ES2236834T3 - Subunidad catalitica de fosfatidil inositol 3-quinasa p11o delta. - Google Patents

Subunidad catalitica de fosfatidil inositol 3-quinasa p11o delta.

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ES2236834T3 ES97948540T ES97948540T ES2236834T3 ES 2236834 T3 ES2236834 T3 ES 2236834T3 ES 97948540 T ES97948540 T ES 97948540T ES 97948540 T ES97948540 T ES 97948540T ES 2236834 T3 ES2236834 T3 ES 2236834T3
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Merl F. Hoekstra
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UNA NUEVA SUBUNIDAD CATALITICA DE UNA QUINASA LIPIDA DESIGNADA P110 DE . SE PROPORCIONAN POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS DE LA P110 DE Y LA P110 DE RECOMBINANTE JUNTO CON ANTICUERPOS CONTRA LA P110 DE , ENSAYOS PARA IDENTIFICAR LOS INHIBIDORES DE LA P110 DE Y SIMILARES.

Description

Subunidad catalítica de fosfatidil inositol 3-quinasa p110\delta.
La presente invención se refiere en general a la identificación y al aislamiento de una nueva lípido quinasa y más particularmente al descubrimiento de una nueva subunidad catalítica relacionada con la fosfatidil inositol 3-quinasa designada aquí p110\delta.
Se identificó originalmente la fosfatidil inositol 3-quinasa (PI 3-quinasa) como una actividad asocial con oncoproteínas virales y tirosina quinasas receptor del factor de crecimiento que fosforila el fosfatidil inositol (PI) y derivados fosforilados de PI en el 3'-hidroxilo del anillo inositol [Panayotou et al., Trends in Cell Biol. 2:358-360 (1992)]. La purificación inicial y la clonación molecular de PI 3-quinasa reveló que era un heterodímero constituido por subunidades p85 y p110\delta [Otsu et al., Cell, 65:91-104 (1992); Hiles et al., Cell, 70:419-429 (1992)].
La subunidad p85 actúa para circunscribir la PI 3-quinasa a la membrana plasmática mediante la interacción de su dominio SH2 con residuos de tirosina fosforilados (presente en un contexto secuencial adecuado) en proteínas blanco [Rameh et al., Cell, 83: 821-830 (1995)]. Se han identificado dos isoformas de p85, p85\alpha de expresión ubicua, y p85\beta que se encuentra principalmente en tejidos linfoides y del cerebro [Volinia et al., Oncogene, 7: 789-793
(1992)].
La subunidad p110 contiene el dominio catalítico de PI 3-quinasa y se han identificado hasta ahora tres isoformas (\alpha, \beta, y \gamma) de p110. p110\alpha y \beta se asocian con p85 mientras que p110\gamma que es activada por subunidades \beta\gamma de la proteína G no lo hace [Stoyanov et al, Science, 269:690-693 (1995)]. La clonación de p100\gamma reveló una complejidad adicional dentro de esta familia de enzimas. p110\gamma está estrechamente relacionada con p110\alpha y \beta (45-48% de identidad en el dominio catalítico) pero no utiliza p85 como subunidad de referencia (targeting); por el contrario, p110\gamma contiene un dominio adicional denominado dominio de homología pleckstrin cerca de su término amino. Este dominio permite la interacción con las subunidades \beta \gamma de las proteínas G heterotriméricas y parece ser que es esta interacción la que regula su actividad [Stoyanov et al., 1995]. Por consiguiente, las PI 3-quinasas son definidas por su identidad de aminoácidos o su actividad. Como miembros adicionales de esta familia creciente de genes, se pueden citar quinasas lipídicas y proteínicas relacionadas más alejadas, inclusive Vps34, TOR1 y TOR2 de Saccharomyces cerevisiae (y su homólogo mamífero como FRAP y mTOR), el producto génico ataxia telangiaectasia y la subunidad catalítica de quinasa proteínica dependiente de ADN [Véase en general la revisión de Hunter, Cell, 83: 1-4 (1995)].
Los niveles de fosfatidil inositol (3, 4, 5) trifosfato (PIP_{3}), el producto primario de activación PI 3-quinasa aumentan tras el tratamiento de las células con una amplia variedad de agonistas. Se cree por lo tanto que la actividad PI 3-quinasa interviene en ciertas respuestas celulares, inclusive el crecimiento celular, la diferenciación y la apoptosis [Parker et al., Current Biology, 5: 577-579 (1995); Yao et al., Science, 267:2004-2005 (1995)]. Las dianas, aguas abajo, de los lípidos fosforilados generados tras la actividad PI 3-quinasa no han sido bien caracterizadas. In vitro, algunas isoformas de quinasa proteínica C (PKC) son activadas directamente por PIP_{3} y se ha visto que la quinasa proteínica PKB relacionada con PKC es activada por PI 3-quinasa mediante un mecanismo todavía no determinado [Burgering and Coffer, Nature, 376:599-602 (1995)].
Parece ser también que la PI 3-quinasa interviene en ciertos aspectos de la activación leucocítica. Se ha visto que una actividad de PI 3-quinasa asociada a p85 se asocia físicamente con el dominio citoplásmico de CD28, una molécula co-estimuladora importante para la activación de células T en respuesta a antígeno [Pages et al., Nature, 369: 327-329 (1994); Rudd, Immunity, 4: 527-534 (1996)].
La activación de células T por CD28 reduce el umbral de activación por antígeno y aumenta la magnitud y duración de la respuesta proliferativa. Estos efectos están relacionados con aumentos en la transcripción de cierto número de genes, inclusive el factor de crecimiento de célula T interleuquina 2 (IL-2) [Fraser et al., Science 251:313-316 (1992)]. La mutación de CD28 de modo que ya no interactúa con PI 3-quinasa conduce a la falta de iniciación de la producción de IL-2, lo cual sugiere un papel crítico de la PI 3-quinasa en la activación de la célula T [Pages et al., 1994]. Tomando como base ciertos estudios en los que se utiliza el inhibidor de Pi 3-quinasa, wortmannina, se comprueba que la/las PI 3-quinasa(s) también se necesitan para ciertos aspectos de señalización de leucocitos por receptores acoplados con proteína G [Telen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4960-4964 (1994)].
Sigue existiendo por lo tanto la necesidad, en este campo, de más estudios sobre la naturaleza, la función y la distribución de la PI 3-quinasa, que ofrezcan medios para realizar modulaciones beneficiosas de los efectos de la PI 3-quinasa.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se ofrece un polinucleótido purificado y aislado que codifica la secuencia de aminoácido de p110\delta expuesta en la SEQ ID NO:2. La presente invención ofrece además un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención, junto con una célula huésped establemente transformada o transfectada con el mismo. En otro aspecto, se ofrece un polipéptido purificado y aislado que comprende la secuencia de aminoácido p110\delta de la SEQ ID NO:2. También se ofrece un anticuerpo específicamente inmunoreactivo con el polipéptido de la presente invención y una línea celular hibridoma, que expresa un anticuerpo monoclonal de la presente invención.
La presente invención ofrece nuevos polinucleótidos purificados y aislados (es decir ADN y ARN, cadenas sentido y antisentido) que codifican un miembro catalítico hasta ahora desconocido de la familia de las PI 3-quinasas designado p110\delta, que se expresa predominantemente en leucocitos y desempeña probablemente un papel en el sistema inmunitario en la señalización por medio de PI 3-quinasa. Las secuencias preferidas de ADN de la invención comprenden secuencias genómicas y cADN así como secuencias de ADN sintetizadas químicamente de forma total o parcial. La secuencia de ADN que codifica p110\delta se exponen en la SEQ ID NO:1.
La presente invención también contempla replicas biológicas (es decir copias de secuencias de ADN aisladas realizadas in vivo o in vitro) de secuencias de ADN de la invención. También se ofrecen construcciones recombinantes de replicación autónoma como vectores ADN plásmido y virales que incorporan secuencias de p110\delta y especialmente vectores en los que el ADN que codifica p110\delta está vinculado operativamente con una secuencia ADN de control de expresión endógena o exógena y un terminador de transcripción. El experto en la materia entenderá los diversos componentes de vectores [por ejemplo promotor(es) marcador(es) seleccionables, origen de replicación(es), zona(s) de clonación múltiple etc.], métodos para la manipulación de vectores y las utilizaciones de vectores en la transformación o transfección de células huéspedes (procarióticas y eucarióticas) y expresión de p110\delta de la presente inven-
ción.
Según otro aspecto de la invención, las células huéspedes procarióticas o eucarióticas son transformadas de forma estable o transitoria con secuencias ADN de la invención de una forma que permite la expresión de p110\delta. Las células huéspedes que expresan p110\delta o p110\delta junto con un elemento de enlace del mismo pueden servir para toda una serie de fines útiles. Estas células constituyen una fuente valiosa de inmunógeno para el desarrollo de sustancias anticuerpo específicamente inmunoreactivas con p110\delta. Las células huéspedes de la invención también resultan útiles en métodos para la producción a gran escala de p110\delta en los que las células se cultivan en un medio de cultivo adecuado y los productos polipeptídicos deseados se aíslan de las células o del medio en el que se cultivan las células por ejemplo, por purificación mediante inmunoafinidad.
Según se describe aquí, p110\delta es un polipéptido que posee actividad catalítica de quinasa.
En un aspecto, la presente invención ofrece polipéptidos p110\delta que comprenden los residuos de aminoácidos según la SEQ ID NO:2. El dominio catalítico del polipéptido p110\delta (residuos aminoácido 723-1044 de la SEQ ID NO:2) presentan más del 72% de identidad con el dominio catalítico de p110\delta. Los polipéptidos de esta invención presentan una identidad con el dominio catalítico de p110\delta de 75% o más.
La presente invención ofrece, en otro aspecto más, fragmentos de polipéptido o análogos de p110\delta. Los fragmentos de p110\delta resultan útiles en la modulación del enlace de p110\delta y un elemento de enlace (por ejemplo p85, Ras, y receptores de factor de crecimiento). Los análogos son polipéptidos, en los cuales se han realizado adiciones, sustituciones, inclusive sustituciones conservativas, o deleciones de residuos de aminoácidos con el objeto de incrementar o reducir la afinidad de fijación del análogo y un elemento de enlace. Estos análogos de p110\delta pueden resultar útil para modular (por ejemplo bloquear, inhibir o estimular) la interacción entre p110\delta y un elemento de enlace.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados para facilitar el paso al interior de la célula, conjugándolos por ejemplo con una mitad soluble de lípido. Por ejemplo, el p110\delta (o fragmentos o análogos del mismo) se pueden conjugar para obtener ácido mirístico. Los péptidos pueden ser miristolilados utilizando técnicas standard como las descritas en Eichholtz et al., J. Biol. Chem. 268: 1982-1986 (1993), que se incorporan aquí a modo de referencia. Alternativamente, los péptidos se pueden envasar en liposomas que se pueden fundir con membranas celulares y administrar los péptidos dentro de las células. La encapsulación de los péptidos en liposomas también puede realizarse utilizando técnicas standard tales como se describen en general en las patentes US 4,766,046; 5,169,637; 5,180,713; 5,185,154; 5,204,112 y 5,252,263 y la solicitud PCT 92/02244, que se incorporan aquí a modo de referencia.
En otro aspecto de la invención, se ofrecen sustancias anticuerpo (por ejemplo anticuerpos policlonales y monoclonales, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos híbridos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados y similares), específicamente inmunoreactivos con p110\delta. Las sustancias anticuerpos se pueden preparar utilizando técnicas standard, en las que se recurre a p110\delta recombinantes o naturales. Como anticuerpo monoclonales que ilustran específicamente la presente invención se puede citar el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma 208F, que fue depositada por la American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, el 8 de octubre de 1996 y a la que se asignó el número de adhesión HB 12200. Las sustancias anticuerpo resultan útiles para modular (p. e., bloquear, inhibir o estimular) la unión entre p110\delta y su elemento de enlace. Las sustancias anticuerpo también resultan útiles para purificar p110\delta y también para detectar y cuantificar p110\delta en muestras biológicas, utilizando procedimientos inmunológicos conocidos. Se contemplan también líneas celulares (p. e. hibridomas) o líneas celulares transformadas con constructos de expresión recombinante que producen sustancias anticuerpo de la invención.
En otro aspecto, se contemplan métodos para identificar un modulador que inhibe o activa la actividad quinasa de p110\delta. En un método preferido, se determina y compara la actividad quinasa de p110\delta en presencia y ausencia de un compuesto modulador potencial. Una reducción en la actividad de quinasa observada en presencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un inhibidor. Un aumento de la actividad quinasa observado en presencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un activador.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para identificar un modulador que afecte la unión de p110\delta y un elemento de enlace (p. e, p85, Ras y receptores de factor de crecimiento) y aumente o reduzca la concentración subcelular específica eficaz de p110\delta. En este método, p110\delta y su elemento de enlace se incuban en presencia y ausencia de un modulador putativo en condiciones adecuadas para la unión. Se compara la unión observada en presencia y en ausencia del compuesto modulador. Una reducción en la unión observada indica que el compuesto inhibe la unión. Un aumento en la unión observada indica que el compuesto aumenta la unión. Estos moduladores resultan útiles para circunscribir p110\delta a un lugar subcelular específico.
La presente invención ofrece además un método para detectar la presencia de p110\delta en una muestra biológica. El método comprende la exposición de un anticuerpo específico p110\delta a una muestra biológica que se va a ensayar. La unión del anticuerpo específico p110\delta con p110\delta en la muestra biológica se detecta utilizando medios bien conocidos. Por ejemplo, para detectar el anticuerpo anti-p110\delta se utiliza un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) que reconoce específicamente el anticuerpo anti-p110\delta. Una reacción de color positiva, catalizada por HRP indica que se encuentra presente p110\delta en la muestra biológica.
En otro aspecto más, la presente invención ofrece un reactivo diagnóstico para detectar la presencia de polinucleótidos que codifican p110\delta en muestras biológicas. El reactivo diagnóstico es un polinucleótido etiquetado de forma detectable, que codifica la totalidad o parte de los residuos de aminoácidos de p110\delta expuestos en SEQ ID NO:2. La presencia del polinucleótido en la muestra biológica queda determinada por la hibridación del reactivo de diagnóstico del polinucleótido que codifica p110\delta. Como ejemplos de muestras biológicas, se pueden mencionar los cromosomas y el ADN cromosomal. El reactivo diagnóstico se rotula de forma detectable con etiquetas bien conocidas, inclusive ligantes radioactivos, enzimáticos u otros como avidina/biotina y marcas fluorescentes que pueden proporcionar una señal detectable.
La información de la secuencia ADN proporcionada por la presente invención también permite el desarrollo, mediante estrategias de recombinación homóloga o "knockout" [véase p. e. Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)] de mamíferos que no expresan un p110\delta funcional o que expresan un análogo variante de p110\delta. Los mamíferos no humanos de la presente invención comprenden un gen p110\delta destruido o un homólogo destruido del gen p110\delta. La estrategia general utilizada para producir los mamíferos no humanos de la presente invención comprenden la preparación de un constructo de referencia, que comprende secuencias de ADN homólogas al gen endógeno a destruir. El constructo de referencia se introduce entonces en células madres embriónicas no humanas (células ES) integrándose en el gen endógeno u homólogo del mismo y destruyéndolo. Tras elegir las células que incluyen la destrucción deseada, las células ES elegidas se implantan en un embrión no humano en la etapa de blastocisto. Como ejemplares de mamíferos, se pueden citar conejos y especies roedoras.
Se espera también que los polinucleótidos de la invención sean útiles en estudios de circunscripción/localización cromosonal potencialmente útiles en la detección de expresión inadecuada y/o sobre-expresión de p110\delta en tipos de células anormales.
La invención también proporciona polinucleótidos antisentido adecuados para regular la expresión de p110\delta mediante las células que suelen expresarlo.
Otros numerosos aspectos y ventajas de la presente invención se podrán apreciar en la descripción detallada de realizaciones ilustrativas de la misma.
La figura 1 presenta una alineación del dominio catalítico previsto de p110\delta con el dominio correspondiente de otros miembros de la familia de PI 3-quinasa. La alineación se realizó utilizando Geneworks (Intelligenetics, Inc., Mountain View, CA).
La figura 2 presenta una alineación de la región reguladora Ras prevista de p110\delta con la región correspondiente de otros miembros de la familia de PI 3-quinasa. La lisina conservada, que es esencial para la interacción con Ras, se indica con el símbolo # debajo de la línea de consenso.
La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos. El ejemplo 1 describe la clonación y caracterización de cADN de codificación de p110\delta. Se obtuvo p110\delta combinando tres clones cADN separados que se extienden sobre toda la longitud p110\delta cADN. El ejemplo 2 describe la expresión y la actividad quinasa de recombinante p110\delta. El ejemplo 3 describe el aislamiento de un clon p110\delta genómico de ratón. En ejemplo 4, se describe la expresión de baculovirus de p110\delta. El ejemplo 5 evalúa la capacidad del recombinante p110\delta para asociarse con p85 en células de mamífero transfectadas. En el ejemplo 6, se muestra la expresión de p110\delta en diversos tejidos humanos. El ejemplo 7 proporciona anticuerpos monoclonales específicos de p110\delta. El ejemplo 8 describe experimentos dirigidos a la localización/circunscripción cromosomal de p110\delta. El ejemplo 9 describe experimentos relacionados con la asociación de p110\delta y receptores del factor de crecimiento. El ejemplo 10 trata de la utilización de animales transgénicos proyectados para incluir una destrucción en el gen p110\delta.
Ejemplo 1
Se diseñaron iniciadores de oligonucleótido degenerados para utilizarlos en una reacción PCR, basada eh secuencias conservadas en el domino catalítico de PI 3-quinasas conocidas. El iniciador de sentido era GCAGACGGATCCG
GIGAYGAYHKIAGRACARGA (SEQ ID NO:3) que codifica la secuencia GDDL RQD (SEQ ID NO:4) y el iniciador anti-sentido fue GCAGACGAATTCRWRICCRAARTCIRYRTG (SEQ ID NO:5) que codifica la secuencia de aminoácidos HIDFGH (SEQ ID NO:6). Las zonas de restricción Bam HI y Eco RI están subrayadas. Las reacciones PCR estaban constituidas por 100 ng de molde (template) cADN [de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) activada durante 18 horas con 10 ng/ml de miristato de forbol y 250 ng/ml de ionóforo de calcio (Sigma), 10 \mug/ ml de iniciadores oligonucleótidos, 50 mM KCl, 10mM Tris HCl (pH 8,4), 1,5 mM MgCl_{2}, 200 mM dNTPs y 1 U de polimerasa Taq en un volumen final de 100 \mul. Las reacciones se realizaron utilizando desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, hibridación a 60ºC durante 2 minutos y extensión a 72ºC durante 1 minuto durante 3 ciclos. El procedimiento se repitió entonces utilizando temperatura de hibridación de 56ºC durante 3 ciclos, temperatura de hibridación de 52ºC durante 3 ciclos y 50ºC de temperatura de hibridación durante 30 ciclos. Los productos multiplicados se sometieron a purificación de gel, digestión con Bam HI y Eco RI y se subclonaron en el vector pBSSKII+ (Stratagene, La Jolla, CA) para la secuenciación. Todo el ADN para la secuenciación se preparó utilizando el Sistema de Purificación de ADN Wizard Miniprep (Promega, Madison, WI). La secuenciación se realizó en el secuenciador automático Modelo 373 de Applied Biosystems. Se realizaron búsquedas en la base datos utilizando el programa BLAST y se realizaron alineaciones de proteína y ADN utilizando el programa Geneworks (Intelligenetics Inc. Mountain View Ca.). Un clon contenía un inserto de 399 bp que codificaba un marco de lectura abierto de 133 aminoácidos con semejanza con p110\delta.
Este clon era un clon parcial de una nueva subunidad catalítica de PI 3-quinasa designada p110\delta.
Para identificar un cADN que codifica p110\delta, se diseñaron iniciadores específicos de oligonucleótido en base a la secuencia del producto PCR 399 bp. El iniciador directo era CATGCTGACCCTGCAGATGAT (SEQ ID NO:7) y el iniciador inverso era AACAGCTGCCACTCTCTCGG (SEQ ID NO:8). Estos iniciadores se utilizaron para examinar una biblioteca cADN de PBMC humano estimulado con PMA e ionomicina (según lo descrito anteriormente) en el vector de expresión de mamífero pRc-CMV. Se realizaron series sucesivas de PCR inicialmente sobre agrupaciones de 100.000 clones y ulteriormente sobre agrupaciones más pequeñas hasta aislar un solo clon designado PBMC # 249 por hibridación por réplica (colony hybridization) utilizando el producto PCR marcado por cebado aleatorio como sonda. Este cADN no era de longitud normal. Por ello, para identificar clones cADN más largos se utilizó el mismo método que para examinar una biblioteca cADN de macrófagos humanos (también en el vector pRcCMV). Esto condujo al aislamiento de un clon cADN adicional (M#928) que ampliaba en 1302 bp la secuencia cADN.
El extremo restante 5' del cADN de codificación de p110\delta se obtuvo por 5' RACE PCR (Clonetech, Palo Alto, CA). Se diseñaron dos iniciadores de oligonucleótido gen-específico anti-sentido en base al extremo 5' de cADN M#928' para reacciones RACE PCR. El iniciador principal RACE era GGGCCACATGTAGAGGCAGCGTTCCC (SEQ ID NO:9) y el iniciador RACE encajado era GGCCCAGGCAATGGGGCGTCCGCC (SEQ ID NO:10). Se realizaron las reacciones Marathon-RACE utilizando una matriz cADN lista de Marathon de leucocitos humanos y el kit Advantage Core PCR Reaction (Clonetech, Palo Alto, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Se modificaron las condiciones de repetición Touchdown PCR para mejorar la especificidad de la reacción principal Marathon-RACE PCR en la forma indicada a continuación: desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos, seguido de 5 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg. e hibridación y extensión a 72ºC durante 3 minutos; 5 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg. e hibridación y extensión a 70ºC durante 3 minutos; y 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg. e hibridación y extensión a 68ºC durante 3 minutos.
Los productos multiplicados se utilizaron como matrices en una reacción PCR encajada utilizando los parámetros de repetición descritos anteriormente. Los productos remultiplicados se analizaron entonces por transferencia Southern utilizando sondas oligonucleótidas específicas de p110\delta. Las sondas se marcaron en su extremo (10 ng cada una) con ^{32}P-\gammaATP y se hibridaron y lavaron en condiciones standard (Frisch and Sambrook). Las secuencias de las dos sondas fueron GATGCGGAACGGCTGCTCCAGGG (SEQ ID NO:11) y CCAGGGACCACAGGGACACAGAG (SEQ ID NO:12).
Los productos específicos 5' RACE PCR identificados de este modo se purificaron en gel y se subclonaron en el vector TA PCRII (Invitrogen, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron 3 clones independientes para garantizar la veracidad de la secuencia 5'.
Se ensambló un cADN de longitud normal para p110\delta a partir de clones #249, M#928 y los productos 5' RACE PCR. El producto 5' RACE se utilizó como matriz en PCR utilizando el iniciador 5' GTTACGGATCCGGCACCATG(GACTACAAGGACGATGAC AAG(CCCCCTGGGGTGGACTGCCC(SEQ ID NO:13) y el iniciador 3' CCACATGTAGAGGCAGCGTTCC (SEQ ID NO:14). El iniciador 5' incluye una zona Bam HI (subrayada) y unas secuencias que codifican la secuencia peptídica FLAG DYKDDDDK (SEQ ID NO:15) (mostrada entre paréntesis) que es reconocida por el anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 (Kodak Scientific Imaging Systems,. New Haven, CT). El producto PCR.se digirió con Bam HI y Afl II y se ligó con un fragmento de Afl II/Pvu I derivado del clon M#928 y un fragmento de Pvu II/Xba I derivado del clon PBMC #249 en las zonas Bam HI/Xba I del vector de expresión de mamífero pcADN3 (Invitrogen, San Diego, CA). El vector que contiene el compuesto marcado FLAG p110\delta cADN se denomina pCADN3:p110\deltaFLAG. En el p110\delta marcado FLAG la marca FLAG está situada inmediatamente después de la metionina de iniciación.
En SEQ ID NO:1 se muestra un cADN compuesto de longitud normal que codifica p110\delta. La secuencia de p110\delta incluye un marco de lectura abierta de 3135 nucleótidos, que se prevé codifique una proteína de aproximadamente 114 KD. Además, hay 197 bp de 5' y 1894 bp de secuencia no traducida 3'. La secuencia en torno a la metionina de iniciación prevista coincide bien con lo requerido para la iniciación translacional óptima. [Kozak, M., J. Cell Biol., 115:887-992 (1991)] y la presencia de codones de terminación en la secuencia no traducida 5' es consiste con el aislamiento de la región de codificación completa de p110\delta.
La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de p110\delta (SEQ ID NO:2) con otras PI 3-quinasas revela que está muy estrechamente relacionada con p110\beta. De forma similar a p110\beta, el dominio catalítico de p110\delta se encuentra en el término C de la proteína y se cree que reside dentro de los residuos de aminoácidos 723-1044 de SEQ ID NO:2. En la figura 1 se muestra una alineación de los dominios catalíticos terminales carboxilo previstos en la familia de PI 3-quinasa (inclusive residuos de p110\delta 723 a 1044 de SEQ ID NO:2). El cuadro 1 muestra la identidad de p110\delta con otros miembros de la familia de la PI 3-quinasa. p110\delta es idéntico en un 72% a p110\beta en esta región, aunque está menos estrechamente relacionado con p110\alpha (49%) y p110\gamma (45%). El cuadro 1 muestra también que p110\delta presenta menos identidad con cpk/p170 y la proteína Vps34 de levadura, 31 y 32% respectivamente.
CUADRO 1
16
El análisis del dendrograma reveló que p110\beta y p110\delta forman una sub-rama distinta de la familia de la PI 3-quinasa. Se han incluido en la comparación el gen ATM remotamente relacionado y la subunidad catalítica de quinasa proteína dependiente de ADN.
Se ha demostrado que PI 3-quinasa es un intermediario importante en la ruta Ras [Hu et al., 1993; Rodríguez-Viciana et al., EMBO Journal, 15: 2442-2451 (1996)]. Una forma constitutivamente activa de PI 3-quinasa aumenta, como se ha visto, la transcripción del gen c-fos activa la proteína quinasa Raf y estimula la maduración del ovocito [Hu et al., 1995]. Los efectos de la PI 3-quinasa en estos sistemas pueden bloquearse mediante la co-expresión de una forma negativa dominante de Ras, que indica que PI 3-quinasa actúa corriente arriba de Ras. Unos estudios adicionales han mostrado que Ras puede interaccionar físicamente con PI 3-quinasa in vitro y estimular su actividad de quinasa [Rodríguez-Viciana et al., 1996]. Por consiguiente, PI 3-quinasa puede actuar como efector de señalización dependiente de Ras o ser activada directamente por interacción con Ras. Una región específica en el término amino de las subunidades p110 denominada el dominio regulatorio Ras es responsable de esta interacción [Rodríguez-Viciana et al., 1996]. La comparación de la secuencia de p110\delta con otras subunidades p110 indica que esta región se conserva también en p110\delta, incluyendo un residuo de lisina que según se ha visto, es esencial para la asociación física con Ras (Rodríguez-Viciana et al., 1996). Por consiguiente, p110\delta interactúa probablemente también con la ruta Ras. La figura 2 presenta una alineación de las zonas de fijación Ras propusetas de 4 subunidades pilo, que incluyen residuos p110\delta 141 a 310 de la SEQ ID NO:2.
Ejemplo 2
El p110\delta marcado FLAG se expresó transfectando pCADN3:p110\deltaFLAG en células COS utilizando dextrano DEAE. Tres días después de la transfección, se determinó la expresión de p110\delta por inmunoprecipitaciones y transferencia western utilizando el anticuerpo monoclonal M2 (Kodak Scientific Imaging Systems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad de la PI 3-quinasa en la forma descrita [Hu et al., Mol. Cell. Biol., 13:7677-7688 (1993)].
Para determinar la actividad de PI 3-quinasa de p110\delta, se mezclaron 5 \mul de p110\delta inmuno precipitado con 1 \mul de PI/EGTA y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos [PI/EGTA es 10 mg/ml PI (Sigma) en CHCl_{3}, que se ha secado bajo vacío, vuelto a suspender en 20 mg/ml DMSO en presencia o ausencia de diversas concentraciones de wortmannina inhibidora de PI3 quinasa y diluido 1:10 en 5mM EGTA] y se añadió a 1 \mul tampón 10X HM (200mM HEPES pH7,2, 50mM MnCl_{2}), 0,5 \mul \gamma^{32}PATP (10mCi/ml 300Ci/mmol), 1 \mul 100 \muM ATP, y 1,5 \mul H_{2}O y se incubó a 30ºC durante 15 minutos. Las reacciones se terminaron añadiendo 100 \mul 1M HCl. Se extrajeron lípidos con 200 \mul CHCl_{3}/MeOH (1:1), realizando un movimiento vorticial durante 1 minuto seguido de centrifugación a 16.000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Los lípidos se siguieron extrayendo con 80 \mul 1M HCl/MeOH (1:1), realizando un movimiento vorticial durante 1 minuto, seguido de centrifugación a 16.000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Los lípidos se secaron bajo vacío, se resuspendieron en 10 \mul CHCl_{3}/MeOH (1:1) y se situaron/observaron a 2 cm del fondo de una placa de cromatografía 60 de gel de sílice seca (VWR), que había sido pre-impregnada con 1% de K_{2}C_{2}O_{4} en H_{2}O. Se situaron como marcadores 250 \mug de fosfoinositidos crudos (Sigma). Los productos se resolvieron por cromatografía durante 2 horas en CHCl_{3}/MeOH/4N NH_{4}OH (9:7:2), se dejaron secar y se colocaron en un depósito de vapor de yodo durante 5 minutos con el objeto de visualizar los patrones (standards) crudos. La posición de los standards se marcó con un lápiz y se hizo una autoradiografía de la placa.
Se generaron lípidos fosforilados en los ensayos de quinasa. El producto principal fue el fosfatidil inositol fosfato (PIP). Además, la generación de estos lípidos fosforilados se inhibió, dependiendo de la dosis, con wortmannina (aproximadamente 50% de la actividad se inhibió con 100 nM de wortmannina) lo cual demuestra que p110\delta es una PI 3-quinasa funcional.
Ejemplo 3
Se aisló en la forma descrita a continuación un gen genómico de ratón que codifica p110\delta. Se examinó una biblioteca genómica lambda 129 SvEv de ratón (Stratagene, La Jolla, Ca) utilizando un fragmento del clon cADN humano para p110\delta (que corresponde a los aminoácidos 739 a 1044 de la SEQ ID NO:2), etiquetado con elevada actividad específica (^{\sim}1 x 10^{9} dpm/\mug ADN) por cebado aleatorio utilizando el kit de marcado de ADN cebado aleatoriamente (Boehringer Mannheim). La hibridación se realizó durante 16 horas a 42ºC en un tampón que contenía 50% de formamida, 5X SSC, 5 X Denhardts, 0,05M fosfato Na y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. Se lavaron los filtros en 0,2 XSSC/0,1% SDS a 50ºC. Se aisló un solo clon. Se digirió ADN de fago purificado con Not I y se subclonaron insertos en el vector pBSSKII+ (Stratagene, La Jolla, Ca) para la secuenciación. Este clon era de aproximadamente 16kb e incluía la totalidad de la región catalítica de p110\delta.
Ejemplo 4
El p110\delta recombinante se puede expresar en células de insecto SF9 utilizando un sistema de expresión de baculovirus.
Según lo tratado en el ejemplo 1, las secuencias de codificación p110\delta marcadas FLAG resultan útiles en la expresión de las quinasas de la presente invención. Tras la expresión en células de insecto, se utiliza un anticuerpo monoclonal que reconoce la marca FLAG (Eastman Kodak, Rochester, Nueva York), para purificar grandes cantidades de la proteína de fusión de quinasa relacionada con PIK-FLAG. Las células de insecto infectadas son incubadas durante 48 horas y lisadas en tampón de lisis (25mM 2-glicerolfostato, 50mM fosfato sódico pH 7,2, 0,5% Triton-X 100, 2mM EDTA, 2mM EGTA, 25 mM fluoruro sódico, 100 \muM de vanadato sódico, 1mM PMSF, 1 \mug/ml leupeptina, 1 \mug/ml pepstatina, 1mM de benzamidina y 2mM DTT). Las proteínas de fusión FLAG expresadas se purifican sobre una columna que contiene resina de afinidad anticuerpo M2 anti-FLAG (Eastman Kodak). La columna se lava con 2 volúmenes de columna de tampón de lisis y luego 5 volúmenes de columna de cloruro de litio 0,5M, 50mM Tris pH 7, 6, 1mM DTT y luego se eluye con 0,1M glicina pH 3,0 seguido de neutralización inmediata o por elusión competitiva con el péptido FLAG. Para proteínas marcada con histidina se utiliza agarosa Ni-NTA (Qiagen) para purificación de la proteína.
Los plásmidos para la expresión de p85 y p110\delta en el sistema de expresión de baculovirus se prepararon del siguiente modo.
El plásmido pcADN3:p85 ADN descrito en el ejemplo 5 se digirió con BamHI y EcoRI y la banda 2,5 kb FLAG-p85 que contiene toda la región de codificación de p85 con la marca FLAG se purificó en gel y se insertó en la zona BamHI-EcoRI de pFastbac Dual (Gibco BRL). La mezcla de ligación se transformó en XL-1 azul E. coli (Stratagene) y se cultivó en una placa que contenía ampicilina. Se purificó un clon que lleva el plásmido pFastbac-Dual-p85.
El plásmido pFastbac-Dual-p85 se transformó en células Bac DH10 E. coli y se seleccionaron colonias blancas sobre placas que contenían kanomicina gentamicina, tetraciolina, X-gel e IPTG. Se re-estrió una colonia blanca en una placa similar para la re-purificación. Se purificó a partir de este clon ADN p85-bacmid recombinante.
El plásmido pcADN3:p110\delta que contiene toda la región de codificación de p110\delta con la marca FLAG se digirió con BamHI y XbaI, se purificó en gel y se insertó en la zona BamHI-XbaI de pFastbac HTb (Gibco BRL), de modo que la región de codificación de p110\delta marcado FLAG se encontraba encuadrada (in frame) con las secuencias de codificación de la marca de histidina presente en el vector. La mezcla de ligación se transformó entonces en XL-1 azul E. coli (Stratagene). Se aisló un clon que llevaba pFast-bac htb p110\delta y del plásmido ADN se aisló y se purificó. Se preparó ADN p110\delta-bacmid transformando células bac DH10 E. coli en la forma descrita para p85-bacmid.
Para preparar stocks (linajes) de virus, se transfectaron por separado los ADN p85-bacmid y p110\delta-bacmid en células SF9 según el protocolo sugerido por Gibco BRL. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recolectó el nódulo celular SF9 y el baculovirus producidos por las células transfectadas. El virus se almacenó a 4ºC en medio completo de Grace que contenía 10% FBS, penicilin-estreptomicina y gentamicina. Este prep viral se utilizó para realizar un linaje de virus (P2) de alto valor. El linaje de virus P2 se utilizó para infectar 50 ml de cultivo de células SF9. Las células se recogieron 48 horas después de la infección y se centrifugaron a baja velocidad para granular las células sin lisis. El gránulo celular se almacenó a -20ºC durante 24 hora antes de la lisis. Las células se lisaron en 5 ml de tampón de lisis (50 mM Tris, pH 8,0; 500 mM NaCl; 1% NP40; 1001Am PMSF). La expresión de p85 y p110\delta se confirmó por inmuno-transferencia utilizando como sonda el anti-FLAG anticuerpo M2. Las células transfectadas SF9 produjeron una proteína de aproximadamente 85 kDa y una proteína 11 kDa que eran inmunoreactivas con anticuerpos anti-FLAG.
También se utilizó el linaje del virus P2 para co-infectar un cultivo de 2 litros de células SF9. Las células se recogieron 48 horas después de la infección, se centrifugaron a baja velocidad para granular las células sin lisis y se almacenaron a -20ºC. Un gránulo celular de 150 mis de este cultivo se lisó en 7,5 ml de tampón de lisis (50 mM NaPO_{4} pH 7,2; 0,5% NP-40; 10mM imidazol, 25mM NaF, 100 \muM 100 \muM Na_{3}VO_{4}; 0,5 mM AEBSF; 1 \mug/ml leupeptina; 1 \mug/ml pepstatina A) y se incubó sobre hielo durante 15 minutos. El lisado se centrifugó entonces durante 30 minutos a 10.000 x g. El sobrenadante se quitó y el posible ADN en el lisado procedentes de núcleos rotos se disgregó aspirando por una aguja de calibre 20. La materia en forma de partículas se eliminó filtrando a través de un filtro de 0,8 micras seguido de un filtro de 0,2 micras. Este lisado aclarado se ajustó hasta contener 5 mM \beta-mercaptoetanol y 0,4M NaCl. Se equilibró una columna de 1 ml Ni-NTA-agarosa (Qiagen) en tampón A (0,4 M NaCl; 5mM \beta-mercaptoetanol; 0,1% Triton X-100; 50 mM NaPO_{4}, 10 mM imidazol; 25 mM NaF, 100 \muM Na_{3}VO_{4}; 0,5 mM AEBSF; 1 \mug/ml leupeptina; 1 \mug/ml pepstatina A) antes de cargar el lisado aclarado. La muestra se cargó entonces a una velocidad de 0,25 ml/minuto, se lavó 5 ml de ampón A y luego e eluyó en 10 ml de un gradiente de 50 a 500 mM imidazol en tampón A.
Ejemplo 5
La capacidad de p110\delta para asociarse con p85 se evaluó con análisis de transferencia Western. Se transfectaron transitoriamente células COS con p110\delta (véase ej. 2) y la asociación con p85 endógeno se determinó por co-inmuno-precipitación. Como controles, se transfectaron también células con ADN p85 marcado FLAG o vector vacío. El cADN que codifica la subunidad p85 se aisló del cADN de leucocito humano por Marathon-race PCR. La secuencia cADN de p85 se describe en Otsu, Cell, 65:91-104 (1992). El cADN p85 se modificó para su expresión como proteína marcada FLAG (pcADN3:p85) de una forma similar a los protocolos descritos aquí para p110\delta.
Se lisaron células COS en 3ml de tampón R (1% Triton X-100, 150mM NaCl, 10mM Tris pH 7,5, 1mM EGTA, 0,5% NP40, 0,2mM Na_{3}VO_{4}, 0,2mM PMSF, 1X aprotinina, 1X leupeptina, 1X pepstatina A). Después de 10 minutos a 4ºC, los lisados se disgregaron haciéndolos pasar por una aguja de calibre 27 varias veces. Los lisados se aclararon por centrifugación a 16.000 x g durante 10 minutos a 4ºC y se inmunoprecipitaron durante 2 horas a 4ºC con 1 \mug anti-p110\delta (Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), 10 \mug anti-FLAG-M2 (Eastman Kodak), o 1 \mug anti-p85 (Santa Cruz Laboratories). Se fijaron complejos inmunes a 60 \mul de proteína G-sefarosa (Pharmacia) durante 30 minutos a 4ºC y luego se lavaron tres veces en 300 \mul de tampón R y se resuspendieron en 25 \mul PAN (100 mM NaCl, 10mM PIPES pH 7,0, 20 \mug/ml Aprotinina), 5 \mul de cada inmunoprecipitado se resolvieron con 8% SDS-PAGE (Novex), se transfirieron a Immobilon-P (Millipore), se bloquearon una hora a temperatura ambiente en leche seca no grasa al 5% en TBS y se detectaron por transferencia Western utilizando anticuerpos policlonales de conejo anti-p85 (Santa Cruz Laboratories) a 1 \mug/ml seguido de anticuerpo secundario conjugado HRP IgG anti-ratón-cabra (Boehringer) o anticuerpo monoclonal anti-FLAG-M2 a 10 \mug/ml seguido de anticuerpo secundario conjugado HRP IgG anti-ratón-cabra (Boehringer).
Las transferencias Western mostraron que el anticuerpo anti-FLAG-M2 reconocía complejos inmunes inclusive p85 marcado FLAG y p110\delta marcado FLAG.
Ejemplo 6
Aunque la activación de la PI 3-quinasa ha sido estudiada detenidamente en una amplia gama de sistemas biológicos, se conoce menos la expresión específica de tipo celular de isoformas particulares de p110. La expresión de p110\delta en el corazón, el cerebro, la placenta, el pulmón, el hígado, los músculos del esqueleto, el riñón, el páncreas, el bazo, el timo, la próstata, los testículos, el útero, el intestino delgado, el colon y PBMC humano, se determinó por análisis de transferencia Northern.
Se prepararon sondas cADN marcadas ^{32}P por PCR utilizando 10 ng de matriz ADN plásmido que codifica p110\delta, según lo indicado anteriormente [Godiska et al., J. Neuroimmun 58:167-176 (1995)]. El iniciador directo era TGCCATGTTGCTCTTGTTGA (SEQ ID NO:16) y el iniciador inverso era GAGTTCGACATCAACATC (SEQ ID NO:17). Las reacciones de calentaron durante 4 minutos a 94ºC, seguido de 15 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, hibridación durante 1 minuto a 55ºC y extensión durante 2 minutos a 72ºC.
Los nucleotídos no incorporados se eliminaron haciendo pasar la reacción por una columna Sephadex G50 (Boehringer Mannheim Biochemicals). Se probó una transferencia Northern de tejido múltiple (Clontech, Palo alto, CA) y se lavó en condiciones rigurosas según las recomendaciones del fabricante. La autoradiografia se expuso durante 1-4 días a 80ºC con pantallas reforzadoras.
El análisis de transferencia Northern reveló una sola transcripción de aproximadamente 5,4 kb (consistente con el tamaño del cADN compuesto). Los máximos niveles de expresión se vieron en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) así como en el bazo y en el timo. Tras una exposición prolongada de la autoradiografía, se pudo detectar también la expresión de p110\delta en testículos, útero, colon e intestino delgado pero no en otros tejidos examinados, inclusive la próstata, el corazón, el cerebro y el hígado. Por el contrario, p110\beta se expresa a niveles elevados en el cerebro, el corazón, el riñón y el hígado pero no se puede detectar fácilmente en tejidos linfoides como el bazo. El p110\beta se expresa a niveles elevados en la línea de célula T Jurkat transformada (HU et al., 1993). La expresión de la isoforma de p110\alpha no ha sido bien documentada.
Se ha visto que las isoformas p110 difieren con respecto a sus especificidades de substrato preferido [Stephens et al., Current Biology, 4:203-214 (1994)]. A la vista de su potencial de interacción con una proteína adaptadora p85 común, es probable que la naturaleza de los lípidos fosforilados generados en respuesta a un agonista particular pueda regularse por lo menos parcialmente mediante la expresión específica célula/tejido de las diversas isoformas de la actividad enzimática de quinasa. La abundante expresión de p110\delta en PBL y tejidos linfoides tales como bazo y timo, sugiere que esta isoforma puede estar involucrada en aspectos de la activación de los leucocitos.
Ejemplo 7
Se generaron anticuerpos monoclonales contra la parte terminal carboxi de p110\delta (aminoácidos 740-1044 de la SEQ ID NO:2) expresado como proteína de fusión con glutatione S transferasa (GST) [Pharmacia, Alameda, CA]. Se inmunizaron subcutáneamente 5 ratones BALB/c (Charles River Biotechnical Services, Inc, Wilmington, Massachussets, IACUC nº 90113) con 30 \mug de antígeno en adyuvante completo de Freunds [CFA] (Sigma), se administró el día 22 una segunda inmunización de 30 \mug de antígeno en adyuvante incompleto de Freunds (IFA) (Sigma). Una tercera inmunización con 30 \mug de antígeno en IFA se administró el día 44. El suero inmune se recogió por sangrado retro orbital el día 55 y se comprobó con transferencia Western para determinar la reactividad a p110\delta. Todos los animales mostraron actividad hacia el inmunógeno y se inmunizaron una cuarta vez el día 66 con 30 \mug de antígeno en IFA. El suero inmune se recogió por sangrado retro orbital el día 76 y se comprobó por transferencia Western para determinar su reactividad; el animal nº. 2321 mostró el máximo nivel de inmuno reactividad y se eligió para la fusión. El día 367 y el 368 se inyectó intra peritonealmente al ratón nº 2321, 50 \mug de antígeno en PBS y se realizó una fusión el día 371.
Se extirpó estérilmente el bazo y se formó una suspensión monocelular picando el bazo entre los extremos helados de dos portaobjetos de cristal de microscopio sumergidos en suero libre de RPMI 1640, suplementado con 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato sódico, 100 unidades/ml penicilina, y 100 \mug/ ml estreptomicina (RPMI) (Gibco, Canadá). La suspensión celular se filtró por un colador celular Nitex estéril de 70 mallas (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey), y se lavó dos veces centrifugando a 200 g durante 5 minutos y resuspendiendo el gránulo en 20 ml de suero libre de RPMI. Se prepararon del mismo modo los timocitos tomados de 3 ratones Balb/c sin tratamiento
previo.
Se combinaron dos x 10^{8} células de bazo con 4 x l0^{7} células NS-1 (mantenidas en fase log en RPMI con 11% de suero bovino fetal (FBS) durante tres días antes de la fusión), se centrifugaron y se aspiró el sobrenadante. El gránulo celular se sacó derivando el tubo y se añadieron 2 ml de PEG 1500 a 37ºC (50% en 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim), agitando durante 1 minuto, y seguidamente se añadieron 14 ml de suero libre de RPMI durante 7 minutos. Se añadieron 16 ml más de RPMI y las células se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos. Después de descartar el sobrenadante, el gránulo se resuspendió en 200 ml de RPMI que contenía 15% de FBS, 100 mM hipoxantina sódica, 0,4 mM aminopterina, 16 mM timidina (HAT) (Gibco), 25 unidades/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 10^{6} timocitos/ ml. La suspensión se preparó en 10 placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Reino Unido) a 200 \mul/pocillo. Las células se alimentaron los días 2,4 y 6 días después de la fusión aspirando 100 \mul de cada pocillo con una aguja de 18 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul/pocillo de medio que contenía 10 U/ml IL-6 y carecía de timocitos.
Cuando el crecimiento celular alcanzó una confluencia de 60-80% (día 8-10), se tomaron sobrenadantes del cultivo de cada pocillo y se examinó su reactividad a p110\delta por medio de ELISA. Se recubrieron 4 placas de Immulon (Dynatech, Cambridge, Massachussets) a 4ºC con 5 \mul/pocillo con 100 ng/pocillo de p110\delta:GST o GST en 50 mM de tampón de carbonato, pH 9,6. Las placas se lavaron tres veces con PBS con 0,05%, Tween 20 (PBST), se bloquearon durante 30 minutos a 37ºC con 0,5% de Gelatina de Piel de Pescado. Las placas se lavaron en la forma descrita anteriormente y se añadió 5O111 desóbrenadante de cultivo. Después de la incubación a 37ºC durante 30 minutos, se añadieron 50 \mul de peroxidasa de rábano picante conjugado con IgG (fc) anti-ratón-cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) [diluido 1:10.000 en PBST]. Las placas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos, se lavaron cuatro veces con PBST y se añadió 100 \mul de sustrato constituido por 1 mg/ml TMB (Sigma) y 0,15 ml/ml 30% H_{2}O_{2} en 100 mM citrato, pH 4,5. La reacción de color se detuvo a los tres minutos con la adición de 50 ml de H_{2}SO_{4} 15%. Se leyó A_{450} sobre un lector de placa (Dynatech).
Treinta y seis pocillos mostraban una reactividad preferente respecto a p110\delta comparado con GST. Se examinó entonces la reactividad de los sobrenadantes de estos pocillos al p110\delta recombinante mediante transferencia Western. Diez pocillos (208A, 208B, 208C, 208D, 208E, 208F, 208G,208H, 208I e 208J) mostraron reactividad por transferencia Western y se clonaron dos veces por dilución limitadora. 7-10 días más tarde, se probaron los pocillos elegidos mediante ELISA. Se mantuvo la actividad en las diez líneas. Los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares fueron isotipados mediante el ensayo ELISA. 208A, 208C, 208D, 208E, 208G, 208H, 208I eran IgG_{2a}, mientras que 208J era IgG_{1} y 208B era IgG2b. Un anticuerpo monoclonal de ejemplo producido por línea celular hibridoma 208F (ATCC HB 12200) mostró una alta reactividad con p110\delta y reconoció una proteína 110 kD en PMBC mediante análisis Western. El peso molecular de la proteína 110 kD es acorde con el peso molecular de p110\delta.
Ejemplo 8
Se han detectado niveles elevados de 3' fosfoinositidos fosforilados en células transformadas con onco-proteínas virales. Esta observación sugiere que las PI 3-quinasas pueden jugar un papel en la carcinogénesis. La circunscripción (localización) cromosomal de p110\delta permite conocer mejor el papel de la PI 3-quinasa en la carcinogénesis. Los estudios de circunscripción cromosomal de p110\delta de células cancerosas pueden identificar una expresión inadecuada y/o una sobre expresión de p110\delta.
Por ejemplo, en 90-95% de la leucemia mielogena crónica, existe una translocación cromosomal recíproca, que conduce a la transferencia de la tirosino quinasa c-abl del cromosoma 9 al gen ber en el cromosoma 22. La expresión inadecuada resultante de actividad de c-abl tirosina quinasa es importante para la transformación celular y la génesis tumoral. La circunscripción cromosomal de p110\delta se determina por fluorescencia en hibridación in situ (FISH) utilizando el cADN completo para p110\delta como sonda. De este modo, se identifica el papel de p110\delta en las translocaciones cromosomales observadas durante la génesis tumoral (por ejemplo leucomogénesis).
Ejemplo 9
Según ciertos informes, la actividad de Pi 3-quinasa está asociada con cierto número de receptores de factor de crecimiento. Además, se ha observado que la actividad de la PI 3-quinasa aumenta tras la activación celular. Los anticuerpos de p110\delta descritos en el ejemplo 5 se utilizan para determinar por transferencia Western e inmuno precipitación la naturaleza de los receptores con los cuales se asocia p110\delta. Estos anticuerpos resultan también útiles para elucidar la regulación de la actividad enzimática de la PI 3-quinasa y la localización celular durante la activación celular. A la vista de los elevados niveles de expresión de p110\delta en el sistema inmunitario, es probable que los receptores de factor de crecimiento que interviene en la activación inmunitaria puedan asociarse con o ser regulados por p110\delta. Estos receptores incluyen los receptores de célula T CD28 y receptores CD2 y de citoquina como IL-1 y IL-4, y receptores acoplados con tirosina quinasa como CSF-1 R.
Ejemplo 10
Para determinar el papel funcional de p110\delta in vivo, se inactiva el gen p110\delta en la línea germinal de mamíferos por recombinación homóloga. Los animales en los cuales se ha inactivado un gen endógeno por recombinación homóloga reciben también el nombre de animales "Knockout". Como ejemplos de mamíferos, se pueden citar los conejos y las especies roedoras como los ratones. Los animales "Knockout" se pueden preparar por métodos de recombinación homóloga que utilizan el clon genómico p110\delta del ejemplo 3.
Estos animales "Knockout" permiten determinar el papel de p110\delta en respuestas inmunitarias y proliferativas. El papel de p110\delta en respuestas inmunitarias y proliferativas se determina analizando el desarrollo del sistema inmunitario en estos animales (se determina mediante análisis FACS de poblaciones celulares a diferentes etapas del desarrollo), caracterización de la función efectora de las poblaciones linfoides maduras de estos animales tanto in vivo (determinado por respuestas de anticuerpos a antígenos inyectados, respuestas de célula T citotóxica a virus y/o líneas tumórales inyectadas, y la capacidad de rechazar aloinjertos) como in vitro (determinado por proliferación de linfocitos en respuesta alo-antígeno, activación policlonal por mitógenos/superantígenos y la capacidad de elaborar citoquinas).
13
(i)
SOLICITANTE: Chantry, David
\hskip3.9cm
Hoekstra, Meri F. 
\hskip3.9cm
Holtzman, Douglas A 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: Nueva lípido quinasa
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DOMICILIO POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Marshall O'Toole Gerstein Murray & Borun
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6300 Sears Tower/233 South Wacker Drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 60606
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disquete ordenador
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPOSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Noland, Greta E.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO REGISTRO: 35,302
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/DOCKET NÚMERO: 27866/33441
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INF. TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (312) 474-6300
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (312) 474-0448;
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 25-3856
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5220 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
UBICACIÓN: 196..3327
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
1
2
3
4
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1044 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9
10
11
12 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "n=inosine"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 24
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "n=inosine"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGACGGAT CCGGNGAYGA YHKNAGRCAR GA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGY: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Asp Leu Arg GIn Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "n = inosine"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "n=inosine"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGACGAAT TCRWRNCCRA ARTCNRYRTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Ile Asp Phe Gly His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGCTGACC CTGCAGATGA T 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACAGCTGCC CACTCTCTCG G 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN FOR SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCCACATG TAGAGGCAGC GTTCCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cADN
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCCAGGCA ATGGGGCAGT CCGCC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGCGGAAC GGCTGCTCCA GGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGGGACCA CAGGGACACA GAG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ, ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTACGGAT CCGGCACCAT GGACTACAAG GACGACGATG ACAAGCCCCC TGGGGTGGAC 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCCC 
\hfill
65 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACATGTAG AGGCAGCGTT CC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 amino ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGY: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ.ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGCCATGTT GCTCTTGTTG A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGTTCGACA TCAACATC 
\hfill

Claims (23)

1. Polinucleótido purificado y aislado que codifica la secuencia de aminoácido de p110\delta expuesta en la SEQ ID NO:2.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, siendo dicho polinucleótido un ADN.
3. El polinucleótido de la reivindicación 1, eligiéndose dicho polinucleótido dentro del grupo formado por un ADN genómico, un cADN y un ADN sintetizado químicamente.
4. El polinucleótido de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO:1.
5. El polinucleótido de la reivindicación 1, siendo dicho polinucleótido un ARN.
6. Un vector que comprende un ADN según reivindicación 2.
7. El vector de la reivindicación 6, en el que dicho ADN está ligado operativamente a una secuencia de ADN de control de expresión.
8. Una célula huésped transformada establemente o transfectada con un ADN según reivindicación 2.
9. Método para producir p110\delta, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped según reivindicación 8 en un medio nutriente adecuado y aislar el polipéptido expresado de la célula o del medio nutriente.
10. Polipéptido purificado y aislado, que comprende la secuencia de aminoácido p110\delta de la SEQ ID NO:2.
11. Sustancia anticuerpo, específicamente inmunoreactiva con el péptido de la reivindicación 10.
12. La sustancia anticuerpo de la reivindicación 11, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
13. Línea celular hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 12.
14. Línea celular hibridoma 208F (HB 12200).
15. El anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma de la reivindicación 14.
16. Un anticuerpo humanizado según reivindicación 11.
17. Método de identificación de un compuesto que es un modulador de 110\delta, con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, que comprende las siguientes etapas:
a)
determinación de la actividad de la quinasa del p110\delta en ausencia y en presencia del compuesto;
b)
comparación de las actividades de la quinasa observadas en la etapa (a); e
c)
identificación del compuesto como modulador del p110\delta, donde se observa una diferencia en la actividad de la quinasa en presencia y en ausencia de dicho compuesto.
18. Método de la determinación de la presencia de p110\delta, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2, en una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:
a)
exposición de un anticuerpo específico p110\delta a una muestra biológica; y
b)
detección de la interacción del anticuerpo específico p110\delta con el p110\delta en la muestra biológica.
19. Agente de diagnóstico, que comprende un polinucleótido rotulado de forma detectable que codifica parte o la totalidad de las secuencias de aminoácidos p110\delta expuestas en la SEQ ID NO:2.
20. Método de identificación de un compuesto, que es un modulador de fijación entre p110\delta que una tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:2 y el enlace correspondiente, que comprende las siguientes etapas:
a)
determinar el nivel de unión entre el p110\delta y el enlace correspondiente en ausencia y en presencia del compuesto;
b)
comparar el nivel de unión observado en la etapa (a); e
c)
identificar el compuesto como modulador de la unión entre el p110\delta y el enlace correspondiente, observándose una diferencia de unión en presencia y ausencia de dicho compuesto.
21. El método de la reivindicación 20, en el que el citado enlace correspondiente (partner de unión) es p85.
22. El método de la reivindicación 20, en el que el citado partner de unión es Ras.
23. El método de la reivindicación 20, en el que el citado partner de unión es un receptor de factor de crecimiento.
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