WO2007086545A1 - 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 - Google Patents

細胞機能調節物質のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007086545A1
WO2007086545A1 PCT/JP2007/051338 JP2007051338W WO2007086545A1 WO 2007086545 A1 WO2007086545 A1 WO 2007086545A1 JP 2007051338 W JP2007051338 W JP 2007051338W WO 2007086545 A1 WO2007086545 A1 WO 2007086545A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
amino acid
acid sequence
rock2
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/051338
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiro Nakajima
Natsumi Araya
Tetsuya Amano
Original Assignee
Locomogene, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Locomogene, Inc. filed Critical Locomogene, Inc.
Publication of WO2007086545A1 publication Critical patent/WO2007086545A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/24—Drugs for disorders of the endocrine system of the sex hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for a cell function regulating substance.
  • Peripheral neuropathy originates from a defect in nerve excitatory transmission at the end of the motor neuromuscular junction
  • the present inventor has grasped the fact that cDNA isolated from a patient with Isaacs syndrome encodes a specific protein and that protein is increased in the patient's blood. So As a result of further intensive research, it was suggested that the cDNA and the protein encoded by the cDNA were factors related to the pathogenesis of Isaacs syndrome. This identified molecule was called neurotonin, and the cDNA base sequence and protein amino acid sequence information (derived from human) were determined (International Publication W002 / 064787 pamphlet).
  • Neurotonin is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (International Publication W002 / 064787 pamphlet), and has an activity of binding to an antibody found in the blood of the above patient, and further exists in peripheral nerve cells. It can be combined with a protein called “14-3-3”.
  • the present invention relates to a c-terminal partial fragment of neurotonin and a method for producing the same, a method for screening a substance that binds to the fragment, and a substance that regulates the binding between neurotonin or its C-terminal partial fragment and Rock2 protein. It is an object of the present invention to provide a method and a regulator of formation of actin cytoskeleton.
  • the present inventor has found that the substance that binds to neurotonin is the Rock2 protein, and the binding region of neurotonin to Rock2 is the C-terminal of its amino acid sequence. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a transformant comprising the vector according to (4).
  • a method for producing a protein that binds to Rock2 protein comprising culturing the transformant according to (5), and collecting a protein having binding activity to Rock2 protein from the obtained culture.
  • a method in which a candidate substance is brought into contact with a C-terminal partial fragment of neurotonin and a substance that binds to the partial fragment is screened from candidate substances.
  • neurotonin is the following protein (a) or (b).
  • neurotonin is the following protein (a) or (b):
  • a pharmaceutical composition for treating a disease associated with abnormal formation of actin cytoskeleton comprising neurotonin or a C-terminal partial fragment thereof.
  • Rock2 protein As a substance that binds to neurotonin and has cell function regulating activity.
  • the region to which the Rock2 protein binds was found to be the C-terminal side of the amino acid sequence region of neurotonin.
  • Rock2 protein is a kinase that is activated by the low molecular weight G protein RhoA and acts on many substrates. It is a factor that binds to neurotonin and acts on the formation of the actin cytoskeleton, that is, controls the actin cytoskeleton of cells. It is a factor that can control cell morphology, cell movement, polarity, adhesion, etc.
  • the C-terminal partial fragment of neurotonin of the present invention and the substance that regulates the binding of neurotonin or its C-terminal partial fragment to Rock2 are cell proliferative diseases, neurological diseases, cancer metastasis, angiogenesis It is useful for the development of therapeutic methods and therapeutic drugs.
  • FIG. 1 is a diagram showing in vivo binding analysis of neurotonin and Rock2.
  • FIG. 2 shows the determination of the Rock2 binding region in neurotonin.
  • FIG. 3 shows the determination of the -eurotonin binding region in Rock2.
  • FIG. 4 shows the observation of the actin skeleton in a neurotonin-constant cell line.
  • FIG. 5 is a diagram showing the control of actin filaments by Rho family.
  • FIG. 6 is a diagram showing an evaluation method of an arthritis model in wild-type (WT) and -eurotonin knockout (NT-K0) mice.
  • Figure 7 is a photograph showing the condition of limb arthritis in the limbs of mice in WT and NT-K0 mice.
  • FIG. 8 is a graph showing arthritis scores in WT and NT-K0 mice.
  • FIG. 9 is a knee joint histology in WT and NT-K0 mice.
  • Rock2 is a kinase that is activated by the low molecular weight G protein RhoA and acts on many substrates.
  • R oc k2 binds to the C-terminal side of neurotonin and participates in the formation of the actin cytoskeleton of cells to control cell morphology, cell motility, polarity and adhesion.
  • the C-terminal fragment of neurotonin plays an important role in the formation of the actin cytoskeleton.
  • the present invention provides a C-terminal partial fragment of neurotonin and a method for producing the same.
  • the present invention also provides a method for screening a substance that binds to the c-terminal partial fragment of neurotonin. Furthermore, the present invention provides a method of screening for a substance that regulates the binding between neurotonin or a c-terminal partial fragment thereof and Rock2. Furthermore, the present invention provides a regulator for the formation of actin cytoskeleton comprising neurotonin or a C-terminal partial fragment thereof. 1. Rock2
  • Rock 2 '' is a lyoform of Rho-associated coi led-coil forming protein kinase (Rock). As mentioned above, it is activated by the low molecular weight G protein RhoA and acts on many substrates. is there. That is, Rock2 is one of the major effectors of Rho, and is a serine 'threonine kinase activated by GTP-Rho. It has been reported that Rock2 activated by GTP-Rho is involved in induction of formation of actin stress fiber and focal contact, cell migration, and the like. For this reason, Rock2 binds to the C-terminal side of neurotonin and activates it to control cell actin cytoskeleton reorganization and control cell morphology, cell movement, polarity, adhesion, etc. Can do.
  • actin stress fiber is an aggregate composed of actin and cocoon-type myosin, and is a fiber that exerts a contractile force on cells.
  • Flucal contact is an adhesion site between a cell and an extracellular matrix.
  • cell migration is the key to many life phenomena such as organ formation, wound healing, inflammation, and cancer metastasis. In this method, the (polarity) is acquired in different forms, and the cytoskeleton such as actin and microtubules is reorganized to move in a directional direction (migration).
  • Nuotonin (sometimes abbreviated as “NT”) is a protein that can be obtained by immunoscreening using serum from patients with Isaacs syndrome. The molecular weight determined by SDS PAGE is It is about 66 kDa.
  • GenBank GenBank Accession No. 176816 etc.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding neurotonin is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of diaurotonin is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the neurotonin partial fragment of the present invention is a fragment on the C-terminal side of the full-length amino acid sequence of neurotonin. Since there are 511 amino acid residues of human-eurotonin (SEQ ID NO: 2), the entire length is divided equally into regions 1-255 as the N-terminal region and regions 256-511 as the C-terminal region. be able to. Therefore, the partial fragment of the present invention is a fragment contained in a half region (256th to 511th) on the C-terminal side of the full-length amino acid sequence.
  • the C-terminal-side partial fragment of the present invention is not limited to a length that is 1/2 of the total length, but includes a 1/3 region on the C-terminal side, a 1/4 region on the C-terminal side, and the like. Is included.
  • SEQ ID NO: 2 256-511, 260-511, 270-511, 280-511, 290-511, 300-511, 310-511, 320- 511, 330-511, 340-511, 350-511, 360-511, 370-511, 380-511, 390-511, 400-511, 410-511, 420-
  • the 511 area can be listed.
  • the present invention is not limited to the fragment specifically showing the amino acid position as described above, but an arbitrary sequence (for example, a restriction enzyme site) added to the base sequence of the gene when the partial fragment is expressed. It is possible to design the amino acid region appropriately, taking into account the codons.
  • the region of sequence 256 to 511 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4, the sequence for the gene base sequence) Number 3) can be selected,
  • the region from 335 to 511 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 for the gene base sequence) ) Can be selected.
  • the present invention also includes an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the amino acid sequence of the C-terminal partial fragment of the above neurotonin, and Provided is a mutant protein having binding activity to Rock2 protein.
  • the mutant protein has (i) 1 to 10 (preferably 1 to 5, preferably 1) in the amino acid sequence of the C-terminal partial fragment (eg, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6). Is 1 to 3 amino acids deleted from the amino acid sequence; (ii) 1 to 10 (preferably 1 to 5) amino acid sequences (for example, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6) of the C-terminal partial fragment; More preferably 1 to 3 amino acids
  • Amino acid sequence (including insertion), (iii) 1 to 10 (preferably 1 to 5, preferably 1) in the amino acid sequence of the C-terminal partial fragment (eg, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6) Amino acid sequences in which 1 to 3 amino acids are substituted with other amino acids, (iv) amino acid sequences in which the above (i) to (iii) are combined, and the like.
  • the amino acid sequence of the C-terminal partial fragment is not limited to those shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6.
  • Enzymol. 85: 2763-6 (1988), etc. can be prepared according to a method such as site-directed mutagenesis.
  • mutation introduction kits using site-directed mutagenesis such as the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Strata GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takarabio Co., Ltd.) and the like.
  • the above-mentioned mutant neurotonin may occur as a natural biological mutation, but such a naturally-mutated neurotonin c-terminal partial fragment also has
  • the “binding activity with Rock2” is defined based on the binding property with the ligand protein that binds to Rock2, and means that the binding property has affinity with Rock2. This binding activity is preferably equal to or greater than the binding activity with neurotonin.
  • the protein having such activity is included in the mutant protein.
  • the binding activity and binding site with Rock2 can be confirmed using a known binding analysis method such as a pull-down method.
  • the base sequence of the gene encoding Rock2 protein is known, and the sequence can be easily obtained through a public database such as GenBank (GenBank Accession No. 004850 etc.).
  • the present invention also provides a DNA encoding the C-terminal partial fragment or a mutant fragment thereof.
  • a DNA that encodes the above-mentioned 1/3 region on the C-terminal side and 1/4 region on the C-terminal side for example, DNA including the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5
  • a DNA that encodes the above-mentioned 1/3 region on the C-terminal side and 1/4 region on the C-terminal side for example, DNA including the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5
  • Is a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5 preferably Is a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 5
  • DNA encoding the C-terminal side 1/3 region and C-terminal side 1/4 region DNA encoding a protein hybridizing under stringent conditions and having a binding activity to the Rock2 protein is also included.
  • Such DNA can be obtained, for example, by a nucleic acid synthesis method using a DNA synthesizer generally used as a genetic engineering technique.
  • a primer specific to each gene is designed, and a PCR method is used to amplify the gene sequence using a PCR apparatus. Yes, it is possible.
  • the above method can be easily performed by those skilled in the art according to Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
  • known hybrids such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blot, etc., using the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 or a partial fragment thereof as a probe. It can be obtained from the cDNA library and the genomic library by the hybridization method. See “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” for information on how to create a cDNA library. 2nd ed. "(Cold Spring Harbor Press (1989)). In addition, a commercially available cDNA library and genomic library may be used.
  • Examples of stringent conditions in the above hybridization include 1 X SSC to 2 X SS 0.1% to 0.5% SDS and 42 ° C to 68 ° C. Includes conditions for pre-precipitation at 60-68 ° C for 30 minutes or more, followed by washing 4-5 times in 2 X SSC, 0.1% SDS at room temperature for 5-15 minutes It is done.
  • “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) and the like can be referred to.
  • the obtained DNA may be purified by a known method or using a kit.
  • a method using agarose gel by GENECLEAN QIAGEN (QIAGEN) and a method using DEAE-cellulose filter paper.
  • QIAGEN QIAGEN
  • DEAE-cellulose filter paper When using agarose gel, perform electrophoresis on agarose gel, cut out the DNA fragment from the agarose gel and purify it. If necessary, it can be confirmed that the expected gene is obtained by a conventional sequencing method. For example, it is possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer (eg, ABI PRISM (Applied Biosystems)).
  • an appropriate DNA sequencer eg, ABI PRISM (Applied Biosystems)
  • a neurotonin expression vector and a transformant containing the above vector can be prepared as follows.
  • the amplified region can be excised with a restriction enzyme, incorporated into an expression vector, and introduced into a host (such as E. coli) to obtain a transformant.
  • the cloned plasmid is digested with a restriction enzyme. If there is an appropriate restriction enzyme cleavage site in the above base sequence, a corresponding restriction enzyme may be used. Alternatively, if the desired DNA is obtained by PCR, It is possible to use a restriction enzyme corresponding to the restriction enzyme recognition sequence inserted into the limer.
  • DNA fragment after restriction enzyme digestion is purified by agarose gel electrophoresis.
  • This DNA fragment can be incorporated into an expression vector by a known method to obtain an expression vector containing DNA encoding the C-terminal partial fragment of neurotone.
  • This expression vector is introduced into a host to produce a transformant and used for expression of the target gene.
  • the expression vector and host are not particularly limited as long as they can express the target gene.
  • HEK293 cells, COS cells, CH0 cells, NIH cells, HeLa cells, etc. as hosts, such as Escherichia coli ), Bacteria such as Bacillus subtilis, yeast such as Saccharomyces cerevis iae, and the like.
  • Examples of the vector of the present invention include plasmids, butteriophages and viruses (including eukaryotic viruses) that are known in the field of genetic engineering or used in techniques described in the literature. It can be used in various known expression systems.
  • examples of preferable viral vectors include baculovirus, adenovirus and vaccinia virus.
  • examples of expression vectors include pCAGGS and pcDNA3 (INVITR0GEN CORPORATION).
  • pCAGGS and pcDNA3 IVITR0GEN CORPORATION
  • a ribosome method using PolyFect Transfection Reagent (QUAGEN) or Lipofectamine (GIBC0 BRL) can be used.
  • the gene of the present invention can be independently replicated in the host and at the same time includes a promoter and a transcription termination sequence.
  • An example of the expression vector is pGEX manufactured by Pharmacia. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as E. coli.
  • promoters derived from E. coli or phages such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter are used.
  • the as a method for introducing recombinant DNA into bacteria for example, the electoporation method or the salty calcium method can be used.
  • examples of expression vectors include YEpl3 and YCp50.
  • examples of the promoter include a gall promoter and a gallO plug motor.
  • Examples of the method for introducing the recombinant vector into yeast include the electopore position method, the spheroplast method, and the lithium acetate method.
  • the C-terminal partial fragment or a mutant fragment thereof can be produced by culturing the transformant and collecting the target protein from the resulting culture.
  • “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells.
  • the method of culturing the transformant in the medium is carried out according to the usual method used for culturing the host.
  • the target protein (C-terminal partial fragment or mutant fragment thereof) is produced in the cells or cells
  • the protein is extracted by disrupting the cells or cells.
  • the target protein is produced outside the cells or cells, use the culture solution as it is, or remove the cells or cells by centrifugation or the like.
  • general biochemical methods used for protein isolation and purification such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, affliction mouth matography, etc. alone or in combination as appropriate
  • the target protein can be isolated and purified.
  • the method for measuring the binding activity is as described above.
  • ANTI-FLAG M2 Affinity Gel For example, react with ANTI-FLAG M2 Affinity Gel, wash away non-specific proteins, and elute the target protein with FLAG peptide.
  • the collected protein is subjected to force rubamoyl methylation and then digested with a protein-degrading enzyme such as Lysyl Endopeptidase.
  • the peptide mixture is analyzed using HPLC and a mass spectrometer.
  • Ligation with partial fragments or mutant fragments thereof Combined proteins eg Rock2
  • the protein binding region in Rock2 can be determined using a known binding analysis method such as the pulldown method.
  • RNA examples include polynucleotides obtained by transcribing the DNA of the present invention
  • vertical DNA includes polynucleotides in which a promoter is incorporated upstream of the translation start point.
  • in vitro translation system a commercially available system such as Expressway TM system (Invitrogen), PURESYSTEM (registered trademark; Post Genome Research Institute), TNT system (registered trademark; Promega), etc. can be used.
  • the target peptide can be isolated and purified by using the above general biochemical methods alone or in combination. 5.
  • Antibodies against neurotonin are produced in patients with peripheral nerves other than Isaacs syndrome.
  • various antibodies against eurotonin are present in patient sera, the present inventors have found antibodies to the C-terminal portion of many patients in particular. These antibodies are also closely related to neurotonin physiology and are involved in symptoms. Therefore, antibodies that can bind to these C-terminal partial fragments of neurotonin can also exert some pharmacological action in Isaacs syndrome or peripheral neuropathy.
  • the above-mentioned antibody can be prepared by inoculating an animal with an antigen protein and immunizing it.
  • the animals used for this purpose include rabbits, sheep, mice, and rats, which are widely used.
  • monoclonal antibodies are particularly useful and preferred antibodies because they are uniform antibodies that specifically bind to a single epitope.
  • Monoclonal antibodies can be produced by using a hybridoma cell consisting of a lymphocyte from a spleen of an animal immunized with neurotonin or its C-terminal fragment as an antigen and a HAT-sensitive myeloma cell.
  • Conventional and established cell fusion techniques for preparation and cloning may be used, or known genetic recombination techniques may be used.
  • Humanized monoclonal antibodies can be obtained by production of chimeric or humanized antibodies by genetic recombination techniques including fusion of antibody cDNAs of animal cells from humans, rats, etc. with human antibody cDNAs. Examples include the use of human-derived cells / tumor cell cupoons, the fusion of mouse tumor cells with human cells, and the production of human antibodies using transgenic mice.
  • Examples of the above-mentioned antibody applications include screening agents for detecting neurotonin or its C-terminal partial fragment, diagnostic or therapeutic agents for Isaacs syndrome, research reagents, analytical reagents, immunoscreening reagents, etc. .
  • the screening method of the present invention comprises contacting a candidate substance with a C-terminal partial fragment of neurotonin, and then c-terminal part of the candidate substance. It includes the process of selecting the substance bound to the fragment.
  • the ligand or compound obtainable by the above screening method can be a neurotonin inhibitor. Therefore, the compound obtained by the above screening uses the bond with neurotonin,
  • a specific screening method is to bring a candidate substance into contact with a C-terminal partial fragment of neurotonin, and the binding activity between the C-terminal partial fragment of neurotonin and the candidate substance is known as: immunoprecipitation reaction, etc.
  • the measurement may be performed using the method.
  • contact means that the C-terminal partial fragment of neurotonin and the candidate substance are present in the same reaction system or culture system.
  • the C-terminal partial fragment of neurotonin is included.
  • Mixing the prepared solution with the candidate substance, adding the candidate substance to a culture vessel of a transformant encoding the C-terminal partial fragment of neurotonin, and culturing the transformant in the presence of the candidate substance Etc. are included.
  • the same Atsy system is performed in the absence of the candidate substance, and binding to the c-terminal side fragment of neurotonin in both the presence and absence of the candidate substance. It is preferable to determine whether the candidate substance has binding activity for the C-terminal partial fragment of neurotonin by measuring the activity and comparing the two.
  • neurotonin or the same fragment on the terminal end side is brought into contact with Rock2, and from among the candidate substances, neurotonin or its C-terminal fragment on the side and Rock2 are mixed. This includes the step of selecting a substance that regulates binding.
  • Modulating binding means promoting or suppressing the binding between neurotonin or its C-terminal partial fragment and Rock2, and as a substance that regulates binding, a substance having agonistic or antagonistic activity is used. Including.
  • the screened substance is useful as a therapeutic agent for peripheral neuropathy such as Isaacs syndrome and as a regulator of the formation of actin cytoskeleton in the treatment and development of neurological diseases, cancer metastasis, angiogenesis. Become.
  • Specific screening methods include binding of neurotonin or its C-terminal partial fragment to Rock2 with or without the addition of a candidate substance to an experimental system containing neurotonin or its C-terminal partial fragment. Just measure the activity and compare the two. If the binding activity changes, the candidate substance can be selected as an effective substance for regulating the binding of Rock2 to -eurotonin or its C-terminal partial fragment.
  • candidate substances are not particularly limited.
  • peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds (polymer or low molecular compounds), fermentation products, cell extracts Cell culture supernatant, plant extract Examples include effusion, tissue extracts of mammals (eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human), plasma, etc.
  • tissue extracts of mammals eg, mouse, rat, pig, ushi, hidge, monkey, human
  • plasma etc.
  • candidate substances may form salts
  • salts of candidate substances include salts with physiologically acceptable acids (for example, inorganic acids and organic acids) and bases (for example, metal acids). Used.
  • the formation regulator of actin cytoskeleton of the present invention comprises a C-terminal partial fragment of neurotonin as an active ingredient.
  • the actin cytoskeleton is one of the elements that make up the cytoskeleton.
  • the morphology is determined by the tissue structure of the cytoskeleton and cell adhesion, and the morphology changes remarkably depending on the state of the cell, for example, the cell cycle, cell canceration and cell differentiation.
  • the cytoskeleton also functions as the main device of cell movement, and cytoskeletal regulatory proteins are involved in the formation of the cytoskeleton.
  • Rock2 is a kinase that is activated by the low molecular weight G protein RhoA and acts on many substrates, and controls cell shape, cell movement, polarity, and adhesion through the control of the cell actin cytoskeleton. Is a possible factor. Therefore, interaction with Rock2 was found-Eurotonin or its C-terminal partial fragment is preferred as a regulator of actin cytoskeleton formation because it is involved in the control of the cell's actin cytoskeleton.
  • the fact that neurotonin or its C-terminal partial fragment is involved in the control of actin cytoskeleton in cells is a known method for the change of actin cytoskeleton when neurotonin or its C-terminal part is strongly expressed in cells. You can observe with. Specifically, lysophosphatidic acid (LPA), etc. are applied to cells that strongly express the above neutronin, etc.
  • F-actin which is the main actin of the cytoskeleton
  • F-actin which is the main actin of the cytoskeleton
  • Changes in the actin cytoskeleton may be observed with a fluorescence microscope.
  • neurotonin acts on the formation of the actin cytoskeleton due to the strong accumulation of the actin cytoskeleton at the periphery of the cell membrane.
  • eurotonin or a C-terminal partial fragment thereof is used as a pharmaceutical composition for regulating the formation of a lactocytoskeleton or as a research reagent for analyzing the formation of actin cytoskeleton. Can do.
  • Cell proliferative disease means a disease caused by proliferation of a benign or malignant cell population that appears morphologically different from surrounding tissues, such as rheumatoid arthritis, cancer, fibrosis, arteriosclerosis, Examples include Castleman's disease.
  • the diseases that can be targeted by the pharmaceutical composition include Isaacs syndrome, dystrophin abnormality, dilated cardiomyopathy, amyotrophic lateral sclerosis, cancer metastasis, cancer invasion, vascular invasion, myopathy, nipple Pachi, motor neuron disease, Alzheimer, Parkinson's disease, Huntington's disease, spinocerebellar degeneration, polyglutamine disease, Cushing disease, Addison disease, Nelson syndrome, glucocorticoid refractory, ACTH refractory, anorexia nervosa, Anterior pituitary dysfunction, hypothalamic dysfunction, ADH (antidiuretic hormone) secretion disorder, acromegaly, giantism, renal failure, insulin-dependent diabetes, Laron dwarfism, hyperthyroidism, hypothyroidism Hypopituitarism, pituitary dwarfism, bilateral adolescent (ovarian) disease, Turner syndrome, Klinefelter syndrome, ovarian atheroma, testi
  • HYPERLINK http: // mmh. Banyu. Co. Jp / mmhe2j / sec05 / ch069 / ch069c. Html" Temporal vasculitis, HYPERLINK "http: // mmh. Banyu. Co. Jp / mmhe2 j / sec05 h069 H069d. Html "Polymyalgia Rheumatic, HYPERLINK
  • Examples of subjects to which the pharmaceutical composition is administered include mammals. For example, in addition to humans, domestic animals such as horses, horses, hedges, goats, pets such as dogs, cats, mice, rats, and guinea pigs. Laboratory animals such as horseradish and magpies, but are not limited to these animals.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be either oral or parenteral. In the case of oral administration, for example, administration by tablet, capsule, granule, powder or syrup is possible. In the case of parenteral administration, injections, suppositories, eye drops, transpulmonary dosage forms (for example, using Nefryza), nasal dosage forms, transdermal dosage forms (for example, ointments, creams), etc. Is mentioned.
  • an injection form it can be administered systemically or locally by intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • pharmaceutically acceptable additives such as excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, and diluents.
  • excipients include starches such as potato starch and corn starch, lactose, crystalline cellulose, and calcium hydrogen phosphate.
  • lubricant examples include ethyl cellulose, hydroxypropenoresenorellose, hydroxypropinolemethyl senorelose, shellac, tanolec, carnaubarou, paraffin and the like.
  • binder for example, polybulurpyrrolidone, macrogol and the same compound as the above-mentioned excipient can be mentioned.
  • disintegrant examples include the same compounds as the above excipients and chemically modified starch / celluloses such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and cross-linked polyvinyl pyrrolidone.
  • the stabilizer examples include, for example, para-benzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol, and phenylolanol; benzalkonium chloride; and phenols / les such as phenol and cresol. It is done.
  • flavoring agent examples include sweeteners, acidulants, and fragrances that are usually used.
  • ethanol phenol, black mouth cresol, purified water, distilled water and the like can be used as a solvent for producing the liquid agent.
  • the surfactant or emulsifier examples include polysorbate 80, polyoxyl stearate 40, lauromacrogol and the like.
  • the above additives and the like are selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the purified c-terminal partial fragment of neurotonin, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof is used as a solvent (eg, physiological saline, buffer solution, glucose solution). Etc.) and added with Tween 80, Tween 20, gelatin, human serum albumin and the like.
  • it may be lyophilized to obtain a dosage form that dissolves before use.
  • sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the effective dose is, for example, about 0.1 mg to 100 mg per kg body weight per day, preferably 0.1 mg to: L. O mg.
  • the actin cytoskeleton formation regulator is not limited to these doses.
  • the C-terminal partial fragment of the present invention When used as a research reagent for analyzing the formation regulation of actin cytoskeleton, it can be applied both in vitro and in vivo.
  • the analysis target when used in vivo include insects (for example, Drosophila), animal bodies such as the aforementioned experimental animals, and zebrafish.
  • insects for example, Drosophila
  • animal bodies such as the aforementioned experimental animals
  • zebrafish zebrafish.
  • muscle cell extracts, muscle-derived cultured cells, etc. can be used.
  • the “research reagent” of the present invention may include a buffer solution, physiological saline and the like.
  • “reagents for research” may include auxiliary agents, special containers, instructions for use, and other necessary accessories as necessary.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples. [Example 1]
  • the NT interaction factor was searched for by the following procedure.
  • the NT gene SEQ ID NO: 1 obtained by elucidating the cDNA was polyFected into HEK293 cells.
  • Expression was carried out by transfection using Reagent (QUAGEN). The operation was performed according to the contents of the instruction manual, and the incubation time was 48 hours. After culturing the cells, the cells were lysed and centrifuged, and the supernatant was centrifuged. Thereafter, it was reacted with ANTI-FLAG M2 Affinity Gel to wash away non-specific proteins, and the target protein was dissolved with FLAG peptide. The recovered protein was intensively methylated with DTT and pseudoacetamide, then added with Lysyl Endopeptidase and incubated at 37 ° C. The obtained peptide mixture was used as an analysis sample, and measurement was performed using an HPLC system and a mass spectrometer.
  • Wash buffer 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 10% glycerol s 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 2 mM Na 3 V0 4 Protein G sepharose was washed with 1 ⁇ g / ml Aprotinin, 1 ⁇ g / ral Leupeptin, 1 ⁇ g / ml Pepstatin A) and suspended in 151 1 6xUrea SDS sample birffer.
  • Each suspension 10 // 1 was applied to SDS-PAGE, blocked with 5% skim milk, ct Rock2 antibody (1/10000 dilution) or HA-C antibody (1/1000 dilution) was added and shaken for 1 hour. Thereafter, the sample was washed with TBS-T, a-rabbit-IgG HRP diluted 1/5000 was added, shaken for 1 hour, washed with TBS-T, and detected by Home made ECL.
  • Each GST fusion protein (GST, GST-NT,-NT (N),-NT (M), -NT (C)) 3 / g and pulldown buffer (10 ⁇ 1 in Rock2 protein solution bound to glutathione sepharose beads 50 mM Tris-HCl ( PH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 ⁇ g / ml Aprotinin, 1 ⁇ g / ml Leupeptin, 500 ⁇ l of 1 ⁇ g / ml Pepstatin A)!], And a single binding reaction was performed while stirring at 4 ° C.
  • GST-NT represents the full length of the NT gene
  • -NT (N) represents 1-200 from the N-terminal side
  • -NT (M) represents 199-347
  • -NT (C) represents 335-511 amino acid residues (amino acid number is , Based on SEQ ID NO: 2).
  • Example 3 the binding region to Rock2 in NT was analyzed.
  • binding analysis was performed by the GST-pulldown method.
  • Rock2 is a kinase that is activated by RhoA, a low molecular weight G protein, and acts on many substrates. It can control cell morphology, cell movement, polarity, adhesion, etc. through the control of the actin cytoskeleton of cells. It is. Therefore, the present inventor predicted that NT, which was found to interact with Rock2, might not be involved in the control of the actin cytoskeleton of cells, and observed changes in the actin cytoskeleton with strong NT expression.
  • Rhizophosphatidic acid (LPA) (WAK0), a stimulus that can activate RhoA-Rock2 signaling, in cell lines in which pcDNA3-FLAG or FLAG-humanNT (hNT) is constitutively expressed in HEK293 cells.
  • LPA Rhizophosphatidic acid
  • hNT FLAG-humanNT
  • Rhodamin-FITC which specifically stains F-actin, which is the main factor in the cytoskeleton, is used.
  • the arthritis targeted in this example is collagen-induced arthritis (CIA).
  • CIA collagen-induced arthritis
  • the fact is that antibodies to type II collagen are detected in the blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis (RA).
  • the arthritis model of this example is based on this fact, and is an animal experimental model that develops multiple arthritis similar to rheumatoid arthritis (RA) by administering type II collagen to animals (Trethan DE et al., Exp Med., 146, 857-868 (1977)).
  • RA is a systemic chronic inflammatory disease with abnormal growth in the synovial tissue of the joints.
  • reorganization of the actin cytoskeleton by cell migration can be considered.
  • mNT knockout mice obtained at the time of preparation of the same generation ⁇ same age (10 weeks old) ⁇ same sex (male) wild type mice (WT) 2 (TN1-143, TN1-154), Oral knockout mice (+/-) 1 mouse (TN to 139), homozygous mouse (-/-) 2 mice (TN1-130, TN1-140), 8mg monoclonal for arthritis induction by tail injection Antibody cocktail (mAbs) (Chondrex Inc. monoclonal antibody cocktail kit for inducing arthritis) was administered. Three days later, 50 ⁇ g of LPS (lipopolysaccharide) was intraperitoneally administered to each individual, and scoring of swelling due to arthritis was continued for 8 days from the next day (Fig. 6).
  • LPS lipopolysaccharide
  • Fig. 7 For scoring, the limbs of the mouse were visually observed (Fig. 7), the degree of swelling of each mouse was scored, and the total was used as the arthritis score of each individual. The results were plotted to show the degree of arthritis progression, and the degree of arthritic malignancy due to genotype differences was compared (Fig. 8). In addition, Fig. 9 shows the results of preparing tissue samples of the extremities from the individuals whose final score was measured and observing the arthritic tissue.
  • the arthritis score in Figure 8 is a graph of the progression of arthritis, scoring the degree of daily swelling and plotting the total.
  • Monoclonal antibody From Day 5 of Tell administration (Day 2 of LPS administration) arthritis scores increased in the order of wild-type mice, heterozygous mice, and homozygous mice, and the ranking was maintained until the final day. Gross observation of arthritic swelling was expected to induce a worsening of arthritis due to mNT gene deficiency.
  • the substance that regulates the binding of Neurotonin or its C-terminal partial fragment to Rock2 and the c-terminal partial fragment of -eurotonin of the present invention is a cell proliferative disease, neurological disease, cancer metastasis, angiogenesis It can be used to develop therapeutic methods and therapeutic drugs.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)

Abstract

本発明は、以下の(a)又は(b)のタンパク質を提供する。(a) 配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質(b)配列番号４若しくは６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質。

Description

細胞機能調節物質のスクリ一ユング方法
技術分野
本発明は、 細胞機能調節物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
明
末梢神経障害は、 運動神経筋接合部終末において神経の興奮伝達の欠陥に由来 糸
する疾患であり、 筋疾患をも伴うことが多い。 このため、 末梢神経障害において 書
は感覚異常、 運動障害、 自律神経障害など種々の病態が現われることが知られて レ、る。 末梢神経障害の病因は多様であり、 詳細は不明な場合が多いが、 末梢神経 の VGKC (Voltage gated potassium channel)異常、 神経末端からの持続的なァセ チルコリンの放出を伴う神経 '筋疾患として、 Isaacs症候群が知られている。 この疾患は持続性筋線維活動症候群ともいわれており、 その臨床的特徴として、 四肢の筋硬直、 有痛性筋痙攣、 筋収縮後の弛緩困難 （例えば手指の開排制限等） 、 歩行障害、 発汗過多などの症状が観察されている。 Isaacs症候群の発症機序は 不明であるが、 胸腺腫との合併の存在、 血中に免疫複合体を有する症例が見られ ることから、 一つには自己免疫疾患機序が関与していることが想定されている。 このような Isaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治療方法として、 血漿 交換による方法、 ビタミン B12投与などが挙げられるが、 これらの治療法は対処 的な治療法に留まるものであり、 現在では根本的に治療し得る選択的かつ有効な 方法がないのが実情である。 本格的な高齢ィヒ社会の到来を間近に控えて、 上記末 梢神経障害に加えて、 糖尿病の合併症である末梢性多発性神経炎、 筋の全般的な 有痛性痺れなどにも有効な治療法の開発が待たれている。
本発明者は、 Isaacs症候群患者から単離された cDNAが、 ある特定のタンパク 質をコードして、 そのタンパク質が患者の血中に増加している事実を捉えた。 そ してさらに鋭意研究を進めた結果、 上記 cDNAおよびそれによりコードされるタ ンパク質は、 Isaacs症候群の病態に関わる因子と示唆された。 この同定された 分子をニューロトニンと呼び、 cDNAの塩基配列及びタンパク質のァミノ酸配列 情報 （ヒ ト由来） を決定した （国際公開 W002/064787号パンフレッ ト） 。
ニューロトニンは、 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であり (国際公開 W002/064787号パンフレッ ト） 、 上記患者の血液に見出される抗体と 結合する活性を有し、 さらに末梢神経細胞に存在する 「14- 3 - 3」 と呼ばれるタン パク質と結合することができる。
し力 し、 14- 3- 3タンパク質以外のタンパク質については、 どのような物質が ニューロトユンに結合するのかは明らかでなく、 機能も不明である。
発明の開示
本発明は、 ニューロトニンの c末端側部分断片及びその製造方法、 前記断片に 結合する物質をスクリーニングする方法、 ニューロトニン又はその C末端側部分 断片と Rock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方法、 及 びァクチン細胞骨格の形成調節剤を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、 ニューロトニン に結合する物質は Rock2タンパク質であることを見出し、 また、 ニューロトニン の Rock2への結合領域はそのアミノ酸配列の C末端側領域であることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 以下の（a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質 (b) 配列番号 4若しくは 6に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2 タンパク質との結合活性を有するタンパク質
( 2 ) 以下の（a)又は (b)のタンパク質をコードする DNA。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質 (b) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2 タンパク質との結合活性を有するタンパク質
(3) 以下の（a)又は（b)の DNA。
' (a) 配列番号 3若しくは 5に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 3若しくは 5に示される塩基配列からなる DNAに対し相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつ、 Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードする DNA
(4) (2) 又は （3) に記載の DNAを含有するベクター。
(5) (4) に記載のベクターを含む形質転換体。
(6) (5) に記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Rock2タンパ ク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、 Rock2タンパク質 と結合するタンパク質の製造方法。
(7) ニューロトニンの C末端側部分断片に候補物質を接触させ、 候補物質の 中から前記部分断片に結合する物質をスクリーニングする方法。
(8) 候補物質の存在下で、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2タンパク質とを接触させ、 候補物質の中から当該ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニング する方法。
(9) ニューロトニンが以下の（a)又は (b)のタンパク質である （8) 記載の方 法。
(a) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タンパク質 との結合活性を有するタンパク質
(10) ニューロトニンの C末端側部分断片が、 以下の（a)又は (b)のタンパク 質である （7) 又は （8) 記載の方法。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質 (b) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付カ卩されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2 タンパク質との結合活性を有するタンパク質
(1 1) ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨 格の形成調節剤。
(1 2) ニューロトニンが以下の（a)又は (b)のタンパク質である （1 1) 記載 の調節剤。
(a) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タンパク質 との結合活性を有するタンパク質
(1 3) ニューロトニンの C末端側部分断片が、 以下の（a)又は (b)のタンパク 質である （1 1) 記載の調節剤。 '
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質 (b) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2 タンパク質との結合活性を有するタンパク質
(14) ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨格 の形成を解析するための研究用試薬。
(1 5) ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨格 の形成異常に伴う疾患の治療用医薬組成物。
(1 6) 疾患が細胞増殖性疾患又は神経疾患である請求項 1 4記載の医薬組成 物。
本発明により、 ニューロトニンに結合し、 細胞機能調節活性を有する物質とし て Rock2タンパク質をスクリーニングすることができた。 また、 Rock2タンパク 質が結合する領域は、 ニューロトニンのアミノ酸配列領域のうち C末端側である ことが判明した。 Rock2タンパク質は、 低分子量 Gタンパク質 RhoAにより活性 化され多数の基質に作用するキナーゼであり、 ニューロトニンに結合してァクチ ン細胞骨格の形成に作用する因子、 すなわち、 細胞のァクチン細胞骨格の制御を 介して細胞形態や細胞の運動 ·極性 ·接着などを制御し得る因子である。 従って、 本発明のニューロトニンの C末端側部分断片、 及び、 ニューロトニン又はその C 末端側部分断片と Rock2との結合を調節する物質は、 細胞増殖性疾患、 神経疾患、 ガンの転移、 血管新生の治療法及び治療薬開発に有用である。
図面の簡単な説明
図 1は、 インビボにおけるニューロトニンと Rock2の結合解析を示す図である。 図 2は、 ニューロトニンにおける Rock2結合領域の決定を示す図である。
図 3は、 Rock2における-ユーロトニン結合領域の決定を示す図である。
図 4は、 ニューロトニン恒常化細胞系におけるァクチン骨格の観察を示す図で ある。
図 5は、 Rhoフアミリーによるァクチンフィラメントの制御を示す図である。 図 6は、 野生型 （WT) 及び-ユーロトニンノックアウト（NT - K0)マウスにおけ る関節炎モデルの評価方法を示す図である。
図 7は、 WT及ぴ NT- K0マウスにおけるマウスの四肢の闋節炎の様子を示す写 真である。
図 8は、 WT及ぴ NT - K0マウスにおける関節炎スコアを示すグラフである。
図 9は、 WT及ぴ NT- K0マウスにおける膝関節組織図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明するが、 以下の実施の形態は本発明を説明するため の例示であり、 本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施するこ とができる。 なお、 本明細書において引用した文献、 特許文献は、 参照として本 明細書に組み込むものとする。 また、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる 日本出願、 特願 2 0 0 6— 0 1 5 4 7 7号の開示内容を包含する。 本発明は、 ニューロトニンと結合する物質をスクリーニングした結果、
Rock2 (Rho - associated, coi led - coil containing protein kinase 2)と呼はれる タンパク質 （以下、 単に 「Rock2」 という） が得られたことにより完成されたも のである。 Rock2は、 低分子量 Gタンパク質 RhoAにより活性化され多数の基質 に作用するキナーゼである。 そして、 Rock2は、 ニューロトニンの C末端側に結 合し、 細胞のァクチン細胞骨格の形成に関与して細胞形態や細胞の運動 ·極性 · 接着などを制御する。 言い換えれば、 ァクチン細胞骨格の形成には、 ニューロト ニンの C末端側部分断片が重要な役割を果たすといえる。
従って、 本発明は、 ニューロトニンの C末端側部分断片及びその製造方法を提 供する。
また、 本発明は、 ニューロトニンの c末端側部分断片に結合する物質をスクリ 一二ングする方法を提供する。 さらに、 本発明は、 ニューロトニン又はその c末 端側部分断片と Rock2との結合を調節する物質をスクリーニングする方法を提供 する。 さらに、 本発明は、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァ クチン細胞骨格の形成調節剤を提供する。 1 . Rock2
厂 Rock2」 とは、 Rho - associated coi led - coi l forming protein kinase (Rock)のァイソフォームであり、 上述のように、 低分子量 Gタンパク質 RhoAに より活性化され多数の基質に作用するキナーゼである。 すなわち、 Rock2は、 Rhoの主要なエフェクターの一つであり、 GTP-Rhoにより活性化されるセリン 'スレオニ ンキナーゼである。 GTP- Rhoにより活性化された Rock2が、 ァクチンストレスファイバ 一やフォーカルコンタクトの形成の誘導や細胞遊走等に関与する事が報告されている。 このため、 Rock2は、 ニューロトニンの C末端側に結合し活性化することで、 細胞 のァクチン細胞骨格の再編成等を制御し、 細胞形態や細胞の運動 ·極性 ·接着な どを制御することができる。
ここで、「ァクチンストレスファイバー」とは、ァクチンと Π型ミオシンからなる会合体であ り、細胞に収縮力を働力せる繊維である。また、「フォーカルコンタクト」とは、細胞と細胞 外基質の接着部位のことである。さらに、 「細胞遊走」 とは、 器官形成、創傷治癒、 炎症、癌転移など多くの生命現象の要であり、細胞が遊走刺激に応じ、移動方向前後 で異なった形態を (極性)を獲得し、ァクチンや微小管などの細胞骨格を再編し方向性 を持った移動（遊走）を行う事をいう。
2 . ニューロトニン
ニュ^"ロトニン（Neurotonin、 「NT」 と略す場合もある） とは、 Isaacs症候群 患者の血清を利用するィムノスクリーニングにより取得することができるタンパ ク質であり、 SDS · PAGEにより求めた分子量は約 66kDaである。 ニューロトニン をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、 その配列情報は GenBank等の公 共データベースを通じて容易に入手することができる （GenBank Accession No. 顧— 176816等）。 ニューロトニンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 1、 二 ユーロトニンのアミノ酸配列を配列番号 2に示す。
本発明のニューロトニン部分断片は、 ニューロトニンの全長アミノ酸配列のう ち C末端側の断片である。 ヒ ト由来-ユーロトニンのアミノ酸残基は 511個存在 するため （配列番号 2 ) 、 全長を等分割すると、 N末端側領域として 1〜255番、 C末端側領域として 256〜511番の領域に分けることができる。 従って、 本発明 の部分断片は、 全長ァミノ酸配列のうち C末端側の 2分の 1の領域 （256〜511 番） 中に含まれる断片である。
また、 本発明の C末端側部分断片は、 上記全長の 1/2の長さに限定されるもの ではなく、 C末端側の 1/3の領域、 C末端側の 1/4の領域などを含むものである。 例えば、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 256〜511番、 260〜511番、 270〜511番、 280〜511番、 290〜511番、 300〜511番、 310〜511番、 320〜511 番、 330〜511番、 340〜511番、 350〜511番、 360〜511番、 370〜511番、 380〜 511番、 390〜511番、 400〜511番、 410〜511番、 420〜511番の領域を挙げるこ とができる。 伹し、 本発明においては、 上記の具体的にアミノ酸の位置を示した 断片に限定されるものではなく、 部分断片を発現させる際に遺伝子の塩基配列に 付加する任意配列 （例えば制限酵素部位） ゃコドンを考慮して、 アミノ酸領域を 適宜設計することが可能である。 例えば、 全長の 1/2の長さの C末端側部分断片 を設計する場合は、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列のうち、 256〜511番の 領域 （配列番号 4、 遺伝子の塩基配列では配列番号 3 ) を選択することができ、 全長の 1/3の長さの C末端側部分断片を設計する場合は、 配列番号 2に示される アミノ酸配列のうち、 335〜511番の領域 （配列番号 6、 遺伝子の塩基配列では 配列番号 5 ) を選択することができる。
また、 本発明は、 上記ニューロトニンの C末端側部分断片のアミノ酸配列のほ 力 \ 当該ァミノ酸配列において 1又は数個のァミノ酸が欠失、 置換又は付加され たアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タンパク質との結合活性を有する変異型タ ンパク質を提供する。 具体的には、 上記変異型タンパク質は、 （i) C末端側部分 断片のアミノ酸配列 （例えば配列番号 4又は配列番号 6 ) 中の 1〜10個 （好まし くは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (ii) C末端側部分断片のァミノ酸配列 （例えば配列番号 4又は配列番号 6 ) に 1 〜10個 （好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜3個） のアミノ酸が付カロ
(挿入を含む） したアミノ酸配列、 （iii) C末端側部分断片のアミノ酸配列 （例 えば配列番号 4又は配列番号 6 ) 中の 1〜10個 （好ましくは 1〜5個、 さらに好 ましくは 1〜3個） のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、 （iv) 上記（i)〜（iii)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。 但し、 C末端側 部分断片のァミノ酸配列は、 配列番号 4及び配列番号 6に示されるものに限定さ れるものではない。
このような 1又は数個のァミノ酸が欠失、 置換又は付加されたァミノ酸配列を コードする DNAは、 「Moleculai: Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) )、 「Current Protocols in Molecular BiologyJ (John Wiley & Sons (1987-1997) )、 Kunkel, Method.
Enzymol. 85： 2763-6 (1988)等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って 調製することができる。
また、 DNAの塩基配列に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法 等の公知手法により、 部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラタジーン社製） 、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製) 、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan - K、 Mutan-Super Express Km 等：タカラバィォ社製） 等を用いて行うことができる。 なお、 上記変異型ニューロトニンは、 天然の生物学的変異として発生すること があるが、 そのような天然に変異が生じたニューロトニンの c末端側部分断片も、
Rock2との結合活性を有する限り、 本発明に含まれる。
ここで、 「Rock2との結合活性」 とは、 Rock2に結合するリガンドタンパク質 との結合特性に基づいて定義され、 結合特性が Rock2との親和性を有することを 意味する。 この結合活性は、 ニューロトニンとの結合活性と同等もしくはそれ以 上が好ましい。 このような活性を有するタンパク質は、 上記変異型タンパク質に 含まれる。 Rock2との結合活性及び結合部位は、 プルダウン法等の公知の結合解 析方法を用いて確認することができる。 Rock2タンパク質をコードする遺伝子の 塩基配列は公知であり、 その配列は GenBank等の公共データベースを通じて容 易に入手することができる （GenBank Accession No. 應— 004850等）。
本発明はまた、 上記 C末端側部分断片又はその変異型断片をコードする DNAも 提供する。 具体的には、 上記 C末端側の 1/3の領域、 C末端側の 1/4の領域をコ 一ドする DNA (例えば配列番号 3又は 5に示される塩基配列も含む DNA) 、 好ま しくは、 配列番号 3又は 5に示される塩基配列からなる DNA、 及び、 上記 C末端 側の 1/3の領域、 C末端側の 1/4の領域をコードする DNAに対し相補的な塩基配 列からなる DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズし、 かつ、 Rock2タ ンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードする DNAも含まれる。
このような DNAは、 例えば、 遺伝子工学的手法として一般的に用いられている DNA合成装置を用いた核酸合成法により得ることができる。 また、 鎵型となる遺 伝子配列を単離又は合成した後に、 それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設 計し、 PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅する PCR法を用いて得ることも可 能である。 上記方法は、 Moleculer cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に従い、 当業者ならば容易に行うことができる。 あ るいは、 配列番号 3又は 5で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はそ の部分断片をプローブとして、 コロニーハイブリダィゼーシヨン、 プラークハイ ブリダイゼーシヨン、 サザンブロット等の公知のハイブリダィゼーシヨン法によ り、 cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリーから得ることができる。 cDNAラ イブラリーの作製方法については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 （Cold Spring Harbor Press (1989) )を参照することができる。 また、 巿販の cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
上記ハイブリダィゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、 たと えば、 1 X SSC〜2 X SS 0. 1%〜0. 5%SDS及び 42°C〜68°Cの条件が挙げられ、 よ り詳細には、 60〜68°Cで 30分以上プレハイプリダイゼーシヨンを行った後、 2 X SSC、 0. 1%SDS中、 室温で 5〜15分の洗浄を 4〜6回行う条件が挙げられる。 ハイブリダィゼーシヨン法の詳細な手順については、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ) 等を参照することができる。
得られた DNAは公知の方法により、 あるいはキットを用いて精製してもよい。 例えば、 GENECLEAN (フナコシ）、 QIAGEN (QIAGEN社）等によるァガロースゲルを用 いる方法、 DEAE -セルロース濾紙を用いる方法等がある。 ァガロースゲルを用い る場合には、 ァガロースゲル電気泳動し、 DNA断片をァガロースゲルより切り出 して精製する。 必要に応じて、 慣用の配列決定法により期待された遺伝子が得ら れていることを確認することができる。 例えば、 適当な DNAシークェンサ一 （例 'えば、 ABI PRISM (アプライドバイオシステムズ社)） を利用して配列を解析する ことが可能である。
3 . ベクター及ぴ形質転換体
ニューロトニンの発現ベクター及び上記ベクターを含む形質転換体は、 以下の ように作製することができる。
' 上記-ユーロトニン又はその C末端側部分断片をコードする DNAの塩基配列領 域の開始コドンの 5' 側と終止コドンの 3' 側にそれぞれ異なる制限酵素配列を 有するプライマーを設定し、 本領域を遺伝子増幅する。 増幅した領域を制限酵素 で切り出して発現ベクターに組み込み、 宿主 （大腸菌等） に導入して形質転換体 を得ることができる。
具体的には、 クローニングを行ったプラスミ ドを、 制限酵素を用いて消化する。 上記の塩基配列中に適当な制限酵素切断部位があれば、 それに対応した制限酵素 を用いればよい。 また、 別法として PCRにより目的の DNAを得た場合は、 PCRプ ライマー中に挿入された制限酵素認識配列に対応した制限酵素を用いることがで さる。
次に、 制限酵素消化後の DNA断片をァガロースゲル電気泳動により精製する。 この DNA断片を、 発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込み、 ニューロトェ ンの C末端側部分断片をコードする DNAを含有する発現用ベクターを得ることが できる。 この発現ベクターを宿主に導入し形質転換体を作製し、 目的遺伝子の発 現に供する。
発現ベクター及び宿主は、 目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限 定されず、 例えば、 宿主として HEK293細胞、 COS細胞、 CH0細胞、 NIH細胞、 HeLa細胞等の哺乳類細胞、 大腸菌 （Escherichia coli) 、 バチルス .ズブチリ ス（Bacillus subtilis) 等の細菌、 サッカロミセス 'セレビシェ（Saccharomyces cerevis i ae)等の酵母などが挙げられる。
本発明のベクターには、 遺伝子工学分野での公知の、 または文献に記載された 技術に用いられるプラスミ ド、 バタテリオファージおよびウィルス （真核ウィル スも含む） などが挙げられ、 これらのベクターは、 公知のさまざまな発現システ ムにおいて使用することができる。 好ましいウィルス性ベクターとしてバキュ口 ウィルス、 アデノウィルスおよびワクシニアウィルスなどを例示することができ る。
哺乳類細胞を宿主として用いる場合は、 発現ベクターとして例えば pCAGGSや pcDNA3 (INVITR0GEN CORPORATION)等が挙げられる。 例えば、 HEK293細胞に組換 え pCAGGS 発現ベクタープラスミ ドを導入するには、 PolyFect Transfection Reagent (QUAGEN)や、 Lipof ectamine (GIBC0 BRL社） を用いたリボソーム法を用 いることができる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、 本発明の遺伝子が宿主中で自立複 製可能であると同時に、 プロモーター、 転写終結配列を含む構成であることが好 ましい。 発現ベクターとしては、 例えばフアルマシア社の pGEX 等が挙げられる。 プロモーターとしては、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用 いてもよレヽ。 例えば、 trpプロモーター、 lac プロモーター、 PLプロモーター、 PRプロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられ る。 細菌への組み換え体 DNAの導入方法としては、 例えばエレクト口ポレーショ ン法ゃ塩ィ匕カルシウム法を用いることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、 発現ベクターとして、 例えば YEpl3、 YCp50 等が挙げられる。 プロモーターとしては、 例えば gall プロモーター、 gallOプ 口モーター等が挙げられる。 酵母への組換えベクターの導入方法としては、 例え ばエレクト口ポレーシヨン法、 スフエロプラスト法、 酢酸リチウム法等が挙げら れる。
4 . C末端側部分断片又はその変異型断片の製造
本発明において C末端側部分断片又はその変異型断片を製造するには、 前記形 質転換体を培養し、 得られる培養物から目的のタンパク質を採取すればよい。
「培養物」 とは、 培養上清、 培養細胞、 培養菌体、 又は細胞若しくは菌体の破 砕物のいずれをも意味するものである。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿 主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
培養後、 目的タンパク質 （C末端側部分断片又はその変異型断片） が菌体内又 は細胞内に生産される場合には、 菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質 を抽出する。 また、 目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用するか、 遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。 その 後、 タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、 例えば硫酸アン モ -ゥム沈殿、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ-ティーク口 マトグラフィ一等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、 目的のタン パク質を単離精製することができる。 なお、 変異型断片を製造する際には、 Rock2との結合活性を測定しておくことが好ましい。 結合活性の測定法は前記の 通りである。
例えば、 ANTI - FLAG M2 Affinity Gel等と反応させ、 非特異的なタンパク質を 洗浄除去してから、 目的タンパク質を FLAG peptide等で溶出する。 回収された タンパク質を力ルバモイルメチル化後、 Lysyl Endopeptidase等のタンパク質分 解酵素により消化して得られたぺプチド混合物を分析試料とし、 HPLCと質量分 析装置を用いて測定することにより、 C末端側部分断片又はその変異型断片と結 合するタンパク質 （例えば Rock2) を分析することができる。 Rock2におけるタ ンパク質結合領域は、 上記のように、 pulldown法等の公知の結合解析方法を用 いて決定することができる。
さらに、 本発明においては、 in vitro翻訳によるタンパク質合成を採用する ことができる。 この場合は、 RNAを鎳型にする方法と DNAを錡型にする方法 （転 写/翻訳） の 2通りの方法を用いることができる。 铸型 RNAとしては、 本発明の DNAを転写させたポリヌクレオチドが挙げられ、 铸型 DNAとしては、 翻訳開始点 の上流にプロモーターが組み込まれたポリヌクレオチドが挙げられる。 in vitro 翻訳システムは、 市販のシステム、 例えば Expressway™システム （Invitrogen 社） 、 PURESYSTEM (登録商標；ポストゲノム研究所） 、 TNTシステム（登録商 標； Promega社）などを用いることができる。 in vitro翻訳システムによるタン パク質合成後は、 上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせることによ り、 目的のペプチドを単離精製することができる。 5 . ニューロトニン C末端側部分断片に対する抗体
ニューロトニンに対する抗体は、 Isaacs症候群おょぴそれ以外の末梢神経患 者において産生されている。 したがって、 患者の血清にはュユーロトニンに対す る種々の抗体も存在するが、 本発明者らの研究により特にその C末端側部分に対 する抗体が多くの患者に見出されている。 これらの抗体もニューロトニンの生理 機能と密接に関連し、 症状に関与している。 このため、 これらのニューロトニン の C末端側部分断片に結合できる抗体もまた、 Isaacs症候群または末梢神経障 害において何らかの薬理学的作用を発揮することができる。
上記抗体は、 抗原となるタンパク質を動物に接種して免疫することにより調製 することができる。 そのための動物として、 広く利用されている、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 マウス、 ラットなどが挙げられる。
抗体の中で、 モノクローナル抗体は、 単一のェピトープに特異的に結合する均 一な抗体であるため、 特に有用かつ好ましい抗体である。 モノクローナル抗体の 製造は、 抗原となるニューロトニン又はその C末端側部分断片などで免疫した動 物脾臓からのリンパ球細胞と HAT感受性の骨髄腫細胞とのハイプリ ドーマ細胞を 調製しクローン化する従来の確立された細胞融合技術を利用してもよく、 また公 知の遺伝子組み換え技術を利用してもよい。 ヒト化モノクローナル抗体を得るに は、 マウス、 ラットなどからの動物細胞の抗体 cDNAとヒト抗体 cDNAとの融合を 含む遺伝子組み換え技術によるキメラ又はヒト化抗体の産生がある。 ヒト由来細 胞 ·腫瘍細胞ク口ーンの利用、 マウス腫瘍細胞とヒト細胞との融合、 トランスジ エニックマウス利用によるヒ ト抗体の産生方法も挙げられる。
上記抗体用途として、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片を検出するた めの検查薬、 Isaacs 症候群などの診断薬又は治療薬、 研究用試薬、 分析用試薬、 免疫スクリーニング用試薬などが挙げられる。
6 . スクリーニング方法
( 1 ) ニューロトニンの C末端側部分断片に結合する物質のスクリーニング方法 本発明のスクリーニング方法は、 ニューロトニンの C末端側部分断片に候補物 質を接触させ、 候補物質の中から c末端側部分断片に結合した物質を選択するェ 程を含むものである。 上記スクリーニング方法によって得られ得るリガンド又は 化合物は、 ニューロトニンの阻害剤となり得るものである。 従って、 上記のスク リーニングで得られる化合物は、 ニューロトニンとの結合を利用することにより、
Isaacs症候群などの末梢神経障害の治療用薬剤として使用することができる。 具体的なスクリ一二ング方法は、 ニューロトニンの C末端側部分断片に候補物 質を接触させ、 ニューロトニンの C末端側部分断片と候補物質との結合活性を、 ： 免疫沈降反応等の公知の方法を用いて測定すればよい。
上記スクリーニングによって得られた化合物として、 例えば Rock2を挙げるこ とができる。
ここで、 「接触」 とは、 ニューロトニンの C末端側部分断片と候補物質とを同 一の反応系又は培養系に存在させることを意味し、 例えば、 ニューロトニンの C 末端側部分断片が含まれた溶液と候補物質とを混合すること、 ニューロトニンの C末端側部分断片をコードする形質転換体の培養容器に候補物質を添加すること、 該形質転換体を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。 また、 一般的には、 同一のアツセィ系を候補物質の非存在下でも行い、 候補物 質の存在下の場合と非存在下の場合の両者におけるニューロトニンの c末端側部 分断片との結合活性を測定し、 両者を比較することにより、 候補物質がニューロ トニンの C末端側部分断片に対して結合活性を有しているか否かを判別すること が好ましい。
( 2 ) ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2との結合を調節する物 質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、 候補物質の存在下で、 ニューロトニン又はそ のじ末端側部分断片と Rock2とを接触させ、 候補物質の中から、 ニューロトニン 又はその C末端側部分断片と Rock2との結合を調節する物質を選択する工程を含 むものである。
「結合を調節する」 とは、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2 との結合を促進又は抑制することを意味し、 結合を調節する物質として、 ァゴニ スト活性又はアンタゴニスト活性を有する物質を含む。
スクリ一二ングされた物質は、 Isaacs症候群を始めとする末梢神経障害の治 療用薬剤及びァクチン細胞骨格の形成調節剤として神経疾患、 ガンの転移、 血管 新生の治療法及び治療開発に有用となる。
具体的なスクリーニング方法は、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片を 含む実験系に候補物質を添カ卩した場合と無添加の場合において、 ニューロトニン 又はその C末端側部分断片と Rock2との結合活性を測定し、 両者を比較すればよ い。 結合活性が変化した場合には、 その候補物質は-ユーロトニン又はその C末 端側部分断片と Rock2との結合を調節するのに有効な物質であるとして選択する ことができる。
( 3 ) 候補物質
本発明のスクリーニング方法において、 候補物質としては特に限定されるもの ではなく、 例えば、 ぺプチド、 タンパク質、 非ぺプチド性化合物、 合成化合物 (高分子又は低分子化合物） 、 発酵生産物、 細胞抽出液、 細胞培養上清、 植物抽 出液、 哺乳動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジ、 サル、 ヒトな ど） の組織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であって もよいし、 公知の化合物であってもよい。 これら候補物質は塩を形成していても よく、 候補物質の塩として、 生理学的に許容される酸 （例えば、 無機酸や有機酸 など） や塩基 （例えば、 金属酸など） などとの塩が用いられる。
7 . ァクチン細胞骨格の形成調節剤
本発明のァクチン細胞骨格の形成調節剤は、 ニューロトニンの C末端側部分断 片を有効成分として含むものである。
ァクチン細胞骨格とは、 細胞骨格を構成する要素のひとつである。 動物細胞で は、 細胞骨格の組織構造と細胞接着によってその形態が決定されており、 細胞の 状態、 例えば、 細胞周期、 細胞癌化及び細胞分化などによって著しくその形態が 変わる。 細胞骨格は細胞運動の主装置としても機能しており、 細胞骨格の形成に は細胞骨格調節タンパク質が関与している。
上記のように、 Rock2は低分子量 Gタンパク質 RhoAにより活性化され多数の 基質に作用するキナーゼであり、 細胞のァクチン細胞骨格の制御を介して細胞形 態や細胞の運動 ·極性 ·接着などを制御し得る因子である。 従って、 Rock2との 相互作用が見出された-ユーロトニン又はその C末端側部分断片は細胞のァクチ ン細胞骨格制御に関与するため、 ァクチン細胞骨格の形成調節剤として好ましい。 ニューロトニン又はその C末端側部分断片が細胞のァクチン細胞骨格制御に関 与することは、 ニューロトニン又はその C末端側部分を細胞内で強発現させたと きのァクチン細胞骨格の変化を公知の方法で観察すればよい。 具体的には、 上記 ニュートロニン等を強発現させた細胞にリゾフォスファチジン酸 （LPA) 等の
RhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激物質を添加して、 細胞膜を破 壊した後に、 細胞骨格の主要ァクチンである F-ァクチンを特異的染色し、 続い て細胞核を染色した細胞サンプルのァクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により 観察すればよい。 それにより、 ニュートロニンを強発現させた細胞では、 通常の 細胞と異なり、 細胞膜辺縁部に強いァクチン細胞骨格の集積が見られたこと力 ら、 ニューロトニンがァクチン細胞骨格の形成に作用することが示される。 また、 本発明においては、 ェユーロトニン又はその C末端側部分断片は、 ァク チン細胞骨格の形成調節のための医薬組成物、 あるいはァクチン細胞骨格の形成 を解析するための研究用試薬として使用することができる。
医薬組成物として使用する場合は、 ァクチン細胞骨格の形成異常にともなう疾 患を対象とすることができる。 このような疾患としては、 細胞増殖性疾患、 神経 疾患等がある。 「細胞増殖性疾患」 とは、 形態的に周囲の組織とは異なって現れ る良性又は悪性の細胞集団の増殖により生じる疾患を意味し、 例えば、関節リウマ チ、癌、線維症、動脈硬化、キャッスルマン病などが挙げられる。さらに、医薬組成物の 対象とすることができる疾患としては、 Isaacs症候群、 ジストロフィン異常症、 拡張 型心筋症、 筋萎縮性側索硬化症、 癌転移、 癌浸潤、 血管浸潤、 ミオパチ一、 ニュ 一口パチ一、 運動ニューロン疾患、 アルツハイマー、 パーキンソン病、 ハンチン トン病、 脊髄小脳変性症、 ポリグルタミン病、 Cushing病、 Addison病、 Nelson 症候群、 糖質コルチコィド不応症、 ACTH不応症、 神経性食欲不振症、 下垂体前 葉機能障害、 視床下部障害、 ADH (抗利尿ホルモン) 分泌異常症、 末端肥大症、 巨人症、 腎不全、 インスリン依存型糖尿病、 Laron小人症、 甲状腺機能亢進症、 甲状腺機能低下症、 下垂体機能低下症、 下垂体性小人症、 両側無睾丸 （卵巣） 症、 Turner症候群、 Klinefelter症候群、 卵巣蓑腫、 睾丸腫瘍、 副腎腫瘍、 Sheehan 症候群、 Pitl症候群、 アルドステロン産生性腺腫、 アルドステロン症、 Batter 症候群、 褐色細胞腫、 神経芽細胞腫、 特発性起立性低血圧症、 クレチン症， 橋本 病， 肥満症、 炎症性大腸炎、 脱髄性多発根神経炎、 結節性多発動脈炎 ·
HYPERLINK "http : //mmh. banyu. co. jp/mmhe2j/sec05/ch069/ch069c. html" 側頭動 脈炎、 HYPERLINK"http： //mmh. banyu. co. jp/mmhe2 j/sec05ん h069ん h069d. html" リゥマチ性多発筋痛、 HYPERLINK
"http： //mmh. banyu. co. jp/mmhe2 j/ sec05/ ch069/ ch069e. htm上 ヴェーグナ一肉芽 月重症、 ベーチヱット症候群、 骨粗鬆症などが挙げられる。
医薬組成物を投与する対象は、 哺乳動物が挙げられ、 例えばヒ トのほか、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ等の家畜、 ィヌ、 ネコ等の愛玩動物、 マウス、 ラット、 モル モッ ト、 ゥサギ等の実験動物が挙げられるが、 これらの動物に限定されるもので はない。 本発明の医薬組成物の投与形態は、 経口、 非経口投与のいずれでも可能である。 経口投与の場合は、 例えば錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤又はシロップ剤等に よる投与が可能である。 非経口投与の場合は、 注射剤、 座剤、 点眼剤、 経肺剤型 (例えばネフライザ一などを用いたもの）、 経鼻投与剤型、 経皮投与剤型 (例えば 軟膏、 クリーム剤)等が挙げられる。 注射剤型の場合は、 例えば点滴等の静脈内 注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 皮下注射等により全身又は局部的に投与するこ とができる。 これらの製剤は、 賦形剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壊剤、 安定剤、 矯味 矯臭剤、 希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。 賦形剤としては、 例えば、 バレイショデンプン、 トウモロコシデンプン等のデ ンプン、 乳糖、 結晶セルロース、 リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。 滑沢剤 （コーティング剤） としては、 例えば、 ェチルセルロース、 ヒ ドロキシ プロピノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロピノレメチルセノレロース、 セラック、 タノレク、 カルナウバロゥ、 パラフィン等を挙げることができる。
結合剤としては、 例えばポリビュルピロリ ドン、 マクロゴール及び前記賦形剤 と同様の化合物を挙げることができる。
崩壊剤としては、 例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナ トリゥム、 カルボキシメチルスターチナトリ ゥム、 架橋ポリ ビニルピロリ ドン等 の化学修飾されたデンプン ·セルロース類を挙げることができる。
安定剤としては、 例えばメチルパラベン、 プロピルパラベン等のパラォキシ安 息香酸エステル類；クロロブタノール、 ベンジルアルコール、 フエ-ルェチルァ ノレコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニゥム ； フエノール、 クレゾール等 のフエノ一/レ類が挙げられる。
矯味矯臭剤としては、 例えば通常使用される、 甘味料、 酸味料、 香料等を挙げ ることができる。
また、 液剤を製造するための溶媒としては、 エタノール、 フエノール、 クロ口 クレゾール、 精製水、 蒸留水等を使用することができる。
界面活性剤又は乳化剤としては、 例えば、 ポリソルベート 80、 ステアリン酸 ポリォキシル 40、 ラウロマクロゴール等を挙げることができる。 上記添加物等は、 本発明の医薬組成物の剤型に応じて上記の中から単独で又は 適宜組み合わせて選ばれる。 例えば、 注射用製剤として使用する場合、 精製され たニューロトニンの c末端側部分断片、 その薬学的に許容可能な塩、 又はこれら の水和物を溶剤（例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等）に溶解し、 これに Tween 80、 Tween 20、 ゼラチン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用する ことができる。 あるいは、 使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したもの であってもよい。 凍結乾燥用賦形剤としては、 例えば、 マンニトール、 ブドウ糖 等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤 型によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜選択する。 有効投 与量は、 例えば一日にっき体重 1kgあたり約 0. 1 mg〜100 mg、 好ましくは 0· 1 mg〜： L. O mgである。 但し、 上記ァクチン細胞骨格の形成調節剤はこれらの投与 量に制限されるものではない。
本発明の C末端側部分断片を、 ァクチン細胞骨格の形成調節を解析するための 研究用試薬として使用する場合は、 in vitro及び in vivoのいずれにおいても 適用が可能である。 in vivoで使用する場合の解析対象は、 昆虫 （例えばショウ ジヨウバエ） 、 前記した実験動物などの動物体のほか、 ゼブラフィッシュなどが 挙げられる。 in vitroの場合は、 筋細胞の抽出液、 筋肉由来培養細胞などを使 用することができる。
ァクチン細胞骨格の形成調節の解析は、 in vitroの場合は培養細胞の蛍光フ ァロイジン染色、 in vivoの場合は血管新生、 癌転移、 癌浸潤の変化などを指標 に行うことができる。
ここで、 本発明の 「研究用試薬」 には、 緩衝液、 生理食塩水等を含めることが できる。 さらに 「研究用試薬」 には、 必要に応じて、 補助剤、 専用容器、 使用説 明書、 その他必要なアクセサリーを含めることができる。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。 [実施例 1 ]
新規 NT相互作用因子の探索
本実施例では、 機能未知因子 Neur0tonin (NT)の生体内における役割を明らか にするため、 NT相互作用因子の探索を以下の手順で行った。 Issacs症候群患者 からの血清を利用するィムノスクリーニング手法により、 神経細胞由来の cDNA ライブラリーから特定の cDNAを分離し、 それを解明することにより入手した NT 遺伝子 （配列番号 1 ) を HEK293細胞に PolyFect Transfection
Reagent (QUAGEN)を用いてトランスフエクシヨンし、 発現させた。 操作は取り扱 い説明書の内容に準じ、 培養時間は 48 時間とした。 培養終了後の細胞を溶解後、 遠心分離し、 上清を遠心濾過した。 その後 ANTI- FLAG M2 Affinity Gelと反応さ せ、 非特異的なタンパク質を洗浄除去し、 目的タンパク質を FLAG peptideで溶 出した。 回収されたタンパク質を DTT、 ョードアセトアミドを用いて力ルバモイ ルメチル化した後、 Lysyl Endopeptidaseを添加して 37°Cで一晚ィンキュベート した。 得られたペプチド混合物を分析試料とし、 HPLCシステムと質量分析装置 を用いて測定を行った。
その結果、 NTに結合する物質として Rho- associated, coiled - coil
containing protein kinase 2 (Rock2) を得に。
[実施例 2 ]
NTと Rock2の細胞内相互作用
質量分析装置により NT相互作用因子として同定された Rock2が NTと細胞内で 結合活性を示すことを確認するため、 HEK293細胞に哺乳類培養細胞発現べクタ 一 pCAGGSまたは HAタグを付加している NT発現ベクター（HA-NT)を一過性に導入 した HEK293細胞を作製し、 この細胞抽出液を Lysis buffer (20 mM Hepes (pH7. 9) , 420 mM NaCl, 10% glycerol , 0. 5% NP-40, 0. 5 mM DTT， 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 2 mM Na3V04, 1 μ g/ml Aprotinin, 1 μ g/ml Leupeptin, 1 μ g/ml Pepstatin A) により回収した。 回収産物に、 a; Rho kinase Alpha (BL964)抗体 ( a Rock2抗体） 4 をカ卩え、 4°Cでローテ一ターにて撹拌しながら 2時間反応 させた。 そこに protein G sepharose 30 μ 1 (50% slurry) を加えて 4°C'でロー テーターにて撹拌しながらさらに 2時間反応させた。
その後、 Wash buffer (50 mM Tris- HC1 pH7. 5 、 10% glycerol s 150 mM NaCl , 0. 1 % NP-40, 0. 5 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM NaF, 2 mM Na3V04, 1 μ g/ml Aprotinin, 1 μ g/ral Leupeptin, 1 μ g/ml Pepstatin A) で protein G sepharose を洗浄し、 15 1の 6xUrea SDS sample birfferに懸濁した。 各懸濁 液 10 // 1を SDS-PAGEにかけ、 5 % スキムミルクでブロッキング後、 ct Rock2抗 体 （1/10000希釈） または ひ HA- C抗体 （1/1000希釈） を加え 1 時間振盪した。 その後サンプルを TBS- Tで洗浄した後に、 1/5000希釈した a - rabbit- IgG HRP を加え 1時間振盪後、 TBS- T で洗浄し Home made ECL により検出した。
その結果、 HA-NTを一過性発現させた細胞において a RoCk2抗体による免疫沈 降により、 共沈された HA- NTのバンドが確認された （図 1 ) 。 よって、 細胞内に おいて NTと Rock2の相互作用が示された。 [実施例 3 ]
NTにおける Rock2結合領域の決定
本実施例では、 NTにおける Rock2の結合領域を決定するため、 GST- pulldown 法により結合解析を行った。 TNT Coupled Reticulocyte Lysate
Systems (promega)を用レヽた in vitro translation fこより 35S ラベノレされた
Rock2タンパク質溶液 10 μ 1に glutathione sepharose beads に結合させた各 GST融合タンパク質 （GST, GST-NT, - NT (N)， - NT (M)， -NT (C) ) 3 / gと pulldown buffer (50 mM Tris-HCl (PH7. 5) , 150 mM NaCl, 0. 5% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 μ g/ml Aprotinin, 1 μ g/ml Leupeptin, 1 μ g/ml Pepstatin A) を 500 1力!]え、 4°Cで撹拌しながら一晚結合反応を行つ た。 GST- NTは NT遺伝子全長、 -NT (N)は N末端側から 1-200、 - NT (M)は 199-347、 - NT (C)は 335 - 511アミノ酸残基を表す （アミノ酸番号は、 配列番号 2を基準） 。 その後、 Pulldown bufferにより glutathione sepharose beadsを 5回洗浄し、 4 X SDS sample bufferを加えて 100°Cでボイルしたサンプルを SDS- PAGEにより 展開し、 autoradiographyにより 35S- Rock2と各 NT欠失変異体間の結合活性を検 出した。
その結果、 GST-NT (C)による pulldownにおいて 3¾-Rock2のバンドが検出され た （図 2 ) 。 よって、 Rock2は NTの C末端領域を介して相互作用することが示 された。
[実施例 4 ]
Rock2における NT結合領域の決定
実施例 3では NTにおける Rock2への結合領域の解析を行つたが、 本実施例で は、 Rock2における NTの結合領域を決定するため、 GST-pulldown法により結合 解析を行った。
TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems 用いた m vitro translation により 35S ラベルされた NTタンパク質溶液 10 z lに、 glutathione sepharose beads に結合させた各 GST融合タンパク質 （GST， GST- Rock2， -Rock2 (N) , - Rock2 (C) ) 3 gと pulldown buffer (50 mM Tris-HCl (pH7. 5) , 150 mM NaCl、 0. 5% NP-40, 1 raM EDTA, 1 mM DTT， 1 mM PMSF, 1 μ g/ml Aprotinin, 1 μ g/ml Leupeptin, 1 μ g/ml Pepstatin A) を 500 μ 1加え、 4°Cで撹拌しながら終夜結合 反応を行つた。 「- Rock2 (N)」 は Rock2のァミノ酸配列の 1-708、 「- Rock2 (C)」 は Rock2のアミノ酸配列 698- 1388番のアミノ酸残基を表す （いずれも、 Accessi on番号麗_004850のァミノ酸配列を基準）。
その後、 pulldown bufferにより glutathione sepharose beadsを 5回洗净し 4xSDS sample bufferを加えて 100°Cでボイルしたサンプルを SDS-PAGEにより展 開し、 autoradiographyにより 3¾- NTと各 Rock2欠失変異体間の結合活性を検出 した。
その結果、 GST - Rock2 (C)の pulldownにおいて GST - Rock2と同程度の 35S-NTの バンドが検出された （図 3 ) 。 よって、 Rock2は NTの C末端領域により強く結 合活性を有することが示された。
[実施例 5 ] NT stable cell line におけるァクチン細胞骨格の観察
Rock2は、 低分子量 Gタンパク質 RhoAにより活性化され多数の基質に作用す るキナーゼであり、 細胞のァクチン細胞骨格の制御を介して細胞形態や細胞の運 動 ·極性 ·接着などを制御し得る因子である。 そこで本発明者は、 Rock2との相 互作用が見出された NTが細胞のァクチン細胞骨格制御に関与し得るのではない 力 と予想し、 NT強発現におけるァクチン細胞骨格の変化を観察した。 HEK293細 胞に pcDNA3-FLAGまたは FLAG-humanNT (hNT)を恒常的に発現させた細胞株に対 して、 RhoA-Rock2のシグナル伝達系を活性化し得る刺激であるリゾフォスファ チジン酸 （LPA) (WAK0) を無血清培地に終濃度 10 ί Μで添加した。 37°Cにて 30 分間培養後、 細胞を 3. 7% ホルムアルデヒドにより固定した。 細胞膜破壌のため、 固定した細胞に 0. 1% TritonX- 100/PBS (-)を 30分間処理し、 1% BSA/0. 1%
Tween20/PBS (-)により 30分間ブロッキングを行った。 その後、 細胞骨格の主要 ァクチンである F -ァクチンを特異的染色する Rhodamin- FITC (SIGMA)を 50
U g/ lにて用いて 40分間細胞を染色し、 続いて DAPIにより細胞核を染色した 細胞サンプルのァクチン細胞骨格の変化を蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、 pcDNA3- FLAG発現株と FLAG- hNT発現株において、 LPA処理を行った 際の Phalloidin- FITC染色の像を比較すると、 pcDNA3- FLAG発現株ではァクチン 細胞骨格が細胞全体に広がつているのに対し、 FLAG-hNT発現株では細胞膜辺縁 部に強いァクチン細胞骨格の集積が観察された （図 4 ) 。 本実験で NT発現細胞 株において観察されたァクチン局在は、 Raclの活性化による葉状仮足 （ラメリ ポディァ） を形成する際に見られるァクチンの細胞局在に類似していると思われ る （図 5中央 （三木裕明/編， わかる実験医学シリーズ 「細胞骨格 ·運動がわか る一その制御機構とシグナル伝達ネットワーク」 ， 羊土社， 2 0 0 4ノ 3発行， p p 2 1 , 図 1 ) ) 。 Racl活性と RhoA活性は拮抗関係にあることから、 NT 発現により RhoA経路から Racl経路に活性が傾いた結果、 ァクチンの細胞局在 化が観察された事が予想される。
以上の結果から、 NTの強発現がァクチン細胞骨格の形成に作用し得ることが 示された。 + [実施例 6 ]
NTノックアウトマウスにおける関節炎モデルの作製と評価
raNT (マウスニューロト-ン） ノックァゥトマウスにおける関節炎に対する応 答性を検討するため関節炎モデルマウスを作製し、 その進行状況を野生型、 へテ 口ノックアウト、 及びホモノックアウトマウスにおいて比較した。 本実施例で対 象とする関節炎はコラーゲン誘導性関節炎 （CIA) である。 ヒ ト関節リウマチ (RA) 患者の血液や関節液中に II型コラーゲンに対する抗体が検出されるとい う事実がある。 本実施例の関節炎モデルは、 この事実に基づくもので、 動物に II 型コラーゲンを投与する事によりヒ ト関節リウマチ （RA) によく似た多発性 関節炎を発症させる動物実験モデルである （Trethan D. E. et al. , Exp Med. , 146， 857-868 (1977) ) 。 RA は、 関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性 の慢性炎症性疾患である。 このような滑膜組織の増殖の一因として細胞遊走によ るァクチン細胞骨格の再編成が考えられる。 このため、 本実施例では、 本発明の 細胞機能調節物質との関連を調べるため、 検討を行った。
具体的には、 次のようにして検討を行った。 mNT ノックアウトマウス （TN- K0) 作製時に得られた同世代 ·同週齢 （10週齢） ·同性 （雄） の野生型マウス (WT) 2匹 (TN1-143, TN1-154)、 へテ口ノックアウトマウス (+/- ) 1匹 (TNト 139)、 ホモノックァゥトマウス（- /- ) 2匹（TN1 - 130， TN1- 140)に対してそれぞれ尾静注 により 8mg の関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテル （mAbs) (Chondrex社 関節炎惹起用モノクローナル抗体カクテルキット） を投与した。 その 3日後、 各 個体に 50 μ gの LPS (リポポリサッカライド） を腹腔内投与し、 翌日より関節炎 による腫脹のスコアリングを 8日間継続して行った （図 6 ) 。
スコアリングはマウスの四肢を肉眼的に観察し （図 7 ) 、 それぞれの腫張の程 度をスコアィ匕し、 合計を各個体の関節炎スコアとした。 その結果をプロットし関 節炎進行の程度をグラフ化し、 遺伝子型の違いによる関節炎悪性ィヒの程度を比較 した （図 8 ) 。 また、 最終スコアを計測した個体より四肢の組織標本を作製し、 関節炎組織の観察を行った結果を図 9に示す。
上述のように、 図 8の関節炎スコアは、 毎日の腫脹の程度をスコア化し合計を プロットし、 関節炎の進行をグラフ化したものである。 モノクローナル抗体カク テル投与 5日目 （LPS投与 2日目） より、 関節炎スコアは野生型マウス、 ヘテロ マウス、 ホモノックアウトマウスの順に高くなり、 最終日までその順位は維持さ れた。 関節炎腫脹の肉眼的観察においては、 mNT遺伝子の欠損により関節炎の悪 性化が誘導される傾向が予想された。
この結果は、 N Tノックアウトマウスでみられた炎症刺激による関節炎悪性化 は、 ニューロトニンの C末端側部分により Rock2が活性化する経路を経ることで 制御されるはずのァクチン細胞骨格がニューロトニンの欠損により制御されず、 さらに、 細胞遊走が促進される結果、 細胞増殖が生じ、 関節炎が悪性化したもの と予想される。 すなわち、 ニューロトニン C末端側部分断片は関節炎等の炎症反 応に対し抑制的に作用し得るタンパク質である事が示された。 産業上の利用可能性
本発明の-ユーロトニンの c末端側部分断片、 及び、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2との結合を調節する物質は、 細胞増殖性疾患、 神経疾 患、 ガンの転移、 血管新生の治療法及び治療薬開発に利用できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（a)又は (b)のタンパク質。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 4若しくは 6に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タ ンパク質との結合活性を有するタンパク質
2 . 以下の（a)又は（b)のタンパク質をコードする DNA。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 4若しくは 6に示されるアミノ酸配列において 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、 置換若しくは付カ卩されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タ ンパク質との結合活性を有するタンパク質
3 . 以下の（a)又は（b)の DNA。
(a) 配列番号 3若しくは 5に示される塩基配列を含む DNA
(b) 配列番号 3若しくは 5に示される塩基配列からなる DNAに対し相補的な塩 基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、 Rock2タンパク質との結合活性を有するタンパク質をコードする DNA
4 . 請求項 2又は 3に記載の DNAを含有するベクター。
5 . 請求項 4に記載のべクターを含む形質転換体。
6 . 請求項 5に記載の形質転換体を培養し、 得られる培養物から Rock2タンパ ク質との結合活性を有するタンパク質を採取する工程を含む、 Rock2タンパク質 と結合するタンパク質の製造方法。
7 . ニューロトニンの C末端側部分断片に候補物質を接触させ、 候補物質の中 から前記部分断片に結合する物質をスクリ一二ングする方法。
8 . 候補物質の存在下で、 ニューロトニン又はその C末端側部分断片と Rock2 タンパク質とを接触させ、 候補物質の中から当該ニューロトニン又はその C末端 側部分断片と Rock2タンパク質との結合を調節する物質をスクリーニングする方 法。
9 . ニューロトニンが以下の（a)又は (b)のタンパク質である請求項 8記載の方 法。
(a) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付カ卩されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タンパク質と の結合活性を有するタンパク質
1 0 . -ユーロトニンの C末端側部分断片が、 以下の（a)又は (b)のタンパク質 である請求項 7又は 8記載の方法。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個の アミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タ ンパク質との結合活性を有するタンパク質
1 1 . ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨格の 形成調節剤。
1 2 . ニューロトニンが以下の（a)又は（b)のタンパク質である請求項 1 1記載 の調節剤。
(a) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 2に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タンパク質と の結合活性を有するタンパク質
1 3 . ニューロトニンの C末端側部分断片が、 以下の（a)又は（b)のタンパク質 である請求項 1 1記載の調節剤。
(a) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列を含むタンパク質
(b) 配列番号 4若しくは 6に示されるァミノ酸配列において 1若しくは数個の ァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列を含み、 かつ、 Rock2タ ンパク質との結合活性を有するタンパク質
1 4 . ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨格の 形成を解析するための研究用試薬。
1 5 . ニューロトニン又はその C末端側部分断片を含む、 ァクチン細胞骨格の 形成異常に伴う疾患の治療用医薬組成物。
1 6 . 疾患が細胞増殖性疾患又は神経疾患である請求項 1 4記載の医薬組成物。
PCT/JP2007/051338 2006-01-24 2007-01-23 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 WO2007086545A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006-015477 2006-01-24
JP2006015477A JP2009089601A (ja) 2006-01-24 2006-01-24 細胞機能調節物質のスクリーニング方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007086545A1 true WO2007086545A1 (ja) 2007-08-02

Family

ID=38309324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/051338 WO2007086545A1 (ja) 2006-01-24 2007-01-23 細胞機能調節物質のスクリーニング方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2009089601A (ja)
WO (1) WO2007086545A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015159766A (ja) * 2014-02-27 2015-09-07 国立大学法人京都大学 クッシング症候群の検査方法、検査用バイオマーカー及び治療剤

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002233383A (ja) * 2001-02-09 2002-08-20 Locomogene Inc ニューロトニンおよびその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002233383A (ja) * 2001-02-09 2002-08-20 Locomogene Inc ニューロトニンおよびその利用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009089601A (ja) 2009-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4074645B2 (ja) 腫瘍細胞成長阻害のための組成物及び方法
JP2002502590A (ja) Ｃａｒｄ関連蛋白質ファミリーの新規分子とその使用
JP2001526914A (ja) ヒト・調節タンパク質
JP2001514657A (ja) 成長因子受容体結合タンパク質
JP2001507220A (ja) アポトーシス関連カルシウム結合タンパク質
JP2001503628A (ja) 新規なヒスタミンｈ２受容体
JP2001509018A (ja) Ｐ５３応答マウス遺伝子ｅｉ１２４に類似なｄｎａがコードするヒトアポトーシス関連タンパク質
WO2007086545A1 (ja) 細胞機能調節物質のスクリーニング方法
JP4201712B2 (ja) Ｇｉｐ、グッドパスチャー抗原結合タンパク質と相互作用する転写因子活性を備えたポリペプチドのファミリー
US20230272020A1 (en) Modified semaphorin 3a, compositions comprising the same and uses thereof
JP2001503621A (ja) ヒトＰ▲下２ｘ▼プリン受容体
US7141365B2 (en) Methods for diagnosing a mucin production associated disease condition
JP2002511735A (ja) アダプター蛋白質ｆｒｓ２および関連する物質および方法
JP2003502033A (ja) ヒトポリ（ａｄｐ−リボース）ポリアミラーゼ２材料および方法
US7179898B1 (en) Human vanilloid receptor-like receptor
JP2002527028A (ja) ヒトアポトーシス調節タンパク質
JP2001509015A (ja) ヒト塩素イオンチャネルタンパク質（ｈｃｃｐ）
EP1369478A1 (en) Novel scavenger receptor class a protein
JP2002505104A (ja) レクトメディン物質および方法
JP2003503062A (ja) タンキラーゼ２物質および方法
US20040038895A1 (en) Inflammation related G-protein coupled receptor
US6455681B1 (en) DNA molecules encoding single strand gap response proteins involved in activation of a DNA repair/cell cycle checkpoint pathway
JP2001512968A (ja) ヒトｐ２４小胞タンパク質
WO2001077166A1 (fr) Nouveaux peptides a activite physiologique et leur utilisation
US20030165506A1 (en) Novel alpha-catenin expressed in heart and testis

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07707569

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP