JP2009089601A - 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 - Google Patents
細胞機能調節物質のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009089601A JP2009089601A JP2006015477A JP2006015477A JP2009089601A JP 2009089601 A JP2009089601 A JP 2009089601A JP 2006015477 A JP2006015477 A JP 2006015477A JP 2006015477 A JP2006015477 A JP 2006015477A JP 2009089601 A JP2009089601 A JP 2009089601A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- acid sequence
- rock2
- neurotonin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 238000012216 screening Methods 0.000 title abstract description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000003915 cell function Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 90
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 66
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 63
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 101150013910 Rock2 gene Proteins 0.000 claims description 74
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 claims description 40
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 33
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 208000000209 Isaacs syndrome Diseases 0.000 description 11
- 206010072359 Neuromyotonia Diseases 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 201000004403 episodic ataxia Diseases 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 5
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 4
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 4
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000011068 Cdc42 Human genes 0.000 description 2
- 108050001278 Cdc42 Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 2
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010021067 Hypopituitarism Diseases 0.000 description 2
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101150058540 RAC1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100022122 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 description 2
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 description 2
- 102100039314 Rho-associated protein kinase 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710088493 Rho-associated protein kinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 2
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102000003734 Voltage-Gated Potassium Channels Human genes 0.000 description 2
- 108090000013 Voltage-Gated Potassium Channels Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 208000037922 refractory disease Diseases 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N Aldosterone Chemical compound C([C@@]1([C@@H](C(=O)CO)CC[C@H]1[C@@H]1CC2)C=O)[C@H](O)[C@@H]1[C@]1(C)C2=CC(=O)CC1 PQSUYGKTWSAVDQ-ZVIOFETBSA-N 0.000 description 1
- PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N Aldosterone Natural products C1CC2C3CCC(C(=O)CO)C3(C=O)CC(O)C2C2(C)C1=CC(=O)CC2 PQSUYGKTWSAVDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000103 Anorexia Nervosa Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000027496 Behcet disease Diseases 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- 208000033054 Cushing disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010017577 Gait disturbance Diseases 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001011021 Gallus gallus Gallinacin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000007465 Giant cell arteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010020850 Hyperthyroidism Diseases 0.000 description 1
- 208000028482 Hypothalamic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025282 Hypothalamo-pituitary disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017924 Klinefelter Syndrome Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229920002884 Laureth 4 Polymers 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 description 1
- 208000026072 Motor neurone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- 208000029578 Muscle disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000013625 Nelson syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 101150054854 POU1F1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 208000010067 Pituitary ACTH Hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 208000020627 Pituitary-dependent Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002701 Polyoxyl 40 Stearate Polymers 0.000 description 1
- 206010036297 Postpartum hypopituitarism Diseases 0.000 description 1
- 208000009144 Pure autonomic failure Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010040021 Sensory abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 201000009895 Sheehan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001800 Shellac Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000010112 Spinocerebellar Degenerations Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- -1 acidulants Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000006590 anterior pituitary dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000013869 carnauba wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000004203 carnauba wax Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229960002242 chlorocresol Drugs 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003210 demyelinating effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000008606 intracellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229940067107 phenylethyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 208000019629 polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940099429 polyoxyl 40 stearate Drugs 0.000 description 1
- 208000000813 polyradiculoneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 235000013874 shellac Nutrition 0.000 description 1
- 239000004208 shellac Substances 0.000 description 1
- ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N shellac Chemical compound OCCCCCC(O)C(O)CCCCCCCC(O)=O.C1C23[C@H](C(O)=O)CCC2[C@](C)(CO)[C@@H]1C(C(O)=O)=C[C@@H]3O ZLGIYFNHBLSMPS-ATJNOEHPSA-N 0.000 description 1
- 229940113147 shellac Drugs 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 101150056399 slc20a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000035900 sweating Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 206010043207 temporal arteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000006211 transdermal dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
- A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
Abstract
【課題】細胞機能調節物質のスクリーニング方法及びアクチン細胞骨格の形成調節剤の提供。
【解決手段】以下の(a)又は(b)のタンパク質。(a) 特定の配列に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、(b) 特定の配列に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質。また、ニューロトニンまたはそのＣ末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質のスクリーニング方法、およびアクチン細胞骨格の形成調節剤。
【選択図】なし
【解決手段】以下の(a)又は(b)のタンパク質。(a) 特定の配列に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、(b) 特定の配列に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質。また、ニューロトニンまたはそのＣ末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質のスクリーニング方法、およびアクチン細胞骨格の形成調節剤。
【選択図】なし
Description
本発明は、細胞機能調節物質のスクリーニング方法に関する。
末梢神経障害は、運動神経筋接合部終末において神経の興奮伝達の欠陥に由来する疾患であり、筋疾患をも伴うことが多い。このため、末梢神経障害においては感覚異常、運動障害、自律神経障害など種々の病態が現われることが知られている。末梢神経障害の病因は多様であり、詳細は不明な場合が多いが、末梢神経のVGKC(Voltage gated potassium channel)異常、神経末端からの持続的なアセチルコリンの放出を伴う神経・筋疾患として、Isaacs症候群が知られている。この疾患は持続性筋線維活動症候群ともいわれており、その臨床的特徴として、四肢の筋硬直、有痛性筋痙攣、筋収縮後の弛緩困難（例えば手指の開排制限等）、歩行障害、発汗過多などの症状が観察されている。Isaacs症候群の発症機序は不明であるが、胸腺腫との合併の存在、血中に免疫複合体を有する症例が見られることから、一つには自己免疫疾患機序が関与していることが想定されている。
このようなIsaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治療方法として、血漿交換による方法、ビタミンB12投与などが挙げられるが、これらの治療法は対処的な治療法に留まるものであり、現在では根本的に治療し得る選択的かつ有効な方法がないのが実情である。本格的な高齢化社会の到来を間近に控えて、上記末梢神経障害に加えて、糖尿病の合併症である末梢性多発性神経炎、筋の全般的な有痛性痺れなどにも有効な治療法の開発が待たれている。
本発明者は、Isaacs症候群患者から単離されたcDNAが、ある特定のタンパク質をコードして、そのタンパク質が患者の血中に増加している事実を捉えた。そしてさらに鋭意研究を進めた結果、上記cDNAおよびそれによりコードされるタンパク質は、Isaacs症候群の病態に関わる因子と示唆された。この同定された分子をニューロトニンと呼び、cDNAの塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列情報（ヒト由来）を決定した（特許文献１）。
ニューロトニンは、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり（特許文献１）、上記患者の血液に見出される抗体と結合する活性を有し、さらに末梢神経細胞に存在する「14-3-3」と呼ばれるタンパク質と結合することができる。
しかし、14-3-3タンパク質以外のタンパク質については、どのような物質がニューロトニンに結合するのかは明らかでなく、機能も不明である。
国際公開WO02/064787号パンフレット
本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片及びその製造方法、前記断片に結合する物質をスクリーニングする方法、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法、及びアクチン細胞骨格の形成調節剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ニューロトニンに結合する物質はRock2タンパク質であることを見出し、また、ニューロトニンのRock2への結合領域はそのアミノ酸配列のC末端側領域であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（２）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（３）以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNA
（４）（２）又は（３）に記載のDNAを含有するベクター。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（２）以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（３）以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNA
（４）（２）又は（３）に記載のDNAを含有するベクター。
（５）（４）に記載のベクターを含む形質転換体。
（６）（５）に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からRock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、Rock2タンパク質と結合するタンパク質の製造方法。
（７）ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法。
（８）候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質とを接触させ、候補物質の中から当該ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法。
（９）ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である（８）記載の方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１０）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（７）又は（８）記載の方法。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１０）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（７）又は（８）記載の方法。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１１）ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤。
（１２）ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である（１１）記載の調節剤。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１３）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（１１）記載の調節剤。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
（１３）ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である（１１）記載の調節剤。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
本発明により、ニューロトニンに結合し、細胞機能調節活性を有する物質としてRock2タンパク質をスクリーニングすることができた。また、Rock2タンパク質が結合する領域は、ニューロトニンのアミノ酸配列領域のうちC末端側であることが判明した。Rock2タンパク質は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、ニューロトニンに結合してアクチン細胞骨格の形成に作用する因子、すなわち、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。従って、本発明のニューロトニンのC末端側部分断片、及び、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質は、神経疾患、ガンの転移、血管新生の治療法及び治療薬開発に有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ニューロトニンと結合する物質をスクリーニングした結果、Rock2(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2)と呼ばれるタンパク質（以下、単に「Rock2」という）が得られたことにより完成されたものである。Rock2は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼである。そして、Rock2は、ニューロトニンのC末端側に結合し、細胞のアクチン細胞骨格の形成に関与して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御する。言い換えれば、アクチン細胞骨格の形成には、ニューロトニンのC末端側部分断片が重要な役割を果たすといえる。
従って、本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片及びその製造方法を提供する。また、本発明は、ニューロトニンのC末端側部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤を提供する。
１．ニューロトニン
ニューロトニン(Neurotonin、「NT」と略す場合もある）とは、Isaacs症候群患者の血清を利用するイムノスクリーニングにより取得することができるタンパク質であり、SDS・PAGEにより求めた分子量は約66kDaである。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列情報は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる (GenBank Accession No. NM 176816等)。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号1、ニューロトニンのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
ニューロトニン(Neurotonin、「NT」と略す場合もある）とは、Isaacs症候群患者の血清を利用するイムノスクリーニングにより取得することができるタンパク質であり、SDS・PAGEにより求めた分子量は約66kDaである。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列情報は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる (GenBank Accession No. NM 176816等)。ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号1、ニューロトニンのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
本発明のニューロトニン部分断片は、ニューロトニンの全長アミノ酸配列のうちC末端側の断片である。ヒト由来ニューロトニンのアミノ酸残基は511個存在するため（配列番号２）、全長を等分割すると、N末端側領域として１〜255番、C末端側領域として256〜511番の領域に分けることができる。従って、本発明の部分断片は、全長アミノ酸配列のうちC末端側の２分の１の領域（256〜511番）中に含まれる断片である。
また、本発明のC末端側部分断片は、上記全長の1/2の長さに限定されるものではなく、C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域などを含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、256〜511番、260〜511番、270〜511番、280〜511番、290〜511番、300〜511番、310〜511番、320〜511番、330〜511番、340〜511番、350〜511番、360〜511番、370〜511番、380〜511番、390〜511番、400〜511番、410〜511番、420〜511番の領域を挙げることができる。但し、本発明においては、上記の具体的にアミノ酸の位置を示した断片に限定されるものではなく、部分断片を発現させる際に遺伝子の塩基配列に付加する任意配列（例えば制限酵素部位）やコドンを考慮して、アミノ酸領域を適宜設計することが可能である。例えば、全長の1/2の長さのC末端側部分断片を設計する場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、256〜511番の領域（配列番号４、遺伝子の塩基配列では配列番号３）を選択することができ、全長の1/3の長さのC末端側部分断片を設計する場合は、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、335〜511番の領域（配列番号６、遺伝子の塩基配列では配列番号５）を選択することができる。
また、本発明は、上記ニューロトニンのC末端側部分断片のアミノ酸配列のほか、当該アミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有する変異型タンパク質を提供する。具体的には、上記変異型タンパク質は、(i) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）中の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）に1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が付加（挿入を含む）したアミノ酸配列、(iii) C末端側部分断片のアミノ酸配列（例えば配列番号４又は配列番号６）中の1〜10個（好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。但し、C末端側部分断片のアミノ酸配列は、配列番号４及び配列番号６に示されるものに限定されるものではない。
このような1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をコードするDNAは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel, Method. Enzymol. 85: 2763-6 (1988)等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、DNAの塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
なお、上記変異型ニューロトニンは、天然の生物学的変異として発生することがあるが、そのような天然に変異が生じたニューロトニンのC末端側部分断片も、Rock2との結合活性を有する限り、本発明に含まれる。
ここで、「Rock2との結合活性」とは、Rock2に結合するリガンドタンパク質との結合特性に基づいて定義され、結合特性がRock2との親和性を有することを意味する。この結合活性は、ニューロトニンとの結合活性と同等もしくはそれ以上が好ましい。このような活性を有するタンパク質は、上記変異型タンパク質に含まれる。なお、Rock2との結合活性及び結合部位は、プルダウン法等の公知の結合解析方法を用いて確認することができる。なお、Rock2タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、その配列は GenBank 等の公共データベースを通じて容易に入手することができる (GenBank Accession No. NM 004850等)。
本発明はまた、上記C末端側部分断片又はその変異型断片をコードするDNAも提供する。具体的には、上記C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域をコードするDNA（例えば配列番号3又は5に示される塩基配列を含むDNA）、好ましくは、配列番号3又は5に示される塩基配列からなるDNA、及び、上記C末端側の1/3の領域、C末端側の1/4の領域をコードするDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNAも含まれる。
このようなDNAは、例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法により得ることができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法を用いて得ることも可能である。上記方法は、Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。あるいは、配列番号3又は5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその部分断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜2×SSC、0.1％〜0.5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。
得られたDNAは公知の方法により、あるいはキットを用いて精製してもよい。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAGEN(QIAGEN 社)等によるアガロースゲルを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動し、DNA断片をアガロースゲルより切り出して精製する。必要に応じて、慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得られていることを確認することができる。例えば、適当なDNAシークエンサー（例えば、ABI PRISM(アプライドバイオシステムズ社)）を利用して配列を解析することが可能である。
２．ベクター及び形質転換体
ニューロトニンの発現ベクター及び上記ベクターを含む形質転換体は、以下のように作製することができる。
上記ニューロトニン又はそのC末端側部分断片をコードするDNAの塩基配列領域の開始コドンの5’側と終止コドンの3’側にそれぞれ異なる制限酵素配列を有するプライマーを設定し、本領域を遺伝子増幅する。増幅した領域を制限酵素で切り出して発現ベクターに組み込み、宿主（大腸菌等）に導入して形質転換体を得ることができる。
具体的には、クローニングを行ったプラスミドを、制限酵素を用いて消化する。上記の塩基配列中に適当な制限酵素切断部位があれば、それに対応した制限酵素を用いればよい。また、別法としてPCRにより目的のDNAを得た場合は、PCRプライマー中に挿入された制限酵素認識配列に対応した制限酵素を用いることができる。
ニューロトニンの発現ベクター及び上記ベクターを含む形質転換体は、以下のように作製することができる。
上記ニューロトニン又はそのC末端側部分断片をコードするDNAの塩基配列領域の開始コドンの5’側と終止コドンの3’側にそれぞれ異なる制限酵素配列を有するプライマーを設定し、本領域を遺伝子増幅する。増幅した領域を制限酵素で切り出して発現ベクターに組み込み、宿主（大腸菌等）に導入して形質転換体を得ることができる。
具体的には、クローニングを行ったプラスミドを、制限酵素を用いて消化する。上記の塩基配列中に適当な制限酵素切断部位があれば、それに対応した制限酵素を用いればよい。また、別法としてPCRにより目的のDNAを得た場合は、PCRプライマー中に挿入された制限酵素認識配列に対応した制限酵素を用いることができる。
次に、制限酵素消化後のDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このDNA断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込み、ニューロトニンのC末端側部分断片をコードするDNAを含有する発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入し形質転換体を作製し、目的遺伝子の発現に供する。
発現ベクター及び宿主は、目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主としてHEK293細胞、COS細胞、CHO細胞、NIH細胞、HeLa細胞等の哺乳類細胞、大腸菌（Escherichia coli) 、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) 等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母などが挙げられる。
本発明のベクターには、遺伝子工学分野での公知の、または文献に記載された技術に用いられるプラスミド、バクテリオファージおよびウイルス（真核ウイルスも含む）などが挙げられ、これらのベクターは、公知のさまざまな発現システムにおいて使用することができる。好ましいウイルス性ベクターとしてバキュロウイルス、アデノウイルスおよびワクシニアウイルスなどを例示することができる。
哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えばpCAGGSやpcDNA3(INVITROGEN CORPORATION)等が挙げられる。例えば、HEK293細胞に組換えpCAGGS 発現ベクタープラスミドを導入するには、PolyFect Transfection Reagent(QUAGEN)や、Lipofectamine(GIBCO BRL社) を用いたリポソーム法を用いることができる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、本発明の遺伝子が宿主中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、転写終結配列を含む構成であることが好ましい。発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX等が挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換え体DNAの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えばYEp13、YCp50等が挙げられる。プロモーターとしては、例えばgal1 プロモーター、gal10プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
３．C末端側部分断片又はその変異型断片の製造
本発明においてC末端側部分断片又はその変異型断片を製造するには、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から目的のタンパク質を採取すればよい。
本発明においてC末端側部分断片又はその変異型断片を製造するには、前記形質転換体を培養し、得られる培養物から目的のタンパク質を採取すればよい。
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
培養後、目的タンパク質（C末端側部分断片又はその変異型断片）が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のタンパク質を単離精製することができる。なお、変異型断片を製造する際には、Rock2との結合活性を測定しておくことが好ましい。結合活性の測定法は前記の通りである。
例えば、ANTI-FLAG M2 Affinity Gel等と反応させ、非特異的なタンパク質を洗浄除去してから、目的タンパク質をFLAG peptide等で溶出する。回収されたタンパク質をカルバモイルメチル化後、Lysyl Endopeptidase等のタンパク質分解酵素により消化して得られたペプチド混合物を分析試料とし、HPLCと質量分析装置を用いて測定することにより、C末端側部分断片又はその変異型断片と結合するタンパク質（例えばRock2）を分析することができる。Rock2におけるタンパク質結合領域は、上記のように、pulldown 法等の公知の結合解析方法を用いて決定することができる。
さらに、本発明においては、in vitro翻訳によるタンパク質合成を採用することができる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型RNAとしては、本発明のDNAを転写させたポリヌクレオチドが挙げられ、鋳型DNAとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターが組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。in vitro翻訳システムは、市販のシステム、例えばExpresswayTMシステム（Invitrogen社）、PURESYSTEM（登録商標；ポストゲノム研究所）、TNTシステム(登録商標；Promega社)などを用いることができる。in vitro翻訳システムによるタンパク質合成後は、上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
４．ニューロトニンC末端側部分断片に対する抗体
ニューロトニンに対する抗体は、Isaacs症候群およびそれ以外の末梢神経患者において産生されている。したがって、患者の血清にはニューロトニンに対する種々の抗体も存在するが、本発明者らの研究により特にそのC末端側部分に対する抗体が多くの患者に見出されている。これらの抗体もニューロトニンの生理機能と密接に関連し、症状に関与している。このため、これらのニューロトニンのC末端側部分断片に結合できる抗体もまた、Isaacs症候群または末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。
ニューロトニンに対する抗体は、Isaacs症候群およびそれ以外の末梢神経患者において産生されている。したがって、患者の血清にはニューロトニンに対する種々の抗体も存在するが、本発明者らの研究により特にそのC末端側部分に対する抗体が多くの患者に見出されている。これらの抗体もニューロトニンの生理機能と密接に関連し、症状に関与している。このため、これらのニューロトニンのC末端側部分断片に結合できる抗体もまた、Isaacs症候群または末梢神経障害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。
上記抗体は、抗原となるタンパク質を動物に接種して免疫することにより調製することができる。そのための動物として、広く利用されている、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが挙げられる。
抗体の中で、モノクローナル抗体は、単一のエピトープに特異的に結合する均一な抗体であるため、特に有用かつ好ましい抗体である。モノクローナル抗体の製造は、抗原となるニューロトニン又はそのC末端側部分断片などで免疫した動物脾臓からのリンパ球細胞とHAT感受性の骨髄腫細胞とのハイブリドーマ細胞を調製しクローン化する従来の確立された細胞融合技術を利用してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を利用してもよい。ヒト化モノクローナル抗体を得るには、マウス、ラットなどからの動物細胞の抗体cDNAとヒト抗体cDNAとの融合を含む遺伝子組み換え技術によるキメラ又はヒト化抗体の産生がある。ヒト由来細胞・腫瘍細胞クローンの利用、マウス腫瘍細胞とヒト細胞との融合、トランスジェニックマウス利用によるヒト抗体の産生方法も挙げられる。
上記抗体用途として、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を検出するための検査薬、Isaacs症候群などの診断薬又は治療薬、研究用試薬、分析用試薬、免疫スクリーニング用試薬などが挙げられる。
５．スクリーニング方法
（１）ニューロトニンのC末端側部分断片に結合する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中からC末端側部分断片に結合した物質を選択する工程を含むものである。上記スクリーニング方法によって得られ得るリガンド又は化合物は、ニューロトニンの阻害剤となり得るものである。従って、上記のスクリーニングで得られる化合物は、ニューロトニンとの結合を利用することにより、Isaacs症候群などの末梢神経障害の治療用薬剤として使用することができる。
（１）ニューロトニンのC末端側部分断片に結合する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中からC末端側部分断片に結合した物質を選択する工程を含むものである。上記スクリーニング方法によって得られ得るリガンド又は化合物は、ニューロトニンの阻害剤となり得るものである。従って、上記のスクリーニングで得られる化合物は、ニューロトニンとの結合を利用することにより、Isaacs症候群などの末梢神経障害の治療用薬剤として使用することができる。
具体的なスクリーニング方法は、ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、ニューロトニンのC末端側部分断片と候補物質との結合活性を、免疫沈降反応等の公知の方法を用いて測定すればよい。
上記スクリーニングによって得られた化合物として、例えばRock2を挙げることができる。
上記スクリーニングによって得られた化合物として、例えばRock2を挙げることができる。
（２）ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2とを接触させ、候補物質の中から、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質を選択する工程を含むものである。
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2とを接触させ、候補物質の中から、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節する物質を選択する工程を含むものである。
「結合を調節する」とは、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を促進又は抑制することを意味し、結合を調節する物質として、アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有する物質を含む。
スクリーニングされた物質は、Isaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治療用薬剤及びアクチン細胞骨格の形成調節剤として神経疾患、ガンの転移、血管新生の治療法及び治療開発に有用となる。
具体的なスクリーニング方法は、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む実験系に候補物質を添加した場合と無添加の場合において、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合活性を測定し、両者を比較すればよい。結合活性が変化した場合には、その候補物質はニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2との結合を調節するのに有効な物質であるとして選択することができる。
（３）候補物質
本発明のスクリーニング方法において、候補物質としては特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、候補物質としては特に限定されるものではなく、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）などとの塩が用いられる。
６．アクチン細胞骨格の形成調節剤
本発明のアクチン細胞骨格の形成調節剤は、ニューロトニンのC末端側部分断片を有効成分として含むものである。
本発明のアクチン細胞骨格の形成調節剤は、ニューロトニンのC末端側部分断片を有効成分として含むものである。
アクチン細胞骨格とは、細胞骨格を構成する要素のひとつである。動物細胞では、細胞骨格の組織構造と細胞接着によってその形態が決定されており、細胞の状態、例えば、細胞周期、細胞癌化及び細胞分化などによって著しくその形態が変わる。細胞骨格は細胞運動の主装置としても機能しており、細胞骨格の形成には細胞骨格調節タンパク質が関与している。
上記のように、Rock2は低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。従って、Rock2との相互作用が見出されたニューロトニン又はそのC末端側部分断片は細胞のアクチン細胞骨格制御に関与するため、アクチン細胞骨格の形成調節剤として好ましい。
ニューロトニン又はそのC末端側部分断片が細胞のアクチン細胞骨格制御に関与することは、ニューロトニン又はそのC末端側部分を細胞内で強発現させたときのアクチン細胞骨格の変化を公知の方法で観察すればよい。具体的には、上記ニュートロニン等を強発現させた細胞にリゾフォスファチジン酸（LPA）等のRhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激物質を添加して、細胞膜を破壊した後に、細胞骨格の主要アクチンであるF-アクチンを特異的染色し、続いて細胞核を染色した細胞サンプルのアクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察すればよい。それにより、ニュートロニンを強発現させた細胞では、通常の細胞と異なり、細胞膜辺縁部に強いアクチン細胞骨格の集積が見られたことから、ニューロトニンがアクチン細胞骨格の形成に作用することが示される。
また、本発明においては、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片は、アクチン細胞骨格の形成調節のための医薬組成物、あるいはアクチン細胞骨格の形成を解析するための研究用試薬として使用することができる。
医薬組成物として使用する場合は、アクチン細胞骨格の形成異常にともなう疾患を対象とすることができる。このような疾患としては、例えばIsaacs症候群、ジストロフィン異常症、拡張型心筋症、筋萎縮性側索硬化症、癌転移、癌浸潤、血管浸潤、ミオパチー、ニューロパチー、運動ニューロン疾患、アルツハイマー、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、ポリグルタミン病、Cushing病、Addison病、Nelson症候群、糖質コルチコイド不応症、ACTH不応症、神経性食欲不振症、下垂体前葉機能障害、視床下部障害、ADH（抗利尿ホルモン）分泌異常症、末端肥大症、巨人症、腎不全、インスリン依存型糖尿病、Laron小人症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、両側無睾丸（卵巣）症、Turner症候群、Klinefelter症候群、卵巣蓑腫、睾丸腫瘍、副腎腫瘍、Sheehan症候群、Pit1症候群、アルドステロン産生性腺腫、アルドステロン症、Batter症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、特発性起立性低血圧症、クレチン症，橋本病，肥満症、炎症性大腸炎、脱髄性多発根神経炎、結節性多発動脈炎・ HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069c.html" 側頭動脈炎、 HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069d.html" リウマチ性多発筋痛、 HYPERLINK "http://mmh.banyu.co.jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069e.html" ヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット症候群、骨粗鬆症などが挙げられる。
医薬組成物を投与する対象は、哺乳動物が挙げられ、例えばヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
本発明の医薬組成物の投与形態は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤又はシロップ剤等による投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤、座剤、点眼剤、経肺剤型(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型(例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。
賦形剤としては、例えば、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェエノール類が挙げられる。
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート80、ステアリン酸ポリオキシル40、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
上記添加物等は、本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたニューロトニンのC末端側部分断片、その薬学的に許容可能な塩、又はこれらの水和物を溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これにTween 80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、例えば一日につき体重1kgあたり約0.1 mg〜100 mg、好ましくは0.1 mg〜1.0 mgである。但し、上記アクチン細胞骨格の形成調節剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明のC末端側部分断片を、アクチン細胞骨格の形成調節を解析するための研究用試薬として使用する場合は、in vitro及びin vivoのいずれにおいても適用が可能である。in vivoで使用する場合の解析対象は、昆虫（例えばショウジョウバエ）、前記した実験動物などの動物体のほか、ゼブラフィッシュなどが挙げられる。in vitroの場合は、筋細胞の抽出液、筋肉由来培養細胞などを使用することができる。
アクチン細胞骨格の形成調節の解析は、in vitroの場合は培養細胞の蛍光ファロイジン染色、in vivoの場合は血管新生、癌転移、癌浸潤の変化などを指標に行うことができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
新規NT相互作用因子の探索
本実施例では、機能未知因子Neurotonin(NT)の生体内における役割を明らかにするため、NT相互作用因子の探索を以下の手順で行った。Issacs症候群患者からの血清を利用するイムノスクリーニング手法により、神経細胞由来のcDNAライブラリーから特定のcDNAを分離し、それを解明することにより入手したNT遺伝子（配列番号１）をHEK293細胞にPolyFect Transfection Reagent(QUAGEN)を用いてトランスフェクションし、発現させた。操作は取り扱い説明書の内容に準じ、培養時間は48時間とした。培養終了後の細胞を溶解後、遠心分離し、上清を遠心濾過した。その後ANTI-FLAG M2 Affinity Gelと反応させ、非特異的なタンパク質を洗浄除去し、目的タンパク質をFLAG peptideで溶出した。回収されたタンパク質をDTT、ヨードアセトアミドを用いてカルバモイルメチル化した後、Lysyl Endopeptidaseを添加して37℃で一晩インキュベートした。得られたペプチド混合物を分析試料とし、HPLCシステムと質量分析装置を用いて測定を行った。
本実施例では、機能未知因子Neurotonin(NT)の生体内における役割を明らかにするため、NT相互作用因子の探索を以下の手順で行った。Issacs症候群患者からの血清を利用するイムノスクリーニング手法により、神経細胞由来のcDNAライブラリーから特定のcDNAを分離し、それを解明することにより入手したNT遺伝子（配列番号１）をHEK293細胞にPolyFect Transfection Reagent(QUAGEN)を用いてトランスフェクションし、発現させた。操作は取り扱い説明書の内容に準じ、培養時間は48時間とした。培養終了後の細胞を溶解後、遠心分離し、上清を遠心濾過した。その後ANTI-FLAG M2 Affinity Gelと反応させ、非特異的なタンパク質を洗浄除去し、目的タンパク質をFLAG peptideで溶出した。回収されたタンパク質をDTT、ヨードアセトアミドを用いてカルバモイルメチル化した後、Lysyl Endopeptidaseを添加して37℃で一晩インキュベートした。得られたペプチド混合物を分析試料とし、HPLCシステムと質量分析装置を用いて測定を行った。
その結果、NTに結合する物質としてRho-associated, coiled-coil containing protein kinase 2 （Rock2）を得た。
NTとRock2の細胞内相互作用
質量分析装置によりNT相互作用因子として同定されたRock2がNTと細胞内で結合活性を示すことを確認するため、HEK293細胞に哺乳類培養細胞発現ベクターpCAGGSまたはHAタグを付加しているNT発現ベクター(HA-NT)を一過性に導入したHEK293細胞を作製し、この細胞抽出液をLysis buffer（20 mM Hepes （pH7.9），420 mM NaCl，10% glycerol，0.5% NP-40，0.5 mM DTT，1 mM PMSF，10 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）により回収した。回収産物に、αRho kinase Alpha (BL964)抗体（αRock2抗体）4 μgを加え、4℃でローテーターにて撹拌しながら2時間反応させた。そこにprotein G sepharose 30 μl（50% slurry）を加えて4℃でローテーターにて撹拌しながらさらに2時間反応させた。
質量分析装置によりNT相互作用因子として同定されたRock2がNTと細胞内で結合活性を示すことを確認するため、HEK293細胞に哺乳類培養細胞発現ベクターpCAGGSまたはHAタグを付加しているNT発現ベクター(HA-NT)を一過性に導入したHEK293細胞を作製し、この細胞抽出液をLysis buffer（20 mM Hepes （pH7.9），420 mM NaCl，10% glycerol，0.5% NP-40，0.5 mM DTT，1 mM PMSF，10 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）により回収した。回収産物に、αRho kinase Alpha (BL964)抗体（αRock2抗体）4 μgを加え、4℃でローテーターにて撹拌しながら2時間反応させた。そこにprotein G sepharose 30 μl（50% slurry）を加えて4℃でローテーターにて撹拌しながらさらに2時間反応させた。
その後、Wash buffer（50 mM Tris-HCl pH7.5 、10% glycerol、150 mM NaCl，0.1 % NP-40，0.5 mM DTT，1 mM PMSF，10 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）でprotein G sepharose を洗浄し、15 μlの6xUrea SDS sample bufferに懸濁した。各懸濁液10μlをSDS-PAGEにかけ、5 % スキムミルクでブロッキング後、αRock2抗体（1/10000 希釈）またはαHA-C抗体（1/1000 希釈）を加え1 時間振盪した。その後サンプルを TBS-T で洗浄した後に、1/5000 希釈したα-rabbit-IgG HRPを加え1時間振盪後、TBS-T で洗浄しHome made ECL により検出した。
その結果、HA-NTを一過性発現させた細胞においてαRock2抗体による免疫沈降により、共沈されたHA-NTのバンドが確認された（図１）。よって、細胞内においてNTとRock2の相互作用が示された。
NTにおけるRock2結合領域の決定
本実施例では、NTにおけるRock2の結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems(promega)を用いたin vitro translationにより35S ラベルされたRock2タンパク質溶液10 μlにglutathione sepharose beads に結合させた各GST 融合タンパク質（GST, GST-NT, -NT(N), -NT(M), -NT(C)）3 μgとpulldown buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.5)，150 mM NaCl、0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）を500 μl加え、4℃で撹拌しながら一晩結合反応を行った。GST-NTはNT遺伝子全長、-NT(N)はN末端側から1-200、-NT(M)は199-347、-NT(C)は335-511アミノ酸残基を表す（アミノ酸番号は、配列番号２を基準）。その後、Pulldown bufferによりglutathione sepharose beadsを５回洗浄し、4 x SDS sample bufferを加えて100℃でボイルしたサンプルをSDS-PAGEにより展開し、autoradiographyにより35S-Rock2と各NT欠失変異体間の結合活性を検出した。
本実施例では、NTにおけるRock2の結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems(promega)を用いたin vitro translationにより35S ラベルされたRock2タンパク質溶液10 μlにglutathione sepharose beads に結合させた各GST 融合タンパク質（GST, GST-NT, -NT(N), -NT(M), -NT(C)）3 μgとpulldown buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.5)，150 mM NaCl、0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，1 μg/ml Aprotinin，1 μg/ml Leupeptin，1 μg/ml Pepstatin A）を500 μl加え、4℃で撹拌しながら一晩結合反応を行った。GST-NTはNT遺伝子全長、-NT(N)はN末端側から1-200、-NT(M)は199-347、-NT(C)は335-511アミノ酸残基を表す（アミノ酸番号は、配列番号２を基準）。その後、Pulldown bufferによりglutathione sepharose beadsを５回洗浄し、4 x SDS sample bufferを加えて100℃でボイルしたサンプルをSDS-PAGEにより展開し、autoradiographyにより35S-Rock2と各NT欠失変異体間の結合活性を検出した。
その結果、GST-NT(C)によるpulldownにおいて35S-Rock2のバンドが検出された（図２）。よって、Rock2はNTのC末端領域を介して相互作用することが示された。
Rock2におけるNT結合領域の決定
実施例３ではNTにおけるRock2への結合領域の解析を行ったが、本実施例では、Rock2におけるNTの結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。
実施例３ではNTにおけるRock2への結合領域の解析を行ったが、本実施例では、Rock2におけるNTの結合領域を決定するため、GST-pulldown法により結合解析を行った。
TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systemsを用いたin vitro translationにより35S ラベルされたNTタンパク質溶液10 μlに、glutathione sepharose beads に結合させた各GST 融合タンパク質（GST, GST-Rock2, -Rock2(N), -Rock2(C)）3 μgとpulldown buffer(50 mM Tris-HCl(pH7.5)，150 mM NaCl、0.5% NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，1 mM PMSF，1μg/ml Aprotinin，1μg/ml Leupeptin，1μg/ml Pepstatin A）を500μl加え、4℃で撹拌しながら終夜結合反応を行った。「-Rock2(N)」はRock2のアミノ酸配列の1-708、「-Rock2(C)」はRock2のアミノ酸配列698-1388番のアミノ酸残基を表す（いずれも、Accession 番号NM 004850のアミノ酸配列を基準)。
その後、pulldown bufferによりglutathione sepharose beadsを５回洗浄し、4xSDS sample bufferを加えて100℃でボイルしたサンプルをSDS-PAGEにより展開し、autoradiographyにより35S-NTと各Rock2欠失変異体間の結合活性を検出した。
その結果、GST-Rock2(C)のpulldownにおいてGST-Rock2と同程度の35S-NTのバンドが検出された（図３）。よって、Rock2はNTのC末端領域により強く結合活性を有することが示された。
NT stable cell line におけるアクチン細胞骨格の観察
Rock2は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。そこで本発明者は、Rock2との相互作用が見出されたNTが細胞のアクチン細胞骨格制御に関与し得るのではないかと予想し、NT強発現におけるアクチン細胞骨格の変化を観察した。HEK293細胞にpcDNA3-FLAGまたはFLAG-humanNT (hNT)を恒常的に発現させた細胞株に対して、RhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激であるリゾフォスファチジン酸（LPA）（WAKO）を無血清培地に終濃度10μMで添加した。37℃にて30分間培養後、細胞を3.7% ホルムアルデヒドにより固定した。細胞膜破壊のため、固定した細胞に0.1% TritonX-100/PBS(-)を30分間処理し、1% BSA/0.1% Tween20/PBS(-)により30分間ブロッキングを行った。その後、細胞骨格の主要アクチンであるF-アクチンを特異的染色するRhodamin-FITC (SIGMA)を50 μg/mlにて用いて40分間細胞を染色し、続いてDAPIにより細胞核を染色した細胞サンプルのアクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察した。また、代表的なRho ファミリー Cdc42、Rac1及びRhoAの各恒常的活性化変異体をBHK 細胞に強制発現させた後、各Rho ファミリーとアクチンフィラメントを染色して観察した。
Rock2は、低分子量Gタンパク質RhoAにより活性化され多数の基質に作用するキナーゼであり、細胞のアクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運動・極性・接着などを制御し得る因子である。そこで本発明者は、Rock2との相互作用が見出されたNTが細胞のアクチン細胞骨格制御に関与し得るのではないかと予想し、NT強発現におけるアクチン細胞骨格の変化を観察した。HEK293細胞にpcDNA3-FLAGまたはFLAG-humanNT (hNT)を恒常的に発現させた細胞株に対して、RhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激であるリゾフォスファチジン酸（LPA）（WAKO）を無血清培地に終濃度10μMで添加した。37℃にて30分間培養後、細胞を3.7% ホルムアルデヒドにより固定した。細胞膜破壊のため、固定した細胞に0.1% TritonX-100/PBS(-)を30分間処理し、1% BSA/0.1% Tween20/PBS(-)により30分間ブロッキングを行った。その後、細胞骨格の主要アクチンであるF-アクチンを特異的染色するRhodamin-FITC (SIGMA)を50 μg/mlにて用いて40分間細胞を染色し、続いてDAPIにより細胞核を染色した細胞サンプルのアクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察した。また、代表的なRho ファミリー Cdc42、Rac1及びRhoAの各恒常的活性化変異体をBHK 細胞に強制発現させた後、各Rho ファミリーとアクチンフィラメントを染色して観察した。
その結果、pcDNA3-FLAG発現株とFLAG-hNT発現株において、LPA処理を行った際のPhalloidin-FITC染色の像を比較すると、pcDNA3-FLAG発現株ではアクチン細胞骨格が細胞全体に広がっているのに対し、FLAG-hNT発現株では細胞膜辺縁部に強いアクチン細胞骨格の集積が観察された（図４）。また、Cdc42を発現させると、糸状仮足である突起構造が見られ、Rac1 を発現させると、葉状仮足である形質膜辺縁部に強いアクチンフィラメントを集積し、RhoAを発現させると、太いファイバー状のアクチンフィラメントが集積した（図５）。
以上の結果から、NTの強発現がアクチン細胞骨格の形成に作用し得ることが示された。
Claims (13)
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号３若しくは５に示される塩基配列からなるDNAに対し相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードするDNA - 請求項２又は３に記載のDNAを含有するベクター。
- 請求項４に記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からRock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、Rock2タンパク質と結合するタンパク質の製造方法。
- ニューロトニンのC末端側部分断片に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法。
- 候補物質の存在下で、ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質とを接触させ、候補物質の中から当該ニューロトニン又はそのC末端側部分断片とRock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法。
- ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項８記載の方法。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質 - ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項７又は８記載の方法。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質 - ニューロトニン又はそのC末端側部分断片を含む、アクチン細胞骨格の形成調節剤。
- ニューロトニンが以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項１１記載の調節剤。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質 - ニューロトニンのC末端側部分断片が、以下の(a)又は(b)のタンパク質である請求項１１記載の調節剤。
(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006015477A JP2009089601A (ja) | 2006-01-24 | 2006-01-24 | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 |
| PCT/JP2007/051338 WO2007086545A1 (ja) | 2006-01-24 | 2007-01-23 | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006015477A JP2009089601A (ja) | 2006-01-24 | 2006-01-24 | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009089601A true JP2009089601A (ja) | 2009-04-30 |
Family
ID=38309324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006015477A Pending JP2009089601A (ja) | 2006-01-24 | 2006-01-24 | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009089601A (ja) |
| WO (1) | WO2007086545A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015159766A (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-07 | 国立大学法人京都大学 | クッシング症候群の検査方法、検査用バイオマーカー及び治療剤 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002233383A (ja) * | 2001-02-09 | 2002-08-20 | Locomogene Inc | ニューロトニンおよびその利用 |
-
2006
- 2006-01-24 JP JP2006015477A patent/JP2009089601A/ja active Pending
-
2007
- 2007-01-23 WO PCT/JP2007/051338 patent/WO2007086545A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015159766A (ja) * | 2014-02-27 | 2015-09-07 | 国立大学法人京都大学 | クッシング症候群の検査方法、検査用バイオマーカー及び治療剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007086545A1 (ja) | 2007-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8173775B2 (en) | Collagen-like protein CLAC, a precursor thereof, and genes encoding the same | |
| US20100136014A1 (en) | GIPs, a Family of Polypeptides with Transcription Factor Activity that Interact with Goodpasture Antigen Binding Protein | |
| JP7316592B2 (ja) | 抗ｎｉｎｊ－１抗体及びその使用 | |
| JP2009089601A (ja) | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 | |
| JPWO2004018669A1 (ja) | 塩誘導性キナーゼ２及びその用途 | |
| JP2003530082A (ja) | 免疫関連疾患を治療するための組成物及び方法 | |
| JP4429269B2 (ja) | アポトーシス誘導遺伝子およびその利用 | |
| JP2002517998A (ja) | ｐ２７（ＫＩＰ１）のＦＫＢＰ−１２との相互作用 | |
| US7179898B1 (en) | Human vanilloid receptor-like receptor | |
| JP4746537B2 (ja) | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
| US20040115682A1 (en) | Novel scavenger receptor class a protein | |
| WO2006085648A1 (ja) | 新規ナルコレプシー関連遺伝子 | |
| JPWO2005103257A1 (ja) | ＲｈｏＡと結合するグアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子 | |
| WO2003078633A1 (fr) | Polypeptides se liant a la syntaxine 1a humaine | |
| JPWO2003044196A1 (ja) | ポストシナプス蛋白質 | |
| WO2015174641A1 (ko) | Aimp2-dx2-34s 단백질 및 이의 제조방법 | |
| JPWO2005056597A1 (ja) | 免疫グロブリンＦｃ受容体タンパク質 | |
| JPWO2005100567A1 (ja) | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
| JP2005192567A (ja) | チロシンキナーゼ遺伝子およびその遺伝子産物 | |
| JP2005527190A (ja) | 核タンパク質「ｓｈｏｃａ」−ｗｎｔシグナル伝達経路の成分 | |
| JPWO2005103256A1 (ja) | Ｇｔｐアーゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
| JP2003524406A (ja) | 腫瘍細胞成長阻害のための組成物及び方法 | |
| JP2003259884A (ja) | 新規ポリペプチド | |
| WO2001023423A1 (fr) | Nouveau gene comprenant le domaine ww et codant le polypeptide humain interagissant avec l'huntingtine, methode de production dudit gene et application correspondante | |
| WO2005030805A1 (ja) | 新規タンパク質複合体およびその用途 |