JPWO2005103257A1

JPWO2005103257A1 - ＲｈｏＡと結合するグアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子

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Publication number: JPWO2005103257A1
Application number: JP2006512564A
Authority: JP
Inventors: 小原　收; 收小原; 長瀬　隆弘; 隆弘長瀬; 道夫大石; 横田　博; 博横田; 上田　修; 修上田
Original assignee: 第一製薬株式会社; 財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所
Priority date: 2004-04-21
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2008-03-13
Also published as: US20080045608A1; EP1757692A4; EP1757692A1; WO2005103257A1

Abstract

低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に結合し、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を示し得る新規な蛋白質をコードする遺伝子、すなわち配列番号１若しくは３に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドの相同物、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に対する抗体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能および／または発現を阻害する化合物の同定方法、疾患の判定方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。

Description

本発明は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に結合し、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を示し得る蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質であるＲｈｏＡに結合する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止方法および／または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。

Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単にＲｈｏファミリー蛋白質と称することがある）は低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単に低分子量Ｇ蛋白質と称する）の１グループに属する蛋白質である。低分子量Ｇ蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器（エフェクター）との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量Ｇ蛋白質は、グアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）またはグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）と特異的に結合し、結合したＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性をもつ。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量Ｇ蛋白質に伝達され、低分子量Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応（以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応と略称する）が起きる。その結果、活性型のＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質が生じる。活性型低分子量Ｇ蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、ＧＴＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質は、その酵素活性により、結合しているＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、それにより不活性化する。このように、低分子量Ｇ蛋白質は、グアニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スイッチとして働く。

Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡ等が知られている。Ｃｄｃ４２は線維芽細胞でフィロポディアの形成を制御している。Ｒａｃ１は、白血球やマクロファージではスーパーオキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングやラメリポディアの形成を制御している。また、Ｃｄｃ４２とＲａｃ１はｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る。このように、Ｒｈｏファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。Ｒｈｏファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。

Ｒｈｏファミリー蛋白質の分子スイッチとしての作用に関与している分子の１つがＲｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（ＲｈｏＧｕａｎｉｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＥｘｃｈａｎｇｅＦａｃｔｏｒ、以下Ｒｈｏ−ＧＥＦと略称する）である。Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進して、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換する機能を有する。この機能により、Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進して、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換することをＧＥＦ活性またはＲｈｏファミリー蛋白質の活性化と称することがある。

Ｒｈｏ−ＧＥＦには、特徴的ドメイン構造、例えばＤｂｌ相同ドメイン（ＤｂｌＨｏｍｏｌｏｇｙＤｏｍａｉｎ、以下ＤＨドメインと略称する）およびプレックストリン相同ドメイン（ＰｌｅｃｋｓｔｒｉｎＨｏｍｏｌｏｇｙＤｏｍａｉｎ、以下ＰＨドメインと略称する）が存在する。ＤＨ／ＰＨのタンデム構造は、Ｒｈｏ−ＧＥＦに典型的なドメイン構造である。以下、ＤＨドメインおよびＰＨドメインのタンデム構造を、ＤＨ／ＰＨドメインと呼称する。

ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦによるＲｈｏファミリー蛋白質の活性化に寄与する重要なドメインであり、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであると考えられている。例えば、Ｒｈｏ−ＧＥＦのプロトタイプであるｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのアミノ酸配列のうち、ＤＨ／ＰＨドメインを含むＣ末端側領域からなる蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化することが報告されている（非特許文献１）。この報告において、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの全長９２５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうちＮ末端側第１番目から第４９７番目のアミノ酸残基の欠失により生じたＣ末端側領域からなる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化し、その結果、細胞形質転換に関与した。このことから、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの活性化は腫瘍原性活性化（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と考えられている。以下、ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＣ末端側領域からなるこのような蛋白質をｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌと呼称する。ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌが、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１と結合すること、並びにＣｄｃ４２およびＲｈｏＡに対してＧＥＦ活性を有する一方、Ｒａｃ１にはＧＥＦ活性を示さないことが報告されている（非特許文献２）。

ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのファミリー蛋白質をコードする遺伝子として、例えばｖａｖ（非特許文献３および４）、ｏｓｔ（非特許文献５）、ｌｂｃ（非特許文献６）等が知られている。これら遺伝子は癌に関与する遺伝子である。その他、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質をコードする遺伝子として、Ｔｒｉｏ（非特許文献７）やｋａｌｉｒｉｎ（非特許文献８）等が報告されている。Ｔｒｉｏは、そのノックアウトマウスにおいて胎仔発生時の骨格筋の異常および脳の構成異常を引き起こす。ｋａｌｉｒｉｎは、神経細胞における神経突起形成に関与する。このように、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質が関与する細胞機能は各蛋白質ごとに固有であり、また、該蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質もそれぞれ異なる。

ビ（Ｂｉ，Ｆ．）ら、「モレキュラーアンドセルラーバイオロジー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．１４６３−１４７４。ハート（Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｊ．）ら、「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年、第２６９巻、ｐ．６２−６５。カツァブ（Ｋａｔｚａｖ，Ｓ．）ら、「エンボジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）」、１９８９年、第８巻、ｐ．２２８３−２２９０。コステロ（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｐ．Ｓ．）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．３０３５−３０４０。ホリイ（Ｈｏｒｉｉ，Ｙ．）ら「エンボジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）」、１９９４年、第１３巻、ｐ．４７７６−４７８６。トクソズ（Ｔｏｋｓｏｚ，Ｄ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９４年、第９巻、ｐ．６２１−６２８。オブリエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｐ．）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．１２０７４−１２０７８。ペンゼス（Ｐｅｎｚｅｓ，Ｐ．）ら、「ジャーナルオブニューロサイエンス（ＪｏｕｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．８４２６−８４３４。

本発明の課題は、新規なＲｈｏ−ＧＥＦおよび該Ｒｈｏ−ＧＥＦをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの製造方法および該Ｒｈｏ−ＧＥＦを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能および／または該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能の異常および／または該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。

本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、Ｒｈｏ−ＧＥＦに特徴的なＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を有する新規遺伝子を見出し、さらに該遺伝子を取得することに成功した。そして、該遺伝子によりコードされる蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡに結合することを実証した。さらに、該遺伝子の組織発現が、扁桃の扁平上皮腫瘍例および気管の腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄｃｙｓｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）例においてそれぞれ正常組織の少なくとも２．５倍以上および少なくとも１．５倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。

すなわち本発明は、配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。

本発明はまた、下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、ＲｈｏＡと結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する：
ｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。

本発明はさらに、下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、ＲｈｏＡに対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する：
ｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。

本発明はさらにまた、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。

本発明はまた、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。

本発明はさらに、前記組換えベクターおよびＲｈｏＡをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。

本発明はさらにまた、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。

本発明はまた、前記いずれかのポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。

本発明はさらに、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記蛋白質の製造方法に関する。

本発明はさらにまた、前記蛋白質を認識する抗体に関する。

本発明はまた、前記蛋白質の機能および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法に関する。

本発明はさらに、蛋白質の機能が、ＲｈｏＡに対するＧＥＦ活性である前記同定方法に関する。

本発明はさらにまた、ヒト扁桃組織由来の被検組織が、ヒト扁桃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。

本発明はまた、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常扁桃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも２．５倍以上である場合に、被検組織がヒト扁桃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。

本発明はさらに、ヒト気管組織由来の被検組織が、ヒト気管腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。

本発明はさらにまた、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常気管由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも１．５倍以上である場合に、被検組織がヒト気管腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。

本発明はまた、前記蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止剤および／または治療剤に関する。

本発明はさらに、前記蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止方法および／または治療方法に関する。

本発明はさらにまた、前記蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。

本発明により、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する新規蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を提供できる。本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡに結合した。本蛋白質は、そのアミノ酸配列中にＲｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインと考えられるＤＨ／ＰＨドメインを有する。このことから、本蛋白質は、Ｒｈｏ蛋白質、例えばＲｈｏＡに結合して、ＧＥＦ活性を示すと考える。

本発明によりまた、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供できる。さらに、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体を提供できる。また、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供できる。さらに、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍疾患、例えば扁桃腫瘍および気管腫瘍の診断方法を提供できる。また、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる腫瘍疾患、例えば扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患、例えば扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止方法および／または治療方法を提供できる。さらに、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供できる。

本発明により、Ｒｈｏファミリー蛋白質、例えばＲｈｏＡが関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が実施できる。さらに、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患、例えば腫瘍疾患、より具体的には扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の診断、防止および／または治療が実施できる。

ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターと、ＲｈｏＡ発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液において、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合を示すバンドが検出されたことを説明する図である（上段パネルのレーン２）。ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターにより、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質として発現される。結合の測定はプルダウン法により行った。一方、ｓｈ０６５３７の部分配列からなるＤＮＡであってＤＨ／ＰＨドメインコード領域を欠失したＤＮＡ（ｓｈ０６５３７−Ｄ）を用いて構築したベクターとＲｈｏＡ発現ベクターとをコトランスフェクションした細胞の細胞溶解液では、このようなバンドは検出さなかった（上段パネルのレーン３）。また、ＲｈｏＡ発現ベクターのみをトランスフェクションした細胞の細胞溶解液では、このようなバンドは検出されなかった（上段パネルのレーン１）。中段パネルは、各細胞溶解液のサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質を検出した図である。下段パネルは、各細胞溶解液のサンプルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＧＳＴ抗体を用いてＧＳＴ融合ＲｈｏＡを検出した図である。各細胞溶解液中の、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質の量はほぼ同量であった（中段パネルのレーン２および３）。また、各細胞溶解液中のＲｈｏＡの量もほぼ同量であった（下段パネルのレーン１−３）。（実施例３）

以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。

本発明において、単離された完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；合成完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；単離されたＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類；あるいは合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡは最小サイズが２ヌクレオチドである。

本発明において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。

（ポリヌクレオチド）
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーから、Ｒｈｏ−ＧＥＦに特徴的なドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定し単離した。

本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであり得る。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、５５４１ｂｐのポリヌクレオチドであり、１５９７アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。配列番号１に記載の塩基配列において第３７０６番目から第４２４５番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１１７８番目のバリン（Ｖａｌ）から第１３５７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）までの１８０アミノ酸残基からなるＤＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第４３４５番目から第４６８０番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１３９１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第１５０２番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）までの１１２アミノ酸残基からなるＰＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第３７０６番目から第４６８０番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１１７８番目のバリン（Ｖａｌ）から第１５０２番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）までの３２５アミノ酸残基からなるＤＨ／ＰＨドメインをコードする。

本発明の範囲には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも包含される。

本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。本発明において「蛋白質間の結合」とは、ある蛋白質（蛋白質Ａ）と別のある蛋白質（蛋白質Ｂ）が複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用などの非共有結合により、蛋白質Ａと蛋白質Ｂが相互作用することを意味する。ここでの結合とは、蛋白質Ａと蛋白質Ｂがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。例えば、蛋白質Ａまたは蛋白質Ｂを構成するアミノ酸中に、蛋白質Ａと蛋白質Ｂの結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。

配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡと結合した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＲｈｏＡをコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡの結合が検出された（実施例３参照）。一方、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＲｈｏＡをコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡの結合は検出されなかった（実施例３参照）。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第１７５番目から第３６９３番目までのヌクレオチドで表わされるポリヌクレオチドである。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが有するＤＨ／ＰＨドメインコード領域を欠失している。すなわち、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を欠失しているポリヌクレオチド（配列番号３）によりコードされる蛋白質はＲｈｏＡに結合しなかった。このことから、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合に、ＤＨ／ＰＨドメインが寄与していることが明らかになった。ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦとＲｈｏファミリー蛋白質との結合、さらにＲｈｏ−ＧＥＦのＧＥＦ活性に重要なドメインであることが知られている。

本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、その構造にＤＨ／ＰＨドメインを有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する。ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦとＲｈｏファミリー蛋白質との結合、さらにＲｈｏ−ＧＥＦのＧＥＦ活性に重要なドメインである。したがって、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合して、該Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を示すと考える。言い換えれば、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合して、該Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化する。

「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性」または「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化」とは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合したグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）をグアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）に交換することによって、Ｒｈｏファミリー蛋白質をＧＤＰが結合した不活性型からＧＴＰが結合した活性型に変換することを意味する。本交換反応は、Ｒｈｏファミリー蛋白質からのＧＤＰの解離反応と、その結果生成したヌクレオチドに結合していないＲｈｏファミリー蛋白質へのＧＴＰの結合反応からなる。具体的には、ＲｈｏＡに対するＧＥＦ活性またはＲｈｏＡの活性化とは、ＲｈｏＡに結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応により、ＲｈｏＡを不活性型から活性型に変換することを意味する。

本明細書において「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性」という用語と「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化」という用語は交換可能に使用される。

本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質として、ＲｈｏＡが好ましく例示できる。本発明においてＲｈｏファミリー蛋白質というときは、好ましくはＲｈｏＡを指す。Ｒｈｏファミリー蛋白質はこれに限定されず、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化される限りにおいていずれのＲｈｏファミリー蛋白質であってもよい。好ましくは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が結合して活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質が挙げられる。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質の結合は、例えばプルダウン法により測定できる（実施例３参照）。また、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によるＲｈｏファミリー蛋白質の活性化は、例えば後述するエフェクタープルダウン法により測定できる。

ＲｈｏＡのアミノ酸配列およびＲｈｏＡ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号９および８に記載する。ＲｈｏＡおよびその遺伝子は、上記各配列で表わされるものに限らず、一般的に知られているＲｈｏＡの機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。ＲｈｏＡは、例えば、その遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により適当な宿主にトランスフェクションして形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより取得できる。

本発明に係るポリヌクレオチドの取得は、本発明により開示されたその具体例、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドについての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に実施できる。

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脾臓由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒト脾臓由来の市販されているｐｏｌｙＡ^＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法は特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンの選択を実施できる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。

ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。蛋白質発現系は、自体公知の発現系がいずれも利用できる。例えば、無細胞蛋白質発現系により簡便に発現蛋白質を確認できる（マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４）。

本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能、または本発明に係る蛋白質の機能として、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す機能が例示される。言い換えれば、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質と結合してＲｈｏファミリー蛋白質を活性化する機能が例示される。

本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびサイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４）。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５−６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。

ポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ）ら、「プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンシズオブザユナイテッドステーツオブアメリカ（ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（マキサム（ＭａｘａｍＡ．Ｍ．）ら、「メソッズインエンザイモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。

本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつ好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、ＤＨ／ＰＨドメインがその機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す機能を保持していることがさらに好ましい。

本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において１個以上、例えば１乃至１００個、好ましくは１乃至３０個、より好ましくは１乃至２０個、さらに好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドが、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。さらに好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。このような変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであることができ、誘発変異を有するポリヌクレオチドであることができる。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を、単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施することもできる。

本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドであることが望ましい。より好ましくは、コードする蛋白質が好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質であることが望ましい。

本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。具体的には、配列番号５または６に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。これらオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として使用できる。これらオリゴヌクレオチドは、本ポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを製造できる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくはヒト由来のポリヌクレオチドである。しかし、本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域における配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。

本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれによりコードされる蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであることができる。本ポリヌクレオチドに付加し得る遺伝子として、具体的にはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、あるいはＨｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が例示できる。これら遺伝子から選択した１種類または複数種類の遺伝子を組合せて付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするために有用である。

（ベクター）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより取得できる。

ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡであることができる。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡが挙げられる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。

ベクターＤＮＡは、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれを用いることもできる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。

ベクターＤＮＡには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。

ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。

（形質転換体）
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡの１種類または複数種類をさらに導入することができる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡとして、例えば、ＲｈｏＡ等のＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターＤＮＡが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、言い換えればＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を阻害または促進する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換体として好ましくは、本ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとＲｈｏＡをコードする遺伝子を含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。

宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、２９３ＥＢＮＡ細胞を用いる。

組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、自体公知の手段を応用して実施できる。例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が例示できる。

原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターとして、大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用できる。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用できる。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用される。

哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が利用される。最も好ましくは、リポフェクション法が利用される。

酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用される。

昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が利用される。

（蛋白質）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。

本発明に係る蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を例示できる。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質において、その第１１７８番目バリン（Ｖａｌ）から第１３５７番目アスパラギン（Ａｓｎ）までのアミノ酸残基がＤＨドメインを構成する。第１３９１番目ロイシン（Ｌｅｕ）から第１５０２番目グルタミン酸（Ｇｌｕ）までのアミノ酸残基がＰＨドメインを構成する。第１１７８番目バリン（Ｖａｌ）から第１５０２番目グルタミン酸（Ｇｌｕ）までのアミノ酸残基がＤＨ／ＰＨドメインを構成する。

本発明に係る蛋白質は、好ましくは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質である。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡに結合した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＲｈｏＡをコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡの結合が検出された（実施例３参照）。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードする。したがって、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が、ＲｈｏＡと結合したと考える。一方、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＲｈｏＡをコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡの結合は検出されなかった（実施例３参照）。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第１７５番目から第３６９３番目までのヌクレオチドで表わされるポリヌクレオチドである。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードする。配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１１７４番目から第１５９７番目までのアミノ酸残基で表わされる領域を欠失している。該領域には、ＤＨ／ＰＨドメインが含まれる。すなわち、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質はＤＨ／ＰＨドメインを欠失している。ＤＨ／ＰＨドメインを欠失している配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質がＲｈｏＡに結合しないことから、ＤＨ／ＰＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合に寄与していることが明らかになった。

本発明に係る蛋白質は、その構造にＤＨ／ＰＨドメインを有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する。ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦとＲｈｏファミリー蛋白質との結合、さらにＲｈｏ−ＧＥＦのＧＥＦ活性に重要なドメインである。したがって、本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合して、該Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を示すと考える。より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡに結合してＧＥＦ活性を示すと考える。言い換えれば、本蛋白質は、ＲｈｏＡに結合してこれを活性化すると考える。

本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合する蛋白質が包含される。より好ましくは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質を包含する。このような蛋白質として、例えば、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドおよび配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドより選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。また、例えば、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質と結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。

本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質が例示できる。より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質が例示できる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインを有するポリペプチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、ＤＨ／ＰＨドメインがその機能を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１乃至１００個、好ましくは１乃至３０個、より好ましくは１乃至２０個、さらに好ましくは１乃至１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質が例示できる。より好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質である限り特に制限されない。さらに好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質である。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであることができ、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。

本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質が包含される。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような蛋白質は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、特に好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で表わされる。

本発明に係る蛋白質は、好ましくはヒト由来の蛋白質である。しかし、本蛋白質と配列相同性を有し、かつ好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質と結合する蛋白質、より好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質に結合してＧＥＦ活性を示す蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。また、好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質が望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインにおける配列相同性は少なくとも７０％であることが好ましい。より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上であることが適当である。

本発明に係る蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であることができ、あるいはこれらからさらに精製されたものであることができる。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであることができる。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であることができる。

本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変ができる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化できる。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。標識化に用いる物質（標識物質）として、例えばＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化もできる。標識物質は、１種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質の検出または精製を容易に実施でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が実施できる。

（蛋白質の製造方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）により取得できる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該ｃＤＮＡライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。

具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、形質転換体の作製に用いた宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。

本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。本蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、精製および／または分離することができる。

本発明に係る蛋白質の精製および／または分離は、本蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、具体的には、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を例示できる。また、これら方法は適宜組合せて実施できる。好ましくは、本蛋白質に対する特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが用いられる。本蛋白質に対する特異抗体は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、自体公知の抗体作成法により取得できる。精製および／または分離を行なうとき、本蛋白質を得るための指標として、本蛋白質の機能を利用できる。

本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成法として、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年；および「ペプチドシンテシス（ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、固相合成方法や液相合成方法等が知られているが、いずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製できる。

本発明に係る蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質は、本蛋白質を適当なペプチダーゼにより切断することによっても取得できる。

（抗体）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原は、本蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はない。このようなアミノ酸配列として、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位のアミノ酸配列が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質は結合しないか、弱く結合することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。

抗体の生産は、自体公知の抗体作製法により実施できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体を取得できる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントとして、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。

ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収法として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。

モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から採取した抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）と、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）とを融合させて作製したハイブリドーマを用いて生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成し、次いでクローン化する。クローン化した数々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。

本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。

（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現をを阻害または促進する化合物の同定方法に関する。本ポリヌクレオチドは扁桃扁平上皮腫瘍等の扁桃腫瘍や気管の腺様嚢胞癌等の気管腫瘍において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および／または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法が挙げられる。

本発明に係る同定方法は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか１種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。

本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定し得る実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物（被検化合物）の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を促進すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等が例示できるが、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であればいずれも利用できる。

本発明に係る蛋白質の機能として、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性が好ましく挙げられる。また、本発明者らは、本蛋白質がＲｈｏ−ＧＥＦ活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインを有し、かつ該ドメインをＲｈｏファミリー蛋白質への結合に必須とすることから、本蛋白質の機能を阻害する化合物は、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対する本蛋白質の結合を指標として同定することができると考えている。

本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下におけるＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＲｈｏファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。グルタチオンセファロースに結合させたＲｈｏファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物が同定できる。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等の標識物質で標識した抗体であることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグペプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量を実施できる。

本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を指標にした同定方法は、より具体的には、本蛋白質をコードするポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系を用いて実施できる。（実施例３参照）。

本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を指標にした同定方法はまた、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、Ｒｈｏファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物を同定できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。

本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を指標にした同定方法はまた、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施できる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎｐｒｏｘｉｍｉｔｙａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、本同定方法を実施できる。

本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質と本蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質とを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を、被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被検化合物の非存在下と比較して被検化合物の存在下において減少する場合、該化合物は、本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害すると判定できる。逆に、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量が被検化合物の非存在下と比較して被検化合物の存在下において増加する場合、該化合物は、本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を増強すると判定できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の測定は、該蛋白質に対する抗体等を用いて実施できる。例えば、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の測定は、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子を用いて、エフェクタープルダウン法により実施できる。

より具体的には、本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、本蛋白質により活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質を定量する。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の定量は、該蛋白質との結合部位を含むエフェクター分子断片にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質を利用してエフェクタープルダウン法により実施できる。具体的には、まず、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質とエフェクター分子断片にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質とを反応させる。その後、エフェクター分子断片を抗ＧＳＴ−ｔａｇ抗体で回収する。次いで、回収されたエフェクター分子断片に結合した活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を測定する。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量は、電気泳動法およびウエスタンブロット法により測定できる。Ｒｈｏファミリー蛋白質の種類によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。したがって、用いるＲｈｏファミリー蛋白質の種類により適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたＲｈｏＡが結合するエフェクターとしてローテキン（Ｒｈｏｔｅｋｉｎ）が知られている。したがって、ＲｈｏＡの活性化を阻害または増強する化合物を同定する場合は、エフェクター分子としてＲｈｏｔｅｋｉｎを用いることが推奨される。

本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を指標にした同定方法はまた、本蛋白質、本蛋白質により活性化されるＲｈｏファミリー蛋白質であって放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質およびＧＴＰを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質の量の減少により定量され得る。このような方法は、公知文献（「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９６年、第２７１巻、第４４号、ｐ．２７３７４−２７３８１）記載の方法等を参照して実施できる。

「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を阻害する」とは、ＧＤＰが結合した不活性型のＲｈｏファミリー蛋白質からＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質への変換を阻害することを意味する。より具体的には、ＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質の量を低減させるまたは消失させることを意味する。「Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を促進する」とは、ＧＤＰが結合した不活性型のＲｈｏファミリー蛋白質からＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質への変換を促進することを意味する。より具体的には、ＧＴＰが結合した活性型のＲｈｏファミリー蛋白質の量を増加させることを意味する。

本発明に係る同定方法において用いるＲｈｏファミリー蛋白質は、本発明に係る蛋白質による活性化に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよく、あるいは上記のような標識物質が付加された蛋白質であってよい。標識物質として、上記標識物質が例示できる。

本発明に係るポリヌクレオチドの発現を指標にした化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定し得る実験系において、本ポリヌクレオチドと被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が増加する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を促進すると判定できる。

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を指標にした化合物の同定方法は、例えば、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施できる。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定を実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光物質等が使用できる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。

本発明に係るポリヌクレオチドの発現を指標にした化合物の同定方法はまた、例えば本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。

（化合物）
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤、本発明に係る蛋白質の機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。該化合物は、例えば、Ｒｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性、言い換えればＲｈｏファミリー蛋白質の活性化の阻害剤の候補化合物として利用できる。本同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現促進剤、または本発明に係る蛋白質の機能の促進剤の候補化合物として利用できる。本ポリヌクレオチドは扁桃扁平上皮腫瘍等の扁桃腫瘍や気管の腺様嚢胞癌等の気管腫瘍において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および／または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法により得られる化合物として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物が挙げられる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製できる。このような医薬は、本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止および／または治療に有効である。本発明に係る化合物には、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物、あるいは本蛋白質の機能を促進するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物も含まれる。

（医薬組成物）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗すること、あるいは本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を促進することに基づく医薬または医薬組成物に関する。

本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、１種類または２種類以上の医薬用に許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。

本発明に係る医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１乃至７０重量％、好ましくは０．０００１乃至５重量％程度の範囲とするのが適当である。

医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。

例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。

所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。

安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。

界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。

緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。

等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。

等張化剤として、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。

キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。

本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。

本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用できる。

本発明に係る蛋白質の機能および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬用担体とともに対象に投与することにより、異常な症状を防止、改善または治療するといった効果が得られる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現をブロックする方法を用いて阻害することにより同様の効果が得られる。本ポリヌクレオチドの発現の阻害は、例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることにより実施できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるオリゴヌクレオチオドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。

本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患として、腫瘍疾患、好ましくは扁桃腫瘍や気管腫瘍が例示できる。本ポリヌクレオチドである配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、扁桃腫瘍の１つである扁桃扁平上皮腫瘍で正常扁桃組織と比較して２．７７倍高いことが判明した。また、該ポリヌクレオチドの発現は、気管の腺様嚢胞癌（ａｄｅｎｏｉｄｃｙｓｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）で正常気管組織と比較して１．６５倍高いことが判明した。上記のように、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏ蛋白質に結合することから、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用すると考えられる。Ｒｈｏ−ＧＥＦとして単離された遺伝子には、癌に関与する次のような遺伝子が知られている：ｖａｖ（非特許文献３および４）；ｏｓｔ（非特許文献５）；およびｉｂｃ（非特許文献６）。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は腫瘍疾患、例えば、扁桃腫瘍や気管腫瘍に関連すると考える。本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これら疾患を防止および／または治療できると考える。発明に係る医薬および医薬組成物は、腫瘍疾患、例えば扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の、防止剤および／または治療剤として有用である。さらに、腫瘍疾患、例えば扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の、防止方法および／または治療方法に使用できる。

本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。

本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときは、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。

投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。腫瘍疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することもできる。

投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。

（診断方法）
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。

本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種組織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出できる。本ポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および／または機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。

疾患の診断は、例えば調べようとする試料（被検試料）について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化およびその量的変化を検出できる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出できる。また、被検試料から増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。

本発明には、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法も包含される。

配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、疾患データベース情報ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、扁桃腫瘍の１つである扁桃扁平上皮腫瘍で正常扁桃組織と比較して２．７７倍高いことが判明した。また、該ポリヌクレオチドの発現は、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ社）を用いて調べたところ、気管の腺様嚢胞癌で正常気管組織と比較して１．６５倍高いことが判明した。上述したように、該ポリヌクレオチドの高発現は腫瘍疾患、例えば、扁桃腫瘍または気管腫瘍に関連すると考えられる。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が腫瘍疾患、例えば、扁桃腫瘍または気管腫瘍由来の被検試料であるか否かを判定する方法を実施できる。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト扁桃組織由来またはヒト気管組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常扁桃由来組織またはヒト正常気管由来組織が挙げられる。ヒト扁桃組織由来の試料において、本ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも２．５倍以上、より好ましくは少なくとも３倍以上に増加している場合、被検試料がヒト扁桃腫瘍由来試料であると判定できる。また、ヒト気管組織由来の試料において、本ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも１．５倍以上、より好ましくは少なくとも２倍以上に増加している場合、被検試料がヒト気管腫瘍由来試料であると判定できる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。

被検試料は、ヒト扁桃組織由来またはヒト気管組織由来の被検組織に制限されず、生体由来のあらゆる組織や細胞を使用できる。具体的には、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体由来の試料を例示できる。所望により被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれであることもできる。核酸は、ＰＣＲまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする各種方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が例示できる。また、ｉｎｓｉｔｕＲＴ−ＰＣＲやｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの遺伝子検出方法も使できる。このような遺伝子検出法においては、本ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に５乃至５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０乃至３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５乃至３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号５または６に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することができる。プローブおよびリガンドを標識する方法は、様々な方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等が例示できる。適当な標識として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる

遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えばＲＴ−ＰＣＲが例示できる。その他、当該分野で用いられる様々なＰＣＲの変法が適用できる。

ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も実施できる。このような分析方法として、ＭＳＳＡ法等の競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。

本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および／または機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。

蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化が検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、本蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。

本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表わされる蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いることにより実施できる。

蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質を検出できる。さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いることにより、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無が検出できる。

本発明には、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法が包含される。

具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、本蛋白質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィン切片または凍結組織切片中の本蛋白質を検出できる。

本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が例示できる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等が利用できる。

本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも１種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。該試薬はその他、本蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。

本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が例示できる。標識物質は、予め本蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。

（遺伝子のクローニング）
ヒト脾臓由来ｃＤＮＡライブラリーは、小原らの方法（オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエーリサーチ（ＤＮＡＲｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９）に従って構築した。具体的には、ＮｏｔＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（ＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ（Ｔ）１５）（配列番号１２：ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）をプライマーとして用い、ヒト脾臓ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：カタログ番号６５４２−１）をテンプレートにしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳａｌＩ部位を有するアダプター（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）をｃＤＮＡとライゲーションした後、ＮｏｔＩ消化し、１％濃度の低融点アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のＤＮＡ断片を精製した。精製ｃＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限酵素処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋プラスミドとライゲーションした。エレクトロポーレーション法により、大腸菌ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘＤＨ１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に組換えプラスミドを導入した。構築したｃＤＮＡライブラリーから、約１０，０００個の組換え体を選択し、これらクローンの両末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約４２０個のクローンを選択し、そのｃＤＮＡについて全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、株式会社島津製作所製のＤＮＡシーケンサー（ＲＩＳＡ）とＰＥアプライドバイオシステム社製の反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法（ターミネーター標識法）を用いて決定した。

全塩基配列が決定されたｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によりＯＲＦを予想した。次いで、ＯＲＦ領域についてモチーフドメイン検索を行い、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡを同定した。

その結果、新規な塩基配列を有し、ＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡ（以下、ｓｈ０６５３７と称する）が同定された。

シーケンス解析の結果、ｓｈ０６５３７は、配列番号１に示す塩基配列（５５４１ｂｐ）からなり、配列番号２に示すアミノ酸配列（１５９７アミノ酸）をコードすることが判明した。ｓｈ０６５３７において、ＤＨドメインは、配列番号１に示す塩基配列の第３７０６番目から第４２４５番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。ＰＨドメインは、配列番号１に示す塩基配列の第４３４５番目から第４６８０番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。また、ｓｈ０６５３７によりコードされる蛋白質において、ＤＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１１７８番目のバリン（Ｖａｌ）から第１３５７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）までの１８０アミノ酸残基からなる。ＰＨドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１３９１番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第１５０２番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）までの１１２アミノ酸残基からなる。

（ＤＮＡの発現と精製）
実施例１で得られたｓｈ０６５３７の発現ベクターを、ゲートウェイ^ＴＭクローニングテクノロジー（ＧＡＴＥＷＡＹ^ＴＭＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。次いで、該発現ベクターを用いて、ｓｈ０６５３７によりコードされる蛋白質をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で発現させた。また、ｓｈ０６５３７の、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を欠失した部分塩基配列からなるＤＮＡ（以下、ｓｈ０６５３７−Ｄと称する）を含む発現ベクターを同様に作製した。そして、該発現ベクターを用いて、ｓｈ０６５３７によりコードされる蛋白質のＤＨ／ＰＨドメインを欠失した部分アミノ酸配列からなる蛋白質を、同様にＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞で発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。

具体的には、実施例１で得られたｓｈ０６５３７（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入されている）をテンプレートとし、ｐｆｕｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｓｈ０６５３７のＯＲＦ領域（終止コドンを除く）を増幅した。増幅用プライマーには、配列番号５および６に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた。その後、増幅産物をＴＯＰＯｃｌｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍを用いた反応にて、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断した遺伝子断片および実施例１で得られたｓｈ０６５３７をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳｃａＩで切断した遺伝子断片をライゲーションした後、コンピテントセル（ＴＯＰ１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。形質転換した大腸菌より精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡ（以下、ｓｈ０６５３７−Ｆと称する）を精製した。増幅した領域の配列および制限酵素処理を行なった塩基配列前後の配列が正しい配列であることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７を用いて、それぞれ実施した。次に、ｓｈ０６５３７−ＦとＢｓｐＥＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターとを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、ｓｈ０６５３７−Ｆ発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質は、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質として発現される。

次に、ｓｈ０６５３７−Ｄ発現ベクターを、ゲートウェイ^ＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて構築した。具体的には、まず、実施例１で得られたｓｈ０６５３７（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋のＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入されている）をテンプレートとし、ｓｈ０６５３７のＤＨ／ＰＨコード領域を欠失した部分配列（配列番号１の第１７５番目から第３６９３番目までのヌクレオチド：配列番号３）を増幅した。増幅は、プライマーとして配列番号５および７に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用い、ｐｆｕｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により行なった。その後、増幅産物をＴＯＰＯｃｌｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍを用いた反応にて、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターをＮａｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＰｍａＣＩで切断した遺伝子断片および実施例１で得られたｓｈ０６５３７をＮａｅＩ／ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断した遺伝子断片をライゲーションした後、コンピテントセル（ＴＯＰ１０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。形質転換した大腸菌より精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを精製した。増幅した領域の配列および制限酵素処理を行なった塩基配列前後の配列が正しい配列であることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、泳動および解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７を用いて、それぞれ実施した。次に、精製したＤＮＡとＢｓｐＥＩで切断したＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターとを用いて、ＬＲクロナーゼ酵素による組換え反応により、ｓｈ０６５３７−Ｄ発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、ｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質は、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）が付加された蛋白質として発現される。

ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターおよびｓｈ０６５３７−Ｄ発現ベクターは、それぞれ２９３ＥＢＮＡ細胞にリポフェクション法によりトランスフェクションした。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日に２４ウエルプレートに細胞数６×１０^４／ｗｅｌｌで播種し、培養培地（ＩＭＤＭ培地、ＳＩＧＭＡ社製；１０％牛胎仔血清；４ｍＭグルタミン；および１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン）中で培養した。翌日、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた手法で遺伝子導入を実施した。具体的には、まず、各発現ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ社製）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００を添加したＤＭＥＭとを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して３７℃にて５％ＣＯ_２存在下で培養した２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ_２存在下でさらに培養を行なった。遺伝子導入２日後、培地を除去してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣｌ；１ｍＭＣａＣｌ_２；および１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。

各細胞溶解液は、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、１００℃で５分間加熱処理して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、泳動ゲルをブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した後、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔにブロックエース（大日本製薬株式会社製）を３：１の割合で混合した溶液（ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡ）に４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて１０分以上振とうしながら１回洗浄した。上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーは、トリスＳＤＳβＭＥサンプル処理液（第一化学薬品社製）を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いた泳動バッファーは次の組成からなる：１００ｍＭＴｒｉｓ；１９２ｍＭグリシン；０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３（ＢｉｏＲａｄ社製）。上記ブロッティングバッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭＴｒｉｓ；４０ｍＭ ε−アミノ−ｎ−カプロン酸；２０％メタノール；および０．０５％ＳＤＳ。ＴＢＳ−Ｔは、次の組成からなる：１５０ｍＭＮａＣｌ；１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０。

ＰＶＤＦ膜に、抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈して添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置（ＬｕｍｉｎｏＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。

ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターをトランスフェクションした細胞から調製した細胞溶解液において、１８０ＫＤａ近辺に主要バンドが検出された。また、ｓｈ０６５３７−Ｄ発現ベクターをトランスフェクションした細胞から調製した細胞溶解液において、１３０ＫＤａ近辺に主要バンドが検出された。ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターによりＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現される蛋白質の予想分子量は、約１８０ＫＤａである。また、ｓｈ０６５３７−Ｄ発現ベクターによりＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現される蛋白質の予想分子量は、約１８０ＫＤａである。一方、各発現ベクターを導入せずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００のみを添加した細胞から調製した細胞溶解液ではこのようなバンドは認められなかった。このことから、検出された主要バンドは、それぞれｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質およびｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質であると考えられる。かくして、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質およびｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質を取得できた。

（ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出）
ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を、実施例２で構築したｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターを用いて、プルダウン法により検討した。また、実施例２で構築したＤＨ／ＰＨドメインコード領域を欠失した部分塩基配列からなるＤＮＡ（ｓｈ０６５３７−Ｄと称する）を含む発現ベクターを用いて、ｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を同様に検討した。

Ｒｈｏファミリー蛋白質として、ＲｈｏＡを用いた。ＲｈｏＡをＮ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるための発現ベクターは、ゲートウェイ^ＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。具体的には、まず、ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅｃＤＮＡＰａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のスプリーンファーストストランドＤＮＡ（ｓｐｌｅｅｎｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄＤＮＡ）をテンプレートとして、ｐｆｕｔｕｒｂｏを用いてＲｈｏＡ遺伝子を増幅した。増幅産物を、ＴＯＰＯｃｌｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍを用いた反応にてｐＥＮＴＲ／Ｄに挿入してエントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、配列番号１０および１１に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、Ｎ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質発現ベクターであるｐＤＥＳＴ２７を用いてＬＲクロナーゼによる組換え反応よりＧＳＴ融合Ｒｈｏ発現プラスミドを作製した。各遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスを行って確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃＥＴＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、泳動および解析はＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７を用いて行なった。

ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出のために、まず、ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターとＲｈｏＡ遺伝子発現ベクターとを２９３ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクションした。具体的には、両ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００を添加した無血清のＤＭＥＭを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日に細胞数６．０×１０^４／ｗｅｌｌを２４ウエルプレートへ播種し、３７℃にて５％ＣＯ_２存在下で一晩培養した後に本実施例で用いた。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ_２存在下で２日間インキュベーションした。培養終了後、ＰＢＳにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（組成は実施例２を参照）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。また、ｓｈ０６５３７−Ｆ発現ベクターの代わりにｓｈ０６５３７−Ｄ発現ベクターを用いてＲｈｏＡ遺伝子発現ベクターとともに、上記方法により２９３ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクションした。得られた細胞から、実施例２に記載の方法により細胞溶解液を調製した。陰性コントロールとして、ＲｈｏＡ遺伝子発現ベクターのみを遺伝子導入した細胞の細胞溶解液を用いた。

各細胞溶解液について、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合をプルダウン法により検出した。各細胞溶解液３００μＬ、溶解バッファーにけん濁した２０μＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）および溶解バッファー１００μＬを混合した。各サンプルは、ＭｇＣｌ_２およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）がそれぞれ最終濃度１ｍＭとなるように調製した。回転盤にて回転させながら４℃で１時間反応させた後に、１ｍＬの冷却した溶解バッファー（ＭｇＣｌ_２の最終濃度１ｍＭ）を用いて遠心処理（１，０００ｒｐｍで４℃にて１５秒間）により３回洗浄した。洗浄後に上清を除去したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂに、溶解バッファーと等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを混合した溶液を４０μＬ添加してミキサーにて撹拌後、１００℃にて５分間加熱処理して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した泳動ゲルから、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡに４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄した（１０分以上の振とうを１回）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー、ブロッティングバッファー、ＴＢＳ−ＴおよびＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡはいずれも、実施例２で使用した各バッファーと同一組成のバッファーを用いた。

抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈してＰＶＤＦ膜に添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き２０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置（ＬｕｍｉｎｏＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。

結果を図１に示す。ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとを共発現させた細胞から調製した細胞溶解液を用いたときは、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合を示すバンドが検出された（図１の上段パネルのレーン２）。一方、ｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとを共発現させた細胞から調製した細胞溶解液を用いたときは、ｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合を示すバンドは検出されなかった（図１の上段パネルのレーン３）。また、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質の各細胞における発現が確認された（図１の中段パネル）。各細胞溶解液に含まれるｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質の量は、ほぼ同量であった（図１の中段パネル）。また、各細胞溶解液に含まれるＲｈｏＡの量も、ほぼ同量であった（図１の下段パネル）。

ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質またはｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質と、ＲｈｏＡとが結合するのであれば、抗ＦＬＡＧ抗体にて検出した場合に、それぞれの蛋白質に対応する位置にバンドが検出される。上記結果から、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質がＲｈｏＡに結合することが明らかになった。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域が欠失しているｓｈ０６５３７−Ｄによりコードされる蛋白質はＲｈｏＡに結合しなかった。このことから、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質とＲｈｏＡとの結合は、該蛋白質のＤＨ／ＰＨドメインに依存することが判明した。ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦによるＲｈｏファミリー蛋白質の活性化に寄与する重要なドメインであり、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであると考えられている。したがって、ｓｈ０６５３７−Ｆによりコードされる蛋白質は、ＲｈｏＡ等のＲｈｏファミリー蛋白質に結合し、ＧＥＦ活性を示すと考える。

本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はＲｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡに結合した。本蛋白質がＤＨ／ＰＨドメインを介してＲｈｏファミリー蛋白質に結合すること、Ｒｈｏ−ＧＥＦは通常、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合しＤＨ／ＰＨドメインによってＲｈｏファミリー蛋白質を活性化することから、本蛋白質はＲｈｏファミリー蛋白質に対してＧＥＦ活性を有すると考える。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば腫瘍疾患、より具体的には扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の診断、防止および／または治療が実施できる。したがって、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。

配列番号１：グアニンヌクレオチド交換因子としての機能を有する蛋白質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１：（３７０６）：（４２４５）Ｄｂｌ相同ドメインをコードする領域。
配列番号１：（４３４５）：（４６８０）プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号３：配列番号１の第１７５番目から第３６９３番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含まない配列からなるポリヌクレオチド。
配列番号３：配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：ＲｈｏＡをコードするポリヌクレオチド。
配列番号９：ＲｈｏＡ。
配列番号１０：プライマー用に配列番号８の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用に配列番号８の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims

配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、ＲｈｏＡと結合する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、ＲｈｏＡに対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド：
ｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
請求項４に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
請求項４に記載の組換えベクターおよびＲｈｏＡをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる請求項５に記載の形質転換体。
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
請求項２または３に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
請求項５または６に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項７または８に記載の蛋白質の製造方法。
請求項７または８に記載の蛋白質を認識する抗体。
請求項７または８に記載の蛋白質の機能および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
蛋白質の機能が、ＲｈｏＡに対するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）活性である請求項１１に記載の同定方法。
ヒト扁桃組織由来の被検組織が、ヒト扁桃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常扁桃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも２．５倍以上である場合に、被検組織がヒト扁桃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１３に記載の判定方法。
ヒト気管組織由来の被検組織が、ヒト気管腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
被検組織における請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常気管由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも１．５倍以上である場合に、被検組織がヒト気管腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１５に記載の判定方法。
請求項７または８に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止剤および／または治療剤。
請求項７または８に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および／または請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする扁桃腫瘍および／または気管腫瘍の防止方法および／または治療方法。
請求項７または８に記載の蛋白質、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載の組換えベクター、請求項５または６に記載の形質転換体および請求項１０に記載の抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。