JP4579328B2 - 大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質 - Google Patents
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本発明において提供される新規蛋白質M1をコードするポリヌクレオチドは、ヒトの胎児脳cDNAライブラリーから、APC遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを使い、2ハイブリッドスクリーニング法により、新規なアミノ酸配列を有する物質として、そのcDNAが取得されたものである。本発明の新規蛋白質M1のcDNAは、619個のアミノ酸からなる蛋白質をコードし、既知のDblファミリー(低分子量G蛋白質Rhoファミリーに作用するGDP解離促進蛋白質の1つである)(Current Opinion in Cell Biology,8:216−222,1996)に類似のドメイン構造を有していた。遺伝子データベース(The National Center for Biotechnology Information)を検索したところ、本発明の新規蛋白質M1のcDNAは、Dblファミリーの1つである既知物質KIAA0424と約73%の相同性を有することが判明した。KIAA0424は、本発明の新規蛋白質M1とは、該M1のN末端領域を欠如する点に最も大きな差異を有する。両者は、Dbl相同(DH)ドメイン、プレックストリン(Preckstrin)相同(PH)ドメイン、Src相同3(SH3)ドメインを担持する点において同一である。また、マウスを用いた新規蛋白質M1の組織分布研究において、該M1のmRNAが脳に高レベルで発現しており、他の臓器でも低レベルで発現していることを確認した。
本発明の新規蛋白質M1は、配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。さらに本発明のポリペプチドは、この配列表の配列番号1に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドは、配列表の配列番号1に示すポリペプチドと、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%をこえる相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドの選択は、例えばAPC遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号2のポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖、これらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドのうち少なくとも15個の連続した塩基配列を有しかつコードするペプチドがAPC遺伝子産物のarmドメインとの結合能を有するポリヌクレオチド、を意味する。ポリヌクレオチドとしてDNAを代表例にとると、「DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA」は、例えば前述のMoleculer Cloningに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、6×SSC、0.5%SDSおよび50%ホルムアミドの溶液中で42℃にて加温した後、0.1×SSC、0.5%SDSの溶液中で 68℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなる新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドを提供可能である。本発明の具体例においては、COS−7細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない。
培地からの新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドの回収は、APC遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。より好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
抗体は、本発明の新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を選別し、作成する。抗原決定基は、少なくとも5個、より好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号1と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。実施例では、アミノ酸配列の73位〜126位の断片を免疫原として利用した。抗体は、免疫学的に新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドを認識する限り特に限定されない。この認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定する。
かくして調製された新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、並びに新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドとAPC遺伝子産物との結合性、新規蛋白質M1のGEF活性等の機能、または新規蛋白質M1の発現に対する阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか1つを用いることで、本発明のポリペプチドとAPC遺伝子産物との結合性を阻害もしくは増強する化合物を得るためのスクリーニング方法が、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体の少なくともいずれか1つを用いることで本発明のポリヌクレオチドと相互作用し該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか1つを用いることで本発明のポリペプチドのGEF活性等の機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が提供可能である。例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて利用可能である。
上記のスクリーニング方法で得られた化合物は、新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドとAPC遺伝子産物との相互作用、または新規蛋白質M1のGEF活性等の機能を調節する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規蛋白質M1およびその由来物からなるポリペプチドの発現に対する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としても利用可能である。上記の阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さないポリペプチド、低分子化合物等が挙げられ、好ましくは低分子化合物である。
(cDNAのクローニング )
APC遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン(以下、APC−armと略称することもある)に対する結合能を有する蛋白質を得ることを目的として、2ハイブリッドスクリーニング(two hybrid screens)(CLONTECH MATCHMAKERTM Two−Hybrid System)を行った。すなわち、ベイト(bait)として、ヒトAPC遺伝子産物アルマジロリピートドメイン(アミノ酸残基446−880)を融合させたGAL4 DNA結合ドメインを含有するプラスミドGBT9−APCを用い、ヒト胎児脳(human fetal brain)cDNAライブラリー(Clontech)を対象としてスクリーニングした。該cDNAライブラリーとベイトとを、レポーター遺伝子としてhis3とlacZとを導入した酵母にトランスフェクションし、β−galアッセイおよびHIS栄養要求性を指標として、陽性クローンを検出した。
上記方法で得られた、配列表の配列番号2に示すcDNAは新規な塩基配列を有していた。該cDNAをもとに、その塩基配列の翻訳によって、新規蛋白質M1の推定アミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号1に示すアミノ酸残基619の配列が得られた(図1A)。
該新規蛋白質M1の推定アミノ酸配列を用いて、既存のdatabase(Genbank)に対してBLAST(The National Center for Biotechnology Information)を用いた相同性検索を行ったところDblファミリーのサブファミリーメンバーの1つであるKIAA0424と73%の相同性を認めた(図2B、C)。両者は、Dbl相同(Dbl homology;DH)ドメイン、プレックストリン相同(Preckstrin homology;PH)ドメイン、Src相同3(SH3)ドメインを保持する点において同一であるが、KIAA0424には、新規蛋白質M1のN末端領域は存在しないことが判明した。この結果、配列表の配列番号1に示すアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質M1は新規蛋白質であることが確認された。
次に配列表の配列番号1の推定アミノ酸配列で示される新規蛋白質M1の、ヒト組織における発現を、ノザンブロット解析により確認した。多種のヒト組織から得たpoly(A)+RNAをブロットしたフィルターをClontech社より入手し、DIG標識したM1のcDNAプローブ、5’−GACCACACTGCCATCGCTG−3’および5’−TGTAGTTTACCAAGGACCG−3’でハイブリダイゼーションした。その結果、脳に高レベルで発現していることを確認した。また、tissue blotsによる解析では、脳以外に、睾丸でも存在を確認した。さらに、腎由来の細胞でも発現を確認した。
M1に対する抗体は、NZWウサギをM1のアミノ酸73−126を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫し調製した。APCに対する抗体は、NZWウサギをAPC遺伝子産物(以下APCと略称することもある)のアミノ酸1122−1729を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫して調製した。APCのN末端領域に対するマウスモノクローナル抗体は公知の方法で調製した(Miyashiro et al.1995)。抗体は、それぞれ免疫に用いた抗原を結合させたアフィニティーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製した。精製したウサギポリクローナル抗M1抗体とGST融合M1(GST−M1)との結合反応性を調べたところ、得られた抗体は、GST−M1に強い反応性を示した。
本発明の新規蛋白質M1を発現させるために、発現プラスミドpcDNA3.1(+)のEcoRI/NotI部位にM1のcDNAを組み込み、COS−7細胞にトランスフェクションした。新規蛋白質M1の発現確認のため、M1cDNAを組み込んだベクター、コントロールベクター、HA−タグで標識したM1cDNAを組み込んだベクター、HA−タグを組み込んだベクターを、COS−7細胞にトランスフェクションした。培養した各形質転換体の溶解物、およびM1の存在が確認されているラット胎児脳の溶解物について、上記の様に取得した抗M1抗体、および抗HA抗体を用いて免疫沈降し、SDS−PAGEにより分画し、次いで抗M1抗体および抗HA抗体を用いてイムノブロットを行った。M1cDNAを組み込んだベクター(レーン3)、HA−タグで標識したM1cDNAを組み込んだベクター(レーン6、8)で形質転換したCOS−7細胞およびラット胎児脳(レーン1)では明らかに新規蛋白質の発現が認められ、その分子量は約85kDaであることが判明した(図2)。また、用いた抗M1抗体を抗原で事前処理しておく(図2中、pep.±で表示)と、新規蛋白質は検出されなかった。すなわち、抗M1抗体で認識される新規蛋白質M1が発現されたことが確認された。
ラット胎児脳溶解物について、上記で作製した新規蛋白質M1、およびAPCに対するウサギポリクローナル抗体、ならびにβ−カテニンに対するマウスモノクローナル抗体(Transduction Laboratories)を用いて免疫沈降し、SDS−PAGEにより各沈降物を分離後、各抗体を用いてイムノブロットを行った(図3)。レーン1および2はラット胎児脳の溶解物を抗M1抗体で、レーン3および4は抗APC抗体で、レーン5および6は抗β−カテニン抗体で免疫沈降した結果を、レーン1、3、5は、予め各抗体を対応する抗原で吸収して用いた結果(図3中、pep.±で表示)を示す。抗M1抗体で免疫沈降したM1が抗APC抗体もしくは抗β−カテニン抗体で検出され、抗APC抗体で免疫沈降したAPC遺伝子産物が抗M1抗体で検出され、抗β−カテニン抗体で免疫沈降したβ−カテニンが抗M1抗体で検出されることから、新規蛋白質M1はin vivoにおいてもAPCおよびβ−カテニンと結合していることが明らかとなった。
新規蛋白質M1の、APC結合ドメインの解析を行うため、M1の様々な欠失変異体(deletion mutant)を公知の方法で作製し、APCとの結合領域を酵母(yeast)を用いた2ハイブリッドシステムにより調べた。具体的には、M1の欠失変異体を、下記の特異的なプライマーを用いPCRを行って、pGAD424にクローニングし、GAL4活性化ドメインとの融合体を作成した。
5’−ATTTATTGTAGTTTACCAAGGAC−3’
5’−TGCGCTGAAGCACTCTGGGAC−3’
5’−GACCACACTGCCATCGCTGATG−3’
5’−CCTCAGCCGAACGAAGCTGGCTG−3’
5’−CTTGCTGCTCTGCGCCTCCGC−3’
5’−GTGAATCAGGACGAGCCCGCG−3’
5’−GATGTTCCCGAAGATGGTACG−3’
5’−ATGCCTGATGGAGCTCTGGAC−3’
ついで、該GAL4活性化ドメインとの融合体を2ハイブリッドシステムにおいてHIS3 auxotrophyとβ−gal リポーター活性を用いて、その相互作用を試験した。その結果、図4に示すように、SH3の上流の領域にAPC結合部位が存在することが判明した。
新規蛋白質M1は、Dblファミリーのサブファミリーの1つであるKIAA0424と高い相同性を有する。Dblファミリーは低分子量G蛋白質の1つであるRhoファミリーに作用するGDP解離促進蛋白質である。新規蛋白質M1と、KIAA0424との相同性に着目し、新規蛋白質M1の機能解析のため、Rhoファミリー低分子量G蛋白質(small G protein;RhoA、Rac1、CDC42)との結合を調べた。ニッケルビーズに吸着させた新規蛋白質M1をRhoA、Rac1およびGST−CDC42と、0.1%NP−40を含むE1A緩衝液〔50mM HEPES,pH7.0,150mM NaCl,50mM NaF,5mM EDTA,1mMDTT,50μg/mL phenylmethylsulphonyl fluoride(PMSF),1μg/ml ロイペプチン,1μg/mlアプロチニン〕中で4℃にて1時間混合し、共沈殿物をイムノブロッティングで検出した。図5に示すように、陽性コントロールとして使用したDblは用いた全てのRhoファミリー低分子量G蛋白質と結合するが、新規蛋白質M1はRhoAおよびRac1とは結合したが、CDC42とは結合しなかった。
次に、新規蛋白質M1のGEF活性について検討した。低分子量G蛋白質からのGDP解離を調べるために使用する[3H]GDP結合型の低分子量G蛋白質を、2pmolの各低分子量G蛋白質を0.2μM[3H]GDPと30℃で20分間、導入用緩衝液(loading buffer;20mM Tris−HCl、pH8.0、3mM MgCl2、10mM EDTAおよび1mM ジチオスレイトール)中でインキュベートすることにより得た。低分子量G蛋白質からの[3H]GDPの解離を防ぐため、375mM MgCl2を終濃度が18mMとなるように加え、直ちに、該混合液を氷冷した。[3H]GDPの解離は、反応溶液(20mM Tris−HCl、pH8.0、6mM MgCl2、3.5mM EDTAおよび1mM ジチオスレイトール)に250倍過剰の非標識GDP、GTPおよびM1を加えることにより25℃で行った(図6A、B)。次に、低分子量G蛋白質へのGTPの結合を調べるために使用するGDP結合型の低分子量G蛋白質を、2pmolの各低分子量G蛋白質を0.2μM非標識GDPと30℃で20分間、導入用緩衝液(loading buffer)中でインキュベートし、375mM MgCl2を終濃度が18mMとなるように加えることにより得た。[35S]GTPγSの、GDP結合型低分子量G蛋白質への結合は、10μMの[35S]GTPγSおよびM1を反応溶液に加えることにより、25℃で実施した(図7A、B)。解離試験、結合試験の両方において、反応は1mlの氷冷した停止用緩衝液(20mM Tris−HCl、pH8.0、25mM MgCl2および100mM NaCl)を加えて、停止した。希釈した混合溶液をニトロセルロースろ紙で濾過し、フィルターを数回、停止用緩衝液で洗浄した。ろ紙上に捕捉された放射活性をカウントした。タンパク質濃度はウシ血清アルブミン(BSA)を標準蛋白質として用いて測定した。
さらに、様々な濃度のM1について、APC−armの存在下または非存在下で、20nMの[3H]GDPを結合させた結合型のRac1からの[3H]GDP解離促進能を30℃で15分間インキュベーションして測定した。APC−armはM1より過剰量、モル比で5倍となるように加えた。図8に示すように、M1のGDP解離促進能は、APC−armの添加により、増強された。すなわち、M1は、APCと結合することにより、GDP解離促進能が増強されることが示唆された。
次に、本発明の新規蛋白質M1の細胞内局在について検討した。まず、Madin−Darby canine kidney(MDCK)上皮細胞株を10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)中で培養した。全長のM1およびM1△NB(アミノ酸127−619)cDNAはCMVプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(+)中にサブクローン化した。プラスミドDNA、pMKITNeo−Mycタグで標識したAPC−armは、APC(アミノ酸446−880)の部分配列をコードしているDNA断片をSRαプロモーターを有するpMKITNeoに挿入することにより構築した。発現プラスミドは、リポフェクトアミン(LipofectAMINE;Life Technologies社)を用いて、使用者マニュアルにしたがって、MDCK細胞にトランスフェクトした。
さらに、M1△NBを安定に発現するMDCK細胞株を樹立し、M1が細胞の形態、骨格に与える影響を調べたところ、M1△NB発現細胞株5クローンはいずれも密に接着せずばらばらに増殖する傾向が見られた。新規蛋白質M1の細胞接着への関与が推定された。
Claims (5)
- 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
- 請求項2記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドの製造方法。
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