外磷酸化作用。我们把从被杆状病毒感染的细胞制备的重组J42，与重组GAST-BAD培养，进行激酶反应。J42对BAD的活性非常高。磷酸-BAD(Ser 112)特异性抗体鉴定Ser112是被J42磷酸化的位点之一。有趣的是，Ser136不受J42的影响，但是被PKB磷酸化。

实施例10：J42对S112-BAD的体内磷酸化作用

为了检查J42是否能够体内磷酸化BAD的S112，将COS细胞用J42和不再导致编程性细胞死亡的BAD突变形式瞬时转染。然后利用磷酸-112抗-BAD抗体，通过细胞溶胞产物的蛋白质印迹观察BAD位点112的磷酸化作用。Wt-J42能够增加磷酸-BAD水平超过背景水平，而J42-KA减少该水平。因此，J42能够体内磷酸化BAD的S112。

实施例11：质粒和cDNA文库的构建

通过在BstX1与Not1之间插入新颖的多接头(Sal1、Sac1、AatII和Xho1)，从pAB23-BXN衍生含有URA3可选择性标记物的2μm级质粒pAB23BXN2(Schild等《美国国家科学院院报》87：2916-2920，1990)，用作文库载体。在5μg Poly(A+)RNA上进行cDNA合成，这种RNA是利用Invitrogen Fast跟踪试剂盒从2×10⁸个Jurkatt细胞中分离的。第一链用来自ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene)的接头-引物来引发，它含有Xho1位点。这种3’克隆位点的保护作用保证最终cDNA的单向克隆化。5’克隆位点是由BstX1衔接体的连接作用所提供的。将cDNA文库按大小分级，收集含有500bp以上插入片段的部分，与所制备的载体连接。大肠埃希氏菌DH10β(GIBCO-BRL)的转化得到总计大约1×10⁶个转化体，载体的再连接作用代表其3％背景。

来自用在2-杂交筛选中的U937细胞的人cDNA文库是来自AliciaEguinoa(The Babraham Institute，Cambridge)的慷慨礼物。在pAD-GAL4质粒(Stratagene)中的Eco R1与Xho1位点之间构建该文库。使用质粒pDB-GAL4-SRK-WT-C和pDB-GAL4-SRK-KA-C作为诱饵。利用来自Stratagene的定点诱变试剂盒QuickChange^TM生成无SRK-激酶活性的突变体。使用下列引物将K45、K46和D133转变为A：对于SRK-KA使用GAGGTGGCTGTCGCGAAGCTCCTCA，对SRK-KKAA使用GGTGGCTGTAGCAGCGCTCCTCAAA，对SRK-DA使用GTGATTCACAGGGCCCTCAAGTCAAG。按照厂商的提示进行诱变。含有RacN17、DN-MEK和RasV12的质粒EXV及其衍生物是从Marc Symons(OnyxPharmaceuticals)获得的。pBS-SRK-KT3是这样构建的，在PCR反应中，利用下列3’端低聚体，在SRK的最后一个密码子之后插入KT3标记：GGATCCAACACCACCACCAGAACCAGAAACATGAGCGGCCGC。

含有SV40启动子的pCDB载体是从George Martin(OnyxPharmaceuticals)获得的，用于生成pCDB-SRK-WT、pCDB-SRK-KA和pCDB-SRK-KKAA，方法是亚克隆来自pBS构建物的Sal1(填补)-Not1片段。Hax-1克隆102和104分别代表全长的和N-端截短的基因。将它们从文库质粒亚克隆到pT7 Blue-2载体(Novagen)中，后者提供N-端的S-标记，然后作为Nco 1-填补-Hinc II片段重新克隆到pCDB的填补Eco R1位点。

利用含有KT3-标记的突变SRK编码序列的pBS-SRK-KA的HindIII-Not1片段构建pIND-SRK-KA，将其连接到用相同酶消化的pIND(Invitrogen)载体上。

实施例12：酵母菌株和技术

SY1984菌株(MAT ste11 pep4 his3 FUS1：：HIS3 leu2 ura3 trp1can1)(Freed等《科学》265：1713-1716，1994)用于生成其衍生物SY1984 R-L、SY1984 M-T和SY1984 R-L M-T，方法是将RAF(R)和MEK(M)基因分别整合在LEU2(L)和TRP1(T)基因座上。SY1493-L21菌株(MAT ste11 pep4 his3 FUS1∷HIS3 leu2 ura3trp1 can1 ste7∷LEU2)是从Kunihiro Matsumoto(NagoyaUniversity，Japan)获得的。YRG2菌株(Stratagene)和YGH1(Hannon等《基因进展》7：2378-2391，1993)用于2-杂交筛选。

使用标准酵母培养基(Rose等，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)和遗传技术(Sherman等，ColdSpring Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982)。

实施例13：RNA和蛋白质分析

利用Invitrogen Fast跟踪试剂盒从HT1080细胞制备Poly(A⁺)RNA。从Clontech购买人多组织RNA印迹I和II，与上述SRK激酶结构域杂交。将哺乳动物细胞溶解在溶胞缓冲液中，后者含有20mMtris-HCl pH8.0、137mM NaCl、1mM EGTA、1％Triton x-100、10％甘油、1.5mM MgCl₂，在使用前补充1mM原钒酸钠、50mM NaF、1mMPefabloc、20μM亮抑酶肽和10μg/ml抑酶肽。将细胞在4℃下溶解20分钟，在4℃下使碎屑在14Krpm下自旋。通常，将500μg蛋白质用适当的抗体进行免疫沉淀，该抗体与蛋白质G琼脂糖珠粒偶联(KT3抗体)或者与蛋白质A珠粒一起，在4℃下免疫沉淀2小时。将免疫复合物用溶胞缓冲液洗涤三次，将蛋白质在Laemmli样本缓冲液中洗脱，在95℃下加热5分钟。对样本进行加工，用于蛋白质印迹分析或激酶反应，后者是在30mM Tris-HCl pH8.0、20mM MgCl₂、1mM EDTA、75mM NaCl、1mM DTT、1mM原钒酸钠、10μM冷ATP、5微居里[-³²P]ATP和适当底物的存在下。

免疫荧光是这样进行的，将细胞在4％甲醛中固定15分钟，然后用PBS、0.1％Triton x-100洗涤三次，使细胞透化，用含有5％奶粉和0.1％吐温的blotto溶液封闭45分钟。必要时，在固定前进行30秒钟的细胞透化作用。

按下列稀释比使用抗体：SRK 4-1-1抗体为1∶200，S-FITC蛋白稀释为1∶2000。培养45分钟。用axiovert 100显微镜(Zeiss)观察细胞，并利用40x(0.75NA)neofluar物镜或100x(1.3NA)平面neofluar物镜，用冷却的CCD照相机捕获图象。

实施例14：细胞转染

如下利用电穿孔进行COS细胞的瞬时转染。4×10⁶个细胞经受胰蛋白酶消化作用，用HeBs缓冲液洗涤两次，该缓冲液含有20mM HepespH7.0、137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na₂HPO₄和6mM葡萄糖。将细胞再悬浮在HeBs中，最终体积为260μl，该HeBs含有10μg(1μg/ml)供试DNA和100μg鲑睾丸载体DNA。在Biorad仪器中进行电穿孔，电压为250伏，电容为125μF。使细胞在比色杯中恢复10分钟，放置在10cm平皿内，72小时后收获。从Invitrogen购买稳定表达蜕皮激素受体的EcR-293细胞，采用Qiagen的SuperFect技术，用SRK-KA或载体质粒稳定地转染该细胞。在300μg/ml G418和400μg/Zeocin(Invitrogen)的存在下进行转染细胞的选择。

实施例15：转化灶形成测定法、SRB和软琼脂生长

转化灶形成测定法如前人所述进行(Qiu等《自然》374：457-459，1995)。简单地说，使用磷酸钙法，将NIH3T3细胞用不同DNA转染，14天后计数转化灶。SRB测定法如前人所述进行(Skehan等《国家癌症研究院杂志》82：1107-1112，1990)。简单地说，将细胞按104个细胞/孔接种在96孔微量滴定板中。为了实现再现性，每种细胞系试验七个孔，每个时间点、即0或4天试验两个板。附着几小时后，改变培养基，开始进行处理。在该0时间点，固定平板以提供用于数据归一化的内部对照。四天后，将细胞用50％三氯乙酸溶液固定。将平板在4℃下培养60分钟，然后在室温(RT)下用0.2％SRB的1％乙酸溶液染色30分钟，风干。在低速摇动器上，将所结合的染料在200μl 10mM未缓冲的Tris碱中溶解5分钟，在ELISA平板读数器中、在515nm下读取OD值。

软琼脂生长如前人所述进行(Qiu等《自然》374：457-459，1995)。

实施例16：FL5.12细胞的编程性细胞死亡测定法

将FL5.12细胞培养至最大密度为5×10⁵个细胞/ml，培养基为RPMI 1640、10％FCS、10％WEHI IL-3上清液、2.0mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠、100u/ml青霉素和10μg/ml链霉素。

在室温下，在1.5ml eppendorf试管内，使DEAE葡聚糖与所有转染的DNA结合，二者比例为1.0μg DEAE葡聚糖/10μg DNA。离心收获FL5.12细胞，用冷的电穿孔培养基洗涤两次；该培养基为RPMI1640、20％FCS、2.0mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠、100u/ml青霉素和10μg/ml链霉素，再按4×10⁷个细胞/ml的密度悬浮。将500μl细胞悬液转移到含有DNA/DEAE葡聚糖复合物的eppendorf试管内。将细胞悬液在冰上培养15分钟，并进行间歇的混合(反转)，再转移到预冷却的0.4cm Bio-Rad电穿孔比色杯内。使细胞在Bio-RadGene-pulsor电穿孔仪中进行电穿孔，电压为250-350V，电容为960μF，在冰上培养10分钟。从比色杯内收集细胞，用吸移管小心地除去游离的基因组DNA。将细胞用预温热至37℃的培养基稀释至5.0ml，在15ml圆锥形离心试管内小心地覆盖在5.0ml预温热的Ficoll-paque上。在22℃下，在装有GS-3.8转子的Beckman GS-6R离心机中离心分离存活的细胞中的电濒死细胞，在3000xg下离心20分钟。小心地收集梯度界面上的细胞，用培养基洗涤2次。将细胞再悬浮在10ml培养基中，使其在37℃、5％CO₂下恢复24小时。

24小时恢复期后，将细胞用PBS、1.0％FCS洗涤3次，再悬浮在RPMI 1640、1.0％FCS、2.0mM L-谷氨酰胺、1.0mM丙酮酸钠、100u/ml青霉素、10μg/ml链霉素和+/-IL-3中。将细胞在标准环境条件下另外培养18-36小时。

将细胞在冷的PBS、1.0％FCS中洗涤2次，再悬浮在500μl不含钙或镁的PBS中。然后将细胞用5.0ml冰冷却的85％乙醇固定，在冰上避光培养20分钟。固定后，将细胞在冰冷却的、不合Ca和Mg的PBS中洗涤2次，再悬浮在1.0ml碘化丙锭溶液中：10μg/ml碘化丙锭、25μg/ml RNA酶A、1.0％FCS在不含Ca和Mg的PBS中的溶液，在37℃下避光培养30分钟。将细胞转移到带滤帽的4.0ml聚碳酸酯试管内，在Becton-Dickenson FACScalibur扫描仪上进行FACS分析。

讨论

在这项研究中，我们描述了新颖的人丝氨酸/苏氨酸激酶SRK的鉴定方法，SRK在酿酒酵母中能够活化Ste7，后者是介导交配信息素应答的酵母MEK同系物。SRK蛋白与MAPKKK类蛋白质在激酶结构域上共享显著的同源性，后者蛋白质已知活化MEK。功能鉴定和序列相似性提示SRK是MAPKKK家族的新成员，可能涉及另一种信号途径。

比较所分离的SRK cDNA与其mRNA的长度，分别为2kb和7.5kb，说明这是一种部分cDNA。我们对若干cDNA文库进行了广泛筛选，以分离全长基因，但是我们所分离到的最长克隆与原始分离到的cDNA开始于同一点。不过有趣的是，细胞内所检测到的SRK的主要形式的分子量非常接近于被所分离的cDNA克隆编码的蛋白质。

SRK活性位点的突变干扰其在酵母系统中的活性。因此我们使用这些突变蛋白研究SRK在细胞增殖控制中的作用。转化灶形成测定法说明突变后的SRK能够干扰Ras介导的转化作用，说明其功能是致癌基因Ras发挥全部转化能力所必需的。另外，显性失活SRK的可诱导构建物对293细胞在软琼脂中生长的能力具有显著影响。这种表型与对细胞生长的影响密切相关，这是用SRB测定法检测到的，并且与显微镜观察结果是一致的，显示培养物中的生存能力丧失。同时，这些发现说明了SRK在维持转化表型中的作用。人们关于SRK调节转化作用的分子机理的一定认识来自其结合配偶体之一是Hax-1蛋白这一发现。Hax-1经鉴定是HS1-相互作用分子，与Bcl2家族共享一定同源性。Bcl2家族代表一大类抗编程性细胞死亡因子以及原编程性细胞死亡因子(Chao等《免疫学年鉴》16：395-419，1998，1998)。它们主要以共享的同源性结构域为特征，这些结构域包括保守区域，称为BH(Bcl同源性)1、BH2、BH3和BH4。Hax-1具有BH1和BH2区域，但是缺少BH3同源性(Suzuki等《免疫学杂志》158：2736-2744，1997)，其意义是不清楚的。HS1是造血的特异性蛋白质，它转导淋巴样细胞内克隆扩充和缺失的信号(Taniuchi等《欧洲分子生物学组织杂志》14：3664-3678，1995)，并已涉及编程性细胞死亡的诱导作用(Fukuda等《美国国家科学院院报》92：7302-7306，1995)。作为HS1的结合配偶体，提示Hax-1在介导细胞存活功能中发挥作用(Suzuki等《免疫学杂志》158：2736-2744，1997)。我们指出，不再膜定位的Hax-1的截短突变形式导致编程性细胞死亡，而且SRK能够抑制这种表型。另外，SRK抑制由除去FL5.12细胞中的IL-3诱导的细胞死亡。

最近日益明显的是，癌基因除了解除调节生长以外还诱导细胞死亡(Evan等《细胞》69：119-128，1992；Shi等《科学》257：212-214，1992)。携带癌基因突变的细胞内编程性细胞死亡的抑制作用因此是发展为转化表型的先决条件。这种抑制作用可以是由原编程性细胞死亡因子、如Bax的丧失引起的(Rampino等《科学》275：967-969，1997)，或者是由存活因子或其受体、例如IGF-1和IGF-1R的过度产生引起的(Yee等《癌症治疗研究》53：93-106，1991；Cullen等《癌症研究》9：443-454，1991)。涉及编程性细胞死亡抑制的磷酸化作用已被描述为Bcl-2活性(Ito等，1997；May等，1994)以及BAD活性(Zha等，1996)的调节作用。

Hax-1和SRK的共定位作用象征这样一种模型，其中与Hax-1结合的SRK使这种激酶适当地定位，以磷酸化原编程性细胞死亡蛋白，例如淋巴细胞中的HS1或其它细胞类型中的副本。这种修饰作用能够防止原编程性细胞死亡蛋白与Hax-1结合，并减少它们的毒性作用。我们的发现说明，SRK活性的抑制作用能够引起转化细胞经历编程性细胞死亡，因此，SRK代表一种有用的靶子，用于癌症的治疗介入。

勿庸赘言，相信本领域技术人员借助前面的说明，能够最充分地利用本发明。前述优选的具体实施方式因此被解释为仅供举例说明，无论如何也不限制其余任何公开内容。上文引用的和附图中的全部申请、专利和文献的完整公开内容全文引用在此作为参考文献。

Claims (63)

1、分离的人SRK多肽或其生物学活性多肽片段。

2、权利要求1的分离的SRK多肽，其中所述多肽具有蛋白激酶活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特异性致免疫活性；

3、权利要求1的分离的人SRK多肽，包含图2所示的氨基酸1至氨基酸455。

4、权利要求1的分离的人SRK多肽，包含图2所示的氨基酸1至氨基酸455，并具有图2所示的DNA序列。

5、权利要求1的人SRK的分离的生物学活性片段，其中所述片段包含氨基酸1-250、23-250、287-322和430-455。

6、权利要求1的人SRK的分离的生物学活性片段，其中所述片段基本上由图2所示的氨基酸1-455组成。

7、权利要求1的分离的人SRK多肽，与图2氨基酸序列具有95％的序列同一性。

8、分离的SRK或其生物学活性片段，它是被一种核酸序列的补体编码的，该序列在严格性强的条件下与图2所示的DNA序列杂交，并且与所述DNA序列具有至少95％的序列同一性。

9、权利要求8的分离的SRK或其生物学活性片段，它是从天然来源获得的。

10、权利要求8的分离的SRK，具有图2的氨基酸序列，但是氨基酸45位赖氨酸被丙氨酸代替；氨基酸45位赖氨酸被丙氨酸代替并且氨基酸46位赖氨酸被丙氨酸代替；或者氨基酸133位天冬氨酸被丙氨酸代替。

11、权利要求8的分离的SRK或其生物学活性片段，它具有蛋白激酶活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特异性致免疫活性。

12、分离的核酸，包含编码全长人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的核苷酸序列。

13、权利要求12的分离的核酸，其中所述被编码的多肽具有蛋白激酶活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特异性致免疫活性。

14、权利要求12的分离的核酸，其中所述核酸是被7.5kb、3.8kb或1.6kb的mRNA所编码的。

15、权利要求12的分离的核酸，其中该核苷酸序列编码图2所示的氨基酸1至氨基酸455。

16、权利要求12的分离的核酸，具有图2所示的核苷酸序列。

17、权利要求12的分离的核酸，其中该核苷酸序列可操纵地连接于表达控制序列上。

18、权利要求12的分离的核酸，其中该核酸不间断地编码所述多肽。

19、权利要求12的分离的核酸，其中该核酸进一步包含可检测的标记。

20、在转化的宿主细胞内表达被核酸编码的人SRK多肽的方法，包括：

在有效表达该多肽的条件下，培养含有权利要求11的核酸的转化的宿主细胞。

21、权利要求20的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

22、权利要求20的方法，其中所述宿主细胞是酵母。

23、权利要求20的方法，进一步包括分离所述人SRK。

24、用权利要求20的方法生产的分离的人SRK多肽。

25、含有权利要求12的核酸的转化的宿主细胞。

26、包含权利要求12的核酸的载体。

27、分离的核酸，它在严格性强的条件下与图2所示的核酸序列或其补体杂交，并且与所述核酸序列或其补体具有至少95％的序列同一性。

28、权利要求27的分离的核酸，该序列编码蛋白激酶活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；MAPKK刺激活性；和SRK特异性致免疫活性。

29、分离的核酸，基本上由选自图2所示核苷酸序列的、12-100个碱基对的任意连续序列或其补体组成。

30、权利要求29的分离的核酸序列，进一步包含可检测的标记。

31、权利要求29的分离的核酸，在所述序列中具有至少一个但是不超过五个核苷酸取代，该核酸在严格性强的条件下与它或其补体杂交。

32、检测人SRK多肽或其生物学活性多肽片段中蛋白激酶活性的方法，包括：

使人SRK多肽或其生物学活性多肽片段与底物在有效使所述SRK多肽磷酸化所述底物的条件下反应；和

检测所述底物的所述磷酸化作用。

33、权利要求32的方法，其中所述底物是MBP。

34、鉴定调制人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的MAPKK刺激活性的试剂的方法，包括：

将供试试剂对表达(1)人SRK多肽或其生物学活性多肽片段和(2)MAPKK多肽的细胞给药，给药在有效使所述SRK多肽刺激所述MAPKK多肽的蛋白激酶活性的条件下进行；

检测所述蛋白激酶活性；和

通过比较在有和没有该供试试剂的存在下的激酶活性的量，鉴定该供试试剂是否调制所述SRK多肽的所述刺激活性。

35、权利要求34的方法，其中所述给药是对已经引入和表达编码所述SRK多肽和所述MAPKK多肽的核酸的细胞而进行的。

36、权利要求35的方法，其中所述MAPKK多肽进一步包含多肽表位。

37、权利要求36的方法，进一步包括：

溶解所述包含所述被表达的SRK多肽和MAPKK多肽的细胞；

使所述溶胞产物与抗多肽表位抗体在有效使所述抗体与所述表位结合形成复合体的条件下接触；

分离所述复合体；和

检测所述分离的复合体中的激酶活性。

38、权利要求37的方法，其中所述MAPKK多肽是MEK，所述多肽表位是myc、KT3、Glu或与所述MEK多肽框内融合的血凝素多肽序列。

39、鉴定调制由Ras和SRK介导的细胞转化的试剂的方法，包括：

将供试试剂对表达RasV12多肽和缺少激酶活性的SRK多肽或其生物学活性片段的细胞在有效使所述RasV12导致所述细胞形成转化灶的条件下给药，其中所述RasV12多肽具有转化灶形成活性，所述SRK多肽抑制所述RasV12的转化灶形成活性；

检测由所述细胞形成的转化灶；和

通过比较在有或没有所述供试化合物的存在下的转化灶数量和大小，鉴定该供试试剂是否调制所述SRK多肽抑制所述RasV12的转化灶形成活性的能力；和

40、权利要求39的方法，其中所述细胞是小鼠NIH3T3细胞或人293细胞。

41、权利要求39的方法，其中所述给药是对已经引入和表达编码所述RasV12和所述SRK多肽的核酸的细胞而进行的。

42、权利要求39的方法，其中所述转化活性是在软琼脂中测定的。

43、权利要求39的方法，其中所述缺少激酶活性的SRK多肽是SRK-KA。

44、鉴定调制由Ras和SRK介导的细胞转化的试剂的方法，包括：

将供试试剂对表达RasV12多肽的细胞在有效使所述RasV12导致所述细胞形成转化灶的条件下给药，其中所述RasV12多肽具有转化灶形成活性；

检测由所述细胞形成的转化灶；

通过比较在有或没有所述供试化合物的存在下的转化灶数量和大小，鉴定该供试试剂是否调制所述RasV12的转化灶形成活性；和

测定所述供试化合物是否调制人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的蛋白激酶活性，其中所述活性是蛋白激酶活性；自磷酸化活性；细胞转化活性；细胞生长调节活性；HAX-1结合活性；编程性细胞死亡抑制活性；或MAPKK刺激活性。

45、权利要求44的方法，其中所述检测激酶活性包括：

使人SRK多肽或其生物学活性多肽片段与底物在有效使所述SRK多肽磷酸化所述底物的条件下反应；和

检测所述底物的所述磷酸化作用。

46、权利要求45的方法，其中所述底物是MBP。

47、鉴定调制人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的编程性细胞死亡抑制活性的试剂的方法，包括：

将供试试剂对表达可溶性HAX-1多肽和人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的细胞给药，其中所述可溶性HAX-1多肽导致所述细胞内的编程性细胞死亡；

在有和没有所述供试化合物的存在下，检测所述细胞内的编程性细胞死亡。

48、权利要求47的方法，其中所述检测编程性细胞死亡包括利用DNA染色剂检测染色体缩合。

49、鉴定调制人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的编程性细胞死亡抑制活性的试剂的方法，包括：

将供试试剂对已经引入编码人SRK多肽或其生物学活性多肽片段的基因的细胞或其后代细胞给药；

在发生编程性细胞死亡的条件下培养所述细胞；和

在有和没有所述供试化合物的存在下，检测所述细胞内的编程性细胞死亡。

50、权利要求49的方法，其中所述检测编程性细胞死亡包括利用DNA染色剂检测染色体缩合。

51、分离的抗体，它对人SRK多肽序列是特异性的。

52、权利要求51的分离的抗体，它与选自图2的氨基酸序列结合。

53、权利要求49的分离的抗体，其中所述多肽序列包含AKQNSSKTTSKRRG。

54、具有编程性细胞死亡活性的人胞质HAX-1。

55、权利要求54的人胞质HAX-1，包含图7所示的氨基酸104-279。

56、权利要求54的人胞质HAX-1，包含图7所示的、编码氨基酸104-279的核苷酸序列。

57、权利要求54的人胞质HAX-1，基本上由图7所示的氨基酸104-279组成。

58、权利要求57的人胞质HAX-1，进一步包含与所述HAX-1多肽框内融合的多肽表位。

59、具有编程性细胞死亡活性的人胞质HAX-1，它被一种核酸序列的补体所编码，该序列在严格性强的条件下与图7所示DNA序列杂交，并且与所述DNA序列具有至少95％的序列同一性。

60、分离的核酸，包含编码人胞质HAX-1的核苷酸序列。

61、权利要求60的分离的核酸，其中该核苷酸序列可操纵地连接于表达控制序列上。

62、权利要求1的分离的人SRK，进一步包含具有编程性细胞死亡活性的人胞质HAX-1。

63、权利要求1的分离的人SRK，进一步包含人胞质HAX-1，后者包含图7所示的氨基酸104-279。

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