MXPA98004934A - Diagnostico y tratamiento de alteraciones relacionadas con aur-1 y/o aur-2 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos AUR-1 y/o AUR-2, aácidos nucléicos que codifican dichos polipéptidos a células, tejidos y animales que contienen dichosácidos nucléicos, a anticuerpos para dichos polipéptidos, a análisis que utilizan dichos polipéptidos y a métodos que se refieren a todo lo anterior;están provistos métodos para tratar, diagnosticar y seleccionar enfermedades o condiciones relacionadas con AUR-1 y/o AUR-2, caracterizadas por una interacción anormal entre un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2 y un partícipe de unión de AUR-1 y/o AUR-2.

Description

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ALTERACIONES RELACIONADAS CON AUR- 1 Yr^Q ?UR-2 CAMPO, pg A INVENCIÓN La presente invención ße refiere a la pro eína novedosas denominada AURORA l y AURORA 2 ("AUR-1 y AUR-2")» con las secuenc as de nucleótido que codifican AUR-1 y/o AUR-Zr asi como con diversos productos y métodos útiles para el diagnóstico y el tratamiento de diversas enfermedades y condiciones relacionadas con AUR-1 y/o AUR-2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción de los antecedentes de la invención es provista para ayudar a comprender la invenció pero no se admi e que sea técnica anterior con respecto a la invención. La transducción de la señal celular eß un mecanismo fundamental mediante el cual se retransmite al interior de las células los estímulos externos que regulan diversos procedimientos celulares. Uno de los mecanismos bioquímicos claves en la transducción de se?aleß implica la fosforilación reversible de las prote naßt lo que permite la regulación de la actividad de laß proteínas maduras al alterar su estructura y su función.

Las quinases de proteína mejor caracter zadas en los eucariotes fosforilan las proteínas en la porción alcohol en los residuos de serina» treonina y tirosina. Estas quinasas quedan divididas en dos grandes grupos» las específicas para fosfor lar serinas y treoninas» y las específicas para fosforilar tirosi as. Algunas quinasas» denominadas quinases "de doble espec fic dad" son capaces de fosforilar la tirosina así como los residuos de serina/treonina. Las quinasas de proteína también pueden estar caracterizadas por su ubicación dentro de la célula. Algunas quinasas son proteínas del tipo de receptor de transmembrana» capaces de alterar directamente su actividad catalítica en respuesta al ambiente exterior» por ejemplo» a la unión de un ligando. Otras son proteínas de tipo no receptor» que carecen de todo dominio de transmembrana. Pueden ser encontradas en una variedad de compartimentos celulares» desde la superficie interior de la membrana celular hasta el núcleo. Muchas quinasas están implicadas en las cascadas reguladoras en donde sus substratos pueden incluir otras quinases cuyas actividades están reguladas por su eßtado de fosforilación. Finalmente» la actividad de algún efector situada corriente abajo eß modulada por la fosforilación que eß el resultado de la activación de dicha trayectoria. La familia de quinasas de seri a/treonina incluye miembros que se encuentran en todos loe pasos de diversas cascadaß señal zado as. incluyendo aquellas que están implicadas en el control del crecimiento de las células» la migración, la diferenc ación y la ßecreción de hormonaß» la fosforilación de factores de transcripción que dan por resultado la expresión de genes alterada» la contracción muscular» el metabolismo de la glucosa» el control de la síntesis de proteína celular y la regulación del ciclo de la célula.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a po ipeptidos AUR-1 y/o AUR-2» a los ácidos nucleicos que codifican dichos pol ?péptidos» a células que contienen dichos ácidos nucleicos» a anticuerpos para dichos polipéptidos» a análisis que utilizan dichos polipéptidos y a métodos que se refieren a todo lo anterior. La presente invención se basa en el aislamiento y caracterización de nuevas proteínas que han sido designadas AUR-1 y/o AUR-2. Los polipéptidos y los ácidos nucleicos pueden ser producidos utilizando técnicas de síntesis bien conocidas y normales» cuando están dadas las secuencias presentadas aquí. AUR-1 y/o AUR-2 están relacionadas con las quinasas de serina/treoni a» con extensiones N-terminales cortas. La Drosófila y los homólogos de levadura parecen estar implicados en la regulación mitótica. Las proteínas humanas parecen estar involucradas en el cáncer y/o en otras alteraciones de la transcripción de señal. El ARN de AUR-1 es expresado ampliamente en células que se dividen rápidamente» derivadas de tejidos tanto normales como de tumor. Sin embargo» el ARN de AUR2 es expresado en un patrón más restringido que es bajo en los tejidos más normales o los tiene ausente» y eß abundante solamente en una subserie de l neas de células derivadas de tumor» particularmente las que son de origen colo-rectal. Tanto Auroral como Aurora2 muestran expresión intermediaria en el hígado fetal, en loe testículos de adultos y en el timo» lo que sugiere un papel normal de esas proteínas en la división meiótica. Tanto AUR1 como AUR2 parecen regular la división nuclear» con alteración de su señalización» lo que da por resultado células poliploides. Este fenotipo es probable que se deba a la segregación errónea de cromosomas» tal como se ve con su homólogo de levadura y IPL1. Dado que el po iploide es una marca de contraste de células tumorales y en células defectuosas en el supresor de tumor ?53» se está probando el papel de AUR1 y AUR2 en la transformación células. El análisis de secuencia primaria de loe genes humanos revela que contienen un dominio de quinasa de proteína C-termi al sumamente conservado, y un dominio N-termi al débilmente conservado» de 74 a 130 aminoácidos» que juega un papel regulador o una función reguladora como un motivo de unión al substrato. Los genes humanos también contienen un sitio de fosforilación cAMP/PKA. R/KR/KXS/T en el circuito de activación de dominio de quinasa» lo que sugiere una trayectoria reguladora similar a las proteínas relacionadas con CDC2/CD . reguladas por el ciclo de la célula. El análisis de Southern» que sirve para sondear los derivados de la región N-terminal única de AUR1 y AUR2. indica que existen como genes de una sola copia en células humanas. Si embargo» bajo condiciones de baja exigencia» se está en capacidad de detectar fragmentos Sacl de 1.3 Kb y 3.2 kb que se hibridan débilmente a la sonda AURl. El análisis de clonación y de secuencia revela esta región que codifica un seudógeno relacionado con AUR1» que carece de intrón (denominado AUR3) • con múltiples desplazamientos de marco. Adicionalmente» inmediatamente corriente arriba del seudógeno AUR3 hay una región con repeticiones invertidaß complejas, que ße predice que forma un circuito de horqu lla muy estable. La secuencia de ADN de AUR3 es homologa a AUR1» que comienza desde el primer nucleótido del cADN de AURl. Inmediatamente corriente arriba de ese sitio» está el circuito de horquilla predicho de AUR3. Se está caracterizando actualmente los clones genómicos de AURl para determinar si la homología con AUR3 continúa corriente arriba de este nucleótido y si el cADN de AUR1 incluye o está precedido por un circuito de horquilla similar. La ut lidad de la presente invención incluye la capacidad de discriminar los inhibidores del crecimiento de las células y desarrollar terapéuticos de molécula pequeña para tratar cánceres. Así pues» en un primer aspecto» la invención incorpora un acido nucleico aislado» enriquecido o purificado» que codifica un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. Por "polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2" se quiere decir una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la mostrada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N0:4, o fragmentos de la misma. Una secuencia que eß sustancialmente similar» preferentemente tendrá por lo menos una identidad de 9054 (mejor aún» por lo menos 95X y lo más preferible 99 a 100%). con la secuencia de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N0:4. Por "identidad" se quiere decir una propiedad de secuencias que mide su similitud o su relación. Se mide la identidad dividiendo el número de residuos idénticos entre el número total de residuos y mu tiplicando el producto por cien. Así pues» dos copias de exactamente la misma secuencia tendrían una i entidad de 100JÍ. pero las secuencias que son menos fuertemente conservadas y tienen omisiones» adiciones o reemplazos, pueden tener un grado menor de identidad. Quienes sean expertos en la materia reconocerán que están disponibles varios programas de computadora para determinar la identidad de secuencias. Por "aislado" en referencia al ácido nucleico ße quiere decir un pol mero de 6 (de preferencia 21» mejor aún 39, y lo mejor de todo 75) o más nucleótidos conjugados entre sí» que incluyen ADN o ARN» que se aisla de una fuente natural o que se sintetiza. En ciertas modalidades de la invención» ße prefiere los ácidos nucleicos más largos» por ejemplo» los de 300» 600» 900 o mas nucleotidos y/o aquel os que tienen por lo menos 50%» 60%» 75%» 90%, 95% o 99% de identidad con la secuencia de longitud completa» mostrada en SEQ ID N0:i o SEQ ID N0:2. El ácido nucleico aislado de la presente invención es único en el sentido de que no se encuentra en estado puro o separado, en la naturaleza. El uso del término "aislado" indica que una secuencia que ocurre en la naturaleza» ha sido retirada de su ambiente celular normal (es decir, cromosómico). De tal manera, la secuencia puede estar en una solución libre de células o puede ser colocada en un ambiente celular diferente. El término no implica que la ßecuencia sea la única cadena de nucleótidos presente, pero sí que está esenc almente libre (alrededor de 90 a 95% de pureza por lo menos) de material no nucleótido» asociado naturalmente con él» y de tal manera se pretende que se distinga de los cromosomas aislados. Mediante el uso del término "enriquecido" en referencia al ácido nucleico» se quiere decir que la secuencia de ADN o de ARN específica const tuye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces) del ADN o ARN total presente en las células» o en la solución de interés» que en las células normales o enfermas» o en laß células de laß que ße tomó la secuencia. Esto sería provocado por una persona mediante reducción preferencial en la cantidad del otro ADN o ARN presente, o mediante incremento preferencial en la cantidad de la secuencia específica de ADN o ARN» o mediante combinación de ambas. Sin embargo» se debe notar que "enriquecido" no s implica que no estén presentes otras secuencias de ADN o de ARN» sí no solo que la cantidad relativa de la secuencia de interés ha sido incrementada significativamente. El término "significativo" se usa aquí para indicar que el nivel de incremento es útil para la persona que efectúa dicho incremento» y en general significa un aumento con respecto a otros ácidos nucleicos de alrededor de al menos dos veces» mejor aún. cinco a diez veces» o incluso más. El término tampoco implica que no haya ADN o ARN de otras fuentes. El ADN de otra fuente» por ejemplo, puede comprender ADN de genoma de levadura o bacteriana, o un vector de clonación» tal como PUC19. Este término ße distingue de eventos que ocurren en la naturaleza» tales como infección viral o crecimientos de tipo tumoral» en donde el nivel de un rnARN puede ser incrementado naturalmente con respecto a otras especies de mARN» es decir» se pretende que el término cubra solamente aquellas situaciones en las cuales una persona ha intervenido para elevar la proporción del ácido nucleico deseado. También es ventajoso para algunos propósitos que laß secuencias de nucleótidos eßté en forma purificada. El término "purificado" con referencia al ácido nucleico, no requiere una pureza absoluta (por ejemplo» una preparación homogénea); más bien representa una indicación de que la secuencia es relativamente más pura que en el ambiente natural (en comparación con el nivel natural, este nivel debe ser de 2 a 5 veces mayor, por ejemplo, en términos de mg/ml). Se puede purificar los clones individuales aislados de un banco de cADN, hasta homogeneidad electro orá ca. Las moléculas de ADN recuperadas» obtenidas de estos clones» podrían ser obtenidas directamente del ADN total o del ARN total. Los clones de cADN no ocurren en la naturaleza» sino más bien son obtenidos preferencial ente mediante manipulación de una sustancia parcialmente purificada que ocurre en la naturaleza (ARN mensajero). La construcción de un banco de cADN a partir de mARN implica la creación de una sustancia sintética (cADN) y los clones individuales de cADN pueden ser aislados de eßte banco sintético por selección clonal de las células que lleva el banco de cADN. Así pues» el procedimiento que incluye la construcción de un banco de cADN a partir de mARN y el aislamiento de distintos clones de cADN, da por resultado una purificación aproximada de 10* veces del mensaje natural. Así pues, la purificación de por lo menos un orden de magnitud, de preferencia dos o tres órdenes y, mejor aún, de cuatro a cinco órdenes de magnitud, está contemplada expresamente. Mediante "un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2" se quiere dar a entender 25 (de preferencia 30» mejor aún 35» lo más preferible 40) o más aminoácidos contiguos» expuestos en laß secuencias de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4 o un derivado funcional de loe mismos» tal como se describe aquí. En determinados aspectos» se prefiere polipéptidos de 100, 200, 300 o más aminoácidos. Se puede codificar el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 mediante una secuencia de ácido nucleico de longitud completa o cualquier porción de la secuencia de ácido nucleico de longitud completa, siempre y cuando se retenga una actividad funcional del pol péptido. En las modalidades preferidas» el ácido nucleico aislado comprende, consiste esencialmente de» o consiste de» una secuencia de ácido nucleico señalada en la secuencia de aminoácido de longitud completa de SEQ ID NO:8 o SEQ ID N0:4» un derivado de la misma» o codifica por lo menos 25» 30» 35» 40» 50, 100» 200 o 300 aminoácidos contiguos de la misma» el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 comprende» consiste esencialmente de» o consiste de por lo menos 25, 30, 35 o 40 aminoácidos contiguos, de un polipéptido AUR-1 y/o AUR-2. Se puede aislar el ácido nucleico de una fuente natural mediante clonación de cADN o mediante hibridación substracti va. La fuente natural puede ser sangre de mamífero (humano), semen o tejido y se puede sintetizar el ácido nucleico mediante el método de triéßter o utilizando un si tetizador de ADN automático. En otras modalidadeß preferidas adicionales, se conserva el ácido nucleico o una región única, por ejemplo, laß que son útiles para el d seño de sondas de hibridación para facilitar la identificación y clonación de polipéptidos adicionales, el diseño de sondas de RCP para facilitar la clonación de polipéptidos adicionales y la obtención de anticuerpos a regiones de polipéptido. Los ejemplos de secuencias de aminoácido de la presente invención incluyen laß siguientes secuencias de aminoácido (los ácidos nucleicos aislados, purificados o enriquecidos que loe codifican eßtán dentro del alcance de la presente invención): ENSYPWPYGRQ (SEQ ID N0:5) CISGP (SEQ ID N0:6) QFPO (SEQ ID NO: 7) VNSGQ (SEQ ID N?:ß) RKEPVTPSA-LV (SEQ ID NO:9) LMSRSNVQPTAAP (SEQ ID NO:10) VQNQKQKQLQATSVPH (SEQ ID NO: 11) PVSRPLNNTQK (SEQ ID NO: 12) VMENSSGTPD (SEQ ID NO' 13) ILTRHFTID (SEQ ID NO:14) SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK (SEQ ID NO:15). Mediante "regiones de ácido nucleico conservadas" se quiere decir regiones presentes en dos o más ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2, a los que se puede hibridar una secuencia particular de ácidos nucleicos» bajo condiciones de baja exigencia. Los ejemplos de condiciones de baja exigencia» adecuadas para discriminar los pol péptidos de AUR-1 y/o AUR-2 que codifican el ácido nucleico están provistaß en Abe y coautoreß J. Biol. Chem.» 19:13361 (1992) (incorporada aquí como referencia en la presente en su totalidad» incluyendo cualquier dibujo). De preferencia» laß regiones conservadas difieren en no más de 5 de 20 nucleótidos. Mediante "región única de ácido nucleico" se quiere decir una secuencia presente en un ácido nucleico de longitud completa que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o AUR2, que no está presente en una secuencia que codifica cualquier otro polipéptido que ocurre en la naturaleza. Dichas regiones contienen de preferencia 30 a 45 nucleótidos contiguos presentes en el ácido nucleótido de longitud completa que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o AUR2. En particular, una región única de ácido nucleico preferentemente es de origen de mamífero. La invención incorpora también una sonda de ácido nucleico para la detección de un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. en una muestra. La sonda de ácido nucleico contiene ácido nucleico que ße hi bridará a una secuencia señalada en SEQ ID N0:i o SEQ ID N0:2» o un derivado funcional de laß mismas. En las modalidades preferidas» la sonda de ácido nucleico se hibrida al ácido nucleico que codifica por lo menos 12» 75, 90» 105. 120. 150, 200. 250» 300 o 350 am noácidos contiguos de la secuencia de longitud completa, señalada en SEQ ID N0:i o SEQ ID N0:2» o un derivado funcional de la misma. Se puede utilizar diversas condicioneß de hibridación de baja o de alta exigencia» dependiendo de la especif cidad o de la selectividad deseadas. Bajo condiciones de hibridación exigentes» solamente se hibridan laß secuencias de ácido nucleico sumamente complementarias. De preferencia» dichas condiciones previenen la hibridación de ácidos nucleicoß que tengan una o dos desigualdades en cada 20 nucleótidos cont guos. Los métodos para utilizar laß sondas incluyen detectar la presencia o la cantidad de ARN de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra, poniendo en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico» bajo condiciones en las que ocurre la hibridación» y detectar la presencia o la cantidad de la sonda unida al ARN de AUR-1 y/o AUR-2. El dúplex de ácido nucleico formado entre la sonda y una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 puede ser usado en la identificación de la secuencia de ácido nucleico detectado (por ejemplo» véase Nelson y coautores en Nonißotropic DNA Probé Techniques. p. 275 Academic Prese. San Diego (Kricka editores. 1992). la cual queda incorporada de esta manera mediante la referencia, en su totalidad, incluyendo cualquier dibujo). Se puede construir equipos para llevar a cabo dichos métodos, que incluyan un medio contenedor que tenga dispuesta en él una sonda de ácido nucleico. La invención también incorpora el ácido nucleico recombinante, de preferencia en una células o en un organismo. El ácido nucleico recombinante puede contener una secuencia señalada en SEQ ID N0:i o SEQ ID NO: 2 o un derivado funcional de la misma» y un vector o un promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula anfitriona. El ácido nucleico recombinante puede contener alternativamente una región de iniciación de transcripción» funcional» en una célula» una secuencia complementaria a una secuencia de ARN que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o de AUR-2» y una región de terminación transcripcional» funcional, en una célula. En otro aspecto, la invención incorpora un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» aislado, enriquecido o purificado. Por "aislado", en referencia aun polipéptido, ße quiere deci un polipéptido de 2 (de preferencia 7, mejor aún 13» lo mejor de todo 25) o más aminoácidos, conjugados entre sí, que incluyen polipéptidos que son aislados de una fuente natural o que son sintetizados. En determinados aspectos, se prefiere los poli épt dos más largos, tales como aquellos que tienen 402. 407. 413 o 425 aminoácidos contiguos, señalados en SEQ ID N0:3 o SEQ ID N?:4. Los polipéptidos aislados de la presente invención son únicos en el sentido de que no ße encuentran en estado puro o separado en la naturaleza. El uso del término "aislado" indica que una secuencia que ocurre en la naturaleza ha sido eliminada de su ambiente celular normal. Así, la secuencia puede estar en una solución libre de células o puede ser colocada en un ambiente celular diferente. El término no implica que la secuencia sea la única cadena de aminoácidos presente, sino que está esencialmente libre (alrededor de 90 a 95% de pureza por lo menos) de material que no sea aminoácido, naturalmente asociado con ella. Mediante el uso del término "enriquec do" en referencia a un pol péptido, se quiere decir que la secuencia de aminoácidos específica constituye una fracción significativamente mayor (de 2 a 5 veces) de los aminoácidos totales presentes en las células o en la solución de interés, que en las células normales o enfermas o en las células de las que se tomó la secuencia. Esto podría ser provocado por una persona mediante reducción preferencial en la cantidad de los demás aminoácidos presentes, o mediante un incremento preferencial en la cantidad de la secuencia de aminoácidos específica que interesa, o mediante una combinación de ambas. Sin embargo, se debe hacer notar que enriquecido no imp ica que no estén presentes otras secuencias de aminoácido, sino solamente que la cantidad relativa de la secuencia interesante ha sido incrementada significati amente. El término "significati o" se usa aquí para indicar que el nivel de incremento es útil para la persona que efectúa dicho incremento, y en general significa un aumento con respecto a los otros aminoácidos de por lo menos el doble, de preferencia de alrededor de 5 a 10 veces o ncluso más. El término tampoco implica que no haya aminoácidos de otras fuentes. El aminoácido de otra fuente» por ejemplo, puede comprender el aminoácido codificado por una genoma de levadura o bacteriana, o por un vector de clonación, tal como pUC19. El término se pretende que cubra solamente aquellas situaciones en las que el hombre ha intervenido para elevar la proporción del ácido nucleico deseado. También eß ventajoso para algunos propósitos, que una ßecuencia de aminoácidos esté en forma purificada. El término "purificado" en referencia a un polipéptido» no requiere la pureza absoluta (tao como una preparación homogénea)» más bien representa una indicación de que la secuencia eß relativamente más pura que en el ambiente natural (en comparación con el nivel natural» este nivel debe ser por lo menos de 2 a 5 veces mayor, por ejemplo» en términos de rag/ml ) . La purificación de por lo menos un orden de magnitud» de preferencia de dos o tres órdenes de magnitud y» mejor aún» de cuatro a cinco órdenes de magnitud» está contemplada expresamente. La sustancia de preferencia está libre de contaminación a un nivel funcionalmente significativo» por ejemplo» con una pureza de 90%» 95% o 99%. En las modalidades preferidas» el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 contiene por lo menos 25, 30, 35, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300 o 350 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa señalada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO: o un derivado funcional de la misma. En otro aspecto más, la invención incorpora un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal), que tiene afinidad de unión específica al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. El anticuerpo contiene una secuencia de aminoácidos que es capaz de unirse específicamente a un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Mediante "afinidad de unión específica" se quiere decir que el anticuerpo se une a los polipéptidos de AUR-1 y/o AUR-2 con mayor afinidad que la que se une a otros polipéptidos, bajo condiciones específicas. Los anticuerpos que tienen afinidad de unión específica para los polipéptidos de AUR-1 y/o AUR-2 pueden ser usados en métodos para detectar la presencia y/o la cantidad del polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra, poniendo en contacto la muestra con el anticuerpo bajo condiciones tales que se forme un inmunocomplejo y detectar la presencia y/o la cantidad del anticuerpo conjugado al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Se puede construir equipos de diagnóstico para llevar a cabo estos métodos, que incluyen un primer medio contenedor que contiene el anticuerpo y un segundo medio contenedor que tiene un conjugado o un partícipe de unión del anticuerpo y un marcador. En otro aspecto, la invención incorpora un hibridoma que produce un anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Por "hibridoma" se quiere decir una l nea de células inmortalizada, que es capaz de secretar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo para AUR-1 y/o AUR-2. En las modalidadeß preferidas, el anticuerpo para AUR-1 y/o AUR-2 comprende una ßecuencia de aminoácidos que es capaz de unirse específicamente al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. En otro aspecto, la invención describe un polipéptido que comprende un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 recombinante o un fragmento único del mismo. Por "fragmento único" se quiere decir una secuencia de aminoácidos que está presente en el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 de longitud completa, que no está presente en ningún otro polipéptido que ocurre en la naturaleza. De preferencia, dicha secuencia comprende 6 aminoácidos contiguos, presentes en la secuencia completa. Mejor aún, dicha secuencia comprende 12 aminoácidos contiguos presentes en la secuencia completa. Todavía mejor aún, dicha secuencia comprende 18 aminoácidos contiguos presentes en la secuencia completa. Mediante " polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 recombinante" se quiere decir que incluye un polipéptido producido mediante técnicas de ADN recombinante, de manera que sea distinto de un polipéptido que ocurre naturalmente, ya sea en su ubicación (por ejemplo, presente en una célula o tejido diferente al que se encuentra natural ente), en su pureza o en su estructura. En general, dicho polipéptido recorabinante eßtará presente en una célula, en una cantidad diferente a la que se observa normalmente en la naturaleza. En otro aspecto, la invención describe una célula o tejido recombinante que contiene ácido nucleico purificado que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. En dichas células, el ácido nucleico puede estar bajo el control de sus elementos reguladores genómicos o puede estar bajo el control de elementos reguladores exógenos, que incluyen un promotor exógeno. Por "exógeno" se quiere decir un promotor que no esté acoplado normalmente in vivo, de manera transcripcional , a la secuencia codificadora para el polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2.

En otro aspecto, la invención incorpora un agente de unión al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» capaz de unirse al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. El agente de unión de preferencia es un anticuerpo purificado que reconoce un epítope presente en un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Otros agentes de unión incluyen moléculas que se unen al polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 y moléculas análogas que se unen a un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Dichos agentes de unión pueden ser identif cados utilizando análisis que miden la actividad de partícipe de unión a AUR-1 y/o AUR-2, tales como los que miden la actividad de PDGFR. Por "purificado" en referencia a un anticuerpo, se quiere decir que el anticuerpo es distinto del anticuerpo que ocurre en la naturaleza, tal como en forma purificada. Preferentemente, el anticuerpo está provisto como una preparación homogénea mediante técnicas comunes y corrientes. Los usos de los anticuerpos al polipéptido clonado incluyen aquel os que van a ser ußadoß como herramientas terapéuticas o como herramientas de diagnóstico. La invención incorpora un método para discriminar células humanas que contienen polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» o una secuencia equivalente. El método incorpora identificar el polipéptido novedoso en células humanas» utilizando técnicas que son rutinarias y comunes y corrientes en eßte campo» tales como las que están descritas aquí para identificar AUR-1 y/o AUR-2 (por ejemplo» clonación» análisis de manchas de Southern o de Northern» hibridación in si tu» amplificaci n por RCP» etc. ) . La invención también incorpora métodos para discriminar células humanas para partícipes de unión de polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. y discriminación de otros organismos para AUR-1 y/o AUR-2. o el partícipe de unión correspondiente. La presente invención incorpora también las versiones purificada» aislada o enriquecida de los péptidos identificados mediante los métodos descritos anteriormente. En otro aspecto» la invención provee un análisis para identificar los agentes capaces de interferir con al interacción entre AUR-1 y/o AUR-2 y un partícipe de unión de AUR-1 y/o AUR-2. Dichos análisis pueden ser efectuados in vitro o in vivo y están descritos detalladamente aquí o pueden ser obtenidos modificando análisis existentes» tales como el análisis de crecimiento descrito en la solicitud de patente No. de serie 08/487,088 presentada el 7 de junio de 1995 (incorporada aquí mediante esta referencia incluyendo cualquier dibujo), o los análisis descritos en la solicitud de patente No. de serie 60/005,167, presentada el 13 de octubre de 1995 ((incorporada aquí mediante esta referencia, incluyendo cualquier dibujo). Otro análisis que podría ser modificado para usar los genes de la presente invención está descrito en la solicitud internacional No. WO 94/23039» publicada el 13 de octubre de 1994. Otras posibilidades incluyen detectar la actividad de quinase en un análisis de autofosfori lación o probar la actividad de quinasa sobre substratos comunes y corrientes, tales como histonas, proteína básica de mielina, gamma-tubulina o proteínas centrosómicas. Los partícipes de unión pueden ser identificados colocando la porción N—terminal de la proteína en un tamiz de dos híbridos o detectando la fosfotirosina de una quinasa de doble especificidad. Fields y Song, patente estadoun ense No, 5.283»173» expedida el 1 de febrero de 1994» la cual queda incorporad aquí mediante esta referencia. Un medio mediante el cual se puede definir la actividad de los inhibidores de Aurora, es un sistema discriminador que utiliza un mutante de levadura sensible a la temperatura, tal como el descrito por Chan y Botstein (Genetics 135:677-691» 1993); véase también Francisco y coautores, Mol. Cell, Bio. 14( 7):4731-4740, 1994), ambos incorporados aquí mediante esta referencia, en su totalidad, incluyendo cualquier dibujo. Brevemente, la cepa de levadura CCY72-3D-1 (ipl 1-2), que expresa una forma sensible a la temperatura del homólogo de levadura de Aurora (ipil), si bien es viable a 26°C, eß incapaz de desarrol arse a 37°C. La transfección de esta cepa con un plásmido de expresión que contiene un gene híbrido de Aurora» que contiene la porción N-terminal de ipil» que contiene el dominio o los dominios de interacción de substrato putativo)» y la porción C-terminal de Auroras 1 o 2» que contiene el dominio catalítico» se impone a esta senßibilidad a la temperatura de desarrol o. La cepa de levadura que expresa Aurora se desarrolla entonces a 37°C en presencia de una sustancia de prueba. No será evidente ningún desarrollo en presencia de sustancias que inhiban la función catalítica de Aurora. Loe inhibidores potenciales incluyen sustancias químicas de bajo peso molecular y/o productos naturales que se aislan de diversos organismos tales como hongos» organismos marinos» plantas» etc. La breve descripción de la invención descrita anteriormente no es limitativa y serán evidentes otros aspectos y ventajas de la invención a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas y de las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a loe polipéptidos de AUR-1 y/o AUR-2» a los ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, a células, tejidos y animales que contienen dichos ácidos nucleicos, a los anticuerpos para dichos polipéptidos, a loe análisis que utilizan dichos polipéptidos y a los métodos que se refieren a todo lo anterior.

I.- EL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA POLIPEPTIDOS DE AUR-1 Y/0 ¿UB=2 Están incluidos dentro del alcance de esta invención loe equivalentes funcionales de laß moléculas de ácido nucleico aisladas aquí descritas. La degeneración del código genético permite la sustitución de determinados codones por otros codones que especifiquen el mismo aminoácido y, por lo tanto» que den lugar a la misma proteína. La secuencia de ácido nucleico puede variar sustancialmente puesto que» con excepción de la metionina y el triptofano» los aminoácidos conocidos pueden ser codificados por más de un codón. De tal manera» las porciones o la totalidad del gene AUR-1 y/o AUR-2 se podrían sintetizar para dar una secuencia de ácido nucleico significativamente diferente de la mostrada en SEQ ID N0:i o SEQ ID N0:2. Su secuencia de aminoácido codificada» sin embargo, se conservaría. Además» la secuencia de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que sea el resultado de la adición» la omisión o la sustitución de por lo menos un nucleótido en el extremo 5r y/o el extremo 3' de la fórmula de ácido nucleico mostrada en SEQ ID N?:i o SEQ ID N0:2 o un derivado del mismo. Cualquier nucleótido o polinucleótido puede ser usado en este sentido» siempre y cuando su adición, omisión o sustitución no altere la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N0:4, que es codificada por la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, se pretende que la presente invención incluya cualquier secuencia de ácido nucleico que sea el resultado de la adición de ATG como un codón de inicio en el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico de la invención, o su derivado, o de la adición de TTA, TA6 o TGA, como codón de terminación en el extremo 3T de la secuencia de nucleótido de la invención, o su derivado. Ademáß. la molécula de ácido nucleico de la presente invención, según sea necesario» puede tener sitios de reconocimiento de endonucleaßa de reßtricción» añadidos a su extremo 5' y/o a su extremo 3T. Dichas alteraciones funcionales de una secuencia de ácido nucleico dada» proveen una oportunidad para promover la secreción y/o el procesamiento de proteínas heterólogas codificadas por secuencias de aminoácidos extrañas, fundidas a ellas. Todas las variaciones de la secuencia de nucleótidos de los genes de AUR-1 y/o AUR-2 y sus fragmentos permitidas por el código genético» por lo tanto» están incluidas dentro de esta invención. Adicionalmente» es posible omitir codones o sustituir uno o más codones por otros codones que degeneren los codones para producir un polipéptido estructuralmente modificado, pero que tenga sustancialmente la misma utilidad o actividad del polipéptido producido por la molécula de ácido nucleico sin modificar. Tal como se reconoce en la técnica, los dos polipéptidos son funcionalmente equivalentes, al igual que las dos moléculas de ácido nucleico que dan lugar a su producción, aún cuando las diferencias entre las moléculas de ácido nucleico no están relacionadas con la degeneración del código genético.

II.- LA SONDA DE ACIDO NUCLEICO PARA LA DETECCIÓN DE AUR-1 Y/O UR-3 Se puede usar una sonda de ácido nucleico de la presente invención para sondear un banco cromosómico o de cADN apropiado» mediante métodos de hibridación usuales» para obtener otra molécula de ácido nucleico de la presente invención. Un banco de ADN o de cADN cromosómico puede ser preparado a partir de células apropiadas» de acuerdo con métodos reconocidos en este campo (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, editado por Sambrook. Fritsch y Maniatis» Cold Spring Harbor Laboratory» 1989). Alternati amente» se lleva a cabo la síntesis química a fin de obtener sondas de ácido nucleico que tengan secuenciaß de nucleótidos que correspondan a porciones N-terminales y C-terminaleß de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés. Así pues» las sondas de ácido nucleico sintetizadas pueden ser usadas como senßi il izadoreß en una reacción en cadena de polimerasa (RCP) llevada a cabo de acuerdo con técnicas de RCP reconocidas» esencialmente de acuerdo con loe protocoloß de RCP "A Guide to Methodß and Appl cations", editado por Michael y coautores, Academic Press, 1990, utilizando el banco cromosómico o de cADN apropiado para obtener el fragmento de la presente invención. Quienes sean expertos en la materia pueden diseñar fácilmente dichas sondas, con base en la secuencia descrita aquí, utilizando métodos de alineación por computadora y análisis de secuencia por computadora, conocidos en la técnica (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición» editado por Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 19B9). Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser marcadas mediante técnicas de marcación comunes y corrientes, por ejemplo, con una radiornarca, una marca de enzima, una marca fluorescente, una marca de biotina-ani 1 na, quimioluminiscencia y similares. Después de la hibridación, se puede visualizar las sondas utilizando métodos conocidos. Las sondas de ácido nucleico de la presente invención incluyen ARN, así como sondas de ADN, tales como las sondas que son generadas utilizando técnicas conocidas en este campo. La sonda de ácido nucleico puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido. Los ejemplos de dichos soportes sólidos incluyen, pero sin limitación a ellos, los plásticos, tales como policarbonato, los carbohidratos complejos, taleß como agarosa y sefaroßa, y laß resinas acrílicas, tales como poliacrilamida y granulos de látex. Las técnicas para acoplar sondas de ácido nucleico a dichos soportes sólidos son bien conocidas en la materia. Las muestras de prueba adecuadas para métodos de sondeo con ácido nucleico de la presente invención incluyen, por ejemplo» células o extractos de ácido nucleico de células o fluidos biológicos. La muestra usada en los métodos descritos arriba variará con base en el formato de análisis» el método de detección y la naturaleza de los tejidos» las células o los extractos que se van a analizar. Los métodos para preparar los extractos de células de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y pueden ser adaptados fácilmente a fin de obtener una muestra que sea compatible con el método utilizado.

III.- UN MÉTODO QUE SE BASA EN SONDA Y UN EQUIPO PARA DETECTAR AUR-A Y/Q AUR-Z Un método para detectar la presencia de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra comprende: (a) poner en contacto la muestra con la sonda de ácido nucleico descrita arriba» bajo tales condiciones que ocurra hibridación» y (b) detectar la presencia de la sonda unida a la molécula de ácido nucleico. Quien sea experto en la materia seleccionará la sonda de ácido nucleico de acuerdo con las técnicas conocidas en la materia» tal como se describió arriba. Las muestras que van a ser probadas incluyen» pero sin limitación a el as» muestras de ARN de tejido humano. Un equipo para detectar la presencia de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra comprende por lo menos un medio contenedor que tiene dispuesta en él la sonda de ácido nucleico arriba descrita. El equipo puede comprender además otros recipientes que comprendan uno o más de los siguientes: reactivos de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de la sonda de ácido nucleico unida. Ejemplos de reactivos de detección incluyen. pero sin limitación a ellos: las sondas radio arcadas» sondas marcadas enzimáticamente: peroxidasa de rábano picante, fosfatase alcalina), y sondas marcadas por afinidad (biotina» avidina o esteptavidina) . En detalle» un equipo con compartimentos incluye cualquier equipo en el cual estén contenidos los reactivos en recipientes separados. Dichos recipientes incluyen los recipientes de vidrio pequeños» recipientes de plástico o tiras de plástico o papel. Dichos recipientes permiten la transferencia eficiente de los reactivos de un compartimento a otro compartimento» de manera que las muestras y los reactivos no estén contaminados de manera cruzada» y los agentes o las soluciones de cada recipiente puedan ser añadidos en forma cuantitativa de un compartimento a otro. Dichos recipientes incluirán un recipiente que acepte la muestra de prueba» un recipiente que contenga la sonda o los sensibilizadores usados en el análisis» recipientes que contengan reactivos de lavado (tales como salina regulada con fosfato» tris-reguladores y similares)» y recipientes que contengan loe reactivoß usados para detectar la sonda hibridada» el anticuerpo unido» el producto amplificado o similares. Quien sea experto en la materia reconocerá fácilmente que las sondas de ácido nucleico descritas en la presente invención pueden ser incorporadas fácilmente en uno de los formatos de equipo establecidos que son bien conocidos en la técnica.

IV.- CONSTRUCCIONES DE ADN QUE COMPRENDEN LA MOLÉCULA DE ACIDO NUCLEICO PE ?UR-A Y/0 AUR-Z Y CÉLULAS QUE CONTIENEN SS S CONSTRUCCIONES La presente invención se refiere también a una molécula de ADN recombinante que comprende» de 5' a 3'» un promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula anfitriona» y las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Además» la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende un vector y las moléculas de ácido nucleico descritas arriba. La presente invención se refiere también a una molécula de ácido nucleico que comprende una región de transcripción funcional en una célula» una secuencia complementaria de una ßecuencia de ARN que codifica una ßecuencia de aminoácido que corresponde al polipéptido deßcrito anteriormente» y una región de terminación de transcripción» funcional en dicha célula. Las moléculas descritas arriba pueden ser moléculas de ADN aisladas y/o purificadas. La presente invención se refiere también a una célula u organismo que contiene una molécula de ácido nucleico descrita arriba» y que de tal manera es capaz de expresar un péptido. Se puede purificar el polipéptido a partir de células que han sido alteradas para expresar el polipéptido. Se dice que una célula eß "alterada para expresar un polipéptido deseado" cuando la célula» por medio de manipulación genética, es obligada a producir una proteína que normalmente no produce o que produce normalmente la célula a niveles menores. Quien sea experto en la materia puede adaptar fácilmente los procedimientos para introducir y expresar secuenciaß genómicaß, de cADN o sintéticas» en células eucarióticas o procarióticas. Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido, si contiene secuenciaß de nucleótido que contengan información reguladora de transcripción y de translación, y dichas secuencias están "enlazadas operablemente" a las secuencias de nucleótido que codifican el polipéptido. Un enlace operable es un enlace en el cual las secuencias de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se busca expresar, están conectadas de tal manera que permiten la expresión de la secuencia de genes. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de la secuencia de genes puede variar de un organismo a otro, pero en general incluirán una región promotora que, en los procariotes, contiene tanto el promotor (que dirige el inicio de la transcripción de ARN), como las secuencias de ADN que, cuando son transcritas al ARN, señalarán el inicio de la síntesis. Dichas regiones normalmente incluirán laß secuenciaß 5*-no codificadoras» involucradas con el inicio de la transcripción y la translación» tal como la casilla TATA» la secuencia encabezadora» la secuencia CAAT y simi ares. Si ße desea» la región no codificadora 3T con respecto a la secuencia que codifica el gene AUR-1 y/o AUR-2» se puede obtener mediante los métodos descritos arriba. Esta región puede ser retenida para sus secuencias reguladoras de terminación de transcripción, tal como la terminación y la poliadenilación. Así pues» al retener la región 3" naturalmente contigua a la secuencia de ADN que codifica un gene AUR-1 y/o AUR-2. se puede proveer las señales de terminación de transcripción. Cuando las señales de terminación de transcripción no son ßatißfactoriamenté funcionaleß en la expresión de la célula anfitriona. entonces se puede sustituir con una región 3' funcional en la célula anfitriona. Se dice que dos secuencias de ADN (tales como una secuencia de región promotora y una secuencia de AUR-1 y/o AUR-2) están enlazadas operablemente si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN: (1) no da por resultado la introducción de una mutación en el desplazamiento de marco; (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de región promotora para dirigir la transcripción de una ßecuencia de gene de AUR-1 y/o AUR-2; o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia de gene AUR-1 y/o AUR-2 para ser transcrito por la secuencia de región promotora. De tal manera» una región promotora estaría enlazada operablemente a una secuencia de ADN si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN. Así. para expresar un gene AUR-1 y/o AUR-2» son necesarias señaleß de transcripción y de tranßlación reconocidas por un anfitrión apropiado.

La presente invención comprende la expresión del gene AUR-1 y/o AUR-2 (o un derivado funcional del mismo) en células procarióticas o eucarióticas. Los anfitriones procarióticos» en general» son muy eficientes y convenientes para la producción de proteínas recombinantes y» por lo tanto, un tipo de sistema de expresión preferido para el gene AUR-1 y/o AUR-2. Los procar otes muy frecuentemente están representados por diversas cepas de E. coli. Sin embargo» también se puede utilizar otras cepas microbianas» que incluyen otras cepas bacterianas. En loe sistemas procarióticos, los vectores plásm dos que contienen sitios de reproducción y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el anfitrión, pueden ser ußadoß. Loe ejemplos de dichos vectores plásmidos adecuados pueden incluir pBR322. pUCllß» pUC119 y similares; vectores de fago o bacteriófago adecuados que pueden incluir ga ma-gtlO» ga ma-gtll y similares; y vectores de virus adecuados que pueden incluir pMAM-neo» pKRC y similares. De preferencia» el vector seleccionado de la presente invención tiene capacidad para reproducirse en la célula anfitriona seleccionada. Los anfitrioneß procarióticoß reconocidos incluyen bacterias tales como E. coli» Bacillus, Streptomyces» Pseudomonas, Salmonella, Serratia y similares. Sin embargo, bajo tales condiciones, el péptido no será glicosilado. El anfitrión procariótico debe ser compatible con el replicón y las secuencias de control en el plásmido de expresión. Para expresar AUR-1 y/o AUR-2 (o un derivado funcional de los mismos) en una célula procariótica, es necesario enlazar operablemente la secuencia de AUR-1 y/o AUR-2 a un promotor procariótico funcional . Dichos promotores pueden ser constitutivos o, mejor aún, regulables (eß decir, inducibles o desrepresibles) . Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor b a de la secuencia de gene beta-lacta asa de pBR322, y el promotor CAT de la ßecuencia de gene de cloranfenicol-eceti 1 transferasa de pPR325 y similares. Los ejemplos de promotores procarióticos incluyen los promotores derechos e izquierdos principales del bacteriófago lambda (P y PN), los promotores Trp, recA, lambda-acz, lambda-acl y gal de E. coli, la alfa-amilasa (Ulmanen y coautores, J. Bacteriol. 162:176-182 (19B5)) y los promotores específicos para c-28 de B. subtilis (Gilman y coautores, Gene sequence 32:11-20 (1984)), los promotores de bacteriófagos de Basilluß (Gryczan, en: The Molecular Biology of the Bacilli. Academic Prese. Inc. NY» EUA (1982)) y loe promotores de Streptomyces (Ward y coautores» Mol. Gen. Genet., 203:468-478 (1986)). Los promotoreß procarióticoß están resumidos por Glick (J. Ind. Microbiot. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo (Biochimie. 68:505-516 (1986))? y Gottesman (Ann. Rev. Genet.. l?:415-442 (1984)). La expresión apropiada en una célula procariótica también requiere la presencia de un sitio de unión ribosómica corriente arriba de la secuencia codificadora de secuencia de gene. Dichos sitios de unión ribosómica están descritos, por ejemplo, por Gold y coautores (Ann. Rev. Microbio!.» 35:365-404 (1981)). La selección de las secuencias de control» de los vectores de expresión» de los métodos de transformación y similares, dependen del tipo de célula anfitriona usada para expresar el gene. Tal como se usa en la presente, "célula", "línea de células" y "cultivo de células" pueden ser usadas intercambiablemente y todas esas designaciones incluyen la progenie. Así pues, las palabras "transformanteß" o "células transformadas" incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de ella, sin tener en cuenta el número de trans e enc as. También se entiende que toda la progenie no puede ser idéntica en el contenido de ADN» debido a mutaciones del beradas o inadvertidas. Sin embargo» tal como se define, la progenie mutante tiene la misma funcionalidad que la de la célula transformada originalmente. Las células anfitriones que pueden ser usadas en loe sistemas de expresión de la presente invención no están limitadas de manera estricta, siempre y cuando sean usadas en la expresión del péptido de AUR-1 y/o AUR-2» que interesa. Los anfitriones adecuados frecuentemente pueden incluir células eucarióticas. Los anfitriones eucarióticos preferidos incluyen, por ejemplo, levadura, hongos, células de i sectoß, células de mamíferos, ya sea in vivo o en cultivo de tejidos. Las células de mamíferos que pueden ser ußadaß como anfitrioneß incluyen células HeLa, células de origen fibroblástico, tales como VERO o CH0-K1 o células de origen linfoide, y sus derivados. Las células anfitriones de mamífero preferidas incluyen SP2/0 y J558L, así como las líneas de células de neuroblastoma, tales como IMR 332, que puede proveer mejores capacidades para corregir el procesamiento posteriores a la translación. Adicionalmente, también están disponibles células de plantas como anfitriones, y las secuencias de control compatibles con las células de plantas pueden ser obtenidas, por ejemplo» el viruß de mosaico 35S y 19S de la coliflor, y las secuencias promotora y de señal de poliadenilación de nopalina-sintasa. Otro anfitrión preferido eß una célula de insecto» por ejemplo» las larvas de Dros?fila. Utilizando células de insecto como anfitriones» se puede ut lizar el promotor de alcohol-deshidrogenasa de Drosófila. Rubín» Science 240:1453-1459 (19BB). Alternativamente» se puede diseñar por ingeniería vectores de baculovirus para que expresen cantidades grandes de AUR-1 y/o AUR-2 en células de insectos (Jasny» Science, 238:1653 (1987)5 Mi 11er y coautores, en: Genetic Engineering (1986); Setlow, J.K. y coautores, editores, Plenu , Volumen 8, páginas 277-297). Se puede utilizar cualquiera de entre una serie de sistemas de expresión de la secuencia de gene de levadura, que incorpora elementos promotores y de terminación a partir de secuencias de gene expresadas activamente, que codifican laß enzimas gl col iticas» y son producidas en cantidades grandes cuando se desarrolla la levadura en medios ricos en glucosa. Las secuencias de genes gl neolíticos conocidos también pueden proveer de manera muy eficiente señal eß de control de transcripción. La levadura provee ventajee sustanciales en cuanto también puede efectuar modificaciones en el péptido posteriores a la translación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y un número elevado de copias de plásmidos que pueden ser utilizados para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce las secuencias encabezadoras o los productos de gene de mamíferos clonados y secreta péptidos que llevan las secuencias encabezadoras (es decir» pre-péptidos). Para un anfitrión de mamífero» están disponibles diversos sistemas de vector posibles para la expresión de AUR-1 y/o AUR-2. Se puede emplear una gran variedad de secuenciaß reguladoraß de transcripción y de translación» dependiendo de la naturaleza del anfitrión. Las señales reguladoras de transcripción y de translación pueden ser derivadas de fuentes virales» tales como adenovirus» viruß del papiloma bovino» ci to egaloviruß» virus de simios o similares» en donde laß señales reguladoras están aßociadaß con una ßecuencia de gene particular, que tiene un nivel elevado de expresión. Alternativamente, se puede emplear promotores para productos de expresión de mamíferos, tales como actina» colágeno» miosina y similares. Se puede seleccionar señales reguladoras del inicio de transcripción que permitan la represión o la activación» de manera que se pueda modular la expresión de las secuencias de gene. Son de interés las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de manera que al variar la temperatura se puede reprimir o iniciar la expresión, o las que están sujetaß a regulación química (por ejemplo, como metabolito). La expresión de AUR-1 y/o AUR-2 en anfitrioneß eucariótico requiere el uso de regiones reguladoras eucarióticas. En general, dichas regiones incluirán una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN. Los promotores eucarió icos preferidoß incluyen, por ejemplo» el promotor de la secuencia de gene metalotioneína I de ratón (Ha er y coautores» J. Mol. APPI . Gen.» i:273-2BB (1982)); el promotor TK del virus del Herpes (McKnight. Cell » 31:355-365 (1982)); el promotor temprano SV40 (Benoist y coautores» Nature (Londres). 290:304-310 (1981)); el promotor de secuencia de gene gal4 de levadura (Johnston y coautores» Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver y coautores. Proc. Nati. Acad. Sci. (USA). 81:5951-5955 (1984)). La translación del mARN eucariótico se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esa razón eß preferible asegurarse de que el enlace entre un promotor eucariótico y una ßecuencia de ADN que codifica AUR-1 y/o AUR-2 (o un derivado funcional de la misma) no contenga ningún codón intermedio que sea capaz de codificar una metionina (eß decir. 3B AUG). La presencia de dichos codones da por resultado una formación de proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la secuencia codificadora de AUR-1 y/o AUR-2) o bien una mutación de desplazamiento de marco (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia codificadora de AUR-1 y/o AUR-2). Se puede introducir una molécula de ácido nucleico de AUR-1 y/o AUR-2 y un promotor enlazado operablemente en una célula procariótica o eucariótica receptora, ya sea como una molécula de ADN no reproductor (o de ARN). que puede ser una molécula lineal o. mejor aún» una molécula circular» covalente» cerrada. Puesto que dichas moléculas son incapaces de reproducirse de manera autónoma» la expresión del gene puede ocurrir por medio de la expresión transitoria de la secuencia introducida. Alternativamente, puede ocurrir expresión permanente por medio de a integración de la secuencia de ADN introducida en el cromosoma anfitrión. Se puede emplear un vector que sea capaz de integrar las secuencias de gene deseadas en el cromosoma de la célula anfitriona. Las células que tienen integrado de manera estable el ADN introducido en los cromosomas, pueden ser seleccionadas introduciendo también uno o más marcadores que permitan la selección de las células anfitriones que contienen el vector de expresión. El marcador puede proveer fototrofia a un anfitrión auxotrófico» resistencia a la biocida» por ejemplo» a loe antibióticos o a metales pesados» tales como cobre» o similares. La secuencia de gene marcador seleccionable también puede estar enlazada directamente a las secuencias de gene de ADN que van a ser expresadas o introducidas en la misma célula mediante co-transfección. También es necesario que haya elementos adicionales para la síntesis óptima del mARN de proteína con enlace de una sola cadena. Estos elementos pueden incluir señales de empalme así como promotores de transcripción» incrementadores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cADN que incorporan dichos elementos incluyen los que están descritos por Okayama» Molec. Cell . Biol. 3:280 (1983)). Se puede incorporar la molécula de ácido nucleico introducida en un vector plásmido o viral» capaz de reproducción autónoma en un anfitrión receptor. Cualquiera de entre una gran cantidad de vectores puede ser empleado para ese propósito. Los factores importantes al seleccionar un vector plásmido o viral particular incluyen: la facilidad con que las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas de las células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un anfitrión particular» y si es conveniente poder "intercambiar" el vector entre células anfitriones de diferentes especies. Los vectores procarióticos preferidos incluyen los plásmidos» tales como los que son capaces de reproducción en E. coli (tales como» por ejemplo» pBR322» ColEl» pSClOl» pACYC 184, nVX. Dichos plásmidos, por ejemplo, están descritoß por Sambrook (véase "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, editado por Sambrook, Fritßch y Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory. 1989)). Los plásmidos de bacilos incluyen pC194. pC221, pT127 y similares. Dichos plásmidos están deßcritos por Gryczan (en The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc. NY, EUA (1982), páginas 307-329). Los plásmidos de streptomyces adecuados incluyen pIJIOl (Kendall y coautores, J. Bacteriorl., 169:4177-4183 (19B7)) y los bacteriófagos de streptomyces. tales como TC31 (Chater y coautores. en: Sixth International Symposium on Actino ycetales Biology. Akademiai Kaido, Budapest, Hungría (1986), páginas 45-54). Loe plásmidos de pseudomonas están resumidos por John y coautores (Rev. Infect. Dis., 8:693-704 (19B6)) y por Izaki (Jpn. J. Bacteriol . , 33:729-742 (1978)). Los plásmidos eucarióticos preferidos incluyen, por ejemplo, BPV» vacunas, SV40, círculo de 2 mieras, y similares, o sus derivados. Dichos plásmidos son bien conocidos en la técnica (Bolstein y coautores, Miami Wntr. Sympo, 19:265-274 (1982); Broach en: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Circle and Inheri tance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EUA páginas 445-470 (1981); Broach, Cell , 28:203-204 (1982); Bollón y coautores J. Ctin. Hematol . Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, en: Cell Biology: A Comprehenßi ve Treatiße, tomo 3, Gene Sequence Expreßßion, Academic Press, NY, EUA páginas 563-608 (1980).

Una vez que se ha preparado el vector o la molécula de ácido nucleico que contiene la construcción o construcciones para la expresión» se puede introducir la construcción o las construcciones de ADN en la célula anfitriona apropiada, mediante cualquiera de entre una gran variedad de medios adecuados» es decir» transformación» transfección» conjugación» fusión del protoplasto. electroporación. tecnología de cañón de partículas» precipitación con fosfato de calcio» mieroinyección directa y similares. Después de la introducción del vector, se desarrolla las células receptoras en un medio selectivo, que selecciona el desarrollo de las células que contienen el vector. La expresión de la molécula o las moléculas de gene clonadas da por resultado la producción de AUR-1 y/o AUR-2 o fragmentos de los mismos. Esto puede tener lugar en laß células transformadas como tales, o después de la inducción de estas células a diferenciarse (por ejemplo, mediante administración de bromodesoxiuraci lo a células de neuroblastoma o similares). Se puede utilizar una variedad de condiciones de incubación para formar el péptido de la presente invención. Las condiciones más preferidas son aquellas en laß cualeß ße imita las condiciones fisiológicas.

V.- POLIPEPTIDOS DE AUR-1 Y/O AUR-2 PURIFICADOS Se puede utilizar una variedad de metodologías conocidas en la técnica para obtener el péptido de la presente invención. Se puede purificar el péptido a partir de tejidos o células que producen naturalmente el péptido. Alternativamente» se podría usar fragmentos de ácido nucleico aislados» descritos anteriormente, para expresar la proteína de AUR-1 y/o AUR-2 en cualquier organismo. Las muestras de la presente invención incluyen células, extractos de proteína o extracto de membrana de células, o fluidos biológicos. La muestra variará con base en el formato de análisis, el método de detección y la naturaleza de los tejidos, las células o los extractos usados como muestra. Se puede usar cualquier organismo eucariótico como fuente para el péptido de la invención, siempre y cuando el organismo de fuente contenga dicho péptido. Tal como se usa aquí "organismo de origen u organismo de fuente" se refiere al organismo original del que se deriva la ßecuencia de aminoácidos de la subunidad, independientemente del organismo en que se exprese la subunidad y finalmente se aisle. Quien sea experto en la materia seguirá fácilmente los métodos para aislar proteínas, a fin de obtener el péptido libre de contaminantes naturales. Estos incluyen, pero sin limitación a ellos: cromatografía por exclusión de tamaño, HPLC, cromatografía de intercambio de iones y cromatograf a por in unoafinidad.

VIt- UN ANTICUERPO QUE TIENE AFINIPAP PE UNION A UN PQLIPEPTIPQ DE AUR-l Y/O AUR-2. Y UN HIBRIDOMA QUE CONTIENE EL ANTICUERPO La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión a un anticuerpo de AUR-1 y/o AUR-2. El polipéptido puede tener la secuencia de aminoácido señalada en SEQ ID N0:tt o SEQ ID N0:4, o un derivado funcional de la misma, o por lo menos 9 aminoácidos contiguos de la misma (de preferencia» por lo menos 20, 30» 35 o 40 de sus aminoácidos contiguos). La presente invención también se refiere a un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica a un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Dicho anticuerpo puede ser aislado comparando su afinidad de unión a un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» con su afinidad de unión a otro polipéptido. Aquellos que se unen selectivamente a AUR-1 y/o AUR-2 serán seleccionados para ser usadoß en los métodos que requieren una distinción entre AUR-1 y/o AUR-2 y otros polipéptidos. Dichos métodos podrían incluir, pero ßin limitación a ellos, el análisis de expresión alterada de AUR-1 y/o AUR-2 en el tejido que contiene otros polipéptidos. Las proteínas de AUR-1 y/o AUR-2 de la presente invención pueden ser usadas en una variedad de procedimientos y de métodos, por ejemplo, para la generación de anticuerpos, para uso en la identificación de composiciones farmacéuticas y para estudiar la interacción de ADN/proteína.

El péptido de AUR-1 y/o AUR-2 de la presente invención puede ser usado para producir anticuerpos o hibridomas. Quien sea experto en la materia reconocerá que si se desea un anticuerpo, dicho péptido ße generaría como ße describe aquí y se usaría como un inmunógeno. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales. así como fragmentos de eßos anticuerpos y formaß humanizadas. Las formas humanizadas de los anticuerpos de la presente invención pueden ser generadas utilizando uno de los procedimientos conocidos en la técnica, tales como quimerización o injerto de RDC. La presente invención se refiere también a un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal descrito arriba, o un fragmento de unión del mismo. Un hibridoma es una línea de células inmortalizada que es capaz de secretar un anticuerpo monoclonal específico. En general, las técnicas para preparar anticuerpos monoclonales e hibridomas son bien conocidas en la técnica (Campbell, "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology"» Elsevier Science Publishers, Amsterda , Loe Paíßes Bajos (1984); St. Groth y coautores, J. Immunol . Methods 35:1-21 (19B0)). Se puede inmunizar cualquier animal (ratón, conejo y similares) que se sabe que produce anticuerpos, con el polipéptido se eccionado. Los métodos para inmunización son bien conocidos en la técnica. Los métodos incluyen la inyección subcutánea o intraperitoneal del polipéptido. Quien sea experto en la materia reconocerá que la cantidad de polipeptido usada para la inmunización variará con base en el animal que se inmuniza, en la antigenicidad del polipéptido y en el sitio de la inyección. Se puede modificar el polipéptido o se le puede administrar un adyuvante, a fin de incrementar la antigenicidad del péptido. Los métodos para incrementar la antigenicidad de un polipéptido son bien conocidos en la materia. Dichos procedimientos incluyen acoplar el antígeno con una proteína heteróloga (tal como globulina o ß-galactosidasa) o por medio de la incl sión de un adyuvante durante la inmunización. Para anticuerpos monoclonales, se eliminan las células de bazo de los animales inmunizados, se las funde con células de mieloma, tales como células de mielona SP2/0-Agl4 y se las deja que se vuelvan células de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal. Se puede usar cualquiera de entre un número de métodos bien conocidos en la técnica para identificar las células de hibridoma que producen un anticuerpo con las características deseadas. Estas incluyen la selección de hibridoma con un análisis ELISA, análisis de mancha Western o radioinmunoanál isis (Lutz y coautoreß, EXP . Ce11 Res. 175: 109-124 (1988)). Los hibridomas que secretan los anticuerpos deseados son clonados y se determina la claße y la subclase usando procedimientos conocidos en la técnica ("Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", supra (1984)). Para anticuerpos pol iclónales» ße a ela loe antisueros que contienen anticuerpo de los animales inmunizados y se discrimina la presencia de anticuerpos con la especificidad deseada» utilizando uno de los procedimientos descritos más arriba. Los anticuerpos deßcritos arriba pueden ser marcados de manera detectable. Los anticuerpos pueden ßer marcados de manera detectable mediante el uso de radioisótopos» etiquetas de afinidad (tales como biotina» avidina y similares)» etiquetas enzimáticas (tales como peroxidasa de rábano picante» fosfatasa alcalina y similares)» etiquetas fluorescentes (tales como FITC o rodamina y similares), átomos para agnét cos. y similares. Los procedimientos para obtener dicho mareaje son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, véase (Stemberger y coautores» J. Histochem. Cytochem.» 18:315 (1970), Bayer y coautores, Met . Enzym. 62:308 (1979); Engval y coautores, Immunot . 109:129 (1972)5 Goding, J. Im unol . Meth. 13:215 (1976)). Los anticuerpos marcados de la presente invención pueden ser usados para análisis in vitro» in vi o e in situ para identificar células o tejidos que expresan un péptido específico. También ße puede inmovilizar loe anticuerpos descritos arriba sobre un soporte sólido. Los ejemplos de dichos soportes sólidos incluyen plásticos» tales como policarbonato» carbohidratos complejos» tales como agarosa y sefaroßa» resinas acrílicas» tales como poliacrilamida y granulos de látex. Las técnicas para acoplar anticuerpos a dichos soportes sólidos son bien conocidas en la materia.

(Weir y coautores» "Handbook of Experimental Im unology", 4a. edición» Blackwell Scientific Publ cat onß» Oxford. Inglaterra» Capítulo 10 (19B6); Jacoby y coautores. Meth. Enzym. 34» Academic Press NY» EUA (1974)). Los anticuerpos inmovilizados de la preßente invención pueden ser usadoß para análisis in vivo» in vitro e in situ» así como en i munocromotografía. Por otra parte» quien sea experto en la materia puede adaptar fácilmente los procedimientos actualmente disponibles, así como las técnicas, los métodos y loe equipos descritos arriba» con respecto a anticuerpos» para generar péptidos capaces de unirse a una secuencia de péptido específica» a fin de generar los péptidos antipéptidos racionalmente diseñados, por ejemplo, véase Hurby y coautoreß, "Application of Synthetic Peptides: Antisenße Peptides", en Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, EUA, páginas 289-307 (1992) y Kaspczak y coautores, Biochemistry 2B:9230-B (1989). Se puede generar los péptidos an ipéptido reemplazando los residuos de aminoácido básicos en la secuencia de péptido de AUR-1 y/o AUR-2 con residuoß ácidos, al mismo tiempo que se mantienen los grupos polares hidrófobos y no cargados. Por ejemplo, se reemplaza los residuoß lisina» arginina y/o histidina por ácido aßpártico o ácido glutámico y loe residuos ácido glutámico son reemplazados por lisina, arginina o histidina.

VII.- UN MÉTODO Y UN EQUIPO QUE SE BASAN EN EL ANTICUERPO. PARA DETECTAR AUR-1 Y/O AUR-2 La presente invención comprende un método para detectar un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2 en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la mueßtra con el anticuerpo descrito arriba. bajo condiciones tales que formen inmunocomplejos; y (b) detectar la presencia del anticuerpo unido al polipéptido. En detalle, loe métodos comprenden incubar una muestra de prueba con uno o más de loe anticuerpos de la presente invención y analizar si el anticuerpo se une a la muestra de prueba. Los niveles alterados de AUR-1 y/o AUR-2 en una mueßtra. en comparación con loe niveleß normales, pueden indicar enfermedad. Las condiciones para incubar un anticuerpo con una muestra de prueba varían. Las condiciones de incubación dependen del formato empleado en los análisis, de los métodos de detección empleados y del tipo y la naturaleza del anticuerpo usados en el análisis. Los expertos en la materia reconocerán que cualquiera de los formatos de anál sis inmunológico actualmente disponibles (tales como los radioinmunoanálisiß, los análisis i nmunosorbentes enlazados por enzima, la difusión con base de Oucheterlony o loe análisis de inmunofluorescencia de cohete) pueden ser adaptados fácilmente para emplear los anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos de dichos análisis pueden ßer encontrados en Chard, "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniqueß" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Loe Países Bajos (1986); Bul lock y coautores, "Techniques in Immunocytochemistry", Academic Prese, Orlando Florida» EUA» Vol . 1 (1982), Vol. 2(19B3), Vol . 3 (1985)5 Tijsßen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays : Laboratory Techniqueß in Biochemistry and Molecular Biology". Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Los Países Bajos (1985). Las muestras de prueba en el análisis inmunológico de la presente invención, incluyen células, extractoß de proteína o de membrana de las células o fluidos biológicos tales como sangre, suero, p asma u orina. La muestra de prueba usada en el método arriba descrito variará con base en el formato de análisis, en la naturaleza del método de detección y en los tejidos, células o extractoß usados como muestra que va a ser analizada. Los métodos para preparar extractos de proteína o extractos de membrana de células son bien conocidos en la técnica y pueden ser adaptados fácilmente a fin de obtener una muestra que sea capaz con el sistema utilizado. Un equipo contiene todos loe reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de detección descritos previamente. El equipo puede comprender: (i) un primer medio recipiente que contiene un anticuerpo descrito arriba; y (ii) un segundo medio recipiente que contiene un conjugado que comprende un partícipe de unión del anticuerpo y un marcador. En otra modalidad preferida, el equipo comprende además uno o más recipientes diferentes que comprenden uno o más de los siguientes: reactivoß de lavado y reactivos capaces de detectar la presencia de loe anticuerpos unidos. Los ejemplos de reactivoß de detección incluyen, pero sin l mitación a ellos, anticuerpos secundarios marcados o, al ternetivamente, si está marcado el anticuerpo primario, los reactivos cromóforos, enzimáticos o de unión de anticuerpo, que son capaces de reaccionar con el anticuerpo marcado. El equipo con compartimentos puede ser como se describió anteriormente para los equipos de sonda de ácido nucleico. Quienes sean expertos en la materia reconocerán fácilmente que loe anticuerpoß descritos en la preßente invención pueden ser incorporados fácilmente en uno de los formatos de equipo establecidos, que son bien conocidos en la materia.

VIII.- AISLAMIENTO DE LOS COMPUESTOS QUE INTERACTUAN CON AUR-1 Y/Q AUR-Z La presente invención se refiere también a un método para detectar un compuesto capaz de unirse a un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2, que comprende incubar el compuesto con AUR-1 y/o AUR-2 y detectar la presencia del compueßto unido a AUR-1 y/o AUR-2. El compuesto puede estar presente dentro de una mezcla compleja» por ejemplo» suero» fluido del cuerpo o extractos de células. La presente invención se refiere también a un método para detectar un agonista o antagonista d la actividad de AUR-1 y/o AUR-2, o de la actividad de partícipe de unión de AUR-1 y/o AUR-2» que comprende incubar células que producen AUR-1 y/o AUR-2 en presencia de un compuesto y detectar los cambios en el nivel de la actividad de AUR-1 y/o AUR-2 o de la actividad de partícipe de unión de AUR-1 y/o AUR-2. Los compuestos así identificados producirían un cambio en la actividad» que indicaría la presencia del compuesto. El compuesto puede eßtar presente dentro de una mezcla compleja» por ejemplo» suero» fluido del cuerpo o extractos de células. Una vez que se identifica el compuesto se lo puede aislar utilizando técnicas bien conocidas en la materia. La presente invención también comprende un método para agonizar (estimular) o antagonizar la actividad asociada con AUR-1 y/o AUR-2 en un mamífero» que comprende administrar al mamífero un agonista o un antagonista para AUR-1 y/o AUR-2» en una cantidad suficiente para efectuar dicho agonismo o antagonismo. Un método para tratar laß enfermedades en un mamífero con un agonista o antagonista de la actividad relacionada con AUR-1 y/o AUR-2» comprende administrar el agonista o antagonista a un mamífero en una cantidad suficiente para agonizar o antagonizar laß funciones aßociadaß con AUR-1 y/o AUR-2» y también eßtá comprendido en la preßente ßolicitud.

IX.- LOS ANIMALES TRANS6ENIC0S Se dispone de una variedad de métodos para la producción de animales transgénicos» asociados con la presente invención. Se puede inyectar el ADN en el pronúcleo de un huevo fertilizado antes de la fusión de los pronúcleos macho y hembra» o se puede inyectar en el núcleo de una célula embriónica (por ejemplo» en el núcleo de un embrión de dos células)» después del inicio de la división de la célula (Brinster y coautores. Proc. Nati. Acad. Science. USA. 82:4438- 4442 (1985)). Se puede infectar los embriones, especialmente retrovirus. modificados para llevar laß secuencias de nucleótido receptor de ion inorgánico de la presente invención. Se puede manipular células de procedencia pluripotente, derivadas de una masa de células interna del embrión y eßtabi 1 izadas en cultivo, en un cultivo para incorporar las secuencias de nucleótido de la presente invención. Se puede producir un animal transgénico a partir de dichas células mediante la implantación en un bastocito que ße implanta en una madre adoptiva y ße deja que llegue a término. Loe anima eß adecuados para loe experimentos transgénicos pueden ser obtenidos de fuentes comerciales normales» tales como Charles River (Wilmington» MA» EUA)» Taconic (Germantown» NY. EUA). Harían Sprague Dawley (Indianapol is. IN. EUA). etc. Los procedimientos para la manipulación del embrión de roedor y para la ieroinyección de ADN en el pronúcleo del zi oto son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia (Hogan y coautores, supra). Loe procedimientos de microinyecc?ón para huevos de peces, de anfibios y para aves están detallados en Houdebine y Chourrout, Experientia 47:897-905 (1991). Otros procedimientos para la introducción de ADN en tejidos de animales están descritos en la patente estadounidense No. 4.945.050 ( Sandford y coinventores. 30 de julio. 1990). A manera de ejemplo únicamente, para preparar un ratón transgénico. se induce a que supero uTen los ratones hembras. Se colocan las hembras con los machos y las hembras apareadas son sacrificadas medi óte asfixia con C03 o mediante dislocación cervical, y ße recupera loe embriones de loe oviductos extirpados. Se eliminan laß células de cumuluß circundantes. Luego se lava los embriones pronucleares y se los a macena hasta el momento de la inyección. Se forman pares de ratones hembras adultas» con ciclos aleatorios» con machos vasectomizados. Se aparean las hembras receptoras al mismo tiempo que las hembras donadoras. Los embriones son transferidos entonces quirúrgicamente. El procedimiento para generar ratas transgénicas eß similar al de los ratones. Véase Ham er y coautores. Cell . 63:1099-1112 (1990). Los métodos para el cultivo de laß células de est rpe embriónica (ES) y la producción subßecuente de animales transgénicos mediante la introducción de ADN en laß células ES» utilizando métodos tales como electroporación» precipitación con foßfato de calcio/ADN y mediante inyección directa, también son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia, véase, por ejemplo. Teratocarcino as and Embtyonic Stem Cells. A Practical Approach. E.J. Robertson. editor. IRL Press (1987). En el caso que implica la integración aleatoria de genes, un clon que contiene la secuencia o secuencias de la invención es transfectado con un gene que codifica resistencia. Alternativamente, se enlaza físicamente el gene que codifica la resistencia a la neomicina con la secuencia o las secuencias de la invención. Se lleva a cabo la transfección y el aielamiento de los clones deseados mediante cualquiera de los diversos métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia (E.J. Robertson. supra) . Las moléculas de ADN introducidas en las células ES también pueden ser integradas en el cromosoma mediante el procedimiento de recombinación homologa. Capecchi» Science» 244:1288-1292 (1989). Los métodos para la selección positiva del evento de recombinación (eß decir» la neo-resistencia) y la selección positivo-negativa doble (es decir» la neo-resistencia y la resistencia a ganciclovir) y la identificación subßecuente de los clones deseados mediante RCP. han sido descritos por Capecchi. supra y Joyner y coautores» Nature. 338:153-156 (19B9). cuyas enseñanzas quedan incorporadas aquí. La fase final del procedimiento es inyectar las células ES de destino en blastocitos y transferir los blastocitos a hembras pßeudopreñadaß. Los animales quiméricos resultantes son criados y las crias son analizadas mediante manchado de Southern para identificar los individuos que llevan el tranßgene. Los procedimientos para la producción de loe mamíferos no roedores y otros animales han sido discutidos por otros. Véase Houdebine y Chourrout. supra ; Pursel y coautores Seience » 244:1281-1288 (1989); y Simms y coautores» Bio/Technology 6:179-183 (19BB). De tal manera» la invención provee mamíferos no humanos» transgénicos» que contienen un transgene que codifica un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» o un gene que efectúa la expresión de un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2. Dichos mamíferos no humanos transgénicos son particularmente útiles como un sistema de prueba in vivo para estudiar los efectos de introducir un polipéptido de AUR-1 y/o AUR-2» regular la expresión de AUR-1 y/o AUR-2 (es decir» mediante la introducción de genes adicionales» ácidos nucleicos de sentido opuesto» o ribosimas). Un "animal tranßgénico" eß un animal que tiene células que contiene ADN que ha sido injertado artificialmente en una célula» y dicho ADN se vuelve parte de la genoma de ese animal que se desarrolla a partir de esa célula. Loe animales tranßgénicos preferidoß ßon pri atee» ratoneß» ratas» vacas» cerdos» caballos» cabras» ovejas» perros y gatos. El ADN transgénico puede codificar un polipéptido AUR—1 y/o AUR—2 humano. La expresión natural en un animal puede ser reducida proporc onando una cantidad de ARN o ADN de sentido opuesto» efectiva para reducir la expresión del receptor.

X.- LA TERAPIA CON GENES También puede ser útil el AUR-1 y/o AUR-2 o sus secuencias genéticas en la terapia con gene (resumida en Mi 11er. Nature, 357:455-460 (1992). Mi 11er señala que los avances han dado por resultado enfoques prácticos en la terapia con genes humanos, que han demostrado resultados iniciales positivos. La ciencia básica de la terapia con genes está descrita en Mulligan, Science, 260:926-931 (1993). En una modalidad preferida, un vector de expresión que contiene la secuencia codificadora de AUR-1 y/o AUR-2 eß insertada en las células, se desarrolla laß células in vitro y luego se infunden en números grandes de pacientes. en otra modalidad preferida, ße transfiere un segmento de ADN que contiene un promotor de selección (por ejemplo, un promotor fuerte) en células que contienen un AUR-1 y/o AUR-2 endógeno, de tal manera que el segmento promotor incremente la expresión del gene AUR-1 y/o AUR-2 endógeno (por ejemplo, ße transfiere el segmento promotor a la célula de tal manera que quede enlazado directamente con el gene de AUR-1 y/o AUR-2 endógeno). La terapia con genes puede implicar el uso de un adenovirus que contiene el cADN de AUR-1 y/o AUR-2, al que ße destina en un tumor, incremento sistémico de AUR-1 y/o AUR-2 mediante implantación de células tratadas por ingeniería, la inyección con virus de AUR-1 y/o AUR-2 o la inyección de ADN de AUR-l y/o AUR-2 natural, en tejidos apropiados. Se puede modificar las poblaciones de células de destino introduciendo formaß alteradas de uno o máß de loe componenteß de loe complejos proteínicos, a fin de modular la actividad de dichos complejos. Por ejemplo, al reducir o inhibir la actividad de un componente complejo dentro de las células de destino, se puede disminuir, inhibir o revertir uno o más eventos de transducción de señal anormal, que conducen a una condición. Los mutantes de un componente, por omisión, o por sentido erróneo, que retienen la capacidad de interactuar con otros componentes de loe complejos proteínicos, pero no pueden funcionar en la transducción de señal, pueden ser usados para inhibir un evento de transducción de señal perjudicial, anormal . Los vectores de expresión derivados de virus, tales como retrovirus, virus de vacunas, adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes, varios viruß de ARN o viruß del papiloma bovino, pueden ßer usados para el suministro de secuencias de nucleótido (por ejemplo, cADN), que codifican la proteína recombinante de AUR-l y/o AUR-2» en la población de células de destino (por ejemplo, células tumorales). Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia pueden ser usados para construir vectores virales recombinantes que contienen secuencias codificadoras. véase» por ejemplo» las técnicas descritas en Maniatis y coautores» Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory» NY» EUA (1989) y en Ausubel y coautores» Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, EUA (1989). Alternativamente» laß moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican secuencias de proteína pueden ser usadas como ADN natural o en un sistema reconstituido» por ejemplo» liposomas u otros sistemas lípidos» para suministro a las células de destino (por ejemplo» véase Felgner y coautores» Nature» 337:3B7-B (1989)). Otros diversos métodos para la transferencia directa del ADN de plásmido a las cél las existen para uso en terapia con genes humanos e implican destinar el ADN a receptores en células mediante la formación de complejo del ADN plásmido con las proteínas. Véase Mi 11er» supra. En su forma más simple» se puede llevar a cabo la transferencia de genes mediante la simple inyección de cantidades diminutas de ADN en el núcleo de una célula» a través de un procedimiento de m cro nyección. Capecchi, MR. Cell 22;479-88 (1980). Una vez que se introduce los genes recombinantes en une célula, pueden ser reconocidos por loe mecanismos normales de las células para la transcripción y la translación, y se expresará un producto de gene. Se ha intentado otros métodos también para introducir el ADN en números mayores de células. Estos métodos incluyen la transfección. en donde se precipita el ADN con CaPO^ y se recoge en células mediante pinocitosis (Chen C. y Okayama H.

Mol. Cell Biol. 7:2745-52 (19B7))5 electroporaci n. en donde se expone las células a pulsos grandes de voltaje para introducir agujeros en la membrana (Chu G y coautores. Nucleic Acids Res.. 15:1311-26 (1987)); 1 ipofección/fusion de liposoma, en donde se empaca el ADN en vesículas lipofílicas que se funden con una célula de destino (Felgner PL y coautoreß, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7 (1987)); y bombardeo con partículaß, utilizando el ADN unido a proyectiles pequeños (Yang NS y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci. 87:9568-72 (1990)). Otro método para introducir el ADN en células es acoplar el ADN a proteínas químicamente modificadas. También se ha demostrado que laß proteínas de adenovirus son capaces de desestabilizar loe endosomas y de incrementar la absorción de ADN en las células. La mezcla de adenovirus con soluciones que contienen complejos de ADN o la unión de ADN a pol i lisina unida covalentemente al adenovirus utilizando agentes entrelazadores de proteína, mejora sustancialmente la recolección y expresión del gene recombinante. Curiel DT y coautores, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 6:247-52 (1992). Tal como se ußa en la presente, "transferencia de genes" significa el procedimiento para introducir una molécula de ácido nucleico extraña en una célula. La transferencia de genes comúnmente se lleva a cabo para incrementar la expresión de un producto particular codificado por el gene. El producto puede incluir una proteína» un polipéptido» un ADN o ARN de sentido opuesto o un ARN enzimáticamente activo. Se puede levar a cabo la transferencia de genes en células cultivadas o mediante administración directa a animales. La transferencia de genes implica generalmente el procedimiento de poner en contacto el ácido nucleico con una célula de destino mediante interacciones no específicas o mediadas por receptor» la recepción de ácido nucleico en la célula por medio de la membrana o por endocitosis» y la liberación del ácido nucleico en el citoplasma a partir del plasma» de la membrana o del endosoma. La expresión puede requerir» además» el movimiento del ácido nucleico hacia el núcleo de la célula y la unión a factores nucleares apropiados» para la transcripción. Tal como se usa en la presente "terapia de genes" es una forma de transferencia de genes y se incluye dentro de la definición de transferencia de genes» tal como ße ußa en la presente» y se refiere específicamente a la transferencia de genes para expresar un producto terapéutico a partir de una célula in vivo o vitro. Se puede llevar a cabo la transferenc a de genes ex vivo en células que son transplantadas luego en un paciente» o ße puede llevar a cabo mediante la ad inißtración directa del ácido nucleico o del complejo de ácido nucleico-proteína» en el paciente. En otra modalidad preferida» se provee un vector que tiene secuencias de ácido nucleico que codifican un AUR-l y/o AUR-2» en donde a secuencia de ácido nucleico es expresada únicamente en tejido específico. Los métodos para obtener expresión de genes específica para el tejido» están señalados en la publicación internacional No. WO 93/09236» presentada el 3 de noviembre de 1992 y publicada el 13 de mayo de 1993. En todos los vectores precedentes» señalados arriba» otros aspecto de la invención es que la secuencia de ácido nucleico contenida en el vector puede incluir adiciones» omisiones o modificaciones a algo o a toda la secuencia de ácido nucleico» tal como se definió arriba. En otra modalidad preferida» se señala un método para el reemplazo de genes. "Reemplazo de genes" tal como se usa en la presente» significa suministrar una secuencia de ácido nucleico que es capaz de ser expresada in vivo en un animal» y proveer de esa manera o incrementar la función de un gene endógeno que está fáltente o defectuoso en el animal.

EJEMPLOS Los ejemplos que vienen a continuación son no limitativos y solamente son repreßentati voß de diverßoß aßpectoß y características de la presente invención. Los ejemplos que vienen a continuación demuestran el aislamiento y la caracterización de las proteínas novedosas AUR-l y AUR-2. Las quinasas de proteína son una de las familias más grandes de proteínas eucarióticas con varios cientos de miembros conocidos. Estas proteínas comparten un dominio de 250 a 300 aminoácidos» que se puede subdividir a 12 subdomínios distintos que comprenden la estructura de núcleo catalítica común. Estos motivos proteínicos conservados han sido explotados recientemente utilizando estrategiaß de clonación a base de RCP» que conducen a una expansión significativa de laß quinasas conocidas. La múltiple alineación de las secuencias en el dominio catalítico de las quinasas de proteína y el análisis filogenético subsecuente permite su segregación a un árbol filogenético. De esa manera» las quinasas relacionadas son agrupadas a ramas distintas o subfamilias que incluyen: tirosina-quinasas, quinasas que dependen del nucleótido cíclico» quinasas de calcio/calmodul in, quinasas dependientes de ciclina y MAP-qui asaß, así como otraß varias subfamilias menos definidas. Inicialmente se procede a identificar los homólogos de CCK4» un receptor que representa una familia distinta de tirosina-quinasas. Las múltiples alineaciones sugirieron que CCK4 estaba más íntimamente relacionada con REOS y con la familia TRK de laß tirosina-quinasas receptoras. Se diseñó sensibi izadores degenerados para conservar las secuencias dentro de los subdominios de quinasa I y IX de esos receptores. El subdominio I eßtá en el extremo N del dominio de quinasa y contiene el motivo de consenso GXGXXGXV que eßtá implicado en el anclaje de ATP a la unidad catalítica de todas las clases de quinases. El subdominio IX contiene un Asp casi invariable que actúa para estabilizar el rizo catalítico, uniéndose a residuos en el subdominio VIB. Este Asp invariable y que flanquea los aminoácidos frecuentemente es usado en estrategias de clonación por RCP, ya que distingue laß tiroßina-quinaßas (DVWSY/FGI/V) de las serina/treonina-quinasaß (DXWA/SXGI/V) . Con base en la comparación de todas las quinasas de proteína conocidas, se diseñó sensibilizadores de oligonucleótido degenerados para los subdominios I y IX que recogieran solamente CCK4 y su homólogo de pollo KLG, mediante RCP. Se diseñó sensibilizadores degenerados A y DVW que se basan en residuos conservados dentro del dominio de quinasa CCK4, para uso en la identificación de quinasas novedosas, utilizando la reacción de cadena de polimerasa (RCP). Cuando se aplica al sscADN de célula HEPM, como una plantilla, se aisló copias múltiples de CCK4 así como un fragmento de ADN novedoso (43-43) de 567 pares de bases, con homología con las demás quinasas. La secuencia novedosa fue muy similar a la quinaßa aurora de Drosófila (No. de acceso del GeneBank XB3465) y se diseñó el clon Auroral humano. Utilizando ese fragmento como una sonda se discriminó los ARN de numerosas líneas de células de cáncer de colon y una mancha de Northern de tejido múltiple humano, lo que demuestra una selectividad aparente en la expresión de Auroral en células tumorales. También se usó la sonda Auroral para discriminar un banco de cADN construido a partir del mARN de la línea de células de cáncer pancreático humano para aislar los clones traslapantes que cubren el marco de lectura abierta completo de Auroral. De los múltiples clones aislados» siete corresponden a Auroral humano. También se aisló dos clones débilmente hibridantes adicionales, durante esta discriminación, y el análisis de secuencia reveló que correspondían a una quinasa relacionada» aunque distinta» que fue designada Aurora2 humana. AUR0RA1 y AUR0RA2 recombinantes se expresaron en células COS migradas con Mr aparente de 39.000 y 46,000. consistentes con sus pesos moleculares predichos de 39264 y 46730. con base en su secuencia de aminoácido primaria. Este análisis confirma que la proteína recombinante puede ser producida de manera estable en células de mamíferos. Los análisis de fosforilación para determinar la especificidad de destino de estas quinasas putativas se están llevando a cabo. Se generó inmunorreactivos específicos en conejos contra la secuencia de péptido de dominios N-terminales de AUR1 y AUR2» y se usó estos reactivos para localizar la expresión de Auroras endógenas y recombinantes dentro de las células. Adicionalmente, se puede utilizar esoß reactivoß en un esfuerzo por identificar los substratos para laß AURORAS a fin de comprender mejor su papel biológico normal. Laß formaß negativa dominante y cons itut vamente activas de AUR1 y AUR2 serán útiles para delinear consecuencias biológicas en la oblación y en la sobre-expreßión de estas serina/treonina-quinaßaß putativas. Los estudios iniciales con construcciones de ADN alteradas demuestran que en ßol amenté 2 horas después de la infección de células NIH3T3 o BALB/3T3 con materiales retrovirales de AUR1 y AUR2, las células quedaron muí tinucleadas. Eßte fenotipo persistió de tal manera que dos días después de la infección se encontró que algunas células tenían hasta 20 núcleos. Las células muí tinucleadas típicamente tuvieron un citoplasma incrementado y límites de células difusos. El inmunomanchado con actina y con DAPI confirmó que estoß núcleos estaban contenidos todos dentro de una célula, y que el citoesqueleto de actina era aparentemente normal. Los experimentos que se están llevando a cabo ße dirigirán al contenido del cromoßoma y a lo intacto dentro del núcleo, al número y ubicación del centroßoma y a la organización general de la red icrotubular. La caracterización con secuencias a largo plazo de la expresión de AUR1 y AUR2 normales, constitutivamente activas y negativa dominante está en estudio, y particularmente si inducen o invierten la transformación celular. Se está aislando clones estables que expresan esas proteínas recombi antes. Estarán caracterizadas por la velocidad de crecimiento, por la síntesis de ADN» la inhibición del contacto con la célula (formación de focos) » el desarrollo independiente del anclaje (análisis en agar blando) y la tumoricidad en ratones sin pelo. ¿Qué papel juegan laß Auroras en la reproducción y segregación de centroßomaß de mamífero? La interrupción o desregulación de dichas funciones se sabe que da por resultado la falta de agregación de cromoßomaß» husos monopolares y división polar en levadura» drosófila y anfibios. La homología entre Auroras humanas y la aurora de levadura IPL1 y de drosófila es chocante. Por lo tanto» es conveniente determinar si las Auroras humanas son equivalentes funcionales de la levadura IPL1. El gene IPL1 de levadura es necesario para la segregación de cromosoma con alta fidelidad en 3Saccharomyces cerevisiae (Francisco, L. y coautores, Mol. Cell Biol. 14:4731-4740 (1994)) y se ha aislado un mutante sensible a la temperatura. Se planifica determinar si diversas versiones de longitud completa y quiméricas de las Auroras humanas pueden complementar este mutante senßible a la temperatura en levaduras. Las construcciones quiméricas que contienen el dominio N-terminal de IPL1 y el dominio de quinasa de laß Auroraß humanas permitirán determinar ßi la quinasa es funcionalmente equivalente, al mismo tiempo que evitan los papeles regulador potencial o de localización intracelular mediados por los dominios N-termi nales menos bien conservadoß. En caso de que los genes humanos compensen la pérdida de IPL1 de función, se podría utilizar dicha línea para discriminar los inhibidores de molécula pequeña de la quinasa de Aurora humana.

CLONACIÓN MOLECULAR Se aisló el total de ARN utilizando el protocolo de extracción con sal de guanid na/fenol de Chomczynßki y Sacchi (P. Cho czynski y N. Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156 (1987) a partir de próstata humana normal, duodeno, ovario, hígado pituitaria, cerebro, timo y glándulas salivales, de células HEPM humanas (meßenquima palatal), a partir de tumor humano primario de Wilm y de carcinoma de los ovarios, y a partir de las líneas de células tumorales humanas que ße originan del colon/recto (HT29, SW480, SW1463, SW1417, SW837, SW94B. SW620. SW403. SW111G. TB4» HTC15» LS123 y caco-2) » del riñon (CaKi-1, CaKi-2), del hígado (SK-HEP-1). del páncreaß (HS766T, ASPC» Capan-1) y de mama (MCF7). Eßtos ARN fueron usados como plantilla para generar los cADN de un solo filamento» utilizando el sieterna de prea pl ificación de superíndice para el equipo de síntesis de primer filamento» adquirido de GibcoBRL (Life Technologies» U.S.A.; Gerard» GF y coautoreß (1989), FOCUS 11, 66) bajo laß condiciones recomendadas por el fabricante. Una reacción típica utilizó 10 µg en total de ARN o 2 µg de poli (A)* ARN con 1.5 µg ol igo(dtT) i?_iß, en un volumen de reacción de 60 µl . Se trató el producto con aRNseH y ße diluyó a 100 µl con Ha0. Para la ampl ficación de RCP subsecuente se utilizó en cada reacción de 1 a 4 µl de eßtos sscADN. Se sintetizó los o igonucleótidos en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems 394, utilizando química de fosforamidita establecida, y luego se los utilizó sin purificar después de purificar con etano. Los sensibilizadores de oligonucleótido degenerados son: A = 5»-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC- 3' (SEQ ID NO: 16) (del 6B mismo sentido) y DVW ß 5»-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC- 3» (SEQ ID N0:17) (sentido opuesto) . Estos sensibilizadores fueron derivados de laß ßecuencias de péptido EFGEVFLA (SEQ ID NO: 18) (filamento del mismo sentido procedente del subdominio I de quinasa) y DVW(A/S)FGVL (filamento de sentido opuesto procedente del subdominio IX de quinasa), respectivamente. Laß designaciones de residuo de nucleótido degenerado son: N = A» C. G o T; R = A o G; y Y = C o T. Utilizando CCK4 como plantilla» estos sensibilizadores producen un producto de 567 pares de bases. Se llevó a cabo una reacción de RCP uti izando los sensibi 1 izadoreß A y DVW aplicados a laß fuenteß de un solo fi amento señaladas arriba. Se añadió loe sensibilizadores a una concentración final de 5 µmoles cada uno» a una mezcla que contenía 10 mmoles de Tris-HCl (pH 8.3). 50 mmoles de KCl. 1.5 mmoles de MgCl3» 200 µmoles de cada uno de trifosfato de desoxinucleosida» 0.001% de gelatina y 1.5 unidades de ADN-polimeraßa AmpliTaq (Perkin-Elmer/Cetuß) y 1 a 4 µl de cADN. Después de una desnaturalización a 95°C durante 3 minutos» las condicioneß de ciclo fueron 94°C durante 30 segundos» 37°C durante 1 minuto» una rampa de 2 minutos hasta 72°C y 72°C durante 1 minutos durante los 3 primeros ciclos» seguidos por 94°C durante 30 segundos» 50°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto 45 segundos, durante 35 ciclos. Los fragmentos de RCP que migran a entre 500 y 600 pares de bases fueron aißladoß a partir de geles de agarosa al 2% ut lizando GeneClean (BiolOl)» y se los clonó por T-A en el vector pCRII (Invitrogen Corp. EUA). de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se seleccionó laß colonias para preparaciones de ADN de miniplás ido utilizando columnas Qiagen y se determinó la secuencia de loe ADN de plásmido ut l zando el equipo terminador de colorante» deterrni ador de secuencia de ciclo» utilizando ADN-pol imerasa AmpliTaq» FS (ABI» Foster City» CA» EUA). Se operó los productos de reacción de determinación de ßecuencia en el secuenciador de ADN ABI Prism 377 y se analizó utilizando el algoritmo de alineación BLAST (Altschul» S.F. y coautores» J. Mopl . Biol. 215:403-10). Se aisló un clon novedoso (843-43)» por RCP con los sensibilizadores A y DVW en cADN de un solo filamento, procedente del mesenquima palatal embriónico humano (HEPM o CRL1486) como plantilla. Este clon fue designado como un fragmento de Auroral humana. Se construyó un banco de cADN lambda ZapII (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, EUA) utilizando mARN procedente de una reunión de líneas de células de carcinoma pancreático como una plantilla para la síntesis de cADN de primer filamento. Se discriminó el fago en filtros de microcelulosa con el inserto marcado con aP, sens bi 1 izadora aleatoriamente, procedente de p43-43 que codifica Auroral humana a 2x10* cpam/ l , en regulador de hibridación que contiene ßxSSC. l? reactivo de Denhardt, 0.1% de SDS» con 0.1 mg/ml de ADN de eßperma de salmón fragmentado y desnaturalizado. Después de hibridar durante la noche a 65°C» se lavó los filtros en O.lxSSC» 0.1% de SDS a 65°C. Se determinó la secuencia de clones de cADN de longitud completa en ambos filamentos, utilizando la determinación de secuencia manual con polimerasa T7 y sensibilizadores de oligonucleótido (Tabor y Richardson, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA» 84:4767-71).

EJEMPLO 2 ANÁLISIS PE MANCHA PE NORTHERN Se obtuvo manchados de Northern que contenían 2 µg de poli A+ARN por carril» a partir de 16 diferentes tejidos humanos adultos (bazo» timo» próstata» testículo» ovario» intestino delgado» mucosa colónica» corazón» cerebro» placenta» pulmón» hígado» músculo esqueletal» riñon» páncreas y leucocitos de sangre periférica), cuatro diferentes tejidos fetales humanos (cerebro, pulmón, hígado y riñon) y 8 líneas de célulaß de cáncer humano (HL60. HeLa. K-562. MOLT-4. Raji . SW480 y G361) en una membrana de nylon modificada con carga, a partir de Clontech (Palo Alto. CA. EUA). Se preparó manchados de Northern adicionales operando 10 µg de ARN total aislado de líneas de células tumorales humanas, en un gel al 1.2% de agarosa con formaldehído. desnaturalizante» y transfiriendo a membranas de nylon. Se hi bridó los filtros con sondas de preparación aleatoria, marcadas con C^^PDdCTP. sintetizadas ya sea del inserto de 427 pares de bases del clon 43—43 de Auroral humana o del fragmento EcoRI de 1162 pares de bases procedente de PSG20 y fragmento EcoRI de 1 kb del clon 11-1A de Aurora2 humana o el fragmento Ba HI-Not I de 1257 pares de bases, de PS621. Se llevó a cabo la hibridación a 60°C En 6XSSC. 0.1% de SDS» IX de solución de Denhart. 100 mg/ml de ADN de esperma de arenque desnatural izado con 1-2 ? 10* cpm/ml de sondas de ADN marcadas con 3aP. Se lavó los filtros en 0.1XSCC/0.1% de SDS» 65°C» y se expuso sobre la noche sobre película Kodak XAR-2. Se identificó un solo transcripto de mARN AUR1» de aproximadamente 1.4 kb» y se encontró que era más abundante en el timo y en el intestino delgado» con débiles señales de testículo» ovario» colon» placenta y bazo. La próstata y los linfocitos de sangre periférica fueron negativos. El hígado y el riñon fetales humanos también fueron positivoß con la ßeñal más débil en el pulmón fetal y sin expresión en el cerebro fetal (cuadro). Un análisis similar de la expresión de AUR2 humana oßtró un perfil de e?preßión más restringido. Se detectó un ßolo tranßcripto de AUR2» de 2.4 kb» fuertemente en el testículo adulto y el timo» y débilmente en Cmúsculo cardiaco» de placenta y esqueletalD, y en e 1 hígado fetal y en el riñon» mientraß que en otras fuentes de tejido normal fueron negativos (véase el cuadro).

ANÁLISIS DE NORTHERN DE AURORA 1 Y AURORA 2 EN CÉLULAS DE TEUIPO NORMAL Y CÉLULAS CANCEROSAS HUMANAS Tipo de células Origen AUR1 AUR2 Timo Tejido normal 5 4 Hígado fetal Tejido normal 4 2 Riñon fetal Tejido normal 4 1 ' Pulmón Tejido norma1 3 0 Duodeno Tejido normal 2 1 Colon Tejido normal 2 0 Pulmón fetal Tejido normal 2 0 Ovarios Tejido normal 2 0 Testículos Tejido normal 2 2 Cerebro Tejido normal 0 0 Cerebelo Tejido normal 0 0 Glándula salival Tejido normal 0 0 Corazón Tejido normal 0 0 Hígado Tejido normal 0 0 Páncreas Tejido normal 0 0 Riñon Tejido normal 0 0 Bazo Tejido normal 0 0 Estómago Tejido normal 0 0 Útero Tejido normal 0 0 Próstata Tejido normal 0 0 Músculo esqueletal Tejido normal 0 0 Cerebro fetal Tejido normal 0 0 Tipo de células Origen AUR1 AUR2 PBL Tejido normal 0 0 Glándula salival Tejido normal 0 0 Placenta Tejido normal 0 0 SF-268 Tumor del SNC 4 ND CCRF-CEM Leucemia 4 ND K-5G2 Leucemia 4 ND HCC-2998 Tumor de colon 4 ND SW620 Tumor de colon 4 2 KM-12 Leuce ia 4 ND MCF7/ADR-RES Tumor de mama 4 2 MDA-N Tumor de mama 4 ND BT-549 Tumor de mama 4 ND SW4B0 Tumor de colon 4 4 SW48 Tumor de colon 4 ND CalU-3 Tumor de pul ón 4 ND Calu3 Tumor de pulmón 4 2 T47D Tumor de mama 4 2 A375 Melanoma 4 0 SF767 Tumor del 1 SNC 4 0 SW1417 Tumor de colon 4 4 CaKi2 Tumor de riñon 4 0 Ca il Tumor de riñon 4 0 Caco2 Tumor de colon 4 4 SW1417 Tumor de colon 4 0 T98G Tumor del 1 SNC 4 0 Tipo de células Origen AUR1 AUR2 SF-539 Tumor del 1 SNC 3 ND SK-MEL-2 Melanoma 3 ND SK-MEL-5 Melanoma 3 ND R-4B Tumor gástrico 3 ND RF-1 Tumor gástrico 3 ND SW948 Tumor de colon 3 ND AGS Tumor gástrico 3 ND HFL1 Pulmón normal 3 ND OVCAR-8 Tumor de ovario 2 ND HT-29 Tumor de colon 2 ND MDA-MB-231 Tumor de mama 2 ND MDA-MB-435 Tumor de mama 2 ND SK-MEL-5 Melanoma 2 ND Kato-3 Tumor gástrico 2 ND ColO 205 Tumor de colon 2 ND ColO 320DM Tumor de colon 2 2 WiDr Tumor de colon 2 ND HT-29 Tumor de colon 2 ND SNU-C2B Tumor de colon 2 ND HTC15 Tumor de colon 2 2 T84 Tumor de colon 2 0 SW948 Tumor de colon 2 0 Daoy Tumor dell SNC 2 0 0VCAR3 Tumor de ovario 2 0 HS766T Tumor de páncreas 2 0 Tipo de células Origen AUR1 AUR2 SW1116 Tumor de colon 2 0 Tumor de Wilm Tumor de riñon 2 0 UO-31 Tumor renal 0 ND Se determinó el perfil de e?preßión de mARN de AUR1 en varioß tumores primarios y en varias líneas de células múltiples» de diverso origen neoplástico» mediante análisis de Northern y mediante análisis de RCP semi-cuantitati vo» utilizando sensibil zadores procedentes de las secuencias en el dominio de quinasa de AURl. Los resultados están incluidos en el Cuadro. Los transcriptos de AUR1 fueron detectados en cada línea de tumor analizada con la más alta expresión en diversas líneas de células de cáncer humano (SW480. Colo320» SW620» SW147» Caco2» SW12417) y en carcinoma de pulmón (Calu3)> carcinoma de mema (T47D. MCF7). melanoma (A375). carcinoma de riñon (CaKi-1. CaKi-2) » carcinoma de hígado (SK-HEP-1) y en tumores neuraleß (SF767» T9BG). La menor expresión de AUR1 se observó en otros carcinomas de colon (HTC15. TB4» SW94T. SW1116. HT29). tumores neurales (Daoy). carcinoma ovárico (0vcar2. tumor primario), carcinoma pancreático (HS766T) y un tumor de riñon primario. El perfil de expresión de AUR2 en las líneas de células tumorales fue chocantemente más restringido que el de AURl. La expresión fuerte de AUR2 fue detectada únicamente en las l neas de células de carcinoma de colon (Caco2, SW1417» SW620) mientras que se observó líneas débiles en otras líneas de células de colon (HTC15» Colo320)» de mama (T47D, MCF7) y de pulmón (Calu3). Otraß diversas líneas de tumores no tuvieron transcriptos de AUR2 detectables.

EJEMPLO 3 PETECCION PE RCP SEMICUANTITATIYA PE AURORA! Se aisló el ARN de una variedad de líneas de células humanas» tejidos congelados frescos y tumores primarios. Se sintetizó el cADN de un solo filamento a partir de 10 mg de cada ARN, como se describió anteriormente, utilizando el sistema Superscript Preempl ificatión (GibcoBRL). Luego se utilizó estas plantillas de un solo filamento en una reacción de RCP de 35 ciclos, con dos oligonucleótidos específicos de AUR0RA1 (3476: 5»-TTTGGCTCGGGAGAAGAAAAGCCAT- 3» (SEQ ID N0:19) y 3506: 5'-CATCATCTCTGGGGGCAGGTAGT- 3') (SEQ ID N0:20>. Se sometió a electroforeéis los productos de reacción en geles de agarosa al 2%, se manchó con bromuro de etidio y ße fotografió en una caja de luz UV. Se estimó la intensidad relativa de las bandas específicas de Auroral de aproximadamente 475 pares de bases» para cada muestra.

EJEMPLO - ANÁLISIS DE MANCHAS DE SOUTHERN Se aisló el ADN genómico de una variedad de líneas humanas trans ormadas (CaC02* HTC15, LS147T, SKC04, SW480» SW403. SW620. SW948» SW1417» SW1116» MCF7 » BT474) utilizando procedimientos comunes y corrientes (Maniatis y coautores). Se triptinizó células» se las lavó con PBS y se volvió a suspender a alrededor de 10" células/ml en regulador de digestión (100 mmoles de NaCl » 10 mmoles de Tris pH 8» 25 mmoles de EDTA» pH 8» 0.5% de SDS» 0.1 mg/ml de proteinasa K). Se sometió a lisis las células mediante incubación a 50°C durante 12 horaß, seguidas por extracción con fenol/cloroformo y se precipitó con un volumen igual de 7.5 moles de acetato de amonio y 100% de EtOH. Se volvió a suspender el ADN en el regulador TE. Se digirió aproximadamente 20 microgramos de ADN genómico con HindIII o XhoII a 37°C durante al menos 4 horas antee de fraccionar en geles de agarosa al 1%. Se transfirió loe fragmentos de ADN a membranas de ni troce uí osa, mediante el método de transferencia capital (Southern. EM» J. Mol. Bio. 98:503» 1975) y se hibridó con sondas especificad para Auroral y Aurora2 humana* tal como ße describió para el análisis de mancha de Northern anterior. Se restringió los ADN con HindIII puesto que los cADN de AUR1 y AUR2 contienen un solo sitio para eßta enzima de restricción. AUR1 mostró una sola banda de 4.3 kb de igual intensidad» procedente de todas las fuentes» lo que sugiere que es un solo gene no reacomodado» de una sola copia» en los múltiples tipos de tumor analizados. Sin embargo, bajo condiciones de baja exigencia» se pudo detectar fragmentos Sacl de 1.3 kb y 3.2 kb» que se hibridaron débilmente a la sonda AURl. La clonación y el análisis de secuencia reveló que está región codificada un pseudogene relacionado con AUR1» sin intrón (denominado AUR3) » con desplazamiento múltiples de marco. Adicionalmente» inmediatamente arriba del pseudogene AUR3» hay una región con repeticiones invertidas complejas» que se predijo que formaría un rizo de horquilla muy estable. La secuencia de ADN de AUR3 eß homologa con AUR1» comenzando desde el primer nucleótido de cADN de AURl. Inmediatamente corriente arriba de este sitio» está predicho un rizo de horquilla de AUR3. Actualmente se está caracterizando a los clones genómicos de AUR1 pas a determinar si la homología con AUR3 continúa corriente arriba de este nucleótido y si el ADN de AUR1 incluye o está precedido con un rizo de horquilla similar. AUR2 mostró bandas a 7.0 kb y 4.3 kb y una banda débil» de mayor peso molecular a alrededor de 10 kb, procedente de todas laß fuentes. Estos datos sugieren que AUR2 eß también un gene de una ßola copia. Las bandas múltiples que fueron vistas en laß manchas sondeadas con AUR2 probablemente son debidas al hecho de que se utilizó una sonda de cADN de longitud completa.

EJEMPLO 5 AN LISIS DE SECUENCIA DE CLONES DE CADN QUE CODIFICAN AURORAl Y AURQRAZ HUMANAS Se determinó la secuencia completa de Auroral y Aurora2 humanas a partir de clones de longitud completa de cada uno de los aislados del banco de carcinoma pancreático humano» procedente de duodeno humano normal » y de Auroral humana parcial aislada de células de HEPM. La secuencia de nucleótidos de Auroral humana (AURl_h) de 1.244 pares de bases» está mostrada en SEQ ID N?:i o SEQ ID N0:2 y contiene un solo marco de lectura abierto» que codifica un polipéptido de 344 aminoácidos. La región codificadora de AURl_h está flanqueada por una región 5* no transladada de 54 nucleótidos y una región 3' no transladada de 132 nucleótidos» que finaliza con una cola de pol i (A). La secuencia de nucleótidos de Aurora2 humana (AUR2_h)> de 2» 198 pares de bases» está mostrada en SEQ ID N0:i o SEQ ID NO:2 y contiene un solo marco de lectura abierto, que codifica un polipéptido de 403 aminoácidos. La región codificadora de AUR2_h eßtá flanqueada por una región 5T no transí adada de 200 nucleótidoß y una región 3» no transí adada de 768 nucleótidos. Las secuencias de cADN de AUR1 y AUR2 fueron determinadas a partir de tumor pancreático humano y de duodeno normal, sin diferencias de secuencia excepto por algunos sitioß probablemente pol imórficoß. Eßta ambigüedades incluyen: cADN Nucleótido Comentar o AUR1 1174 un clon tiene inserto poli A 873 T en todos los clones duodenales» C en el tumor pancreático 469 T en un clon» C en todos loe demás 848 G en un clon» A en todos los demás.- el aminoácido cambia E a G 1097 G en un clon» T en otros 2 956 G en un clon» A en otros 4 29 Empalme a 103 en 5 clones» sin empalme (como se muestra en 5 clones) AUR2 349 T en 1 clon. C en otros múltiples (el aminoácido cambia P a L) 369 A en 3 clones» G en otros múltiples (cambia AA V a I) . Las porciones terminales C de AUR1 y AUR2 conservan todos los 12 subdominios característicos de las quinases de proteína eucariótica. Estos dominios de quinasa de AUR1 y AUR2 están precedidos por un dominio N-terminal» de 74 y 130 aminoácidos» respectivamente. se comparó el nucleótido AUR1 y AUR2 y se dedujo las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N0:4) con el ADN disponible y las baseß de datoe de secuencias de proteínas que son únicas» con excepción de varias secuenciaß EST» que comparten una elevada identidad de ßecuencia. Sin embargo» sí tienen una homología chocante tanto en los dominios N. terminal como catalítico» con aurora de drosófila y con los genes IPL1 de Saccharomyces cerevisiae. Adicional ente» dos anotaciones de la base de datos no publicadas probablemente seßn homólogos cercanos de Xenopus laevis (p46APK - número de acceso de GB Z1726 y p46BPK - número de acceso de GB 217207). Los dominios N-terminales de Aurores procedentes de humano» de rana» de Drosófila y de levadura comparten una identidad de secuencia limitada. AUR2 de requisito tiene una abundancia de glutamatos frecuentemente preßente en paree separados por un solo residuo. La comparación de los dominios catalíticos de estas proteínas revela que AUR1 comparte el 70% de identidad de am noácidos con AUR2» 61% con aurora de Drosóf la y 45% con al gene IPL1 de levadura. La quinasa de AUR2 comparte 60% de identidad de aminoácidos con la proteína de Drosófila y 45% de identidad con IPL1 de levadura. Tanto AUR1 como AUR2 comparten menos de 45% de homología con todas laß demás quinasas de mamífero conocidas (la quinasa A de proteína dependiente de cAMP eß la más cercana)» lo que sugiere que son homólogos de estas quinasaß de Drosóf la y de levadura. AUR1 y AUR2 contienen ambas un sitio de fosforilación de quinasa de la proteína, dependiente de cAMP (THR232 de AUR1 y THR288 de AUR2). que se conserva en los homólogos de drosófila y de levßdura y un sitio regulador conocido en le quinasa dependiente de ciclina p34cdc2. AUR2 contiene un sitio PKA adicional en SER342. Ambas proteínes tienen también sitios de fosforilación múltiples de quinasa II de caseína (cinco y seis para AUR1 y AUR2) y de quinasa C de proteína (cuatro y diez para AUR1 y AUR2). AUR2 también tiene un solo sitio de consenso de fosforileción de tirosina en TYR334 que conserva también aurora de drosófila. pero no está presente en AUR1 ni en IPL1 de levadura. De manera intrigante, los mutantes naturales de la aurora de drosófila AUR_dm y del gene ILP1 de levadura dan por resultado la división nuclear asimétrica que conduce a la segregación errónea de cromosomaß y a loe husos monopolares atípicos. Eßte fenotipo parece ser el resultado de una falla en la separación den centrosoma. La arquitectura icrotubular asociada parece no estar afectada. Los mutantes naturales tanto en loe residuos de aminoácidos de drosófila como de levadura, de destino, que son conservados estrictamente entre las Auroras humanas» apoyan adicionalmente que son homólogos funcionales. Los residuos correspondientes en AUR1» que se encuentran en mutantee natural eß de AUR_dm o IPL1» ßon GLU125» THR232» PR0312» HIS324. Todas estas mutaciones están dentro del dominio catalítico y» pri cipalemente» una representa el sitio de fosforilación PKA conservado. Una mutación adicional en AUR_dm en ASP47» está en un residuo no conservado en el dominio N-terminal . Estos descubrimientos sugieren que la actividad catalítica puede jugar en realidad un papel central en la biología de la reproducción centrosomica o la segregación en los organismos inferiores» y sugiere que laß Auroras humanas puedan jugar un papel complementario en células de mamíferos.

EJEMPLO ß EXPRESIÓN RECQMBINANTE PE LA CONSTRUCCIÓN PEL VECTOR PE EXPRESIÓN PE AURORA! Y AURQRAZ Se generó construcciones de expresión mediante mutagénesis ayudada por RCP» en la cual los dominios completos de codificación de Auroral y Aurora2 fueron marcados en sus extremos carboxi-terminales con el epítope YPYDVPDYAS (SEQ ID N0:21) (Pati» 1992) de la hemaglutinina (HA) de influenza hemofílica. Se introdujo estas construcciones en dos vectores de expresión de mamíferos: pLXSN (Miller. A.D. y Roßman» G.J.. Biotechniques 7» 980-988. 1989) pera la generación de líneas productoras de virus; y pRK5 para el análisis de expresión transitoria. Se diseñó loe inßertoß para que estuvieran flanqueados por los sitios únicos BamHI y Notl. y fueron clonados directamente a pLXSN o pRK5» en los ßitioß 5*-BamHI y 3'-NotI. También se ligó las construcciones AUR1 y AUR2 de longitud completa» de BamHl-Notl a pRS316 (Liu» H. y coautores» Genetics 132:665-673» 1992). Este vector contiene un promotor inducible por galactosa en un vector de vaivén centromérico para expresión en Saccharomyces cerevisiae. Está por determinar si los genes humanos pueden complementar el mutante IPLl de levadura» sensible a la temperatura» relacionado» que está íntimamente relacionado con AURl. Además» las construcciones de fusión que contienen el dominio N-terminal de IPL1 de levadura» fundidos a» los dominios de quinasa C-terminal de AUR1 y AUR2» fueron generados. Estos fueron producidos por inserción de un ßitio Clal artificial en el extremo 5' de loe dominios de quinasa de las quinasas. en la secuencia Aßp-Asp-Phe-Glu conservada. También se hizo conßtruccioneß de AUR1 y AUR2 negativas» dominantes» tanto en pLXSN como en pRK5> por mutación del Lys invariable (posiciones de aminoácido 106 y 162 en AUR1 y AUR2» respectivamente)» a un Met por mutagénesis de RCP. Las conßtruccioneß fueron denominadas AUR1KM y AUR2KM. Se generó formas constitutivamente activas de AUR1 y AUR2 por mutación del ADN que encabeza la codi icación del ßitio de foßforilación (232 y 288). a un Aßp que da por resultado en AUR1TD y AUR2TD. También se hizo construcciones de expresión tanto en pLXSN como en pRK5 que contenían apenas el dominio no catalítico N-terminal de AUR1 y AUR2. Eßtoß fueron generadoß por RCP a partir de construcciones parientales y que contienen los 77 aminoácidos N-terminales de AUR1 y los 132 aminoácidos de AUR2. Los marcos de lectura abierta completos de AUR1 y AUR2 (sin etiqueta HA), excluyendo las metioninaß iniciadoraß, fueron generados por RCP y ligados al vector pGEX para la producción bacteriana de proteínas de fusión GST, para la inmunización de conejos, para la producción de anticuerpos.

EJEMPLO 7 S6NERACIQN PE LINEAS PE CÉLULAS PE AURORA PRQPUCTQRAS PE VIRUS Para generar materiales de viruß de alto título» ße transfectó construcciones recombinantes pLXSN que contenían genes AUR1 o AUR2. a una línea de células auxiliares anfotrópicas PA317» utilizando tranßfección mediada por CaCl-.. Después de selección en G418» se formó placas con laß células en medios normales G418 (500 µg/ml). Se utilizó los sobrenadantes de las células reßißtenteß para infectar la línea de célula auxiliar ecotrópica GP+E86 y nuevamente ße seleccionó las células en G41B. Se volvió a recoger nuevamente laß células reßißtenteß de G418 y ße cosechó loe sobrenadantes cada 8 a 12 horas» y se reunió como material de virus (Rede ann, N. , Holzmann, B., Wagner, E.F., Schlesßinger, J. y Ullrich, A., Mol. Cell. Biol. 12, 491-498, 1992). Los títulos de material viral fueron típicamente de alrededor de 10*/ml .

EJEMPLO fl INFECCIÓN RETROVIRAL DE CÉLULAS NIH-3T3 CON AURORAS Se desarrolló células NIH-3T3 y BALB/3T3 en placas de 100 mm con DMEM (Gibco) que contenía 10% de suero de ternera fetal (FCS). Se superinfectó les célulaß con retrovirus de AUR1 y AUR2, añadiendo aproximadamente 3 ml del sobrenadante viral a medios de cultivo de 15 ml , durante aproximadamente 24 horas. Las células que expresen laß construcciones retrovi ralee fueron seleccionadas entonces desarrollándolas entonces en DMDM/10% de FCS, suplementado con 500 µg/ml de G418.

EJEMPLO 9 GENERACIÓN DE INMUNORREACTIVO ESPECIFICO DE AURORA Se crió inmunorreactivos eßpecíficos para AURORA en conejos, contra péptidos sintéticos conjugados en KLH» que corresponden a la región N-terminal de AUR2 ( xo-^SAPENPEEQLASK**-* ) (SEQ ID NO:22) y (•°RPLNNTQKSKQPLa-°*) (SEQ ID N0:23). o el extremo N o el dominio N-terminal de AUR1 humana (^MAQKENSYPWPYG3-») (SEQ ID NO: 24) y ("PGWKVMENSSGTP*") (SEQ ID NO:25). Adicionalmente se generó inmunorreactivos inmunizando conejos con las proteínas de fusión de AUR1 y AUR2 con GDT» de longitud completa expresadas bacterianamente.

EJEMPLO 10 EXPRESIÓN TRANSITORIA PE AURORAS EN CÉLULAS PE MAMÍFEROS Se introdujo los plas idos de expresión pRK5 (lOµg de ADN/100 mm de placa) que contenía loe genes AUR1 y AUR2 marcados con HA. en células COS y 293. con lipofectamina (Gibco BRL). Después de 72 horas se cosechó las células en 0.5 ml de regulador de solubilización (20 mmoles de HEPES pH 7.35» 150 mmoles de NaCl. 10% de glicerol. 1% de Tritón X-100. 1.5 mmoles de MgCl-., 1 mmol de EGTA» 2 mmoles de fluoruro de feni lmetilsulfonilo» 1 µg/ml de aprotinina). Se resolvió las a ícuotas de muestra mediante SDS» electro oresis en gel de poliacrilamida (PAGE) sobre 15% de acri lamida/0.5% de geles de bis-acri lamida» y se transfirió electroforáticamente a nitrocelulosa. Se bloqueó la unión no específica pre ncubando las manchas en Blotto (salina regulada con foßfato que contiene 5% en peso/volumen de leche seca desgraßada y 0.2% en volumen/volumen de nonidet P-40 (Sigma))» y ße detectó la proteína recombinante utilizando un Mab de rnúrido a la etiqueta de decapéptido de HA. Alternativamente» ße puede detector la proteína recombinante utilizando diversos antisueros específicos para AUR1 o AUR2.

EJEMPLO 11 LA PROTEINA BÁSICA DE MIELINA ES UN SUBSTRATO ARTIFICIAL PARA LA QUI ASA DE AURORAl Y AUR0RA2 Método Se cultivó células SW480 de adenocarc noma colorectal humano en RPMI 1640 más 10% de suero bovino fetal. L- 8B glutamina, penicilina y estreptomicina. Se lavó tres veces los cultivos confluentes de células SW480, con salina regulada con fosfato (PBS) enfriada con hielo, y luego se raspó en 1 ml de PBS enfriada con hielo. Se centrifugó las células a 1000 rpm a 4°C y se aspiró el PBS, y se almacenó la pella de células resultantes a -80°C. Se descongeló sobre hielo las pellas de tres placas de 15 cm y se vol ió a suspender en un total de 1 ml de regulador de lisie de quinasa» 50 mmoles de HEPES» pH 7.4» 100 ml de KCl» 25 mmoles de NaF» 1 mmol de NaV0a» 0.5% de NP40» 1 mmol de DTT» 2 µg/ml de aprotinina y 1 µg/ml de leupeptina)» y se hizo rotar suavemente durante 20 minutos a 4°C. Luego se centrifugó las muestras a 10»000 x g durante 10 minutos a 4°C y se transfirió el sobrenadante resultante a un tubo de centrífuga limpio» de 1.5 m • y ße almacenó y ße mantuvo ßobre hielo. Se determinó la concentración de proteínas mediante análisis de Bradford. Se preaclaró 1 mg de proteína total con 10 µl de proteína A-Sepharose (Boehringer) durante 15 minutos a 4°C seguido por 2 µl de suero preinmunizado de conejo» antisuero de péptido de auroral purificado por afinidad, antisuero de péptido de auroral purificado por afinidad más 6 µg de péptido de auroral competidor, antisuero de aurora2 purificado por afinidad o antisuero de péptido de aurora 2 purificado por afinidad más 6 µg de péptido de aurora 2 competidor, y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Subsecuentemente se añadió 10 µl de proteína A-Sepharose y se continuó la incubación durante otros 45 minutos a 4°C. Se centrifugó brevemente loe tubos para formar pella con el complejo de anticuerpo-proteína A-Sepharoße y ße aspiró el sobrenadante resultante. Se lavó dos veces la pella de anticuerpo-proteína A-Sepharose con 0.5 ml de regulador de lisis de quinasa» seguido por un lavado con 0.5 ml de regulador de quinasa (20 mmoles de HEPES pH 7.4» 125 mmoleß de KCl» 10 mmoles de MgCla, 1 mmol de NaF» 1 mmol de NaV0a y 1 mmol de DTT). Se volvió a suspender la pella de anticuerpo-proteína A-Shefaróse en 20 µl de regulador de quinasa que contenía 5 µCi de Cgamma-3aP3 ATP y 0.5 mg/ml de proteína básica de mielina (Sigma) se incubó durante 20 minutos a 37°C» después de lo cual se añadió 10 µl de regulador de mueßtra de proteína» 200 mmoleß de Tris-HCl pH 6.8, 40% de glicerol, 730 mmoles de B-mercaptoetanol , 0.4% de SDS y 0.05% de azul de bromofenol). Se mezcló loe tubos bien y se los incubó durante 5 minutos a 100°C. Se resolvió las muestras en un gel al 18% de SDS-poliacrilamida y se visualizó por autorradiografía.

LQft resú aos Los inmunocomple os de auroral y aurora2 fueron capaces de fosforilar la proteína básica de mielina. Cuando se usó un péptido de competencia en las inmunoprecipi taciones» ninguno de los inmunocomplejos de ant suero de auroral o aurora2 fueron capaces de fosforilar la proteína básica de mielina más que el control de suero preinmunológico. Esto sugiere que la actividad de quinasa observada se debe a auroral y 2, y no a otras proteínas presentes en el inptunocomplejo. Esta observación permitirá la purificación de quinasa de auroral y 2 utilizando la proteína básica de mielina como un substrato para seguir la actividad de quinasa. También permitirá el desarrollo de un análisis de quinasa in vitro utilizando las proteínas auroral y 2 recombinantes. Adicionalmente, un análisis de quinasa de auroral y 2 in vitro permitirá discriminar las colecciones de moléculas pequeñas para inhibidores de las quinasas de auroral y 2. midiendo la inhibición de la fosforilación en la proteína básica de miel ina. La invención descrita ilustrativamente aquí adecuadamente puede ser puesta en práctica en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no eßtán descritas específicamente aquí. Los términos y las expresiones que han sido empleadas lo son como términos de descripción y no de limitación, y no se pretende que en el uso de dichos términos y expresiones, se excluya ningún equi alente de los aspectos mostrados y descritos ni porciones de loe mismos» sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Así pues» se debe entender que» aunque se ha descrito eßpecíficamente la presente invención mediante las modalidades preferidas y aspectos opcionales, se puede recurrir a la modificación y variación de los conceptos aquí descritos por quien sea experto en la materia, y que dichas modificaciones y variaciones están consideradas como dentro del alcance de esta invención» tal como se define en las reivindicaciones que vienen a continuación. Las referencias no incorporadas previamente aquí mediante la referencia» incluyendo tanto patentes y referencias que no son de patente» quedan expresamente incorporadas en la presente mediante esta referencia» para todos los propósitos. Otras modalidades están dentro de las reivindicaciones que vienen al final .

LISTAPO PE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Mossie» Kevin G. Plowman, Gregory D. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ALTERACIONES RELACIONADAS CON AUR-l Y/O AUR-2 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) NOMBRE: Lyon & Lyon (B) CALLE: 633 West Fifth Street» Suite 4700 (C) CIUDAD: Los Angeles (D) ESTADO: California (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 90071-2066( iV) FORMA (v) QUE PUEDA SER LEÍDA EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE APLICACIÓN: Patentln Reléase 1*1.0» Versión tl.30 (V) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (Vii i) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE (A) NOMBRE: Wargurg. Richard J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32»327 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (213) 489-1600 (B) TELEFAX: (213) 955-0440 (C) TELEX: 67-3510 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N?:l (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1244 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE FILAMENTOS: uno SOlo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CADN (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO CONTRARIO: NO (vi ) FUENTE NATURAL: (A) ORGANISMO: Homo sap ens (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:i CGGGAGAGTA GCAGTGCCTT GGACCCCAGC TCTCCTCCCC CTTTCTCTCT AAGGATGGCC 60 CAGAAGGAGA ACTCCTACCC CTGGCCCTAC GGCCGACAGA CGGCTCCATC TGGCCTGAGC120 ACCCTGCCCC AGCGAGTCCT CCGGAAAGAG CCTGTCACCC CATCTGCACT TGTCCTCATG180 AGCCGCTCCA ATGTCCAGCC CACAGCTGCC CCTGGCCAGA AGGTGATGGA GAATAGCAGT2 0 GGGACACCCG ACATCTTAAC GCGGCACTTC ACAATTGATG ACTTTGAGAT TGGGCGTCCT300 CTGGGCAAAG GCAAGTTTGG AAACGTGTAC TTGGCTCGGG AGAAGAAAAG CCATTTCATC360 GTGGCGCTCA AGGTCCTCTT CAAGTCCCAG ATAGAGAAGG AGGGCGTGGA GCATCAGCTG420 CGCAGAGAGA TCGAAATCCA GGCCCACCTG CACCATCCCA ACATCCTGCG TCTCTACAAC 80 TATTTTTATG ACCGGAl- 3AG GATCTACTTG ATTCTAGAGT ATGCCCCCCG CGGGGAGCTC 540 TACAAGGAGC TGCAGAAGAG CTGCACATTT GACGAGCAGC GAACAGCCAC GATCATGGAG600 GAGTTGGCAG ATGCTCTAAT GTACTGCCAT GGGAAGAAGG TGATTCACAG AGACATAAAG660 CCAGAAAATC TGCTCTTAGG GCTCAAGGGA GAGCTGAAGA TTGCTGACTT CGGCTGGTCT720 GTGCATGCGC CCTCCCTGAG GAGGAAGACA ATGTGTGGCA CCCTGGACTA CCTGCCCCCA780 GAGATGATTG AGGGGCGCAT GCACAATGAG AAGGTGGATC TGTGGTGCAT TGGAGTGCTT840 TGCTATGAGC TGCTGGTGGG GAACCCACCC TTCGAGAGTG CATCACACAA CGAGACCTAT900 CGCCGCATCG TCAAGGTGGA CCTAAAGTTC CCCGCTTCTG TGCCCACGGG AGCCCAGGAC960 CTCATCTCCA AACTGCTCAG GCATAACCCC TCGGAACGGC TGCCCCTGGC CCAGGTCTCJk.020 GCCCACCCTT GGGTCCGGGC CAACTCTCGG AGGGTGCTGC CTCCCTCTGC CCTTCAATCT080 GTCGCCTGAT GGTCCCTGTC ATTCACTCGG GTGCGTGTGT TTGTATGTCT GTGTATGTAT140 AGGGGAAAGA AGGGATCCCT AACTGTTCCC TTATCTGTTT TCTACCTCCT CCTTTGTTTA200 ATAAAGGCTG AAGCTTTTTG TAAAAAAACA AAAAAAAAAA AAAA 1244 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2198 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE FILAMENTOS: uno SOlO (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO CONTRARIO: NO (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:2 GGGATATCTC AGTGGCGGAC GAGGACGGCG GGGACAAGGG GCGGCTGGTC GGAGTGGCGG 60 ACGTCAAGTC CCCTGTCGGT TCCTCCGTCC CTGAGTGTCC TTGGCGCTGC CTTGTGCCCG120 CCCU3CGCCT TTGCATCCGC TCCTGGGCAC CGAGGCGCCC TGTAGGATAC TGCTTGTTAC180 TTA TACAGC TAGAGGCATC ATGGACCGAT CTAAAGAAAA CTGCATTTCA GGACCTGTTA240 AGGCTACAGC TCCAGTTGGA GGTCCAAAAC GTGTTCTCGT GACTCAGCAA TTTCCTTGTC300 AGAATCCATT ACCTGTAAAT AGTGGCCAGG CTCAGCGGGT CTTGTGTCCT TCAAATTCTT360 CCCAGCGCGT TCCTTTGCAA GCACAAAAGC TTGTCTCCAG TCACAAGCCG GTTCAGAATC 20 AGAAGCAGAA GCAATTGCAG GCAACCAGTG TACCTCATCC TGTCTCCAGG CCACTGAATA480 ACACCCAAAA GAGCAAGCAG CCCCTGCCAT CGGCACCTGA AAATAATCCT GAGGAGGAAC540 TGGCATCAAA ACAGAAAAAT GAAGAATCAA AAAAGAGGCA GTGGGCTTTG GAAGACTTTG600 AAATTGGTCG CCCTCTGGGT AAAGGAAAGT TTGGTAATGT TTATTTGGCA AGAGAAAAGC660 AAAGCAAGTT TATTCTGGCT CTTAAAGTGT TATTTAAAGC TCAGCTGGAG AAAGCCGGAG720 TGGAGCATCA GCTCAGAAGA GAAGTAGAAA TACAGTCCCA CCTTCGGCAT CCTAATATTC780 TTAGACTGTA TGGTTATTTC CATGATGCTA CCAGAGTCTA CCTAATTCTG GAATATGCAC840 CACTTGGAAC AGTTTATAGA GAACTTCAGA AACTTTCAAA GTTTGATGAG CAGAGAACTG900 CTACTTATAT AACAGAATTG GCAAATGCCC TGTCTTACTG TCATTCGAAG AGAGTTATTC960 ATAGAGACAT TAAGCCAGAG AACTTACTTC TTGGATCAGC TGGAGAGCTT AAAATTGCAO;020 ATTTTGGGTG GTCAGTACAT GCTCCATCTT CCAGGAGGAC CACTCTCTGT GGCACCCTGS080 ACTACCTGCC CCCTGAAATG ATTGAAGGTC GGATGCATGA TGAGAAGGTG GATCTCTGGA140 GCCTTGGAGT TCTTTGCTAT GAATTTTTAG TTGGGAAGCC TCCTTTTGAG GCAAACACAT200 ACCAAGAGAC CTACAAAAGA ATATCACGGG TTGAATTCAC ATTCCCTGAC TTTGTAACAG260 AGGGAGCCAG GGACCTCATT TCAAGACTGT TGAAGCATAA TCCCAGCCAG AGGCCAATGC320 TCAGAGAAGT ACTTGAACAC CCCTGGATCA CAGCAAATTC ATCAAAACCA TCAAATTGCCC380 AAAACAAAGA ATCAGCTAGC AAACAGTCTT AGGAATCGTG CAGGGGGAGA AATCCTTGAG440 CCAGGGCTGC CATATAACCT GACAGGAACA TGCTACTGAA GTTTATTTTA CCATTGACTS500 CTGCCCTCAA TCTAGAACGC TACACAAGAA ATATTTGTTT TACTCAGCAG GTGTGCCTTA560 ACCTCCCTAT TCAGAAAGCT CCACATCAAT AAACATGACA CTCTGAAGTG AAAGTAGCCA620 CGAGAATTGT GCTACTTATA CTGGTTCATA ATCTGGAGGC AAGGTTCGAC TGCAGCCGCÍH680 CCGTCAGCCT GTGCTAGGCA TGGTGTCTTC ACAGGAGGCA AATCCAGAGC CTGGCTGTG<B740 GGAAAGTGAC CACTCTGCCC TGACCCCGAT CAGTTAA 'GA GCTGTGCAAT AACCTTCCTA800 GTACCTGAGT GAGTGTGTAA CTTATTGGGT TGGCGAAGCC TGGTAAAGCT GTTGGAATGA86O GTATGTGATT CTTTTTAAGT ATGAAAATAA AGATATATGT ACAGACTTGT ATTTTTTCT(r920 TGGTGGCATT CCTTTAGGAA TGCTGTGTGT CTGTCCGGCA CCCCGGTAGG CCTGATTGGfli980 TTTCTAGTCC TCCTTAACCA CTTATCTCCC ATATGAGAGT GTGAAAAATA GGAACACGTG0 0 CTCTACCTCC ATTTAGGGAT TTGCTTGGGA TACAGAAGAG GCCATGTGTC TCAGAGCTG2100 TAAGGGCTTA TTTTTTTAAA ACATTGGAGT CATAGCATGT GTGTAAACTT TAAATATGC&160 AATAAATAAG TATCTATGTC AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2198 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 344 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) NUMERO DE FILAMENTOS: uno ßolo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO CONTRARIO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 Met Ala Gln Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Arg Gln Thr 1 5 10 15 Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gln Arg Val Leu Arg Lys Glu 20 25 30 Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu Val Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gln 35 40 45 Pro Thr Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Met Glu Asn Ser Ser Gly Thr 50 55 60 Pro Asp lie Leu Thr Arg His Phe Thr lie Asp Asp Phe Glu lie Gly 65 70 75 80 Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu 85 90 95 Lys Lys Ser His Phe lie Val Ala Leu Lys Val Leu The Lys Ser Gln 100 105 110 lie Glu Lys Glu Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu lie Glu lie 115 120 125 Gln Ala His Leu His His Pro Asn lie Leu Arg Leu Tyr Asn Tyr Phe 130 135 140 Tyr Asp Arg Arg Arg lie Tyr Leu lie Leu Glu Tyr Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Gln Lys Ser Cys Thr Phe Asp Glu Gln Arg 165 170 175 Thr Ala Thr lie Met Glu Glu Leu Ala Asp Ala Leu Met Tyr Cys His 180 185 190 Gly Lys Lys Val lie His Arg Asp lie Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu 195 200 205 Gly Leu Lys Gly Glu Leu Lys lie Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His 210 215 220 Ala Pro Ser Leu Arg Arg Lys Thr Met Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu 225 230 235 240 Pro Pro Glu Met lie Glu Gly Arg Met His Asn Glu Lys Val Asp Leu 245 250 255 Trp Cys lie Gly Val Leu Cys Tyr Glu Leu Leu Val Gly Asn Pro Pro 260 265 270 Phe Glu Ser Ala Ser His Asn Glu Thr Tyr Arg Arg lie Val Lys Val 275 280 285 Asp Leu Lys Phe Pro Ala Ser Val Pro Thr Gly Ala Gln Asp Leu lie 290 295 300 Ser Lys Leu Leu Arg His Asn Pro Ser Glu Arg Leu Pro Leu Ala Gln 305 310 315 320 Val Ser Ala His Pro Trp Val Arg Ala Asn Ser Arg Arg Val Leu Pro 325 330 335 Pro Ser Ala Leu Gln Ser Val Ala 340 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 403 arainoácidoß (B) TIPO: aminoácido (C) NUMERO DE FILAMENTOS: uno SOlo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) SENTIDO CONTRARIO: NO (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:4 Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys lie Ser Gly Pro Val Lys Ala Thr 1 5 10 15 Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Thr Gln Gln Phe Pro 20 25 30 Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu 35 40 45 Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln 65 70 75 80 Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln 85 90 95 Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu 100 IOS 110 Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp 115 120 125 Ala Leu Glu Asp Phe Glu lie Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe 130 135 140 Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe lie Leu Ala 145 150 155 160 Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His 165 170 175 Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu lie Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn 180 185 190 lie Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu 195 200 205 lie Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys 210 215 220 Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr lie Thr Glu Leu 225 230 235 240 Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val lie His Arg Asp 245 250 255 He Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys He 260 265 270 Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr 275 280 285 Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met He Glu Gly Arg 290 295 300 Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr 305 310 315 320 Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln Glu 325 330 335 Thr Tyr Lys Arg He Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val 340 345 350 Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu He Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro 355 360 365 Ser Gln Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp He Thr 370 375 330 Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser 385 390 395 400 Lys Gln Ser

Claims (45)

NQVEPAP PE LA INVENCIÓN REIYINPICACIQNES

1.- Una molécula de ácido nucleico aislada, enriquecida o purificada, caracterizada porque codifica al polipéptido AUR-l y/o AUR-2.

2.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el ácido nucleico es ácido nucleico humano.

3.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la molécula codifica por lo menos 25 aminoácidos contiguos de la ßecuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. 4.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada ademáß porque la molécula codifica por lo menos 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0:3 o SEQ ID N?:

4.

5.- La molécu a de ácido nucleico de conformidad con la rei indicación 1, caracterizada además porque la molécula codifica por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de am noácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N0:4.

6.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la molécula codifica por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la ßecuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N?:4.

7.- La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la molécula codifica por lo menos 300 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID N0:3 o SEQ ID N0:4.

8.- Una sonda de ácido nucleico para la detección de ácido nucleico que codifica el polipéptido de AUR-l y/o AUR-2 en une muestra.

9.- La sonda de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el polipéptido comprende por lo menos 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N0:4.

10.- La sonda de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque el polipéptido comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4.

11.- La sonda de conformidad con la reivindicación 8» caracterizada además porque el polipéptido comprende por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N?:4.

12.- La sonda de conformidad con la reivindicación 8» caracterizada además porque el polipéptido comprende por lo menos 200 aminoácidos contiguos de la ßecuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N0:4.

13.- La sonda de conformidad con la reivindicación 8» caracterizada además porque el polipéptido comprende por lo menos 300 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:3 o SEQ ID N0:4.

14.- Una molécula de ácido nucleico recombinante» caracterizada porque codifica un polipéptido AUR-l y/o AUR-2 y un vector o promotor efectivo para iniciar la transcripción en una célula anfitriona.

15.- Una molécula de ácido nucleico recombinante» caracterizada porque comprende una región de transcripción funcional en una células» una secuencia complementaria para una secuencia de ARN que codifica un polipéptido AUR-l o AUR-2» y una región de terminación de transcripción» funcional en una célula.

16.- Un polipéptido AUR-l o AUR-2 aislado» enriquecido o purificado.

17.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16» caracterizado además porque el polipéptido comprende por lo menos 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N0:4.

18.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16» caracterizado ademáß porque el polipéptido comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N?:4.

19.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16» caracterizado además porque el polipéptido comprende por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N?:4.

20.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado ademáß porque el polipéptido comprende por lo menoß 200 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: o SEQ ID N?:4.

21.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado ademáß porque el polipéptido comprende por lo menoß 300 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID N?:4.

22.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polipéptido eß aislado, purificado o enriquecido, a partir de un mamífero.

23.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16» caracterizado además porque el polipéptido eß aislado, purificado o enriquecido, a partir de un humano.

24.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-l.

25.- El polipéptido AUR-l o AUR-2 de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-2.

26.- Un anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica para el polipéptido AUR-l o AUR-2.

27.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado ademáß porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 3 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

28.- El anticuerpo de conformidad con la rei indicación 26» caracterizado ademáß porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 4 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

29.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado ademáß porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menoß 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

30.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26» caracterizado además porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 50 aminoáci os contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

31.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26» caracterizado ademáß porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

32.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26» caracterizado además porque el polipéptido es aislado» purificado o enriquecido a partir de un mamífero.

33.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el polipéptido es aislado, purificado o enriquecido a partir de un humano.

34.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-l.

35.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-2.

36.- Un hibridoma, caracterizado porque produce un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica para el polipéptido AUR-l y/o AUR-2.

37.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N0:4.

38.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N?:4.

39.- El hibridoma de conformidad con la rei indicación 36, caracterizado además porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menos 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N?:4.

40.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado ademáß porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende por lo menoß 200 a inoácidoß contiguos de la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N?:4.

41.- El hibridóme de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido AUR-l o AUR-2 comprende? por lo menos 300 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido moßtrada en SEQ ID NO.3 o SEQ ID N?:4.

42.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado ademáß porque el polipéptido eß aislado, purificado o enriquecido a partir de un mamífero.

43.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido es aislado, purificado o enriquecido a partir de un humano.

44.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-l.

45.- El hibridoma de conformidad con la rei indicación 36, caracterizado además porque el polipéptido es un polipéptido AUR-2.