JPWO2005100567A1 - グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 - Google Patents
グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2005100567A1 JPWO2005100567A1 JP2006512373A JP2006512373A JPWO2005100567A1 JP WO2005100567 A1 JPWO2005100567 A1 JP WO2005100567A1 JP 2006512373 A JP2006512373 A JP 2006512373A JP 2006512373 A JP2006512373 A JP 2006512373A JP WO2005100567 A1 JPWO2005100567 A1 JP WO2005100567A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- protein
- seq
- present
- represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 537
- 102000016285 Guanine Nucleotide Exchange Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 86
- 108010067218 Guanine Nucleotide Exchange Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 429
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 393
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 393
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 393
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 164
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 107
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 99
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 88
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 86
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 72
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 72
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 102000011068 Cdc42 Human genes 0.000 claims description 75
- 108050001278 Cdc42 Proteins 0.000 claims description 75
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 70
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 66
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 65
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 31
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 29
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 25
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 25
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 23
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 230000004853 protein function Effects 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 abstract description 148
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 abstract description 148
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 15
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 abstract description 14
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 abstract description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 400
- 239000002585 base Substances 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 34
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 30
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 28
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 26
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 23
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 22
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K GDP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-K 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 17
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 17
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 13
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 101150086838 CDC42 gene Proteins 0.000 description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 102000006271 p21-Activated Kinases Human genes 0.000 description 10
- 108010058266 p21-Activated Kinases Proteins 0.000 description 10
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101150058540 RAC1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100022122 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Human genes 0.000 description 7
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 5
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 208000036764 Adenocarcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 206010030137 Oesophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 208000028653 esophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 101800001318 Capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102100027609 Rho-related GTP-binding protein RhoD Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000016515 regulation of signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YTOPFCCWCSOHFV-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethyl-4-tridecylmorpholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCN1CC(C)OC(C)C1 YTOPFCCWCSOHFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100023093 Kalirin Human genes 0.000 description 1
- 101710100270 Kalirin Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 102100033204 Rho guanine nucleotide exchange factor 28 Human genes 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 229920003123 carboxymethyl cellulose sodium Polymers 0.000 description 1
- 229940063834 carboxymethylcellulose sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N diphenylphosphoryl azide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(=O)(N=[N+]=[N-])C1=CC=CC=C1 MKRTXPORKIRPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000003221 ear drop Substances 0.000 description 1
- 229940047652 ear drops Drugs 0.000 description 1
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108040001860 guanyl-nucleotide exchange factor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001341 hydroxy propyl starch Substances 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013828 hydroxypropyl starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N n-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide Chemical compound C1=CC2CC1C1C2C(=O)N(O)C1=O ZUSSTQCWRDLYJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000005853 oncogenic activation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 238000011170 pharmaceutical development Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000022932 ruffle assembly Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
- Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
低分子量GTP結合蛋白質の1グループであるRhoファミリー蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)活性を有する新規な蛋白質をコードする遺伝子、すなわち配列番号1、3若しくは5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドの相同物、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターを含む形質転換体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に対する抗体、前記ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能および/または発現を阻害する化合物の同定方法、疾患の判定方法、医薬組成物および試薬キットを提供した。
Description
本発明は、低分子量GTP結合蛋白質の1グループであるRhoファミリー蛋白質に対するグアニンヌクレオチド交換因子活性を有する蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、Rhoファミリー低分子量GTP結合蛋白質であるCdc42に対するグアニンヌクレオチド交換因子活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および/または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍疾患、例えば食道癌の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および/または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる腫瘍疾患、例えば食道癌の防止剤および/または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および/または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患、例えば食道癌の防止方法および/または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キットに関する。
Rhoファミリー低分子量GTP結合蛋白質(以下、単にRhoファミリー蛋白質と称することがある)は低分子量GTP結合蛋白質(以下、単に低分子量G蛋白質と称する)の1グループに属する蛋白質である。低分子量G蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器(エフェクター)との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量G蛋白質は、グアノシン5´−三リン酸(GTP)またはグアノシン5´−二リン酸(GDP)と特異的に結合し、結合したGTPをGDPに加水分解する酵素活性をもつ。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量G蛋白質に伝達され、低分子量G蛋白質に結合しているGDPと細胞内に存在するGTPとの交換反応(以下、GDP/GTP交換反応と略称する)が起きる。その結果、活性型のGTP結合型低分子量G蛋白質が生じる。活性型低分子量G蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、GTP結合型低分子量G蛋白質は、その酵素活性により、結合しているGTPをGDPに加水分解し、それにより不活性化する。このように、低分子量G蛋白質は、グアニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スイッチとして働く。
Rhoファミリー蛋白質として、Cdc42、Rac1およびRhoA等が知られている。Cdc42は線維芽細胞でフィロポディアの形成を制御している。Rac1は、白血球やマクロファージではスーパーオキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングやラメリポディアの形成を制御している。また、Cdc42とRac1はc−Jun N末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る。このように、Rhoファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。Rhoファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。Rhoファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。
Rhoファミリー蛋白質の分子スイッチとしての作用に関与している分子の1つがRhoグアニンヌクレオチド交換因子(Rho Guanine nucleotide Exchange Factor、以下Rho−GEFと略称する)である。Rho−GEFは、Rhoファミリー蛋白質のGDP/GTP交換反応を促進して、Rhoファミリー蛋白質をGDPが結合した不活性型からGTPが結合した活性型に変換する機能を有する。この機能により、Rho−GEFは、Rhoファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、GDP/GTP交換反応を促進して、Rhoファミリー蛋白質をGDPが結合した不活性型からGTPが結合した活性型に変換することをGEF活性またはRhoファミリー蛋白質の活性化と称することがある。
Rho−GEFには、特徴的ドメイン構造、例えばDbl相同ドメイン(Dbl Homology Domain、以下DHドメインと略称する)およびプレックストリン相同ドメイン(Pleckstrin Homology Domain、以下PHドメインと略称する)が存在する。DH/PHのタンデム構造は、Rho−GEFに典型的なドメイン構造である。以下、DHドメインおよびPHドメインのタンデム構造を、DH/PHドメインと呼称する。
DH/PHドメインは、Rho−GEFの活性化に寄与する重要なドメインであり、Rho−GEFの活性ドメインであると考えられている。例えば、Rho−GEFのプロトタイプであるproto−Dblのアミノ酸配列のうち、DH/PHドメインを含むC末端側領域からなる蛋白質が、Rhoファミリー蛋白質を活性化することが報告されている(非特許文献1)。この報告において、proto−Dblの全長925アミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうちN末端側第1番目から第497番目のアミノ酸残基の欠失により生じたC末端側領域からなる蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質を活性化し、その結果、細胞形質転換に関与した。このことから、proto−Dblの活性化は腫瘍原性活性化(oncogenic activation)と考えられている。以下、proto−DblのC末端側領域からなるこのような蛋白質をoncogenic−Dblと呼称する。oncogenic−Dblが、RhoA、Cdc42およびRac1と結合すること、並びにCdc42およびRhoAに対してGEF活性を有する一方、Rac1にはGEF活性を示さないことが報告されている(非特許文献2)。
proto−Dblのファミリー蛋白質をコードする遺伝子として、例えばvav(非特許文献3および4)、ost(非特許文献5)、lbc(非特許文献6)等が知られている。これら遺伝子は癌に関与する遺伝子である。その他、Rho−GEFとして作用する蛋白質をコードする遺伝子として、Trio(非特許文献7)やkalirin(非特許文献8)等が報告されている。Trioは、そのノックアウトマウスにおいて胎仔発生時の骨格筋の異常および脳の構成異常を引き起こす。kalirinは、神経細胞における神経突起形成に関与する。このように、Rho−GEFとして作用する蛋白質が関与する細胞機能は蛋白質ごとに固有であり、また、該蛋白質により活性化されるRhoファミリー蛋白質もそれぞれ異なる。
ビ(Bi,F.)ら、「モレキュラー アンド セルラー バイオロジー(Molecular and Cellular Biology)」、2001年、第21巻、p.1463−1474。
ハート(Hart,M.J.)ら、「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)」、1994年、第269巻、p.62−65。
カツァブ(Katzav,S.)ら、「エンボ ジャーナル(EMBO Journal)」、1989年、第8巻、p.2283−2290。
コステロ(Costello,P.S.)ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)」、1999年、第96巻、p.3035−3040。
ホリイ(Horii,Y.)ら「エンボ ジャーナル(EMBO Journal)」、1994年、第13巻、p.4776−4786。
トクソズ(Toksoz,D.)ら、「オンコジーン(Oncogene)」、1994年、第9巻、p.621−628。
オブリエン(O’Brien,S.P.)ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)」、2000年、第97巻、p.12074−12078。
ペンゼス(Penzes,P.)ら、「ジャーナル オブ ニューロサイエンス(Jounal of Neuroscience)」、2001年、第21巻、p.8426−8434。
本発明の課題は、新規なRho−GEFおよび該Rho−GEFをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Rho−GEFの製造方法および該Rho−GEFを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該Rho−GEFの機能および/または該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Rho−GEFの機能の異常および/または該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および/または治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、Rho−GEFに特徴的なDH/PHドメインをコードする領域を有する新規遺伝子を見出し、さらに該遺伝子を取得することに成功した。そして、該遺伝子の部分配列であってDH/PHドメインコード領域を含む塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が、Rhoファミリー蛋白質であるCdc42に対するGEF活性を有することを実証した。さらに該Rho−GEF遺伝子の組織発現が、食道癌例において正常な食道組織の少なくとも2.5倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。
すなわち本発明は、配列番号1に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、配列番号3若しくは5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列番号4若しくは6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。
本発明はさらに、配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Cdc42に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明はさらにまた、下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Cdc42に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する:
i)前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ii)前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
iii)前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
i)前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ii)前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
iii)前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
本発明はまた、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。
本発明はさらに、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
本発明はさらにまた、前記組換えベクターおよびCdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。
本発明はまた、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。
本発明はさらに、配列番号4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。
本発明はさらにまた、前記いずれかのポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。
本発明はまた、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記いずれかの蛋白質の製造方法に関する。
本発明はさらに、前記いずれかの蛋白質を認識する抗体に関する。
本発明はさらにまた、前記いずれかの蛋白質の機能および/または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および/または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および/または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および/または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法に関する。
本発明はまた、蛋白質の機能がCdc42に対するGEF活性である前記同定方法に関する。
本発明はさらに、ヒト食道組織由来の被検組織が、ヒト食道癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。
本発明はさらにまた、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常食道由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも2.5倍以上である場合に、被検組織がヒト食道癌由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。
本発明はまた、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および/または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる食道癌の防止剤および/または治療剤に関する。
本発明はさらに、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および/または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする食道癌の防止方法および/または治療方法に関する。
本発明はさらにまた、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キットに関する。
本発明により、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する新規蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を提供できる。また、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供できる。さらに、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体を提供できる。また、前記蛋白質の機能および/または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法を提供できる。さらに、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする腫瘍疾患、例えば食道癌の診断方法を提供できる。また、前記蛋白質の機能阻害剤および/または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる腫瘍疾患、例えば食道癌の防止剤および/または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および/または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患、例えば食道癌の防止方法および/または治療方法を提供できる。さらに、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キットを提供できる。
本蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質であるCdc42を活性化した。本発明により、Rhoファミリー蛋白質、例えばCdc42が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が実施できる。さらに、本蛋白質の機能の異常および/または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患、例えば腫瘍疾患、より具体的には食道癌の診断、防止および/または治療が実施できる。
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本発明において、単離された完全長DNAおよび/またはRNA;合成完全長DNAおよび/またはRNA;単離されたDNAオリゴヌクレオチド類および/またはRNAオリゴヌクレオチド類;あるいは合成DNAオリゴヌクレオチド類および/またはRNAオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなDNAおよび/またはRNAは最小サイズが2ヌクレオチドである。
本発明において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質;単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド;または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが2アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、1文字または3文字にて表記することがある。
(ポリヌクレオチド)
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脾臓由来cDNAライブラリーから、Rho−GEFに特徴的なドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定し単離した。
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脾臓由来cDNAライブラリーから、Rho−GEFに特徴的なドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定し単離した。
本発明に係るポリヌクレオチドは、例えば配列表の配列番号1に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであり得る。配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、6018bpのポリヌクレオチドであり、574アミノ酸残基(配列番号2)をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。また、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドはRho−GEFの活性ドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を含む。配列番号1に記載の塩基配列において第496番目から第1032番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第166番目のバリン(Val)から第344番目のアスパラギン(Asn)までの179アミノ酸残基からなるDHドメインをコードする。配列番号1に記載の塩基配列において第1132番目から第1449番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第378番目のロイシン(Leu)から第483番目のアルギニン(Arg)までの106アミノ酸残基からなるPHドメインをコードする。配列番号1に記載の塩基配列において第496番目から第1449番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第166番目のバリン(Val)から第483番目のアルギニン(Arg)までの318アミノ酸残基からなるDH/PHドメインをコードする。
本発明の範囲には、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも包含される。
本発明に係るポリヌクレオチドとしてまた、配列番号3若しくは5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号1に記載の塩基配列の第388番目から第1722番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。また、配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの5´末端にコザックコンセンサス配列(以下、コザックシークエンスと称する)とメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号3または5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、Rho−GEFの活性ドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を含む。
配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードする。実際、配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとCdc42をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、Cdc42をコードする遺伝子のみを発現させた動物細胞と比較して、活性型Cdc42(GTP結合型)が増加した(実施例3参照)。配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号1に記載の塩基配列の第388番目から第1722番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド(配列番号3)の5´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質(配列番号6)は、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質(配列番号4)のN末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)は、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として付加したオリゴヌクレオチドであり、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)が付加されていないが、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードすると考える。
本発明に係るポリヌクレオチドは、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質またはRhoファミリー蛋白質を活性化する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。
「Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性」または「Rhoファミリー蛋白質の活性化」とは、Rhoファミリー蛋白質に結合したグアノシン5´−二リン酸(GDP)をグアノシン5´−三リン酸(GTP)に交換することによって、Rhoファミリー蛋白質をGDPが結合した不活性型からGTPが結合した活性型に変換することを意味する。本交換反応は、Rhoファミリー蛋白質からのGDPの解離反応と、その結果生成したヌクレオチドに結合していないRhoファミリー蛋白質へのGTPの結合反応からなる。具体的には、Cdc42の活性化またはCdc42に対するGEF活性とは、Cdc42に結合しているGDPと細胞内に存在するGTPとの交換反応により、Cdc42を不活性型から活性型に変換することを意味する。
本明細書において「Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性」という用語と「Rhoファミリー蛋白質の活性化」という用語は交換可能に使用される。
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Rho−GEFの活性ドメインであるDH/PHドメインを含み、Rhoファミリー蛋白質を活性化した。一般的に、Rhoファミリー蛋白質を活性化する蛋白質、すなわちRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に結合してその機能を示す。したがって、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に結合して、Rhoファミリー蛋白質を活性化すると考える。
配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質および配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はいずれも、上記のように、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する。配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。配列番号4若しくは6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。
配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドがRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードすることから、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードすると考える。また、配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードすると考える。配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとして、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードすると考える。
本発明の範囲には、配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含される。好ましくは、このようなポリヌクレオチドであって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、該ポリヌクレオチドであって、DH/PHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである。
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化されるRhoファミリー蛋白質として、Cdc42が好ましく例示できる。本発明においてRhoファミリー蛋白質というときは、好ましくはCdc42を指す。Rhoファミリー蛋白質はこれに限定されず、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質により活性化される限りにおいていずれのRhoファミリー蛋白質であってもよい。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質による、Rhoファミリー蛋白質の活性化は、例えばエフェクタープルダウン法により測定できる(実施例3参照)。
Cdc42のアミノ酸配列およびCdc42遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号12および11に記載する。Cdc42およびその遺伝子は、上記各配列で表わされるものに限らず、一般的に知られているCdc42の機能を有する限りにおいて、上記各配列において1乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に1乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。Cdc42は、例えば、その遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により適当な宿主にトランスフェクションして形質転換体を作製し、該形質転換体を培養することにより取得できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの取得は、本発明により開示されたその具体例、例えば配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドについての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー;および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社等を参照)により容易に実施できる。
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該cDNAライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。cDNAの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脾臓由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全RNAの分離、mRNAの分離や精製、cDNAの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒト脾臓由来の市販されているpolyA+RNAからcDNAライブラリーを構築して用いることもできる。cDNAライブラリーから所望のクローンを選択する方法は特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンの選択を実施できる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。
cDNAライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能として、Cdc42等のRhoファミリー蛋白質を活性化する機能、言い換えればRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性が例示できる。蛋白質発現系は、自体公知の発現系がいずれも利用できる。例えば、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である(マディン(Madin,K.)ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)」、2000年、第97巻、p.559−564)。
本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCRと略称する)によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる(ウルマー(Ulmer,K.M.)、「サイエンス(Science)」、1983年、第219巻、p.666−671;エールリッヒ(Ehrlich,H.A.)編、「PCRテクノロジー,DNA増幅の原理と応用」、1989年、ストックトンプレス;およびサイキ(Saiki,R.K.)ら、「サイエンス(Science)」、1985年、第230巻、p.1350−1354)。cDNAライブラリーから全長のcDNAが得られ難いような場合には、RACE法(「実験医学」、1994年、第12巻、第6号、p.615−618)、特に5´−RACE法(フローマン(Frohman,M.A.)ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)」、1988年、第85巻、第23号、p.8998−9002)等の採用が好適である。PCRに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。
ポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法(サンガー(Sanger,F)ら、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America)」、1977年、第74巻、p.5463−5467)やマキサム−ギルバート法(マキサム(Maxam A.M.)ら、「メソッズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymology)」、1980年、第65巻、p.499−560)等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。
本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で50%以上、好ましくは少なくとも70%であることが適当である。より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。また、好ましくは、DH/PHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。DH/PHドメインコード領域における配列相同性は少なくとも70%であることが好ましい。より好ましくは、70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。また、DH/PHドメインがその機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を保持していることがさらに好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において1個以上、例えば1乃至100個、好ましくは1乃至30個、より好ましくは1乃至20個、さらに好ましくは1乃至10個、特に好ましくは1個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドがRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質、より好ましくはDH/PHドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであることができ、誘発変異を有するポリヌクレオチドであることができる。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであることもできる。このようなポリヌクレオチドとして、配列番号1に記載の塩基配列の第1566番目のチミン(T)がシトシン(C)に置換したポリヌクレオチドが例示できる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはPCR等を、単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー;および村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社)に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施でき、ウルマーの技術(ウルマー(Ulmer,K.M.)、「サイエンス(Science)」、1983年、第219巻、p.666−671)を利用して実施することもできる。
本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー)等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、6×SSC、0.5% SDSおよび50% ホルムアミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1×SSC、0.5% SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質がRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質であり、より好ましくはDH/PHドメインを有する蛋白質であることが望ましい。
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する5個以上のヌクレオチド、より好ましくは10個以上、より好ましくは20個以上のヌクレオチドからなる。これらオリゴヌクレオチドは、本ポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、DNA/RNA自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを製造できる。これらオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として使用できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとして、配列番号7、8または9に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくはヒト由来のポリヌクレオチドである。しかし、本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で50%以上、好ましくは少なくとも70%であることが適当である。より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。また、好ましくは、DH/PHドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。DH/PHドメインコード領域における配列相同性は少なくとも70%であることが好ましい。より好ましくは、70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。
本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれによりコードされる蛋白質の機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性が阻害されない限りにおいて、5´末端側や3´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであることができる。本ポリヌクレオチドに付加し得る遺伝子として、具体的にはグルタチオン S−トランスフェラーゼ(GST)、β−ガラクトシダーゼ(β−Gal)、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(ALP)等の酵素類、あるいはHis−tag、Myc−tag、HA−tag、FLAG−tagまたはXpress−tag等のタグペプチド類等の遺伝子が例示できる。これら遺伝子から選択された1種類または複数種類の遺伝子を組合せて本ポリヌクレオチドに付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やmRNAの検出を容易にするために有用である。
(ベクター)
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに挿入することにより取得できる。
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターDNAに挿入することにより取得できる。
ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターDNAは、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、複製に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAであることができる。代表的なベクターDNAとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを挙げられる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージDNAとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターDNAとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、SV40、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターDNA等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターDNA、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターDNA(コスミドやファージミド等)を例示できる。
ベクターDNAは、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれを用いることもできる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。
ベクターDNAには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターDNAに組込むことができる。このような遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー(ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等)等を例示できる。これらから選択された1種類または複数種類の遺伝子配列をベクターDNAに組込むことができる。
ベクターDNAに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターDNAと混合し、リガーゼにより再結合する方法が用いられる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。
(形質転換体)
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAの1種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAとして、例えば、Cdc42等のRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターDNAが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性、言い換えればRhoファミリー蛋白質の活性化を阻害または増強する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換体として好ましくは、本ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとCdc42をコードする遺伝子を含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAの1種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターDNAとして、例えば、Cdc42等のRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターDNAが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとRhoファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性、言い換えればRhoファミリー蛋白質の活性化を阻害または増強する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換体として好ましくは、本ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとCdc42をコードする遺伝子を含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌(エシェリヒアコリ(Escherichia coli))等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等が挙げられる。昆虫細胞は、Sf9細胞やSf21細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞(COS細胞、Vero細胞等)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞や293EBNA細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、293EBNA細胞を用いる。
組換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、自体公知の手段を応用して実施できる。例えば成書に記載されている標準的な方法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー)により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられる。簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic introduction)および感染等が例示できる。
原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターとして、大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用できる。例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用できる。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用される。
哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、RNAスプライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が利用される。最も好ましくは、リポフェクション法が利用される。
酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用される。
昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が利用される。
(蛋白質)
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。
本発明に係る蛋白質として、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を例示できる。より具体的には、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質において、その第166番目バリン(Val)から第344番目アスパラギン(Asn)までのアミノ酸残基がDHドメインを構成する。第378番目ロイシン(Leu)から第483番目アルギニン(Arg)までのアミノ酸残基がPHドメインを構成する。第166番目バリン(Val)から第483番目アルギニン(Arg)までのアミノ酸残基がDH/PHドメインを構成する。
本発明に係る蛋白質としてまた、配列番号3または5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を例示できる。より具体的には、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。また、配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号4に記載のアミノ酸配列は、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第130番目のグルタミン酸(Glu)から第574番目のリジン(Lys)までのアミノ酸配列に相当する。また、配列番号6に記載のアミノ酸配列は、配列番号4に記載のアミノ酸配列のN末端にメチオニンがペプチド結合により付加されたアミノ酸配列である。すなわち、これら各アミノ酸配列で表わされる蛋白質は、DH/PHドメインを含んでいる。
配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する。実際、配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとCdc42をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、Cdc42をコードする遺伝子のみを発現させた動物細胞と比較して、活性型Cdc42(GTP結合型)が増加した(実施例3参照)。配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のN末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として該ポリヌクレオチドの5´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)を付加した結果、得られた蛋白質である。付加されたメチオニンは、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、N末端のメチオニンが付加されていないが、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有すると考える。
本発明に係る蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質またはRhoファミリー蛋白質を活性化する蛋白質である。
本発明に係る蛋白質は、Rho−GEFの活性ドメインであるDH/PHドメインを含み、Rhoファミリー蛋白質を活性化した。一般的に、Rhoファミリー蛋白質を活性化する蛋白質、すなわちRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に結合してその機能を示す。したがって、本蛋白質は、Rhoファミリー蛋白質に結合して、Rhoファミリー蛋白質を活性化すると考える。
配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、上記のように、配列番号5に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有すると考える。また、これら蛋白質に含まれるDH/PHドメインは、Rhoファミリー蛋白質のGEF活性に寄与する重要なドメインであることが知られている。これらから、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含有する蛋白質もRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有すると考える。このような蛋白質として、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。具体的には、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が例示できる。これら例示した蛋白質はいずれも、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有すると考える。
本発明の範囲には、配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も包含される。
本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質が望ましい。このような蛋白質として、配列番号1に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号3若しくは5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、および配列番号4若しくは6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドからなる群より選ばれるいずれか1のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。また、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか1のポリヌクレオチドの塩基配列において1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか1のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。
本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号2、4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質が例示できる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で50%以上、好ましくは少なくとも70%であることが適当である。より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。また、好ましくは、DH/PHドメインを有するポリペプチドが望ましい。DH/PHドメインにおける配列相同性は少なくとも70%であることが好ましい。より好ましくは、70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。また、DH/PHドメインがその機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号2、4または6に記載のアミノ酸配列において1個以上、例えば1乃至100個、好ましくは1乃至30個、より好ましくは1乃至20個、さらに好ましくは1乃至10個、特に好ましくは1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質、より好ましくはDH/PHドメインを有する蛋白質である限り特に制限されない。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであることができ、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質(物性、機能、生理活性または免疫学的活性等)を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等)の間での相互の置換は容易に想定される。
本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質が包含される。例えば、配列番号2、4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質も本発明の範囲に包含される。このような蛋白質は、その最小単位として好ましくは5個以上、より好ましくは8個以上、さらに好ましくは12個以上、特に好ましくは15個以上の連続するアミノ酸で表わされる。
本発明に係る蛋白質は、好ましくはヒト由来の蛋白質である。しかし、本蛋白質と配列相同性を有し、かつRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を有する蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。好ましくはDH/PHドメインを有する蛋白質が望ましい。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で50%以上、好ましくは少なくとも70%であることが適当である。より好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。DH/PHドメインにおける配列相同性は少なくとも70%であることが好ましい。より好ましくは、70%以上、さらに好ましくは80%以上、さらにより好ましくは90%以上であることが適当である。
本発明に係る蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であることができ、あるいはこれらからさらに精製されたものであることができる。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであることができる。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であることができる。
本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、N末端側やC末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化できる。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。さらに好ましくは、本蛋白質のRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性が阻害されないような標識化が推奨される。標識化に用いる物質(標識物質)として、例えばGST、β−Gal、HRPまたはALP等の酵素類、His−tag、Myc−tag、HA−tag、FLAG−tagまたはXpress−tag等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)またはフィコエリスリン(phycoerythrin)等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのFc断片あるいはビオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化もできる。標識物質は、1種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質の検出または精製を容易に実施でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が実施できる。
(蛋白質の製造方法)
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー;村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社;ウルマー(Ulmer,K.M.)、「サイエンス(Science)」、1983年、第219巻、p.666−671;およびエールリッヒ(Ehrlich,H.A.)編、「PCRテクノロジー,DNA増幅の原理と応用」、1989年、ストックトンプレス等を参照)により取得できる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってcDNAライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該cDNAライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法(サムブルック(Sambrook)ら編、「モレキュラークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2版」、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリー;村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、1988年、丸善株式会社;ウルマー(Ulmer,K.M.)、「サイエンス(Science)」、1983年、第219巻、p.666−671;およびエールリッヒ(Ehrlich,H.A.)編、「PCRテクノロジー,DNA増幅の原理と応用」、1989年、ストックトンプレス等を参照)により取得できる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってcDNAライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該cDNAライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。
具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、形質転換体の作製に用いた宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。
本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。本蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、分離および/または精製することができる。
本蛋白質の精製および/または分離は、本蛋白質の物理的性質や化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、具体的には、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を例示できる。また、これら方法は適宜組合せて実施できる。好ましくは、本蛋白質に対する特異抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが用いられる。本蛋白質に対する特異抗体は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、自体公知の抗体作成法により取得できる。分離および/または精製を行なうとき、本蛋白質を得るための指標として、本蛋白質の機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性が利用できる。
本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成法として、成書(「ペプチド合成」、丸善株式会社、1975年;および「ペプチド シンテシス(Peptide Synthesis)」、インターサイエンス(Interscience)、ニューヨーク(New York)、1996年)に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、固相合成方法や液相合成方法等が知られているが、いずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)法、DCC+添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等)法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製できる。
本発明に係る蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質は、本蛋白質を適当なペプチダーゼにより切断することによっても取得できる。
(抗体)
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原は、本蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さらに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はない。このようなアミノ酸配列として、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位のアミノ酸配列が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質には結合しないか、弱く結合することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原は、本蛋白質またはその断片でもよく、少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さらに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はない。このようなアミノ酸配列として、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位のアミノ酸配列が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質には結合しないか、弱く結合することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。
抗体の生産は、自体公知の抗体作製法により実施できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および/または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体を取得できる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントとして、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、Ribi(MPL)、Ribi(TDM)、Ribi(MPL+TDM)、百日咳ワクチン(Bordetella pertussis vaccine)、ムラミルジペプチド(MDP)、アルミニウムアジュバント(ALUM)、およびこれらの組合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収法として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が例示できる。
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から採取した抗体産生細胞(例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球)と、自体公知の永久増殖性細胞(例えば、P3−X63−Ag8株等のミエローマ株)とを融合させて作製したハイブリドーマを用いて生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成し、次いでクローン化する。クローン化した数々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および/または治療のために有用である。
(化合物の同定方法)
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法に関する。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および/または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法が挙げられる。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法に関する。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および/または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法が挙げられる。
本発明に係る同定方法は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか1種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。
本発明に係る蛋白質の機能を阻害または促進する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定し得る実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物(被検化合物)の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を促進すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとして、GST等の酵素類、His−tag、Myc−tag、HA−tag、FLAG−tagまたはXpress−tag等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等が例示できるが、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であればいずれも利用できる。
本発明に係る蛋白質の機能として、好ましくはRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性、より好ましくはRhoファミリー蛋白質に結合してGEF活性を示す機能が例示される。言い換えれば、Rhoファミリー蛋白質の活性化、より好ましくはRhoファミリー蛋白質と結合してRhoファミリー蛋白質を活性化する機能が例示される。
本発明に係る蛋白質がRhoファミリー蛋白質と結合してGEF活性を示すと考えられることから、本蛋白質とRhoファミリー蛋白質との結合を阻害することにより本蛋白質のGEF活性を阻害できると考える。また、本蛋白質とRhoファミリー蛋白質との結合を増強することにより本蛋白質のGEF活性を促進できると考える。本同定方法の範囲には、本蛋白質とRho蛋白質、例えばCdc42との結合を阻害または増強する化合物の同定方法も包含される。
本発明に係る蛋白質が有するRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を阻害または促進する化合物の同定方法は、例えば、本蛋白質と本蛋白質により活性化されるRhoファミリー蛋白質とを共存させ、活性化されたRhoファミリー蛋白質の量を、被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたRhoファミリー蛋白質の量が被検化合物の非存在下と比較して被検化合物の存在下において減少する場合、該化合物は、本蛋白質が有するRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を阻害すると判定できる。逆に、活性化されたRhoファミリー蛋白質の量が被検化合物の存在下において増加する場合、該被検化合物は本蛋白質が有するRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を促進すると判定できる。活性化されたRhoファミリー蛋白質の測定は、該蛋白質に対する抗体等を用いて実施できる。例えば、活性化されたRhoファミリー蛋白質の測定は、活性化されたRhoファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないRhoファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子を用いて実施できる。具体的には、活性化されたRhoファミリー蛋白質との結合部位を含むエフェクター分子断片にGST−tagを付加した蛋白質と、活性化されたRhoファミリー蛋白質との結合の検出を、実施例3に示すように、プルダウン法により実施する。このような方法において、活性化されたRhoファミリー蛋白質の量は、電気泳動法およびウエスタンブロット法により測定できる。Rhoファミリー蛋白質の種類によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。したがって、用いるRhoファミリー蛋白質の種類により適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたCdc42が結合するエフェクターとしてPAK−1(p21 activated kinase)が知られている。したがって、本蛋白質が有するCdc42に対するGEF活性を阻害または促進する化合物を同定する場合は、エフェクター分子としてPAK−1を用いることが推奨される。
本発明に係る蛋白質が有するRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を阻害または促進する化合物の同定方法はまた、本蛋白質、本蛋白質により活性化されるRhoファミリー蛋白質であって放射性同位元素で標識したGDPと結合しているRhoファミリー蛋白質およびGTPを共存させ、活性化されたRhoファミリー蛋白質の量を被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたRhoファミリー蛋白質は、放射性同位元素で標識したGDPと結合しているRhoファミリー蛋白質の量の減少により定量され得る。このような方法は、公知文献(グラベン(Glaven J.A.)ら、「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)」、1996年、第271巻、第44号、p.27374−27381)記載の方法等を参照して実施できる。
「Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を阻害する」とは、GDPが結合した不活性型のRhoファミリー蛋白質からGTPが結合した活性型のRhoファミリー蛋白質への変換を阻害することを意味する。より具体的には、GTPが結合した活性型のRhoファミリー蛋白質の量を低減させるまたは消失させることを意味する。「Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を促進する」とは、GDPが結合した不活性型のRhoファミリー蛋白質からGTPが結合した活性型のRhoファミリー蛋白質への変換を促進することを意味する。より具体的には、GTPが結合した活性型のRhoファミリー蛋白質の量を増加させることを意味する。
本発明に係る同定方法において用いるRhoファミリー蛋白質は、本発明に係る蛋白質による活性化に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよく、あるいは標識物質が付加された蛋白質であってよい。標識物質として、上記標識物質が例示できる。
本発明に係る蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下におけるRhoファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばRhoファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法によりGST−tag融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。グルタチオンセファロースに結合させたRhoファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定を実施できる。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、HRPやALP等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等の標識物質で標識した抗体であることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグペプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量を実施できる。
本発明に係る蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法は、より具体的には、本蛋白質をコードするポリヌクレオチドとRhoファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系を用いて実施できる。
本発明に係る蛋白質とRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法はまた、公知のツーハイブリッド(two−hybrid)法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質とDNA結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、Rhoファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に連結したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質とRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定を達成できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が増加する場合、該被検化合物は本蛋白質のRhoファミリー蛋白質との結合を増強すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Galまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。
本発明に係る蛋白質とRhoファミリー蛋白質との結合を阻害または増強する化合物の同定方法はまた、ビアコアシステム(BIACORE system)等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施できる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法(Scintillation proximity assay、SPA)や蛍光共鳴エネルギー転移(Fluorescence resonance energy transfer、FRET)を応用した方法を用いて、本同定方法を実施できる。
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定し得る実験系において、本ポリヌクレオチドと被検化合物を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。逆に、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が増加する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を促進すると判定できる。
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法は、例えば、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施できる。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能、例えばRhoファミリー蛋白質に対するGEF活性を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定を実施できる。シグナルとして、GST等の酵素類、His−tag、Myc−tag、HA−tag、FLAG−tagまたはXpress−tag等のタグペプチド類、または蛍光物質等が使用できる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害または促進する化合物の同定方法はまた、例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも使用できる。具体的には、ルシフェラーゼ、β−Galまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子が例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。
(化合物)
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤、本発明に係る蛋白質の機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。該化合物は、例えば、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性、言い換えればRhoファミリー蛋白質の活性化の阻害剤の候補化合物として利用できる。本同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現促進剤、または本発明に係る蛋白質の機能の促進剤の候補化合物として利用できる。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および/または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法により得られる化合物として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物が挙げられる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製できる。このような医薬は、本蛋白質の機能の異常および/または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止および/または治療に有効である。本発明に係る化合物には、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物、あるいは本蛋白質の機能を促進するおよび/または本ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物も含まれる。
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤、本発明に係る蛋白質の機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。該化合物は、例えば、Rhoファミリー蛋白質に対するGEF活性、言い換えればRhoファミリー蛋白質の活性化の阻害剤の候補化合物として利用できる。本同定方法により得られた化合物は、本発明に係るポリヌクレオチドの発現促進剤、または本発明に係る蛋白質の機能の促進剤の候補化合物として利用できる。本ポリヌクレオチドは食道腺癌等の食道癌において発現が高いことが判明したので、本発明者らは、本蛋白質の機能を阻害および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これらの疾患を防止および/または治療できると考える。したがって、本発明に係る同定方法により得られる化合物として、好ましくは、本蛋白質の機能を阻害する化合物および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物が挙げられる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製できる。このような医薬は、本蛋白質の機能の異常および/または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止および/または治療に有効である。本発明に係る化合物には、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物、あるいは本蛋白質の機能を促進するおよび/または本ポリヌクレオチドの発現を促進する化合物も含まれる。
(医薬組成物)
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および/または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗すること、あるいは本蛋白質の機能および/または本ポリペプチドの発現を促進することに基づく医薬または医薬組成物に関する。
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および/または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗すること、あるいは本蛋白質の機能および/または本ポリペプチドの発現を促進することに基づく医薬または医薬組成物に関する。
本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれか1つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、1種類または2種類以上の医薬用に許容される担体(医薬用担体)を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。
本発明に係る医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約0.00001乃至70重量%、好ましくは0.0001乃至5重量%程度の範囲とするのが適当である。
医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜1種類または2種類以上を組合せて使用される。
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のL−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記L−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および/またはそれらに対応する塩(例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)等が例示できる。
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および/または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および/または治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止方法および/または治療方法に使用できる。
本発明に係る蛋白質の機能および/または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬用担体とともに対象に投与することにより、異常な症状を防止、改善または治療するといった効果が得られる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現をブロックする方法を用いて阻害することにより同様の効果が得られる。本ポリヌクレオチドの発現の阻害は、例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることにより実施できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるオリゴヌクレオチオドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。
本発明に係る蛋白質の機能の異常および/または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患として、癌疾患、好ましくは食道癌が例示できる。本ポリヌクレオチドである配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、疾患データベース情報BioExpress(GeneLogic社)を用いて調べたところ、食道癌の1つである食道腺癌(esophagus adenocarcinoma)で正常食道組織と比較して2.78倍高いことが判明した。上記のように、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はGEF活性を有することから、Rho−GEFとして作用すると考えられる。Rho−GEFとして単離された遺伝子には、癌に関与する次のような遺伝子が知られている:vav(非特許文献3および4);ost(非特許文献5);およびibc(非特許文献6)。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は癌疾患、例えば食道腺癌等の食道癌に関連すると考える。本蛋白質の機能および/または本ポリヌクレオチドの発現を阻害することにより、これら疾患を防止および/または治療できると考える。本発明に係る医薬および医薬組成物は、食道癌の防止剤および/または治療剤として有用であり、食道癌の防止方法および/または治療方法に使用できる。
本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質(体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等)、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重1kgあたり約0.01μg乃至100mg程度、好ましくは約0.1μg乃至1mg程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に1回の割合で間欠的に投与してもよい。
本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときは、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することもできる。
投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて適宜選択できる。その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤(点滴剤、注射剤)、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
(診断方法)
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。
本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種組織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出できる。本ポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および/または機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および/または予後の診断が実施できる。
疾患の診断は、例えば調べようとする試料(被検試料)について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および/またはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化およびその量的変化を検出できる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出できる。また、被検試料から増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。
本発明には、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法も包含される。
配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、食道癌の1つである食道腺癌で正常食道組織と比較して2.78倍高いことが判明した。上述したように、本ポリヌクレオチドの高発現は食道癌に関連すると考えられる。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が食道癌由来の被検試料であるか否かを判定する方法を実施できる。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト食道組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常食道由来組織が挙げられる。該ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは少なくとも2.5倍以上、より好ましくは少なくとも3倍以上に増加している場合、被検試料がヒト食道癌由来試料であると判定できる。本判定方法はまた、配列番号1に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの代わりに、本ポリヌクレオチドを除く本発明に係るポリヌクレオチドを用いて実施できる。このようなポリヌクレオチドとして、配列番号3に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。
被検試料は、食道由来組織に制限されず、生体由来のあらゆる組織や細胞を使用できる。具体的には、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体由来の試料を例示できる。所望により被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ゲノムDNA、RNAまたはcDNAのいずれであることもできる。核酸は、PCRまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする各種方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。
本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、NASBA法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)等が例示できる。また、in situ RT−PCRやin situ ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの遺伝子検出方法も使できる。このような遺伝子検出法においては、本ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および/またはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとしては、塩基配列長が一般的に5乃至50ヌクレオチド程度であるものが好ましく、10乃至35ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、15乃至30ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号7、8または9に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することができる。プローブおよびリガンドを標識する方法は、様々な方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等が例示できる。適当な標識として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。
遺伝子検出法は、PCRが感度の点から好ましい。PCRは、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えばRT−PCRが例示できる。その他、当該分野で用いられる様々なPCRの変法が適用できる。
PCRにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子のDNAの定量も実施できる。このような分析方法として、MSSA法等の競合的定量法、または一本鎖DNAの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるPCR−SSCP法を例示できる。
本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および/または機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および/または予後の診断が実施できる。
蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および/またはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および/またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化が検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。このような変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、本蛋白質および/またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。
本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列番号2、4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において1若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表わされる蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いることにより実施できる。
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質を検出できる。さらに好ましくは、抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル抗体)を用いることにより、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無が検出できる。
本発明には、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法が包含される。
具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、本蛋白質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的技術によりパラフィン切片または凍結組織切片中の本蛋白質を検出できる。
本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法(ELISA)、放射線免疫検定法(RIA)、免疫放射線検定法(IRMA)、および免疫酵素法(IEMA)等が例示できる。その他、ラジオイムノアッセイや競争結合アッセイ等が利用できる。
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも1種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および/または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。該試薬はその他、本蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。
本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が例示できる。標識物質は、予め本蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。
(遺伝子のクローニング)
ヒト脾臓由来cDNAライブラリーは、小原らの方法(オハラ(Ohara,O.)ら、「ディーエヌエー リサーチ(DNA Research)」、1997年、第4巻、p.53−59)に従って構築した。具体的には、NotI部位を有するオリゴヌクレオチド(GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15)(配列番号15:GIBCO BRL社製)をプライマーとして用い、ヒト脾臓mRNA(Clontech社製:カタログ番号6542−1)をテンプレートにしてSuperscriptII逆転写酵素キット(GIBCO BRL社製)で2本鎖cDNAを合成した。SalI部位を有するアダプター(GIBCO BRL社製)をcDNAとライゲーションした後、NotI消化し、1%濃度の低融点アガロース電気泳動により、3kb以上のDNA断片を精製した。精製cDNA断片を、SalI−NotI制限酵素処理したpBluescriptII SK+プラスミドとライゲーションした。エレクトロポーレーション法により、大腸菌ElectroMax DH10B株(GIBCO BRL社製)に組換えプラスミドを導入した。構築したcDNAライブラリーから、約10,000個の組換え体を選択し、これらクローンの両末端DNA配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約420個のクローンを選択し、そのcDNAについて全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、株式会社島津製作所製のDNAシーケンサー(RISA)とPEアプライドバイオシステム社製の反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法(ターミネーター標識法)を用いて決定した。
ヒト脾臓由来cDNAライブラリーは、小原らの方法(オハラ(Ohara,O.)ら、「ディーエヌエー リサーチ(DNA Research)」、1997年、第4巻、p.53−59)に従って構築した。具体的には、NotI部位を有するオリゴヌクレオチド(GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15)(配列番号15:GIBCO BRL社製)をプライマーとして用い、ヒト脾臓mRNA(Clontech社製:カタログ番号6542−1)をテンプレートにしてSuperscriptII逆転写酵素キット(GIBCO BRL社製)で2本鎖cDNAを合成した。SalI部位を有するアダプター(GIBCO BRL社製)をcDNAとライゲーションした後、NotI消化し、1%濃度の低融点アガロース電気泳動により、3kb以上のDNA断片を精製した。精製cDNA断片を、SalI−NotI制限酵素処理したpBluescriptII SK+プラスミドとライゲーションした。エレクトロポーレーション法により、大腸菌ElectroMax DH10B株(GIBCO BRL社製)に組換えプラスミドを導入した。構築したcDNAライブラリーから、約10,000個の組換え体を選択し、これらクローンの両末端DNA配列を決定した。この中から、新規遺伝子を含む約420個のクローンを選択し、そのcDNAについて全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、株式会社島津製作所製のDNAシーケンサー(RISA)とPEアプライドバイオシステム社製の反応キットを使用した。大部分の配列は、ショットガンクローンをダイターミネーター法(ターミネーター標識法)を用いて決定した。
全塩基配列が決定されたcDNAクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によりORFを予想した。次いで、ORF領域についてモチーフドメイン検索を行い、Rho−GEFの活性ドメインであるDH/PHドメインをコードする領域を含むcDNAを同定した。
その結果、新規な塩基配列を有し、DH/PHドメインをコードする領域を含むcDNA(以下、sh04009と称する)が同定された。
同定したcDNAクローンsh04009の塩基配列が全長蛋白質をコードする塩基配列か否かを検討するために、EST(Expression Sequence Tag)データベースを用いてインシリコ(in silico)で解析を行なった。その結果、sh04009の5´末端配列と部分的に重複するBU599407を見出した。BU599407がsh04009において欠失している5´側配列であると予測し、この5´側配列を含むsh04009のコード領域(CDS)がmRNAに存在するかをRT−PCRクローニングにより確認した。具体的には、BU599407の100番目から122番目までの塩基配列を含むオリゴヌクレオチド(配列番号7)とsh04009の1582番目から1554番目までの塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチド(配列番号8)とをプライマーとして用い、ヒト脾臓由来polyA(+)RNA(Clontech社製)をテンプレートとして逆転写反応によりcDNAを作製した。DNAポリメラーゼとしてpfu turbo(STRATAGENE社製)を用い、PCRによりBU599407の配列を5´上流に有するsh04009のCDSを取得した。該CDSは、TOPO cloning systemを用いた反応によりpENTR/SD/D−TOPO(Invitrogen社製)に挿入し、エントリーベクターを作製した。以下、BU599407の配列を5´上流に有するsh04009をsh04009全長遺伝子と称する。インシリコで予測した、sh04009全長遺伝子のCDSの塩基配列が正しいこと、そしてCDSの塩基配列がエントリーベクターに正しく挿入されていることを、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて、それぞれ実施した。
シーケンス解析の結果、sh04009全長遺伝子は、配列番号1に示す塩基配列(6018bp)からなり、配列番号2に示すアミノ酸配列(574アミノ酸)をコードすることが判明した。sh04009全長遺伝子とsh04009を比較すると、sh04009の5´上流側に140ヌクレオチドの欠失が認められた他、1塩基が異なることが判明した。しかし、この1塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。具体的には、sh04009全長遺伝子の塩基配列(配列番号1)において第1566番目の塩基はチミン(T)である。一方、sh04009において該塩基に相当する位置の塩基はシトシン(C)である。sh04009全長遺伝子の第1564番目から第1566番目までの塩基はCCTであり、プロリンをコードしている。一方、sh04009において、該位置に相当する塩基はCCCであり、同様にプロリンをコードしている。すなわち、1塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。一塩基の違いがある配列の前後についてゲノム配列(NT_009799.11 Hs13_9956)と比較したところ、配列番号1に記載の塩基配列の第1566番目に相当する塩基はチミン(T)であった。
sh04009全長遺伝子において、DHドメインは、配列番号1に示す塩基配列の第496番目から第1032番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。PHドメインは、配列番号1に示す塩基配列の第1132番目から第1449番目のヌクレオチドからなる領域にコードされている。また、sh04009全長遺伝子によりコードされる蛋白質において、DHドメインは、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第166番目のバリン(Val)から第344番目のアスパラギン(Asn)までの179アミノ酸残基からなる。PHドメインは、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第378番目のロイシン(Leu)から第483番目のアルギニン(Arg)までの106アミノ酸残基からなる。
(DNAの発現と精製)
実施例1で得られたsh04009全長遺伝子の発現ベクターを、ゲートウェイTMクローニングテクノロジー(GATEWAYTM Cloning Technology、Invitrogen社製)を用いて作製した。次いで、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質(以下、sh04009全長蛋白質と称する)をFLAG−tag融合蛋白質として293EBNA細胞(Invitrogen社製)で発現させた。また、該遺伝子の、DH/PHドメインコード領域を含む部分塩基配列からなるDNA(以下、sh04009DH/PHと称する)を含む発現ベクターを同様に作製した。そして、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質のDH/PHドメインを含む部分アミノ酸配列からなる蛋白質(以下、sh04009DH/PH蛋白質と称する)を、同様にFLAG−tag融合蛋白質として293EBNA細胞で発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。
実施例1で得られたsh04009全長遺伝子の発現ベクターを、ゲートウェイTMクローニングテクノロジー(GATEWAYTM Cloning Technology、Invitrogen社製)を用いて作製した。次いで、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質(以下、sh04009全長蛋白質と称する)をFLAG−tag融合蛋白質として293EBNA細胞(Invitrogen社製)で発現させた。また、該遺伝子の、DH/PHドメインコード領域を含む部分塩基配列からなるDNA(以下、sh04009DH/PHと称する)を含む発現ベクターを同様に作製した。そして、該発現ベクターを用いて、該遺伝子によりコードされる蛋白質のDH/PHドメインを含む部分アミノ酸配列からなる蛋白質(以下、sh04009DH/PH蛋白質と称する)を、同様にFLAG−tag融合蛋白質として293EBNA細胞で発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。
具体的には、sh04009全長遺伝子の発現ベクターの作製および該遺伝子の発現のために、ヒト脾臓由来polyA(+)RNA(Clontech社製)から逆転写反応によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーをテンプレートとし、pfu turbo(STRATAGENE社製)により、該遺伝子のORF領域(終止コドンを除く)を増幅した。増幅用プライマーには、配列番号7および8に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた。その後、増幅産物をTOPO cloning systemを用いた反応にて、pENTR/SD/D−TOPOに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターとBspEIで切断したC末端FLAG−tag(3×)融合蛋白質発現ベクターとを用いて、LRクロナーゼ酵素による組換え反応により、sh04009全長遺伝子発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、C末端にFLAG−tag(3×)が付加されたsh04009全長蛋白質が得られる。sh04009全長遺伝子のコード領域の塩基配列が発現プラスミドに正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて、それぞれ実施した。
次に、sh04009DH/PHの発現ベクターを、ゲートウェイTMクローニングテクノロジー(Invitrogen社製)を用いて構築した。具体的には、まず、上記作製した、sh04009全長遺伝子のエントリーベクターをテンプレートとし、sh04009全長遺伝子のDH/PHコード領域を含む部分配列(配列番号1の第388番目から第1722番目までのヌクレオチド:配列番号3)の5´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド(配列番号10)が付加されたポリヌクレオチド(配列番号5)を増幅した。増幅は、プライマーとして配列番号9および8に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを用い、pfu turbo(STRATAGENE社製)により行なった。その後、増幅産物をTOPO cloning systemを用いた反応にて、pENTR/SD/D−TOPOに挿入してエントリーベクターを作製した。作製したエントリーベクターとBspEIで切断したC末端FLAG−tag(3×)融合蛋白質発現ベクターとを用いて、LRクロナーゼ酵素による組換え反応により、sh04009DH/PH発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドを用いることにより、配列番号2に記載のアミノ酸配列の第130番目から第574番目のアミノ酸残基からなる配列(配列番号4)のN末端にメチオニン(Met)が付加され(配列番号6)、さらにそのC末端にFLAG−tag(3×)が付加された蛋白質が得られる。sh04009DH/PHの塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて、それぞれ実施した。
sh04009全長遺伝子発現ベクターおよびsh04009DH/PH発現ベクターは、それぞれ293EBNA細胞にリポフェクション法によりトランスフェクションした。293EBNA細胞は、遺伝子導入の前日にT25フラスコに細胞数6×105で播種し、培養培地(IMDM培地、SIGMA社製;10%牛胎児血清;4mM グルタミン;および10μg/mL ゲンタマイシン)5mL中で培養した。翌日、培養した細胞から培地を3mL除去した後、リポフェクトアミン2000(LipofectamineTM2000、Invitrogen社製)を用いた手法で遺伝子導入を実施した。具体的には、まず、各発現ベクターを添加した無血清のDMEMとLipofectamineTM2000を添加したDMEMとを混合し、室温で20分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して37℃にて5% CO2存在下で培養した293EBNA細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は37℃にて5% CO2存在下で8時間以上培養後、培養培地を3mL添加してさらに培養を行なった。遺伝子導入2日後、培地を除去してリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)にて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル(protease inhibitor cocktail、SIGMA社製)1%を含む溶解バッファーA(Lysis buffer A)にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファーAは、次の組成からなる:25mM Tris−HCl、pH7.5;150mM NaCl;1mM CaCl2;および1% Triton X−100。
各細胞溶解液は、等量のSDS−PAGEサンプルバッファーと混合し、100℃で5分間加熱処理して電気泳動用サンプルを調製した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を行い、泳動ゲルをブロッティングバッファーに5分間以上浸して平衡化した後、PVDF膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のPVDF膜は、TBS−Tにブロックエース(大日本製薬株式会社製)を3:1の割合で混合した溶液(TBS−T+BA)に4℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、PVDF膜をTBS−Tにて10分以上振とうしながら1回洗浄した。SDS−PAGEサンプルバッファーは、トリスSDSβMEサンプル処理液(第一化学薬品社製)を用いた。SDS−PAGEに用いた泳動バッファーは次の組成からなる:100mM Tris;192mM グリシン;0.1% SDS、pH8.3(Bio Rad社製)。上記ブロッティングバッファーは、次の組成からなる:25mM Tris;40mM ε−アミノ−n−カプロン酸;20%メタノール;および0.05% SDS。TBS−Tは、次の組成からなる:150mM NaCl;10mM Tris−HCl、pH7.5;および0.05% Tween−20。
PVDF膜に、抗FLAG M2モノクローナル抗体(SIGMA社製)をTBS−T+BAで1000倍希釈して添加し、37℃で1時間以上保温した。その後、PVDF膜をTBS−Tにて3回洗浄し(1回の洗浄に付き20分以上の振とう)、TBS−T+BAで1000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Cell Signaling Technology社製)を添加して、37℃で1時間以上保温した。最終的に、PVDF膜をTBS−Tにて3回洗浄した後(1回の洗浄に付き20分以上の振とう)、ECLプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム(Amersham Biosciences社製)により、抗FLAG抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置(Lumino Imaging Analyzer、東洋紡績株式会社製)にて可視化した。
結果を図1に示す。sh04009全長遺伝子発現ベクターおよびsh04009DH/PH発現ベクターをそれぞれトランスフェクションした細胞から調製した細胞溶解液のいずれにおいても、50KDaから100KDaの間に主要バンドが検出された(それぞれ図1内レーン2およびレーン3)。これらベクターによりFLAG−tag融合蛋白質として発現されるsh04009全長蛋白質およびsh04009DH/PH蛋白質の予想分子量は、それぞれ約72KDaおよび約58KDaである。一方、各ベクターを導入せずLipofectamineTM2000のみを添加した細胞から同様の処理により得た細胞溶解液では、このようなバンドは検出されなかった(図1内レーン1)。このことから、図1のレーン2およびレーン3で認められた主要バンドは、それぞれsh04009全長蛋白質およびsh04009DH/PH蛋白質であると考える。かくして、sh04009全長蛋白質およびsh04009DH/PH蛋白質を取得できた。
(sh04009DH/PH蛋白質のCdc42に対するGEF活性)
sh04009DH/PH蛋白質のGEF活性を、実施例2で構築したsh04009DH/PH発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。この発現ベクターによれば、sh04009DH/PH蛋白質は、C末端3×FLAG−tag融合蛋白質として発現される。Rhoファミリー蛋白質として、Cdc42を用いた。Cdc42を発現させるために、Cdc42遺伝子発現ベクターを、ゲートウェイTMクローニングテクノロジー(Invitrogen社製)を用いて作製した。具体的には、まず、Multiple Tissue cDNA Panels(Clontech社製)のスプリーンファーストストランドDNA(spleen first strand DNA)をテンプレートとして、pfu turboを用いてCdc42遺伝子(配列番号11)を増幅した。増幅産物を、TOPO cloning systemを用いた反応にてpENTR/Dに挿入してエントリーベクターを作製した。Cdc42遺伝子の増幅用プライマーとして、配列番号13および14に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、BspEIで切断したN末端FLAG−tag(3×)融合蛋白質発現ベクターを用いて、LRクロナーゼ酵素による組換え反応により、Cdc42遺伝子発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドにより、Cdc42(配列番号12)のN末端にFLAG−tag(3×)が付加された蛋白質が発現される。Cdc42遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて、それぞれ実施した。
sh04009DH/PH蛋白質のGEF活性を、実施例2で構築したsh04009DH/PH発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。この発現ベクターによれば、sh04009DH/PH蛋白質は、C末端3×FLAG−tag融合蛋白質として発現される。Rhoファミリー蛋白質として、Cdc42を用いた。Cdc42を発現させるために、Cdc42遺伝子発現ベクターを、ゲートウェイTMクローニングテクノロジー(Invitrogen社製)を用いて作製した。具体的には、まず、Multiple Tissue cDNA Panels(Clontech社製)のスプリーンファーストストランドDNA(spleen first strand DNA)をテンプレートとして、pfu turboを用いてCdc42遺伝子(配列番号11)を増幅した。増幅産物を、TOPO cloning systemを用いた反応にてpENTR/Dに挿入してエントリーベクターを作製した。Cdc42遺伝子の増幅用プライマーとして、配列番号13および14に記載の各塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、BspEIで切断したN末端FLAG−tag(3×)融合蛋白質発現ベクターを用いて、LRクロナーゼ酵素による組換え反応により、Cdc42遺伝子発現プラスミドを作製した。この発現プラスミドにより、Cdc42(配列番号12)のN末端にFLAG−tag(3×)が付加された蛋白質が発現される。Cdc42遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンス解析により確認した。シーケンス反応はDYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit(Amersham Biosciences社製)を用いて、泳動および解析はABI PRISM 377を用いて、それぞれ実施した。
sh04009DH/PH発現ベクターとCdc42遺伝子発現ベクターとを、24ウエルプレートに播種した293EBNA細胞(細胞数5.0×104/well)に導入した。ベクターの細胞への導入は、LipofectamineTM2000を用いて行った。陰性コントロールとして、各ベクターのCDSが挿入されていない空ベクター(empty vector)を導入した細胞を用いた。遺伝子導入2日後、培地を除去してPBSにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル(SIGMA社製)1%を含む溶解バッファーBで細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液をエフェクタービーズ(UPSTATE社製)と4℃で1時間反応させた。エフェクタービーズとして、PAK−1の、活性型Rhoファミリー蛋白質に結合するドメインにGST−tagを付加した蛋白質が結合しているグルタチオンアガロースを用いた。PAK−1は活性型Cdc42および活性型Rac1と結合することが知られている。反応させたエフェクタービーズは、溶解バッファーBで洗浄し、溶解バッファーBとSDS−PAGEサンプルバッファーの等量混合溶液を40μL添加した後、100℃で5分間の加熱処理を行い、サンプルを調製した。SDSポリアクリルアミドゲルに8μLのサンプルをアプライして電気泳動を行なった。タンク式ブロッティングバッファーに5分間以上浸して平衡化した泳動ゲルから、PVDF膜上に蛋白質をトランスファーした。TBS−T+BAに4℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、PVDF膜をTBS−Tにて10分以上振とうしながら1回洗浄した。溶解バッファーBは、次の組成からなる:1mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA);2% グリセロール;1% Triton X−100;25mM HEPES、pH7.5;150mM NaCl;および10mM MgCl2。タンク式ブロッティングバッファーは、以下の組成からなる:25mM Tris;192mM グリシン;および20% メタノール。SDS−PAGEサンプルバッファー、泳動バッファー、TBS−TおよびTBS−T+BAはいずれも、実施例2で使用した各バッファーと同一組成のバッファーを用いた。
FLAG−tag付加蛋白質の検出は、抗FLAG抗体を用いて実施した。具体的には、抗FLAG M2モノクローナル抗体(SIGMA社製)をTBS−T+BAで1000倍希釈して添加し、室温で1時間以上保温した。その後、PVDF膜をTBS−Tにて3回洗浄し(1回の洗浄に付き20分以上の振とう)、TBS−T+BAで1000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Cell Signaling Technology社製)を添加して、室温で1時間以上保温した。最終的に、PVDF膜をTBS−Tにて3回洗浄した後(1回の洗浄に付き20分以上の振とう)、ECLウエスタンブロッティングディテクションシステム(Amersham Biosciences社製)により、抗FLAG抗体に反応する発現蛋白質の検出を行った。化学発光シグナルは検出装置(Lumino Imaging Analyzer、東洋紡績株式会社製)にて可視化した。
sh04009DH/PH蛋白質がCdc42に対するGEF活性を有するならば、sh04009DH/PH蛋白質によりCdc42は不活性型(GDP結合型)から活性型(GTP結合型)に移行する。エフェクタービーズとして使用したPAK−1は活性型Cdc42および活性型Rac1と結合することが知られている。したがって、sh04009DH/PH蛋白質がCdc42に対するGEF活性を有しCdc42を活性化するならば、エフェクタービーズに結合するCdc42量が増加する。sh04009DH/PH蛋白質およびCdc42を共発現させた細胞から得た細胞溶解液を用いたときに、Cdc42のみを発現させた細胞から得た細胞溶解液を用いたときよりも、Cdc42のバンドが濃く検出される場合、sh04009DH/PHはGEF活性を有しCdc42を活性化すると判定した。
結果を図2に示す。図2の上段のパネルは、上記各細胞溶解液を用いてエフェクタープルダウン法を実施した結果を示す。sh04009DH/PH蛋白質とCdc42とを共発現させた細胞から得た細胞溶解液(図2のレーン4)を用いたときに、Cdc42のみを発現させた細胞から得た細胞溶解液(図2のレーン2)を用いたときと比較して、バンドが濃く検出された。すなわち、Cdc42とsh04009DH/PH蛋白質を共発現させた細胞では、PAK−1に結合する活性型Cdc42が増加した。図2の中段のパネルは、各細胞溶解液に含まれるCdc42を、抗FLAG抗体により検出した結果を示す。Cdc42は、Cdc42のみを発現させた細胞およびCdc42とsh04009DH/PH蛋白質とを共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同量であった(図2のレーン2および4)。図2の下段のパネルは、各細胞溶解液に含まれるsh04009DH/PH蛋白質を、抗FLAG抗体により検出した結果を示す。sh04009DH/PH蛋白質は、sh04009DH/PH蛋白質のみを発現させた細胞およびsh04009DH/PH蛋白質とCdc42とを共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同量であった(図2のレーン3および4)。
これら結果から、sh04009DH/PH蛋白質により、Cdc42が不活性型から活性型に変換されることが明らかになった。すなわち、sh04009DH/PH蛋白質はGDP/GTP交換反応を促進して、Cdc42を不活性型から活性型に変換すると考える。言い換えれば、sh04009DH/PH蛋白質はGEF活性を有すると考える。
sh04009全長蛋白質は、sh04009DH/PH蛋白質を含むことから、sh04009DH/PH蛋白質と同様に、Cdc42に対して同様にGEF活性を有すると考える。
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はRhoファミリー蛋白質、例えばCdc42に対するGEF活性を示した。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、Rhoファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば食道癌の診断、防止および/または治療が実施できる。したがって、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。
配列番号1:グアニンヌクレオチド交換因子としての機能を有する蛋白質(配列番号2)をコードするポリヌクレオチド。
配列番号1:(496):(1032)Dbl相同ドメインをコードする領域。
配列番号1:(1132):(1449)プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号3:配列番号1の第388番目から第1722番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列からなるポリヌクレオチド。
配列番号3:配列番号4に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号5:5´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンをコードする配列を有し、それに続いて、配列番号1の第388番目から第1722番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチド。
配列番号5:配列番号6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号5:(1):(4)コザックコンセンサス配列。
配列番号5:(5):(7)メチオニンに対応するコドン。
配列番号7:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号8:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号9:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10:コザックコンセンサス配列とそれに続くメチオニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11:Cdc42をコードするポリヌクレオチド。
配列番号12:Cdc42。
配列番号13:プライマー用に配列番号11の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14:プライマー用に配列番号11の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号1:(496):(1032)Dbl相同ドメインをコードする領域。
配列番号1:(1132):(1449)プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号3:配列番号1の第388番目から第1722番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列からなるポリヌクレオチド。
配列番号3:配列番号4に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号5:5´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンをコードする配列を有し、それに続いて、配列番号1の第388番目から第1722番目までのヌクレオチドからなる部分配列であり、Dbl相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチド。
配列番号5:配列番号6に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
配列番号5:(1):(4)コザックコンセンサス配列。
配列番号5:(5):(7)メチオニンに対応するコドン。
配列番号7:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号8:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号9:プライマー用に配列番号1の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10:コザックコンセンサス配列とそれに続くメチオニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11:Cdc42をコードするポリヌクレオチド。
配列番号12:Cdc42。
配列番号13:プライマー用に配列番号11の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14:プライマー用に配列番号11の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15:プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
Claims (19)
- 配列表の配列番号1に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号3若しくは5に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号4若しくは6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
- 配列表の配列番号3に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号4に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Cdc42に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記の群から選ばれるポリヌクレオチドであって、Cdc42に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド:
i)請求項1または2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも70%の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、
ii)請求項1または2に記載のポリヌクレオチドの塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチド、および
iii)請求項1または2に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。 - 請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項5に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
- 請求項5に記載の組換えベクターおよびCdc42をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる請求項6に記載の形質転換体。
- 配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
- 配列表の配列番号4または6に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
- 請求項3または4に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
- 請求項6または7に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質を認識する抗体。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質の機能および/または請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、該化合物と該蛋白質および/または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および/または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および/または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法。
- 蛋白質の機能が、Cdc42に対するグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)活性である請求項13に記載の同定方法。
- ヒト食道組織由来の被検組織が、ヒト食道癌由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法。
- 被検組織における請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常食道由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の少なくとも2.5倍以上である場合に、被検組織がヒト食道癌由来組織であると判定することを特徴とする、請求項15に記載の判定方法。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および/または請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる食道癌の防止剤および/または治療剤。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質の機能を阻害する化合物および/または請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする食道癌の防止方法および/または治療方法。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の蛋白質、請求項1から4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項5に記載の組換えベクター、請求項6または7に記載の形質転換体および請求項12に記載の抗体のうち少なくともいずれか1つを含んでなる試薬キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004120054 | 2004-04-15 | ||
JP2004120054 | 2004-04-15 | ||
PCT/JP2005/007233 WO2005100567A1 (ja) | 2004-04-15 | 2005-04-14 | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2005100567A1 true JPWO2005100567A1 (ja) | 2008-03-06 |
Family
ID=35150009
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006512373A Withdrawn JPWO2005100567A1 (ja) | 2004-04-15 | 2005-04-14 | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080274954A1 (ja) |
EP (1) | EP1757690A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2005100567A1 (ja) |
WO (1) | WO2005100567A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112533617A (zh) * | 2018-04-25 | 2021-03-19 | 卫理公会医院体系公司 | 癌症新抗原和其在癌症疫苗和基于tcr的癌症免疫疗法中的效用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6743619B1 (en) * | 2001-01-30 | 2004-06-01 | Nuvelo | Nucleic acids and polypeptides |
JP2003088388A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-25 | Herikkusu Kenkyusho:Kk | 新規な全長cDNA |
EP1504101A2 (en) * | 2001-11-09 | 2005-02-09 | Incyte Genomics, Inc. | Intracellular signaling molecules |
JP2004222720A (ja) * | 2003-01-21 | 2004-08-12 | Research Association For Biotechnology | 全長cDNA |
-
2005
- 2005-04-14 WO PCT/JP2005/007233 patent/WO2005100567A1/ja active Application Filing
- 2005-04-14 EP EP05730477A patent/EP1757690A4/en not_active Withdrawn
- 2005-04-14 JP JP2006512373A patent/JPWO2005100567A1/ja not_active Withdrawn
- 2005-04-14 US US11/578,324 patent/US20080274954A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1757690A1 (en) | 2007-02-28 |
EP1757690A4 (en) | 2007-07-18 |
WO2005100567A1 (ja) | 2005-10-27 |
US20080274954A1 (en) | 2008-11-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4353798B2 (ja) | 肝細胞癌に関連する遺伝子およびタンパク質 | |
US7070940B2 (en) | Method for determining the ability of a compound to modify the interaction between parkin and the p38 protein | |
JPWO2005103257A1 (ja) | RhoAと結合するグアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子 | |
JP4746537B2 (ja) | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
US8067540B2 (en) | Human ALEX1 proteins | |
JP4638354B2 (ja) | G蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
JPWO2005100567A1 (ja) | グアニンヌクレオチド交換因子をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
JP4426023B2 (ja) | 大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 | |
JP3811733B2 (ja) | Dnアーゼ活性を有する蛋白質 | |
JP2006122048A (ja) | ミツグミン29遺伝子 | |
JP2003530109A (ja) | エルビンをコードする遺伝子及びその診断及び治療的使用 | |
JPWO2005103256A1 (ja) | Gtpアーゼ活性化蛋白質をコードする遺伝子およびその遺伝子産物 | |
US8058408B2 (en) | Transcription factor having zinc finger domains | |
US6743603B2 (en) | Tumor suppressor encoding nucleic acid, PTX1, and methods of use thereof | |
EP1215283A1 (en) | NOVEL bHLH TYPE TRANSCRIPTION FACTOR GENE DEC2 | |
JP2003532424A (ja) | Rh116ポリペプチドとその断片、および前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと治療の用途 | |
JP2005192567A (ja) | チロシンキナーゼ遺伝子およびその遺伝子産物 | |
KR100833367B1 (ko) | 더블유티1 상호작용 단백질 더블유티아이피 | |
JP4579328B2 (ja) | 大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 | |
JP2009089601A (ja) | 細胞機能調節物質のスクリーニング方法 | |
US20040102611A1 (en) | Novel human homologue of the dbf4/ask1 protein, nucleic acids, and methods related to the same | |
JP2006101873A (ja) | カルシウム依存性マキシクロライドチャンネルをコードする遺伝子およびその遺伝子産物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080701 |