JP2004516227A - 免疫関連疾患を治療するための組成物と方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は新規なタンパク質を含む組成物と免疫関連疾患の診断と治療の方法に関する。
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は免疫関連疾患の診断と治療のための組成物と方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害から修復を開始し、外来生物体に対する生得及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複合化し、多くの場合は多重に相互に関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、さらなる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路、及び多くの生物学的システム/経路、に関与しており、一又は複数のこれらの経路の重要点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス/経路、又は有益なプロセス/経路の刺激のいずれかにより生じる。
【0003】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Tリンパ球(T細胞)は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。主要組織適合性複合体(MHC)内の遺伝子によりコードされる自己分子と結合する抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片の表面上のMHC分子と共に示され得る。T細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去するものである。T細胞はヘルパーT細胞及び細胞障害性T細胞を含む。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原−MHC複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーT細胞は種々のサイトカイン、例えばリンホカインを分泌し、これはB細胞、細胞障害性T細胞、及び免疫反応に寄与している種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担っている。
【0004】
体液及び細胞媒介性の免疫反応の双方における中心的事象は、ヘルパーT細胞の活性化及びクローン増殖である。ヘルパーT細胞の活性化は、抗原提示細胞の表面におけるT細胞レセプター(TCR)−CD3複合体と抗原−MHCとの相互作用により開始される。この相互作用は休止ヘルパーT細胞が細胞サイクル(G0からG1転移)に入るのを誘発する生化学的事象のカスケードを媒介し、結果として、IL−2と、時々はIL−4とに対する高親和性レセプターが発現する。活性化されたT細胞は増殖及び記憶細胞とエフェクター細胞への分化のサイクルを通って進行する。
TCRを通して媒介されたシグナルに加えて、T細胞の活性化は、抗原提示細胞により放出されるサイトカイン、又は抗原提示細胞とT細胞上の膜結合性分子との相互作用により誘発される付加的な同時刺激に関与している。サイトカインIL−1及びIL−6は同時刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面で発現したB7分子とT細胞表面で発現したCD28及びCTLA−4分子との相互作用により細胞の活性化がなされる。活性化されたT細胞は増加した数の細胞付着分子、例えばICAM−1、インテグリン、VLA−4、LFA−1、CD56等を発現する。
【0005】
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応(MLR)におけるT細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫反応において、炎症細胞は傷害又は感染部位に浸潤する。移動細胞は、影響を受けた組織の組織学的検査により決定可能な好中球、好酸球、単球又はリンパ球でありうる。Current Protocols in Immunology, 編集 John. E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.参照。
免疫関連疾患は免疫反応を抑制することにより治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を使用することは、免疫媒介及び炎症疾患の治療に有用である。免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に有用であり(タンパク質を直接、又は抗体アゴニストの使用を介して)、よって免疫関連疾患を改善する。
【0006】
(発明の概要)
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断と治療ための組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタンパク質(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)の同定に基づく。免疫関連疾患は免疫反応を阻害又は増強することで治療することができる。免疫反応増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子は治療に使用可能である。また、免疫反応の抑制が重要である場合には、このような刺激分子は阻害されうる。
中和抗体は、免疫刺激活性を有する分子を阻害する分子の例であり、免疫関連及び炎症疾患の治療に役立つ。また、免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に(タンパク質を直接又は抗体アゴニストの使用を経て)利用されうるし、こうして免疫関連疾患は改善する。
【0007】
従って、PROポリペプチド及び抗−PRO抗体及びそれらの断片は、免疫関連疾患の診断及び/又は治療(予防を含む)に役立つ。刺激タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の阻害に利用可能である。阻害タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の刺激に有用である。また、PROポリペプチド及び抗−PRO抗体は免疫関連及び炎症疾患の治療のための薬や薬剤の調製に有用である。
一実施態様において、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様において、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【0008】
他の態様において、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されたPROポリペプチドcDNAのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
さらなる態様では、本発明は、(a)ここに開示されたATTCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【0009】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたPROポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の実施態様は、PROポリペプチドコード配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗−PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約20のヌクレオチド長、又は少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約40のヌクレオチド長、又は少なくとも約50のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約70のヌクレオチド長、又は少なくとも約80のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約100のヌクレオチド長、又は少なくとも約110のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約130のヌクレオチド長、又は少なくとも約140のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約160のヌクレオチド長、又は少なくとも約170のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約190のヌクレオチド長、又は少なくとも約200のヌクレオチド長、又は少なくとも約250のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約350のヌクレオチド長、又は少なくとも約400のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約500のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約700のヌクレオチド長、又は少なくとも約800のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長、又は少なくとも約1000のヌクレオチド長、又は少なくとも約1500ヌクレオチド長、又は少なくとも約2000ヌクレオチド長、又は少なくとも約2500ヌクレオチド長、又は少なくとも約3000ヌクレオチド長、又は少なくとも約4000ヌクレオチド長、又は少なくとも約5000ヌクレオチド長、又はそれ以上であり、ここで、「約」という用語は、その参照長のプラス又はマイナス10%の参照ヌクレオチド配列長を意味する。それぞれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、それぞれのPROポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのヌクレオチド配列断片(類)が新規であるかを決定することにより常套的方法により決定することができることに留意される。そのようなそれぞれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子によりコードされるPROポリペプチド断片、好ましくは抗−PROポリペプチド抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのポリペプチド断片である。
【0010】
他の実施態様では、本発明は、上記で同定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。
或る態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたATTCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
【0011】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、又は少なくとも約81%のポジティブ、又は少なくとも約82%のポジティブ、又は少なくとも約83%のポジティブ、又は少なくとも約84%のポジティブ、又は少なくとも約85%のポジティブ、又は少なくとも約86%のポジティブ、又は少なくとも約87%のポジティブ、又は少なくとも約88%のポジティブ、又は少なくとも約89%のポジティブ、又は少なくとも約90%のポジティブ、又は少なくとも約91%のポジティブ、又は少なくとも約92%のポジティブ、又は少なくとも約93%のポジティブ、又は少なくとも約94%のポジティブ、又は少なくとも約95%のポジティブ、又は少なくとも約96%のポジティブ、又は少なくとも約97%のポジティブ、又は少なくとも約98%のポジティブ、又は少なくとも約99%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
特定の態様では、本発明は、N末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを持たない単離されたPROポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の態様では、本発明は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたPROポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
【0012】
他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ここに記載のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものが含まれる。
さらに他の実施態様では、本発明は、アンチセンスプローブとして、又はゲノム及びcDNAヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでそれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意の任意のものから誘導されうる。
【0013】
さらなる他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を模倣又は阻害する、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは、PROポリペプチド又は小分子に結合する抗体である。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、PROポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はPROポリペプチドの活性を模倣し(アゴニスト抗体)、又は逆に抗体はPROポリペプチドの活性を阻害又は中和する(アンタゴニスト抗体)。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗−イディオタイプ抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
【0014】
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤との混合物においてポリペプチドと結合するPROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含む組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が免疫刺激分子を含むとき、組成物は:(a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるT−リンパ球の増殖を増加させるのに役立つ。さらなる態様では、組成物が免疫阻害分子を含むとき、組成物は:(a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させ、(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低減させ、又は(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるT−リンパ球の増殖を減少させるのに役立つ。他の態様では、組成物はさらなる活性成分を含み、それは例えばさらなる抗体又は細胞毒又は化学療法剤であり得る。好ましくは、組成物は滅菌される。
他の実施態様では、本発明は、上述の用途を有する組成物又は医薬品の調製のための、本発明のPROポリペプチド及び抗体の使用に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を構成するベクターや組み換え宿主細胞に関する。またさらなる実施態様では、本発明は、抗体が発現するような条件下で、抗体をコードする核酸を使って形質転換された宿主細胞を培養し、細胞媒地から抗体を回収することにより、そのような抗体を生産する方法に関する。
【0015】
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドをコードする核酸分子、又はその補体にハイブリッド形成する単離された核酸分子に関する。この核酸は好ましくはDNAであり、ハイブリッド形成は好ましくは緊縮条件下で起こる。このような核酸分子は、ここに同定される増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用でき、翻って、対応する増幅遺伝子の変調において、又は増幅反応のアンチセンスプライマーとしての用途が見いだされる。さらに、このような配列はリボザイム及び/又はトリプルヘリックス配列の一部として燃使用でき、翻って、増幅遺伝子の調節で使用することもできる。
他の実施態様では、本発明は、ポリペプチドを含有及び/又はそれを発現すると疑われる細胞を、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体に暴露し、抗体の細胞への結合を測定することを含んでなるPROポリペプチドの存在を決定する方法に関する。
さらなる他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得た組織細胞の試験試料における、及び(b)同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における、PROポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、対照試料と比較して試験試料の発現レベルが高い又は低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
【0016】
他の実施態様では、本発明は(a)抗−PROポリペプチド抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、(b)試験試料中でのそれぞれのPROポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、該疾患の有又は無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監視との比較において実施される。試験試料における多量の複合体形成は、試験組織細胞を得た哺乳動物における免疫疾患の有又は無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術により監視することができる。通常、試験試料は、免疫システムに欠陥又は異常があると推測される個体から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体と(例えば緩衝剤のような)担体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはPROポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
【0017】
さらなる実施態様では、本発明は:
容器;
容器上の説明書;及び
容器内に収容された活性剤を含む組成物;
を含んでなる製造品に関し;ここでその組成物は哺乳類における免疫反応の刺激又は阻害に効果があり、容器上の説明書は組成物が免疫関連疾患の治療に使用されうることを示しており、組成物中の活性剤はPROポリペプチドの発現及び/又は活性を刺激又は阻害する薬剤である。好ましい態様では、活性剤は、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、又は抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体である。
【0018】
さらなる実施態様は、PROポリペプチドに候補化合物を、これら2つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と状況の下で接触させることにより、PROポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法である。特定の態様では、候補化合物又はPROポリペプチドのどちらかは固体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出標識を保有する。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−PRO抗体に応答性のある症状の治療に有用な医薬品の調製のための、ここに記載されたPROポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−PRO抗体の使用に向けられる。
【0019】
(好適な実施態様の詳細な説明)
I.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド(類)」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/数字、すなわち特に、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を称する。「PRO/数字ポリペプチド」及び「PRO/数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体(ここで更に定義する)を含む。ここに記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列PROポリペプチド(類)」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PRO/数字ポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド(類)」という用語には、特に、特定のPRO/数字ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここで記載の天然配列PROポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字又は下線で示す。しかし、添付の図面に開示したPRO/数字ポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置1としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置1の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をPROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
「PROポリペプチド(類)細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しない前記ポリペプチドの形態を称する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えないと思われる。よって、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン/細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約5又はそれ未満のアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、そのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【0020】
ここに開示する種々のPRO/数字PROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC−末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸以下である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに当該技術にいて日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1−6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683−4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのC−末端境界のいずれかの側の約5アミノ酸以下の範囲内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「PROポリペプチド変異体」、「PRO/数字変異体」又は「PRO変異体」とは、ここに(例えば以下に)定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN−又はC−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の特に定められた他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、又は少なくとも約20アミノ酸長、又は少なくとも約30アミノ酸長、又は少なくとも約40アミノ酸長、又は少なくとも約50アミノ酸長、又は少なくとも約60アミノ酸長、又は少なくとも約70アミノ酸長、又は少なくとも約80アミノ酸長、又は少なくとも約90アミノ酸長、又は少なくとも約100アミノ酸長、又は少なくとも約150アミノ酸長、又は少なくとも約200アミノ酸長、又は少なくとも約300アミノ酸長、又は少なくとも約400アミノ酸長、又は少なくとも約500アミノ酸長、又は少なくとも約600アミノ酸長、又は少なくとも約700アミノ酸長、又は少なくとも約800アミノ酸長、又は少なくとも約900アミノ酸長、又は少なくとも約1000アミノ酸長、又は少なくとも約1200アミノ酸長、又は少なくとも約1400アミノ酸長、又は少なくとも約1500アミノ酸長、又はそれ以上である。
【0021】
ここで同定されているPROポリペプチド配列に対して「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のPRO/数字ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが以下の表1に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表1に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから公に入手可能であり、また以下の表1に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2と3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO」とは関心ある仮のPRO/数字ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」とは関心ある「PRO」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「X」、「Y」、「Z」はそれぞれ異なった仮のアミノ酸配列を表す。
【0022】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての%アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて得ることもできる。殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2を用いた場合、%アミノ酸配列同一性値は、WU−BLAST−2により決定されるように(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるPROポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)関心あるPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含むポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが関心あるPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
また、パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードしてもよく、別にNational Institute of Health, Bethesda, MDから得てもよい。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【0023】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性PROポリペプチドをコードする核酸分子でを意味し、(1)ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド;(2)ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド;(3)ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又は(4)ここに開示された全長ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する。通常は、PROポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、(1)ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド配列、(2)ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、(3)ここに開示されたシグナル配列を伴うか伴わないPROポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は(4)ここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。変異体は天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PROポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約210のヌクレオチド長、又は少なくとも約240のヌクレオチド長、又は少なくとも約270のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約500のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約700のヌクレオチド長、又は少なくとも約800のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長、又は少なくとも約1000のヌクレオチド長、又は少なくとも約1200のヌクレオチド長、又は少なくとも約1400のヌクレオチド長、又は少なくとも約1600ヌクレオチド長、又は少なくとも約1800のヌクレオチド長、又は少なくとも約2000ヌクレオチド長、又は少なくとも約2500ヌクレオチド長、又は少なくとも約3000ヌクレオチド長、又は少なくとも約3500のヌクレオチド長、又は少なくとも約4000ヌクレオチド長、又は少なくとも約5000ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるPRO核酸のヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、%核酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが以下の表1に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表1に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから公に入手可能であり、また以下の表1に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0024】
核酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。%核酸配列同一性の計算の例として、表4と5は、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO−DNA」は、関心ある仮のPROポリペプチドコード化核酸配列を表し、「比較DNA」は関心ある「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「N」、「L」及び「V」はそれぞれ異なった仮のヌクレオチド配列を表す。
特に断らない限り、ここで用いられる全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて得ることもできる。殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2を用いた場合、%核酸配列同一性値は、WU−BLAST−2により決定されるように(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列(すなわち参照配列)を有する関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、関心ある比較核酸分子(すなわち、関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子が比較されるPRO変異ポリヌクレオチドであってもよい配列)との間の、一致する同一ヌクレオチドの数を、(b)PRO参照配列のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bと少なくとも80%の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含む単離された核酸分子」という記載において、核酸配列Aは関心ある比較核酸分子であり、核酸配列Bは関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【0025】
また、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードしてもよく、別にNational Institute of Health, Bethesda, MDから得てもよい。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチド数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【0026】
他の実施態様では、PRO変異体ポリヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能な核酸分子である。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「ポジティブ(陽性)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基(例えば、保存的置換の結果として、下記の表6参照)を含む。ここでの目的のために、ポジティブの%値は、(a)天然配列PROポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるPROポリペプチド配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列)との間の、WU−BLAST−2のBLOSUM62マトリクス内で決定されるようにポジティブ値をスコアされるアミノ酸残基の数を、(b)関心あるPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の%値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。しかしながら、上述のALIGN−2及びNCBI−BLAST2について記載したように実施されるアミノ酸配列同一性比較には、同一のみならず類似した特性をもつ比較配列におけるアミノ酸残基が含まれる。関心あるアミノ酸残基に対してポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表1に定義)であるものである。
【0027】
ALIGN−2又はNCBI−BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対するポジティブの%値(与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対して或る程度の%ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2又はNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによってポジティブ値であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%ポジティブは、BのAに対する%ポジティブとは異なると認識されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、自然環境におけるPROポリペプチドの少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
【0028】
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、PROポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される状態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたPROポリペプチドコード化核酸は、天然の細胞中に存在するポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある特定のポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるものを含む。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0029】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
【0030】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といったものある。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
「抗体」(Abs)と「免疫グロブリン」(Igs)は、概略的に、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、PROポリペプチドに特異的なエピトープと結合する単鎖抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片もカバーする。抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体は、それぞれPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドに免疫学的に結合する抗体である。抗体は、抗体に接触し得るPROポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。例えば、抗体はポリペプチドの任意の細胞外ドメインに、また全ポリペプチドが分泌されたものである場合は、抗体が結合のために利用可能なポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。
【0031】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の「高頻度可変領域」又は「相補性決定領域(CDR)」と呼ばれる3又は4のセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成するCDRにより連結されたβシート配置を主にとる4又は5のFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して結合せしめられ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91−3242, Vol.I, 647−669頁[1991]を参照のこと)。CDRの範囲を決定するためには少なくとも2つの技術がある:(1)交雑種配列可変性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda. MD);及び(2)抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Chothia, C.等., (1989), Nature 342:877)。さらにまた、CDRは先の技術の両方により同定される残基を導入するハイブリッド形成アプローチを使用して決定することもできる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057−1062[1995]);単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るF(ab’)2断片が生じる。
【0032】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH−VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているFab’に対するここでの命名である。F(ab’)2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
【0033】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 [1975]により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624−628[1991]、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581−597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。また、ファージミド及びファージベクターを使用する抗体の調製について記載した米国特許第5,750,373号、同5,571,698号、同5,403,484号及び同5,223,409号を参照のこと。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855[1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522−525(1986);Reichmann等, Nature 332, 323−329[1988];及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593−596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心ある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来する「プリマタイズした(primatized)」抗体を含む。旧世界ザルの残基を含有する抗体も本発明の範疇に入れることができる。例えば、米国特許第5,658,570号;同5,693,780号;同5,681,722号;及び同5,756,096号を参照のこと。
【0034】
本発明の抗体及びその断片には、抗体を一又は複数のCDR領域及び/又はフレームワーク領域のアミノ酸配列を変化させて、それが結合する抗原に対する抗体又はその断片の親和性を改変させた「親和成熟(affinity matured)」抗体も含まれる。親和成熟により、出発抗体と比較して抗原に対する成熟抗体の親和性が増加又は低減する結果となる。典型的には、出発抗体はヒト化、ヒト、キメラもしくはマウス抗体であり、親和成熟した抗体は出発抗体よりも高い親和性を有する。成熟プロセス中、CDR又はフレームワーク領域における一又は複数のアミノ酸残基は、任意の標準的な方法を使用して異なる残基に変えられる。適切な方法には、よく知られているカセット突然変異法(Well等, 1985. Gene 34:315)又はオリゴヌクレオチド媒介突然変異法(Zoller等, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487−6504)を使用する点突然変異が含まれる。また親和成熟は、多くの変異体を産出し、所望の親和性を有する変異体を抗原又はリガンドに対する改善された親和性に基づき、変異体のライブラリ又はプールから選択する、既知の選択法を使用して実施することもできる。既知のファージライブラリ技術をこのアプローチ法で簡便に使用することができる。例えば米国特許第5,750,373号、米国特許第5,223,409号等を参照のこと。
ヒト抗体は本発明の抗体の範囲に入る。ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985);Boerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991);米国特許第5,750,373号]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により十分に記載されている。
【0035】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接又は間接的に抱合して、「標識」化合物を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の化合物がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここで含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫システムの成分が、哺乳動物の病的状態を引き起こし、媒介し又は寄与等するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫不全症、異常増殖等が含まれる。
「T細胞媒介疾患」という用語は、T細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか寄与等する疾患を意味する。T細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等を伴い、例えばT細胞により分泌されるリンホカインによりB細胞が刺激されている場合はB細胞に関連した効果を伴う。
本発明で治療可能で、そのいくつかは免疫又はT細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vaculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎及び他の非肝炎性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎;クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばAIDS(例えばHIV感染)、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【0036】
「治療」とは、疾患の病理の進行又は改変の防止を意図して行われる。従って、「治療」とは、治癒的処置、予防的処置及び防止的処置の両方を称する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。免疫関連疾患の治療において、治療薬は直接的に免疫反応の成分度合いを減少又は増加させてもよいし、又は他の治療薬、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対してより敏感にしてもよい。
「有効量」という用語は、インビトロアッセイで測定される哺乳動物における免疫反応の成分で、検出可能な改善を引き起こすか、誘発するか、又は結果をもたらすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。例えば、T細胞の増殖及び/又は血管透過性の増加又は低減がここで提供される実施例で測定される。さらに「治療有効量」は、哺乳動物における免疫反応の成分で、病状を少なくとも緩和させる(ケースによっては増加又は減少させる)のに有効で、上述したパラグラフに定義された治療に効果的な結果をもたらすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
免疫関連疾患の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、抗体生産、自己抗体生産、補体生産及び活性化、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化、組織空間への炎症細胞(好中球、エシオン好性球、単球、リンパ球)の侵入等を含む。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、ハムスター、イタチ、ネコ等を含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【0037】
ここで用いられる「細胞障害薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び/又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90及びRe186)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(Taxol, Bristol−Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(Taxotere, Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、S相でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S相以外の位置で)ブロックする薬剤、例えばG1停止又はM相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM相ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S相停止にも溢流し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、及びara−Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、1つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インシュリン;プロインシュリン;レラキシン;プロレラキシン;糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体化ホルモン(LH);肝臓成長因子;線維芽成長因子;プロラクチン;胎盤ラクトゲン;腫瘍壊死因子−α及び−β;ミューラー阻害因子;マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF−β等の神経成長因子;血小板成長因子;TGF−α及びTGF−β等のトランスフォーミング成長因子(TGF);インシュリン様成長因子−I及びII;エリスロポエチン(EPO);骨誘発因子;インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えばマクロファージ−CSF(M−CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF);及び顆粒球−CSF(G−CSF);インターロイキン(ILs)、例えばIL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12;腫瘍壊死因子、例えばTNF−α及びTNF−β;及びLIF及びキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【0038】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは、融合するPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20のアミノ酸残基)を有する。
PROポリペプチド変異体における「活性な」及び「活性」とは、PROポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体の産生を誘発する能力及び/又は生物学的機能を保持する本発明のタンパク質の形態を指す。より詳細には、「生物学的活性」とは、天然配列又は天然発生PROポリペプチドによって引き起こされる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能を指す。さらにより詳細には、ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能な抗体又は他の分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、このような分子が、組織への炎症細胞の侵入を誘発又は阻害し、T細胞の増殖又は活性化を刺激又は阻害し、細胞からのサイトカインの放出を阻害し、又は血管透過性を増加又は低減させる能力のことである。他の特定の生物学的活性は増加した血管透過性又はその阻害である。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列PROポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列PROポリペプチドの生物学的活性を模倣又は増幅する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、PROポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「小分子」とは、ここで、約600ダルトン未満の分子量を持つと定義され、一般的に有機化合物である。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(場合によっては化学療法剤を含む)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【0039】
【0040】
【0041】
II. 本発明の組成物と方法
1.本発明のPROポリペプチドの調製
本発明は、本出願でPROポリペプチドとされるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に開示するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」又は「PRO」で呼称する。
特に、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド(それぞれ、UNQ174、UNQ178、UNQ186、UNQ190、UNQ200、UNQ214、UNQ209、UNQ219、UNQ146、UNQ240、UNQ239、UNQ293、UNQ330、UNQ365、UNQ316、UNQ317、UNQ318、UNQ319、UNQ313、UNQ332、UNQ334、UNQ540、UNQ434、UNQ408、UNQ407、UNQ430、UNQ557、UNQ491、UNQ598、UNQ516、UNQ701、UNQ585、UNQ633、UNQ678、UNQ606、UNQ630、UNQ653、UNQ608、UNQ698、UNQ732、UNQ722、UNQ728、UNQ900、UNQ859、UNQ179、UNQ21、UNQ236、UNQ303、UNQ294、UNQ322、UNQ388、UNQ435、UNQ433、UNQ483、UNQ545、UNQ589、UNQ707、UNQ685、UNQ693、UNQ739、UNQ1888、UNQ1866、UNQ1947及びUNQ2448に相当)をコードするcDNAは、以下の実施例においてさらに詳細に開示されているように、同定され単離されている。
【0042】
特に、本明細書は、天然配列PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430及びPRO5727ポリペプチドをそれぞれコードする、cDNA、DNA29101−1276、DNA30871−1157、DNA30942−1134、DNA33087−1158、DNA33460−1166、DNA34387−1138、DNA35558−1167、DNA35638−1141、DNA35916−1161、DNA39523−1192、DNA40620−1183、DNA40982−1235、DNA44184−1319、DNA44205−1285、DNA45410−1250、DNA45416−1251、DNA45419−1525、DNA47365−1206、DNA47470−1130、DNA48314−1320、DNA49435−1219、DNA50921−1458、DNA53974−1401、DNA54228−1366、DNA54231−1366、DNA56405−1357、DNA57033−1403、DNA57690−1374、DNA59220−1514、DNA59294−1381、DNA59776−1600、DNA59849−1504、DNA60775−1532、DNA61873−1574、DNA62814−1521、DNA64885−1529、DNA65404−1551、DNA65412−1523、DNA66675−1587、DNA68864−1629、DNA68872−1620、DNA68874−1622、DNA76400−2528、DNA77624−2515、DNA30868−1156、DNA36638−1056、DNA38260−1180、DNA40592−1242、DNA41374−1312、DNA44194−1317、DNA53517−1366、DNA53971−1359、DNA53987−1438、DNA57700−1408、DNA59620−1463、DNA60627−1508、DNA64890−1612、DNA66659−1593、DNA66667−1596、DNA68818−2536、DNA84210−2576、DNA92218−2554、DNA96878−2626、DNA98853−1739を記載している。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの事実上のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。寄託された配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託物の配列は正確な配列を含むと理解される。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0043】
B.PROポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PRODNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROの翻訳後プロセスを変えうると認識するであろう。
天然全長配列PRO配列又はここに記載したPROの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROと比較してPROのアミノ酸配列が変化するPROをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
PROポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、N−末端又はC−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【0044】
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換と題して表6に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6に例示的置換と示した又は以下に参照としてアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【0045】
【0046】
本発明のポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
【0047】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、もしくは好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位指向性)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cuningham及びWells, Science, 244: 1081−1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0048】
C.PROの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)−ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79−86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【0049】
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列PROに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失(潜在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O−結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981)に記載されている。
【0050】
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号又は同第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、PROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
【0051】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly−his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 (1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547−553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204−1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192−194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163−15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz−Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393−6397 (1990)]を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG1分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0052】
D.PROの調製
以下の記述は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid−Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149−2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
【0053】
1.PROポリペプチド(類)をコードするDNAの単離
PROをコードするDNAは、ポリペプチドmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPROコード化遺伝子は、ゲノムライブラリ、オリゴヌクレオチド合成、又は他の既知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリは、関心ある遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(例えば、PROポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。PROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の手段はPCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
下記の実施例には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
【0054】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の定められた領域内又は全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【0055】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPROポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456−457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527−537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348−352 (1988)を参照のこと。
ここのベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompTkanを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF−lac)169 degP ompT rbs7 ilvGkanを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【0056】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383);クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968−975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98−8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265−278 [1988]);カンジダ;トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259−5263 [1979]);シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日発行のEP 394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開のWO 91/00357);及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284−289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205−221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475−479 [1985])が含まれる。ここではメチロトロピック(methylotropic)酵母が適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見出される。
グリコシル化PROポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より特定の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS−7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 (1980));ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術範囲内にあると考えられる。
【0057】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージミド又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPROコード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362,179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PROコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4−1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
【0058】
発現及びクローニングベクターは、通常、PROコード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成に指向するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【0059】
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROポリペプチドコード化配列の5’又は3’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’、時には3’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620−625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40−46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【0060】
4.遺伝子発現の検出
遺伝子発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201−5205 (1980)]、サザンブロット法、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、PROポリペプチドをコードするDNAに融合した外因性配列に対して調製され得る。
【0061】
5.ポリペプチドの精製
PROの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン−X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York (1982)に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROポリペプチドの性質に依存する。
【0062】
E.組織分布
PROを発現する組織の位置は、種々のヒト組織でのmRNAの発現を測定することにより同定可能である。このような遺伝子の位置により、PROポリペプチドの活性の刺激又は阻害の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特異的組織における遺伝子の位置により、以下で論議される活性阻止アッセイについての試料組織も提供される。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来の、mRNAの転写の定量化のためのノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201−5205 [1980])、サザンブロット、ドットブロット(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二重鎖又はDNA−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培地又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列PROポリペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNA配列に基づく合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、PROポリペプチドをコードするDNAに融合した外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
【0063】
F.抗体結合性の研究
遺伝子増幅実験の結果は、それぞれ、組織細胞上でのPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの効果を阻害する、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体の能力が試験される抗体結合性の研究によって更に証明できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147−158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは2つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第1の抗体に結合し、その後第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第2の抗体は検出可能部分で標識され(直接サンドウィッチアッセイ)、あるいは検出可能部分で標識された抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はELISAアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【0064】
G.細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定されたポリペプチドと遺伝子との関係、及び免疫関連疾患の進行及び病理との関係をさらに理解するために使用するすることができる。
異なる方法では、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られた細胞型の細胞をここに記載のcDNAで形質移入し、これらのcDNAの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞を所望の遺伝子で形質移入し、免疫機能活性を監視できる。このような形質移入株化細胞は、次いで、例えばT細胞増殖又は炎症細胞の侵入を調節するといった、免疫機能を刺激又は阻害するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、(下記のような)トランスジェニック動物から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている(Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642−648 [1985]参照)。
一つの適切な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応(MLR)である。Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版。このアッセイでは、試験化合物が活性化したT細胞の増殖を刺激又は阻害する能力をアッセイする。レスポンダーT細胞の懸濁液を同種刺激細胞で培養し、トリチウム化チミジンの取込によりT細胞の増殖度合いを測定する。このアッセイはT細胞反応性の一般的な測定法である。多くのT細胞が応答し、IL−2の活性化をもたらすため、このアッセイにおける応答性の差異は、応答細胞によるIL−2生産の差異に部分的に反映する。MLRの結果を、標準的なリンホカイン(IL−2)検出アッセイにより証明することができる。上掲のCurrent Protocols in Immunology, 3.15.6.3.。
MLRアッセイにおける増殖性T細胞応答は、アッセイされる分子の直接的な有糸分裂促進特性又は外的な抗原誘発活性化による可能性がある。PROポリペプチドのT細胞刺激活性のさらなる証明は、同時刺激アッセイにより得ることができる。T細胞活性化にはT細胞レセプター(TCR)を通して媒介される抗原に特異的なシグナル、及び第2のリガンド結合相互作用、例えばB7(CD80、CD86)/CD28結合相互作用を通して媒介される同時刺激シグナルが必要である。CD28の架橋により、活性化T細胞によるリンホカインの分泌が増加する。T細胞活性化はネガティブ又はポジティブ効果を有するリガンドの結合を通してネガティブ及びポジティブコントロールの双方を有する。CD28及びCTLA−4はB7に結合するIgスーパーファミリーの糖タンパク質に関連している。B7に結合するCD28は、ポジティブなT細胞活性化同時刺激効果を有し;逆にB7に結合するCTLA−4はネガティブなT細胞非活性化効果を有する。Chambers. C.A. and Allison. J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997)9:396。Schwartz, R.H., Cell(1992)71:1065;Linsey, P.S. and Ledbetter. J.A. Annu. Rev. Immunol.(1993)11:191;June, C.H.等 Immunol. Today(1994)15:321;Jenkins. M.K., Immunity(1994)1:405。同時刺激アッセイにおいて、PROポリペプチドはT細胞同時刺激又は阻害活性をアッセイするものである。
【0065】
PROポリペプチド、並びにT細胞の増殖の刺激剤(同時刺激剤)である本発明の他の化合物及びアゴニスト、例えばアゴニスト抗体で、例えばMLR及び同時刺激アッセイで決定されるようなものは、免疫機能の貧弱さ、最適下限又は不適切さに特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。これらの疾患はT細胞(及びT細胞媒介免疫性)の増殖及び活性化を刺激し、刺激化合物、例えば刺激性PROポリペプチドの投与により哺乳動物における免疫反応を増強することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えばPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド又はそのアゴニスト抗体であり得る。
本発明の刺激化合物の直接的用途は、プライムT細胞上で発現するリガンド(4−IBBL)に結合し、T細胞活性化及び成長の信号を発する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである4−IBB糖タンパク質を用いる実験において確認されている。Alderson, M.E.等,J.Immunol.(1994)24:2219。
また、アゴニスト刺激化合物の用途は実験的に確認されている。アゴニスト抗−4−IBB抗体を用いた治療による4−IBBの活性化は腫瘍の根絶化を増強する。Hellstrom. I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol.(1998)18:1。以下により詳細に記載する腫瘍治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激化合物の用途の他の例である。
さらに、免疫刺激又は増強効果はMLRアッセイにおいて阻害することが見出されたPROの活性に拮抗又はこれをブロックすることにより達成することができる。化合物の阻害活性を無効にすることで、ネットの刺激効果が生じる。適切なアンタゴニスト/ブロック化合物は阻害タンパク質を認識し、これに結合する抗体及びその断片であり、それにより該タンパク質とそのレセプターとの効果的な相互作用がブロックされ、レセプターを通したシグナル化が阻害される。この効果は、おそらくCTLA−4結合による阻害シグナルの除去することにより、T細胞増殖を増強する抗−CTLA−4抗体を使用する実験で確認されている。Walunas, T.L.等, Immunity(1994)1:405。
別に、免疫刺激又は増強効果は、血管透過性増強特性を有するPROの投与により達成することもできる。増強した血管透過性は炎症及び免疫細胞(例えば単球、好酸球、PMN)の局部的浸潤により緩和可能な疾患に有益である。
他方、T細胞増殖/活性化、リンホカイン分泌、及び/又は血管透過性の直接阻害剤であるPROポリペプチド並びに本発明の他の化合物は、免疫反応の抑制に直接使用することができる。これらの化合物は、過剰活性、最適上限(superoptimal)又は自己免疫反応により特徴付けられる免疫関連疾患の治療、及び免疫反応の程度を低減するのに有用である。本発明の化合物のこの用途は、レセプターB7に結合するCTLA−4がT細胞を非活性化するという上述の実験により確認されている。本発明の直接阻害化合物は類似した方法で機能する。血管透過性を抑制する化合物の用途は炎症を低減することが期待される。このような用途は過度の炎症に関連した病状の治療に有益である。
別に、刺激PROポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果をブロックする化合物、例えば抗体により、ネットの阻害効果が生じ、T細胞の増殖/活性化及び/又はリホカイン分泌を阻害することにより、T細胞媒介免疫反応を抑制するために使用することができる。ポリペプチドの刺激効果をブロックすると、哺乳動物の免疫反応が抑制される。この用途は抗−IL2抗体を使用する実験において確認されている。これらの実験において、抗体はIL2に結合し、そのレセプターへのIL2の結合が阻害され、よってT細胞阻害効果が達成される。
【0066】
H.動物モデル
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、T細胞機能アッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。(1997年9月18日に発行されたPCT公報WO 97/33551参照。)
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制された、又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は認識し、宿主抗原に反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはMHC抗原及び少量の移植抗原に対するT細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、T細胞がインビボ組織の破壊を媒介する能力を試験し、及び移植拒絶におけるそれらの役割を測定する手段である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がT細胞、ヘルパーT細胞及びキラー−エフェクターT細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが示された。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889−992。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶は、Tanabe, M.等, Transplantation(1994)58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol.(1994)4330−4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
遅延型過敏用の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイを提供する。遅延型過敏反応は、抗原投与による攻撃後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるT細胞媒介インビボ免疫反応である。またこれらの反応は組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(MS)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE、MS用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.5.に詳細に記載されている。
EAEは、T細胞及び単核細胞の炎症、続いて中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるT細胞媒介自己免疫疾患である。EAEは、一般的にヒトにおけるMS用の関連動物モデルであると考えられている。Bolton. C., Multiple Sclerosis(1995)1:143。急性及び再発性弛緩モデルの双方が開発されている。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit15.1及び15.2.に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するT細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Duncan. I.D.等, Molec. Med. Today(1997)554−561に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患用のモデルも参照のこと。
接触性過敏は、細胞媒介免疫機能の単純遅延型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅延型過敏反応が生じている外因性ハプテンに皮膚を暴露し、測定して定量する。接触性過敏は最初に敏感相、続いて顕現相を含む。顕現相はTリンパ球が以前接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫脹及び炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作成される。適切な手順は、Current Protocols in Immunology,;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1):37−44(1998)を参照のこと。
関節炎用の動物モデルは、コラーゲン−誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎用の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及びsubchondral骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit15.5.に記載されているプロトコルを使用し、自己免疫関節炎に対する活性度を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology(1996)88:569に記載されているCD18及びVLA−4インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
喘息モデルでは、抗原誘発気道反応性亢進、肺好球菌増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させることで誘発され、ついで、エアゾールにより送達された同様のタンパク質で動物を攻撃する、と記載されている。いくつかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)では、エアゾール抗原で攻撃されたヒトにおけるアトピー性喘息に類似した徴候が示された。本発明の化合物の、喘息治療における活性及び有効性を試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.(1998)18:777とそこに引用された文献に記載されている。
【0067】
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患用の動物モデルにおいて試験することができる。T細胞が乾癬の病原である証拠も示唆されている。本発明の化合物はSchon. M.P.等, Nat. Med.(1997)3:183により記載されているscid/scidマウスモデルにおいて試験することができ、マウスは組織病理学的傷害に類似した乾癬を示す。他の適切なモデルはNickoloff. B.J.等, Am. J. Path.(1995)146:580に記載されているようにして調製されたヒト皮膚/scidマウスキメラである。
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、関心ある動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号);胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148−615 [1985]);胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313−321 [1989]);胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803−1814 [1983]);精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717−73 [1989])を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232−636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はPCR増幅が用いられる。次いで、mRNA発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
さらに、特定組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために、動物を、例えば組織学的検査により免疫疾患の病原の徴候について検査してもよい。またブロック実験も実施することができ、ここでトランスジェニック動物は本発明の化合物で処理され、化合物のT細胞増殖刺激又は阻害の度合いが測定される。これらの実験において、上述のようにして調製したPROポリペプチドに結合するブロック抗体は動物に投与され、免疫機能における効果が測定される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムDNAと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするcDNAは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5’と3’末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113−152参照]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【0068】
I.免疫アジュバント治療
一実施態様において、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍(癌)治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。T細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のMAGE、BAGE及びGAGEファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織で無症状であるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においてはかなりの量が発現している。DeSmet. C.等, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。T細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine(1997)3:682;Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)94:8099;Lynch. D.H.等, Nature Medicine(1997)3:625;Finn. O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol.(1998)21:114。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、T細胞増殖/活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
J.候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド−免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のタンパク質と相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789−5793 (1991)]に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245−246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578−9582 (1991)]に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2−ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1−lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。2−ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる:通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で2つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第3の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視する。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【0069】
K. 免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、T細胞の増殖/活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害又は刺激するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子を含む。
例えば、アンチセンスRNA及びRNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469−471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照のこと。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【0070】
L.抗体
本発明は、さらにT細胞の増殖、エオシン好性白血球の浸潤、血管透過性等を阻害(アンタゴニスト)又は刺激(アゴニスト)する抗−PRO抗体及びその断片を提供するものである。このような抗−PRO抗体又はその断片の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
抗−PRO抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0071】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗−PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59−103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51−63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrison等, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0072】
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323−329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323−327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534−1536 (1988)]の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985);Boerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991);米国特許第5,750,373号 ]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び/又は突然変異誘発を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製される(一般的にマウス、ヒト化又はヒトの)出発抗体のものよりも、5倍、より好ましくは10倍、さらに好ましくは20又は30倍の親和性を有する。
【0073】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はPROに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537−539[1983])。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655−3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【0074】
WO 96/27011に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えられた第2の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab’−TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’−チオールに再転換し、他のFab’−TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217−225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547−1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444−6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【0075】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPROポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−PROアームは、特定のPROポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のPROポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はPROポリペプチド結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はPROポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(TF)に結合する。
5.ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体は2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【0076】
6.エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191−1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918−2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560−2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti−Cancer Drug Design 3: 219−230 (1989)参照。
7.免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性抱合)に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫抱合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
抗体及び細胞障害薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス−アジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6−ジイソシアネート等)、及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、組織の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体−レセプター抱合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合抱合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【0077】
8.免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG−誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286−288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0078】
9.抗体の製薬組成物
本発明の活性PRO分子(例えばPROポリペプチド、抗−PRO抗体、及び/又はその変異体)、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性PRO分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロイド;ヘキサメトニウムクロイド;ベンズアルコニウムクロイド;ベンズエトニウムクロイド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又は又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここで開示されたスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式でこの分野で知られた標準技術を用いて製剤することができる。
リポフェクション又はリポソームもPRO分子を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えDNA技術によって生成できる。(例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889−7893 [1993]を参照のこと)。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性PRO分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤又はPRO分子を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とγ−エチル−L−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−(D)−3−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【0079】
N.治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、T細胞の増殖の刺激、T細胞の増殖の阻害、血管透過性の増加又は低減又はそれらの阻害によって特徴付けられるものを含む、T細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vaculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎及び他の非肝炎性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎;クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質/組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Tリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Tリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はTリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
【0080】
リウマチ様関節炎(RA)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はTリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己IgGに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる;多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間/体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、2つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第2の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、RA疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し;小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。RAで生じる可能性のある他の徴候には:心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多く場合16才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はRAといくつかの類似点があり;リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な3つのカテゴリー:小関節(pauarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にHLA−B27遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には:強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎;HLA−B27(血清学的には、クラスI MHCのHLA−B座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎;眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はCD8+Tリンパ球であり、クラスI MHC分子により付与される抗原を標的としている細胞である。CD8+T細胞は、MHCクラスI分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスI MHC対立遺伝子HLA−B27と反応する。HLA−27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってCD8+細胞の反応が誘発されると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり;これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり:血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり;血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ICAM−1は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するT細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には:胃腸管:萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動/運動性となっている平滑筋:腎臓:小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖:骨格筋:萎縮、間質性線維症:炎症:肺:間質性肺炎及び間質性線維症:及び心臓:収縮バンド壊死、瘢痕/線維症が含まれる。
【0081】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷/炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びRNAに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小RNA−タンパク質複合体であるRo及びLa抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血/壊死/変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第2の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には:全身壊死性血管炎:多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎:ヴェゲナー肉芽腫症;リンパ腫様肉芽腫症:及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には:粘膜皮膚リンパ節症候群(MLNS又は川崎病)、単離したCNS血管炎、ベヘット(Behet’s)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び/又はADCC/Fc−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【0082】
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc−レセプター−媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには:内在的モデルラット(BUF及びBBラット)及びチキン(肥満チキン種);誘導性モデル:チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
I型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり;この破壊は自己抗体及び自己反応性T細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン−非−反応性の表現型を産出することができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はT細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び/又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出/誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群;及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。MSにおいて、疾患の誘発及び進行はTリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Tリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はT細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み;CD4+Tリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Tリンパ球の駆動によると思われる。
好球性肺炎;特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Tリンパ球に依存して発生する。
乾癬はTリンパ球媒介炎症疾患である。障害はTリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【0083】
喘息;アレルギー性鼻炎;アトピー性皮膚炎;食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はT細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるTリンパ球、及びIgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患はTリンパ球依存性であり;Tリンパ球の機能を阻害することで改善される。免疫及び/又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、MLRを刺激する(分子/誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばHIV感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び/又はTリンパ球が発育しているものもいることが示されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることが示されている。MLRにおけるTリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボにて利用される。MLRにおけるTリンパ球増殖反応を増強する分子(又は拮抗方式で同様のレセプターに影響を及ぼす小分子アゴニスト又は抗体)は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、MLRにおいてリンパ球反応を阻害する分子は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応抑制するように、インビボで機能し;このような分子は新生物細胞自体により発現するか、又はそれらの発現は他の細胞中の新生物により誘発され得る。このような阻害分子(抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段)の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
加えて、炎症誘発性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害;脳卒中;心筋梗塞;アテローム性動脈硬化;急性肺傷害;出血性ショック;火傷;敗血症/敗血症ショック;急性尿細管壊死;子宮内膜症;変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
免疫アジュバント治療、他の治療的養生法において、抗癌剤を、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばCD20、CD11a、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又は血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体を投与することも好ましい。別に、あるいは加えて、同一のもの又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。一実施態様では、PROポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いてPROポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とPROポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μg/kgから15mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な1日の用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kgの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【0084】
O.製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質(例えばPRO分子を含有するもの)を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第2の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
P.免疫関連疾患の診断及び予知
或る種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における用途が見出される。例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質(「マーカー遺伝子産物」)の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、参照としてここに取り込む。
【0085】
(実施例)
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えDNA技術の標準的な手法を用いる:Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【0086】
実施例1
ヒトPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430及びPRO5727ポリペプチドをコードするcDNAクローンの単離
以下に記載するcDNAクローンを単離するための様々な技術を使用した。使用した方法の一般的な記載は直ぐ後に示すが、単離された特定の配列に関連した詳細は各天然配列に対して別個に記載している。PROポリペプチドの実際の配列はATCCに寄託されたクローンによりコードされるか、又はその中に含まれるものであり、寄託された配列とここに開示された配列との間に不一致がある場合は、寄託された配列が正しい配列であると理解される。
ECD相同性
Swiss−Prot公的データベースからの約950の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(あれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えばGenBank)、私的ESTデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)、及びジェネンテクの企業のESTを含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いてEST配列の6フレーム翻訳に対してECDタンパク質配列を比較することで実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物を、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
公的及び私的データベースから引き出した種々のESTを使用して、コンセンサスDNA配列を構築した。次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定し、またここで同定された特定の天然配列PROポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。
全長天然配列クローン源に対して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、以下に記載するPCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマーの一方を用いて、特定の天然配列PROポリペプチドをコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリ構築のためのRNAは、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、小腸、胃筋肉細胞等を含む、種々のヒト組織ライブラリから単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(pRKB等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。クローンは周知の直ぐに利用できる方法を使用して配列化した。
【0087】
アミラーゼ酵母菌スクリーニング:
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを種々の組織(例えば、上述のECD相同性の手法において示したもの)からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬とプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターpRK5DにおいてオリゴdTプライムしたcDNAライブラリの作成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを1000bpを越えるサイズに分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dは、sp6転写開始部位に続いてSfiI制限酵素部位がありXhoI/NotIcDNAクローニング部位がさらに続くクローニングベクターである。
2.ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5’末端を優先的に提示するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上述した)一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST−AMY.0においてLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いてランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500−1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、SfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータを持ち、クローニング部位の後においてマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。よって、アミラーゼ配列と読み枠を合わせて融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
3.形質転換及び検出
上記第2項に記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌ろベクターの混合物を、次いで製造者に推奨されているようにして電気穿孔した。次いで、SOC培地(Life Technplogies、1ml)を添加し、その混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体を、次いでアンピシリンを含む20の標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCisco−勾配を用いてDNAを単離した。次いで精製したDNAについて以下の酵母プロトコールを実施した。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定とさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56−5A(ATCC−90785)であった。この株は以下の遺伝子型:MATアルファ、ura3−52、leu2−3、leu2−112、his3−11、his3−15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び/又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に関与する他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p又はSSA1p−4p)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施した。次いで、形質転換細胞を寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているようにして調製した。終夜培養は、次いで新鮮なYEPDブロス(500ml)中におよそ2x106細胞/ml(約OD600=0.1)となるまで希釈し、1x107細胞/ml(約OD600=0.4−0.5)まで再成長させた。
【0088】
次いで細胞を収集し、5,000rpmで5分間の間、Sorval GS3 ローター中のGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水中に再懸濁することにより形質転換のために調製し、Beckman GS−6KR遠心機において50mlのファルコン管内で3,500rpmにて再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE(10ml, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのLi20OOCCH3)で続けて洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、ミクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精巣DNA(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換DNA(1μg vol.<10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl, 40%のポリエチレングリコール−4000, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi2Ac pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5−10秒間遠心分離し、デカント及びTE(500μl, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地上に拡げた。
あるいは、複数の少量反応の代わりに、形質転換を1回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208−210 (1994)に記載されているようにして調製されたウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体は30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを含ませることにより実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176−179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red−120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD−Ura寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した(最終濃度50−100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離された同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌に対してポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD−Ura寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
標準的な技術による単離と配列決定により、以下に記載するようにさらなるデータベース検索の基礎となる酵母EST断片を同定した。
【0089】
4.アセンブリ
上述したように同定された酵母EST断片を使用し、種々の発現配列タグ(EST)データベースを検索した。ESTデータベースは、公的ESTデータベース(例えばGenBank, Merck/Wash U)及び私的ESTのデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いてEST配列の6フレーム翻訳とECDタンパク質配列を比較することにより実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、コンセンサスDNA配列を、BLAST又はBLAST−2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列及びジェネンテク社の企業のEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
このコンセンサス配列に基づいて:1)PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)特定のPROポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCRによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて関心ある遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリ構築のためのRNAを種々のヒト組織から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【0090】
シグナルアルゴリズム:
ジェネンテク社によって開発された企業のシグナル配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び/又は私的(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)なデータベースからの発現配列タグ(EST)並びに集団化及び構築されたEST断片に使用した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮下の配列又は配列断片の5’末端の第1と、場合によっては第2のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第1のATGに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも35の一義的なアミノ酸をコードしなければならない。第1のATGが必要なアミノ酸を有する場合、第2のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNAと対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)の組を用いてスコアをつけた。
上述した手順の結果、公的ESTデータベース(例えば、GenBank)と企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)を含む様々な発現配列タグ(EST)データベースと比較してEST配列が同定された。相同性検索はコンピュータプログラムBLAST及又はBLAST2を用いて実施された(Altshul等、Methods in Enzymology 266:460−480(1996))。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。この結果、全長クローンに対応するさらなるEST配列が同定され、検査され、配列決定され、又はオリゴヌクレオチドのクローン作成のためのテンプレートとして提供され、天然配列PROポリペプチドをコードするDNAを単離するための種々の組織ライブラリをスクリーニングするために使用された。
【0091】
A.ヒトPRO200(UNQ174)をコードするcDNAクローンの単離
VEGFとの相同性に基づいてIncyte Phamaceuticalsデータベースから同定された発現配列タグ(EST)に基づくプローブを、ヒト神経膠腫株化細胞G61から誘導されたcDNAライブラリのスクリーニングに使用した。スクリーニングは本出願の他の箇所で開示した手順と同様な方法で行った。特に、Incyteクローン「INC1302516」を以下の4つのプローブを生成するのに用いた:
9つのポジティブを同定し特徴付けした。3つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させなかった一つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム(ORF)をCMV−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ(FLAG, Kodak)及びヒスチジンタグ(His8)をORFと停止コドンの間に挿入した。UNQ174−His8及びUNQ174−FLAGを、SuperFect(Qiagen)によりヒト胚腎臓293細胞に形質移入し、[35S]メチオニン及び[35C]システインで3時間パルス標識した。15倍濃縮無血清条件培地20マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動させたとき(SDS−PAGE)、両方のエピトープタグタンパク質が同時に移動する。ヒトFc(IgG)配列の前にORFにクローニングすることによりUNQ174−IgG発現プラスミドを作成した。
UNQ174−IgGプラスミドを、Lipofectin(GibcoBRL)を用いて、10%ウシ胎児血清を添加したヒンクのTNM−FH培地(JRH Biosciences)において成長させた105Sf9細胞中にBaculogoldバキュロウイルスDNA(Pharmagen)で同時形質移入した。細胞を28℃で5日間インキュベートした。上清を収集し、次いで約10の感染多発性(MOI)でのSf9細胞感染による第1のウイルス増幅に使用した。細胞を3日間インキュベートし、次いで上清を回収し、1mlの上清の30μlのプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)への結合、続くSDS−PAGE分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第1の増幅の上清を、ESF−921培地(Expression Systems LLC)中において約0.1のMOIで成長させたSf9細胞のスピナー培地500mlの感染に使用した。収集した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインAセファロース4ファストフロー(Pharmacia)カラムに結合させることにより精製した。
同定されたクローンDNA29101の全ヌクレオチド配列をFig1(配列番号:1)に示す。クローンDNA29101(配列番号:1)は、太字の下線で示したように単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基285−287に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置1320−1322に見出される停止コドン(TAG)で終端する(Fig1、配列番号:1)。予測されるPRO200ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ174、配列番号2)は345アミノ酸長であり、39029ダルトンの算定分子量及び6.06のpIを持ち、これはFig2(配列番号:2)に示される。潜在的N−グルコシル化部位はアミノ酸残基25、54及び254にある。CUBドメインはアミノ酸残基52−65、118−125及び260−273にある。
UNQ174(配列番号:2)をコードするDNAを含むcDNAは、1998年3月5日にATCCに寄託され、寄託番号209653が付されている。
【0092】
B.ヒトPRO204(UNQ178)をコードするcDNAの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ESTを同定した。ヒト胎児網膜cDNAライブラリをPCRオリゴヌクレオチドプライマーでスクリーニングし、EST配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成することにより確認した。
cDNAクローンを同定し全体を配列決定した。DNA30871の全ヌクレオチド配列をFig3(配列番号:11)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA30871−1157(配列番号:11)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置367−378に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1498−1500に見出される停止コドン(TAA)で終端する(Fig3;配列番号:11)。予測されるPRO204前駆体(すなわち、UNQ178、配列番号:12)は374アミノ酸長であり、39285ダルトンの算定分子量及び6.06のpIを持ち、Fig4に示される。UNQ178(配列番号:12)をコードするDNAを含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209380が付与されている。
C.ヒトPRO212(UNQ186)をコードするcDNAの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用した結果、DNA30942の全長DNA配列(Fig5;配列番号:13)と誘導天然配列タンパク質UNQ186(配列番号:14)を同定をした。
この手順で使用したPCRプライマー(正方向及び逆方向)とプローブは次のものである:
DNA30942の全ヌクレオチド配列をFig5(配列番号:13)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA30942(配列番号:13)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置101−103に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1001−1003の停止コドン(TGA)で終端する(Fig5;配列番号:13)。Fig6(配列番号:14)の予測されるPRO212ポリペプチド前駆体は300アミノ酸長であり、32680ダルトンの算定分子量と8.70のpIを持つ。Fig6(配列番号:14)のPRO212配列は膜貫通ドメインを欠いていると考えられる。また、Fig6(配列番号:14)のアミノ酸1〜215は4つのシステインリッチドメイン(CRD)を含むECDを提示していると考えられる。DNA30942(配列番号:13)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託され(DNA30942−1134として特定)、ATCC寄託番号209254が付与されている。
【0093】
D.ヒトPRO216(UNQ190)をコードするcDNAクローンの単離
PRO212の単離のための上述した手順と類似した手順を使用し、PRO216ポリペプチドUNQ190(配列番号:19)(Fig8)をコードするDNA33087(配列番号:18)(Fig7)を単離した。
太字の下線で示したように、DNA33087は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基268−270に見かけの翻訳開始部位を有し、残基1531−1553の停止コドン(TAG)で終端する(Fig7、配列番号:18)。予測されるPRO215ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ190、配列番号:19)は421アミノ酸長であり、49492ダルトンの算定分子量及び5.51のpIを持つ(Fig8)。
ヒドロパシー分析により、アミノ酸残基1から20にシグナル配列、アミノ酸残基268−274及び300−306にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基230−235にN−ミリストイル化部位、及び残基146から167、217から238にロイシンジッパーの存在が示唆された。伝統的な単離技術とは別に、DNA配列は、Dayhoffタンパク質AB000114_1をコードする受託番号AB000114としてGenbankから公的に入手可能である。
また別に、配列はOhno等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228(2):411−414(1996)に記載されている。DNA33087を含むcDNAクローン(DNA33087−1157として同定)は1997年9月16日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、ATCC寄託番号209381が付与されている。
E.ヒトPRO226(UNQ200)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA33460の全長DNA配列(Fig9;配列番号:20)と誘導天然配列タンパク質UNQ200(配列番号:21)を同定をした。
太字の下線で示したように、DNA33460は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基62−64に見かけの翻訳開始部位を有し、残基1391−1393の停止コドン(TGA)で終端する(Fig9、配列番号:20)。予測されるPRO226ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ200、配列番号:21)は443アミノ酸長であり、49391ダルトンの算定分子量及び4.82のpIを持ち、これはUNQ200としてFig10(配列番号:21)に示している。DNA33460−1166と命名されたDNA33460(配列番号:20)を含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209376が付与されている。
上述の手順で使用したヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0094】
F.ヒトPRO240(UNQ214)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA34387の全長DNA配列(Fig11;配列番号:25)と誘導天然配列タンパク質UNQ214(配列番号:26)を同定をした。
DNA34387の全ヌクレオチド配列をFig11(配列番号:25)に示す。太字の下線で示したように、DNA34387は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置12−14に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置699−701の停止コドン(TGA)で終端する(Fig11、配列番号:25)。予測されるPRO240ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ214、配列番号:26)は229アミノ酸長であり、24689ダルトンの算定分子量、7.83のpIを持ち、Fig12に示している。DNA34387(配列番号:25)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託されATCC寄託番号209260が付与されている。
上述に記載した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
G.ヒトPRO235(UNQ209)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35558の全長DNA配列(Fig13;配列番号:30)と誘導PRO235天然配列タンパク質UNQ209(Fig14、配列番号:31)を単離した。
DNA35558の全ヌクレオチド配列をFig13(配列番号:30)に示す。太字の下線で示したように、Fig13に示すDNA35558クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置667−669に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2323−2325の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO235ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ209、配列番号:31)は552アミノ酸長であり、61674ダルトンの算定分子量と6.95のpIを持つ(Fig14)。DNA35558を含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209374が付与されている。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
【0095】
H.ヒトPRO245(UNQ219)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35658の全長DNA配列(Fig15;配列番号:35)と誘導PRO245天然配列タンパク質UNQ219(Fig16、配列番号:36)を単離した。
上述の方法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
DNA35638の全ヌクレオチド配列をFig15(配列番号:35)に示す。クローンDNA35638は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置89−91に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1025−1027の停止コドン(TAG)で終端する(Fig15、配列番号35)。予測されるPRO245ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ219、配列番号:36)は312アミノ酸長であり、34554ダルトンの算定分子量と9.39のpIを持つ(Fig36)。DNA35638−1141と命名したDNA35638(配列番号:35)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209265が付与されている。
I.ヒトPRO172(UNQ146)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35916の全長DNA配列(Fig17;配列番号:40)と誘導PRO172天然配列タンパク質UNQ146(Fig18、配列番号:41)を単離した。
Fig17に太字の下線で示したように、クローンDNA35916(配列番号:40)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置38−40に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2207−2209の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO172ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ146:配列番号:41)は723アミノ酸長であり、78055ダルトンの算定分子量と6.17のpIを持つ(Fig18)。DNA35916(配列番号:40)を含むcDNAクローンは1997年10月28日にATCCに寄託され(DNA35916−1161と命名)、ATCC寄託番号209419が付与されている。
上述の方法で使用されるヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0096】
J.ヒトPRO273(UNQ240)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA39523の全長DNA配列(Fig19;配列番号:45)と誘導PRO273天然配列タンパク質UNQ240(Fig20、配列番号:46)を単離した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA39523は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置500−502の停止コドン(TAG)で終端する(Fig19)。予測されるPRO273ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ240、配列番号:46)は111アミノ酸長であり、13078ダルトンの算定分子量と10.37のpIを持つ(Fig20)。DNA39523(配列番号:45)を含むcDNAクローンは1997年10月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209424が付与されている。
K.ヒトPRO272(UNQ239)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肺組織において、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA40620(Fig21;配列番号:50)と誘導PRO272天然配列タンパク質UNQ239(配列番号:51)を同定した。
PRO272をコードするDNA配列を単離するために合成して使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA40620(配列番号:50)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置35−37に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1020−1022の停止コドン(TGA)で終端する(Fig21)。予測されるポリペプチド前駆体は328アミノ酸長であり(Fig22)、37493ダルトンの算定分子量と4.77のpIを持つ。DNA40620(配列番号:50)を含むcDNAクローンは1997年10月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209388が付与されている。
L.ヒトPRO332(UNQ293)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA40982の全長DNA配列(Fig23、配列番号:56)と誘導PRO332天然配列タンパク質UNQ293(Fig24、配列番号:57)を同定した。
上述した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
DNA40982の全ヌクレオチド配列(配列番号:56)をFig23に示す。Fig23に太字の下線で示したように、クローンDNA40982(配列番号:56)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置342−344に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2268−2270の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO332ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ293、配列番号:57、Fig24)は642アミノ酸長であり、72067ダルトンの算定分子量と6.60のpIを持つ。DNA40982(配列番号:56)を含むcDNAクローン(DNA40982−1235と命名)は1997年11月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209433が付与されている。
【0097】
M.ヒトPRO526(UNQ330)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44184(Fig25、配列番号:61)と誘導PRO526天然配列タンパク質UNQ330(Fig26、配列番号:62)を同定した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA44184(配列番号:61)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置514−516に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1933−1935の停止コドン(TGA)で終端する(Fig61)。予測されるPRO526ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ330、配列番号:62)は473アミノ酸長である(Fig62)。Fig62に示すUNQ330(配列番号:62)タンパク質は約50708ダルトンの算定分子量と9.28のpIを持つ。DNA44184を含むcDNAクローンは1998年3月26日にATCCに寄託され(DNA44184−1319と命名)、寄託番号209704が付与されている。
UNQ330(配列番号:62)の分析により、シグナルペプチド配列はおよそアミノ酸1−26にあることが明らかになった。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸135−156にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸436−439にある。N−グリコシル化部位は、およそアミノ酸82−85、179−182、237−240及び423−426にある。フォンウィルブランド因子(VWF)型Cドメインは、およそアミノ酸411−425に見られる。当業者であれば、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸にどのヌクレオチドが対応するかを理解できるであろう。
【0098】
N.ヒトPRO701(UNQ365)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44205(Fig27、配列番号:66)と誘導PRO526天然配列タンパク質UNQ365(Fig28、配列番号:67)を同定した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
Fig27に太字の下線で示したように、クローンDNA44205(配列番号:66)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置50−52に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2498−3000の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO701ポリペプチド前駆体(すなわちFig28、UNQ365、配列番号:67)は816アミノ酸長であり、91794Daの算定分子量(pI:5.88)を持つ。DNA44205を含むcDNAクローン(配列番号:66)(DNA44205−1285と命名)は1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209720が付与されている。
UNQ365(配列番号:67)は、およそアミノ酸位置25に潜在的シグナルペプチド切断部位を含む。アミノ酸位置83、511、716及び803には潜在的N−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼB型シグネーチャー2配列は、およそ残基125から135である。カルボキシルエステラーゼB型に相同な領域は、およそ残基54−74、197−212及び221−261である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸671からおよそ700に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から通常のようにして決定できる。
Q.ヒトPRO361(UNQ316)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45410(Fig29;配列番号:71)と誘導PRO361天然配列タンパク質UNQ316(Fig30、配列番号:72)を同定した。
ハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーを上述の方法に使用するために合成した:
太字の下線で示したように、クローンDNA45410(配列番号:71)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置226−228に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1519−1521の停止コドン(TAA)で終端する(Fig29)。予測されるPRO361ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ316、配列番号:72)は431アミノ酸長である(Fig30)。UNQ316としてFig30に示す天然配列PRO361タンパク質は、約46810の算定分子量と約6.45のpIを持つ。さらに、アルギナーゼファミリータンパク質を示す領域が、およそ残基F3からV14、またI39からT57に存在しており、膜貫通ドメインはおよそ残基P380からS409に存在している。DNA45410(配列番号:71)を含むcDNAクローンは1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209621が付与されている。
【0099】
P.ヒトPRO362(UNQ317)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45416(Fig31、配列番号:79)と誘導PRO362天然配列タンパク質UNQ317(Fig32、配列番号:80)を単離した。
上述の手順に使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA45416(配列番号:79)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1082−1084の停止コドン(TAA)で終端する(Fig31)。予測されるPRO362ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ317、配列番号:80)は321アミノ酸長である(Fig32)。Fig32に示すUNQ317タンパク質(配列番号:80)は約35544ダルトンの算定分子量と約8.51のpIを持つ。Fig32に示すUNQ317ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸149からおよそアミノ酸152にグリコサミノグリカン結合部位、及びおよそアミノ酸276からおよそアミノ酸306に膜貫通ドメインが存在することが証明された。DNA45416を含むcDNAクローン(配列番号:79)は1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209620が付与されている。
【0100】
Q.ヒトPRO363(UNQ318)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45419(Fig33、配列番号:86)と誘導PRO363天然配列タンパク質UNQ318(Fig34、配列番号:87)を単離した。
上述の手順に使用するために合成されたハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA45419(配列番号:86)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置190−192に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1309−1311の停止コドン(TGA)で終端する(Fig33)。予測されるPRO363ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ318、配列番号:87)は373アミノ酸長である(Fig34)。Fig34に示すUNQ318タンパク質(配列番号:87)は約41281ダルトンの算定分子量と約8.33のpIを持つ。Fig34に示すUNQ318ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基221からおよそ残基254に膜貫通ドメインの存在が証明された。DNA45419を含むcDNAクローン(配列番号:86)は1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209616が付与されている。
R.ヒトPRO364(UNQ319)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト小腸ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性を示すポリペプチドをコードした発現配列タグ(EST)(IncyteEST番号3003460)を同定した。
次に、ECD相同性手順で使用したのと類似した方法でIncyte3003460ESTに対するコンセンサスDNA配列を組み立て、全長DNA配列DNA47365(Fig35、配列番号:91)と誘導PRO364天然配列タンパク質UNQ319(Fig36、配列番号:92)を単離した。
上述のスクリーニング法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA47365(配列番号:91)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置121−123に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置844−846の停止コドン(TGA)で終端する(Fig35)。予測されるPRO364ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ319、配列番号:92)は241アミノ酸長である(Fig36)。Fig36に示すUNQ319(配列番号:92)タンパク質は約26000ダルトンの算定分子量と約6.34のpIを持つ。潜在的N−グリコシル化部位はFig36に示すアミノ酸配列のアミノ酸146から149の間に存在する。推定シグナル配列はFig36に示す配列のアミノ酸1から25、潜在的膜貫通ドメインはFig36に示す配列のアミノ酸162から180の間に存在する。DNA47365を含むcDNAクローン(DNA47365−1206と命名)は1997年11月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209436が付与されている。
【0101】
S.ヒトPRO356(UNQ313)(NL4)をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ヒトTIE−2 L1とTIE−2 L2との間に相同性を示すEST(#2939340)を同定した。
ESTに基づき、一対のPCRプライマー(正方向及び逆方向)とプローブを合成した:
Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターpRK5DにおいてClontech, Inc.から購入した子宮mRNA(Palo Alto, CA, USA, カタログ番号6537−1)よりオリゴdTプライムしたcDNAのライブラリーを作製した。pRK5Dは、sp6転写開始部位に続いてSfiI制限酵素部位を、さらにXhoI/NotIcDNAクローニング部位を持つクローニングベクターである。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で約1000bpを越えるように適切にサイズ分類し、XhoI/NotI切断pRK5Dにおいて所定の方向でクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上述で同定したPCRプライマー対でPCR増幅してスクリーニングを行った。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO356遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
上述のように単離したクローンのDNA配列決定により、天然配列PRO356(NL4)をコードする全長DNA配列(すなわちDNA47470、配列番号:101)及び誘導PRO356タンパク質配列UNQ313(配列番号:102)が得られた。
DNA47470の全ヌクレオチド配列をFig37(配列番号:101)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA47470(配列番号:101)は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置215−217に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置1038−1040にTAA停止コドンを有する。予測されるPRO356ポリペプチド前駆体は346アミノ酸長(すなわちUNQ313、配列番号:102)であり、40018ダルトンの算定分子量及び約8.19のpIを持つ。DNA47470(配列番号:101)を含むcDNAは1997年10月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209422が付与されている。
【0102】
T.ヒトPRO531(UNQ322)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA48314(Fig39、配列番号:106)と誘導PRO531天然配列タンパク質UNQ332(Fig40、配列番号:107)を単離した。
合成されたハイブリッド形成プローブPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA48314(配列番号:106)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置171−173に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2565−2567の停止コドン(TGA)で終端する(Fig39)。予測されるPRO531ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ332、配列番号:107)は789アミノ酸長である。Fig39に示すUNQ332タンパク質(配列番号:107)は約87552ダルトンの算定分子量と約4.84のpIを持つ。DNA48314を含むクローン(配列番号:106)は1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209702が付与されている。
配列番号:107のUNQ332アミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸122−132、231−241、336−346、439−449及び549−559にカドヘリン細胞外反復ドメインシグネーチャーが見られる。ATP/GTP結合部位モチーフA(P−ループ)は、配列番号:107のおよそアミノ酸285−292に見られる。N−グリコシル化部位は、配列番号:107のおよそアミノ酸567−570、786−790、418−421及び336−339に見られ、シグナルペプチドはおよそアミノ酸1−26にあり、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸685−712にある。
U.ヒトPRO533(UNQ334)をコードするcDNAクローンの単離
EST配列受託番号AF007268であるマウス線維芽細胞成長因子(FGF−15)を様々な公的ESTデータベース(例えば、GenBank, Dayhoff等)を検索するのに使用した。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST−2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いて、ECDタンパク質配列をEST配列の6フレーム翻訳と比較することにより実施した。検索の結果、GenBankEST AA220994が同定され、これがストラタジーンNT2ニューロン前駆体937230として同定された。
この配列に基づいて、1)PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ライブラリからのDNAをPCRプライマー対で、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCR増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマーの一方を使用するインビボクローニング手順により、関心あるPRO533遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリの作成のためのRNAはヒト胎児網膜から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、市販試薬(例えばInvitrogen, San Diego, CA;Clontech等々)を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(例えばpRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
cDNAクローンはその全体を配列決定した。全長ヌクレオチド配列DNA49435(配列番号:111)をFig41に示す。Fig41に太字の下線で示したように、クローンDNA49435(配列番号:111)は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置464−466に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置649−651の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO533ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ334、配列番号:112)は216アミノ酸長であり、24003ダルトンの算定分子量と6.99のpIを有する。クローンDNA49435−1219は1997年11月21日にATCCに寄託され(DNA49435−1219と命名)、ATCC寄託番号209480が付与されている。
上述の手順に使用されるオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0103】
V.ヒトPRO1083(UNQ540)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA50921(Fig43、配列番号:116)と誘導PRO1083天然配列タンパク質UNQ540(配列番号:117)を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA50921(配列番号:116)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置154−156に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2233−2235の停止コドン(TAG)で終端する(Fig43)。予測されるPRO1083ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ540、配列番号:117、Fig44)は693アミノ酸長である。Fig44に示すUNQ540(配列番号:117)タンパク質は約77738ダルトンの算定分子量と約8.87のpIを持つ。DNA50921を含むクローンは1998年5月12日にATCCに寄託され、寄託番号209859が付与されている。
アミノ酸配列UNQ540(配列番号:117)の分析により、推定シグナルペプチド配列がおよそアミノ酸1−25にあり、膜貫通ドメインがおよそアミノ酸382−398、402−420、445−468、473−491、519−537、568−590及び634−657にあり、ミクロボディーC末端標的シグナルがおよそアミノ酸691−693にあり、cAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位がおよそアミノ酸198−201及び370−373に、N−グリコシル化部位がおよそアミノ酸39−42、148−151、171−174、234−237、303−306、324−227及び341−344に、さらにG−タンパク質結合レセプターファミリードメインがおよそアミノ酸475−504にあることが明らかになった。
【0104】
W.ヒトPRO865(UNQ434)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA53974(Fig45、配列番号:123)と誘導PRO865天然配列タンパク質UNQ434(配列番号:124)を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA53974(配列番号:123)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1577−1579の停止コドン(TAA)で終端する(Fig45)。予測されるPRO865ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ865、配列番号:124)は468アミノ酸長である。Fig46に示すUNQ434(配列番号:124)タンパク質は約54393の算定分子量と約5.63のpIを持つ。DNA53974(配列番号:123)を含むクローンは1998年4月14日にATCCに寄託され、寄託番号209774が付与されている。
アミノ酸配列UNQ434(配列番号:124)の分析により、およそアミノ酸残基1−23に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基280からおよそ384に潜在的N−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基94からおよそ残基97に潜在的アミド化部位、およそアミノ酸残基20からおよそ23、及びおよそ残基223からおよそ残基226にグリコサミノグリカン結合部位、およそアミノ酸残基216からおよそ残基222にアミノトランスフェラーゼクラス−Vピリドキシル−ホスフェートアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基338からおよそ残基343のインターロイキン−7タンパク質に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロックが存在することが明らかになった。
【0105】
X.ヒトPRO770(UNQ408)をコードするcDNAクローンの単離
公的な発現配列タグ(EST)DNAデータベース(Merck/Washington University)を全長マウスm−FIZZ1DNA(DNA53517)で検索し、AA524300と命名した、m−FIZZ1DNAと相同性を示したESTを同定した。
ESTAA524300に相当する全長クローンをIncyte(Lncyte Pharmaceuticals, Palo Alto, California)から購入し、その全体を配列決定した。
得られたPRO770コード化全長クローンの全ヌクレオチド配列をFig47に示す。太字の下線で示したように、DNA54228と命名されたこの全長クローン(配列番号:133)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置100−102に見かけの翻訳開始部位を有し(Fig47;配列番号133)、残基433−435の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO770ポリペプチド先駆体(20のアミノ酸の推定シグナル配列を含む)(すなわちUNQ408、配列番号134)は111アミノ酸長であり、11730ダルトンの算定分子量と7.82のpIを持つ。m−FIZZ1に対するその相同性に基づいて(ALIGNソフトウェアを使用して、50%)、タンパク質はm−FIZZ1のヒト相同体であると信じられ、h−FIZZ1と命名した。DNA54228を含むcDNAクローン(配列番号:133)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209801が付与されている。
m−FIZZ1(DNA53517)の同定とクローニング
マウス喘息モデル 6〜8週齢の雌のBalb/Cマウスを、二つの実験グループ:対照と喘息に分けた。喘息グループを10μgの卵白アルブミン+1mgのミョウバンで腹腔内に免疫化する一方、対照グループは免疫しなかった。2週間後、UltraNebネブライザー(DeVilbiss)でエアロゾル化したPBSに入れた卵白アルブミン10mg/mlのエアロゾルに、7日連続して一日当り30分間2ml/minの流速で毎日マウスをさらした。最後のエアロゾルの投与の1日後に、全血、血清及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料を収集し、肺を収集し、組織学的検査、免疫組織化学及びインサイツハイブリッド形成のために保存した。
BAL試料のゲル電気泳動 16%のトリシンゲル上でのゲル電気泳動法によるBAL試料の検査は、喘息マウスからのBAL試料にあっては低分子量のタンパク質が発現されるが、対照マウスのBAL試料では発現しないことが示された。この低分子量のタンパク質をm−FIZZ1と名付けたが、8300ダルトンのマーカータンパク質(IL−8)と同時移動することが分かった。
部分的タンパク質配列 関心あるタンパク質をPVDF膜上に移し、エドマン分解により配列決定した。この配列は以下に記載する種々のクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとなった。
部分的cDNA配列 我々は、部分的タンパク質配列の配列の最初の7個と最後の7個のアミノ酸に対する推定DNA配列に対応する2つの縮重オリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。
正常なマウスの肺から調製されたcDNAを88bpの生成物を生じたPCR反応のテンプレートとして使用した。この88pbの生成物は、PCRプライマーをコードする54の既知の塩基対と、他の部分的m−FIZZ1配列をコードする34の新規な塩基対を含んでいた。
全長cDNAクローン この第2の部分配列を使用してプライマーを設計し、最終的にマウスの肺ポリ(A)+RNAのRT−PCRによる全長FIZZクローン(DNA53517)を成功裡に得た。
このオリゴをオリゴd(T)と組み合わせてRT−PCRプライマーとして使用した。
【0106】
Y.ヒトPRO769(UNQ407)をコードするcDNAクローンの単離
公的な発現配列タグ(EST)DNAデータベース(Merck/Washington University)を上述の全長マウス動物m−FIZZ1DNA(DNA53517)で検索し、EST W42069を同定した。
EST断片W42069に相当する全長クローンをLncyte Pharmaceuticals,(Palo Alto, California)から購入し、全体を配列決定し、最終的に全長ヌクレオチド配列DNA54231(配列番号:139)を同定した。
全長の天然配列PRO769クローンに相当するヌクレオチド配列をFig49に示す。太字の下線で示したように、DNA54231と命名されたこのクローン(配列番号:139)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置75−79に見かけの翻訳開始部位を有し、残基417−419の停止コドン(TGA)で終端する(Fig49)。予測されるPRO769ポリペプチド先駆体(10のアミノ酸のシグナル配列を含む)(すなわちUNQ407、配列番号140)は114アミノ酸長であり、12492ダルトンの算定分子量と8.19のpIを持つ。m−FIZZ1に対するその相同性に基づいて(ALIGNソフトウェアを使用して、34%)、タンパク質をm−FIZZ3と命名した。DNA54231を含むクローン(DNA54231−1366と命名)は1998年4月23日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209802が付与されている。
Z.ヒトPRO788(UNQ430)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、部分長EST配列2777828を同定した。さらに対応する全長配列を分析することにより、DNA56405(配列番号:141)と誘導天然配列PRO788タンパク質UNQ430(配列番号:142)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA56405(配列番号:141)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置84−86に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置459−461の停止コドン(TAG)で終端する(Fig51)。予測されるPRO788ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ430、配列番号:1042は125アミノ酸長であり(Fig52)、13115ダルトンの算定分子量と5.90のpIを持つ。Fig52に示すUNQ430(配列番号:142)タンパク質は1998年3月6日にATCCに寄託され、寄託番号209849が付与されている。寄託物のヌクレオチド配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託されたクローンが正しい配列を含むものと理解される。さらにここで提供された配列を配列決定するための方法は周知の配列決定技術に基づくと理解される。
Fig52に示すUNQ430(配列番号:52)の分析により、およそアミノ酸1−17にシグナルペプチド、およそアミノ酸46にN−グリコシル化部位があることが明らかになった。
【0107】
AA.ヒトPRO1114(UNQ557)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト乳癌ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA57033(Fig53、配列番号:143)と誘導PRO1114天然配列タンパク質UNQ557(Fig54、配列番号:144)を単離した。
上述のパラグラフに記載した単離スクリーニングで使用されるPCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA57033(配列番号:143)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置250−252に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1183−1185の停止コドン(TAG)で終端する(Fig53、配列番号143)。予測されるPRO1114ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ557、配列番号:144)は311アミノ酸長であり、約35076ダルトンの算定分子量と約5.04の算定pIを持つ。Fig54に示す全長PRO1114配列(配列番号:144)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸29にシグナルペプチド、およそアミノ酸230からおよそアミノ酸255に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸40からおよそアミノ酸43及びおよそアミノ酸134からおよそアミノ酸137に潜在的N−グルコシル化部位、およそアミノ酸92からおよそアミノ酸119にアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基232からおよそアミノ酸262のインテグリンα鎖と相同性を有するアミノ酸配列ブロック。DNA57033を含むcDNAクローン(配列番号:143)は1998年3月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209905が付与されている。
AB.ヒトPRO1007(UNQ491)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、ヒト肝臓組織(ライブラリ341からのクローン83012)から誘導され、Merck EST T70513と命名されたEST配列を同定し、更に検査した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長DNA配列DNA57690(Fig55、配列番号:145)及び誘導PRO1007天然配列タンパク質UNQ491(Fig56、配列番号:146)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA57690(配列番号:145)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置16−18に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1054−1056の停止コドン(TGA)で終端する(Fig55)。予測されるPRO1007ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ491、配列番号:146)は346アミノ酸長であり(Fig56)、35971ダルトンの算定分子量及び8.17のpIを持つ。Fig56に示すUNQ491(配列番号:146)タンパク質は、約35971ダルトンの算定分子量及び約8.17のpIを持つ。DNA57690を含むcDNAクローン(配列番号:145)は1998年6月9日にATCCに寄託され、寄託番号209950が付与されている。
UNQ491(配列番号:146)のアミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸残基1−30に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基325−346に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基118、129、163、176、183及び227にN−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基17−36及び209−222にLy−6/u−Parドメインタンパク質があることが明らかになった。ここに提供されたアミノ酸の対応するヌクレオチド配列はここで提供された配列が与えられれば常套的に決定できる。
【0108】
AC.ヒトPRO1184(UNQ598)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ(39、SINTBST01)から誘導されたIncyte EST1428374を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長DNA59220(Fig57、配列番号:147)及び誘導PRO1184天然配列タンパク質UNQ598(Fig58、配列番号:148)を単離した。
Fig58に太字の下線で示したように、UNQ598(配列番号:148)は、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を示し、ヌクレオチド位置532−534に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1184ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ598、配列番号:148)は142アミノ酸長であり、約15690ダルトンの算定分子量及び約9.64の算定pIを持つ。UNQ598(配列番号:148)の分析により、およそアミノ酸残基1−38にシグナルペプチドの存在が証明された。DNA59220を含むcDNAクローン(配列番号:147)は1998年6月9日にATCCに寄託され、寄託番号209962が付与されている。寄託されたクローンが実際の配列を有しており、その提示がここになされていると理解される。
AD.ヒトPRO1031(UNQ516)をコードするcDNAクローンの単離 上述のECD相同性手順を使用し、EST配列Merck W74558(クローン344649)を同定した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長DNA配列DNA57690(Fig59、配列番号:149)及び誘導PRO1031天然配列タンパク質UNQ516(Fig60、配列番号:150)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA59294(配列番号:149)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置42−44に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置582−584の停止コドン(TGA)で終端する(Fig59)。予測されるPRO1031ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ516、配列番号:150)は180アミノ酸長である(Fig60)。Fig60に示すUNQ516タンパク質は、約20437ダルトンの算定分子量及び約9.58のpIを持つ。クローンDNA59294(配列番号:149)は1998年3月14日にATCCに寄託され、寄託番号209866が付与されている。配列に関し、寄託されたクローンが正しい配列を含み、ここで提供された配列は既知の配列決定技術に基づいていることが理解される。対応するヌクレオチドはここで提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
AE.ヒトPRO1346(UNQ701)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA59776(Fig61、配列番号:151)と誘導PRO1346天然配列タンパク質UNQ701(Fig62、配列番号:152)を単離した。
DNA59776(配列番号:151)の単離に使用したハイブリッド形成プローブとPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
クローンDNA59776(配列番号:151)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1−3(ATG)に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド位置1384−1386に見かけの停止コドン(TAG)を有する。予測されるPRO1346ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ701、配列番号:152)は461アミノ酸長である。タンパク質は、アミノ酸位置約31から約50に見かけのII型膜貫通ドメインを、およそアミノ酸位置409−421にフィブリノーゲンβ及びγ鎖C末端ドメインシグネーチャーを、およそアミノ酸位置140−161、147−168、154−175及び161−182にロイシンジッパーパターンを含む。
DNA59776−1600と命名されるDNA59776を含むcDNAクローンは1998年8月18日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203128が付与されている。Fig62に示すUNQ701(配列番号:152)タンパク質は約50744ダルトンの算定分子量と約6.38のpIを持つ(Fig18)。
【0109】
AF.ヒトPRO1155(UNQ585)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ(39、SININOT03)から誘導されたIncyte EST2858870を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長DNA配列DNA59849(Fig63、配列番号:156)及び誘導PRO1155天然配列タンパク質UNQ585(Fig64、配列番号:157)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig64に示されたUNQ585(配列番号:157)ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置158−160に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置563−565に見られる停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO1155ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ585、配列番号:157)は135アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基1からおよそ8にあり、ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸残基43からおよそ64にあり、さらにタキキニンファミリーシグネーチャーはおよそアミノ酸残基86からおよそ91にある。UNQ585(配列番号:157)は約14833ダルトンの算定分子量及び約9.78の算定pIを持つ。DNA59849を含むcDNAクローン(配列番号:156)は、DNA59849−1504と命名され、1998年6月16日にATCCに寄託され、寄託番号209986が付与されている。AG.ヒトPRO1250(UNQ633)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのIncyteESTクラスター配列番号56523と称されるESTクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な様々なESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3371784を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA60775(Fig65、配列番号:158)及び誘導PRO1250天然配列タンパク質UNQ633(Fig66、配列番号:159)を単離した。
クローンDNA60775(配列番号:158)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置74−76に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2291−2293の停止コドン(TAG)で終端する(Fig65)。予測されるPRO1250ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ633、配列番号:159)は739アミノ酸長である(Fig66)。Fig66に示すUNQ633(配列番号:159)タンパク質は約82263ダルトンの算定分子量及び約7.55の算定pIを持つ。UNQ633(配列番号:159)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸残基61からおよそ80にII型膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基314からおよそ325に推定AMP−結合ドメインシグネーチャー、及びおよそアミノ酸残基102からおよそ105、およそアミノ酸残基588からおよそ591及びおよそアミノ酸残基619からおよそ622に潜在的N−グルコシル化部位。DNA60775を含むcDNAクローン(配列番号:158)は1998年9月1日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203173が付与されている。
【0110】
AH.ヒトPRO1312(UNQ678)をコードするcDNAクローンの単離
EST(DNA55773)を、一次cDNAクローンの5’末端を優先的に提示するヒト胎児腎臓cDNAライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。DNA55773配列に基づき、全長DNA配列DNA61873(Fig67、配列番号:160)及び誘導PRO1312天然配列UNQ678(配列番号:161)を単離するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを合成した。
太字の下線で示すように、Fig67に示す全長DNA61873クローン(配列番号:160)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置7−9に見かけの翻訳開始部位を有し、およそヌクレオチド位置643−645に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1312ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ678、配列番号:161)は212アミノ酸長である。UNQ678(配列番号:161)は約24024ダルトンの算定分子量及び約6.26の算定pIを持つ。他の特徴は、およそアミノ酸1−14にシグナルペプチド:およそアミノ酸141−160の膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸76−79及び93−96の潜在的N−グルコシル化部位を含む。DNA61873を含むcDNAクローン(配列番号:161)は、DNA61873−1312の名称で1998年8月18日にATCCに寄託され、寄託番号203132が付与されている。
AI.ヒトPRO1192(UNQ606)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA62814(Fig69、配列番号:162)と誘導PRO1192天然配列タンパク質UNQ606(Fig70、配列番号:163)を単離した。
DNA62814(配列番号:162)の単離に使用したPCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブ及びは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA62814(Fig69、配列番号:162)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置121−123に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置766−768に見かけの停止コドン(TAA)を有する。予測されるPRO1192ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ606、配列番号:163)は215アミノ酸長である。Fig70に示すUNQ606(配列番号:163)ポリペプチド前駆体は、およそアミノ酸1−21にシグナルペプチド;およそアミノ酸153−176に膜貫通ドメイン;およそアミノ酸39−42及び118−121に潜在的N−グルコシル化部位;及びおよそアミノ酸27−68及び99−128にミエリンP0タンパク質との相同体を有する。Fig70に示すUNQ606(配列番号:163)は約24484ダルトンの算定分子量と約6.98のpIを持つ(Fig36)。
DNA62814−1521と命名されたDNA62814を含むcDNAクローン(配列番号:162)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203093が付与されている。
【0111】
AJ.ヒトPRO1246(UNQ630)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのIncyteESTクラスター配列番号56853と指定されたESTクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST2481345を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA64885(Fig71、配列番号:167)及び誘導PRO1246天然配列タンパク質UNQ630(Fig72、配列番号:168)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA64885(配列番号:167)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1727−1729の停止コドン(TGA)で終端する(Fig71)。予測されるPRO1246ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ630、配列番号:168)は536アミノ酸長であり(Fig72)、約61450ダルトンの算定分子量及び約9.17のpIを持つ。UNQ630(Fig72、配列番号:168)の分析により、以下のもの:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸15にシグナルペプチド、およそアミノ酸108からおよそアミノ酸111、およそアミノ酸116からおよそアミノ酸169、およそアミノ酸193からおよそアミノ酸196、およそアミノ酸262からおよそアミノ酸265、およそアミノ酸375からおよそアミノ酸378、およそアミノ酸413からおよそアミノ酸416及びおよそアミノ酸498からおよそアミノ酸501に潜在的N−グルコシル化部位、及びおよそアミノ酸286からおよそアミノ酸315、およそアミノ酸359からおよそアミノ酸369及びおよそアミノ酸78からおよそアミノ酸97にスルファターゼタンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックが、明らかになった。DNA64885−1529と命名されたDNA64885を含むcDNAクローン(配列番号:167)は1998年11月3日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203457が付与されている。
AK.ヒトPRO1283(UNQ653)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト乳房腫瘍組織ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA65404(Fig73、配列番号:169)と誘導PRO1283天然配列タンパク質UNQ653(Fig74、配列番号:170)を単離した。
DNA65404(配列番号:169)使用されたPCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA65404(配列番号:169)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置45−47に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置555−557の停止コドン(TAG)で終端する(Fig73)。予測されるPRO1283ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ653、配列番号:170)は170アミノ酸長である(Fig74)。Fig74に示すUNQ653(配列番号:170)タンパク質は約19457ダルトンの算定分子量と約9.10のpIを持つ。UNQ653(配列番号:170)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸17にシグナルペプチド。DNA65404−1551と称されるDNA65404を含むcDNAクローン(配列番号:169)は1998年9月9日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203244が付与されている。
【0112】
AL.ヒトPRO1195(UNQ608)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのESTクラスター配列32204を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST352980を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA65412(Fig75、配列番号:177)及び誘導PRO1195天然配列タンパク質UNQ608(Fig76、配列番号:178)を単離した。
太字の下線で示すように、全長クローンDNA65412(配列番号:177)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置58−60に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置511−513の停止コドン(TAG)で終端する(Fig75)。予測されるPRO1195ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ608、Fig76、配列番号:178)は151アミノ酸長であり、17227ダルトンの算定分子量及び約5.33のpIを持つ。UNQ608(配列番号:178)の分析により、およそアミノ酸1−22があり、約17277ダルトンの算定分子量及び約5.33の算定pIを持つことが示される。DNA65412−1523と称されるDNA65412を含むcDNAクローン(配列番号:177)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203094が付与されている。
AM.ヒトPRO1343(UNQ698)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト平滑筋細胞組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト平滑筋細胞組織ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA66675(Fig77、配列番号:179)と誘導PRO1343天然配列タンパク質UNQ698(Fig78、配列番号:180)を単離した。
使用したオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである:
太字の下線で示したように、全長クローンDNA66675(配列番号:179)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置71−73に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置812−814の停止シグナル(TAA)を有する(Fig77)。予測されるPRO1343ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ698、配列番号:180、Fig78)は274アミノ酸長であり、約25335ダルトンの算定分子量と約7.0の算定pIを持つ。Fig78に示すUNQ698配列(配列番号:180)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸25にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸35からおよそアミノ酸225にサーカムスポロゾイト(circumsporozoite)リピートと相同性の領域。DNA66675−1587と称されるDNA66675を含むcDNAクローン(配列番号:179)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203282が付与されている。
別に、上述のアミラーゼスクリーニングから単離された酵母EST配列の比較を、公的及び私的な種々のESTデータベースに対してスクリーニングし(例えば、上述のECD相同性手順を参照のこと)、Incyte ESTクローン番号4701148を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、Fig77に示すDNA66675配列(配列番号:179)を単離した。
【0113】
AN.ヒトPRO1418(UNQ732)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列10698(Incyteクラスター121480)を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベース(胎盤組織ライブラリから得られたものを含む)と比較して、さらにIncyte EST1306026を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68864(Fig79、配列番号:184)及び誘導PRO1418天然配列タンパク質UNQ732(Fig80、配列番号:185)を単離した。
太字の下線で示すように、Fig79に示す全長クローン(DNA68864、配列番号:184)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置138−140に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1188−1190に見られる停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO1418ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ732、配列番号:185)は350アミノ酸長であり、およそアミノ酸1−19にシグナルペプチドを有し、約39003ダルトンの算定分子量及び約5.59の算定pIを持つ。DNA68864−1629と称されるDNA68864を含むcDNAクローン(配列番号:184)は1998年2月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203276が付与されている。
【0114】
AO.ヒトPRO1387(UNQ722)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列10298を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3507924を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68872(Fig81、配列番号:186)及び誘導PRO1387天然配列タンパク質UNQ722(Fig82、配列番号:187)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA68872(配列番号:186)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置76−78に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1258−1260の停止コドン(TGA)で終端する(Fig81)。予測されるPRO1387ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ722、配列番号:187)は394アミノ酸長である。Fig82に示すUNQ722(配列番号:187)タンパク質は、約44339ダルトンの算定分子量及び約7.10のpIを持つ。さらに、UNQ722(配列番号:187)は、およそアミノ酸残基1からおよそ残基19にシグナルペプチド、およそ残基275からおよそ残基296に膜貫通ドメイン、およそ残基76、231、302、307及び376に潜在的N−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基210からおよそ残基239及びおよそアミノ酸残基92からおよそ残基121にミエリンp0タンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックを含む。DNA68872−1620と称されるDNA68872を含むcDNAクローンは1998年8月25日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203160が付与されている。
AP.ヒトPRO1410(UNQ728)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列98502を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST1257046を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68874(Fig83、配列番号:188)及び誘導PRO1387天然配列タンパク質UNQ728(Fig84、配列番号:189)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA68874(配列番号:188)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置152−154に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置866−868の停止コドン(TGA)で終端する(Fig83)。予測されるPRO1410ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ728、配列番号:189)は238アミノ酸長である(Fig84)。Fig84に示すUNQ728タンパク質(配列番号:189)は、約25262ダルトンの算定分子量及び約6.44のpI、およそアミノ酸残基1からおよそ残基20にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基194からおよそ残基220に膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸残基132に潜在的N−グリコシル化部位を有する。DNA68874を含むクローンは1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203277が付与されている。
AQ.ヒトPRO1917(UNQ900)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列85496を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3255033を同定した。このESTは卵巣腫瘍ライブラリから得た。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA76400(Fig85、配列番号:190)及び誘導PRO1917天然配列タンパク質UNQ900(Fig86、配列番号:191)を単離した。
太字の下線で示すように、Fig85に示す全長クローンDNA76400(配列番号:190)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置6−9に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1467−1469に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1917ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ900、配列番号:191)は487アミノ酸長である。UNQ900(配列番号:191)タンパク質は、約55051ダルトンの算定分子量及び約8.14のpIを持つ。付加的な特徴には、およそアミノ酸残基1−30にシグナルペプチド;およそアミノ酸残基242から481に潜在的N−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基95−97、182−184及び427−429にプロテインキナーゼCリン酸化部位;およそアミノ酸残基107−112、113−118、117−122、118−123及び128−133にN−ミリストイル化部位;およそアミノ酸残基484−487に小胞体標的配列があることが含まれる。
【0115】
AR.ヒトPRO1868(UNQ859)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、ESTクローン番号2994689を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、DNA77624(Fig87、配列番号:192)及び誘導PRO1868天然配列タンパク質UNQ859(Fig88、配列番号:193)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA77624(配列番号:193)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置981−983の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1868ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ859、配列番号:193、Fig89)は310アミノ酸長である。Fig89に示すUNQ859(配列番号:193)タンパク質は約35020ダルトンの算定分子量と約7.90のpI、およそアミノ酸残基243からおよそ残基263に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基104から192にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基107からおよそ残基110にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基106からおよそ残基109及びおよそアミノ酸残基296からおよそ残基299にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、およそアミノ酸残基69からおよそ残基77にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基26からおよそ残基31、およそ残基215からおよそ残基220、およそ残基226からおよそ残基231、およそ残基243からおよそ残基248、およそ残基244からおよそ残基249及びおよそ残基262からおよそ残基267に潜在的N−ミリストル化部位を有する。DNA77624を含むクローン(配列番号:193)は1998年12月22日にATCCに寄託され、寄託番号203553が付与されている。
【0116】
AS.ヒトPRO205(UNQ179)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、ヒト網膜ライブラリから誘導されたEST配列を同定した。インビボクローニング手順を使用し全長クローンをさらに同定する試みがなされたが、これは他のPRO205コード化DNA配列を同定できなかった。
Fig90のUNQ179(配列番号:229)ポリペプチドと実質的に相同な他のポリペプチドをコードするDNA配列は、Genbank提出物AB033089_1及びHSM802147_1として見出され得る。
Fig89に太字の下線で示したように、クローンDNA30868(配列番号:89)は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置405−407に見かけの翻訳開始部位を有する。予測される部分長PRO1868ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ179、配列番号:229)は343アミノ酸長であり、約39285ダルトンの算定分子量と6.06のpIを持つ。
Fig90に示すUNQ179(配列番号:229)の分析により、およそアミノ酸残基1から20にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基318−322にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基21−29およそアミノ酸残基211−220にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基63−69及び317−323にN−ミリストル化部位、及びおよそ残基260−271に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが明らかになった。DNA30868を含むcDNAクローン(配列番号:228)はDNA30868−1156との命名されて2000年3月2日にATCCに寄託され、寄託番号が付与されている。
AT.ヒトPRO21(UNQ21)をコードするcDNAクローンの単離
天然配列PRO21ポリペプチドUNQ21(Fig92、配列番号:231)をコードするDNA36638(Fig91、配列番号:230)は、米国特許第5,955,420号に先に記載されている。さらなるクローニング及び特徴付けの情報はSchneider等, Cell 54(6):787−93(1988)及びManfioletti等, Mol. Cell. Biol.,13(8):4976−85(1993)に見出すことができる。
太字の下線で示したように、クローンDNA36638は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置168−170に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2187−2198の停止コドン(TAG)終端する(Fig91)。予測されるPRO21ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ21、配列番号:231)は673アミノ酸長であり、74512ダルトンの算定分子量と5.45のpIを持つ。DNA36638−1056と称されるDNA36638を含むcDNAクローンは1997年11月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209456が付与されている。
Fig92のUNQ179ポリペプチド(配列番号:231)の分析により、およそアミノ酸残基1−27にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基619−635に膜貫通ドメイン、およそ残基417−421及び488−492にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基126−132、135−141、146−152、173−179、214−220、253−259、346−352、374−380、440−446、479−485、497−503、517−523、612−618にN−ミリストル化部位、およそアミノ酸残基130−142、168−180、209−221及び248−260にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位、およそアミノ酸残基139−151にビタミンK依存性カルボキシル化ドメイン及びEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
AU.ヒトPRO269(UNQ236)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA38260(Fig93;配列番号:232)と誘導PRO269天然配列タンパク質UNQ236(Fig94、配列番号:233)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA38260(配列番号:232)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置314−316に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1784−1786の停止コドン(TAG)で終端する(Fig93)。予測されるPRO269ポリペプチド前駆体は490アミノ酸長であり(すなわちUNQ236、Fig94、配列番号:233)(Fig30)、51636の算定分子量と6.29のpIを持つ。DNA38260を含むcDNAクローン(配列番号:232)は1997年10月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209397が付与されている。
Fig94のUNQ236ポリペプチド(配列番号:223)の分析により、およそアミノ酸残基1−16にシグナル配列、およそ残基399−418に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基189−193及び381−385にN−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基289−293にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基98−102及び434−438にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基30−36、35−41、58−64、59−65、121−127、151−157、185−191、209−215、267−273、350−356、374−380、453−459、463−469及び477−483にN−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基262−274にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位があることが明らかになった。
【0117】
AV.ヒトPRO344(UNQ303)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA40592(Fig95;配列番号:240)と誘導PRO344天然配列タンパク質UNQ303(Fig96、配列番号:241)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
クローンDNA40592(配列番号:240)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置227−229に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置956−958の停止コドン(TAG)で終端する(Fig95)。予測されるPRO344ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ303、配列番号:241)は243アミノ酸長であり(Fig96)、25298の算定分子量と6.44のpIを持つ。Fig96のUNQ303ポリペプチド(配列番号:241)の分析により、およそアミノ酸残基1−15にシグナル配列、およそアミノ酸残基11−17、68−74及び216−222にN−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基77−80に細胞付着部位があることが明らかになった。DNA40592を含むcDNAクローン(配列番号:240)は1997年11月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209492が付与されている。
【0118】
AX.ヒトPRO333(UNQ294)をコードするcDNAクローンの単離
インビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、部分長配列DNA41374(配列番号:248、Fig97)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA41374(配列番号:248)は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1185−1187に見かけの翻訳終止部位(すなわち停止コドン、TGA)を有する。予測される部分長PRO333ポリペプチド(すなわちUNQ294、配列番号:249)は394アミノ酸長であり、43725の算定分子量と8.36のpIを持つ。
Fig98のUNQ294(配列番号:249)ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基1−14にシグナル配列、およそアミノ酸残基359−376に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基166−172、206−212、217−223、246−252、308−314、312−318、361−367にN−ミリストル化部位、及びアミノ酸残基315−323に免疫グロブリンと主要組織適合性複合体タンパク質シグネーチャーがあることが明らかになった。DNA41374を含むcDNAクローン(配列番号:240)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号が付与されている。
AY.ヒトPRO381(UNQ322)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44194(Fig99、配列番号:250)と誘導PRO381天然配列タンパク質UNQ322(Fig100、配列番号:251)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA44194(配列番号:250)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置807−809の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO381ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ322、Fig100、配列番号:251)は211アミノ酸長であり、24172の算定分子量と5.99のpIを持つ。Fig100に示すUNQ322(配列番号:251)タンパク質は次の特徴を有する:およそアミノ酸残基1からおよそ20にシグナル配列、およそアミノ酸残基156に潜在的N−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基143からおよそ146,およそ残基156からおよそ159、およそ残基178からおよそ181、およそ残基200からおよそ203に潜在的カゼインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基78からおよそ114及びおよそ残基118からおよそ131に小胞体標的配列、およそアミノ酸残基140からおよそ159にEF−腕カルシウム結合ドメイン、及びおよそアミノ酸残基183からおよそ203にS−100/ICaBP型カルシウム結合ドメインが存在する。DNA44194を含むcDNAクローン(配列番号:250)は1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209808が付与されている。
【0119】
AZ.マウスPRO720(UNQ388)をコードするcDNAクローンの単離
DNA53517(配列番号:255)の調製については、上述の「X.ヒトPRO770(UNQ408)をコードするcDNAクローンの単離」に記載されている。太字の下線で示したように、クローンDNA53517(配列番号:255)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置36−38に見かけの翻訳開始部位を有し、369−371の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO720ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ388、配列番号:256)は111アミノ酸長であり(Fig102)、11936の算定分子量と5.21のpIを持つ。
Fig102のUNQ388(配列番号:256)ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基1−23にシグナル配列、およそアミノ酸残基70−76及び75−81にN−ミリストル化部位、及び66−77及び68−79に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが示される。DNA53517を含むcDNAクローン(配列番号:255)は1998年4月23日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209802が付与されている。
BA.ヒトPRO866(UNQ435)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA53971(Fig103、配列番号:257)と誘導PRO866天然配列タンパク質UNQ435(Fig104、配列番号:258)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA53971(配列番号:257)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1268−1270の停止コドン(TAA)で終端する。予測される天然配列PRO866ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ435、配列番号:258)は331アミノ酸長であり(Fig104)、35844の算定分子量と5.45のpIを持つ。Fig104に示すUNQ435(配列番号:258)タンパク質は約35844の算定分子量と約5.45のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ残基26にシグナル配列、およそアミノ酸残基131−135にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基144−148にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、及びアミノ酸残基26−32、74−80、132−138、134−140、190−196、287−293及び290−296にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。DNA53971を含むcDNAクローン(配列番号:257)は1998年4月6日にATCCに寄託され、寄託番号209750が付与されている。
【0120】
BB.ヒトPRO840(UNQ433)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト甲状腺ライブラリから単離された組織について酵母菌スクリーニング手順を使用し、PCRオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、DNA53987(F配列番号:266、Fig105)と誘導PRO840天然配列タンパク質UNQ433(配列番号:267、Fig106)を単離した。
またFig106のUNQ433(配列番号:267)と実質的に相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、受託番号HEEPSSARC_1としてGenbankから入手できる。
太字の下線で示したように、Fig105に示すDNA53987(配列番号:266)はオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置18−20に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1329−1331の停止コドン(TGA)で終端する(Fig43)。ヌクレオチド残基90−92の第2のメチオニンコドンが実際の翻訳開始部位である可能性があり、あるいはこれは内部メチオニンをコードする。予測されるPRO840ポリペプチド(すなわちより長い翻訳)はUNQ433(配列番号:267)と命名され、437アミノ酸長であり(Fig106)、49851ダルトンの算定分子量と6.47のpIを持つ。
DNA53987を含むクローン(配列番号:266)は、寄託番号209858で、1998年5月12日にATCCに寄託されている。
Fig106のUNQ433ポリペプチド(配列番号:267)の分析により、およそアミノ酸残基1−46にシグナル配列、およそアミノ酸残基319−338に膜貫通ドメイン、およそ残基200−204にN−グルコシル化部位、アミノ酸残基23−27にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、アミノ酸残基43−52にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基17−23、112−118、116−122及び185−191にN−ミリストリル化部位があることが明らかになった。
BC.ヒトPRO982(UNQ483)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列番号43715を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにMerck EST番号AA24389を同定した。このESTに対応する全長クローンによって、全長DNA配列DNA57700(Fig107、配列番号:268)及び誘導PRO982天然配列タンパク質UNQ483(Fig108、配列番号:269)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig107のDNA57700配列(配列番号:268)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置26−28に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置401−403の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO982ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ982、配列番号:191)は124アミノ酸長であり、約14198ダルトンの算定分子量及び約9.01の算定pIを持つ(Fig108)。Fig108のUNQ483(配列番号:269)ポリペプチドのさらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ21にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基1からおよそ残基59に潜在的アナフィラトキシンドメインがあることが示される。DNA57700を含むcDNAクローン(配列番号:268)は1999年1月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203583が付与されている。
【0121】
BD.ヒトPRO836(UNQ545)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスターを同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST2610075、大腸腫瘍組織から得られたESTを同定した。このESTに対応する全長クローンにより、全長配列DNA59620(Fig109、配列番号:270)及び誘導PRO836天然配列タンパク質UNQ545(Fig110、配列番号:271)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig109に示すヌクレオチド配列DNA59620(配列番号:270)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置65−67に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1448−1450の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO836ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ545、Fig110、配列番号:271)は461アミノ酸長である。Fig110に示すUNQ545(配列番号:271)は約52085ダルトンの算定分子量及び約5.36のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ29にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基193から236にN−グルコシル化部位、及びおよそ残基15、19、234、251、402及び451にN−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基364からおよそ372にYJL126w/YLR351c/yhcXファミリーのタンパク質に保存されたドメイン、及びおよそアミノ酸残基68から約340にSLS1タンパク質と配列同一性を有する領域があることが明らかになった。DNA59620を含むcDNAクローン(配列番号:270)は1998年6月16日にATCCに寄託され、寄託番号209989が付与されている。
【0122】
BE.ヒトPRO1159(UNQ589)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列77245を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST番号376776を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA60627(Fig111、配列番号:272)及び誘導PRO1159天然配列タンパク質UNQ589(Fig112、配列番号:273)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA60627(配列番号:272)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置92−94に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置362−364の停止コドン(TAG)で終端する(Fig111)。予測されるPRO1159ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ589、配列番号:273)は90アミノ酸長である(Fig112)。Fig112に示すUNQ589(配列番号:273)は約9840ダルトンの算定分子量及び約10.13のpIを持つ。
Fig112に示すUNQ589(配列番号:273)配列の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸残基1からおよそ残基15にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基38に潜在的N−グルコシル化部位。クローンDNA60627(配列番号:272)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203092が付与されている。
BF.ヒトPRO1358(UNQ707)をコードするcDNAクローンの単離 上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST088718、肝臓組織ライブラリから得られる断片を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA64890(Fig113、配列番号:274)及び誘導PRO1358天然配列タンパク質UNQ707(Fig114、配列番号:275)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig113に示すDNA64890(配列番号:274)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置86から88に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1418から1420の停止コドン(TAA)で終端する(Fig113)。予測されるPRO1358ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ707、配列番号:275)は444アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基1−18にある。UNQ707(配列番号:275)は約50719ダルトンの算定分子量及び約8.82の算定pIを持つ。DNA64890−1612と称されるDNA64890(配列番号:274)を含むcDNAクローンは1998年8月18日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203131が付与されている。
BG.ヒトPRO1325(UNQ685)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列番号139524を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3744079を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA66659(Fig115、配列番号:276)及び誘導PRO1325天然配列タンパク質UNQ685(Fig116、配列番号:277)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA66659(Fig115、配列番号:276)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2547−2549の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO1325ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ685、配列番号:227)は832アミノ酸長である。Fig116に示すUNQ685(配列番号:227)は約94454ダルトンの算定分子量及び約6.94のpIを持つ。UNQ685(配列番号:227)の分析により、およそアミノ酸1からおよそアミノ酸18にシグナルペプチド、およそアミノ酸292からおよそアミノ酸317、およそアミノ酸451からおよそアミノ酸470、およそアミノ酸501からおよそアミノ酸520、およそアミノ酸607からおよそアミノ酸627、およそアミノ酸751からおよそアミノ酸770に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸497からおよそアミノ酸518にロイシンジッパーパターン配列、及びおよそアミノ酸27からおよそアミノ酸30、およそアミノ酸54からおよそアミノ酸57、およそアミノ酸60からおよそアミノ酸63、およそアミノ酸位置123からおよそアミノ酸位置126、およそアミノ酸位置141からおよそアミノ酸位置144、およそアミノ酸位置165からおよそアミノ酸位置168、およそアミノ酸位置364からおよそアミノ酸位置367、およそアミノ酸位置476からおよそアミノ酸位置479、およそアミノ酸位置496からおよそアミノ酸位置499、およそアミノ酸位置572からおよそアミノ酸位置575、およそアミノ酸位置603からおよそアミノ酸位置606及びおよそアミノ酸位置699からおよそアミノ酸位置702にN−グルコシル化部位があることが明らかになった。DNA66659を含むcDNAクローン(配列番号:276)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203269が付与されている。
【0123】
BH.ヒトPRO1338(UNQ693)をコードするcDNAクローンの単離
酵母菌スクリーニングを使用してEST配列を得、ついで、ECD相同性下で上述したものと類似した方法で公的及び私的な種々のESTデータベースと比較し、胆嚢炎のある胆嚢組織から得られたESTであるIncyte EST2615184を同定した。対応する全長配列の分析により、DNA66667(配列番号:278、Fig117)及び誘導PRO1338天然配列タンパク質UNQ693(配列番号:279、Fig118)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig117に示すDNA66667(配列番号:278)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド残基115−117に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2263−2265の停止コドン(TAA)で終端する(Fig77)。予測されるPRO1338ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ693、配列番号:118)は716アミノ酸長であり(Fig118)、80716ダルトンの算定分子量と6.06のpIを持つ。
Fig118のUNQ693ポリペプチド(配列番号:278)の分析により、およそアミノ酸残基1から25にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基629−648に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基69−73、96−100、106−110、117−121、385−389、517−521、582−586及び611−615にN−グルコシル化部位、およそ残基573−582にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基16−22、224−230、464−470、637−643及び698−704にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
DNA66667−1596と称されるDNA66667を含むcDNAクローン(配列番号:278)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203267が付与されている。
BI.ヒトPRO1434(UNQ739)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト網膜組織ライブラリについて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA68818(Fig119、配列番号:280)と誘導PRO1434天然配列タンパク質UNQ739(Fig120、配列番号:281)を同定した。
この手順において合成されたハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA68818(配列番号:280)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置581−583に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1556−1558の停止コドン(TAG)で終端する(Fig119)。予測されるPRO1434ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ739、配列番号:281)は325アミノ酸長である(Fig120)。Fig120に示すUNQ739タンパク質(配列番号:281)は約35296ダルトンの算定分子量と約5.37のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1−27にシグナル配列、およそアミノ酸残基80−84にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基10−16、102−108、103−109にM−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基114−117に細胞付着配列、及びおよそアミノ酸残基176−188にEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
DNA68818−2536と称されるDNA68818を含むクローン(配列番号:280)は1999年2月9日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203657が付与されている。
【0124】
BJ.ヒトPRO4333(UNQ1888)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順下で上述したものと類似した方法で、発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、リンフォトキシン−ベータレセプターと相同性を示すESTを同定した。
ESTをオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを作成するためのテンプレートとして、ECD相同性手順下で上述したものと類似した方法でヒト胎児腎臓ライブラリをスクリーニングした。
上述の手順で作成されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである:
その結果、全長DNA配列DNA84210(配列番号:285、Fig121)が単離された。太字の下線で示したように、Fig121に記載したDNA84210(配列番号:285)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置185−187に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置1436−1438に停止コドン(TAA)を有する。予測されるPRO4333ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1888、配列番号:286)は417アミノ酸長である。Fig121に示すUNQ1888タンパク質(配列番号:286)は、約45305ダルトンの算定分子量と約5.12の算定pIを持つ。
Fig121のUNQ1888ポリペプチド(配列番号:286)の分析により、およそアミノ酸残基1−25にシグナルペプチド、およそ残基169−192に膜貫通ドメイン、およそ残基105−109、214−218、319−323、350−354、368−372、379−383にN−グルコシル化部位、およそ残基200−204及び238−242にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそ残基207−214にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基55−61、215−218及び270−276にN−ミリストイル化部位、およそ残基259−270に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位、及びおよそ残基89−96にTNFR/NGFRファミリーシステインリッチ領域があることが明らかになった。
【0125】
BK.ヒトPRO4302(UNQ1866)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト組織から単離した組織について上述のアミラーゼスクリーニング手順を使用してEST配列を得、ついでこれを種々のESTデータベースと比較し、アミラーゼスクリーニング手順及び/又はECD相同性手順下で、上述の方法によりコンセンサス配列を作成した。このコンセンサス配列のさらなる分析により、Incyte EST番号2408081H1を単離した。EST番号2408081H1に対応する全長クローンを分析し、全長天然配列クローンDNA92218(配列番号:292)及び誘導PRO4302全長天然配列タンパク質UNQ1866(配列番号:293)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig123に示す全長クローンDNA92218(配列番号:292)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位と、ヌクレオチド位置768−770に停止シグナル(TAG)を有する。予測されるPRO4302ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1866、配列番号:293)は198アミノ酸長であり、約22285ダルトンの算定分子量と約9.35のpIを持つ。UNQ1866(Fig124、配列番号:293)の分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ残基23にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基111からおよそ残基130に膜貫通ドメイン、残基26−30にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、残基44−47及び58−61にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、残基36−43にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基124−130、144−150及び189−195にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
DNA92218−2554と称されるDNA92218を含むcDNAクローン(配列番号:292)は1999年3月9日にATCCに寄託され、寄託番号203834が付与されている。
BL.ヒトPRO4430(UNQ1947)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列を同定し、次いで上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列を更に分析して、全長配列DNA96878(Fig125、配列番号:294)及び誘導PRO4430天然配列タンパク質UNQ1947(Fig126、配列番号:295)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig125に示す天然配列DNA配列DNA96878(配列番号:294)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置56−58に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置431−433に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO4430ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1947、Fig126、配列番号:295)は125アミノ酸長である。Fig126のUNQ4430タンパク質(配列番号:295)は約13821ダルトンの算定分子量及び約8.6の算定pIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ18にシグナル配列、およそ残基77−80、再度およそ残基88−91にN−グルコシル化部位、およそ残基67−70にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、およそ残基84−89にN−ミリストイル化部位、及びおよそ残基85−98にLys−6/u−PARドメインの存在が明らかになった。
DNA96878−2626と称され、DNA96878を含むクローン(配列番号:294)は1999年3月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号23−PTAが付与されている。
【0126】
BM.ヒトPRO5727(UNQ2448)をコードするcDNAクローンの単離
種々の周知のTNF−レセプターを使用し、公的及び私的なESTデータベース(例えば、上述のESD相同性手順を参照)をスクリーニングし、Incyteクローン5091511Hを単離した。ついで、子宮腫瘍組織から得られたこのEST配列を以下に示すクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとし、次いでこれを用いて関心ある配列を含むヒト胸腺DNAライブラリをPCRにより同定した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の通りである:
全長DNA98853ポリペプチドをコードするDNA配列を単離するために、インバースロング(inverse long distance)PCR法を実施した(Fig129)。PCRプライマーは一般に20から30ヌクレオチドの範囲であった。インバースロングPCRのために、プライマー対を、各プライマーの5’から3’方向が互いに離間する方向に向くように設計した。
DNA98853のクローニングのための一対のインバースロングPCRプライマーを合成した:
インバースロングPCR反応では、テンプレートはプラスミドcDNAライブラリである。その結果、PCR生成物は、中間部に、両端に関心ある挿入配列を有する全ベクター配列を含む。PCR反応後、PCR混合物をテンプレートプラスミドのみを消化するDpnIで処理し、続いてライブラリクローニングベクターのサイズより大きなPCR生成物をアガロースゲル精製した。インバースロングPCRで使用したプライマーはまた5’−リン酸化されているので、精製した生成物を次いでセルフライゲーションし、大腸菌コンピテント細胞中で形質転換させた。5’ベクタープライマー及び適切な遺伝子特異的プライマーを使用するPCRによりコロニーをスクリーニングし、より大きな5’配列を有するクローンを同定した。ポジティブクローンから調製されたプラスミドを配列決定した。必要に応じて、プロセスを繰り返し、先のラウンドで得られた新規な配列に基づき、より多くの5’配列を得ることもできる。
インバースロングPCRの目的は関心ある遺伝子の完全な配列を得ることである。ついで、全長コード化領域を含むクローンを一般的なPCRにより得た。
DNA98853(配列番号:296)の全長コード化領域をクローニングするために使用されるプライマー対は以下の通りである:
クローニングに対して、Cla I部位とNot I部位はそれぞれ正方向プライマー及び逆方向プライマーに含まれていた。
PCR生成物の精度を確保するために、非依存性PCR反応を実施し、いくつかのクローン化産物を配列決定した。
上述のようにして単離されたクローンを配列決定したDNAにより、DNA98853(配列番号:296、Fig127)の全長DNA配列と誘導PRO5727天然配列タンパク質UNQ2448(配列番号:297、Fig128)が得られた。
太字の下線で示したように、クローンDNA98853(配列番号:296)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1−3に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置901−903の停止コドン(TAA)で終端する(Fig128)。予測されるPRO5727ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ2448、配列番号:297)は299アミノ酸長であり(Fig128)、32929ダルトンの算定分子量及び4.95のpIを持つ。Fig128に示すUNQ2448ポリペプチド(配列番号:297)は、約3.3キロダルトンの算定分子量及び約4.72のpIを持つ。潜在的N−グルコシル化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸74と77の間に存在する。潜在的N−ミリストイル化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸24と29の間に存在する。潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸123−126、185−188、200−203、252−255、257−260、271−274及び283−286に存在する。潜在的膜貫通ドメインはFig128に示す配列のアミノ酸137と158の間に存在する。現在、上記ポリペプチドはシグナル配列を含んでいないと考えられている。
DNA98853−1739と称され、DNA98853を含むcDNAクローン(配列番号:296)は1999年4月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号1999年4月6日が付与されている。
【0127】
実施例2
混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける刺激活性(番号24)
この実施例は、本発明のポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反応の増強が望まれる場合に治療的に有用である。治療薬は本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、例えばポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態を取ってもよい。
このアッセイの基本的プロトコルは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、3x106細胞/mlのアッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に再懸濁させる。
刺激剤PBMCは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。該アッセイは、100μlの1%又は0.1%に希釈された試験試料、50μlの光にさらされた刺激剤細胞、及び50μlのレスポンダーPBMC細胞の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロリッターのCD4−IgGを対照として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)をパルス適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、次いで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新鮮に収集された脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライト(Lympholyte)M(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地中で単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイが上記のようにして行われる。本発明の化合物におけるこのアッセイの結果を次の表に示す。対照に対して正に増加しているとポジティブであると考えられ、180%以上の増加が好ましい。しかしながら、対照より多い値は全て、試験用タンパク質についての刺激効果を示す。
【0128】
【0129】
実施例3
無毛モルモットの炎症誘発アッセイ(番号32)
このアッセイはPROポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいてポジティブであると試験されたポリペプチドは、例えば局部的免疫システム細胞湿潤を増強することで恩恵を受け得る病状を含む血管透過性を増強することで恩恵を受ける病状の治療に有用であることが期待される。
350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(75−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかけた。PROポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射した。動物当たりおよそ16−24の注射部位があった。ついで1mlのエバンスブルー染料(PBS中1%)を心臓内注射した。化合物に対する皮膚血管透過性応答(すなわち、注射部位の斑点)について、試験動物の投与1、6及び/又は24時間後に注射部位からの青色の漏出の直径(mm)を測定することで視覚によりスコアをつけた。注射部位の青さのmm直径を観察して、記録し、同一の動物対照に対して4標準偏差を超えるスコアを持つ値に対して血管漏出の重症度を記録した。少なくとも5mmの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは正であると考えられ、血管漏出又は浸透性を誘発する能力を示している。7mm直径を超える応答があると、条件培地試料に対してポジティブであると考えられる。ヒトVEGFが正の対照として使用され、0.1μg/100μlで4−8mmの直径、1μg/100μlで15−23mm直径の応答を誘発した。
試験したポリペプチドを初期ストック溶液の1%まで希釈する。UNQ585は10mMのHEPES/140mMのNaCl/4%のマンニトール/1mg/mlのBSA、pH6.8で希釈し、UNQ334は140mMのNaCl、10mMのHepes、4%のマンニトール、pH7.4に希釈した。
【0130】
実施例4
皮膚血管透過性アッセイ(番号64)
このアッセイはあるPROポリペプチドが動物の注入部位において単核細胞、好酸球及びPMN浸潤を誘発することにより免疫反応を刺激し炎症反応を誘発することを示す。この皮膚血管透過性アッセイは次のようにして実施される。体重が350グラム又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(75−80mg/Kg)及び5mg/kgの5キシラジンを筋肉注射(IM)して麻酔をかけた。精製されたPROポリペプチド又は条件培地試験試料を、注射部位あたり100μLで試験動物の背中に皮内注射した。動物当たり約10−30、好ましくは約16−24の注射部位があった。1mLのエバンスブルー色素(生理的緩衝食塩水中に1%)を心臓内注射した。ついで注射部位における斑点を注入後1時間、6時間及び24時間に測定(直径mm)した。動物は注入後6時間で屠殺した。それぞれの皮膚注射部位を生体組織検査し、パラホルムアルデヒドで固定した。ついで皮膚を組織病理学検査のために調製した。それぞれの部位について、皮膚中への炎症細胞浸潤を評価した。可視可能な炎症細胞の炎症を持つ部位をポジティブスコアとする。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。
少なくとも注射部位の最小血管周囲の浸潤をポジティブスコアとし、注射部位で浸潤のなかった場合をネガティブスコアとする。
【0131】
実施例5
混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける阻害活性(番号67)
この実施例は、一又は複数のPROポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい場合に治療的に有用である。
このアッセイの基本的プロトコルは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激剤PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、3x106細胞/mlのアッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に再懸濁させる。刺激剤PBMCは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。
このアッセイは、
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロリッターの細胞培養培地又は100マイクロリッターのCD4−IgGを対照として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)をパルス適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新鮮に収集した脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライトM(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のようにして行われる。
対照以下に減少していると阻害化合物としてポジティブであると考えられ、80%以下の減少が好ましい。しかしながら、対照より少ない値は全て、試験用タンパク質の阻害効果を示す。
【0132】
【0133】
実施例6
インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と位置測定、特定のmRNA合成における変化の追跡及び染色体マッピングの補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169−176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、PCR生成33P−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにしてインサイツハイブリッド形成のために加工した。[33−P]UTP−標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
33P−リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P−UTPを含む各管に以下の成分を添加した:2.0μlの5x転写バッファー;1.0μlのDTT(100mM);2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O);1.0μlのUTP(50μM);1.0μlのRnasin;1.0μlのDNAテンプレート(1μg);1.0μlのH2O。
管を37℃で1時間インキュベートした。1.0μLのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μLのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81ペーパー上にピペットした。残りの溶液をMicrocon−50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μLのTEを添加した。1μLの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IIで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1−3μLのプローブ又は5μLのRNA MrkIIIを3μLの負荷バッファーに添加した。95℃の加熱ブロック上で3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−70℃の冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0134】
33P−ハイブリッド形成
凍結切片の前処理 スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼK中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNAseバッファー中の10mg/mlストック12.5μL)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理 スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μL;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μL、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
プレハイブリッド化 スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μLのハイブリッド形成バッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
ハイブリッド形成 スライド当たり1.0x106cp.のプローブ及び1.0μLのRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μLのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μLの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μLに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
洗浄 洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μL−20μg/ml)。スライドを2x10分間、2xSSC、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
種々のヒト組織からのポリA+RNA(レーン当り2μg)を含有するマルチ−組織ブロットをClontechから購入した(Palo Alto, CA)。DNAプローブをランダムプライムDNAラベルビーズ(Pharmacia Biotech)により[α−32P]−dCTPでラベルした。ハイブリッド形成はExpresshyb(Clontech)を使用し、68℃で1時間行った。ついで、ブロットを2xSSC/0.05%SDS溶液を用い、室温で40分間洗浄し、次に新鮮な溶液に変えて、0.1xSSC/0.1%SDS溶液を用い、55℃で40分間洗浄した。ブロットをホスホイメージャー(phosphorimager)にさらした。
【0135】
DNA29101(VEGFB9)
IS97−029:
軟骨原基の縁(例えば外縁周辺)における発育中の下肢骨、発育中の腱、血管平滑筋及び細胞包含発育中の骨格筋筋細胞及び筋管における発現。発現は、次の組織でも観察された:骨端の成長板:リンパ節−周縁洞:胸腺−胸腺皮質の被膜下領域、おそらく、被膜下上皮細胞又はこの領域で見られる増殖中の二重ネガティブ胸腺のいずれか;気管平滑筋;脳(小脳皮質)−皮質ニューロンにおける病巣発現:小腸−平滑筋:甲状腺−甲状腺上皮;肝臓−管板;胃−壁平滑筋;胎児の皮膚−鱗状上皮の基底層;胎盤−栄養膜絨毛の間細胞;脊髄−動脈及び静脈の壁を除いて発現なし。脾臓と副腎では発現なし。
上述の発現パターンは、DNA29101が細胞分化/増殖に関与していることを示唆している。
IS97−037
過剰排卵したラット卵巣での発現は、アンチセンス及びセンスプローブの双方において全ての切片でネガティブであった。何れのメッセージもこのモデルでは発現されず、あるいはヒトプローブはラットと交差反応しなかった。
【0136】
IS97−087
高発現レベルは以下の部位で観察された:チンパンジー卵巣−成熟小胞の顆粒膜細胞、低強度シグナルが包膜細胞で観察;チンパンジー上皮小体−主細胞全体で高発現;ヒト胎児精巣−発育中の細管を囲む間質細胞全体に中程度の発現;ヒト胎児肺−発育中の気管支の軟骨細胞で高発現、及び分岐している気管支上皮において低レベル発現。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃腸肉腫、大腸、大腸癌腫及び骨盤癌腫を含む。また検査したものはアセトアミノフェン誘発肝臓障害及び肝硬変であった。
DNA30871:
IS97−044: 胎児組織において、胎児の大脳皮質、脊髄、脊髄神経節のニューロン、並びに胎児胃壁の腸ニューロンに強いシグナルが観察された。さらに、大動脈の根本周囲の細胞(おそらくは刺激伝導系)、副腎髄質、神経血管束の間質細胞、腎臓実質及び骨格筋筋細胞間に位置する細胞においてもシグナルが観察された。全ての他の胎児組織はネガティブであった。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織(12−16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りである。
DNA30942:
DNA30942(配列番号:13)を4つに分かれたインサイツ研究において検査し(実施例7の発病した組織研究における2つを含む)、次のプローブを使用した:
【0137】
IS97−043:
胎児組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織は:胎盤、臍帯、脳、脊髄、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
DNA33087(IS97−051):
胎児組織において、DNA33087(配列番号:18)の発現は、内軟骨及び骨膜性骨形成の全ての部位で骨芽細胞において、また発育中の肺動脈及び大動脈幹で観察された。検査した胎児組織は:胎盤、臍帯、脳、脊髄、眼、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
検査した成人組織では何の発現も観察されず、以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
可能な役割は、骨マトリクス沈積及び/又は骨芽細胞成長の制御である。
多ブロックにおける全ての成人組織はβ−アクチンに対してポジティブであった。
この手順で使用したプローブは以下の通りである:
【0138】
DNA34387(IS97−109):
DNA34387(配列番号:25)の発現パターンは胎児及び成人ヒトの以下の部位で観察された:
胎児−甲状腺上皮、小腸上皮、生殖腺、膵臓上皮、肝臓の肝細胞及び腎尿細管。また発育中の長骨の血管組織でも見られた。
成人−胎盤細胞栄養芽層、腎尿細管上皮、膀胱上皮、副甲状腺及び上皮腫瘍に中程度のシグナル。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。
検査した成人組織は:腎臓(正常及び末期)、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、胆嚢、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、前立腺、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性機能不全)を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は以下のものを含む:
チンパンジー組織:唾液腺、胃、甲状腺、副甲状腺、皮膚、胸腺、卵巣、リンパ節。
アカゲザル組織:大脳皮質、海馬、小脳、陰茎。
この手順で使用したプローブは以下の通りである。
【0139】
DNA35638:
IS97−078:
DNA35638(配列番号:35)の発現は胎児及び胎盤血管のサブセットの内側の内皮に観察された。内皮発現はこれらの組織ブロックに限られていた。発現はまた胎盤の中間栄養芽細胞にわたって観察された。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢を含む。
検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
上述の手順で使用したオリゴは以下の通りである。
【0140】
I98−052:
正常なヒト皮膚(新生児の包皮)及び成人の乾癬性皮膚のDNA39523(配列番号:45)は、双方とも、上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体である基底膜に沿った単層の、基底層の上皮細胞において特異的な強い発現を示した。
上部に重なっている層(有棘層、顆粒層等)の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮(表皮直下にある結合組織)でも発現が明らかであった。間質性線維芽細胞であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現が最も顕著であった。
脳では、小脳切片は、表在性皮質ニューロンで強い特異的な発現をし、皮質ニューロンの特定集団に独特なパターンが示唆された。
炎症した、また正常な腸:正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内に多巣性パターンで特異的な中程度から強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく描写される紡錘状(spindloid)間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現はなく、発病した腸においても明らかに増加した(強度又は頻度)発現はなかった。特に、炎症をした腸において病変部と発現との間には相関もなかった。
ヒト胎児腎臓では、多巣性の発育中細管において特異的な弱いないしは中程度の発現があった;これらの病巣における細管上皮に発現があった。
皮膚におけるDNA39523(配列番号:45)の発現と表皮細胞の基底上皮細胞への特異的な局在化は、基底上皮細胞の分化/維持における潜在的な役割を示唆している。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンは、該細胞が表皮における白血球の輸送を調節していることを示唆している。その結果、DNA39523(配列番号:45)は、表皮中への樹状突起/ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるDNA39523(配列番号:45)の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、その発現の炎症性病変部との相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった(しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった)。
IS97−128:
DNA39523(配列番号:45)の発現はマウス胚皮膚の上皮並びにヒト胎児皮膚の基底上皮及び上皮で観察された。チンパンジー舌の鱗状粘膜の基底上皮ペグ(pegs)もポジティブであった。胎児腎臓の発育中の糸球体、成人腎臓細管、及び末期腎臓疾患の「甲状腺化」上皮の細胞のサブセットにおいても発現が観察された。しかしながら、腎細胞癌では、おそらく上皮細胞全体において低い発現が見られた。さらに、発現は、間質細胞では(1)胎児肺で低レベルで、また(2)胃腸腺の先端部分でも観察された。胎児小腸絨毛の固有層、正常大腸粘膜、及び大腸癌における間質細胞にわたって高い発現が示された。肉腫のヒラン化(hylanized)ストローマにおける良性結合組織細胞に強い発現が生じた。胎盤絨毛及び脾赤髄における間質細胞においても発現が生じた。脳では、皮質ニューロンで発現が生じた。
DNA39523(配列番号:45)は発育中の骨を囲む結合組織においてと胎児の神経鞘細胞にわたっても発現した。
検査した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫を含む。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
【0141】
IS98−092:
サル大脳皮質の外層(I及びII)における多数の細胞にDNA39523(配列番号:45)の発現が存在した。より深い皮質層の細胞の小さなサブセットも、このケモカイン相同体のmRNAを発現した。海馬の分子層内と歯状回の内部辺縁の境界の散在細胞はDNA39523(配列番号:45)の発現を示した。大脳皮質内では発現は検出されなかった。DNA39523(配列番号:45)の発現は、ケモカイン相同体が通常は発現される領域において細胞死が起こった梗塞脳では観察されなかった。DNA39523(配列番号:45)は、おそらくは大脳皮質の外層のニューロンのサブセットのマーカーとなり、おそらくはニューロン移動障害を明らかにしうる。異常なニューロン移動は、幾つかの発作性疾患及び精神分裂病の原因となりうる。
IS98−128:
DNA39523(配列番号:45)は、生後(P)10日及び成体マウス脳内に興味ある特定のハイブリッド形成パターンを示した。P10マウスの1つの矢状断面において、海馬の分子層及び歯状回の内辺縁に強いシグナルが散乱して観察された。プレ鉤状回の細胞は中程度に標識された;シグナルは強い帯域を、後部板状皮質の外層を通って後頭皮質に至るまで伸ばし、そこでシグナルはバックグラウンドレベルまで低下する。ポジティブニューロンの小セットがP10運動皮質の深い領域で検出された;P10皮質の外層内のニューロンはバックグラウンドレベルを越えるシグナルを示さなかった。中程度のハイブリッド形成シグナルもまた下丘で検出された。成体マウス脳におけるケモカイン相同体シグナルは、3つの冠状断面において異なるレベルで評価した。強いシグナルが隔壁及び橋核の散在ニューロン及び三叉神経の運動根で検出された;中程度のシグナルが海馬の分子層及び後部板状皮質の外層に見られた。
IS99−027:
ボレカイン(bolekine)(BRAKとしても知られ、DNA39523(配列番号:45)が有意な相同性を有するケモカインである)は、cys−x−cys(CXC)モチーフと、アミノ末端glu−leu−arg(ELR)が存在しないことにより特徴付けられるケモカインのサブグループに属する。非−ELR CXCケモカイン(SDF−1、IP10、Mig及びPF4を含む)はB及びTリンパ球を含む白血球のサブセットに対して走化性を示す。またそれらは、アンギオスタティック(angiostatic)活性も有する。
DNA39523(配列番号:45)は生後(P)1日のマウスの脳で検出され、ボレカインシグナルは海馬(ラクノサム分子層(stratum lacunosum moleculare)及び歯状回の門部)及び前側嗅覚核(olfactory nucleus)で検出されたが、発育中の大脳皮質と小脳では検出されなかった。P10により、シグナルは大脳皮質の層1及び2の細胞のサブセットに存在する。またより深い層における細胞の小集団でもDNA39523(配列番号:45)を発現している。海馬におけるパターンはP1脳と類似していた。弱いシグナルが小脳、特に小葉IX及びXに存在している。シグナルはまた背側線条体及び小丘にも存在している。
成人マウス脳において、ボレカインポジティブ細胞は成人大脳皮質で検出することは困難であるが、シグナルは前側嗅覚核と海馬に存在している。しかし、虚血マウス脳においては、ボレカインシグナルは境界域に誘発されている。
発育中の大脳皮質では、ボレカインの発現はニューロン遊走の最終段階及びシナプス形成と軸索突起の確立に相関している。他のCXCキモカインは中枢神経系でのパターニングとニューロン遊走(SDF−1)及びニューロン活動の調節(IL−8及びGRO−a)における役割を担っている。
ボレカインの発現は脳の虚血性再灌流傷害において誘発されるが、他の炎症状態では誘発されない。
【0142】
DNA47365(IS97−142):胎児組織において、DNA47635(配列番号:91)の発現は、椎骨体の前側表面を内張りする筋膜で観察された。発現は、胎児網膜にわたって見られる。胎児ニューロンにわたって低レベルの発現。
次のプローブを上述の分析で使用した:
DNA49435(配列番号:111)の中程度の発現が胎児脳の皮質ニューロンにわたって観察された。発現は胎児網膜の内面にわたってもまた観察され、発達中のレンズにも見られることがあった。発現は胎児皮膚、軟骨、小腸、胎盤絨毛及び臍帯にわたって見られた。成人組織では、胆嚢上皮に極めて高レベルの発現があった。DNA49435(配列番号:111)の中程度の発現は、成人腎臓、胃及び大腸上皮で見られた。
検査したヒト胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、精巣及び下肢を含む。検査した成人ヒト組織は:腎臓(正常及び末期段階)、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、眼(網膜を含む)、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性機能不全)を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は、チンパンジー組織の副腎、及びアカゲザル組織の大脳皮質、海馬及び小脳を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りであった:
【0143】
DNA54228(IS98−105):
DNA54228(配列番号:133)の発現は骨スピクラ:胎児骨幹端、胎児頭蓋冠(頭蓋)及びヒト異常増殖の骨組織(骨肉腫及び軟骨肉腫)で観察された。軟骨肉腫及び骨肉腫の骨化スピクラ及び胎児骨の骨幹端の小骨スピクラに、弱いが一貫したシグナルがあった。ヒト肺、肝臓、胸腺、腎臓、甲状腺、脳、脾臓、副腎、脳、軟骨、肺、肝臓、腸、生殖腺、心臓及び皮膚を含む胎児組織では何のシグナルも検出されなかった。
上述の手順で使用したプローブは以下の通りであった:
DNA54231(mFIZZ3):
IS98−070:
DNA54231(配列番号:139)は脂肪細胞に特異的な中程度のシグナルを示した。このシグナルは、首において気管の回りの腸間膜脂肪と間質性脂肪に存在する。発現パターンは成体脂肪に対して特異的であるようである。
IS98−109:
DNA54231(配列番号:139)の発現は脂肪細胞に特異的であり、腹膜腸間膜、腎盂の脂肪被膜及び乳房肉趾を含む、この研究でこのような細胞が見出される場所には何れにも存在した。正常なマウス脳、肝臓、腎臓、乳腺、膵臓、脾臓、膵臓、骨髄、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、精巣、皮膚又は肺における何れの他の細胞型においても発現はなかった。
脂肪細胞に対するこの分子の選択的分布は、肥満において何れも重要である、脂肪細胞の産生/生成又は脂肪代謝の何れかにおける役割を示唆している。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
DNA54231−p1(配列番号:224):
5’−GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGGGGACAGGAGCTAATA−3’
DNA54231−p2(配列番号:225):
5’−CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTCCCACGAGCCACAGG−3’
【0144】
DNA59294(IS98−138):
DNA59294(配列番号:149)は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。要約すると、発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及び骨格及びヒト胎児の平滑筋に特異的であった。ヒト成人における発現は、大腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。ヒト成人骨格筋は評価しなかった。胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散した発現があった。腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。
成人組織において、大腸、慢性炎症性腸疾患を持つ5検体において平滑筋(筋層)で低レベルの拡散した発現があった。胆嚢において、胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。
ヒト胎児組織では、骨格筋において中程度の拡散した発現が、また平滑筋において弱から低レベル発現があった。しかしながら、胎児心臓又は肝臓、脾臓、CNS、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現はなかった。
検出可能な発現のなかった試験された付加的なヒト組織には、慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎(5患者)の肺、末梢神経、前立腺、心臓、胎盤、肝臓(傷害及び硬変を誘発するアセトアミノフェンを含む疾患多重ブロック)、脳(大脳及び小脳)、扁桃(反応性過形成)、末梢リンパ節、胸腺が含まれる。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
DNA30868発現は次の胎児組織:脊髄、自律神経節、腸管神経、仙骨神経叢、末梢及び脳神経で見出された。
検査した胎児組織は次のものであった:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0145】
DNA53517:
IS98−070:
正常な成体マウスの肺におけるDNA53517(配列番号:255)の発現は、大きな気道(気管支/細気管支)の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的には正の病巣内に1−3であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管でありうる。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺(好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎)において、肺の大気道(気管支/細気管支)の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散した発現があった。また、肺胞の内側の上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞にも強い発現があった;これらの細胞はII型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質の希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小腸及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸(IL10R KOマウスからのもの)において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
IS98−093:
さらに、DNA53715(配列番号:255)の分布を正常なマウス組織で広範囲なスクリーニングを行い評価した。正常な肺において、発現は変化するが、存在するときはマウスの肺の気管支上皮細胞及びII型肺胞細胞に限定されていた。炎症性肺におけるこれらの細胞(気管支粘膜肥大/過形成を伴うアレルギー性炎症:喘息モデル)では顕著な増加があった。腸におけるDNA53715(配列番号:255)の発現は大腸において最も顕著であり、粘膜下及び筋膜(mucosa muscularis)、腸の筋壁と粘膜との間の血管新生化組織層内の少しの離散細胞に存在していた。これらの細胞の正確な同定は表されていないが、それらの紡錘状(spindloid)形態及び粘膜下の毛細管及び小血管の密接な関連性により次の可能性が示唆される:血管周皮細胞又は非有髄神経線維のサブセット。
腸粘膜下の離散細胞におけるDNA53715(配列番号:255)の発現は大腸に制限され、空腸、回腸、近位十二指腸又は胃の切片では見られなかった。発現は次の正常なマウス組織:肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、肺、膵臓、胃、近位十二指腸、空腸、回腸、脳、皮膚、精巣又は乳腺では検出されなかった。
DNA53715(配列番号:255)は肺の粘膜免疫を増強又は刺激する役割を担っている可能性がある。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0146】
実施例7
疾患組織と細胞におけるインサイツハイブリッド形成
実施例6のインサイツハイブリッド形成法を使用し、特定の病気にかかったヒト個体から単離された発病組織における、遺伝子発現の測定、転写物の組織分布の分析、本発明の遺伝子/DNA及びタンパク質の特異的mRNAの合成における変化の追跡を行った。これらの結果は、本発明の遺伝子が発病組織のどこにより特異的に発現されるかを示しており、本発明の阻害又は刺激化合物(及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト)の病気における治療効果の特定の局在性が予測される。ハイブリッド形成は、一又は複数の次の組織及び試料を使用して、実施例6の方法に従って実施される:
(a)リンパ球及び抗原提示細胞(樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ及び単球、NK細胞);
(b)リンパ組織:正常及び反応性リンパ節、胸腺、気管支関連リンパ組織(BALT)、粘膜関連リンパ組織(MALT);
(c)ヒト疾患組織:
・関節炎及び変性関節疾患を患っている患者の滑膜と関節;
・潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患を患っている患者の大腸;
・乾癬及び他の形態の皮膚炎からの皮膚病変部;
・慢性及び急性気管支炎、肺炎、間質性肺炎、胸膜炎からのリンパ節組織及びBALTを含む肺組織;
・喘息からの組織リンパ節及びBALTを含む肺組織;
・鼻炎又は副鼻孔炎を患っている患者の鼻及び洞組織;
・多発性硬化症、アルツハイマー病及び卒中からの脳及び脊髄;
・腎炎、糸球体腎炎及び全身性エリテマドーデスからの腎臓;
・感染及び非感染肝炎及びアセトアミノフェン誘導性肝硬変からの肝臓; ・新生物/癌からの組織。
発現は細胞又は組織試料に関連した疾患における本発明の化合物(及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト)の治療効果の局在化を示す一又は複数の細胞又は組織試料において観察される。
先に報告された非疾患組織分布と発現が重複する場合に使用したオリゴヌクレオチドの配列は実施例6に記載する。
【0147】
DNA30942:
IS98−021:発現は、正常なチンパンジー胸腺の単核食細胞、並びに胃癌(1/1)、結腸直腸癌(1/1)、乳癌(2/5)及び肺癌(1/4)で観察された。骨肉腫及びあまり分化していない脂肪肉腫の悪性細胞により発現。精巣テラトーマ及び乳癌(1/5)の悪性細胞におけるありうるシグナル。肺癌の一つにおいて、散在シグナルが肺リンパ組織内の高内皮細静脈で見られる。検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、腎細胞癌腫、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。検査したアカゲザル組織は:大脳皮質(rm)、海馬(rm)を含む。検査したチンパンジー組織は:甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜及び唾液腺を含む。
IS98−085:発現が8つの腺癌と7つの扁平上皮肺癌に観察された。アクチンは全ての腫瘍で強くポジティブであり、全てがインサイツハイブリッド形成分析に適していることが示されている。DNA30942の発現は次の6つの腫瘍で観察された:
6727−95/扁平上皮癌−新生物上皮上に強い発現
9558−95/扁平上皮癌−新生物上皮上に発現
12235−95/腺癌−インサイツ及び浸潤腫瘍細胞上に発現
6545−95及び4187−96/扁平上皮癌−腫瘍ストローマの細胞上で発現、腫瘍細胞では発現は見られなかった;
12954−94/扁平上皮癌−間質細胞上に弱い発現。
IS99−112:
DNA30942(配列番号:13)のインサイツ発現を多くの慢性炎症状態及びリンパ器官で評価した。要約すると、DNA30942(配列番号:13)は、慢性喘息の気管支粘膜関連リンパ組織(BALT)、肺門リンパ節、扁桃腺の高内皮細静脈(HEV)で強く発現し、大腸粘膜でパッチ状の発現が、腸粘膜関連リンパ組織(GALT)HEVで弱い不統一な発現があった。
リンパ組織では、慢性喘息のある場合、気管支粘膜関連リンパ組織(BALT)、肺門リンパ節、扁桃腺の単一断片、及びIBD(GALT/MALT)の切片において腸粘膜関連リンパ組織で強い特異的な発現が観察された。これらの各リンパ器官において、発現は高内皮細静脈(HEV)に特に存在していた。
慢性喘息肺の組織では、BALT HEVにおける発現に加えて、特異的発現が炎症性気管支の粘膜下にある高又は反応性の膨張した内皮細胞が裏打ちする小毛細管で観察された。この領域はBALTと密接に関連していないが、気管支への炎症細胞輸送のための粘膜下部位に特異的である。これらの領域には、好酸球の有意な粘膜下浸潤があった。発病した肺(COPD及び慢性間質性肺炎)の他の切片では、DNA30942(配列番号:13)は何ら発現しておらず、これらの切片はいくつかのアーチファクト(スライドからの組織の損失)を有していた。
乾癬組織では、乾癬プラークにおけるいくつかの小真皮毛細管に弱い発現があった。扁桃腺組織では、濾胞に関連するHEVにおける発現に加えて、網状扁桃腺陰窩上皮内に強い発現があった。また、発現は小上皮内毛細管の血管にも存在していた。発現はまたいくつかの上皮細胞内にもあった。これは重要な免疫学的部位であり、抗原提示に関与し、耐性誘発において役割を担っている。
クローン病及び潰瘍性大腸炎を患っている患者から単離された組織では、全ての場合ではないがそのいくつかの場合にパッチ状分布を伴って粘膜に発現が存在した。GALTのHEVにおける発現は他のリンパ組織でみられるよりも顕著に弱いシグナルとして存在しており、粘膜に強いがパッチ状の発現が存在する切片においてさえ一貫して存在はしていなかった。
アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から単離された組織では、慢性リンパ性炎症を有する肝門管の領域内の小毛細管に弱い発現があった。
【0148】
DNA33460(IS98−015):
DNA33460(配列番号:20)の発現は、胎児眼の発育中の外眼性筋肉に直ぐ隣接している緩い結合組織の細胞にわたって観察された。軟部組織肉腫上に中程度の発現。検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、腎細胞癌腫、副腎、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、心筋層、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、膀胱、前立腺、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
この手順で使用したプローブは以下の通りである:
発現は肺癌腫瘍で観察され、8つ全ての扁平上皮癌及び6/8の腺癌においてポジティブであった。発現レベルは腺癌で低から中程度であり、扁平上皮癌で非常に強かった。腫瘍ストローマ、肺胞又は正常な呼吸上皮では何の発現も見られなかった。おそらくリンパ節で低レベル発現。
発現は肺癌で観察された。遺伝子を肺腫瘍パネルのTaqman分析で増幅した。発現は8つの扁平上皮癌及び6/8の腺癌で観察された。発現はインサイツ及び湿潤成分においても見られた。腺癌における発現レベルは低から中程度であった。一般的に発現は扁平上皮癌でより高く、その2つでは発現は強かった。おそらくリンパ節では低レベル発現。
【0149】
DNA35638:
IS98−124:
この研究では、炎症ヒト組織(乾癬、IBD、炎症腎臓、炎症肺、肝炎(肝臓ブロック)、正常な扁桃腺、成人及びチンパンジーの多ブロック)におけるDNA35638(配列番号:35)を検査した。DNA35638(配列番号:35)は、この出願の他の箇所で、免疫賦活性(MLRにおけるT細胞の増殖及び同時刺激の増強)及び炎症誘発特性(インビボにおける好中球湿潤の誘発)を有していることが示されている。
この研究では、非炎症組織と比べて、炎症ヒト組織の血管中におけるこの分子の差次的な発現を評価した。要約すると、発現は、扁桃腺の毛包周囲洞を含む毛細管、慢性硬化性腎炎の検体における細動脈、乾癬皮膚の表層真皮血管、慢性炎症を患っている肺の大血管の内皮/内膜に存在していた。DNA35638(配列番号:35)は、正常な皮膚(ヒト包皮検体)、正常な肺、炎症(8IBD検体)又は正常な大腸、慢性的に炎症した肝臓又は肝硬変、正常な成人心臓組織、又は副腎では、(この方法で検出可能な程には)発現しなかった。
DNA39523:
I98−052:
ヒト正常皮膚(新生児の包皮)及び成人乾癬皮膚の双方において、DNA39523(配列番号:45)は、基底層の上皮細胞−上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体であり、基底膜に沿った単層において所定強さの発現を示した。
上部に重なっている層(有棘層、顆粒層等)の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮(表皮直下にある結合組織)でも発現が明らかであった。間質性線維芽であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現は最も明らかであった。
炎症した、また正常な腸:正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内の多巣性パターンにおいて、特に中程度ないしは強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく表される紡錘状(spindloid)間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現せず、発病した腸においても明らかに増加した(強度又は頻度)発現はなかった。特に、炎症をした腸の病変部と発現との間には相関もなかった。
皮膚におけるDNA39523(配列番号:45)の発現、及び表皮細胞の基底上皮細胞までの特異的な局在性により、基底上皮細胞の分化/維持における潜在的な役割が示唆される。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンにより、該細胞が表皮への白血球の輸送を調節していることが示唆される。そn結果、DNA39523(配列番号:45)は、表皮における樹状突起/ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるDNA39523(配列番号:45)の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、炎症性病変部に対するその発現の相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった(しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった)。
【0150】
DNA45416(IS98−140):
DNA45416(配列番号:79)の発現を、種々のヒト及び非ヒト霊長類組織で評価し、高度に特異的であることが見出された。発現は、肺の肺胞マクロファージ及び肝臓洞様毛細血管のクップファー細胞にのみ存在した。これらの細胞での発現は、これら独特の細胞集団が活性化されたときに有意に増加した。組織マクロファージのこれら2つの亜集団は異なる器官に局在化し、それらは類似の生物学的機能を有する。これら両方の型の食細胞は、病原、老化細胞及びタンパク質を含む血流又は気道からの物質を除去するフィルターとして作用し、共に広範な重要なプロ炎症サイトカインを分泌することができる。
炎症肺(7患者試料)では、発現は反応性肺胞マクロファージ細胞集団において顕著であり、肺胞内に1個又は凝集体で存在する大きくて青白く、しばしば空胞を持つ細胞として定義され、正常で非反応性マクロファージ(正常サイズの単一の散乱細胞)においては弱からネガティブであった。肺胞マクロファージでの発現は、これらの細胞が数及びサイズともに増大(活性化)したとき、炎症の間に増加した。これらの組織の間質炎症及び気管支周辺リンパ細胞過形成の領域に組織球が存在するにも関わらず、発現は肺胞マクロファージに制限されていた。多くの炎症肺も幾分の炎症抑制を有していた;発現は神経向性の顆粒球に存在しなかった。
肝臓においては、急性中心小葉性壊死(アセトアミノフェン毒性)又はかなり顕著な門脈周囲の炎症を持つ肝臓において反応性/活性化クップファー細胞に強い発現があった。しかしながら、正常肝臓、又は中程度の炎症、又は穏和から中程度の小葉過形成/肥大のみを持つ肝臓におけるクップファー細胞では発現がなかった。よって、肺と同様に、活性化/反応性細胞において発現の増加があった。
炎症した腸、過形成/反応性扁桃腺又は正常リンパ節に存在する組織球/マクロファージにおいて、この分子の発現は無かった。全てが組織球炎症又は常在性マクロファージ集団を含むこれらの組織で発現がないことは、肺胞マクロファージ及び肝臓クップファー細胞として定義される独特のマクロファージサブセット集団に制限された発現を強く支持する。しかしながら、DNA454216(配列番号:79)の発現は、脾臓又は骨髄では評価できなかった。
検出可能な発現を示さなかった評価したヒト組織は:炎症性腸疾患(中程度から重症の7患者試料)、反応性過形成を持つ扁桃腺、末梢リンパ節、乾癬皮膚(穏和から中程度の疾患を持つ2患者試料)、心臓、末梢神経を含む。検出可能な発現を示さなかった評価したチンパンジー組織は:舌、胃、胸腺を含む。
上述の研究で使用したプローブは以下の通りである:
【0151】
DNA41374:
IS−98−077:
DNA41374(配列番号:248)は胸腺Tリンパ球で発現した。
要約:評価した多くの組織で、胸腺Tリンパ球に弱い拡散した発現が検出されただけであった。制限された分布パターンは、Tリンパ球又はTリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞(樹状細胞集団等)による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織(炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎/気管支炎)において、有意な数のTリンパ球を含む領域に検出可能な発現はなかった。検出可能な発現がなかった試験した組織は:ヒト正常組織:胎盤、肺、脾臓、副腎、皮膚、腎臓、眼、肝臓;ヒト発病組織:肝臓疾患:慢性肝炎、慢性胆管炎、急性小葉中心壊死(アセトアミノフェン毒性);異常増殖(腫瘍多ブロック);骨肉腫、扁平上皮癌;ヒト胎児組織:脳、脊髄、肺、腎臓、腎臓、軸及び肢筋骨格血管、臍帯;非ヒト霊長類:舌、甲状腺、副甲状腺、胃、唾液腺を含む。
IS98−125
DNA41374(配列番号:248)はTリンパ球特定領域にて、ヒト扁桃腺及び非ヒト霊長類胸腺において低レベルの発現をした。制限された分布パターンは、Tリンパ球又はTリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞(樹状細胞集団等)による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織(炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎/気管支炎)において、有意な数のTリンパ球を含みうる領域に検出可能な発現はなかった。
炎症肺:(慢性リンパ及び肉芽種性間質肺炎):対照センスプローブと比較して間質に弱いないしはネガティブなシグナル。正常なチンパンジー胸腺(ヒト胸腺は入手できず)及びヒト扁桃腺で弱い発現があった。後者において、発現は毛包周囲縁部を含むこの構造のTリンパ球領域及び副皮質に主として発現した。
次のヒト組織:炎症性腸疾患(8患者検体)、慢性的炎症及び正常な肺(6患者検体)、慢性硬化性腎炎(1)、慢性的及び急性的炎症及び正常及び肝硬変の肝臓(10検体、多ブロック)、正常及び乾癬皮膚、末梢リンパ節(非反応性)で検出可能な発現はなかった。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0152】
DNA53517:
IS98−070:
正常な成体マウスの肺におけるDNA53517(配列番号:255)の発現は、大きな気道(気管支/細気管支)の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的に正の病巣内に1−3であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管を提示する。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺(好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎)において、肺の大気道(気管支/細気管支)の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散発現があった。また、肺胞を裏打ちする上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞に強い発現があり;これらの細胞はII型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質に希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸(IL10R KOマウスからのもの)において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
IS98−135:
DNA53715(配列番号:255、マウスFIZZ−1)は次のヒト組織:胃癌、炎症肺(3患者)(脈管、肺胞、大きな気道及び粘液腺)、大動脈、心臓、胎盤及び胆嚢において検出プローブとして使用された。
マウスDNA53715(配列番号:255)の発現は正常なマウス肺の大きな気道上皮に存在し、炎症したマウス肺(気道上皮、II型肺胞肺細胞)で顕著に増加した。また、血管チャンネルに沿った大腸粘膜下における離散細胞にも発現があった。
DNA84210:
インサイツ研究に使用したプローブを次に示す:
DNA84210(配列番号:285)は胎児腎臓、主に発育中の糸球体及び皮質領の細管で発現し、胎児肺及び脊髄では弱かった。また発育中の軟骨及び骨に隣接する間質細胞にも発現があった。成人組織において、弱い発現が正常な気管支上皮、5つの肺腫瘍(2つは扁平上皮癌で3つは腺癌)の一つ(腺癌)、及び軟骨肉腫において見られた。皮膚及びその付属物で発現する可能性もあるが、切片は折り畳まれており、評価することは困難である。
IS99−102:
悪性メラノーマ、肺腫瘍、大腸腫瘍、細胞ペレット、マウス組織、胎児組織におけるDNA84210(配列番号:285)の発現。
DNA84210(配列番号:285)の発現は、いくつかの成人(異常増殖及び非異常増殖)及び胎児組織において見られた。正常な成人組織に関する限り、DNA84210(配列番号:285)は皮膚の表皮(ほとんどが基底部に位置する細胞)及び皮膚付属物、例えば毛髪の濾胞及びそれらに関する皮脂腺で見られる。また発現は、気管支上皮及び粘膜下気管支腺でも見られる。ヒト胎児組織において、DNA84210(配列番号:285)の発現は、皮膚及び皮膚付属物、肺、腎皮質及び膵管で見られる。また、発育中の骨及び軟骨に隣接する間葉細胞でも見られる。マウス胚で見られたハイブリッド形成シグナルはない。DNA84210(配列番号:285)の発現は6つの結腸直腸腺癌の一つ(弱)、3つの肺腺癌の2つ(一つは強を示すが、かなりの限局的発現であり、一つは非常に弱いポジティブである)、3つの肺扁平上皮細胞癌の0、及び一つの軟骨肉腫の一つ(弱)で見られる。また、5つの悪性メラノーマの5つで発現が見られ、発現の強度は非常に弱から強の範囲である。またこれらの切片は正常な表皮及び皮膚付属物におけるDNA84210(配列番号:285)の発現を示す。
【0153】
実施例8
ハイブリッド形成プローブとしてのPROポリペプチドの使用
以下の方法は、PROポリペプチドをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟PROポリペプチドのコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種DNA類(天然発生変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識PRO−誘導プローブ(例えば、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727)のフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDSの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列PROポリペプチドをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【0154】
実施例9
大腸菌におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるPROポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
PROポリペプチドをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード化領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離して採集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化PROポリペプチドタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリHisタグ形態でPROポリペプチドを発現させてもよい。PROポリペプチドをコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでPCR増幅された、ポリ−Hisタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中、30℃で振盪しながら3−5のO.D.600に達するまで成長させる。ついで培養をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中に50−100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20−30時間成長させる。試料を取り出してSDS−PAGE分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させる。
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。条件に応じて、透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni−NTA金属キレートカラムに充填する。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄する。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もる。
【0155】
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中でゆっくりと希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択する。リフォールディング溶液を4℃で12−36時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はTFAを最終濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%になるまで添加する。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたPROポリペプチドタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に処方した。
【0156】
実施例10
哺乳動物細胞でのPROポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPROポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP 307,247参照)を用いる。場合によっては、PRODNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRODNAを挿入させる。得られたベクターは、例えばpRK5−PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約10μgのpRK5−PRODNAを約1μgのVARNA遺伝子コード化DNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μLの1mMトリス−HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させる。この混合物に、滴状の、500μLの50mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させる。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させる。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加する。293細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(単独)又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換する。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに充填する。処理したゲルを乾燥させ、本発明のPROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
これに換わる技術において、pRK5−PROは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5−PROを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現された本発明のポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、本発明のポリペプチドをCHO細胞で発現させることができる。pRK5−PROは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの既知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(単独)又は35S−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。本発明のポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、本発明の発現されたPROを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、本発明のエピトープタグポリペプチドは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。本発明の所望のポリペプチドをコードするDNAはpRK5ベクター外でサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−Hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。本発明のポリ−hisタグポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。本発明の発現されたポリ−hisタグポリペプチドを含む培地を、次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【0157】
実施例11
酵母菌でのPROの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。本発明のポリペプチドをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然配列PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)本発明のポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清を、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。本発明のポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
実施例12
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROの組換え発現を記載する。
PROをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Novagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、本発明のポリペプチド又はPROポリペプチドをコードするDNAのコード化配列の所望部分[例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列]が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、側方に位置する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O’Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
次に、本発明の発現されたポリ−hisタグポリペプチドは、例えばNi2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製することができる。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175−179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製する。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes、pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過する。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物を、毎分0.5mLでカラムに負荷する。カラムを分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄する。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開する。1mLの分画を回収し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に抱合したNi2+−NTAでのウェスタンブロットで分析する。本発明の溶離したHis10−タグポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROポリペプチドの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【0158】
実施例13
PROに結合する抗体の調製
この実施例は、本発明のポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製ポリペプチド、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面に本発明の組換えポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムの量で注入した本発明のポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスを、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。本発明のポリペプチドに特異的な抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、本発明のポリペプチドの最後の静脈内注射を注入することができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ATCC番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【0159】
ハイブリドーマ細胞を、本発明のポリペプチド対する反応性についてELISAでスクリーニングする。本発明のポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【0160】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、VA20110−2209米国(ATCC)に寄託した:
【0161】
これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Fig1】DNA29101−1276(配列番号:1)を示す図である。
【Fig2】天然配列PRO200ポリペプチドUNQ174(配列番号:2)を示す図である。
【Fig3】DNA30871−1157(配列番号:11)を示す図である。
【Fig4】天然配列部分長PRO204ポリペプチドUNQ178(配列番号:12)を示す図である。
【Fig5】DNA30942−1134(配列番号:13)を示す図である。
【Fig6】天然配列PRO212ポリペプチドUNQ186(配列番号:14)を示す図である。
【Fig7】DNA33087−1158(配列番号:18)を示す図である。
【Fig8】天然配列PRO216ポリペプチドUNQ190(配列番号:19)を示す図である。
【Fig9】DNA33460−1166(配列番号:20)を示す図である。
【Fig10】天然配列PRO226ポリペプチドUNQ200(配列番号:21)を示す図である。
【Fig11】DNA34387−1138(配列番号:25)を示す図である。
【Fig12】天然配列PRO240ポリペプチドUNQ214(配列番号:26)を示す図である。
【Fig13】DNA35558−1167(配列番号:30)を示す図である。
【Fig14】天然配列PRO235ポリペプチドUNQ209(配列番号:31)を示す図である。
【Fig15】DNA35638−1141(配列番号:35)を示す図である。
【Fig16】天然配列PRO245ポリペプチドUNQ219(配列番号:36)を示す図である。
【Fig17】DNA35916−1161(配列番号:40)を示す図である。
【Fig18】天然配列PRO172ポリペプチドUNQ146(配列番号:41)を示す図である。
【Fig19】DNA39523−1192(配列番号:45)を示す図である。
【Fig20】天然配列PRO273ポリペプチドUNQ240(配列番号:46)を示す図である。
【Fig21】DNA40620−1183(配列番号:50)を示す図である。
【Fig22】天然配列PRO272ポリペプチドUNQ239(配列番号:51)を示す図である。
【Fig23】DNA40982−1235(配列番号:56)を示す図である。
【Fig24】天然配列PRO332ポリペプチドUNQ293(配列番号:57)を示す図である。
【Fig25】DNA44184−1319(配列番号:61)を示す図である。
【Fig26】天然配列PRO526ポリペプチドUNQ330(配列番号:62)を示す図である。
【Fig27】DNA44205−1285(配列番号:66)を示す図である。
【Fig28】天然配列PRO701ポリペプチドUNQ365(配列番号:67)を示す図である。
【Fig29】DNA45410−1250(配列番号:71)を示す図である。
【Fig30】天然配列PRO361ポリペプチドUNQ316(配列番号:72)を示す図である。
【Fig31】DNA45416−1251(配列番号:79)を示す図である。
【Fig32】天然配列PRO362ポリペプチドUNQ317(配列番号:80)を示す図である。
【Fig33】DNA45419−1252(配列番号:86)を示す図である。
【Fig34】天然配列PRO363ポリペプチドUNQ318(配列番号:87)を示す図である。
【Fig35】DNA47365−1206(配列番号:91)を示す図である。
【Fig36】天然配列PRO364ポリペプチドUNQ319(配列番号:92)を示す図である。
【Fig37】DNA47470−1130(配列番号:101)を示す図である。
【Fig38】天然配列PRO356ポリペプチドUNQ313(配列番号:102)を示す図である。
【Fig39】DNA48314−1320(配列番号:106)を示す図である。
【Fig40】天然配列PRO531ポリペプチドUNQ332(配列番号:107)を示す図である。
【Fig41】DNA49435−1219(配列番号:111)を示す図である。
【Fig42】天然配列PRO533ポリペプチドUNQ334(配列番号:112)を示す図である。
【Fig43】DNA50921−1458(配列番号:116)を示す図である。
【Fig44】天然配列PRO1083ポリペプチドUNQ540(配列番号:117)を示す図である。
【Fig45】DNA53974−1401(配列番号:123)を示す図である。
【Fig46】天然配列PRO865ポリペプチドUNQ434(配列番号:124)を示す図である。
【Fig47】DNA54228−1366(配列番号:133)を示す図である。
【Fig48】天然配列PRO770ポリペプチドUNQ408(配列番号:134)を示す図である。
【Fig49】DNA54231−1366(配列番号:139)を示す図である。
【Fig50】天然配列PRO769ポリペプチドUNQ407(配列番号:140)を示す図である。
【Fig51】DNA56405−1357(配列番号:141)を示す図である。
【Fig52】天然配列PRO788ポリペプチドUNQ430(配列番号:142)を示す図である。
【Fig53】DNA57033−1403(配列番号:143)を示す図である。
【Fig54】天然配列PRO1114ポリペプチドUNQ557(配列番号:144)を示す図である。
【Fig55】DNA57690−1374(配列番号:145)を示す図である。
【Fig56】天然配列PRO1007ポリペプチドUNQ491(配列番号:146)を示す図である。
【Fig57】DNA59220−1514(配列番号:147)を示す図である。
【Fig58】天然配列PRO1184ポリペプチドUNQ598(配列番号:148)を示す図である。
【Fig59】DNA59294−1381(配列番号:149)を示す図である。
【Fig60】天然配列PRO1031ポリペプチドUNQ516(配列番号:150)を示す図である。
【Fig61】DNA59776−1600(配列番号:151)を示す図である。
【Fig62】天然配列PRO1346ポリペプチドUNQ701(配列番号:152)を示す図である。
【Fig63】DNA59849−1504(配列番号:156)を示す図である。
【Fig64】天然配列PRO1155ポリペプチドUNQ585(配列番号:157)を示す図である。
【Fig65】DNA60775−1532(配列番号:158)を示す図である。
【Fig66】天然配列PRO1250ポリペプチドUNQ633(配列番号:159)を示す図である。
【Fig67】DNA61873−1574(配列番号:160)を示す図である。
【Fig68】天然配列PRO1312ポリペプチドUNQ678(配列番号:161)を示す図である。
【Fig69】DNA62814−1521(配列番号:162)を示す図である。
【Fig70】天然配列PRO1192ポリペプチドUNQ606(配列番号:163)を示す図である。
【Fig71】DNA64885−1529(配列番号:167)を示す図である。
【Fig72】天然配列PRO1246ポリペプチドUNQ630(配列番号:168)を示す図である。
【Fig73】DNA65404−1551(配列番号:169)を示す図である。
【Fig74】天然配列PRO1283ポリペプチドUNQ653(配列番号:170)を示す図である。
【Fig75】DNA65412−1523(配列番号:177)を示す図である。
【Fig76】天然配列PRO1195ポリペプチドUNQ608(配列番号:178)を示す図である。
【Fig77】DNA66675−1587(配列番号:179)を示す図である。
【Fig78】天然配列PRO1343ポリペプチドUNQ698(配列番号:180)を示す図である。
【Fig79】DNA68864−1629(配列番号:184)を示す図である。
【Fig80】天然配列PRO1418ポリペプチドUNQ732(配列番号:185)を示す図である。
【Fig81】DNA68872−1620(配列番号:186)を示す図である。
【Fig82】天然配列PRO1387ポリペプチドUNQ722(配列番号:187)を示す図である。
【Fig83】DNA68874−1622(配列番号:188)を示す図である。
【Fig84】天然配列PRO1410ポリペプチドUNQ728(配列番号:189)を示す図である。
【Fig85】DNA76400−2528(配列番号:190)を示す図である。
【Fig86】天然配列PRO1917ポリペプチドUNQ900(配列番号:191)を示す図である。
【Fig87】DNA77624−2515(配列番号:192)を示す図である。
【Fig88】天然配列PRO1868ポリペプチドUNQ859(配列番号:193)を示す図である。
【Fig89】DNA30868−1156(配列番号:228)を示す図である。
【Fig90】部分天然配列PRO205ポリペプチドUNQ179(配列番号:229)を示す図である。
【Fig91】DNA36638−1056(配列番号:230)を示す図である。
【Fig92】天然配列PRO21ポリペプチドUNQ21(配列番号:231)を示す図である。
【Fig93】DNA38260−1180(配列番号:232)を示す図である。
【Fig94】天然配列PRO269ポリペプチドUNQ236(配列番号:233)を示す図である。
【Fig95】DNA40592−1242(配列番号:240)を示す図である。
【Fig96】天然配列PRO344ポリペプチドUNQ303(配列番号:241)を示す図である。
【Fig97】DNA41374−1312(配列番号:248)を示す図である。
【Fig98】部分長天然配列PRO333ポリペプチドUNQ294(配列番号:249)を示す図である。
【Fig99】DNA44194−1317(配列番号:250)を示す図である。
【Fig100】天然配列PRO381ポリペプチドUNQ322(配列番号:251)を示す図である。
【Fig101】DNA53517−1366(配列番号:255)を示す図である。
【Fig102】天然配列PRO720ポリペプチドUNQ388(配列番号:256)を示す図である。
【Fig103】DNA53971−1359(配列番号:257)を示す図である。
【Fig104】天然配列PRO866ポリペプチドUNQ435(配列番号:258)を示す図である。
【Fig105】DNA53987−1438(配列番号:266)を示す図である。
【Fig106】天然配列PRO840ポリペプチドUNQ433(配列番号:267)を示す図である。
【Fig107】DNA57700−1408(配列番号:268)を示す図である。
【Fig108】天然配列PRO982ポリペプチドUNQ483(配列番号:269)を示す図である。
【Fig109】DNA59620−1463(配列番号:270)を示す図である。
【Fig110】天然配列PRO836ポリペプチドUNQ545(配列番号:271)を示す図である。
【Fig111】DNA60627−1508(配列番号:272)を示す図である。
【Fig112】天然配列PRO1159ポリペプチドUNQ589(配列番号:273)を示す図である。
【Fig113】DNA64890−1612(配列番号:274)を示す図である。
【Fig114】天然配列PRO1358ポリペプチドUNQ707(配列番号:275)を示す図である。
【Fig115】DNA66659−1593(配列番号:276)を示す図である。
【Fig116】天然配列PRO1325ポリペプチドUNQ685(配列番号:277)を示す図である。
【Fig117】DNA66667−1596(配列番号:278)を示す図である。
【Fig118】天然配列PRO1338ポリペプチドUNQ693(配列番号:279)を示す図である。
【Fig119】DNA68818−2536(配列番号:280)を示す図である。
【Fig120】天然配列PRO1434ポリペプチドUNQ739(配列番号:281)を示す図である。
【Fig121】DNA84210−2576(配列番号:285)を示す図である。
【Fig122】天然配列PRO4333ポリペプチドUNQ1888(配列番号:286)を示す図である。
【Fig123】DNA92218−2554(配列番号:292)を示す図である。
【Fig124】天然配列PRO4302ポリペプチドUNQ1866(配列番号:293)を示す図である。
【Fig125】DNA96878−2626(配列番号:294)を示す図である。
【Fig126】天然配列PRO4430ポリペプチドUNQ1947(配列番号:295)を示す図である。
【Fig127】DNA98853−1739(配列番号:296)を示す図である。
【Fig128】天然配列PRO5727ポリペプチドUNQ2448(配列番号:297)を示す図である。
(発明の分野)
本発明は免疫関連疾患の診断と治療のための組成物と方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害から修復を開始し、外来生物体に対する生得及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複合化し、多くの場合は多重に相互に関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、さらなる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路、及び多くの生物学的システム/経路、に関与しており、一又は複数のこれらの経路の重要点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス/経路、又は有益なプロセス/経路の刺激のいずれかにより生じる。
【0003】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Tリンパ球(T細胞)は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。主要組織適合性複合体(MHC)内の遺伝子によりコードされる自己分子と結合する抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片の表面上のMHC分子と共に示され得る。T細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去するものである。T細胞はヘルパーT細胞及び細胞障害性T細胞を含む。ヘルパーT細胞は、抗原提示細胞上の抗原−MHC複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーT細胞は種々のサイトカイン、例えばリンホカインを分泌し、これはB細胞、細胞障害性T細胞、及び免疫反応に寄与している種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担っている。
【0004】
体液及び細胞媒介性の免疫反応の双方における中心的事象は、ヘルパーT細胞の活性化及びクローン増殖である。ヘルパーT細胞の活性化は、抗原提示細胞の表面におけるT細胞レセプター(TCR)−CD3複合体と抗原−MHCとの相互作用により開始される。この相互作用は休止ヘルパーT細胞が細胞サイクル(G0からG1転移)に入るのを誘発する生化学的事象のカスケードを媒介し、結果として、IL−2と、時々はIL−4とに対する高親和性レセプターが発現する。活性化されたT細胞は増殖及び記憶細胞とエフェクター細胞への分化のサイクルを通って進行する。
TCRを通して媒介されたシグナルに加えて、T細胞の活性化は、抗原提示細胞により放出されるサイトカイン、又は抗原提示細胞とT細胞上の膜結合性分子との相互作用により誘発される付加的な同時刺激に関与している。サイトカインIL−1及びIL−6は同時刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面で発現したB7分子とT細胞表面で発現したCD28及びCTLA−4分子との相互作用により細胞の活性化がなされる。活性化されたT細胞は増加した数の細胞付着分子、例えばICAM−1、インテグリン、VLA−4、LFA−1、CD56等を発現する。
【0005】
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応(MLR)におけるT細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫反応において、炎症細胞は傷害又は感染部位に浸潤する。移動細胞は、影響を受けた組織の組織学的検査により決定可能な好中球、好酸球、単球又はリンパ球でありうる。Current Protocols in Immunology, 編集 John. E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.参照。
免疫関連疾患は免疫反応を抑制することにより治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を使用することは、免疫媒介及び炎症疾患の治療に有用である。免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に有用であり(タンパク質を直接、又は抗体アゴニストの使用を介して)、よって免疫関連疾患を改善する。
【0006】
(発明の概要)
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断と治療ための組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタンパク質(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)の同定に基づく。免疫関連疾患は免疫反応を阻害又は増強することで治療することができる。免疫反応増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子は治療に使用可能である。また、免疫反応の抑制が重要である場合には、このような刺激分子は阻害されうる。
中和抗体は、免疫刺激活性を有する分子を阻害する分子の例であり、免疫関連及び炎症疾患の治療に役立つ。また、免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に(タンパク質を直接又は抗体アゴニストの使用を経て)利用されうるし、こうして免疫関連疾患は改善する。
【0007】
従って、PROポリペプチド及び抗−PRO抗体及びそれらの断片は、免疫関連疾患の診断及び/又は治療(予防を含む)に役立つ。刺激タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の阻害に利用可能である。阻害タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の刺激に有用である。また、PROポリペプチド及び抗−PRO抗体は免疫関連及び炎症疾患の治療のための薬や薬剤の調製に有用である。
一実施態様において、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様において、単離された核酸分子は、(a)ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【0008】
他の態様において、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されたPROポリペプチドcDNAのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
さらなる態様では、本発明は、(a)ここに開示されたATTCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【0009】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたPROポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の実施態様は、PROポリペプチドコード配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗−PRO抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするPROポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約20のヌクレオチド長、又は少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約40のヌクレオチド長、又は少なくとも約50のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約70のヌクレオチド長、又は少なくとも約80のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約100のヌクレオチド長、又は少なくとも約110のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約130のヌクレオチド長、又は少なくとも約140のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約160のヌクレオチド長、又は少なくとも約170のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約190のヌクレオチド長、又は少なくとも約200のヌクレオチド長、又は少なくとも約250のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約350のヌクレオチド長、又は少なくとも約400のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約500のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約700のヌクレオチド長、又は少なくとも約800のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長、又は少なくとも約1000のヌクレオチド長、又は少なくとも約1500ヌクレオチド長、又は少なくとも約2000ヌクレオチド長、又は少なくとも約2500ヌクレオチド長、又は少なくとも約3000ヌクレオチド長、又は少なくとも約4000ヌクレオチド長、又は少なくとも約5000ヌクレオチド長、又はそれ以上であり、ここで、「約」という用語は、その参照長のプラス又はマイナス10%の参照ヌクレオチド配列長を意味する。それぞれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、それぞれのPROポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのヌクレオチド配列断片(類)が新規であるかを決定することにより常套的方法により決定することができることに留意される。そのようなそれぞれのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子によりコードされるPROポリペプチド断片、好ましくは抗−PROポリペプチド抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのポリペプチド断片である。
【0010】
他の実施態様では、本発明は、上記で同定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。
或る態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたATTCに寄託されたヒトタンパク質cDNAの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
【0011】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するPROポリペプチドのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、又は少なくとも約81%のポジティブ、又は少なくとも約82%のポジティブ、又は少なくとも約83%のポジティブ、又は少なくとも約84%のポジティブ、又は少なくとも約85%のポジティブ、又は少なくとも約86%のポジティブ、又は少なくとも約87%のポジティブ、又は少なくとも約88%のポジティブ、又は少なくとも約89%のポジティブ、又は少なくとも約90%のポジティブ、又は少なくとも約91%のポジティブ、又は少なくとも約92%のポジティブ、又は少なくとも約93%のポジティブ、又は少なくとも約94%のポジティブ、又は少なくとも約95%のポジティブ、又は少なくとも約96%のポジティブ、又は少なくとも約97%のポジティブ、又は少なくとも約98%のポジティブ、又は少なくとも約99%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
特定の態様では、本発明は、N末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを持たない単離されたPROポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の態様では、本発明は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたPROポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
【0012】
他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ここに記載のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものが含まれる。
さらに他の実施態様では、本発明は、アンチセンスプローブとして、又はゲノム及びcDNAヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでそれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意の任意のものから誘導されうる。
【0013】
さらなる他の実施態様では、本発明は、PROポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を模倣又は阻害する、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは、PROポリペプチド又は小分子に結合する抗体である。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、PROポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はPROポリペプチドの活性を模倣し(アゴニスト抗体)、又は逆に抗体はPROポリペプチドの活性を阻害又は中和する(アンタゴニスト抗体)。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗−イディオタイプ抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
【0014】
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤との混合物においてポリペプチドと結合するPROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含む組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が免疫刺激分子を含むとき、組成物は:(a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるT−リンパ球の増殖を増加させるのに役立つ。さらなる態様では、組成物が免疫阻害分子を含むとき、組成物は:(a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させ、(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低減させ、又は(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるT−リンパ球の増殖を減少させるのに役立つ。他の態様では、組成物はさらなる活性成分を含み、それは例えばさらなる抗体又は細胞毒又は化学療法剤であり得る。好ましくは、組成物は滅菌される。
他の実施態様では、本発明は、上述の用途を有する組成物又は医薬品の調製のための、本発明のPROポリペプチド及び抗体の使用に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を構成するベクターや組み換え宿主細胞に関する。またさらなる実施態様では、本発明は、抗体が発現するような条件下で、抗体をコードする核酸を使って形質転換された宿主細胞を培養し、細胞媒地から抗体を回収することにより、そのような抗体を生産する方法に関する。
【0015】
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドをコードする核酸分子、又はその補体にハイブリッド形成する単離された核酸分子に関する。この核酸は好ましくはDNAであり、ハイブリッド形成は好ましくは緊縮条件下で起こる。このような核酸分子は、ここに同定される増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用でき、翻って、対応する増幅遺伝子の変調において、又は増幅反応のアンチセンスプライマーとしての用途が見いだされる。さらに、このような配列はリボザイム及び/又はトリプルヘリックス配列の一部として燃使用でき、翻って、増幅遺伝子の調節で使用することもできる。
他の実施態様では、本発明は、ポリペプチドを含有及び/又はそれを発現すると疑われる細胞を、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体に暴露し、抗体の細胞への結合を測定することを含んでなるPROポリペプチドの存在を決定する方法に関する。
さらなる他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得た組織細胞の試験試料における、及び(b)同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における、PROポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、対照試料と比較して試験試料の発現レベルが高い又は低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
【0016】
他の実施態様では、本発明は(a)抗−PROポリペプチド抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、(b)試験試料中でのそれぞれのPROポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、該疾患の有又は無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監視との比較において実施される。試験試料における多量の複合体形成は、試験組織細胞を得た哺乳動物における免疫疾患の有又は無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術により監視することができる。通常、試験試料は、免疫システムに欠陥又は異常があると推測される個体から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体と(例えば緩衝剤のような)担体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはPROポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
【0017】
さらなる実施態様では、本発明は:
容器;
容器上の説明書;及び
容器内に収容された活性剤を含む組成物;
を含んでなる製造品に関し;ここでその組成物は哺乳類における免疫反応の刺激又は阻害に効果があり、容器上の説明書は組成物が免疫関連疾患の治療に使用されうることを示しており、組成物中の活性剤はPROポリペプチドの発現及び/又は活性を刺激又は阻害する薬剤である。好ましい態様では、活性剤は、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、又は抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体である。
【0018】
さらなる実施態様は、PROポリペプチドに候補化合物を、これら2つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と状況の下で接触させることにより、PROポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法である。特定の態様では、候補化合物又はPROポリペプチドのどちらかは固体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出標識を保有する。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−PRO抗体に応答性のある症状の治療に有用な医薬品の調製のための、ここに記載されたPROポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−PRO抗体の使用に向けられる。
【0019】
(好適な実施態様の詳細な説明)
I.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド(類)」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/数字、すなわち特に、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を称する。「PRO/数字ポリペプチド」及び「PRO/数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体(ここで更に定義する)を含む。ここに記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列PROポリペプチド(類)」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PRO/数字ポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド(類)」という用語には、特に、特定のPRO/数字ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここで記載の天然配列PROポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字又は下線で示す。しかし、添付の図面に開示したPRO/数字ポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置1としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置1の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をPROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
「PROポリペプチド(類)細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しない前記ポリペプチドの形態を称する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えないと思われる。よって、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン/細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約5又はそれ未満のアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、そのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【0020】
ここに開示する種々のPRO/数字PROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC−末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸以下である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに当該技術にいて日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1−6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683−4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのC−末端境界のいずれかの側の約5アミノ酸以下の範囲内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「PROポリペプチド変異体」、「PRO/数字変異体」又は「PRO変異体」とは、ここに(例えば以下に)定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN−又はC−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くPROポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたPROポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の特に定められた他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、又は少なくとも約20アミノ酸長、又は少なくとも約30アミノ酸長、又は少なくとも約40アミノ酸長、又は少なくとも約50アミノ酸長、又は少なくとも約60アミノ酸長、又は少なくとも約70アミノ酸長、又は少なくとも約80アミノ酸長、又は少なくとも約90アミノ酸長、又は少なくとも約100アミノ酸長、又は少なくとも約150アミノ酸長、又は少なくとも約200アミノ酸長、又は少なくとも約300アミノ酸長、又は少なくとも約400アミノ酸長、又は少なくとも約500アミノ酸長、又は少なくとも約600アミノ酸長、又は少なくとも約700アミノ酸長、又は少なくとも約800アミノ酸長、又は少なくとも約900アミノ酸長、又は少なくとも約1000アミノ酸長、又は少なくとも約1200アミノ酸長、又は少なくとも約1400アミノ酸長、又は少なくとも約1500アミノ酸長、又はそれ以上である。
【0021】
ここで同定されているPROポリペプチド配列に対して「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のPRO/数字ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが以下の表1に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表1に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから公に入手可能であり、また以下の表1に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2と3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO」とは関心ある仮のPRO/数字ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」とは関心ある「PRO」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「X」、「Y」、「Z」はそれぞれ異なった仮のアミノ酸配列を表す。
【0022】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての%アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて得ることもできる。殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2を用いた場合、%アミノ酸配列同一性値は、WU−BLAST−2により決定されるように(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるPROポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)関心あるPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含むポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが関心あるPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
また、パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードしてもよく、別にNational Institute of Health, Bethesda, MDから得てもよい。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【0023】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性PROポリペプチドをコードする核酸分子でを意味し、(1)ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド;(2)ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド;(3)ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないPROポリペプチドの細胞外ドメイン又は(4)ここに開示された全長ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する。通常は、PROポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、(1)ここに開示された全長天然配列PROポリペプチド配列、(2)ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、(3)ここに開示されたシグナル配列を伴うか伴わないPROポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は(4)ここに開示された全長PROポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、又は少なくとも約81%の核酸配列同一性、又は少なくとも約82%の核酸配列同一性、又は少なくとも約83%の核酸配列同一性、又は少なくとも約84%の核酸配列同一性、又は少なくとも約85%の核酸配列同一性、又は少なくとも約86%の核酸配列同一性、又は少なくとも約87%の核酸配列同一性、又は少なくとも約88%の核酸配列同一性、又は少なくとも約89%の核酸配列同一性、又は少なくとも約90%の核酸配列同一性、又は少なくとも約91%の核酸配列同一性、又は少なくとも約92%の核酸配列同一性、又は少なくとも約93%の核酸配列同一性、又は少なくとも約94%の核酸配列同一性、又は少なくとも約95%の核酸配列同一性、又は少なくとも約96%の核酸配列同一性、又は少なくとも約97%の核酸配列同一性、又は少なくとも約98%の核酸配列同一性、又は少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。変異体は天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PROポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30のヌクレオチド長、又は少なくとも約60のヌクレオチド長、又は少なくとも約90のヌクレオチド長、又は少なくとも約120のヌクレオチド長、又は少なくとも約150のヌクレオチド長、又は少なくとも約180のヌクレオチド長、又は少なくとも約210のヌクレオチド長、又は少なくとも約240のヌクレオチド長、又は少なくとも約270のヌクレオチド長、又は少なくとも約300のヌクレオチド長、又は少なくとも約450のヌクレオチド長、又は少なくとも約500のヌクレオチド長、又は少なくとも約600のヌクレオチド長、又は少なくとも約700のヌクレオチド長、又は少なくとも約800のヌクレオチド長、又は少なくとも約900のヌクレオチド長、又は少なくとも約1000のヌクレオチド長、又は少なくとも約1200のヌクレオチド長、又は少なくとも約1400のヌクレオチド長、又は少なくとも約1600ヌクレオチド長、又は少なくとも約1800のヌクレオチド長、又は少なくとも約2000ヌクレオチド長、又は少なくとも約2500ヌクレオチド長、又は少なくとも約3000ヌクレオチド長、又は少なくとも約3500のヌクレオチド長、又は少なくとも約4000ヌクレオチド長、又は少なくとも約5000ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるPRO核酸のヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、%核酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが以下の表1に与えられている配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表1に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから公に入手可能であり、また以下の表1に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0024】
核酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。%核酸配列同一性の計算の例として、表4と5は、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「PRO−DNA」は、関心ある仮のPROポリペプチドコード化核酸配列を表し、「比較DNA」は関心ある「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「N」、「L」及び「V」はそれぞれ異なった仮のヌクレオチド配列を表す。
特に断らない限り、ここで用いられる全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性値は、以下に記載するように、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて得ることもできる。殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2を用いた場合、%核酸配列同一性値は、WU−BLAST−2により決定されるように(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列(すなわち参照配列)を有する関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、関心ある比較核酸分子(すなわち、関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子が比較されるPRO変異ポリヌクレオチドであってもよい配列)との間の、一致する同一ヌクレオチドの数を、(b)PRO参照配列のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bと少なくとも80%の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含む単離された核酸分子」という記載において、核酸配列Aは関心ある比較核酸分子であり、核酸配列Bは関心あるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【0025】
また、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードしてもよく、別にNational Institute of Health, Bethesda, MDから得てもよい。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
配列比較にNCBI−BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチド数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【0026】
他の実施態様では、PRO変異体ポリヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能な核酸分子である。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「ポジティブ(陽性)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基(例えば、保存的置換の結果として、下記の表6参照)を含む。ここでの目的のために、ポジティブの%値は、(a)天然配列PROポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるPROポリペプチド配列と、関心ある比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列)との間の、WU−BLAST−2のBLOSUM62マトリクス内で決定されるようにポジティブ値をスコアされるアミノ酸残基の数を、(b)関心あるPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の%値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。しかしながら、上述のALIGN−2及びNCBI−BLAST2について記載したように実施されるアミノ酸配列同一性比較には、同一のみならず類似した特性をもつ比較配列におけるアミノ酸残基が含まれる。関心あるアミノ酸残基に対してポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表1に定義)であるものである。
【0027】
ALIGN−2又はNCBI−BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対するポジティブの%値(与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対して或る程度の%ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2又はNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによってポジティブ値であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%ポジティブは、BのAに対する%ポジティブとは異なると認識されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、自然環境におけるPROポリペプチドの少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
【0028】
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、PROポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される状態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたPROポリペプチドコード化核酸は、天然の細胞中に存在するポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある特定のポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるものを含む。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0029】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハート液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
【0030】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハート液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といったものある。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
「抗体」(Abs)と「免疫グロブリン」(Igs)は、概略的に、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む)、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、PROポリペプチドに特異的なエピトープと結合する単鎖抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片もカバーする。抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体は、それぞれPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドに免疫学的に結合する抗体である。抗体は、抗体に接触し得るPROポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。例えば、抗体はポリペプチドの任意の細胞外ドメインに、また全ポリペプチドが分泌されたものである場合は、抗体が結合のために利用可能なポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。
【0031】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の「高頻度可変領域」又は「相補性決定領域(CDR)」と呼ばれる3又は4のセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成するCDRにより連結されたβシート配置を主にとる4又は5のFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して結合せしめられ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91−3242, Vol.I, 647−669頁[1991]を参照のこと)。CDRの範囲を決定するためには少なくとも2つの技術がある:(1)交雑種配列可変性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat等., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda. MD);及び(2)抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Chothia, C.等., (1989), Nature 342:877)。さらにまた、CDRは先の技術の両方により同定される残基を導入するハイブリッド形成アプローチを使用して決定することもできる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057−1062[1995]);単鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るF(ab’)2断片が生じる。
【0032】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH−VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているFab’に対するここでの命名である。F(ab’)2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
【0033】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 [1975]により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えDNA法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624−628[1991]、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581−597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。また、ファージミド及びファージベクターを使用する抗体の調製について記載した米国特許第5,750,373号、同5,571,698号、同5,403,484号及び同5,223,409号を参照のこと。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851−6855[1984])。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Jones等, Nature 321, 522−525(1986);Reichmann等, Nature 332, 323−329[1988];及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593−596(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心ある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来する「プリマタイズした(primatized)」抗体を含む。旧世界ザルの残基を含有する抗体も本発明の範疇に入れることができる。例えば、米国特許第5,658,570号;同5,693,780号;同5,681,722号;及び同5,756,096号を参照のこと。
【0034】
本発明の抗体及びその断片には、抗体を一又は複数のCDR領域及び/又はフレームワーク領域のアミノ酸配列を変化させて、それが結合する抗原に対する抗体又はその断片の親和性を改変させた「親和成熟(affinity matured)」抗体も含まれる。親和成熟により、出発抗体と比較して抗原に対する成熟抗体の親和性が増加又は低減する結果となる。典型的には、出発抗体はヒト化、ヒト、キメラもしくはマウス抗体であり、親和成熟した抗体は出発抗体よりも高い親和性を有する。成熟プロセス中、CDR又はフレームワーク領域における一又は複数のアミノ酸残基は、任意の標準的な方法を使用して異なる残基に変えられる。適切な方法には、よく知られているカセット突然変異法(Well等, 1985. Gene 34:315)又はオリゴヌクレオチド媒介突然変異法(Zoller等, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487−6504)を使用する点突然変異が含まれる。また親和成熟は、多くの変異体を産出し、所望の親和性を有する変異体を抗原又はリガンドに対する改善された親和性に基づき、変異体のライブラリ又はプールから選択する、既知の選択法を使用して実施することもできる。既知のファージライブラリ技術をこのアプローチ法で簡便に使用することができる。例えば米国特許第5,750,373号、米国特許第5,223,409号等を参照のこと。
ヒト抗体は本発明の抗体の範囲に入る。ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985);Boerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991);米国特許第5,750,373号]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により十分に記載されている。
【0035】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接又は間接的に抱合して、「標識」化合物を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の化合物がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここで含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫システムの成分が、哺乳動物の病的状態を引き起こし、媒介し又は寄与等するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫不全症、異常増殖等が含まれる。
「T細胞媒介疾患」という用語は、T細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか寄与等する疾患を意味する。T細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等を伴い、例えばT細胞により分泌されるリンホカインによりB細胞が刺激されている場合はB細胞に関連した効果を伴う。
本発明で治療可能で、そのいくつかは免疫又はT細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vaculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎及び他の非肝炎性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎;クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばAIDS(例えばHIV感染)、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【0036】
「治療」とは、疾患の病理の進行又は改変の防止を意図して行われる。従って、「治療」とは、治癒的処置、予防的処置及び防止的処置の両方を称する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。免疫関連疾患の治療において、治療薬は直接的に免疫反応の成分度合いを減少又は増加させてもよいし、又は他の治療薬、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対してより敏感にしてもよい。
「有効量」という用語は、インビトロアッセイで測定される哺乳動物における免疫反応の成分で、検出可能な改善を引き起こすか、誘発するか、又は結果をもたらすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。例えば、T細胞の増殖及び/又は血管透過性の増加又は低減がここで提供される実施例で測定される。さらに「治療有効量」は、哺乳動物における免疫反応の成分で、病状を少なくとも緩和させる(ケースによっては増加又は減少させる)のに有効で、上述したパラグラフに定義された治療に効果的な結果をもたらすPROポリペプチド及び/又はアゴニスト/アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
免疫関連疾患の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、抗体生産、自己抗体生産、補体生産及び活性化、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化、組織空間への炎症細胞(好中球、エシオン好性球、単球、リンパ球)の侵入等を含む。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、ハムスター、イタチ、ネコ等を含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【0037】
ここで用いられる「細胞障害薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び/又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90及びRe186)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル(Taxol, Bristol−Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(Taxotere, Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号を参照のこと)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、S相でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(S相以外の位置で)ブロックする薬剤、例えばG1停止又はM相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM相ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S相停止にも溢流し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル、及びara−Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、1つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インシュリン;プロインシュリン;レラキシン;プロレラキシン;糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体化ホルモン(LH);肝臓成長因子;線維芽成長因子;プロラクチン;胎盤ラクトゲン;腫瘍壊死因子−α及び−β;ミューラー阻害因子;マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF−β等の神経成長因子;血小板成長因子;TGF−α及びTGF−β等のトランスフォーミング成長因子(TGF);インシュリン様成長因子−I及びII;エリスロポエチン(EPO);骨誘発因子;インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えばマクロファージ−CSF(M−CSF);顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF);及び顆粒球−CSF(G−CSF);インターロイキン(ILs)、例えばIL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12;腫瘍壊死因子、例えばTNF−α及びTNF−β;及びLIF及びキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【0038】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは、融合するPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20のアミノ酸残基)を有する。
PROポリペプチド変異体における「活性な」及び「活性」とは、PROポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体の産生を誘発する能力及び/又は生物学的機能を保持する本発明のタンパク質の形態を指す。より詳細には、「生物学的活性」とは、天然配列又は天然発生PROポリペプチドによって引き起こされる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能を指す。さらにより詳細には、ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能な抗体又は他の分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、このような分子が、組織への炎症細胞の侵入を誘発又は阻害し、T細胞の増殖又は活性化を刺激又は阻害し、細胞からのサイトカインの放出を阻害し、又は血管透過性を増加又は低減させる能力のことである。他の特定の生物学的活性は増加した血管透過性又はその阻害である。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列PROポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列PROポリペプチドの生物学的活性を模倣又は増幅する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、PROポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「小分子」とは、ここで、約600ダルトン未満の分子量を持つと定義され、一般的に有機化合物である。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(場合によっては化学療法剤を含む)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【0039】
【0040】
【0041】
II. 本発明の組成物と方法
1.本発明のPROポリペプチドの調製
本発明は、本出願でPROポリペプチドとされるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に開示するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」又は「PRO」で呼称する。
特に、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド(それぞれ、UNQ174、UNQ178、UNQ186、UNQ190、UNQ200、UNQ214、UNQ209、UNQ219、UNQ146、UNQ240、UNQ239、UNQ293、UNQ330、UNQ365、UNQ316、UNQ317、UNQ318、UNQ319、UNQ313、UNQ332、UNQ334、UNQ540、UNQ434、UNQ408、UNQ407、UNQ430、UNQ557、UNQ491、UNQ598、UNQ516、UNQ701、UNQ585、UNQ633、UNQ678、UNQ606、UNQ630、UNQ653、UNQ608、UNQ698、UNQ732、UNQ722、UNQ728、UNQ900、UNQ859、UNQ179、UNQ21、UNQ236、UNQ303、UNQ294、UNQ322、UNQ388、UNQ435、UNQ433、UNQ483、UNQ545、UNQ589、UNQ707、UNQ685、UNQ693、UNQ739、UNQ1888、UNQ1866、UNQ1947及びUNQ2448に相当)をコードするcDNAは、以下の実施例においてさらに詳細に開示されているように、同定され単離されている。
【0042】
特に、本明細書は、天然配列PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430及びPRO5727ポリペプチドをそれぞれコードする、cDNA、DNA29101−1276、DNA30871−1157、DNA30942−1134、DNA33087−1158、DNA33460−1166、DNA34387−1138、DNA35558−1167、DNA35638−1141、DNA35916−1161、DNA39523−1192、DNA40620−1183、DNA40982−1235、DNA44184−1319、DNA44205−1285、DNA45410−1250、DNA45416−1251、DNA45419−1525、DNA47365−1206、DNA47470−1130、DNA48314−1320、DNA49435−1219、DNA50921−1458、DNA53974−1401、DNA54228−1366、DNA54231−1366、DNA56405−1357、DNA57033−1403、DNA57690−1374、DNA59220−1514、DNA59294−1381、DNA59776−1600、DNA59849−1504、DNA60775−1532、DNA61873−1574、DNA62814−1521、DNA64885−1529、DNA65404−1551、DNA65412−1523、DNA66675−1587、DNA68864−1629、DNA68872−1620、DNA68874−1622、DNA76400−2528、DNA77624−2515、DNA30868−1156、DNA36638−1056、DNA38260−1180、DNA40592−1242、DNA41374−1312、DNA44194−1317、DNA53517−1366、DNA53971−1359、DNA53987−1438、DNA57700−1408、DNA59620−1463、DNA60627−1508、DNA64890−1612、DNA66659−1593、DNA66667−1596、DNA68818−2536、DNA84210−2576、DNA92218−2554、DNA96878−2626、DNA98853−1739を記載している。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの事実上のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。寄託された配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託物の配列は正確な配列を含むと理解される。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0043】
B.PROポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PRODNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROの翻訳後プロセスを変えうると認識するであろう。
天然全長配列PRO配列又はここに記載したPROの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROと比較してPROのアミノ酸配列が変化するPROをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
PROポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、N−末端又はC−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【0044】
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換と題して表6に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6に例示的置換と示した又は以下に参照としてアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【0045】
【0046】
本発明のポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
【0047】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、もしくは好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位指向性)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cuningham及びWells, Science, 244: 1081−1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0048】
C.PROの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)−ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79−86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【0049】
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列PROに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失(潜在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O−結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981)に記載されている。
【0050】
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号又は同第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、PROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
【0051】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly−his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 (1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547−553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204−1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192−194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163−15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz−Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393−6397 (1990)]を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG1分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0052】
D.PROの調製
以下の記述は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid−Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149−2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
【0053】
1.PROポリペプチド(類)をコードするDNAの単離
PROをコードするDNAは、ポリペプチドmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPROコード化遺伝子は、ゲノムライブラリ、オリゴヌクレオチド合成、又は他の既知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリは、関心ある遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(例えば、PROポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。PROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の手段はPCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
下記の実施例には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
【0054】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の定められた領域内又は全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【0055】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPROポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456−457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527−537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348−352 (1988)を参照のこと。
ここのベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompTkanを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF−lac)169 degP ompT rbs7 ilvGkanを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【0056】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383);クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968−975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98−8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265−278 [1988]);カンジダ;トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259−5263 [1979]);シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日発行のEP 394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開のWO 91/00357);及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284−289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205−221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475−479 [1985])が含まれる。ここではメチロトロピック(methylotropic)酵母が適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見出される。
グリコシル化PROポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より特定の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS−7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 (1980));ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術範囲内にあると考えられる。
【0057】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージミド又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPROコード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日公開のEP362,179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PROコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4−1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
【0058】
発現及びクローニングベクターは、通常、PROコード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成に指向するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【0059】
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROポリペプチドコード化配列の5’又は3’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’、時には3’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620−625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40−46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【0060】
4.遺伝子発現の検出
遺伝子発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201−5205 (1980)]、サザンブロット法、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、PROポリペプチドをコードするDNAに融合した外因性配列に対して調製され得る。
【0061】
5.ポリペプチドの精製
PROの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン−X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York (1982)に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROポリペプチドの性質に依存する。
【0062】
E.組織分布
PROを発現する組織の位置は、種々のヒト組織でのmRNAの発現を測定することにより同定可能である。このような遺伝子の位置により、PROポリペプチドの活性の刺激又は阻害の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特異的組織における遺伝子の位置により、以下で論議される活性阻止アッセイについての試料組織も提供される。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来の、mRNAの転写の定量化のためのノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201−5205 [1980])、サザンブロット、ドットブロット(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、DNA二重鎖、RNA二重鎖、及びDNA−RNAハイブリッド二重鎖又はDNA−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培地又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列PROポリペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNA配列に基づく合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、PROポリペプチドをコードするDNAに融合した外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
【0063】
F.抗体結合性の研究
遺伝子増幅実験の結果は、それぞれ、組織細胞上でのPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの効果を阻害する、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体の能力が試験される抗体結合性の研究によって更に証明できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147−158 (CRC Press, Inc., 1987)。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは2つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第1の抗体に結合し、その後第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3成分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号参照。第2の抗体は検出可能部分で標識され(直接サンドウィッチアッセイ)、あるいは検出可能部分で標識された抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい(間接サンドウィッチアッセイ)。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はELISAアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【0064】
G.細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定されたポリペプチドと遺伝子との関係、及び免疫関連疾患の進行及び病理との関係をさらに理解するために使用するすることができる。
異なる方法では、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られた細胞型の細胞をここに記載のcDNAで形質移入し、これらのcDNAの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞を所望の遺伝子で形質移入し、免疫機能活性を監視できる。このような形質移入株化細胞は、次いで、例えばT細胞増殖又は炎症細胞の侵入を調節するといった、免疫機能を刺激又は阻害するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、(下記のような)トランスジェニック動物から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている(Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642−648 [1985]参照)。
一つの適切な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応(MLR)である。Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版。このアッセイでは、試験化合物が活性化したT細胞の増殖を刺激又は阻害する能力をアッセイする。レスポンダーT細胞の懸濁液を同種刺激細胞で培養し、トリチウム化チミジンの取込によりT細胞の増殖度合いを測定する。このアッセイはT細胞反応性の一般的な測定法である。多くのT細胞が応答し、IL−2の活性化をもたらすため、このアッセイにおける応答性の差異は、応答細胞によるIL−2生産の差異に部分的に反映する。MLRの結果を、標準的なリンホカイン(IL−2)検出アッセイにより証明することができる。上掲のCurrent Protocols in Immunology, 3.15.6.3.。
MLRアッセイにおける増殖性T細胞応答は、アッセイされる分子の直接的な有糸分裂促進特性又は外的な抗原誘発活性化による可能性がある。PROポリペプチドのT細胞刺激活性のさらなる証明は、同時刺激アッセイにより得ることができる。T細胞活性化にはT細胞レセプター(TCR)を通して媒介される抗原に特異的なシグナル、及び第2のリガンド結合相互作用、例えばB7(CD80、CD86)/CD28結合相互作用を通して媒介される同時刺激シグナルが必要である。CD28の架橋により、活性化T細胞によるリンホカインの分泌が増加する。T細胞活性化はネガティブ又はポジティブ効果を有するリガンドの結合を通してネガティブ及びポジティブコントロールの双方を有する。CD28及びCTLA−4はB7に結合するIgスーパーファミリーの糖タンパク質に関連している。B7に結合するCD28は、ポジティブなT細胞活性化同時刺激効果を有し;逆にB7に結合するCTLA−4はネガティブなT細胞非活性化効果を有する。Chambers. C.A. and Allison. J.P., Curr. Opin. Immunol. (1997)9:396。Schwartz, R.H., Cell(1992)71:1065;Linsey, P.S. and Ledbetter. J.A. Annu. Rev. Immunol.(1993)11:191;June, C.H.等 Immunol. Today(1994)15:321;Jenkins. M.K., Immunity(1994)1:405。同時刺激アッセイにおいて、PROポリペプチドはT細胞同時刺激又は阻害活性をアッセイするものである。
【0065】
PROポリペプチド、並びにT細胞の増殖の刺激剤(同時刺激剤)である本発明の他の化合物及びアゴニスト、例えばアゴニスト抗体で、例えばMLR及び同時刺激アッセイで決定されるようなものは、免疫機能の貧弱さ、最適下限又は不適切さに特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。これらの疾患はT細胞(及びT細胞媒介免疫性)の増殖及び活性化を刺激し、刺激化合物、例えば刺激性PROポリペプチドの投与により哺乳動物における免疫反応を増強することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えばPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド又はそのアゴニスト抗体であり得る。
本発明の刺激化合物の直接的用途は、プライムT細胞上で発現するリガンド(4−IBBL)に結合し、T細胞活性化及び成長の信号を発する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである4−IBB糖タンパク質を用いる実験において確認されている。Alderson, M.E.等,J.Immunol.(1994)24:2219。
また、アゴニスト刺激化合物の用途は実験的に確認されている。アゴニスト抗−4−IBB抗体を用いた治療による4−IBBの活性化は腫瘍の根絶化を増強する。Hellstrom. I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol.(1998)18:1。以下により詳細に記載する腫瘍治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激化合物の用途の他の例である。
さらに、免疫刺激又は増強効果はMLRアッセイにおいて阻害することが見出されたPROの活性に拮抗又はこれをブロックすることにより達成することができる。化合物の阻害活性を無効にすることで、ネットの刺激効果が生じる。適切なアンタゴニスト/ブロック化合物は阻害タンパク質を認識し、これに結合する抗体及びその断片であり、それにより該タンパク質とそのレセプターとの効果的な相互作用がブロックされ、レセプターを通したシグナル化が阻害される。この効果は、おそらくCTLA−4結合による阻害シグナルの除去することにより、T細胞増殖を増強する抗−CTLA−4抗体を使用する実験で確認されている。Walunas, T.L.等, Immunity(1994)1:405。
別に、免疫刺激又は増強効果は、血管透過性増強特性を有するPROの投与により達成することもできる。増強した血管透過性は炎症及び免疫細胞(例えば単球、好酸球、PMN)の局部的浸潤により緩和可能な疾患に有益である。
他方、T細胞増殖/活性化、リンホカイン分泌、及び/又は血管透過性の直接阻害剤であるPROポリペプチド並びに本発明の他の化合物は、免疫反応の抑制に直接使用することができる。これらの化合物は、過剰活性、最適上限(superoptimal)又は自己免疫反応により特徴付けられる免疫関連疾患の治療、及び免疫反応の程度を低減するのに有用である。本発明の化合物のこの用途は、レセプターB7に結合するCTLA−4がT細胞を非活性化するという上述の実験により確認されている。本発明の直接阻害化合物は類似した方法で機能する。血管透過性を抑制する化合物の用途は炎症を低減することが期待される。このような用途は過度の炎症に関連した病状の治療に有益である。
別に、刺激PROポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果をブロックする化合物、例えば抗体により、ネットの阻害効果が生じ、T細胞の増殖/活性化及び/又はリホカイン分泌を阻害することにより、T細胞媒介免疫反応を抑制するために使用することができる。ポリペプチドの刺激効果をブロックすると、哺乳動物の免疫反応が抑制される。この用途は抗−IL2抗体を使用する実験において確認されている。これらの実験において、抗体はIL2に結合し、そのレセプターへのIL2の結合が阻害され、よってT細胞阻害効果が達成される。
【0066】
H.動物モデル
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、T細胞機能アッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。(1997年9月18日に発行されたPCT公報WO 97/33551参照。)
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制された、又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は認識し、宿主抗原に反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはMHC抗原及び少量の移植抗原に対するT細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.3.に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、T細胞がインビボ組織の破壊を媒介する能力を試験し、及び移植拒絶におけるそれらの役割を測定する手段である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がT細胞、ヘルパーT細胞及びキラー−エフェクターT細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが示された。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W.E.Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889−992。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.4.に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶は、Tanabe, M.等, Transplantation(1994)58:23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol.(1994)4330−4338により記載されている同種心臓移植片モデルである。
遅延型過敏用の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイを提供する。遅延型過敏反応は、抗原投与による攻撃後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるT細胞媒介インビボ免疫反応である。またこれらの反応は組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症(MS)及び実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE、MS用のモデル)で生じる。適切な手順は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit4.5.に詳細に記載されている。
EAEは、T細胞及び単核細胞の炎症、続いて中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるT細胞媒介自己免疫疾患である。EAEは、一般的にヒトにおけるMS用の関連動物モデルであると考えられている。Bolton. C., Multiple Sclerosis(1995)1:143。急性及び再発性弛緩モデルの双方が開発されている。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit15.1及び15.2.に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するT細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Duncan. I.D.等, Molec. Med. Today(1997)554−561に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患用のモデルも参照のこと。
接触性過敏は、細胞媒介免疫機能の単純遅延型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅延型過敏反応が生じている外因性ハプテンに皮膚を暴露し、測定して定量する。接触性過敏は最初に敏感相、続いて顕現相を含む。顕現相はTリンパ球が以前接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫脹及び炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作成される。適切な手順は、Current Protocols in Immunology,;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, 及びW.Strober編, John Wiley & Sons, Inc, unit4.2に詳細に記載されている。また、Grabbe, S.及びSchwarz, T. Immun. Today 19(1):37−44(1998)を参照のこと。
関節炎用の動物モデルは、コラーゲン−誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎用の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及びsubchondral骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のCurrent Protocols in Immunology unit15.5.に記載されているプロトコルを使用し、自己免疫関節炎に対する活性度を試験することができる。また、Issekutz, A.C.等, Immunology(1996)88:569に記載されているCD18及びVLA−4インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
喘息モデルでは、抗原誘発気道反応性亢進、肺好球菌増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させることで誘発され、ついで、エアゾールにより送達された同様のタンパク質で動物を攻撃する、と記載されている。いくつかの動物モデル(モルモット、ラット、非ヒト霊長類)では、エアゾール抗原で攻撃されたヒトにおけるアトピー性喘息に類似した徴候が示された。本発明の化合物の、喘息治療における活性及び有効性を試験するのに適した手順は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.(1998)18:777とそこに引用された文献に記載されている。
【0067】
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患用の動物モデルにおいて試験することができる。T細胞が乾癬の病原である証拠も示唆されている。本発明の化合物はSchon. M.P.等, Nat. Med.(1997)3:183により記載されているscid/scidマウスモデルにおいて試験することができ、マウスは組織病理学的傷害に類似した乾癬を示す。他の適切なモデルはNickoloff. B.J.等, Am. J. Path.(1995)146:580に記載されているようにして調製されたヒト皮膚/scidマウスキメラである。
組換え(トランスジェニック)動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、関心ある動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号);胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148−615 [1985]);胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313−321 [1989]);胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803−1814 [1983]);精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717−73 [1989])を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232−636 (1992)の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はPCR増幅が用いられる。次いで、mRNA発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
さらに、特定組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために、動物を、例えば組織学的検査により免疫疾患の病原の徴候について検査してもよい。またブロック実験も実施することができ、ここでトランスジェニック動物は本発明の化合物で処理され、化合物のT細胞増殖刺激又は阻害の度合いが測定される。これらの実験において、上述のようにして調製したPROポリペプチドに結合するブロック抗体は動物に投与され、免疫機能における効果が測定される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムDNAと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするcDNAは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5’と3’末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターの記述についてはThomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987)を参照のこと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入され、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞を選択する[例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113−152参照]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【0068】
I.免疫アジュバント治療
一実施態様において、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍(癌)治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。T細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のMAGE、BAGE及びGAGEファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織で無症状であるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においてはかなりの量が発現している。DeSmet. C.等, (1996)Proc. Natl. Acad. Sci.93:7149。T細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Melero. I.等, Nature Medicine(1997)3:682;Kwon. E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1997)94:8099;Lynch. D.H.等, Nature Medicine(1997)3:625;Finn. O.J.及びLotze. M.T., J. Immunol.(1998)21:114。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、T細胞増殖/活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
J.候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド−免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のタンパク質と相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789−5793 (1991)]に開示されているようにして、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245−246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578−9582 (1991)]に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2−ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1−lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。2−ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる:通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で2つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第3の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視する。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【0069】
K. 免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、T細胞の増殖/活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害又は刺激するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子を含む。
例えば、アンチセンスRNA及びRNA分子は、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469−471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照のこと。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【0070】
L.抗体
本発明は、さらにT細胞の増殖、エオシン好性白血球の浸潤、血管透過性等を阻害(アンタゴニスト)又は刺激(アゴニスト)する抗−PRO抗体及びその断片を提供するものである。このような抗−PRO抗体又はその断片の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
抗−PRO抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0071】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗−PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59−103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51−63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrison等, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0072】
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323−329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323−327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534−1536 (1988)]の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985);Boerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991);米国特許第5,750,373号 ]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び/又は突然変異誘発を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製される(一般的にマウス、ヒト化又はヒトの)出発抗体のものよりも、5倍、より好ましくは10倍、さらに好ましくは20又は30倍の親和性を有する。
【0073】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はPROに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537−539[1983])。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655−3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【0074】
WO 96/27011に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えられた第2の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab’−TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’−チオールに再転換し、他のFab’−TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217−225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトT細胞及びErbB2レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547−1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444−6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【0075】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたPROポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−PROアームは、特定のPROポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28、又はB7)等の白血球上のトリガー分子又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgG(FcγR)に対するFcレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のPROポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はPROポリペプチド結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はPROポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子(TF)に結合する。
5.ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体は2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【0076】
6.エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191−1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918−2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560−2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti−Cancer Drug Design 3: 219−230 (1989)参照。
7.免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性抱合)に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫抱合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
抗体及び細胞障害薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス−アジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6−ジイソシアネート等)、及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、組織の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体−レセプター抱合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合抱合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【0077】
8.免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び同第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG−誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286−288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0078】
9.抗体の製薬組成物
本発明の活性PRO分子(例えばPROポリペプチド、抗−PRO抗体、及び/又はその変異体)、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性PRO分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロイド;ヘキサメトニウムクロイド;ベンズアルコニウムクロイド;ベンズエトニウムクロイド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又は又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここで開示されたスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式でこの分野で知られた標準技術を用いて製剤することができる。
リポフェクション又はリポソームもPRO分子を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えDNA技術によって生成できる。(例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889−7893 [1993]を参照のこと)。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性PRO分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤又はPRO分子を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とγ−エチル−L−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−(D)−3−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【0079】
N.治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、T細胞の増殖の刺激、T細胞の増殖の阻害、血管透過性の増加又は低減又はそれらの阻害によって特徴付けられるものを含む、T細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症ミオパシー(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症(systemic vaculitis)、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿)、自己免疫性血小板減少(特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少)、甲状腺炎(グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎(A型、B型、C型、D型、E型肝炎及び他の非肝炎性(nonhepatotropic)ウィルス)、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎;クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質/組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Tリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Tリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はTリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
【0080】
リウマチ様関節炎(RA)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はTリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己IgGに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる;多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間/体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、2つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第2の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、RA疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し;小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。RAで生じる可能性のある他の徴候には:心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多く場合16才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はRAといくつかの類似点があり;リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な3つのカテゴリー:小関節(pauarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にHLA−B27遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には:強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎;HLA−B27(血清学的には、クラスI MHCのHLA−B座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎;眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はCD8+Tリンパ球であり、クラスI MHC分子により付与される抗原を標的としている細胞である。CD8+T細胞は、MHCクラスI分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスI MHC対立遺伝子HLA−B27と反応する。HLA−27のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってCD8+細胞の反応が誘発されると仮定されている。
全身性硬化症(強皮症)は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり;これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり:血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり;血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ICAM−1は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するT細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には:胃腸管:萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動/運動性となっている平滑筋:腎臓:小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖:骨格筋:萎縮、間質性線維症:炎症:肺:間質性肺炎及び間質性線維症:及び心臓:収縮バンド壊死、瘢痕/線維症が含まれる。
【0081】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷/炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びRNAに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小RNA−タンパク質複合体であるRo及びLa抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、bilary硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血/壊死/変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第2の障害として血管炎(vasculitides)、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には:全身壊死性血管炎:多動脈炎結節(polyarteritis nodosa)、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎:ヴェゲナー肉芽腫症;リンパ腫様肉芽腫症:及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には:粘膜皮膚リンパ節症候群(MLNS又は川崎病)、単離したCNS血管炎、ベヘット(Behet’s)病、閉塞性血栓性血管炎(バージャー病)及び皮膚壊死性細静脈炎(venulitis)が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてADCC、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞(いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞)表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び/又はADCC/Fc−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【0082】
他の臨床的セッティング(setting)における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ADCC又はFc−レセプター−媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには:内在的モデルラット(BUF及びBBラット)及びチキン(肥満チキン種);誘導性モデル:チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原(甲状腺ペルオキシダーゼ)を用いた動物の免疫化が含まれる。
I型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり;この破壊は自己抗体及び自己反応性T細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン−非−反応性の表現型を産出することができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はT細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び/又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はT細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出/誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群;及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。MSにおいて、疾患の誘発及び進行はTリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Tリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はT細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み;CD4+Tリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Tリンパ球の駆動によると思われる。
好球性肺炎;特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Tリンパ球に依存して発生する。
乾癬はTリンパ球媒介炎症疾患である。障害はTリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【0083】
喘息;アレルギー性鼻炎;アトピー性皮膚炎;食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はT細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるTリンパ球、及びIgE媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患(GVHD)を含む移植関連疾患はTリンパ球依存性であり;Tリンパ球の機能を阻害することで改善される。免疫及び/又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染(限定するものではないがAIDS、A型、B型、C型、D型及びE型肝炎、ヘルペス)、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染(MLRを刺激する分子(又は誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる)、MLRを刺激する(分子/誘導体/アゴニスト)を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された(例えばHIV感染)又は医原性(例えば化学療法)免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び/又はTリンパ球が発育しているものもいることが示されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることが示されている。MLRにおけるTリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボにて利用される。MLRにおけるTリンパ球増殖反応を増強する分子(又は拮抗方式で同様のレセプターに影響を及ぼす小分子アゴニスト又は抗体)は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、MLRにおいてリンパ球反応を阻害する分子は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応抑制するように、インビボで機能し;このような分子は新生物細胞自体により発現するか、又はそれらの発現は他の細胞中の新生物により誘発され得る。このような阻害分子(抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段)の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
加えて、炎症誘発性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害;脳卒中;心筋梗塞;アテローム性動脈硬化;急性肺傷害;出血性ショック;火傷;敗血症/敗血症ショック;急性尿細管壊死;子宮内膜症;変性関節疾患及び膵炎(pancreatis)の治療に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入(鼻孔内、肺内)経路などにより投与される。抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
免疫アジュバント治療、他の治療的養生法において、抗癌剤を、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤(化学療法剤)又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばCD20、CD11a、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又は血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体を投与することも好ましい。別に、あるいは加えて、同一のもの又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。一実施態様では、PROポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いてPROポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とPROポリペプチドとの組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μg/kgから15mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な1日の用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kgの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【0084】
O.製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質(例えばPRO分子を含有するもの)を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第2の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
P.免疫関連疾患の診断及び予知
或る種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における用途が見出される。例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質(「マーカー遺伝子産物」)の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、参照としてここに取り込む。
【0085】
(実施例)
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えDNA技術の標準的な手法を用いる:Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【0086】
実施例1
ヒトPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430及びPRO5727ポリペプチドをコードするcDNAクローンの単離
以下に記載するcDNAクローンを単離するための様々な技術を使用した。使用した方法の一般的な記載は直ぐ後に示すが、単離された特定の配列に関連した詳細は各天然配列に対して別個に記載している。PROポリペプチドの実際の配列はATCCに寄託されたクローンによりコードされるか、又はその中に含まれるものであり、寄託された配列とここに開示された配列との間に不一致がある場合は、寄託された配列が正しい配列であると理解される。
ECD相同性
Swiss−Prot公的データベースからの約950の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(あれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えばGenBank)、私的ESTデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)、及びジェネンテクの企業のESTを含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いてEST配列の6フレーム翻訳に対してECDタンパク質配列を比較することで実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物を、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
公的及び私的データベースから引き出した種々のESTを使用して、コンセンサスDNA配列を構築した。次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定し、またここで同定された特定の天然配列PROポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。
全長天然配列クローン源に対して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、以下に記載するPCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマーの一方を用いて、特定の天然配列PROポリペプチドをコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリ構築のためのRNAは、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、小腸、胃筋肉細胞等を含む、種々のヒト組織ライブラリから単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(pRKB等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。クローンは周知の直ぐに利用できる方法を使用して配列化した。
【0087】
アミラーゼ酵母菌スクリーニング:
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを種々の組織(例えば、上述のECD相同性の手法において示したもの)からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬とプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターpRK5DにおいてオリゴdTプライムしたcDNAライブラリの作成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを1000bpを越えるサイズに分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dは、sp6転写開始部位に続いてSfiI制限酵素部位がありXhoI/NotIcDNAクローニング部位がさらに続くクローニングベクターである。
2.ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5’末端を優先的に提示するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上述した)一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST−AMY.0においてLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いてランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500−1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、SfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータを持ち、クローニング部位の後においてマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。よって、アミラーゼ配列と読み枠を合わせて融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
3.形質転換及び検出
上記第2項に記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌ろベクターの混合物を、次いで製造者に推奨されているようにして電気穿孔した。次いで、SOC培地(Life Technplogies、1ml)を添加し、その混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体を、次いでアンピシリンを含む20の標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCisco−勾配を用いてDNAを単離した。次いで精製したDNAについて以下の酵母プロトコールを実施した。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定とさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56−5A(ATCC−90785)であった。この株は以下の遺伝子型:MATアルファ、ura3−52、leu2−3、leu2−112、his3−11、his3−15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び/又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に関与する他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p又はSSA1p−4p)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施した。次いで、形質転換細胞を寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているようにして調製した。終夜培養は、次いで新鮮なYEPDブロス(500ml)中におよそ2x106細胞/ml(約OD600=0.1)となるまで希釈し、1x107細胞/ml(約OD600=0.4−0.5)まで再成長させた。
【0088】
次いで細胞を収集し、5,000rpmで5分間の間、Sorval GS3 ローター中のGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水中に再懸濁することにより形質転換のために調製し、Beckman GS−6KR遠心機において50mlのファルコン管内で3,500rpmにて再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE(10ml, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのLi20OOCCH3)で続けて洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、ミクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精巣DNA(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換DNA(1μg vol.<10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl, 40%のポリエチレングリコール−4000, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi2Ac pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5−10秒間遠心分離し、デカント及びTE(500μl, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地上に拡げた。
あるいは、複数の少量反応の代わりに、形質転換を1回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208−210 (1994)に記載されているようにして調製されたウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体は30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを含ませることにより実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176−179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red−120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD−Ura寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した(最終濃度50−100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離された同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌に対してポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD−Ura寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
標準的な技術による単離と配列決定により、以下に記載するようにさらなるデータベース検索の基礎となる酵母EST断片を同定した。
【0089】
4.アセンブリ
上述したように同定された酵母EST断片を使用し、種々の発現配列タグ(EST)データベースを検索した。ESTデータベースは、公的ESTデータベース(例えばGenBank, Merck/Wash U)及び私的ESTのデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いてEST配列の6フレーム翻訳とECDタンパク質配列を比較することにより実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、コンセンサスDNA配列を、BLAST又はBLAST−2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列及びジェネンテク社の企業のEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
このコンセンサス配列に基づいて:1)PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)特定のPROポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCRによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて関心ある遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリ構築のためのRNAを種々のヒト組織から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【0090】
シグナルアルゴリズム:
ジェネンテク社によって開発された企業のシグナル配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び/又は私的(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)なデータベースからの発現配列タグ(EST)並びに集団化及び構築されたEST断片に使用した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮下の配列又は配列断片の5’末端の第1と、場合によっては第2のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第1のATGに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも35の一義的なアミノ酸をコードしなければならない。第1のATGが必要なアミノ酸を有する場合、第2のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNAと対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)の組を用いてスコアをつけた。
上述した手順の結果、公的ESTデータベース(例えば、GenBank)と企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)を含む様々な発現配列タグ(EST)データベースと比較してEST配列が同定された。相同性検索はコンピュータプログラムBLAST及又はBLAST2を用いて実施された(Altshul等、Methods in Enzymology 266:460−480(1996))。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。この結果、全長クローンに対応するさらなるEST配列が同定され、検査され、配列決定され、又はオリゴヌクレオチドのクローン作成のためのテンプレートとして提供され、天然配列PROポリペプチドをコードするDNAを単離するための種々の組織ライブラリをスクリーニングするために使用された。
【0091】
A.ヒトPRO200(UNQ174)をコードするcDNAクローンの単離
VEGFとの相同性に基づいてIncyte Phamaceuticalsデータベースから同定された発現配列タグ(EST)に基づくプローブを、ヒト神経膠腫株化細胞G61から誘導されたcDNAライブラリのスクリーニングに使用した。スクリーニングは本出願の他の箇所で開示した手順と同様な方法で行った。特に、Incyteクローン「INC1302516」を以下の4つのプローブを生成するのに用いた:
9つのポジティブを同定し特徴付けした。3つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させなかった一つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム(ORF)をCMV−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ(FLAG, Kodak)及びヒスチジンタグ(His8)をORFと停止コドンの間に挿入した。UNQ174−His8及びUNQ174−FLAGを、SuperFect(Qiagen)によりヒト胚腎臓293細胞に形質移入し、[35S]メチオニン及び[35C]システインで3時間パルス標識した。15倍濃縮無血清条件培地20マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動させたとき(SDS−PAGE)、両方のエピトープタグタンパク質が同時に移動する。ヒトFc(IgG)配列の前にORFにクローニングすることによりUNQ174−IgG発現プラスミドを作成した。
UNQ174−IgGプラスミドを、Lipofectin(GibcoBRL)を用いて、10%ウシ胎児血清を添加したヒンクのTNM−FH培地(JRH Biosciences)において成長させた105Sf9細胞中にBaculogoldバキュロウイルスDNA(Pharmagen)で同時形質移入した。細胞を28℃で5日間インキュベートした。上清を収集し、次いで約10の感染多発性(MOI)でのSf9細胞感染による第1のウイルス増幅に使用した。細胞を3日間インキュベートし、次いで上清を回収し、1mlの上清の30μlのプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)への結合、続くSDS−PAGE分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第1の増幅の上清を、ESF−921培地(Expression Systems LLC)中において約0.1のMOIで成長させたSf9細胞のスピナー培地500mlの感染に使用した。収集した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインAセファロース4ファストフロー(Pharmacia)カラムに結合させることにより精製した。
同定されたクローンDNA29101の全ヌクレオチド配列をFig1(配列番号:1)に示す。クローンDNA29101(配列番号:1)は、太字の下線で示したように単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基285−287に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置1320−1322に見出される停止コドン(TAG)で終端する(Fig1、配列番号:1)。予測されるPRO200ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ174、配列番号2)は345アミノ酸長であり、39029ダルトンの算定分子量及び6.06のpIを持ち、これはFig2(配列番号:2)に示される。潜在的N−グルコシル化部位はアミノ酸残基25、54及び254にある。CUBドメインはアミノ酸残基52−65、118−125及び260−273にある。
UNQ174(配列番号:2)をコードするDNAを含むcDNAは、1998年3月5日にATCCに寄託され、寄託番号209653が付されている。
【0092】
B.ヒトPRO204(UNQ178)をコードするcDNAの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ESTを同定した。ヒト胎児網膜cDNAライブラリをPCRオリゴヌクレオチドプライマーでスクリーニングし、EST配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成することにより確認した。
cDNAクローンを同定し全体を配列決定した。DNA30871の全ヌクレオチド配列をFig3(配列番号:11)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA30871−1157(配列番号:11)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置367−378に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1498−1500に見出される停止コドン(TAA)で終端する(Fig3;配列番号:11)。予測されるPRO204前駆体(すなわち、UNQ178、配列番号:12)は374アミノ酸長であり、39285ダルトンの算定分子量及び6.06のpIを持ち、Fig4に示される。UNQ178(配列番号:12)をコードするDNAを含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209380が付与されている。
C.ヒトPRO212(UNQ186)をコードするcDNAの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用した結果、DNA30942の全長DNA配列(Fig5;配列番号:13)と誘導天然配列タンパク質UNQ186(配列番号:14)を同定をした。
この手順で使用したPCRプライマー(正方向及び逆方向)とプローブは次のものである:
DNA30942の全ヌクレオチド配列をFig5(配列番号:13)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA30942(配列番号:13)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置101−103に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1001−1003の停止コドン(TGA)で終端する(Fig5;配列番号:13)。Fig6(配列番号:14)の予測されるPRO212ポリペプチド前駆体は300アミノ酸長であり、32680ダルトンの算定分子量と8.70のpIを持つ。Fig6(配列番号:14)のPRO212配列は膜貫通ドメインを欠いていると考えられる。また、Fig6(配列番号:14)のアミノ酸1〜215は4つのシステインリッチドメイン(CRD)を含むECDを提示していると考えられる。DNA30942(配列番号:13)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託され(DNA30942−1134として特定)、ATCC寄託番号209254が付与されている。
【0093】
D.ヒトPRO216(UNQ190)をコードするcDNAクローンの単離
PRO212の単離のための上述した手順と類似した手順を使用し、PRO216ポリペプチドUNQ190(配列番号:19)(Fig8)をコードするDNA33087(配列番号:18)(Fig7)を単離した。
太字の下線で示したように、DNA33087は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基268−270に見かけの翻訳開始部位を有し、残基1531−1553の停止コドン(TAG)で終端する(Fig7、配列番号:18)。予測されるPRO215ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ190、配列番号:19)は421アミノ酸長であり、49492ダルトンの算定分子量及び5.51のpIを持つ(Fig8)。
ヒドロパシー分析により、アミノ酸残基1から20にシグナル配列、アミノ酸残基268−274及び300−306にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基230−235にN−ミリストイル化部位、及び残基146から167、217から238にロイシンジッパーの存在が示唆された。伝統的な単離技術とは別に、DNA配列は、Dayhoffタンパク質AB000114_1をコードする受託番号AB000114としてGenbankから公的に入手可能である。
また別に、配列はOhno等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 228(2):411−414(1996)に記載されている。DNA33087を含むcDNAクローン(DNA33087−1157として同定)は1997年9月16日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、ATCC寄託番号209381が付与されている。
E.ヒトPRO226(UNQ200)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA33460の全長DNA配列(Fig9;配列番号:20)と誘導天然配列タンパク質UNQ200(配列番号:21)を同定をした。
太字の下線で示したように、DNA33460は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基62−64に見かけの翻訳開始部位を有し、残基1391−1393の停止コドン(TGA)で終端する(Fig9、配列番号:20)。予測されるPRO226ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ200、配列番号:21)は443アミノ酸長であり、49391ダルトンの算定分子量及び4.82のpIを持ち、これはUNQ200としてFig10(配列番号:21)に示している。DNA33460−1166と命名されたDNA33460(配列番号:20)を含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209376が付与されている。
上述の手順で使用したヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0094】
F.ヒトPRO240(UNQ214)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA34387の全長DNA配列(Fig11;配列番号:25)と誘導天然配列タンパク質UNQ214(配列番号:26)を同定をした。
DNA34387の全ヌクレオチド配列をFig11(配列番号:25)に示す。太字の下線で示したように、DNA34387は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置12−14に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置699−701の停止コドン(TGA)で終端する(Fig11、配列番号:25)。予測されるPRO240ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ214、配列番号:26)は229アミノ酸長であり、24689ダルトンの算定分子量、7.83のpIを持ち、Fig12に示している。DNA34387(配列番号:25)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託されATCC寄託番号209260が付与されている。
上述に記載した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
G.ヒトPRO235(UNQ209)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35558の全長DNA配列(Fig13;配列番号:30)と誘導PRO235天然配列タンパク質UNQ209(Fig14、配列番号:31)を単離した。
DNA35558の全ヌクレオチド配列をFig13(配列番号:30)に示す。太字の下線で示したように、Fig13に示すDNA35558クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置667−669に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2323−2325の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO235ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ209、配列番号:31)は552アミノ酸長であり、61674ダルトンの算定分子量と6.95のpIを持つ(Fig14)。DNA35558を含むcDNAクローンは1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209374が付与されている。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
【0095】
H.ヒトPRO245(UNQ219)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35658の全長DNA配列(Fig15;配列番号:35)と誘導PRO245天然配列タンパク質UNQ219(Fig16、配列番号:36)を単離した。
上述の方法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
DNA35638の全ヌクレオチド配列をFig15(配列番号:35)に示す。クローンDNA35638は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置89−91に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1025−1027の停止コドン(TAG)で終端する(Fig15、配列番号35)。予測されるPRO245ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ219、配列番号:36)は312アミノ酸長であり、34554ダルトンの算定分子量と9.39のpIを持つ(Fig36)。DNA35638−1141と命名したDNA35638(配列番号:35)を含むcDNAクローンは1997年9月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209265が付与されている。
I.ヒトPRO172(UNQ146)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA35916の全長DNA配列(Fig17;配列番号:40)と誘導PRO172天然配列タンパク質UNQ146(Fig18、配列番号:41)を単離した。
Fig17に太字の下線で示したように、クローンDNA35916(配列番号:40)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置38−40に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2207−2209の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO172ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ146:配列番号:41)は723アミノ酸長であり、78055ダルトンの算定分子量と6.17のpIを持つ(Fig18)。DNA35916(配列番号:40)を含むcDNAクローンは1997年10月28日にATCCに寄託され(DNA35916−1161と命名)、ATCC寄託番号209419が付与されている。
上述の方法で使用されるヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0096】
J.ヒトPRO273(UNQ240)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA39523の全長DNA配列(Fig19;配列番号:45)と誘導PRO273天然配列タンパク質UNQ240(Fig20、配列番号:46)を単離した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA39523は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置500−502の停止コドン(TAG)で終端する(Fig19)。予測されるPRO273ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ240、配列番号:46)は111アミノ酸長であり、13078ダルトンの算定分子量と10.37のpIを持つ(Fig20)。DNA39523(配列番号:45)を含むcDNAクローンは1997年10月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209424が付与されている。
K.ヒトPRO272(UNQ239)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肺組織において、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA40620(Fig21;配列番号:50)と誘導PRO272天然配列タンパク質UNQ239(配列番号:51)を同定した。
PRO272をコードするDNA配列を単離するために合成して使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA40620(配列番号:50)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置35−37に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1020−1022の停止コドン(TGA)で終端する(Fig21)。予測されるポリペプチド前駆体は328アミノ酸長であり(Fig22)、37493ダルトンの算定分子量と4.77のpIを持つ。DNA40620(配列番号:50)を含むcDNAクローンは1997年10月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209388が付与されている。
L.ヒトPRO332(UNQ293)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、DNA40982の全長DNA配列(Fig23、配列番号:56)と誘導PRO332天然配列タンパク質UNQ293(Fig24、配列番号:57)を同定した。
上述した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
DNA40982の全ヌクレオチド配列(配列番号:56)をFig23に示す。Fig23に太字の下線で示したように、クローンDNA40982(配列番号:56)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置342−344に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2268−2270の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO332ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ293、配列番号:57、Fig24)は642アミノ酸長であり、72067ダルトンの算定分子量と6.60のpIを持つ。DNA40982(配列番号:56)を含むcDNAクローン(DNA40982−1235と命名)は1997年11月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209433が付与されている。
【0097】
M.ヒトPRO526(UNQ330)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44184(Fig25、配列番号:61)と誘導PRO526天然配列タンパク質UNQ330(Fig26、配列番号:62)を同定した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA44184(配列番号:61)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置514−516に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1933−1935の停止コドン(TGA)で終端する(Fig61)。予測されるPRO526ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ330、配列番号:62)は473アミノ酸長である(Fig62)。Fig62に示すUNQ330(配列番号:62)タンパク質は約50708ダルトンの算定分子量と9.28のpIを持つ。DNA44184を含むcDNAクローンは1998年3月26日にATCCに寄託され(DNA44184−1319と命名)、寄託番号209704が付与されている。
UNQ330(配列番号:62)の分析により、シグナルペプチド配列はおよそアミノ酸1−26にあることが明らかになった。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸135−156にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸436−439にある。N−グリコシル化部位は、およそアミノ酸82−85、179−182、237−240及び423−426にある。フォンウィルブランド因子(VWF)型Cドメインは、およそアミノ酸411−425に見られる。当業者であれば、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸にどのヌクレオチドが対応するかを理解できるであろう。
【0098】
N.ヒトPRO701(UNQ365)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44205(Fig27、配列番号:66)と誘導PRO526天然配列タンパク質UNQ365(Fig28、配列番号:67)を同定した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
Fig27に太字の下線で示したように、クローンDNA44205(配列番号:66)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置50−52に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2498−3000の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO701ポリペプチド前駆体(すなわちFig28、UNQ365、配列番号:67)は816アミノ酸長であり、91794Daの算定分子量(pI:5.88)を持つ。DNA44205を含むcDNAクローン(配列番号:66)(DNA44205−1285と命名)は1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209720が付与されている。
UNQ365(配列番号:67)は、およそアミノ酸位置25に潜在的シグナルペプチド切断部位を含む。アミノ酸位置83、511、716及び803には潜在的N−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼB型シグネーチャー2配列は、およそ残基125から135である。カルボキシルエステラーゼB型に相同な領域は、およそ残基54−74、197−212及び221−261である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸671からおよそ700に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から通常のようにして決定できる。
Q.ヒトPRO361(UNQ316)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45410(Fig29;配列番号:71)と誘導PRO361天然配列タンパク質UNQ316(Fig30、配列番号:72)を同定した。
ハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーを上述の方法に使用するために合成した:
太字の下線で示したように、クローンDNA45410(配列番号:71)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置226−228に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1519−1521の停止コドン(TAA)で終端する(Fig29)。予測されるPRO361ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ316、配列番号:72)は431アミノ酸長である(Fig30)。UNQ316としてFig30に示す天然配列PRO361タンパク質は、約46810の算定分子量と約6.45のpIを持つ。さらに、アルギナーゼファミリータンパク質を示す領域が、およそ残基F3からV14、またI39からT57に存在しており、膜貫通ドメインはおよそ残基P380からS409に存在している。DNA45410(配列番号:71)を含むcDNAクローンは1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209621が付与されている。
【0099】
P.ヒトPRO362(UNQ317)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45416(Fig31、配列番号:79)と誘導PRO362天然配列タンパク質UNQ317(Fig32、配列番号:80)を単離した。
上述の手順に使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA45416(配列番号:79)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1082−1084の停止コドン(TAA)で終端する(Fig31)。予測されるPRO362ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ317、配列番号:80)は321アミノ酸長である(Fig32)。Fig32に示すUNQ317タンパク質(配列番号:80)は約35544ダルトンの算定分子量と約8.51のpIを持つ。Fig32に示すUNQ317ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸149からおよそアミノ酸152にグリコサミノグリカン結合部位、及びおよそアミノ酸276からおよそアミノ酸306に膜貫通ドメインが存在することが証明された。DNA45416を含むcDNAクローン(配列番号:79)は1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209620が付与されている。
【0100】
Q.ヒトPRO363(UNQ318)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA45419(Fig33、配列番号:86)と誘導PRO363天然配列タンパク質UNQ318(Fig34、配列番号:87)を単離した。
上述の手順に使用するために合成されたハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA45419(配列番号:86)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置190−192に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1309−1311の停止コドン(TGA)で終端する(Fig33)。予測されるPRO363ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ318、配列番号:87)は373アミノ酸長である(Fig34)。Fig34に示すUNQ318タンパク質(配列番号:87)は約41281ダルトンの算定分子量と約8.33のpIを持つ。Fig34に示すUNQ318ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基221からおよそ残基254に膜貫通ドメインの存在が証明された。DNA45419を含むcDNAクローン(配列番号:86)は1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209616が付与されている。
R.ヒトPRO364(UNQ319)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト小腸ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性を示すポリペプチドをコードした発現配列タグ(EST)(IncyteEST番号3003460)を同定した。
次に、ECD相同性手順で使用したのと類似した方法でIncyte3003460ESTに対するコンセンサスDNA配列を組み立て、全長DNA配列DNA47365(Fig35、配列番号:91)と誘導PRO364天然配列タンパク質UNQ319(Fig36、配列番号:92)を単離した。
上述のスクリーニング法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA47365(配列番号:91)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置121−123に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置844−846の停止コドン(TGA)で終端する(Fig35)。予測されるPRO364ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ319、配列番号:92)は241アミノ酸長である(Fig36)。Fig36に示すUNQ319(配列番号:92)タンパク質は約26000ダルトンの算定分子量と約6.34のpIを持つ。潜在的N−グリコシル化部位はFig36に示すアミノ酸配列のアミノ酸146から149の間に存在する。推定シグナル配列はFig36に示す配列のアミノ酸1から25、潜在的膜貫通ドメインはFig36に示す配列のアミノ酸162から180の間に存在する。DNA47365を含むcDNAクローン(DNA47365−1206と命名)は1997年11月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209436が付与されている。
【0101】
S.ヒトPRO356(UNQ313)(NL4)をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、ヒトTIE−2 L1とTIE−2 L2との間に相同性を示すEST(#2939340)を同定した。
ESTに基づき、一対のPCRプライマー(正方向及び逆方向)とプローブを合成した:
Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターpRK5DにおいてClontech, Inc.から購入した子宮mRNA(Palo Alto, CA, USA, カタログ番号6537−1)よりオリゴdTプライムしたcDNAのライブラリーを作製した。pRK5Dは、sp6転写開始部位に続いてSfiI制限酵素部位を、さらにXhoI/NotIcDNAクローニング部位を持つクローニングベクターである。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で約1000bpを越えるように適切にサイズ分類し、XhoI/NotI切断pRK5Dにおいて所定の方向でクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上述で同定したPCRプライマー対でPCR増幅してスクリーニングを行った。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO356遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
上述のように単離したクローンのDNA配列決定により、天然配列PRO356(NL4)をコードする全長DNA配列(すなわちDNA47470、配列番号:101)及び誘導PRO356タンパク質配列UNQ313(配列番号:102)が得られた。
DNA47470の全ヌクレオチド配列をFig37(配列番号:101)に示す。太字の下線で示したように、クローンDNA47470(配列番号:101)は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置215−217に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置1038−1040にTAA停止コドンを有する。予測されるPRO356ポリペプチド前駆体は346アミノ酸長(すなわちUNQ313、配列番号:102)であり、40018ダルトンの算定分子量及び約8.19のpIを持つ。DNA47470(配列番号:101)を含むcDNAは1997年10月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209422が付与されている。
【0102】
T.ヒトPRO531(UNQ322)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA48314(Fig39、配列番号:106)と誘導PRO531天然配列タンパク質UNQ332(Fig40、配列番号:107)を単離した。
合成されたハイブリッド形成プローブPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA48314(配列番号:106)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置171−173に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2565−2567の停止コドン(TGA)で終端する(Fig39)。予測されるPRO531ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ332、配列番号:107)は789アミノ酸長である。Fig39に示すUNQ332タンパク質(配列番号:107)は約87552ダルトンの算定分子量と約4.84のpIを持つ。DNA48314を含むクローン(配列番号:106)は1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209702が付与されている。
配列番号:107のUNQ332アミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸122−132、231−241、336−346、439−449及び549−559にカドヘリン細胞外反復ドメインシグネーチャーが見られる。ATP/GTP結合部位モチーフA(P−ループ)は、配列番号:107のおよそアミノ酸285−292に見られる。N−グリコシル化部位は、配列番号:107のおよそアミノ酸567−570、786−790、418−421及び336−339に見られ、シグナルペプチドはおよそアミノ酸1−26にあり、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸685−712にある。
U.ヒトPRO533(UNQ334)をコードするcDNAクローンの単離
EST配列受託番号AF007268であるマウス線維芽細胞成長因子(FGF−15)を様々な公的ESTデータベース(例えば、GenBank, Dayhoff等)を検索するのに使用した。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST−2[Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996)]を用いて、ECDタンパク質配列をEST配列の6フレーム翻訳と比較することにより実施した。検索の結果、GenBankEST AA220994が同定され、これがストラタジーンNT2ニューロン前駆体937230として同定された。
この配列に基づいて、1)PCRにより関心ある配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ライブラリからのDNAをPCRプライマー対で、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCR増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマーの一方を使用するインビボクローニング手順により、関心あるPRO533遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリの作成のためのRNAはヒト胎児網膜から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、市販試薬(例えばInvitrogen, San Diego, CA;Clontech等々)を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター(例えばpRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
cDNAクローンはその全体を配列決定した。全長ヌクレオチド配列DNA49435(配列番号:111)をFig41に示す。Fig41に太字の下線で示したように、クローンDNA49435(配列番号:111)は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置464−466に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置649−651の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO533ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ334、配列番号:112)は216アミノ酸長であり、24003ダルトンの算定分子量と6.99のpIを有する。クローンDNA49435−1219は1997年11月21日にATCCに寄託され(DNA49435−1219と命名)、ATCC寄託番号209480が付与されている。
上述の手順に使用されるオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである:
【0103】
V.ヒトPRO1083(UNQ540)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA50921(Fig43、配列番号:116)と誘導PRO1083天然配列タンパク質UNQ540(配列番号:117)を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA50921(配列番号:116)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置154−156に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2233−2235の停止コドン(TAG)で終端する(Fig43)。予測されるPRO1083ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ540、配列番号:117、Fig44)は693アミノ酸長である。Fig44に示すUNQ540(配列番号:117)タンパク質は約77738ダルトンの算定分子量と約8.87のpIを持つ。DNA50921を含むクローンは1998年5月12日にATCCに寄託され、寄託番号209859が付与されている。
アミノ酸配列UNQ540(配列番号:117)の分析により、推定シグナルペプチド配列がおよそアミノ酸1−25にあり、膜貫通ドメインがおよそアミノ酸382−398、402−420、445−468、473−491、519−537、568−590及び634−657にあり、ミクロボディーC末端標的シグナルがおよそアミノ酸691−693にあり、cAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位がおよそアミノ酸198−201及び370−373に、N−グリコシル化部位がおよそアミノ酸39−42、148−151、171−174、234−237、303−306、324−227及び341−344に、さらにG−タンパク質結合レセプターファミリードメインがおよそアミノ酸475−504にあることが明らかになった。
【0104】
W.ヒトPRO865(UNQ434)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA53974(Fig45、配列番号:123)と誘導PRO865天然配列タンパク質UNQ434(配列番号:124)を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA53974(配列番号:123)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1577−1579の停止コドン(TAA)で終端する(Fig45)。予測されるPRO865ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ865、配列番号:124)は468アミノ酸長である。Fig46に示すUNQ434(配列番号:124)タンパク質は約54393の算定分子量と約5.63のpIを持つ。DNA53974(配列番号:123)を含むクローンは1998年4月14日にATCCに寄託され、寄託番号209774が付与されている。
アミノ酸配列UNQ434(配列番号:124)の分析により、およそアミノ酸残基1−23に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基280からおよそ384に潜在的N−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基94からおよそ残基97に潜在的アミド化部位、およそアミノ酸残基20からおよそ23、及びおよそ残基223からおよそ残基226にグリコサミノグリカン結合部位、およそアミノ酸残基216からおよそ残基222にアミノトランスフェラーゼクラス−Vピリドキシル−ホスフェートアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基338からおよそ残基343のインターロイキン−7タンパク質に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロックが存在することが明らかになった。
【0105】
X.ヒトPRO770(UNQ408)をコードするcDNAクローンの単離
公的な発現配列タグ(EST)DNAデータベース(Merck/Washington University)を全長マウスm−FIZZ1DNA(DNA53517)で検索し、AA524300と命名した、m−FIZZ1DNAと相同性を示したESTを同定した。
ESTAA524300に相当する全長クローンをIncyte(Lncyte Pharmaceuticals, Palo Alto, California)から購入し、その全体を配列決定した。
得られたPRO770コード化全長クローンの全ヌクレオチド配列をFig47に示す。太字の下線で示したように、DNA54228と命名されたこの全長クローン(配列番号:133)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置100−102に見かけの翻訳開始部位を有し(Fig47;配列番号133)、残基433−435の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO770ポリペプチド先駆体(20のアミノ酸の推定シグナル配列を含む)(すなわちUNQ408、配列番号134)は111アミノ酸長であり、11730ダルトンの算定分子量と7.82のpIを持つ。m−FIZZ1に対するその相同性に基づいて(ALIGNソフトウェアを使用して、50%)、タンパク質はm−FIZZ1のヒト相同体であると信じられ、h−FIZZ1と命名した。DNA54228を含むcDNAクローン(配列番号:133)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209801が付与されている。
m−FIZZ1(DNA53517)の同定とクローニング
マウス喘息モデル 6〜8週齢の雌のBalb/Cマウスを、二つの実験グループ:対照と喘息に分けた。喘息グループを10μgの卵白アルブミン+1mgのミョウバンで腹腔内に免疫化する一方、対照グループは免疫しなかった。2週間後、UltraNebネブライザー(DeVilbiss)でエアロゾル化したPBSに入れた卵白アルブミン10mg/mlのエアロゾルに、7日連続して一日当り30分間2ml/minの流速で毎日マウスをさらした。最後のエアロゾルの投与の1日後に、全血、血清及び気管支肺胞洗浄(BAL)試料を収集し、肺を収集し、組織学的検査、免疫組織化学及びインサイツハイブリッド形成のために保存した。
BAL試料のゲル電気泳動 16%のトリシンゲル上でのゲル電気泳動法によるBAL試料の検査は、喘息マウスからのBAL試料にあっては低分子量のタンパク質が発現されるが、対照マウスのBAL試料では発現しないことが示された。この低分子量のタンパク質をm−FIZZ1と名付けたが、8300ダルトンのマーカータンパク質(IL−8)と同時移動することが分かった。
部分的タンパク質配列 関心あるタンパク質をPVDF膜上に移し、エドマン分解により配列決定した。この配列は以下に記載する種々のクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとなった。
部分的cDNA配列 我々は、部分的タンパク質配列の配列の最初の7個と最後の7個のアミノ酸に対する推定DNA配列に対応する2つの縮重オリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。
正常なマウスの肺から調製されたcDNAを88bpの生成物を生じたPCR反応のテンプレートとして使用した。この88pbの生成物は、PCRプライマーをコードする54の既知の塩基対と、他の部分的m−FIZZ1配列をコードする34の新規な塩基対を含んでいた。
全長cDNAクローン この第2の部分配列を使用してプライマーを設計し、最終的にマウスの肺ポリ(A)+RNAのRT−PCRによる全長FIZZクローン(DNA53517)を成功裡に得た。
このオリゴをオリゴd(T)と組み合わせてRT−PCRプライマーとして使用した。
【0106】
Y.ヒトPRO769(UNQ407)をコードするcDNAクローンの単離
公的な発現配列タグ(EST)DNAデータベース(Merck/Washington University)を上述の全長マウス動物m−FIZZ1DNA(DNA53517)で検索し、EST W42069を同定した。
EST断片W42069に相当する全長クローンをLncyte Pharmaceuticals,(Palo Alto, California)から購入し、全体を配列決定し、最終的に全長ヌクレオチド配列DNA54231(配列番号:139)を同定した。
全長の天然配列PRO769クローンに相当するヌクレオチド配列をFig49に示す。太字の下線で示したように、DNA54231と命名されたこのクローン(配列番号:139)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置75−79に見かけの翻訳開始部位を有し、残基417−419の停止コドン(TGA)で終端する(Fig49)。予測されるPRO769ポリペプチド先駆体(10のアミノ酸のシグナル配列を含む)(すなわちUNQ407、配列番号140)は114アミノ酸長であり、12492ダルトンの算定分子量と8.19のpIを持つ。m−FIZZ1に対するその相同性に基づいて(ALIGNソフトウェアを使用して、34%)、タンパク質をm−FIZZ3と命名した。DNA54231を含むクローン(DNA54231−1366と命名)は1998年4月23日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209802が付与されている。
Z.ヒトPRO788(UNQ430)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、部分長EST配列2777828を同定した。さらに対応する全長配列を分析することにより、DNA56405(配列番号:141)と誘導天然配列PRO788タンパク質UNQ430(配列番号:142)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA56405(配列番号:141)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置84−86に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置459−461の停止コドン(TAG)で終端する(Fig51)。予測されるPRO788ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ430、配列番号:1042は125アミノ酸長であり(Fig52)、13115ダルトンの算定分子量と5.90のpIを持つ。Fig52に示すUNQ430(配列番号:142)タンパク質は1998年3月6日にATCCに寄託され、寄託番号209849が付与されている。寄託物のヌクレオチド配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託されたクローンが正しい配列を含むものと理解される。さらにここで提供された配列を配列決定するための方法は周知の配列決定技術に基づくと理解される。
Fig52に示すUNQ430(配列番号:52)の分析により、およそアミノ酸1−17にシグナルペプチド、およそアミノ酸46にN−グリコシル化部位があることが明らかになった。
【0107】
AA.ヒトPRO1114(UNQ557)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト乳癌ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA57033(Fig53、配列番号:143)と誘導PRO1114天然配列タンパク質UNQ557(Fig54、配列番号:144)を単離した。
上述のパラグラフに記載した単離スクリーニングで使用されるPCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA57033(配列番号:143)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置250−252に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1183−1185の停止コドン(TAG)で終端する(Fig53、配列番号143)。予測されるPRO1114ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ557、配列番号:144)は311アミノ酸長であり、約35076ダルトンの算定分子量と約5.04の算定pIを持つ。Fig54に示す全長PRO1114配列(配列番号:144)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸29にシグナルペプチド、およそアミノ酸230からおよそアミノ酸255に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸40からおよそアミノ酸43及びおよそアミノ酸134からおよそアミノ酸137に潜在的N−グルコシル化部位、およそアミノ酸92からおよそアミノ酸119にアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基232からおよそアミノ酸262のインテグリンα鎖と相同性を有するアミノ酸配列ブロック。DNA57033を含むcDNAクローン(配列番号:143)は1998年3月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209905が付与されている。
AB.ヒトPRO1007(UNQ491)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、ヒト肝臓組織(ライブラリ341からのクローン83012)から誘導され、Merck EST T70513と命名されたEST配列を同定し、更に検査した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長DNA配列DNA57690(Fig55、配列番号:145)及び誘導PRO1007天然配列タンパク質UNQ491(Fig56、配列番号:146)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA57690(配列番号:145)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置16−18に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1054−1056の停止コドン(TGA)で終端する(Fig55)。予測されるPRO1007ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ491、配列番号:146)は346アミノ酸長であり(Fig56)、35971ダルトンの算定分子量及び8.17のpIを持つ。Fig56に示すUNQ491(配列番号:146)タンパク質は、約35971ダルトンの算定分子量及び約8.17のpIを持つ。DNA57690を含むcDNAクローン(配列番号:145)は1998年6月9日にATCCに寄託され、寄託番号209950が付与されている。
UNQ491(配列番号:146)のアミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸残基1−30に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基325−346に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基118、129、163、176、183及び227にN−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基17−36及び209−222にLy−6/u−Parドメインタンパク質があることが明らかになった。ここに提供されたアミノ酸の対応するヌクレオチド配列はここで提供された配列が与えられれば常套的に決定できる。
【0108】
AC.ヒトPRO1184(UNQ598)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ(39、SINTBST01)から誘導されたIncyte EST1428374を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長DNA59220(Fig57、配列番号:147)及び誘導PRO1184天然配列タンパク質UNQ598(Fig58、配列番号:148)を単離した。
Fig58に太字の下線で示したように、UNQ598(配列番号:148)は、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を示し、ヌクレオチド位置532−534に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1184ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ598、配列番号:148)は142アミノ酸長であり、約15690ダルトンの算定分子量及び約9.64の算定pIを持つ。UNQ598(配列番号:148)の分析により、およそアミノ酸残基1−38にシグナルペプチドの存在が証明された。DNA59220を含むcDNAクローン(配列番号:147)は1998年6月9日にATCCに寄託され、寄託番号209962が付与されている。寄託されたクローンが実際の配列を有しており、その提示がここになされていると理解される。
AD.ヒトPRO1031(UNQ516)をコードするcDNAクローンの単離 上述のECD相同性手順を使用し、EST配列Merck W74558(クローン344649)を同定した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長DNA配列DNA57690(Fig59、配列番号:149)及び誘導PRO1031天然配列タンパク質UNQ516(Fig60、配列番号:150)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA59294(配列番号:149)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置42−44に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置582−584の停止コドン(TGA)で終端する(Fig59)。予測されるPRO1031ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ516、配列番号:150)は180アミノ酸長である(Fig60)。Fig60に示すUNQ516タンパク質は、約20437ダルトンの算定分子量及び約9.58のpIを持つ。クローンDNA59294(配列番号:149)は1998年3月14日にATCCに寄託され、寄託番号209866が付与されている。配列に関し、寄託されたクローンが正しい配列を含み、ここで提供された配列は既知の配列決定技術に基づいていることが理解される。対応するヌクレオチドはここで提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
AE.ヒトPRO1346(UNQ701)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA59776(Fig61、配列番号:151)と誘導PRO1346天然配列タンパク質UNQ701(Fig62、配列番号:152)を単離した。
DNA59776(配列番号:151)の単離に使用したハイブリッド形成プローブとPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
クローンDNA59776(配列番号:151)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1−3(ATG)に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド位置1384−1386に見かけの停止コドン(TAG)を有する。予測されるPRO1346ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ701、配列番号:152)は461アミノ酸長である。タンパク質は、アミノ酸位置約31から約50に見かけのII型膜貫通ドメインを、およそアミノ酸位置409−421にフィブリノーゲンβ及びγ鎖C末端ドメインシグネーチャーを、およそアミノ酸位置140−161、147−168、154−175及び161−182にロイシンジッパーパターンを含む。
DNA59776−1600と命名されるDNA59776を含むcDNAクローンは1998年8月18日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203128が付与されている。Fig62に示すUNQ701(配列番号:152)タンパク質は約50744ダルトンの算定分子量と約6.38のpIを持つ(Fig18)。
【0109】
AF.ヒトPRO1155(UNQ585)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ(39、SININOT03)から誘導されたIncyte EST2858870を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長DNA配列DNA59849(Fig63、配列番号:156)及び誘導PRO1155天然配列タンパク質UNQ585(Fig64、配列番号:157)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig64に示されたUNQ585(配列番号:157)ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置158−160に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置563−565に見られる停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO1155ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ585、配列番号:157)は135アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基1からおよそ8にあり、ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸残基43からおよそ64にあり、さらにタキキニンファミリーシグネーチャーはおよそアミノ酸残基86からおよそ91にある。UNQ585(配列番号:157)は約14833ダルトンの算定分子量及び約9.78の算定pIを持つ。DNA59849を含むcDNAクローン(配列番号:156)は、DNA59849−1504と命名され、1998年6月16日にATCCに寄託され、寄託番号209986が付与されている。AG.ヒトPRO1250(UNQ633)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのIncyteESTクラスター配列番号56523と称されるESTクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な様々なESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3371784を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA60775(Fig65、配列番号:158)及び誘導PRO1250天然配列タンパク質UNQ633(Fig66、配列番号:159)を単離した。
クローンDNA60775(配列番号:158)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置74−76に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2291−2293の停止コドン(TAG)で終端する(Fig65)。予測されるPRO1250ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ633、配列番号:159)は739アミノ酸長である(Fig66)。Fig66に示すUNQ633(配列番号:159)タンパク質は約82263ダルトンの算定分子量及び約7.55の算定pIを持つ。UNQ633(配列番号:159)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸残基61からおよそ80にII型膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基314からおよそ325に推定AMP−結合ドメインシグネーチャー、及びおよそアミノ酸残基102からおよそ105、およそアミノ酸残基588からおよそ591及びおよそアミノ酸残基619からおよそ622に潜在的N−グルコシル化部位。DNA60775を含むcDNAクローン(配列番号:158)は1998年9月1日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203173が付与されている。
【0110】
AH.ヒトPRO1312(UNQ678)をコードするcDNAクローンの単離
EST(DNA55773)を、一次cDNAクローンの5’末端を優先的に提示するヒト胎児腎臓cDNAライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。DNA55773配列に基づき、全長DNA配列DNA61873(Fig67、配列番号:160)及び誘導PRO1312天然配列UNQ678(配列番号:161)を単離するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを合成した。
太字の下線で示すように、Fig67に示す全長DNA61873クローン(配列番号:160)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置7−9に見かけの翻訳開始部位を有し、およそヌクレオチド位置643−645に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1312ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ678、配列番号:161)は212アミノ酸長である。UNQ678(配列番号:161)は約24024ダルトンの算定分子量及び約6.26の算定pIを持つ。他の特徴は、およそアミノ酸1−14にシグナルペプチド:およそアミノ酸141−160の膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸76−79及び93−96の潜在的N−グルコシル化部位を含む。DNA61873を含むcDNAクローン(配列番号:161)は、DNA61873−1312の名称で1998年8月18日にATCCに寄託され、寄託番号203132が付与されている。
AI.ヒトPRO1192(UNQ606)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA62814(Fig69、配列番号:162)と誘導PRO1192天然配列タンパク質UNQ606(Fig70、配列番号:163)を単離した。
DNA62814(配列番号:162)の単離に使用したPCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブ及びは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA62814(Fig69、配列番号:162)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置121−123に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置766−768に見かけの停止コドン(TAA)を有する。予測されるPRO1192ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ606、配列番号:163)は215アミノ酸長である。Fig70に示すUNQ606(配列番号:163)ポリペプチド前駆体は、およそアミノ酸1−21にシグナルペプチド;およそアミノ酸153−176に膜貫通ドメイン;およそアミノ酸39−42及び118−121に潜在的N−グルコシル化部位;及びおよそアミノ酸27−68及び99−128にミエリンP0タンパク質との相同体を有する。Fig70に示すUNQ606(配列番号:163)は約24484ダルトンの算定分子量と約6.98のpIを持つ(Fig36)。
DNA62814−1521と命名されたDNA62814を含むcDNAクローン(配列番号:162)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203093が付与されている。
【0111】
AJ.ヒトPRO1246(UNQ630)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのIncyteESTクラスター配列番号56853と指定されたESTクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST2481345を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA64885(Fig71、配列番号:167)及び誘導PRO1246天然配列タンパク質UNQ630(Fig72、配列番号:168)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA64885(配列番号:167)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1727−1729の停止コドン(TGA)で終端する(Fig71)。予測されるPRO1246ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ630、配列番号:168)は536アミノ酸長であり(Fig72)、約61450ダルトンの算定分子量及び約9.17のpIを持つ。UNQ630(Fig72、配列番号:168)の分析により、以下のもの:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸15にシグナルペプチド、およそアミノ酸108からおよそアミノ酸111、およそアミノ酸116からおよそアミノ酸169、およそアミノ酸193からおよそアミノ酸196、およそアミノ酸262からおよそアミノ酸265、およそアミノ酸375からおよそアミノ酸378、およそアミノ酸413からおよそアミノ酸416及びおよそアミノ酸498からおよそアミノ酸501に潜在的N−グルコシル化部位、及びおよそアミノ酸286からおよそアミノ酸315、およそアミノ酸359からおよそアミノ酸369及びおよそアミノ酸78からおよそアミノ酸97にスルファターゼタンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックが、明らかになった。DNA64885−1529と命名されたDNA64885を含むcDNAクローン(配列番号:167)は1998年11月3日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203457が付与されている。
AK.ヒトPRO1283(UNQ653)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト乳房腫瘍組織ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA65404(Fig73、配列番号:169)と誘導PRO1283天然配列タンパク質UNQ653(Fig74、配列番号:170)を単離した。
DNA65404(配列番号:169)使用されたPCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA65404(配列番号:169)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置45−47に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置555−557の停止コドン(TAG)で終端する(Fig73)。予測されるPRO1283ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ653、配列番号:170)は170アミノ酸長である(Fig74)。Fig74に示すUNQ653(配列番号:170)タンパク質は約19457ダルトンの算定分子量と約9.10のpIを持つ。UNQ653(配列番号:170)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸17にシグナルペプチド。DNA65404−1551と称されるDNA65404を含むcDNAクローン(配列番号:169)は1998年9月9日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203244が付与されている。
【0112】
AL.ヒトPRO1195(UNQ608)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、IncyteデータベースからのESTクラスター配列32204を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST352980を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA65412(Fig75、配列番号:177)及び誘導PRO1195天然配列タンパク質UNQ608(Fig76、配列番号:178)を単離した。
太字の下線で示すように、全長クローンDNA65412(配列番号:177)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置58−60に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置511−513の停止コドン(TAG)で終端する(Fig75)。予測されるPRO1195ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ608、Fig76、配列番号:178)は151アミノ酸長であり、17227ダルトンの算定分子量及び約5.33のpIを持つ。UNQ608(配列番号:178)の分析により、およそアミノ酸1−22があり、約17277ダルトンの算定分子量及び約5.33の算定pIを持つことが示される。DNA65412−1523と称されるDNA65412を含むcDNAクローン(配列番号:177)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203094が付与されている。
AM.ヒトPRO1343(UNQ698)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト平滑筋細胞組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、ヒト平滑筋細胞組織ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長DNA配列DNA66675(Fig77、配列番号:179)と誘導PRO1343天然配列タンパク質UNQ698(Fig78、配列番号:180)を単離した。
使用したオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである:
太字の下線で示したように、全長クローンDNA66675(配列番号:179)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置71−73に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置812−814の停止シグナル(TAA)を有する(Fig77)。予測されるPRO1343ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ698、配列番号:180、Fig78)は274アミノ酸長であり、約25335ダルトンの算定分子量と約7.0の算定pIを持つ。Fig78に示すUNQ698配列(配列番号:180)の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸1からおよそアミノ酸25にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸35からおよそアミノ酸225にサーカムスポロゾイト(circumsporozoite)リピートと相同性の領域。DNA66675−1587と称されるDNA66675を含むcDNAクローン(配列番号:179)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203282が付与されている。
別に、上述のアミラーゼスクリーニングから単離された酵母EST配列の比較を、公的及び私的な種々のESTデータベースに対してスクリーニングし(例えば、上述のECD相同性手順を参照のこと)、Incyte ESTクローン番号4701148を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、Fig77に示すDNA66675配列(配列番号:179)を単離した。
【0113】
AN.ヒトPRO1418(UNQ732)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列10698(Incyteクラスター121480)を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベース(胎盤組織ライブラリから得られたものを含む)と比較して、さらにIncyte EST1306026を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68864(Fig79、配列番号:184)及び誘導PRO1418天然配列タンパク質UNQ732(Fig80、配列番号:185)を単離した。
太字の下線で示すように、Fig79に示す全長クローン(DNA68864、配列番号:184)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置138−140に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1188−1190に見られる停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO1418ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ732、配列番号:185)は350アミノ酸長であり、およそアミノ酸1−19にシグナルペプチドを有し、約39003ダルトンの算定分子量及び約5.59の算定pIを持つ。DNA68864−1629と称されるDNA68864を含むcDNAクローン(配列番号:184)は1998年2月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203276が付与されている。
【0114】
AO.ヒトPRO1387(UNQ722)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列10298を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3507924を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68872(Fig81、配列番号:186)及び誘導PRO1387天然配列タンパク質UNQ722(Fig82、配列番号:187)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA68872(配列番号:186)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置76−78に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1258−1260の停止コドン(TGA)で終端する(Fig81)。予測されるPRO1387ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ722、配列番号:187)は394アミノ酸長である。Fig82に示すUNQ722(配列番号:187)タンパク質は、約44339ダルトンの算定分子量及び約7.10のpIを持つ。さらに、UNQ722(配列番号:187)は、およそアミノ酸残基1からおよそ残基19にシグナルペプチド、およそ残基275からおよそ残基296に膜貫通ドメイン、およそ残基76、231、302、307及び376に潜在的N−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基210からおよそ残基239及びおよそアミノ酸残基92からおよそ残基121にミエリンp0タンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックを含む。DNA68872−1620と称されるDNA68872を含むcDNAクローンは1998年8月25日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203160が付与されている。
AP.ヒトPRO1410(UNQ728)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列98502を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST1257046を同定した。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA68874(Fig83、配列番号:188)及び誘導PRO1387天然配列タンパク質UNQ728(Fig84、配列番号:189)を単離した。
太字の下線で示すように、クローンDNA68874(配列番号:188)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置152−154に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置866−868の停止コドン(TGA)で終端する(Fig83)。予測されるPRO1410ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ728、配列番号:189)は238アミノ酸長である(Fig84)。Fig84に示すUNQ728タンパク質(配列番号:189)は、約25262ダルトンの算定分子量及び約6.44のpI、およそアミノ酸残基1からおよそ残基20にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基194からおよそ残基220に膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸残基132に潜在的N−グリコシル化部位を有する。DNA68874を含むクローンは1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203277が付与されている。
AQ.ヒトPRO1917(UNQ900)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列85496を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3255033を同定した。このESTは卵巣腫瘍ライブラリから得た。このEST配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長DNA配列DNA76400(Fig85、配列番号:190)及び誘導PRO1917天然配列タンパク質UNQ900(Fig86、配列番号:191)を単離した。
太字の下線で示すように、Fig85に示す全長クローンDNA76400(配列番号:190)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置6−9に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1467−1469に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1917ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ900、配列番号:191)は487アミノ酸長である。UNQ900(配列番号:191)タンパク質は、約55051ダルトンの算定分子量及び約8.14のpIを持つ。付加的な特徴には、およそアミノ酸残基1−30にシグナルペプチド;およそアミノ酸残基242から481に潜在的N−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基95−97、182−184及び427−429にプロテインキナーゼCリン酸化部位;およそアミノ酸残基107−112、113−118、117−122、118−123及び128−133にN−ミリストイル化部位;およそアミノ酸残基484−487に小胞体標的配列があることが含まれる。
【0115】
AR.ヒトPRO1868(UNQ859)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、ESTクローン番号2994689を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、DNA77624(Fig87、配列番号:192)及び誘導PRO1868天然配列タンパク質UNQ859(Fig88、配列番号:193)を単離した。
太字の下線で示したように、クローンDNA77624(配列番号:193)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置981−983の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO1868ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ859、配列番号:193、Fig89)は310アミノ酸長である。Fig89に示すUNQ859(配列番号:193)タンパク質は約35020ダルトンの算定分子量と約7.90のpI、およそアミノ酸残基243からおよそ残基263に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基104から192にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基107からおよそ残基110にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基106からおよそ残基109及びおよそアミノ酸残基296からおよそ残基299にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、およそアミノ酸残基69からおよそ残基77にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基26からおよそ残基31、およそ残基215からおよそ残基220、およそ残基226からおよそ残基231、およそ残基243からおよそ残基248、およそ残基244からおよそ残基249及びおよそ残基262からおよそ残基267に潜在的N−ミリストル化部位を有する。DNA77624を含むクローン(配列番号:193)は1998年12月22日にATCCに寄託され、寄託番号203553が付与されている。
【0116】
AS.ヒトPRO205(UNQ179)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順を使用し、ヒト網膜ライブラリから誘導されたEST配列を同定した。インビボクローニング手順を使用し全長クローンをさらに同定する試みがなされたが、これは他のPRO205コード化DNA配列を同定できなかった。
Fig90のUNQ179(配列番号:229)ポリペプチドと実質的に相同な他のポリペプチドをコードするDNA配列は、Genbank提出物AB033089_1及びHSM802147_1として見出され得る。
Fig89に太字の下線で示したように、クローンDNA30868(配列番号:89)は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置405−407に見かけの翻訳開始部位を有する。予測される部分長PRO1868ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ179、配列番号:229)は343アミノ酸長であり、約39285ダルトンの算定分子量と6.06のpIを持つ。
Fig90に示すUNQ179(配列番号:229)の分析により、およそアミノ酸残基1から20にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基318−322にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基21−29およそアミノ酸残基211−220にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基63−69及び317−323にN−ミリストル化部位、及びおよそ残基260−271に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが明らかになった。DNA30868を含むcDNAクローン(配列番号:228)はDNA30868−1156との命名されて2000年3月2日にATCCに寄託され、寄託番号が付与されている。
AT.ヒトPRO21(UNQ21)をコードするcDNAクローンの単離
天然配列PRO21ポリペプチドUNQ21(Fig92、配列番号:231)をコードするDNA36638(Fig91、配列番号:230)は、米国特許第5,955,420号に先に記載されている。さらなるクローニング及び特徴付けの情報はSchneider等, Cell 54(6):787−93(1988)及びManfioletti等, Mol. Cell. Biol.,13(8):4976−85(1993)に見出すことができる。
太字の下線で示したように、クローンDNA36638は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置168−170に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2187−2198の停止コドン(TAG)終端する(Fig91)。予測されるPRO21ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ21、配列番号:231)は673アミノ酸長であり、74512ダルトンの算定分子量と5.45のpIを持つ。DNA36638−1056と称されるDNA36638を含むcDNAクローンは1997年11月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209456が付与されている。
Fig92のUNQ179ポリペプチド(配列番号:231)の分析により、およそアミノ酸残基1−27にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基619−635に膜貫通ドメイン、およそ残基417−421及び488−492にN−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基126−132、135−141、146−152、173−179、214−220、253−259、346−352、374−380、440−446、479−485、497−503、517−523、612−618にN−ミリストル化部位、およそアミノ酸残基130−142、168−180、209−221及び248−260にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位、およそアミノ酸残基139−151にビタミンK依存性カルボキシル化ドメイン及びEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
AU.ヒトPRO269(UNQ236)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA38260(Fig93;配列番号:232)と誘導PRO269天然配列タンパク質UNQ236(Fig94、配列番号:233)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA38260(配列番号:232)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置314−316に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1784−1786の停止コドン(TAG)で終端する(Fig93)。予測されるPRO269ポリペプチド前駆体は490アミノ酸長であり(すなわちUNQ236、Fig94、配列番号:233)(Fig30)、51636の算定分子量と6.29のpIを持つ。DNA38260を含むcDNAクローン(配列番号:232)は1997年10月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209397が付与されている。
Fig94のUNQ236ポリペプチド(配列番号:223)の分析により、およそアミノ酸残基1−16にシグナル配列、およそ残基399−418に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基189−193及び381−385にN−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基289−293にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基98−102及び434−438にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基30−36、35−41、58−64、59−65、121−127、151−157、185−191、209−215、267−273、350−356、374−380、453−459、463−469及び477−483にN−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基262−274にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位があることが明らかになった。
【0117】
AV.ヒトPRO344(UNQ303)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA40592(Fig95;配列番号:240)と誘導PRO344天然配列タンパク質UNQ303(Fig96、配列番号:241)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
クローンDNA40592(配列番号:240)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置227−229に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置956−958の停止コドン(TAG)で終端する(Fig95)。予測されるPRO344ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ303、配列番号:241)は243アミノ酸長であり(Fig96)、25298の算定分子量と6.44のpIを持つ。Fig96のUNQ303ポリペプチド(配列番号:241)の分析により、およそアミノ酸残基1−15にシグナル配列、およそアミノ酸残基11−17、68−74及び216−222にN−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基77−80に細胞付着部位があることが明らかになった。DNA40592を含むcDNAクローン(配列番号:240)は1997年11月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209492が付与されている。
【0118】
AX.ヒトPRO333(UNQ294)をコードするcDNAクローンの単離
インビボクローニング手順を組み合わせて上述のECD相同性手順を使用し、部分長配列DNA41374(配列番号:248、Fig97)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA41374(配列番号:248)は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1185−1187に見かけの翻訳終止部位(すなわち停止コドン、TGA)を有する。予測される部分長PRO333ポリペプチド(すなわちUNQ294、配列番号:249)は394アミノ酸長であり、43725の算定分子量と8.36のpIを持つ。
Fig98のUNQ294(配列番号:249)ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基1−14にシグナル配列、およそアミノ酸残基359−376に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基166−172、206−212、217−223、246−252、308−314、312−318、361−367にN−ミリストル化部位、及びアミノ酸残基315−323に免疫グロブリンと主要組織適合性複合体タンパク質シグネーチャーがあることが明らかになった。DNA41374を含むcDNAクローン(配列番号:240)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号が付与されている。
AY.ヒトPRO381(UNQ322)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA44194(Fig99、配列番号:250)と誘導PRO381天然配列タンパク質UNQ322(Fig100、配列番号:251)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA44194(配列番号:250)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置807−809の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO381ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ322、Fig100、配列番号:251)は211アミノ酸長であり、24172の算定分子量と5.99のpIを持つ。Fig100に示すUNQ322(配列番号:251)タンパク質は次の特徴を有する:およそアミノ酸残基1からおよそ20にシグナル配列、およそアミノ酸残基156に潜在的N−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基143からおよそ146,およそ残基156からおよそ159、およそ残基178からおよそ181、およそ残基200からおよそ203に潜在的カゼインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基78からおよそ114及びおよそ残基118からおよそ131に小胞体標的配列、およそアミノ酸残基140からおよそ159にEF−腕カルシウム結合ドメイン、及びおよそアミノ酸残基183からおよそ203にS−100/ICaBP型カルシウム結合ドメインが存在する。DNA44194を含むcDNAクローン(配列番号:250)は1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209808が付与されている。
【0119】
AZ.マウスPRO720(UNQ388)をコードするcDNAクローンの単離
DNA53517(配列番号:255)の調製については、上述の「X.ヒトPRO770(UNQ408)をコードするcDNAクローンの単離」に記載されている。太字の下線で示したように、クローンDNA53517(配列番号:255)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置36−38に見かけの翻訳開始部位を有し、369−371の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO720ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ388、配列番号:256)は111アミノ酸長であり(Fig102)、11936の算定分子量と5.21のpIを持つ。
Fig102のUNQ388(配列番号:256)ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基1−23にシグナル配列、およそアミノ酸残基70−76及び75−81にN−ミリストル化部位、及び66−77及び68−79に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが示される。DNA53517を含むcDNAクローン(配列番号:255)は1998年4月23日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209802が付与されている。
BA.ヒトPRO866(UNQ435)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA53971(Fig103、配列番号:257)と誘導PRO866天然配列タンパク質UNQ435(Fig104、配列番号:258)を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向PCRプライマーは以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA53971(配列番号:257)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1268−1270の停止コドン(TAA)で終端する。予測される天然配列PRO866ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ435、配列番号:258)は331アミノ酸長であり(Fig104)、35844の算定分子量と5.45のpIを持つ。Fig104に示すUNQ435(配列番号:258)タンパク質は約35844の算定分子量と約5.45のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ残基26にシグナル配列、およそアミノ酸残基131−135にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基144−148にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、及びアミノ酸残基26−32、74−80、132−138、134−140、190−196、287−293及び290−296にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。DNA53971を含むcDNAクローン(配列番号:257)は1998年4月6日にATCCに寄託され、寄託番号209750が付与されている。
【0120】
BB.ヒトPRO840(UNQ433)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト甲状腺ライブラリから単離された組織について酵母菌スクリーニング手順を使用し、PCRオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるEST配列を得、DNA53987(F配列番号:266、Fig105)と誘導PRO840天然配列タンパク質UNQ433(配列番号:267、Fig106)を単離した。
またFig106のUNQ433(配列番号:267)と実質的に相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、受託番号HEEPSSARC_1としてGenbankから入手できる。
太字の下線で示したように、Fig105に示すDNA53987(配列番号:266)はオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置18−20に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1329−1331の停止コドン(TGA)で終端する(Fig43)。ヌクレオチド残基90−92の第2のメチオニンコドンが実際の翻訳開始部位である可能性があり、あるいはこれは内部メチオニンをコードする。予測されるPRO840ポリペプチド(すなわちより長い翻訳)はUNQ433(配列番号:267)と命名され、437アミノ酸長であり(Fig106)、49851ダルトンの算定分子量と6.47のpIを持つ。
DNA53987を含むクローン(配列番号:266)は、寄託番号209858で、1998年5月12日にATCCに寄託されている。
Fig106のUNQ433ポリペプチド(配列番号:267)の分析により、およそアミノ酸残基1−46にシグナル配列、およそアミノ酸残基319−338に膜貫通ドメイン、およそ残基200−204にN−グルコシル化部位、アミノ酸残基23−27にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、アミノ酸残基43−52にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基17−23、112−118、116−122及び185−191にN−ミリストリル化部位があることが明らかになった。
BC.ヒトPRO982(UNQ483)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列番号43715を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにMerck EST番号AA24389を同定した。このESTに対応する全長クローンによって、全長DNA配列DNA57700(Fig107、配列番号:268)及び誘導PRO982天然配列タンパク質UNQ483(Fig108、配列番号:269)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig107のDNA57700配列(配列番号:268)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置26−28に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置401−403の停止コドン(TAA)で終端する。予測されるPRO982ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ982、配列番号:191)は124アミノ酸長であり、約14198ダルトンの算定分子量及び約9.01の算定pIを持つ(Fig108)。Fig108のUNQ483(配列番号:269)ポリペプチドのさらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ21にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基1からおよそ残基59に潜在的アナフィラトキシンドメインがあることが示される。DNA57700を含むcDNAクローン(配列番号:268)は1999年1月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203583が付与されている。
【0121】
BD.ヒトPRO836(UNQ545)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスターを同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST2610075、大腸腫瘍組織から得られたESTを同定した。このESTに対応する全長クローンにより、全長配列DNA59620(Fig109、配列番号:270)及び誘導PRO836天然配列タンパク質UNQ545(Fig110、配列番号:271)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig109に示すヌクレオチド配列DNA59620(配列番号:270)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置65−67に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1448−1450の停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO836ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ545、Fig110、配列番号:271)は461アミノ酸長である。Fig110に示すUNQ545(配列番号:271)は約52085ダルトンの算定分子量及び約5.36のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ29にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基193から236にN−グルコシル化部位、及びおよそ残基15、19、234、251、402及び451にN−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基364からおよそ372にYJL126w/YLR351c/yhcXファミリーのタンパク質に保存されたドメイン、及びおよそアミノ酸残基68から約340にSLS1タンパク質と配列同一性を有する領域があることが明らかになった。DNA59620を含むcDNAクローン(配列番号:270)は1998年6月16日にATCCに寄託され、寄託番号209989が付与されている。
【0122】
BE.ヒトPRO1159(UNQ589)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列77245を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST番号376776を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA60627(Fig111、配列番号:272)及び誘導PRO1159天然配列タンパク質UNQ589(Fig112、配列番号:273)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA60627(配列番号:272)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置92−94に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置362−364の停止コドン(TAG)で終端する(Fig111)。予測されるPRO1159ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ589、配列番号:273)は90アミノ酸長である(Fig112)。Fig112に示すUNQ589(配列番号:273)は約9840ダルトンの算定分子量及び約10.13のpIを持つ。
Fig112に示すUNQ589(配列番号:273)配列の分析により、以下の存在が証明された:およそアミノ酸残基1からおよそ残基15にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基38に潜在的N−グルコシル化部位。クローンDNA60627(配列番号:272)は1998年8月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203092が付与されている。
BF.ヒトPRO1358(UNQ707)をコードするcDNAクローンの単離 上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST088718、肝臓組織ライブラリから得られる断片を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA64890(Fig113、配列番号:274)及び誘導PRO1358天然配列タンパク質UNQ707(Fig114、配列番号:275)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig113に示すDNA64890(配列番号:274)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置86から88に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1418から1420の停止コドン(TAA)で終端する(Fig113)。予測されるPRO1358ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ707、配列番号:275)は444アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基1−18にある。UNQ707(配列番号:275)は約50719ダルトンの算定分子量及び約8.82の算定pIを持つ。DNA64890−1612と称されるDNA64890(配列番号:274)を含むcDNAクローンは1998年8月18日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203131が付与されている。
BG.ヒトPRO1325(UNQ685)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列番号139524を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにIncyte EST3744079を同定した。このESTに対応する全長クローンの分析により、全長配列DNA66659(Fig115、配列番号:276)及び誘導PRO1325天然配列タンパク質UNQ685(Fig116、配列番号:277)を同定した。
太字の下線で示したように、クローンDNA66659(Fig115、配列番号:276)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2547−2549の停止コドン(TAG)で終端する。予測されるPRO1325ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ685、配列番号:227)は832アミノ酸長である。Fig116に示すUNQ685(配列番号:227)は約94454ダルトンの算定分子量及び約6.94のpIを持つ。UNQ685(配列番号:227)の分析により、およそアミノ酸1からおよそアミノ酸18にシグナルペプチド、およそアミノ酸292からおよそアミノ酸317、およそアミノ酸451からおよそアミノ酸470、およそアミノ酸501からおよそアミノ酸520、およそアミノ酸607からおよそアミノ酸627、およそアミノ酸751からおよそアミノ酸770に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸497からおよそアミノ酸518にロイシンジッパーパターン配列、及びおよそアミノ酸27からおよそアミノ酸30、およそアミノ酸54からおよそアミノ酸57、およそアミノ酸60からおよそアミノ酸63、およそアミノ酸位置123からおよそアミノ酸位置126、およそアミノ酸位置141からおよそアミノ酸位置144、およそアミノ酸位置165からおよそアミノ酸位置168、およそアミノ酸位置364からおよそアミノ酸位置367、およそアミノ酸位置476からおよそアミノ酸位置479、およそアミノ酸位置496からおよそアミノ酸位置499、およそアミノ酸位置572からおよそアミノ酸位置575、およそアミノ酸位置603からおよそアミノ酸位置606及びおよそアミノ酸位置699からおよそアミノ酸位置702にN−グルコシル化部位があることが明らかになった。DNA66659を含むcDNAクローン(配列番号:276)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203269が付与されている。
【0123】
BH.ヒトPRO1338(UNQ693)をコードするcDNAクローンの単離
酵母菌スクリーニングを使用してEST配列を得、ついで、ECD相同性下で上述したものと類似した方法で公的及び私的な種々のESTデータベースと比較し、胆嚢炎のある胆嚢組織から得られたESTであるIncyte EST2615184を同定した。対応する全長配列の分析により、DNA66667(配列番号:278、Fig117)及び誘導PRO1338天然配列タンパク質UNQ693(配列番号:279、Fig118)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig117に示すDNA66667(配列番号:278)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド残基115−117に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置2263−2265の停止コドン(TAA)で終端する(Fig77)。予測されるPRO1338ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ693、配列番号:118)は716アミノ酸長であり(Fig118)、80716ダルトンの算定分子量と6.06のpIを持つ。
Fig118のUNQ693ポリペプチド(配列番号:278)の分析により、およそアミノ酸残基1から25にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基629−648に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基69−73、96−100、106−110、117−121、385−389、517−521、582−586及び611−615にN−グルコシル化部位、およそ残基573−582にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基16−22、224−230、464−470、637−643及び698−704にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
DNA66667−1596と称されるDNA66667を含むcDNAクローン(配列番号:278)は1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203267が付与されている。
BI.ヒトPRO1434(UNQ739)をコードするcDNAクローンの単離 ヒト網膜組織ライブラリについて上述のECD相同性手順を使用し、全長DNA配列DNA68818(Fig119、配列番号:280)と誘導PRO1434天然配列タンパク質UNQ739(Fig120、配列番号:281)を同定した。
この手順において合成されたハイブリッド形成プローブ及びPCRプライマー(正方向及び逆方向)は以下の通りである:
太字の下線で示したように、クローンDNA68818(配列番号:280)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置581−583に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置1556−1558の停止コドン(TAG)で終端する(Fig119)。予測されるPRO1434ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ739、配列番号:281)は325アミノ酸長である(Fig120)。Fig120に示すUNQ739タンパク質(配列番号:281)は約35296ダルトンの算定分子量と約5.37のpIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1−27にシグナル配列、およそアミノ酸残基80−84にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基10−16、102−108、103−109にM−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基114−117に細胞付着配列、及びおよそアミノ酸残基176−188にEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
DNA68818−2536と称されるDNA68818を含むクローン(配列番号:280)は1999年2月9日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203657が付与されている。
【0124】
BJ.ヒトPRO4333(UNQ1888)をコードするcDNAクローンの単離
上述のECD相同性手順下で上述したものと類似した方法で、発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、リンフォトキシン−ベータレセプターと相同性を示すESTを同定した。
ESTをオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを作成するためのテンプレートとして、ECD相同性手順下で上述したものと類似した方法でヒト胎児腎臓ライブラリをスクリーニングした。
上述の手順で作成されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである:
その結果、全長DNA配列DNA84210(配列番号:285、Fig121)が単離された。太字の下線で示したように、Fig121に記載したDNA84210(配列番号:285)クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置185−187に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置1436−1438に停止コドン(TAA)を有する。予測されるPRO4333ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1888、配列番号:286)は417アミノ酸長である。Fig121に示すUNQ1888タンパク質(配列番号:286)は、約45305ダルトンの算定分子量と約5.12の算定pIを持つ。
Fig121のUNQ1888ポリペプチド(配列番号:286)の分析により、およそアミノ酸残基1−25にシグナルペプチド、およそ残基169−192に膜貫通ドメイン、およそ残基105−109、214−218、319−323、350−354、368−372、379−383にN−グルコシル化部位、およそ残基200−204及び238−242にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそ残基207−214にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基55−61、215−218及び270−276にN−ミリストイル化部位、およそ残基259−270に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位、及びおよそ残基89−96にTNFR/NGFRファミリーシステインリッチ領域があることが明らかになった。
【0125】
BK.ヒトPRO4302(UNQ1866)をコードするcDNAクローンの単離
ヒト組織から単離した組織について上述のアミラーゼスクリーニング手順を使用してEST配列を得、ついでこれを種々のESTデータベースと比較し、アミラーゼスクリーニング手順及び/又はECD相同性手順下で、上述の方法によりコンセンサス配列を作成した。このコンセンサス配列のさらなる分析により、Incyte EST番号2408081H1を単離した。EST番号2408081H1に対応する全長クローンを分析し、全長天然配列クローンDNA92218(配列番号:292)及び誘導PRO4302全長天然配列タンパク質UNQ1866(配列番号:293)を単離した。
太字の下線で示したように、Fig123に示す全長クローンDNA92218(配列番号:292)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位と、ヌクレオチド位置768−770に停止シグナル(TAG)を有する。予測されるPRO4302ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1866、配列番号:293)は198アミノ酸長であり、約22285ダルトンの算定分子量と約9.35のpIを持つ。UNQ1866(Fig124、配列番号:293)の分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ残基23にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基111からおよそ残基130に膜貫通ドメイン、残基26−30にcAMP−及びcGMP−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、残基44−47及び58−61にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、残基36−43にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基124−130、144−150及び189−195にN−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
DNA92218−2554と称されるDNA92218を含むcDNAクローン(配列番号:292)は1999年3月9日にATCCに寄託され、寄託番号203834が付与されている。
BL.ヒトPRO4430(UNQ1947)をコードするcDNAクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ESTクラスター配列を同定し、次いで上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のESTデータベースと比較して、さらにコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列を更に分析して、全長配列DNA96878(Fig125、配列番号:294)及び誘導PRO4430天然配列タンパク質UNQ1947(Fig126、配列番号:295)を同定した。
太字の下線で示したように、Fig125に示す天然配列DNA配列DNA96878(配列番号:294)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置56−58に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置431−433に見られる停止コドン(TGA)で終端する。予測されるPRO4430ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ1947、Fig126、配列番号:295)は125アミノ酸長である。Fig126のUNQ4430タンパク質(配列番号:295)は約13821ダルトンの算定分子量及び約8.6の算定pIを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基1からおよそ18にシグナル配列、およそ残基77−80、再度およそ残基88−91にN−グルコシル化部位、およそ残基67−70にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、およそ残基84−89にN−ミリストイル化部位、及びおよそ残基85−98にLys−6/u−PARドメインの存在が明らかになった。
DNA96878−2626と称され、DNA96878を含むクローン(配列番号:294)は1999年3月4日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号23−PTAが付与されている。
【0126】
BM.ヒトPRO5727(UNQ2448)をコードするcDNAクローンの単離
種々の周知のTNF−レセプターを使用し、公的及び私的なESTデータベース(例えば、上述のESD相同性手順を参照)をスクリーニングし、Incyteクローン5091511Hを単離した。ついで、子宮腫瘍組織から得られたこのEST配列を以下に示すクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとし、次いでこれを用いて関心ある配列を含むヒト胸腺DNAライブラリをPCRにより同定した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の通りである:
全長DNA98853ポリペプチドをコードするDNA配列を単離するために、インバースロング(inverse long distance)PCR法を実施した(Fig129)。PCRプライマーは一般に20から30ヌクレオチドの範囲であった。インバースロングPCRのために、プライマー対を、各プライマーの5’から3’方向が互いに離間する方向に向くように設計した。
DNA98853のクローニングのための一対のインバースロングPCRプライマーを合成した:
インバースロングPCR反応では、テンプレートはプラスミドcDNAライブラリである。その結果、PCR生成物は、中間部に、両端に関心ある挿入配列を有する全ベクター配列を含む。PCR反応後、PCR混合物をテンプレートプラスミドのみを消化するDpnIで処理し、続いてライブラリクローニングベクターのサイズより大きなPCR生成物をアガロースゲル精製した。インバースロングPCRで使用したプライマーはまた5’−リン酸化されているので、精製した生成物を次いでセルフライゲーションし、大腸菌コンピテント細胞中で形質転換させた。5’ベクタープライマー及び適切な遺伝子特異的プライマーを使用するPCRによりコロニーをスクリーニングし、より大きな5’配列を有するクローンを同定した。ポジティブクローンから調製されたプラスミドを配列決定した。必要に応じて、プロセスを繰り返し、先のラウンドで得られた新規な配列に基づき、より多くの5’配列を得ることもできる。
インバースロングPCRの目的は関心ある遺伝子の完全な配列を得ることである。ついで、全長コード化領域を含むクローンを一般的なPCRにより得た。
DNA98853(配列番号:296)の全長コード化領域をクローニングするために使用されるプライマー対は以下の通りである:
クローニングに対して、Cla I部位とNot I部位はそれぞれ正方向プライマー及び逆方向プライマーに含まれていた。
PCR生成物の精度を確保するために、非依存性PCR反応を実施し、いくつかのクローン化産物を配列決定した。
上述のようにして単離されたクローンを配列決定したDNAにより、DNA98853(配列番号:296、Fig127)の全長DNA配列と誘導PRO5727天然配列タンパク質UNQ2448(配列番号:297、Fig128)が得られた。
太字の下線で示したように、クローンDNA98853(配列番号:296)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置1−3に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置901−903の停止コドン(TAA)で終端する(Fig128)。予測されるPRO5727ポリペプチド前駆体(すなわちUNQ2448、配列番号:297)は299アミノ酸長であり(Fig128)、32929ダルトンの算定分子量及び4.95のpIを持つ。Fig128に示すUNQ2448ポリペプチド(配列番号:297)は、約3.3キロダルトンの算定分子量及び約4.72のpIを持つ。潜在的N−グルコシル化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸74と77の間に存在する。潜在的N−ミリストイル化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸24と29の間に存在する。潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位は、Fig128に示すアミノ酸配列のアミノ酸123−126、185−188、200−203、252−255、257−260、271−274及び283−286に存在する。潜在的膜貫通ドメインはFig128に示す配列のアミノ酸137と158の間に存在する。現在、上記ポリペプチドはシグナル配列を含んでいないと考えられている。
DNA98853−1739と称され、DNA98853を含むcDNAクローン(配列番号:296)は1999年4月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号1999年4月6日が付与されている。
【0127】
実施例2
混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける刺激活性(番号24)
この実施例は、本発明のポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反応の増強が望まれる場合に治療的に有用である。治療薬は本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、例えばポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態を取ってもよい。
このアッセイの基本的プロトコルは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、3x106細胞/mlのアッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に再懸濁させる。
刺激剤PBMCは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。該アッセイは、100μlの1%又は0.1%に希釈された試験試料、50μlの光にさらされた刺激剤細胞、及び50μlのレスポンダーPBMC細胞の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロリッターのCD4−IgGを対照として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)をパルス適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、次いで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新鮮に収集された脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライト(Lympholyte)M(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地中で単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイが上記のようにして行われる。本発明の化合物におけるこのアッセイの結果を次の表に示す。対照に対して正に増加しているとポジティブであると考えられ、180%以上の増加が好ましい。しかしながら、対照より多い値は全て、試験用タンパク質についての刺激効果を示す。
【0128】
【0129】
実施例3
無毛モルモットの炎症誘発アッセイ(番号32)
このアッセイはPROポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいてポジティブであると試験されたポリペプチドは、例えば局部的免疫システム細胞湿潤を増強することで恩恵を受け得る病状を含む血管透過性を増強することで恩恵を受ける病状の治療に有用であることが期待される。
350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(75−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかけた。PROポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射した。動物当たりおよそ16−24の注射部位があった。ついで1mlのエバンスブルー染料(PBS中1%)を心臓内注射した。化合物に対する皮膚血管透過性応答(すなわち、注射部位の斑点)について、試験動物の投与1、6及び/又は24時間後に注射部位からの青色の漏出の直径(mm)を測定することで視覚によりスコアをつけた。注射部位の青さのmm直径を観察して、記録し、同一の動物対照に対して4標準偏差を超えるスコアを持つ値に対して血管漏出の重症度を記録した。少なくとも5mmの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは正であると考えられ、血管漏出又は浸透性を誘発する能力を示している。7mm直径を超える応答があると、条件培地試料に対してポジティブであると考えられる。ヒトVEGFが正の対照として使用され、0.1μg/100μlで4−8mmの直径、1μg/100μlで15−23mm直径の応答を誘発した。
試験したポリペプチドを初期ストック溶液の1%まで希釈する。UNQ585は10mMのHEPES/140mMのNaCl/4%のマンニトール/1mg/mlのBSA、pH6.8で希釈し、UNQ334は140mMのNaCl、10mMのHepes、4%のマンニトール、pH7.4に希釈した。
【0130】
実施例4
皮膚血管透過性アッセイ(番号64)
このアッセイはあるPROポリペプチドが動物の注入部位において単核細胞、好酸球及びPMN浸潤を誘発することにより免疫反応を刺激し炎症反応を誘発することを示す。この皮膚血管透過性アッセイは次のようにして実施される。体重が350グラム又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(75−80mg/Kg)及び5mg/kgの5キシラジンを筋肉注射(IM)して麻酔をかけた。精製されたPROポリペプチド又は条件培地試験試料を、注射部位あたり100μLで試験動物の背中に皮内注射した。動物当たり約10−30、好ましくは約16−24の注射部位があった。1mLのエバンスブルー色素(生理的緩衝食塩水中に1%)を心臓内注射した。ついで注射部位における斑点を注入後1時間、6時間及び24時間に測定(直径mm)した。動物は注入後6時間で屠殺した。それぞれの皮膚注射部位を生体組織検査し、パラホルムアルデヒドで固定した。ついで皮膚を組織病理学検査のために調製した。それぞれの部位について、皮膚中への炎症細胞浸潤を評価した。可視可能な炎症細胞の炎症を持つ部位をポジティブスコアとする。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。
少なくとも注射部位の最小血管周囲の浸潤をポジティブスコアとし、注射部位で浸潤のなかった場合をネガティブスコアとする。
【0131】
実施例5
混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける阻害活性(番号67)
この実施例は、一又は複数のPROポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい場合に治療的に有用である。
このアッセイの基本的プロトコルは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Marglies, E. M.Shevach, W.Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激剤PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、3x106細胞/mlのアッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)に再懸濁させる。刺激剤PBMCは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。
このアッセイは、
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロリッターの細胞培養培地又は100マイクロリッターのCD4−IgGを対照として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)をパルス適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新鮮に収集した脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライトM(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のようにして行われる。
対照以下に減少していると阻害化合物としてポジティブであると考えられ、80%以下の減少が好ましい。しかしながら、対照より少ない値は全て、試験用タンパク質の阻害効果を示す。
【0132】
【0133】
実施例6
インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と位置測定、特定のmRNA合成における変化の追跡及び染色体マッピングの補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169−176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、PCR生成33P−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにしてインサイツハイブリッド形成のために加工した。[33−P]UTP−標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
33P−リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P−UTPを含む各管に以下の成分を添加した:2.0μlの5x転写バッファー;1.0μlのDTT(100mM);2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O);1.0μlのUTP(50μM);1.0μlのRnasin;1.0μlのDNAテンプレート(1μg);1.0μlのH2O。
管を37℃で1時間インキュベートした。1.0μLのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μLのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81ペーパー上にピペットした。残りの溶液をMicrocon−50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μLのTEを添加した。1μLの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IIで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1−3μLのプローブ又は5μLのRNA MrkIIIを3μLの負荷バッファーに添加した。95℃の加熱ブロック上で3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−70℃の冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0134】
33P−ハイブリッド形成
凍結切片の前処理 スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼK中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNAseバッファー中の10mg/mlストック12.5μL)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理 スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μL;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μL、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
プレハイブリッド化 スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μLのハイブリッド形成バッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
ハイブリッド形成 スライド当たり1.0x106cp.のプローブ及び1.0μLのRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μLのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μLの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μLに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
洗浄 洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μL−20μg/ml)。スライドを2x10分間、2xSSC、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
種々のヒト組織からのポリA+RNA(レーン当り2μg)を含有するマルチ−組織ブロットをClontechから購入した(Palo Alto, CA)。DNAプローブをランダムプライムDNAラベルビーズ(Pharmacia Biotech)により[α−32P]−dCTPでラベルした。ハイブリッド形成はExpresshyb(Clontech)を使用し、68℃で1時間行った。ついで、ブロットを2xSSC/0.05%SDS溶液を用い、室温で40分間洗浄し、次に新鮮な溶液に変えて、0.1xSSC/0.1%SDS溶液を用い、55℃で40分間洗浄した。ブロットをホスホイメージャー(phosphorimager)にさらした。
【0135】
DNA29101(VEGFB9)
IS97−029:
軟骨原基の縁(例えば外縁周辺)における発育中の下肢骨、発育中の腱、血管平滑筋及び細胞包含発育中の骨格筋筋細胞及び筋管における発現。発現は、次の組織でも観察された:骨端の成長板:リンパ節−周縁洞:胸腺−胸腺皮質の被膜下領域、おそらく、被膜下上皮細胞又はこの領域で見られる増殖中の二重ネガティブ胸腺のいずれか;気管平滑筋;脳(小脳皮質)−皮質ニューロンにおける病巣発現:小腸−平滑筋:甲状腺−甲状腺上皮;肝臓−管板;胃−壁平滑筋;胎児の皮膚−鱗状上皮の基底層;胎盤−栄養膜絨毛の間細胞;脊髄−動脈及び静脈の壁を除いて発現なし。脾臓と副腎では発現なし。
上述の発現パターンは、DNA29101が細胞分化/増殖に関与していることを示唆している。
IS97−037
過剰排卵したラット卵巣での発現は、アンチセンス及びセンスプローブの双方において全ての切片でネガティブであった。何れのメッセージもこのモデルでは発現されず、あるいはヒトプローブはラットと交差反応しなかった。
【0136】
IS97−087
高発現レベルは以下の部位で観察された:チンパンジー卵巣−成熟小胞の顆粒膜細胞、低強度シグナルが包膜細胞で観察;チンパンジー上皮小体−主細胞全体で高発現;ヒト胎児精巣−発育中の細管を囲む間質細胞全体に中程度の発現;ヒト胎児肺−発育中の気管支の軟骨細胞で高発現、及び分岐している気管支上皮において低レベル発現。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃腸肉腫、大腸、大腸癌腫及び骨盤癌腫を含む。また検査したものはアセトアミノフェン誘発肝臓障害及び肝硬変であった。
DNA30871:
IS97−044: 胎児組織において、胎児の大脳皮質、脊髄、脊髄神経節のニューロン、並びに胎児胃壁の腸ニューロンに強いシグナルが観察された。さらに、大動脈の根本周囲の細胞(おそらくは刺激伝導系)、副腎髄質、神経血管束の間質細胞、腎臓実質及び骨格筋筋細胞間に位置する細胞においてもシグナルが観察された。全ての他の胎児組織はネガティブであった。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織(12−16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りである。
DNA30942:
DNA30942(配列番号:13)を4つに分かれたインサイツ研究において検査し(実施例7の発病した組織研究における2つを含む)、次のプローブを使用した:
【0137】
IS97−043:
胎児組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織は:胎盤、臍帯、脳、脊髄、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
DNA33087(IS97−051):
胎児組織において、DNA33087(配列番号:18)の発現は、内軟骨及び骨膜性骨形成の全ての部位で骨芽細胞において、また発育中の肺動脈及び大動脈幹で観察された。検査した胎児組織は:胎盤、臍帯、脳、脊髄、眼、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
検査した成人組織では何の発現も観察されず、以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
可能な役割は、骨マトリクス沈積及び/又は骨芽細胞成長の制御である。
多ブロックにおける全ての成人組織はβ−アクチンに対してポジティブであった。
この手順で使用したプローブは以下の通りである:
【0138】
DNA34387(IS97−109):
DNA34387(配列番号:25)の発現パターンは胎児及び成人ヒトの以下の部位で観察された:
胎児−甲状腺上皮、小腸上皮、生殖腺、膵臓上皮、肝臓の肝細胞及び腎尿細管。また発育中の長骨の血管組織でも見られた。
成人−胎盤細胞栄養芽層、腎尿細管上皮、膀胱上皮、副甲状腺及び上皮腫瘍に中程度のシグナル。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。
検査した成人組織は:腎臓(正常及び末期)、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、胆嚢、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、前立腺、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性機能不全)を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は以下のものを含む:
チンパンジー組織:唾液腺、胃、甲状腺、副甲状腺、皮膚、胸腺、卵巣、リンパ節。
アカゲザル組織:大脳皮質、海馬、小脳、陰茎。
この手順で使用したプローブは以下の通りである。
【0139】
DNA35638:
IS97−078:
DNA35638(配列番号:35)の発現は胎児及び胎盤血管のサブセットの内側の内皮に観察された。内皮発現はこれらの組織ブロックに限られていた。発現はまた胎盤の中間栄養芽細胞にわたって観察された。
検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢を含む。
検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
上述の手順で使用したオリゴは以下の通りである。
【0140】
I98−052:
正常なヒト皮膚(新生児の包皮)及び成人の乾癬性皮膚のDNA39523(配列番号:45)は、双方とも、上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体である基底膜に沿った単層の、基底層の上皮細胞において特異的な強い発現を示した。
上部に重なっている層(有棘層、顆粒層等)の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮(表皮直下にある結合組織)でも発現が明らかであった。間質性線維芽細胞であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現が最も顕著であった。
脳では、小脳切片は、表在性皮質ニューロンで強い特異的な発現をし、皮質ニューロンの特定集団に独特なパターンが示唆された。
炎症した、また正常な腸:正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内に多巣性パターンで特異的な中程度から強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく描写される紡錘状(spindloid)間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現はなく、発病した腸においても明らかに増加した(強度又は頻度)発現はなかった。特に、炎症をした腸において病変部と発現との間には相関もなかった。
ヒト胎児腎臓では、多巣性の発育中細管において特異的な弱いないしは中程度の発現があった;これらの病巣における細管上皮に発現があった。
皮膚におけるDNA39523(配列番号:45)の発現と表皮細胞の基底上皮細胞への特異的な局在化は、基底上皮細胞の分化/維持における潜在的な役割を示唆している。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンは、該細胞が表皮における白血球の輸送を調節していることを示唆している。その結果、DNA39523(配列番号:45)は、表皮中への樹状突起/ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるDNA39523(配列番号:45)の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、その発現の炎症性病変部との相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった(しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった)。
IS97−128:
DNA39523(配列番号:45)の発現はマウス胚皮膚の上皮並びにヒト胎児皮膚の基底上皮及び上皮で観察された。チンパンジー舌の鱗状粘膜の基底上皮ペグ(pegs)もポジティブであった。胎児腎臓の発育中の糸球体、成人腎臓細管、及び末期腎臓疾患の「甲状腺化」上皮の細胞のサブセットにおいても発現が観察された。しかしながら、腎細胞癌では、おそらく上皮細胞全体において低い発現が見られた。さらに、発現は、間質細胞では(1)胎児肺で低レベルで、また(2)胃腸腺の先端部分でも観察された。胎児小腸絨毛の固有層、正常大腸粘膜、及び大腸癌における間質細胞にわたって高い発現が示された。肉腫のヒラン化(hylanized)ストローマにおける良性結合組織細胞に強い発現が生じた。胎盤絨毛及び脾赤髄における間質細胞においても発現が生じた。脳では、皮質ニューロンで発現が生じた。
DNA39523(配列番号:45)は発育中の骨を囲む結合組織においてと胎児の神経鞘細胞にわたっても発現した。
検査した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫を含む。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
【0141】
IS98−092:
サル大脳皮質の外層(I及びII)における多数の細胞にDNA39523(配列番号:45)の発現が存在した。より深い皮質層の細胞の小さなサブセットも、このケモカイン相同体のmRNAを発現した。海馬の分子層内と歯状回の内部辺縁の境界の散在細胞はDNA39523(配列番号:45)の発現を示した。大脳皮質内では発現は検出されなかった。DNA39523(配列番号:45)の発現は、ケモカイン相同体が通常は発現される領域において細胞死が起こった梗塞脳では観察されなかった。DNA39523(配列番号:45)は、おそらくは大脳皮質の外層のニューロンのサブセットのマーカーとなり、おそらくはニューロン移動障害を明らかにしうる。異常なニューロン移動は、幾つかの発作性疾患及び精神分裂病の原因となりうる。
IS98−128:
DNA39523(配列番号:45)は、生後(P)10日及び成体マウス脳内に興味ある特定のハイブリッド形成パターンを示した。P10マウスの1つの矢状断面において、海馬の分子層及び歯状回の内辺縁に強いシグナルが散乱して観察された。プレ鉤状回の細胞は中程度に標識された;シグナルは強い帯域を、後部板状皮質の外層を通って後頭皮質に至るまで伸ばし、そこでシグナルはバックグラウンドレベルまで低下する。ポジティブニューロンの小セットがP10運動皮質の深い領域で検出された;P10皮質の外層内のニューロンはバックグラウンドレベルを越えるシグナルを示さなかった。中程度のハイブリッド形成シグナルもまた下丘で検出された。成体マウス脳におけるケモカイン相同体シグナルは、3つの冠状断面において異なるレベルで評価した。強いシグナルが隔壁及び橋核の散在ニューロン及び三叉神経の運動根で検出された;中程度のシグナルが海馬の分子層及び後部板状皮質の外層に見られた。
IS99−027:
ボレカイン(bolekine)(BRAKとしても知られ、DNA39523(配列番号:45)が有意な相同性を有するケモカインである)は、cys−x−cys(CXC)モチーフと、アミノ末端glu−leu−arg(ELR)が存在しないことにより特徴付けられるケモカインのサブグループに属する。非−ELR CXCケモカイン(SDF−1、IP10、Mig及びPF4を含む)はB及びTリンパ球を含む白血球のサブセットに対して走化性を示す。またそれらは、アンギオスタティック(angiostatic)活性も有する。
DNA39523(配列番号:45)は生後(P)1日のマウスの脳で検出され、ボレカインシグナルは海馬(ラクノサム分子層(stratum lacunosum moleculare)及び歯状回の門部)及び前側嗅覚核(olfactory nucleus)で検出されたが、発育中の大脳皮質と小脳では検出されなかった。P10により、シグナルは大脳皮質の層1及び2の細胞のサブセットに存在する。またより深い層における細胞の小集団でもDNA39523(配列番号:45)を発現している。海馬におけるパターンはP1脳と類似していた。弱いシグナルが小脳、特に小葉IX及びXに存在している。シグナルはまた背側線条体及び小丘にも存在している。
成人マウス脳において、ボレカインポジティブ細胞は成人大脳皮質で検出することは困難であるが、シグナルは前側嗅覚核と海馬に存在している。しかし、虚血マウス脳においては、ボレカインシグナルは境界域に誘発されている。
発育中の大脳皮質では、ボレカインの発現はニューロン遊走の最終段階及びシナプス形成と軸索突起の確立に相関している。他のCXCキモカインは中枢神経系でのパターニングとニューロン遊走(SDF−1)及びニューロン活動の調節(IL−8及びGRO−a)における役割を担っている。
ボレカインの発現は脳の虚血性再灌流傷害において誘発されるが、他の炎症状態では誘発されない。
【0142】
DNA47365(IS97−142):胎児組織において、DNA47635(配列番号:91)の発現は、椎骨体の前側表面を内張りする筋膜で観察された。発現は、胎児網膜にわたって見られる。胎児ニューロンにわたって低レベルの発現。
次のプローブを上述の分析で使用した:
DNA49435(配列番号:111)の中程度の発現が胎児脳の皮質ニューロンにわたって観察された。発現は胎児網膜の内面にわたってもまた観察され、発達中のレンズにも見られることがあった。発現は胎児皮膚、軟骨、小腸、胎盤絨毛及び臍帯にわたって見られた。成人組織では、胆嚢上皮に極めて高レベルの発現があった。DNA49435(配列番号:111)の中程度の発現は、成人腎臓、胃及び大腸上皮で見られた。
検査したヒト胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、精巣及び下肢を含む。検査した成人ヒト組織は:腎臓(正常及び末期段階)、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、眼(網膜を含む)、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性機能不全)を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は、チンパンジー組織の副腎、及びアカゲザル組織の大脳皮質、海馬及び小脳を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りであった:
【0143】
DNA54228(IS98−105):
DNA54228(配列番号:133)の発現は骨スピクラ:胎児骨幹端、胎児頭蓋冠(頭蓋)及びヒト異常増殖の骨組織(骨肉腫及び軟骨肉腫)で観察された。軟骨肉腫及び骨肉腫の骨化スピクラ及び胎児骨の骨幹端の小骨スピクラに、弱いが一貫したシグナルがあった。ヒト肺、肝臓、胸腺、腎臓、甲状腺、脳、脾臓、副腎、脳、軟骨、肺、肝臓、腸、生殖腺、心臓及び皮膚を含む胎児組織では何のシグナルも検出されなかった。
上述の手順で使用したプローブは以下の通りであった:
DNA54231(mFIZZ3):
IS98−070:
DNA54231(配列番号:139)は脂肪細胞に特異的な中程度のシグナルを示した。このシグナルは、首において気管の回りの腸間膜脂肪と間質性脂肪に存在する。発現パターンは成体脂肪に対して特異的であるようである。
IS98−109:
DNA54231(配列番号:139)の発現は脂肪細胞に特異的であり、腹膜腸間膜、腎盂の脂肪被膜及び乳房肉趾を含む、この研究でこのような細胞が見出される場所には何れにも存在した。正常なマウス脳、肝臓、腎臓、乳腺、膵臓、脾臓、膵臓、骨髄、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、精巣、皮膚又は肺における何れの他の細胞型においても発現はなかった。
脂肪細胞に対するこの分子の選択的分布は、肥満において何れも重要である、脂肪細胞の産生/生成又は脂肪代謝の何れかにおける役割を示唆している。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
DNA54231−p1(配列番号:224):
5’−GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGAGGGGGACAGGAGCTAATA−3’
DNA54231−p2(配列番号:225):
5’−CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTCCCACGAGCCACAGG−3’
【0144】
DNA59294(IS98−138):
DNA59294(配列番号:149)は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。要約すると、発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及び骨格及びヒト胎児の平滑筋に特異的であった。ヒト成人における発現は、大腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。ヒト成人骨格筋は評価しなかった。胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散した発現があった。腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。
成人組織において、大腸、慢性炎症性腸疾患を持つ5検体において平滑筋(筋層)で低レベルの拡散した発現があった。胆嚢において、胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。
ヒト胎児組織では、骨格筋において中程度の拡散した発現が、また平滑筋において弱から低レベル発現があった。しかしながら、胎児心臓又は肝臓、脾臓、CNS、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現はなかった。
検出可能な発現のなかった試験された付加的なヒト組織には、慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎(5患者)の肺、末梢神経、前立腺、心臓、胎盤、肝臓(傷害及び硬変を誘発するアセトアミノフェンを含む疾患多重ブロック)、脳(大脳及び小脳)、扁桃(反応性過形成)、末梢リンパ節、胸腺が含まれる。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
DNA30868発現は次の胎児組織:脊髄、自律神経節、腸管神経、仙骨神経叢、末梢及び脳神経で見出された。
検査した胎児組織は次のものであった:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0145】
DNA53517:
IS98−070:
正常な成体マウスの肺におけるDNA53517(配列番号:255)の発現は、大きな気道(気管支/細気管支)の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的には正の病巣内に1−3であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管でありうる。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺(好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎)において、肺の大気道(気管支/細気管支)の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散した発現があった。また、肺胞の内側の上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞にも強い発現があった;これらの細胞はII型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質の希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小腸及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸(IL10R KOマウスからのもの)において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
IS98−093:
さらに、DNA53715(配列番号:255)の分布を正常なマウス組織で広範囲なスクリーニングを行い評価した。正常な肺において、発現は変化するが、存在するときはマウスの肺の気管支上皮細胞及びII型肺胞細胞に限定されていた。炎症性肺におけるこれらの細胞(気管支粘膜肥大/過形成を伴うアレルギー性炎症:喘息モデル)では顕著な増加があった。腸におけるDNA53715(配列番号:255)の発現は大腸において最も顕著であり、粘膜下及び筋膜(mucosa muscularis)、腸の筋壁と粘膜との間の血管新生化組織層内の少しの離散細胞に存在していた。これらの細胞の正確な同定は表されていないが、それらの紡錘状(spindloid)形態及び粘膜下の毛細管及び小血管の密接な関連性により次の可能性が示唆される:血管周皮細胞又は非有髄神経線維のサブセット。
腸粘膜下の離散細胞におけるDNA53715(配列番号:255)の発現は大腸に制限され、空腸、回腸、近位十二指腸又は胃の切片では見られなかった。発現は次の正常なマウス組織:肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、肺、膵臓、胃、近位十二指腸、空腸、回腸、脳、皮膚、精巣又は乳腺では検出されなかった。
DNA53715(配列番号:255)は肺の粘膜免疫を増強又は刺激する役割を担っている可能性がある。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0146】
実施例7
疾患組織と細胞におけるインサイツハイブリッド形成
実施例6のインサイツハイブリッド形成法を使用し、特定の病気にかかったヒト個体から単離された発病組織における、遺伝子発現の測定、転写物の組織分布の分析、本発明の遺伝子/DNA及びタンパク質の特異的mRNAの合成における変化の追跡を行った。これらの結果は、本発明の遺伝子が発病組織のどこにより特異的に発現されるかを示しており、本発明の阻害又は刺激化合物(及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト)の病気における治療効果の特定の局在性が予測される。ハイブリッド形成は、一又は複数の次の組織及び試料を使用して、実施例6の方法に従って実施される:
(a)リンパ球及び抗原提示細胞(樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ及び単球、NK細胞);
(b)リンパ組織:正常及び反応性リンパ節、胸腺、気管支関連リンパ組織(BALT)、粘膜関連リンパ組織(MALT);
(c)ヒト疾患組織:
・関節炎及び変性関節疾患を患っている患者の滑膜と関節;
・潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患を患っている患者の大腸;
・乾癬及び他の形態の皮膚炎からの皮膚病変部;
・慢性及び急性気管支炎、肺炎、間質性肺炎、胸膜炎からのリンパ節組織及びBALTを含む肺組織;
・喘息からの組織リンパ節及びBALTを含む肺組織;
・鼻炎又は副鼻孔炎を患っている患者の鼻及び洞組織;
・多発性硬化症、アルツハイマー病及び卒中からの脳及び脊髄;
・腎炎、糸球体腎炎及び全身性エリテマドーデスからの腎臓;
・感染及び非感染肝炎及びアセトアミノフェン誘導性肝硬変からの肝臓; ・新生物/癌からの組織。
発現は細胞又は組織試料に関連した疾患における本発明の化合物(及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト)の治療効果の局在化を示す一又は複数の細胞又は組織試料において観察される。
先に報告された非疾患組織分布と発現が重複する場合に使用したオリゴヌクレオチドの配列は実施例6に記載する。
【0147】
DNA30942:
IS98−021:発現は、正常なチンパンジー胸腺の単核食細胞、並びに胃癌(1/1)、結腸直腸癌(1/1)、乳癌(2/5)及び肺癌(1/4)で観察された。骨肉腫及びあまり分化していない脂肪肉腫の悪性細胞により発現。精巣テラトーマ及び乳癌(1/5)の悪性細胞におけるありうるシグナル。肺癌の一つにおいて、散在シグナルが肺リンパ組織内の高内皮細静脈で見られる。検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、腎細胞癌腫、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。検査したアカゲザル組織は:大脳皮質(rm)、海馬(rm)を含む。検査したチンパンジー組織は:甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜及び唾液腺を含む。
IS98−085:発現が8つの腺癌と7つの扁平上皮肺癌に観察された。アクチンは全ての腫瘍で強くポジティブであり、全てがインサイツハイブリッド形成分析に適していることが示されている。DNA30942の発現は次の6つの腫瘍で観察された:
6727−95/扁平上皮癌−新生物上皮上に強い発現
9558−95/扁平上皮癌−新生物上皮上に発現
12235−95/腺癌−インサイツ及び浸潤腫瘍細胞上に発現
6545−95及び4187−96/扁平上皮癌−腫瘍ストローマの細胞上で発現、腫瘍細胞では発現は見られなかった;
12954−94/扁平上皮癌−間質細胞上に弱い発現。
IS99−112:
DNA30942(配列番号:13)のインサイツ発現を多くの慢性炎症状態及びリンパ器官で評価した。要約すると、DNA30942(配列番号:13)は、慢性喘息の気管支粘膜関連リンパ組織(BALT)、肺門リンパ節、扁桃腺の高内皮細静脈(HEV)で強く発現し、大腸粘膜でパッチ状の発現が、腸粘膜関連リンパ組織(GALT)HEVで弱い不統一な発現があった。
リンパ組織では、慢性喘息のある場合、気管支粘膜関連リンパ組織(BALT)、肺門リンパ節、扁桃腺の単一断片、及びIBD(GALT/MALT)の切片において腸粘膜関連リンパ組織で強い特異的な発現が観察された。これらの各リンパ器官において、発現は高内皮細静脈(HEV)に特に存在していた。
慢性喘息肺の組織では、BALT HEVにおける発現に加えて、特異的発現が炎症性気管支の粘膜下にある高又は反応性の膨張した内皮細胞が裏打ちする小毛細管で観察された。この領域はBALTと密接に関連していないが、気管支への炎症細胞輸送のための粘膜下部位に特異的である。これらの領域には、好酸球の有意な粘膜下浸潤があった。発病した肺(COPD及び慢性間質性肺炎)の他の切片では、DNA30942(配列番号:13)は何ら発現しておらず、これらの切片はいくつかのアーチファクト(スライドからの組織の損失)を有していた。
乾癬組織では、乾癬プラークにおけるいくつかの小真皮毛細管に弱い発現があった。扁桃腺組織では、濾胞に関連するHEVにおける発現に加えて、網状扁桃腺陰窩上皮内に強い発現があった。また、発現は小上皮内毛細管の血管にも存在していた。発現はまたいくつかの上皮細胞内にもあった。これは重要な免疫学的部位であり、抗原提示に関与し、耐性誘発において役割を担っている。
クローン病及び潰瘍性大腸炎を患っている患者から単離された組織では、全ての場合ではないがそのいくつかの場合にパッチ状分布を伴って粘膜に発現が存在した。GALTのHEVにおける発現は他のリンパ組織でみられるよりも顕著に弱いシグナルとして存在しており、粘膜に強いがパッチ状の発現が存在する切片においてさえ一貫して存在はしていなかった。
アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から単離された組織では、慢性リンパ性炎症を有する肝門管の領域内の小毛細管に弱い発現があった。
【0148】
DNA33460(IS98−015):
DNA33460(配列番号:20)の発現は、胎児眼の発育中の外眼性筋肉に直ぐ隣接している緩い結合組織の細胞にわたって観察された。軟部組織肉腫上に中程度の発現。検査した胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は:肝臓、腎臓、腎細胞癌腫、副腎、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、心筋層、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、膀胱、前立腺、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
この手順で使用したプローブは以下の通りである:
発現は肺癌腫瘍で観察され、8つ全ての扁平上皮癌及び6/8の腺癌においてポジティブであった。発現レベルは腺癌で低から中程度であり、扁平上皮癌で非常に強かった。腫瘍ストローマ、肺胞又は正常な呼吸上皮では何の発現も見られなかった。おそらくリンパ節で低レベル発現。
発現は肺癌で観察された。遺伝子を肺腫瘍パネルのTaqman分析で増幅した。発現は8つの扁平上皮癌及び6/8の腺癌で観察された。発現はインサイツ及び湿潤成分においても見られた。腺癌における発現レベルは低から中程度であった。一般的に発現は扁平上皮癌でより高く、その2つでは発現は強かった。おそらくリンパ節では低レベル発現。
【0149】
DNA35638:
IS98−124:
この研究では、炎症ヒト組織(乾癬、IBD、炎症腎臓、炎症肺、肝炎(肝臓ブロック)、正常な扁桃腺、成人及びチンパンジーの多ブロック)におけるDNA35638(配列番号:35)を検査した。DNA35638(配列番号:35)は、この出願の他の箇所で、免疫賦活性(MLRにおけるT細胞の増殖及び同時刺激の増強)及び炎症誘発特性(インビボにおける好中球湿潤の誘発)を有していることが示されている。
この研究では、非炎症組織と比べて、炎症ヒト組織の血管中におけるこの分子の差次的な発現を評価した。要約すると、発現は、扁桃腺の毛包周囲洞を含む毛細管、慢性硬化性腎炎の検体における細動脈、乾癬皮膚の表層真皮血管、慢性炎症を患っている肺の大血管の内皮/内膜に存在していた。DNA35638(配列番号:35)は、正常な皮膚(ヒト包皮検体)、正常な肺、炎症(8IBD検体)又は正常な大腸、慢性的に炎症した肝臓又は肝硬変、正常な成人心臓組織、又は副腎では、(この方法で検出可能な程には)発現しなかった。
DNA39523:
I98−052:
ヒト正常皮膚(新生児の包皮)及び成人乾癬皮膚の双方において、DNA39523(配列番号:45)は、基底層の上皮細胞−上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体であり、基底膜に沿った単層において所定強さの発現を示した。
上部に重なっている層(有棘層、顆粒層等)の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮(表皮直下にある結合組織)でも発現が明らかであった。間質性線維芽であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現は最も明らかであった。
炎症した、また正常な腸:正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内の多巣性パターンにおいて、特に中程度ないしは強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく表される紡錘状(spindloid)間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現せず、発病した腸においても明らかに増加した(強度又は頻度)発現はなかった。特に、炎症をした腸の病変部と発現との間には相関もなかった。
皮膚におけるDNA39523(配列番号:45)の発現、及び表皮細胞の基底上皮細胞までの特異的な局在性により、基底上皮細胞の分化/維持における潜在的な役割が示唆される。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンにより、該細胞が表皮への白血球の輸送を調節していることが示唆される。そn結果、DNA39523(配列番号:45)は、表皮における樹状突起/ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるDNA39523(配列番号:45)の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、炎症性病変部に対するその発現の相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった(しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった)。
【0150】
DNA45416(IS98−140):
DNA45416(配列番号:79)の発現を、種々のヒト及び非ヒト霊長類組織で評価し、高度に特異的であることが見出された。発現は、肺の肺胞マクロファージ及び肝臓洞様毛細血管のクップファー細胞にのみ存在した。これらの細胞での発現は、これら独特の細胞集団が活性化されたときに有意に増加した。組織マクロファージのこれら2つの亜集団は異なる器官に局在化し、それらは類似の生物学的機能を有する。これら両方の型の食細胞は、病原、老化細胞及びタンパク質を含む血流又は気道からの物質を除去するフィルターとして作用し、共に広範な重要なプロ炎症サイトカインを分泌することができる。
炎症肺(7患者試料)では、発現は反応性肺胞マクロファージ細胞集団において顕著であり、肺胞内に1個又は凝集体で存在する大きくて青白く、しばしば空胞を持つ細胞として定義され、正常で非反応性マクロファージ(正常サイズの単一の散乱細胞)においては弱からネガティブであった。肺胞マクロファージでの発現は、これらの細胞が数及びサイズともに増大(活性化)したとき、炎症の間に増加した。これらの組織の間質炎症及び気管支周辺リンパ細胞過形成の領域に組織球が存在するにも関わらず、発現は肺胞マクロファージに制限されていた。多くの炎症肺も幾分の炎症抑制を有していた;発現は神経向性の顆粒球に存在しなかった。
肝臓においては、急性中心小葉性壊死(アセトアミノフェン毒性)又はかなり顕著な門脈周囲の炎症を持つ肝臓において反応性/活性化クップファー細胞に強い発現があった。しかしながら、正常肝臓、又は中程度の炎症、又は穏和から中程度の小葉過形成/肥大のみを持つ肝臓におけるクップファー細胞では発現がなかった。よって、肺と同様に、活性化/反応性細胞において発現の増加があった。
炎症した腸、過形成/反応性扁桃腺又は正常リンパ節に存在する組織球/マクロファージにおいて、この分子の発現は無かった。全てが組織球炎症又は常在性マクロファージ集団を含むこれらの組織で発現がないことは、肺胞マクロファージ及び肝臓クップファー細胞として定義される独特のマクロファージサブセット集団に制限された発現を強く支持する。しかしながら、DNA454216(配列番号:79)の発現は、脾臓又は骨髄では評価できなかった。
検出可能な発現を示さなかった評価したヒト組織は:炎症性腸疾患(中程度から重症の7患者試料)、反応性過形成を持つ扁桃腺、末梢リンパ節、乾癬皮膚(穏和から中程度の疾患を持つ2患者試料)、心臓、末梢神経を含む。検出可能な発現を示さなかった評価したチンパンジー組織は:舌、胃、胸腺を含む。
上述の研究で使用したプローブは以下の通りである:
【0151】
DNA41374:
IS−98−077:
DNA41374(配列番号:248)は胸腺Tリンパ球で発現した。
要約:評価した多くの組織で、胸腺Tリンパ球に弱い拡散した発現が検出されただけであった。制限された分布パターンは、Tリンパ球又はTリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞(樹状細胞集団等)による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織(炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎/気管支炎)において、有意な数のTリンパ球を含む領域に検出可能な発現はなかった。検出可能な発現がなかった試験した組織は:ヒト正常組織:胎盤、肺、脾臓、副腎、皮膚、腎臓、眼、肝臓;ヒト発病組織:肝臓疾患:慢性肝炎、慢性胆管炎、急性小葉中心壊死(アセトアミノフェン毒性);異常増殖(腫瘍多ブロック);骨肉腫、扁平上皮癌;ヒト胎児組織:脳、脊髄、肺、腎臓、腎臓、軸及び肢筋骨格血管、臍帯;非ヒト霊長類:舌、甲状腺、副甲状腺、胃、唾液腺を含む。
IS98−125
DNA41374(配列番号:248)はTリンパ球特定領域にて、ヒト扁桃腺及び非ヒト霊長類胸腺において低レベルの発現をした。制限された分布パターンは、Tリンパ球又はTリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞(樹状細胞集団等)による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織(炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎/気管支炎)において、有意な数のTリンパ球を含みうる領域に検出可能な発現はなかった。
炎症肺:(慢性リンパ及び肉芽種性間質肺炎):対照センスプローブと比較して間質に弱いないしはネガティブなシグナル。正常なチンパンジー胸腺(ヒト胸腺は入手できず)及びヒト扁桃腺で弱い発現があった。後者において、発現は毛包周囲縁部を含むこの構造のTリンパ球領域及び副皮質に主として発現した。
次のヒト組織:炎症性腸疾患(8患者検体)、慢性的炎症及び正常な肺(6患者検体)、慢性硬化性腎炎(1)、慢性的及び急性的炎症及び正常及び肝硬変の肝臓(10検体、多ブロック)、正常及び乾癬皮膚、末梢リンパ節(非反応性)で検出可能な発現はなかった。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである:
【0152】
DNA53517:
IS98−070:
正常な成体マウスの肺におけるDNA53517(配列番号:255)の発現は、大きな気道(気管支/細気管支)の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的に正の病巣内に1−3であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管を提示する。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺(好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎)において、肺の大気道(気管支/細気管支)の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散発現があった。また、肺胞を裏打ちする上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞に強い発現があり;これらの細胞はII型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質に希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸(IL10R KOマウスからのもの)において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
IS98−135:
DNA53715(配列番号:255、マウスFIZZ−1)は次のヒト組織:胃癌、炎症肺(3患者)(脈管、肺胞、大きな気道及び粘液腺)、大動脈、心臓、胎盤及び胆嚢において検出プローブとして使用された。
マウスDNA53715(配列番号:255)の発現は正常なマウス肺の大きな気道上皮に存在し、炎症したマウス肺(気道上皮、II型肺胞肺細胞)で顕著に増加した。また、血管チャンネルに沿った大腸粘膜下における離散細胞にも発現があった。
DNA84210:
インサイツ研究に使用したプローブを次に示す:
DNA84210(配列番号:285)は胎児腎臓、主に発育中の糸球体及び皮質領の細管で発現し、胎児肺及び脊髄では弱かった。また発育中の軟骨及び骨に隣接する間質細胞にも発現があった。成人組織において、弱い発現が正常な気管支上皮、5つの肺腫瘍(2つは扁平上皮癌で3つは腺癌)の一つ(腺癌)、及び軟骨肉腫において見られた。皮膚及びその付属物で発現する可能性もあるが、切片は折り畳まれており、評価することは困難である。
IS99−102:
悪性メラノーマ、肺腫瘍、大腸腫瘍、細胞ペレット、マウス組織、胎児組織におけるDNA84210(配列番号:285)の発現。
DNA84210(配列番号:285)の発現は、いくつかの成人(異常増殖及び非異常増殖)及び胎児組織において見られた。正常な成人組織に関する限り、DNA84210(配列番号:285)は皮膚の表皮(ほとんどが基底部に位置する細胞)及び皮膚付属物、例えば毛髪の濾胞及びそれらに関する皮脂腺で見られる。また発現は、気管支上皮及び粘膜下気管支腺でも見られる。ヒト胎児組織において、DNA84210(配列番号:285)の発現は、皮膚及び皮膚付属物、肺、腎皮質及び膵管で見られる。また、発育中の骨及び軟骨に隣接する間葉細胞でも見られる。マウス胚で見られたハイブリッド形成シグナルはない。DNA84210(配列番号:285)の発現は6つの結腸直腸腺癌の一つ(弱)、3つの肺腺癌の2つ(一つは強を示すが、かなりの限局的発現であり、一つは非常に弱いポジティブである)、3つの肺扁平上皮細胞癌の0、及び一つの軟骨肉腫の一つ(弱)で見られる。また、5つの悪性メラノーマの5つで発現が見られ、発現の強度は非常に弱から強の範囲である。またこれらの切片は正常な表皮及び皮膚付属物におけるDNA84210(配列番号:285)の発現を示す。
【0153】
実施例8
ハイブリッド形成プローブとしてのPROポリペプチドの使用
以下の方法は、PROポリペプチドをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟PROポリペプチドのコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種DNA類(天然発生変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識PRO−誘導プローブ(例えば、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727)のフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハート液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDSの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列PROポリペプチドをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【0154】
実施例9
大腸菌におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるPROポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
PROポリペプチドをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード化領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離して採集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化PROポリペプチドタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリHisタグ形態でPROポリペプチドを発現させてもよい。PROポリペプチドをコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでPCR増幅された、ポリ−Hisタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中、30℃で振盪しながら3−5のO.D.600に達するまで成長させる。ついで培養をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中に50−100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20−30時間成長させる。試料を取り出してSDS−PAGE分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させる。
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。条件に応じて、透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni−NTA金属キレートカラムに充填する。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄する。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もる。
【0155】
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中でゆっくりと希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択する。リフォールディング溶液を4℃で12−36時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はTFAを最終濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%になるまで添加する。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたPROポリペプチドタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に処方した。
【0156】
実施例10
哺乳動物細胞でのPROポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のPROポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP 307,247参照)を用いる。場合によっては、PRODNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いてPRODNAを挿入させる。得られたベクターは、例えばpRK5−PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約10μgのpRK5−PRODNAを約1μgのVARNA遺伝子コード化DNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μLの1mMトリス−HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させる。この混合物に、滴状の、500μLの50mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させる。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させる。培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加する。293細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートする。
形質移入の約24時間後、培地を除去し、培地(単独)又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換する。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに充填する。処理したゲルを乾燥させ、本発明のPROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
これに換わる技術において、pRK5−PROは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5−PROを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄する。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートする。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現された本発明のポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、本発明のポリペプチドをCHO細胞で発現させることができる。pRK5−PROは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの既知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(単独)又は35S−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。本発明のポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、本発明の発現されたPROを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、本発明のエピトープタグポリペプチドは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。本発明の所望のポリペプチドをコードするDNAはpRK5ベクター外でサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−Hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。本発明のポリ−hisタグポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。本発明の発現されたポリ−hisタグポリペプチドを含む培地を、次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【0157】
実施例11
酵母菌でのPROの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。本発明のポリペプチドをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然配列PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)本発明のポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清を、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。本発明のポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
実施例12
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROの組換え発現を記載する。
PROをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Novagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、本発明のポリペプチド又はPROポリペプチドをコードするDNAのコード化配列の所望部分[例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列]が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、側方に位置する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O’Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
次に、本発明の発現されたポリ−hisタグポリペプチドは、例えばNi2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製することができる。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175−179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製する。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes、pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過する。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物を、毎分0.5mLでカラムに負荷する。カラムを分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄する。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開する。1mLの分画を回収し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に抱合したNi2+−NTAでのウェスタンブロットで分析する。本発明の溶離したHis10−タグポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROポリペプチドの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【0158】
実施例13
PROに結合する抗体の調製
この実施例は、本発明のポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製ポリペプチド、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面に本発明の組換えポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムの量で注入した本発明のポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスを、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。本発明のポリペプチドに特異的な抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ(陽性)」な動物に、本発明のポリペプチドの最後の静脈内注射を注入することができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ATCC番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【0159】
ハイブリドーマ細胞を、本発明のポリペプチド対する反応性についてELISAでスクリーニングする。本発明のポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【0160】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、VA20110−2209米国(ATCC)に寄託した:
【0161】
これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Fig1】DNA29101−1276(配列番号:1)を示す図である。
【Fig2】天然配列PRO200ポリペプチドUNQ174(配列番号:2)を示す図である。
【Fig3】DNA30871−1157(配列番号:11)を示す図である。
【Fig4】天然配列部分長PRO204ポリペプチドUNQ178(配列番号:12)を示す図である。
【Fig5】DNA30942−1134(配列番号:13)を示す図である。
【Fig6】天然配列PRO212ポリペプチドUNQ186(配列番号:14)を示す図である。
【Fig7】DNA33087−1158(配列番号:18)を示す図である。
【Fig8】天然配列PRO216ポリペプチドUNQ190(配列番号:19)を示す図である。
【Fig9】DNA33460−1166(配列番号:20)を示す図である。
【Fig10】天然配列PRO226ポリペプチドUNQ200(配列番号:21)を示す図である。
【Fig11】DNA34387−1138(配列番号:25)を示す図である。
【Fig12】天然配列PRO240ポリペプチドUNQ214(配列番号:26)を示す図である。
【Fig13】DNA35558−1167(配列番号:30)を示す図である。
【Fig14】天然配列PRO235ポリペプチドUNQ209(配列番号:31)を示す図である。
【Fig15】DNA35638−1141(配列番号:35)を示す図である。
【Fig16】天然配列PRO245ポリペプチドUNQ219(配列番号:36)を示す図である。
【Fig17】DNA35916−1161(配列番号:40)を示す図である。
【Fig18】天然配列PRO172ポリペプチドUNQ146(配列番号:41)を示す図である。
【Fig19】DNA39523−1192(配列番号:45)を示す図である。
【Fig20】天然配列PRO273ポリペプチドUNQ240(配列番号:46)を示す図である。
【Fig21】DNA40620−1183(配列番号:50)を示す図である。
【Fig22】天然配列PRO272ポリペプチドUNQ239(配列番号:51)を示す図である。
【Fig23】DNA40982−1235(配列番号:56)を示す図である。
【Fig24】天然配列PRO332ポリペプチドUNQ293(配列番号:57)を示す図である。
【Fig25】DNA44184−1319(配列番号:61)を示す図である。
【Fig26】天然配列PRO526ポリペプチドUNQ330(配列番号:62)を示す図である。
【Fig27】DNA44205−1285(配列番号:66)を示す図である。
【Fig28】天然配列PRO701ポリペプチドUNQ365(配列番号:67)を示す図である。
【Fig29】DNA45410−1250(配列番号:71)を示す図である。
【Fig30】天然配列PRO361ポリペプチドUNQ316(配列番号:72)を示す図である。
【Fig31】DNA45416−1251(配列番号:79)を示す図である。
【Fig32】天然配列PRO362ポリペプチドUNQ317(配列番号:80)を示す図である。
【Fig33】DNA45419−1252(配列番号:86)を示す図である。
【Fig34】天然配列PRO363ポリペプチドUNQ318(配列番号:87)を示す図である。
【Fig35】DNA47365−1206(配列番号:91)を示す図である。
【Fig36】天然配列PRO364ポリペプチドUNQ319(配列番号:92)を示す図である。
【Fig37】DNA47470−1130(配列番号:101)を示す図である。
【Fig38】天然配列PRO356ポリペプチドUNQ313(配列番号:102)を示す図である。
【Fig39】DNA48314−1320(配列番号:106)を示す図である。
【Fig40】天然配列PRO531ポリペプチドUNQ332(配列番号:107)を示す図である。
【Fig41】DNA49435−1219(配列番号:111)を示す図である。
【Fig42】天然配列PRO533ポリペプチドUNQ334(配列番号:112)を示す図である。
【Fig43】DNA50921−1458(配列番号:116)を示す図である。
【Fig44】天然配列PRO1083ポリペプチドUNQ540(配列番号:117)を示す図である。
【Fig45】DNA53974−1401(配列番号:123)を示す図である。
【Fig46】天然配列PRO865ポリペプチドUNQ434(配列番号:124)を示す図である。
【Fig47】DNA54228−1366(配列番号:133)を示す図である。
【Fig48】天然配列PRO770ポリペプチドUNQ408(配列番号:134)を示す図である。
【Fig49】DNA54231−1366(配列番号:139)を示す図である。
【Fig50】天然配列PRO769ポリペプチドUNQ407(配列番号:140)を示す図である。
【Fig51】DNA56405−1357(配列番号:141)を示す図である。
【Fig52】天然配列PRO788ポリペプチドUNQ430(配列番号:142)を示す図である。
【Fig53】DNA57033−1403(配列番号:143)を示す図である。
【Fig54】天然配列PRO1114ポリペプチドUNQ557(配列番号:144)を示す図である。
【Fig55】DNA57690−1374(配列番号:145)を示す図である。
【Fig56】天然配列PRO1007ポリペプチドUNQ491(配列番号:146)を示す図である。
【Fig57】DNA59220−1514(配列番号:147)を示す図である。
【Fig58】天然配列PRO1184ポリペプチドUNQ598(配列番号:148)を示す図である。
【Fig59】DNA59294−1381(配列番号:149)を示す図である。
【Fig60】天然配列PRO1031ポリペプチドUNQ516(配列番号:150)を示す図である。
【Fig61】DNA59776−1600(配列番号:151)を示す図である。
【Fig62】天然配列PRO1346ポリペプチドUNQ701(配列番号:152)を示す図である。
【Fig63】DNA59849−1504(配列番号:156)を示す図である。
【Fig64】天然配列PRO1155ポリペプチドUNQ585(配列番号:157)を示す図である。
【Fig65】DNA60775−1532(配列番号:158)を示す図である。
【Fig66】天然配列PRO1250ポリペプチドUNQ633(配列番号:159)を示す図である。
【Fig67】DNA61873−1574(配列番号:160)を示す図である。
【Fig68】天然配列PRO1312ポリペプチドUNQ678(配列番号:161)を示す図である。
【Fig69】DNA62814−1521(配列番号:162)を示す図である。
【Fig70】天然配列PRO1192ポリペプチドUNQ606(配列番号:163)を示す図である。
【Fig71】DNA64885−1529(配列番号:167)を示す図である。
【Fig72】天然配列PRO1246ポリペプチドUNQ630(配列番号:168)を示す図である。
【Fig73】DNA65404−1551(配列番号:169)を示す図である。
【Fig74】天然配列PRO1283ポリペプチドUNQ653(配列番号:170)を示す図である。
【Fig75】DNA65412−1523(配列番号:177)を示す図である。
【Fig76】天然配列PRO1195ポリペプチドUNQ608(配列番号:178)を示す図である。
【Fig77】DNA66675−1587(配列番号:179)を示す図である。
【Fig78】天然配列PRO1343ポリペプチドUNQ698(配列番号:180)を示す図である。
【Fig79】DNA68864−1629(配列番号:184)を示す図である。
【Fig80】天然配列PRO1418ポリペプチドUNQ732(配列番号:185)を示す図である。
【Fig81】DNA68872−1620(配列番号:186)を示す図である。
【Fig82】天然配列PRO1387ポリペプチドUNQ722(配列番号:187)を示す図である。
【Fig83】DNA68874−1622(配列番号:188)を示す図である。
【Fig84】天然配列PRO1410ポリペプチドUNQ728(配列番号:189)を示す図である。
【Fig85】DNA76400−2528(配列番号:190)を示す図である。
【Fig86】天然配列PRO1917ポリペプチドUNQ900(配列番号:191)を示す図である。
【Fig87】DNA77624−2515(配列番号:192)を示す図である。
【Fig88】天然配列PRO1868ポリペプチドUNQ859(配列番号:193)を示す図である。
【Fig89】DNA30868−1156(配列番号:228)を示す図である。
【Fig90】部分天然配列PRO205ポリペプチドUNQ179(配列番号:229)を示す図である。
【Fig91】DNA36638−1056(配列番号:230)を示す図である。
【Fig92】天然配列PRO21ポリペプチドUNQ21(配列番号:231)を示す図である。
【Fig93】DNA38260−1180(配列番号:232)を示す図である。
【Fig94】天然配列PRO269ポリペプチドUNQ236(配列番号:233)を示す図である。
【Fig95】DNA40592−1242(配列番号:240)を示す図である。
【Fig96】天然配列PRO344ポリペプチドUNQ303(配列番号:241)を示す図である。
【Fig97】DNA41374−1312(配列番号:248)を示す図である。
【Fig98】部分長天然配列PRO333ポリペプチドUNQ294(配列番号:249)を示す図である。
【Fig99】DNA44194−1317(配列番号:250)を示す図である。
【Fig100】天然配列PRO381ポリペプチドUNQ322(配列番号:251)を示す図である。
【Fig101】DNA53517−1366(配列番号:255)を示す図である。
【Fig102】天然配列PRO720ポリペプチドUNQ388(配列番号:256)を示す図である。
【Fig103】DNA53971−1359(配列番号:257)を示す図である。
【Fig104】天然配列PRO866ポリペプチドUNQ435(配列番号:258)を示す図である。
【Fig105】DNA53987−1438(配列番号:266)を示す図である。
【Fig106】天然配列PRO840ポリペプチドUNQ433(配列番号:267)を示す図である。
【Fig107】DNA57700−1408(配列番号:268)を示す図である。
【Fig108】天然配列PRO982ポリペプチドUNQ483(配列番号:269)を示す図である。
【Fig109】DNA59620−1463(配列番号:270)を示す図である。
【Fig110】天然配列PRO836ポリペプチドUNQ545(配列番号:271)を示す図である。
【Fig111】DNA60627−1508(配列番号:272)を示す図である。
【Fig112】天然配列PRO1159ポリペプチドUNQ589(配列番号:273)を示す図である。
【Fig113】DNA64890−1612(配列番号:274)を示す図である。
【Fig114】天然配列PRO1358ポリペプチドUNQ707(配列番号:275)を示す図である。
【Fig115】DNA66659−1593(配列番号:276)を示す図である。
【Fig116】天然配列PRO1325ポリペプチドUNQ685(配列番号:277)を示す図である。
【Fig117】DNA66667−1596(配列番号:278)を示す図である。
【Fig118】天然配列PRO1338ポリペプチドUNQ693(配列番号:279)を示す図である。
【Fig119】DNA68818−2536(配列番号:280)を示す図である。
【Fig120】天然配列PRO1434ポリペプチドUNQ739(配列番号:281)を示す図である。
【Fig121】DNA84210−2576(配列番号:285)を示す図である。
【Fig122】天然配列PRO4333ポリペプチドUNQ1888(配列番号:286)を示す図である。
【Fig123】DNA92218−2554(配列番号:292)を示す図である。
【Fig124】天然配列PRO4302ポリペプチドUNQ1866(配列番号:293)を示す図である。
【Fig125】DNA96878−2626(配列番号:294)を示す図である。
【Fig126】天然配列PRO4430ポリペプチドUNQ1947(配列番号:295)を示す図である。
【Fig127】DNA98853−1739(配列番号:296)を示す図である。
【Fig128】天然配列PRO5727ポリペプチドUNQ2448(配列番号:297)を示す図である。
Claims (44)
- 免疫関連疾患の治療に有用な組成物において、
(a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、
(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は
(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるT−リンパ球の増殖を増加させる、特性を有し、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、そのアゴニスト又は断片、及び担体又は賦形剤を含有する組成物。 - 有効量のPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、そのアゴニスト、アンタゴニスト又は断片を含む請求項1に記載の組成物。
- 成長阻害剤、細胞障害薬又は化学療法剤をさらに含有する請求項2に記載の組成物。
- (a)その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、(b)その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は(c)抗原に反応してその必要とする哺乳動物においてT−リンパ球の増殖を増加させる、
特性を有する組成物を調製するための、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、そのアゴニスト又は断片の使用。 - 有効量のPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430、PRO5727ポリペプチド、そのアゴニスト、アンタゴニスト又は断片を含む請求項4に記載の使用。
- 成長阻害剤、細胞障害薬又は化学療法剤をさらに含有する請求項2に記載の組成物。
- 有効量のPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチド、そのアゴニスト抗体、そのアンタゴニスト抗体又は断片を哺乳動物に投与することを含み、その必要とする哺乳動物におけるT細胞媒介疾患などの免疫関連疾患の治療方法。
- 疾患が、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、伝染性肝炎、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎等の肝疾患、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患から選択される請求項7に記載の方法。
- アゴニスト又はアンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項1ないし8のいずれか1項に記載の組成物又は使用。
- アゴニスト又はアンタゴニストが抗体断片又は単鎖抗体である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の組成物又は使用。
- 抗体が非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)酸基を有する請求項9又は10に記載の組成物又は使用。
- ポリペプチドを含有すると推測される細胞を、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430、抗−PRO5727抗体に暴露し、抗体の細胞への結合を測定することを含んでなる、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの存在を決定する方法。
- 哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法において、(a)哺乳動物から得た組織細胞の試験試料と、及び(b)同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料において、PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、対照と比較して試験試料の発現レベルが高いか低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示すものである診断方法。
- 哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法において、(a)抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、(b)試験試料中でのポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含んでなる方法。
- 適当なパッケージに、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体又はその断片と担体を含有してなる免疫関連疾患診断キット。
- PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための説明書をさらに含んでなる請求項15に記載のキット。
- 容器;
容器上の説明書;及び
容器内に含まれる活性剤を含有する組成物;
を含んでなる製造品において、組成物が哺乳動物における免疫反応の阻害又は低減に効果があり、容器上の説明書が組成物が免疫関連疾患の治療に使用できることを示しており、組成物中の活性剤がPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害する薬剤である製造品。 - 前記活性剤が、抗−PRO200、抗−PRO204、抗−PRO212、抗−PRO216、抗−PRO226、抗−PRO240、抗−PRO235、抗−PRO245、抗−PRO172、抗−PRO273、抗−PRO272、抗−PRO332、抗−PRO526、抗−PRO701、抗−PRO361、抗−PRO362、抗−PRO363、抗−PRO364、抗−PRO356、抗−PRO531、抗−PRO533、抗−PRO1083、抗−PRO865、抗−PRO770、抗−PRO769、抗−PRO788、抗−PRO1114、抗−PRO1007、抗−PRO1184、抗−PRO1031、抗−PRO1346、抗−PRO1155、抗−PRO1250、抗−PRO1312、抗−PRO1192、抗−PRO1246、抗−PRO1283、抗−PRO1195、抗−PRO1343、抗−PRO1418、抗−PRO1387、抗−PRO1410、抗−PRO1917、抗−PRO1868、抗−PRO205、抗−PRO21、抗−PRO269、抗−PRO344、抗−PRO333、抗−PRO381、抗−PRO720、抗−PRO866、抗−PRO840、抗−PRO982、抗−PRO836、抗−PRO1159、抗−PRO1358、抗−PRO1325、抗−PRO1338、抗−PRO1434、抗−PRO4333、抗−PRO4302、抗−PRO4430又は抗−PRO5727抗体である請求項17に記載の製造品。
- PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの発現又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法において、該ポリペプチドに候補化合物を、これら2つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と条件下で接触させることを含んでなる方法。
- 候補化合物、又はPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドが固体支持体上に固定されている請求項19に記載の方法。
- 非固定成分が検出標識を有する請求項20に記載の方法。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:11)、Fig5(配列番号:13)、Fig7(配列番号:18)、Fig9(配列番号:20)、Fig11(配列番号:25)、Fig13(配列番号:30)、Fig15(配列番号:35)、Fig17(配列番号:40)、Fig19(配列番号:45)、Fig21(配列番号:50)、Fig23(配列番号:56)、Fig25(配列番号:61)、Fig27(配列番号:66)、Fig29(配列番号:71)、Fig31(配列番号:79)、Fig33(配列番号:86)、Fig35(配列番号:91)、Fig37(配列番号:101)、Fig39(配列番号:106)、Fig41(配列番号:111)、Fig43(配列番号:116)、Fig45(配列番号:123)、Fig47(配列番号:133)、Fig49(配列番号:139)、Fig51(配列番号:141)、Fig53(配列番号:143)、Fig55(配列番号:145)、Fig57(配列番号:147)、Fig59(配列番号:149)、Fig61(配列番号:151)、Fig63(配列番号:156)、Fig65(配列番号:158)、Fig67(配列番号:160)、Fig69(配列番号:162)、Fig71(配列番号:167)、Fig73(配列番号:169)、Fig75(配列番号:177)、Fig77(配列番号:179)、Fig79(配列番号:184)、Fig81(配列番号:186)、Fig83(配列番号:188)、Fig85(配列番号:190)、Fig87(配列番号:192)、Fig89(配列番号:228)、Fig91(配列番号:230)、Fig93(配列番号:232)、Fig95(配列番号:240)、Fig97(配列番号:248)、Fig99(配列番号:250)、Fig101(配列番号:255)、Fig103(配列番号:257)、Fig105(配列番号:266)、Fig107(配列番号:268)、Fig109(配列番号:270)、Fig111(配列番号:272)、Fig113(配列番号:274)、Fig115(配列番号:276)、Fig117(配列番号:278)、Fig119(配列番号:280)、Fig121(配列番号:285)、Fig123(配列番号:292)、Fig125(配列番号:294)又はFig127(配列番号:296)に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:11)、Fig5(配列番号:13)、Fig7(配列番号:18)、Fig9(配列番号:20)、Fig11(配列番号:25)、Fig13(配列番号:30)、Fig15(配列番号:35)、Fig17(配列番号:40)、Fig19(配列番号:45)、Fig21(配列番号:50)、Fig23(配列番号:56)、Fig25(配列番号:61)、Fig27(配列番号:66)、Fig29(配列番号:71)、Fig31(配列番号:79)、Fig33(配列番号:86)、Fig35(配列番号:91)、Fig37(配列番号:101)、Fig39(配列番号:106)、Fig41(配列番号:111)、Fig43(配列番号:116)、Fig45(配列番号:123)、Fig47(配列番号:133)、Fig49(配列番号:139)、Fig51(配列番号:141)、Fig53(配列番号:143)、Fig55(配列番号:145)、Fig57(配列番号:147)、Fig59(配列番号:149)、Fig61(配列番号:151)、Fig63(配列番号:156)、Fig65(配列番号:158)、Fig67(配列番号:160)、Fig69(配列番号:162)、Fig71(配列番号:167)、Fig73(配列番号:169)、Fig75(配列番号:177)、Fig77(配列番号:179)、Fig79(配列番号:184)、Fig81(配列番号:186)、Fig83(配列番号:188)、Fig85(配列番号:190)、Fig87(配列番号:192)、Fig89(配列番号:228)、Fig91(配列番号:230)、Fig93(配列番号:232)、Fig95(配列番号:240)、Fig97(配列番号:248)、Fig99(配列番号:250)、Fig101(配列番号:255)、Fig103(配列番号:257)、Fig105(配列番号:266)、Fig107(配列番号:268)、Fig109(配列番号:270)、Fig111(配列番号:272)、Fig113(配列番号:274)、Fig115(配列番号:276)、Fig117(配列番号:278)、Fig119(配列番号:280)、Fig121(配列番号:285)、Fig123(配列番号:292)、Fig125(配列番号:294)又はFig127(配列番号:296)に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:11)、Fig5(配列番号:13)、Fig7(配列番号:18)、Fig9(配列番号:20)、Fig11(配列番号:25)、Fig13(配列番号:30)、Fig15(配列番号:35)、Fig17(配列番号:40)、Fig19(配列番号:45)、Fig21(配列番号:50)、Fig23(配列番号:56)、Fig25(配列番号:61)、Fig27(配列番号:66)、Fig29(配列番号:71)、Fig31(配列番号:79)、Fig33(配列番号:86)、Fig35(配列番号:91)、Fig37(配列番号:101)、Fig39(配列番号:106)、Fig41(配列番号:111)、Fig43(配列番号:116)、Fig45(配列番号:123)、Fig47(配列番号:133)、Fig49(配列番号:139)、Fig51(配列番号:141)、Fig53(配列番号:143)、Fig55(配列番号:145)、Fig57(配列番号:147)、Fig59(配列番号:149)、Fig61(配列番号:151)、Fig63(配列番号:156)、Fig65(配列番号:158)、Fig67(配列番号:160)、Fig69(配列番号:162)、Fig71(配列番号:167)、Fig73(配列番号:169)、Fig75(配列番号:177)、Fig77(配列番号:179)、Fig79(配列番号:184)、Fig81(配列番号:186)、Fig83(配列番号:188)、Fig85(配列番号:190)、Fig87(配列番号:192)、Fig89(配列番号:228)、Fig91(配列番号:230)、Fig93(配列番号:232)、Fig95(配列番号:240)、Fig97(配列番号:248)、Fig99(配列番号:250)、Fig101(配列番号:255)、Fig103(配列番号:257)、Fig105(配列番号:266)、Fig107(配列番号:268)、Fig109(配列番号:270)、Fig111(配列番号:272)、Fig113(配列番号:274)、Fig115(配列番号:276)、Fig117(配列番号:278)、Fig119(配列番号:280)、Fig121(配列番号:285)、Fig123(配列番号:292)、Fig125(配列番号:294)又はFig127(配列番号:296)に示すヌクレオチド配列の全長コード化配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- ATCC受託番号209653、209380、209254、209381、209376、209260、209374、209265、209419、209424、209388、209433、209704、209720、209621、209620、209616、209436、209422、209702、209480、209859、209774、209801、209802、209849、209905、209950、209962、209866、203128、209986、203173、203132、203093、203457、203244、203094、203282、203276、203160、203277、203573、203553、−、209456、209397、209492、−、209808、209802、209750、209858、203583、209989、203092、203131、203269、203267、203657、203818、203834、23−PTA、203906で寄託されたDNAの全長コード化配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- 請求項22ないし25のいずれか1項に記載の核酸を含んでなるベクター。
- ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列と作用可能に結合する請求項26に記載のベクター。
- 請求項26に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である請求項28に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が大腸菌である請求項28に記載の宿主細胞。
- 前記細胞が酵母菌細胞である請求項28に記載の宿主細胞。
- PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの生産方法において、該ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項28に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも80%のポジティブのスコアを示す単離されたポリペプチド。
- ATCC受託番号209653、209380、209254、209381、209376、209260、209374、209265、209419、209424、209388、209433、209704、209720、209621、209620、209616、209436、209422、209702、209480、209859、209774、209801、209802、209849、209905、209950、209962、209866、203128、209986、203173、203132、203093、203457、203244、203094、203282、203276、203160、203277、203573、203553、−、209456、209397、209492、−、209808、209802、209750、209858、203583、209989、203092、203131、203269、203267、203657、203818、203834、23−PTA、203906で寄託されたDNAの全長コード化配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
- 異種性アミノ酸配列に融合した請求項33ないし35のいずれか1項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
- 前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項36に記載のキメラ分子。
- 前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリンのFc領域である請求項36に記載のキメラ分子。
- 請求項33ないし35のいずれか1項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体である請求項39に記載の抗体。
- (a)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示すポリペプチドをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列;
(b)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列;又は
(c)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列;
と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - (a)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチド;
(b)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示され、その関連シグナルペプチドを伴うポリペプチドの細胞外ドメイン;又は
(c)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:12)、Fig6(配列番号:14)、Fig8(配列番号:19)、Fig10(配列番号:21)、Fig12(配列番号:26)、Fig14(配列番号:31)、Fig16(配列番号:36)、Fig18(配列番号:41)、Fig20(配列番号:46)、Fig22(配列番号:51)、Fig24(配列番号:57)、Fig26(配列番号:62)、Fig28(配列番号:67)、Fig30(配列番号:72)、Fig32(配列番号:80)、Fig34(配列番号:87)、Fig36(配列番号:92)、Fig38(配列番号:102)、Fig40(配列番号:107)、Fig42(配列番号:112)、Fig44(配列番号:117)、Fig46(配列番号:124)、Fig48(配列番号:134)、Fig50(配列番号:140)、Fig52(配列番号:142)、Fig54(配列番号:144)、Fig56(配列番号:146)、Fig58(配列番号:148)、Fig60(配列番号:150)、Fig62(配列番号:152)、Fig64(配列番号:157)、Fig66(配列番号:159)、Fig68(配列番号:161)、Fig70(配列番号:163)、Fig72(配列番号:168)、Fig74(配列番号:170)、Fig76(配列番号:178)、Fig78(配列番号:180)、Fig80(配列番号:185)、Fig82(配列番号:187)、Fig84(配列番号:189)、Fig86(配列番号:191)、Fig88(配列番号:193)、Fig90(配列番号:229)、Fig92(配列番号:231)、Fig94(配列番号:233)、Fig96(配列番号:241)、Fig98(配列番号:249)、Fig100(配列番号:251)、Fig102(配列番号:256)、Fig104(配列番号:258)、Fig106(配列番号:267)、Fig108(配列番号:269)、Fig110(配列番号:271)、Fig112(配列番号:273)、Fig114(配列番号:275)、Fig116(配列番号:277)、Fig118(配列番号:279)、Fig120(配列番号:281)、Fig122(配列番号:286)、Fig124(配列番号:293)、Fig126(配列番号:295)又はFig128(配列番号:297)に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチドの細胞外ドメイン;
と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 - PBMC細胞をPRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの有効量と接触させ、コントロールレベルからの増殖の変化を測定することを含んでなるT細胞の増殖に影響を及ぼす方法。
- PRO200、PRO204、PRO212、PRO216、PRO226、PRO240、PRO235、PRO245、PRO172、PRO273、PRO272、PRO332、PRO526、PRO701、PRO361、PRO362、PRO363、PRO364、PRO356、PRO531、PRO533、PRO1083、PRO865、PRO770、PRO769、PRO788、PRO1114、PRO1007、PRO1184、PRO1031、PRO1346、PRO1155、PRO1250、PRO1312、PRO1192、PRO1246、PRO1283、PRO1195、PRO1343、PRO1418、PRO1387、PRO1410、PRO1917、PRO1868、PRO205、PRO21、PRO269、PRO344、PRO333、PRO381、PRO720、PRO866、PRO840、PRO982、PRO836、PRO1159、PRO1358、PRO1325、PRO1338、PRO1434、PRO4333、PRO4302、PRO4430又はPRO5727ポリペプチドの有効量を試験動物に注入し、得られた血管透過性の度合いを測定することを含んでなる血管透過性に影響を及ぼす方法。
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