JP2005504830A - Ｈｋｉｄ−１関連タンパク質ファミリーの新規な分子およびその使用 - Google Patents

Ｈｋｉｄ−１関連タンパク質ファミリーの新規な分子およびその使用 Download PDF

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Abstract

新規のＨＫＩＤ−１ポリペプチド、ＨＫＩＤ−１タンパク質、およびＨＫＩＤ−１核酸分子が開示される。単離された全長ＨＫＩＤ−１タンパク質へのさらなる付加により、本発明は、単離されたＨＫＩＤ−１融合タンパク質、ＨＫＩＤ−１抗原性ペプチド、および抗ＨＫＩＤ−１抗体をさらに提供する。本発明はまた、ＨＫＩＤ−１核酸分子、本発明の核酸分子を含むＨＫＩＤ−１組み換え発現ベクター、発現ベクターが導入されている宿主細胞、およびＨＫＩＤ−１遺伝子が導入されているか、または破壊されている非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明の組成物を使用する診断方法、スクリーニング方法、および治療方法もまた提供される。

Description

【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
プロテインキナーゼは、細胞増殖および分裂に関連する、生化学的変化および形態変化の調節において重要な役割を果たす（Ｄ’Ｕｒｓｏ，Ｇ．ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：７８６−７９１；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ．Ｃ．ら（１９９３）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １５：１８５−１８９）。それらは、増殖因子レセプターおよびシグナル伝達物質として働き、細胞のトランスフォーメーションおよび悪性度に関連している（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：３７５−３８７；Ｐｏｓａｄａ，Ｊ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ３：５８３−５９２；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．ら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：５７３−５８２）。例えば、プロテインキナーゼは、増殖因子レセプターからのシグナル伝達（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ，Ｔ．Ｗ．ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：７１５−７１８；Ｇｏｍｅｚ，Ｎ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：１７０−１７３）、細胞が有糸分裂状態に入ることの制御（Ｎｕｒｓｅ，Ｐ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５０３−５０８；Ｍａｌｌｅｒ，Ｊ．Ｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２６９−２７５）およびアクチンの束形成（ｂｕｎｄｌｉｎｇ）の調節（Ｈｕｓａｉｎ−Ｃｈｉｓｈｔｉ，Ａ．ら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７１８−７２１）に関与することが示されている。プロテインキナーゼは、アミノ酸配列の類似性、またはセリン／スレオニンもしくはチロシン残基のいずれかに対する特異性のいずれかに基づいて、２つの大きな群に分けられ得る。少数の二重特異性キナーゼは、セリン／スレオニン特異的群に構造的に類似している。広い分類内では、キナーゼは、そのメンバーが、高い程度の触媒性ドメインアミノ酸配列同一性を共有し、類似の生化学的特性もまた有するファミリーにさらに下位分類され得る。大部分のプロテインキナーゼファミリーのメンバーはまた、それらの特定の細胞役割を反映するキナーゼドメイン以外に構造的特徴を共有する。これらとしては、キナーゼ活性または他のタンパク質との相互作用を制御する調節ドメインが挙げられる（Ｈａｎｋｓ，Ｓ．Ｋ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４２−５２）。
【０００２】
ラットＫＩＤ−１は、膜脱分極またはフォルスコリンによって誘導されるが、ニューロトロフィンによっても増殖因子によっても誘導されないセリン／スレオニンプロテインキナーゼである（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５３５−１６５４３）。ラットＫＩＤ−１は、最初期遺伝子であり、カイニン酸および電気痙攣ショックに応答して海馬および皮質の特定の領域において誘導される。このことは、ラットＫＩＤ−１が、神経機能、シナプス形成性、学習、および記憶、ならびにカイニン酸による痙攣およびいくつかの神経系関連疾患（例えば、痙攣および癲癇）に関与することを示唆する。ラットＫＩＤ−１パラログとしては、前癌遺伝子であることが公知のＰＩＭ−１タンパク質が挙げられる。Ｐｉｍ−１は、サイトカイン媒介性有糸分裂シグナルの伝達に関与する。さらに、Ｐｉｍ−１とｃＭｙｃとの間には強い相乗的腫瘍形成、ならびにアポトーシス誘導に対する関連がある（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｔ，ら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８６５９−１８６６６）。細胞サイクルホスファターゼＣｄｃ２５Ａ（ｃＭｙｃの直接的な転写標的）はまた、Ｐｉｍ−１キナーゼの基質であることが見いだされた。本発明は、少なくとも一部分は、ラットＫＩＤ−１のヒト種のオルソログ（ＨＫＩＤ−１とよばれる）の発見に基づく。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも一部分は、ＨＫＩＤ−１（セリン／スレオニンプロテインキナーゼスーパーファミリーのメンバーであると推定される細胞内タンパク質）をコードする遺伝子の発見に基づく。このことに基づいて、本発明は、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質およびＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはＨＫＩＤ−１核酸を検出する方法、およびＨＫＩＤ−１タンパク質またはＨＫＩＤ−１核酸の調節因子を同定するための方法を提供する。
【０００４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトＨＫＩＤ−１（セリン／スレオニンキナーゼスーパーファミリーのメンバー）をコードするｃＤＮＡ分子の発見に基づく。ヒトＨＫＩＤ−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、図１に示される（配列番号１；配列番号３は、オープンリーディングフレームのみを含む）。ＨＫＩＤ−１タンパク質の推定アミノ酸配列もまた、図１に示される（配列番号２）。
【０００５】
配列番号２のＨＫＩＤ−１タンパク質は、以下の部位またはドメインを有すると推定される：配列番号２のアミノ酸２６０〜２６３由来の１つのｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性キナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）；配列番号５；配列番号２のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１に由来する３つのプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４に由来する３つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；配列番号２のアミノ酸３３〜４０に由来する１つのチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００に由来する７つのＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；配列番号２のアミノ酸４６−５４に由来する１つのプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグナチャ（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２５；配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８に由来する１つのセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグナチャ（ＰＳ００１０８；配列番号２６；配列番号２７；ならびに配列番号２のアミノ酸４０〜２９３の隠されたＭａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）に由来する１つの真核生物プロテインキナーゼドメインコンセンサス（ＰＦ０００６９；配列番号２８）；配列番号２９。ＰＦＡＭ識別子に関する一般的情報については、ＰＳプレフィクスおよびＰＦプレフィクスドメイン識別番号とは、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ ２８：４０５−４２０およびｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐｆａｍ／ｐｆａｍ．ｈｔｍｌ．をいう。
【０００６】
配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列を、ＭＥＭＳＡＴ膜貫通ドメイン推定ソフトウェアを用いて分析した。ＭＥＭＳＡＴにより、配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列の３つの潜在的膜貫通ドメイン：アミノ酸４２〜５８（配列番号４２）、アミノ酸７８〜９４（配列番号４３）、およびアミノ酸２２６〜２４５（配列番号４４）が推定された。ＨＫＩＤ−１のラットオルソログであるラットＫＩＤ−１は、可溶性タンパク質であることが公知であるので、ＭＥＭＳＡＴによって推定されるこの潜在的膜貫通ドメインは、ＨＫＩＤ−１タンパク質のコアでの疎水性相互作用に関与するＨＫＩＤ−１タンパク質の疎水性ドメインを示すのであって、膜貫通ドメインではない可能性が高い。
【０００７】
本発明の実施形態において、ＨＫＩＤ−１分子は、非限定的例としての神経系の細胞、海馬および皮質の細胞において発現されそして／または機能するプロテインキナーゼである。
【０００８】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテインキナーゼ」は、それ自体のリン酸化状態または別のタンパク質もしくはポリペプチドのリン酸化状態を調節し得る、タンパク質またはポリペプチドを含む。プロテインキナーゼは、セリン／スレオニン残基、チロシン残基、またはセリン／スレオニンおよびチロシン残基の両方（例えば、二重特異性キナーゼ）に対する特異性（すなわち、リン酸化する特異性）を有し得る。チロシンまたはセリン／スレオニンのいずれかのリン酸化に対するプロテインキナーゼの特異性は、サブドメインのうちの２つ（ＶＩｂおよびＶＩＩＩ）の配列によって推定され得る（例えば、Ｈａｎｋｓら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４２−５２（その内容は、本明細書中に参考として援用される）に記載される）。
【０００９】
プロテインキナーゼは、これらを発現する細胞と関連するシグナル伝達系路において役割を果たす。従って、ＨＫＩＤ−１分子は、神経細胞において発現されるので、ＨＫＩＤ−１は、以下に関与し得る：１）神経系障害；２）痙攣；３）癲癇；４）学習；５）記憶；または６）シナプス形成性。ＨＫＩＤ−１はまた、前癌遺伝子であることが公知であるＰＩＭ−１タンパク質のパラログであるので、増殖障害（例えば、癌）に関与し得る。
【００１０】
細胞増殖障害および／または細胞分化障害の例としては、癌（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害もしくは造血新生物障害（例えば、白血病））が挙げられる。転移性腫瘍は、多数の原発性腫瘍型（前立腺、結腸、肺、胸部および肝臓が起源のものが挙げられるが、これらに限定されない）から生じ得る。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「癌」、「過剰増殖性」および「新生物性」とは、自律的増殖の能力を有する細胞（すなわち、急激に拡大する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状況または状態）をいう。過剰増殖状態および新生物性疾患状態は、病理的（すなわち、疾患状態を特徴付けるかまたは構成する）と分類され得るか、または非病理的（すなわち、正常からずれてはいるが、疾患状態とは関連しない）と分類され得る。この用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階とは無関係に、全ての型の癌性増殖もしくは腫瘍形成プロセス、転移性組織もしくは悪性に変化した細胞、組織もしくは器官を含むことが意味される。「病理的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍増殖により特徴付けられる疾患状態において発生する。非病理的過剰増殖性細胞の例としては、創傷修復に関連する細胞の増殖が挙げられる。
【００１２】
用語「癌」または「新生物」は、種々の器官系（例えば、罹患している肺、胸部、甲状腺、リンパ、胃腸管および尿生殖器管）の悪性度、ならびに悪性度を含む腺癌（例えば、大部分の結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌）を含む。
【００１３】
用語「癌腫」は、当該分野で認識されており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、胸部癌腫、前立腺癌種、内分泌系癌腫、および黒色腫を含む、上皮組織または内分泌組織の悪性疾患をいう。例示的な癌腫としては、頸部（ｃｅｒｖｉｘ）、肺、前立腺、胸部、頭部および頸部（ｎｅｃｋ）、結腸ならびに卵巣の組織から形成する癌腫が挙げられる。この用語はまた、癌肉腫（例えば、これは、癌性かつ肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む）を含む。「腺癌」とは、腺組織に由来するかまたは腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌腫をいう。
【００１４】
用語「肉腫」は、当該分野で認識されており、間葉由来の悪性腫瘍をいう。
【００１５】
造血性新生物障害としては、造血性起源の過形成性／新生物性細胞（例えば、骨髄系統、リンパ系統もしくは赤血球系統、またはこれらの前駆細胞から生じる）を含む疾患が挙げられる。好ましくは、これらの疾患は、未分化型急性白血病（例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。さらなる例示的な骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７において総説される）が挙げられるが、それらに限定されない；リンパ系の悪性疾患としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる形態の悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ｌａｒｇｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード−スターンバーグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の種々の局面は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００１７】
（Ｉ．単離された核酸分子）
ＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）は、非翻訳領域を含めて約２１２６ヌクレオチド長であり、約３５．８６ｋＤａ（翻訳後修飾を除く）の推定分子量を有する３２６アミノ酸タンパク質（配列番号２）をコードする、９７８塩基対の推定メチオニン開始コード配列（配列番号１のヌクレオチド１７１〜１２５９；配列番号３）を含む（図１）。
【００１８】
本発明の１つの局面は、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、ならびにハイブリダイゼーションプローブとして使用してＨＫＩＤ−１コード核酸（例えば、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡ）を同定するに十分な核酸分子、およびＨＫＩＤ−１核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして用いられるフラグメントを提供する。本明細書中で用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを包含することが意図される。この核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００１９】
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然の供給源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸を誘導した生物のゲノムＤＮＡにおいて天然でその核酸に隣接する配列（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）（好ましくは、タンパク質コード配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、この単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、その核酸を誘導した細胞のゲノムＤＮＡ中のその核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満または約０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、他の細胞性物質を、組換え技術によって産生された場合は培養培地を実質的に含まなくてもよく、あるいは、化学的に合成された場合、化学的前駆体も他の化学物質も実質的に含まなくてもよい。
【００２０】
本発明の単離された核酸分子（例えば、配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補体を有する核酸分子）は、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１または配列番号３の核酸配列の全てまたは一部分を用いて、ＨＫＩＤ−１核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載される通り）。
【００２１】
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡをテンプレートとして、そして適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って増幅され得る。このようにして増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、ＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術によって（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いて）調製され得る。
【００２２】
本発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して少なくとも２６％（または３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％）同一である、単離された核酸分子を特徴とする。本発明はまた、配列番号３に示されるヌクレオチド配列またはその相補体に対して少なくとも４３％（または４５％、５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％）同一である、単離された核酸分子を特徴とする。
【００２３】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５．５％（または９５．８％、９６％、９６．５％、９７％、９８％もしくは９９％）同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。
【００２４】
１つの実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００２５】
本発明内にあるのはまた、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをコードする単離された核酸分子であり、このフラグメントは、配列番号２のうちの少なくとも１５（または２５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、２７０、２９０、３１０もしくは３２６）個連続したアミノ酸を含む。
【００２６】
さらに、本発明の単離された核酸分子は、ＨＫＩＤ−１をコードする単離された核酸配列の一部分のみ（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＨＫＩＤ−１の生物学的に活性な部分をコードするフラグメント（例えば、配列番号１のヌクレオチド３０６〜３３２を含むフラグメント、ＨＫＩＤ−１のこのプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャードメインをコードするフラグメント、配列番号１のヌクレオチド６６６〜７０４、ＨＫＩＤ−１のセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャードメインをコードするフラグメント、およびＨＫＩＤ−１の真核生物プロテインキナーゼドメインをコードする配列番号１のヌクレオチド２８８〜１０４９））を含み得る。
【００２７】
ヒトＨＫＩＤ−１の遺伝子および／またはｃＤＮＡから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型における（例えば、他の組織由来の）ＨＫＩＤ−１ホモログ、ならびに他の哺乳動物由来のＨＫＩＤ−１オルソログおよびＨＫＩＤ−１ホモログを同定ならびに／またはクローニングする際に使用するために設計されたプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを包含する。このオリゴヌクレオチドは代表的に、ストリンジェントな条件下で、配列番号１もしくは配列番号３のセンス配列またはアンチセンス配列、または配列番号１もしくは配列番号３の天然に存在する変異体および／もしくは対立遺伝子改変体のうちの少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０または４００個連続したヌクレオチドに対してハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を包含する。
【００２８】
ヒトＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、同じかもしくは同一のタンパク質またはそれらの対立遺伝子改変体をコードする、転写産物、ｃＤＮＡ、またはゲノム配列を検出し得る。このプローブは、それに結合した標識基（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、酵素補因子）を含む。このようなプローブは、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＨＫＩＤ−１をコードする核酸のレベルを測定することによって（例えば、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡレベルを検出することまたはゲノムＨＫＩＤ−１遺伝子が変異したかもしくは欠失したかを決定することによって）、ＨＫＩＤ−１タンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として用いられ得る。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、セリン／トレオニンプロテインキナーゼスーパーファミリーの他のメンバーをコードする核酸分子と比較して、ＨＫＩＤ−１核酸分子を特異的に検出する、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子を特徴とする。例えば、１つの実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸分子またはそれらの相補体に対してハイブリダイズする。別の実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、少なくとも５４７（または５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２１２６もしくは２２００）ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子またはそれらの相補体に対してハイブリダイズする。別の実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、ＨＫＩＤ−１のプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャードメインをコードする、配列番号１のヌクレオチド３０６〜３３２、またはその相補体を含む。なお別の実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、ＨＫＩＤ−１のセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャードメインをコードする、配列番号１のヌクレオチド６６６〜７０４、またはその相補体を含む。別の実施形態では、単離されたＨＫＩＤ−１核酸分子は、ＨＫＩＤ−１の真核生物プロテインキナーゼドメインをコードする、配列番号１のヌクレオチド２８８〜１０４９、またはその相補体を含む。別の実施形態では、本発明は、ＨＫＩＤ−１核酸のコード鎖に対してアンチセンスである、単離された核酸分子を提供する。
【００３０】
「ＨＫＩＤ−１の生物学的に活性な部分」をコードする単離された核酸フラグメントは、配列番号１または配列番号３の一部分を単離し、ＨＫＩＤ−１タンパク質のコードされる部分を（例えば、インビトロでの組換え発現によって）発現し、そしてＨＫＩＤ−１のコードされる部分の活性を評価することによって調製され得る。例えば、ＨＫＩＤ−１の生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸フラグメントとしては、以下のうちの１以上が挙げられる：配列番号２の（例えば、アミノ酸２６０〜２６３由来の）ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）；配列番号５；配列番号２の（例えば、アミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１由来の）プロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；配列番号２の（例えば、アミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４由来の）カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；配列番号２の（例えば、アミノ酸３３〜４０由来の）チロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００由来のＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；配列番号２の（例えば、アミノ酸４６〜５４由来の）プロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャー（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２５；配列番号２の（例えば、アミノ酸１６６〜１７８由来の）セリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャー（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；配列番号２７；ならびに配列番号２の（例えば、アミノ酸４０〜２９３由来の）真核生物プロテインキナーゼドメイン（ＰＦ０００６９；配列番号２８）；配列番号２９。
【００３１】
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列と異なり、従って、配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質と同じＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする、単離された核酸分子を包含する。
【００３２】
配列番号１または配列番号３に示されるヒトＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列に加えて、ＨＫＩＤ−１のアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒトの集団）内に存在し得ることを当業者は理解する。ＨＫＩＤ−１遺伝子におけるこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子バリエーションに起因して集団内の個体間に存在し得る。対立遺伝子は、所定の遺伝子座に代替的に存在する遺伝子の群の１つである。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」とは、ＨＫＩＤ−１タンパク質、好ましくは、哺乳動物ＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする、オープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。本明細書中で使用される場合、句「対立遺伝子改変体」とは、ＨＫＩＤ−１遺伝子座に存在するヌクレオチド配列か、またはこのヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドをいう。このような天然の対立遺伝子バリエーションは、代表的に、ＨＫＩＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列において、１〜５％の変異を生じ得る。代替的な対立遺伝子は、多くの異なる個体において目的の遺伝子を配列決定することによって同定され得る。これは、種々の個体における同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを使用することによって、容易に行われ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＨＫＩＤ−１の機能活性を変更しない、ＨＫＩＤ−１における、このようなヌクレオチドバリエーション、および生じるアミノ酸多型もしくはアミノ酸バリエーションのいずれか、および全ては、本発明の範囲内にあることが意図される。ＨＫＩＤ−１の対立遺伝子改変体は、実施例５に示されるＨＫＩＤ−１の遺伝子座および物理的位置に対して、第２２染色体連鎖群の先端から１９６．７０ｃｅｎｔｉＲａｙの、Ｄ２２Ｓ１１６９とＤ２２Ｓ＿ｑｔｅｒマーカーとの間の第２２染色体にあると物理的および遺伝子的にマッピングされる。
【００３３】
本発明は、天然に存在する対立遺伝子改変体をコードする単離された核酸分子を含み、この核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの、完全に機能的なタンパク質、部分的に機能的なＨＫＩＤ−１タンパク質または非機能的なタンパク質をコードし、ここで、この核酸分子は、ストリンジェントな条件下配列番号１、配列番号３、またはでその補体を含む核酸分子にハイブリダイズする。
【００３４】
さらに、他の種由来のＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子（ＨＫＩＤ−１ホモログまたはＨＫＩＤ−１オルソログ）（これらは、ヒトＨＫＩＤ−１のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を有する）は、当該分野で公知のもの（例えば、ＨＫＩＤ−１のラット種オルソログおよびＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（カエル）種オルソログ）を除いて、本発明の範囲内であることが意図される。本発明のＨＫＩＤ−１ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体、ホモログ、およびオルソログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして、ヒトｃＤＮＡまたはその部分を使用して、本明細書中に開示されるヒトＨＫＩＤ−１核酸に対するその同一性に基づいて単離され得る。ＨＫＩＤ−１のオルソログは、しばしば、実施例５に示されるヒトＨＫＩＤ−１の遺伝子座とシンテニーである遺伝子座および物理的位置に対して、第２２染色体連鎖群の先端から１９６．７０ｃｅｎｔｉＲａｙの、Ｄ２２Ｓ１１６９とＤ２２Ｓ＿ｑｔｅｒマーカーとの間の第２２染色体にあるとマッピングされる。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列のうちの、少なくとも５４７ヌクレオチド（または少なくとも、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００または２１２６ヌクレオチド）であるか；２）配列番号３に示されるヌクレオチド配列の少なくとも４１５ヌクレオチド（または４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００または９７８ヌクレオチド）であるか；または３）配列番号１；配列番号３０のヌクレオチド１〜９２３由来の少なくとも８ヌクレオチド（または１０、１５、２０、２５、３５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１７５、２２５、２７５、３２５、３７５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または９２３ヌクレオチド）であるか；あるいは４）配列番号３；配列番号３１のヌクレオチド１〜３４４由来の少なくとも８ヌクレオチド（または１０、１５、２０、２５、３５、４５、６５、８５、１０５、１２５、１７５、２２５、２７５、３２５または３４４ヌクレオチド）であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３のヌクレオチド配列（好ましくは、コード配列）またはその相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする。
【００３６】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１もしくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、またはその一部を含む。所定のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、ストリンジェントな条件下でその所定のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る程度に十分に、その所定のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を記載している。ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見出され得る。水性および非水性の方法が、その参考文献に記載されており、いずれの方法も使用され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの別の例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃での１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での１回以上の洗浄である。特に好ましいストリンジェンシー条件（および分子が本発明のハイブリダイゼーション限定の中に入るか否かを決定するためにどの条件を適用すべきかについて、実施者が未確定の場合に使用されるべき条件）は、０．５Ｍ リン酸ナトリウム、７％ ＳＤＳ、６５℃、その後の０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃での１回以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１または配列番号３の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子は、自然界で生じるヌクレオチド配列を有する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【００３９】
集団に存在し得るＨＫＩＤ−１配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加え、当業者はさらに、ＨＫＩＤ−１タンパク質の生物学的活性を変更することなく、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列中へ変異によって変化が導入され得、これによってコードされるＨＫＩＤ−１タンパク質のアミノ酸配列に変化を導き得ることを理解する。例えば、当業者は、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導く、ヌクレオチド置換を作製し得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＨＫＩＤ−１の野生型配列（例えば、配列番号２の配列）から、その生物学的活性を変更することなく変更され得る残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、種々の種のＨＫＩＤ−１間で保存されていないか、または単に準保存的（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）にすぎないアミノ酸残基は、活性に非必須であり得、従って、変更の標的となり得る。あるいは、種々の種のＨＫＩＤ−１タンパク質間で保存されているアミノ酸残基は、活性に必須であり得、従って、変更の標的ではない。
【００４０】
例えば、本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４６〜５４；配列番号２５由来の少なくとも１つの保存されたプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域表示（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８；配列番号２７由来の少なくとも１つの保存されたセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位表示（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；および配列番号２のアミノ酸４０〜２９３；配列番号２９由来の少なくとも１つの保存された真核生物プロテインキナーゼドメイン（ＰＳ０００６９；配列番号２８）を含む。例えば、本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質は、例えば、配列番号２のアミノ酸２６０〜２６３；配列番号５由来の少なくとも１つの保存されたまたは保存されていないｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）；例えば、配列番号２のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１；配列番号７〜９由来のプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；例えば、配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４；配列番号１１〜１３由来のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；例えば、配列番号２のアミノ酸３３〜４０；配列番号１５由来のチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；例えば、配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００；配列番号１７〜２３由来のＮ−ミリストリル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）を含み得る。
【００４１】
従って、本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含むＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする核酸分子を提供する。このようなＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２とアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性を依然として保持している。１つの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
配列番号２の配列と異なる配列を有するＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作製され得る。変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基でなされ得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、ＨＫＩＤ−１における推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖のファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。あるいは、変異は、ＨＫＩＤ−１コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ））、そして生じた変異体は、活性を維持する変異体を同定するためにＨＫＩＤ−１の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。変異誘発後、コードタンパク質は、組換え発現され得、そしてこのタンパク質の活性が、測定され得る。
【００４３】
１つの実施形態において、変異ＨＫＩＤ−１は、（１）プロテインキナーゼによりリン酸化される能力、（２）Ｎ−ミリストイル化される能力、（３）ＡＴＰに結合する能力、（４）タンパク質をリン酸化する能力、および（５）セリン残基およびスレオニン残基上で特異的にタンパク質をリン酸化する能力についてアッセイされ得る。別の実施形態において、変異ＨＫＩＤ−１は、ＨＫＩＤ−１を発現する細胞（例えば、神経系の細胞）に関連するシグナル伝達経路において役割を果たすその能力、ＨＫＩＤ−１を発現する細胞において発現されるその基質タンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力、およびＨＫＩＤ−１を発現する細胞に存在するシグナル伝達経路および生物学的経路におけるタンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力についてアッセイされ得る。
【００４４】
本発明はさらに、アンチセンス核酸分子（すなわち、タンパク質をコードするセンス核酸に相補的（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的）またはｍＲＮＡ配列に相補的である分子）を包含する。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。アンチセンス核酸は、ＨＫＩＤ−１コード鎖全体に相補的であり得るか、その一部（例えば、タンパク質コード領域（すなわちオープンリーディングフレーム）の全体またはその一部）にのみ相補的であり得る。アンチセンス核酸分子は、ＨＫＩＤ−１をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスであり得る。非コード領域（「５’および３’の非翻訳領域」）は、コード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない５’および３’の配列である。
【００４５】
本明細書中に開示されるＨＫＩＤ−１をコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１または配列番号３）を考慮すると、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソン−クリック塩基対合則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、ＨＫＩＤ−１ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＨＫＩＤ−１ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＫＩＤ−１ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る（例えば、以下の配列：ＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧＧＧＣＧＡＣＧＧＣ（配列番号３５）またはＡＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧＧＧＣＧＡＣ（配列番号３６）を有するオリゴヌクレオチド）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用する、化学合成および酵素連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増加するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）設計された種々の改変ヌクレオチドを使用して、化学的に合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、発現ベクターを使用して生物学的に生成され得、この発現ベクター内に、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡであり、これは、以下の小節でさらに記載される）。
【００４６】
代表的に、本発明のアンチセンス核酸分子は、被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果これらは、ＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする細胞性のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはこれらに結合し、それによって、タンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性により得るか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合においては、その二重らせんの大きい方の溝における特異的相互作用を介し得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的するように改変され得、次いで全身的に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが、選択された細胞表面上で発現されるレセプターまたは抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面のレセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、このアンチセンス核酸分子を結合することによって、改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に、このアンチセンス核酸分子を配置したベクター構築物が、好ましい。
【００４７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であり得る。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβユニットとは対照的に、この鎖は、互いに平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【００４８】
本発明はまた、リボザイムを包含する。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）（これに対して、リボザイムは相補的領域を有する）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断して、それにより、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＨＫＩＤ−１をコードする核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、配列番号３）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列がＨＫＩＤ−１をコードするｍＲＮＡの切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるように構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００４９】
本発明はまた、三重らせん構造を形成する核酸分子を包含する。例えば、ＨＫＩＤ−１遺伝子発現は、ＨＫＩＤ−１の調節領域（例えば、ＨＫＩＤ−１プロモーターおよび／またはＨＫＩＤ−１エンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中のＨＫＩＤ−１遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般に、Ｈｅｌｅｎｅ（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９；Ｈｅｌｅｎｅ（１９９２） Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７を参照のこと。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において改変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改良し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するように改変され得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４：５を参照のこと）。本明細書で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格に置換され、そして４つの天然核酸塩基のみが保持されている、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら（１９９６）、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０に記載されるような標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【００５１】
ＨＫＩＤ−１のＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写阻止もしくは翻訳阻止を誘導することまたは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）薬剤として使用され得る。ＨＫＩＤ−１のＰＮＡはまた、例えば、ＰＮＡ指向型ＰＣＲクランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）によって；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合に人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ（１９９６），前出）；あるいはＤＮＡ配列決定およびハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、前出）、例えば、遺伝子における１つの塩基対変異の分析において使用され得る。
【００５２】
別の実施形態において、ＨＫＩＤ−１のＰＮＡは、ＰＮＡに対する脂肪親和性基または他のヘルパー基を付着することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、例えば、それらの安定性、特異性または細胞性取り込みを増強するために改変され得る。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）、前出、Ｆｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３、Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３、およびＰｅｔｅｒｓｅｒら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９に記載されるように実施され得る。
【００５３】
（ＩＩ．単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質）
本発明の１つの局面は、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質、およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗ＨＫＩＤ−１抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントを提供する。１つの実施形態において、ネイティブＨＫＩＤ−１タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を使用する適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現に代えて、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成され得る。
【００５４】
「単離された」タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分または「精製された」タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分は、ＨＫＩＤ−１タンパク質が誘導される細胞または組織供給源からの細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含有しないか、あるいは、化学的に合成される場合に化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。語「細胞性物質を実質的に含有しない」は、ＨＫＩＤ−１タンパク質が単離されるかまたは組替え的に生成される細胞の細胞性成分からこのタンパク質が分離されている、ＨＫＩＤ−１タンパク質の調製物を含む。従って、細胞性物質を実質的に含有しないＨＫＩＤ−１タンパク質は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の非ＨＫＩＤ−１タンパク質（本明細書において「夾雑タンパク質」ともいわれる）を有するＨＫＩＤ−１タンパク質の調製物を含む。ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に生成される場合、これはまた、好ましくは実質的に培養培地を含有しない（すなわち、培養培地が、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％または５％未満を示す）。ＨＫＩＤ−１タンパク質が化学合成によって生成される場合、これは、好ましくは実質的に化学的前駆体または他の化学物質を含有しない（すなわち、このタンパク質は、このタンパク質の合成に関与する化学的前駆体、または他の化学物質から分離される）。従って、ＨＫＩＤ−１タンパク質のこのような調製物は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の化学的前駆体または非ＨＫＩＤ−１化学物質を有する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明の単離されたタンパク質（好ましくは、ＨＫＩＤ−１タンパク質）は、これらのタンパク質における少なくとも１つの「プロテインキナーゼＡＴＰ結合部位」および少なくとも１つの「セリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位」の存在に、ならびに配列番号２を含むアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、またはそれより大きい相同性のアミノ酸配列を有することに基づいて、同定される。本明細書中において使用される場合、用語「プロテインキナーゼＡＴＰ結合部位」は、プロテインキナーゼにおいて保存される配列番号２４のプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列（ＰＳ００１０７）に対する有意なアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。本明細書中において使用される場合、用語「セリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位」は、タンパク質上のセリン残基およびスレオニン残基をリン酸化するプロテインキナーゼ中に保存される、配列番号２６のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャー配列（ＰＳ００１０８）に対する有意なアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
別の実施形態において、本発明の単離されたタンパク質（好ましくは、ＨＫＩＤ−１タンパク質）は、少なくとも１つの真核生物プロテインキナーゼドメインの存在に、および配列番号２を含むアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％、またはそれより大きい相同性のアミノ酸配列を有することに基づいて、同定される。本明細書中において使用される場合、用語「真核生物プロテインキナーゼドメイン」は、プロテインキナーゼにおいて保存される、配列番号２８の真核生物プロテインキナーゼドメイン配列（ＰＦ０００６９）に対する有意なアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明のなお別の実施形態は、配列番号３に少なくとも約４３％（または４５％、５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一な核酸分子を有するヌクレオチド配列によってコードされる、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質；配列番号２のアミノ酸２６０〜２６３由来のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに依存するプロテインキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）をコードする配列番号１の一部と、少なくとも約６５％、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質；配列番号５；配列番号２のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１由来の３つのプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４由来の３つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；配列番号２のアミノ酸３３〜４０由来のチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００由来の７つのＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；ならびに配列番号２のアミノ酸４６〜５４由来のプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャー（ＰＳ００１０７；配列番号２４）をコードする配列番号１の一部に、少なくとも約６５％、好ましくは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一なヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質；配列番号２５（例えば、配列番号１の約ヌクレオチド３０６〜３３２；配列番号３２）；配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８由来のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャー（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；配列番号２７（例えば、配列番号１の約ヌクレオチド６６６〜７０４；配列番号３３）；ならびに配列番号２のアミノ酸４０〜２９３由来の真核生物プロテインキナーゼドメイン（ＰＳ０００６９；配列番号２８）；配列番号２９（例えば、配列番号１の約ヌクレオチド２８８〜１０４９；配列番号３４）、および配列番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる、単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質、またはこれらの相補体を含む。
【００５８】
ＨＫＩＤ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＨＫＩＤ−１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）と実質的に同一であるかまたはこのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含み、このペプチドは、全長ＨＫＩＤ−１タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、そしてＨＫＩＤ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。代表的に、生物学的に活性な部分は、ＨＫＩＤ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＨＫＩＤ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。生物学的に活性なポリペプチドは、１つ以上の同定されたＨＫＩＤ−１構造ドメイン（例えば、配列番号２の例えばアミノ酸２６０〜２６３由来のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに依存するプロテインキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）；配列番号５；例えば、配列番号２の例えばアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１由来のプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；例えば、配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４由来のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；例えば、配列番号２のアミノ酸３３〜４０由来のチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；例えば、配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００由来のＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；例えば、配列番号２のアミノ酸４６〜５４由来のプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャー（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２５；例えば、配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８由来のセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャー（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；配列番号２７；ならびに例えば、配列番号２のアミノ酸４０〜２９３由来の真核生物プロテインキナーゼドメイン（ＰＳ０００６９；配列番号２８）；配列番号２９）を含む。
【００５９】
さらに、他の生物学的に活性な部分（ここで、タンパク質の他の領域が欠失されている）は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブＨＫＩＤ−１タンパク質の１つ以上の機能的活性について評価され得る。
【００６０】
ＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の有用なＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２と実質的に同一であり、そして天然の対立遺伝子改変または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なってもなお、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持する。例えば、このようなＨＫＩＤ−１のタンパク質およびポリペプチドは、本明細書中に記載される少なくとも１つの生物学的活性を有し、この生物学的活性は、例えば、以下である：（１）プロテインキナーゼによってリン酸化される能力、（２）Ｎ−ミリストイル化される能力、（３）ＡＴＰを結合する能力、（４）タンパク質をリン酸化する能力、（５）セリン残基およびスレオニン残基で特異的にタンパク質をリン酸化する能力、（６）ＨＫＩＤ−１を発現する細胞（例えば、神経系の細胞）に関連するシグナル伝達経路において役割を果たす能力、（７）ＨＫＩＤ−１が発現される細胞中で発現されるその基質タンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力、ならびに（８）ＨＫＩＤ−１が発現される細胞中に存在するシグナル伝達経路および生物学的経路において、タンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力。従って、有用な単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約４５％同一、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、そして配列番号２のＨＫＩＤ−１タンパク質の機能的活性を保持する、タンパク質である。他の例において、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸２６０〜２６３由来のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに依存するプロテインキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）を１つ含む１つ以上のＨＫＩＤ−１ドメインと、５５％、６５％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質；配列番号５；配列番号２のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１由来の３つのプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４由来の３つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；配列番号２のアミノ酸３３〜４０由来の１つのチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００由来の７つのＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；配列番号２のアミノ酸４６〜５４由来の１つのプロテインキナーゼＡＴＰ結合領域シグネチャー（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２５；配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８由来の１つのセリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性部位シグネチャー（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；配列番号２７；ならびに配列番号２のアミノ酸４０〜２９３由来の１つの真核生物プロテインキナーゼドメイン（ＰＦ０００６９；配列番号２８）；配列番号２９を有するタンパク質である。１つの実施形態において、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、配列番号２のＨＫＩＤ−１タンパク質の機能的活性を保持する。
【００６１】
２つのアミノ酸配列のパーセント同一性または２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適比較目的のために整列される（例えば、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列中の一方または両方に、ギャップが導入され得、そして比較の目的で、非相同配列が無視され得る）。好ましい実施形態において、比較の目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、そしてなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置で同一である。（本明細書中において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である。）２つの配列間のパーセント同一性は、これら２つの配列の最適な整列のために導入することが必要とされるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【００６２】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）においてＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。特に好ましいセットのパラメータ（およびある分子が本発明の配列同一性内に入るか相同性の限度内に入るかを決定するために適用されるべきパラメータについて実施者が不確かである場合に使用されるべきパラメータ）は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリクスを、ギャップオープンペナルティー１２、ギャップエクステンドペナルティー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５で使用することである。
【００６３】
２つのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７）のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｄｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップレングスペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いて決定され得る。
【００６４】
本明細書中に記載される核酸配列およびタンパク質配列は、公のデーターベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための、「問い合わせ配列」として使用され得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施されて、本発明のＨＫＩＤ−１核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を獲得し得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施されて、本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を獲得し得る。比較目的のためのギャップ化アラインメントを獲得するために、ギャップ化ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが、使用され得る。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００６５】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを可能にしてかまたは可能にすることなく、上記と類似の技術を使用して決定され得る。パーセント同一性の計算において、正確な一致のみが計数される。
【００６６】
本発明はまた、ＨＫＩＤ−１キメラまたはＨＫＩＤ−１融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、ＨＫＩＤ−１の「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＨＫＩＤ−１ポリペプチドに作動可能に連結されるＨＫＩＤ−１ポリペプチドを含む。「ＨＫＩＤ−１ポリペプチド」は、ＨＫＩＤ−１に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいい、一方、「非ＨＫＩＤ−１ポリペプチド」は、ＨＫＩＤ−１タンパク質に実質的に同一でないタンパク質（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質と異なり、そして同じまたは異なる生物に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＨＫＩＤ−１融合タンパク質において、ＨＫＩＤ−１ポリペプチドは、ＨＫＩＤ−１タンパク質の全てまたは一部、好ましくはＨＫＩＤ−１タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分に対応し得る。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、ＨＫＩＤ−１ポリペプチドおよび非ＨＫＩＤ−１ポリペプチドがインフレームで互いに融合されることを示すことが意図される。非ＨＫＩＤ−１ポリペプチドは、ＨＫＩＤ−１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００６７】
１つの有用な単離された融合タンパク質は、ＨＫＩＤ−１配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合された、ＧＳＴ−ＨＫＩＤ−１融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＨＫＩＤ−１の精製を容易にし得る。
【００６８】
別の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナル配列を含むＨＫＩＤ−１タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＨＫＩＤ−１の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加され得る。例えば、バキュロウイルスエンベローブタンパク質のｇｐ６７分泌配列は、異種シグナル配列として使用され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２）。真核生物異種シグナル配列の他の例には、メリチンおよびヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌配列が挙げられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。なお別の例において、有用な原核生物異種シグナル配列には、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）およびプロテインＡ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。
【００６９】
なお別の実施形態において、融合タンパク質は、ＨＫＩＤ−１−イムノグロブリン融合タンパク質であり、これは、ＨＫＩＤ−１の全てまたは一部がイムノグロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。
【００７０】
好ましくは、本発明のＨＫＩＤ−１キメラタンパク質またはＨＫＩＤ−１融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の技術に従って（例えば、連結のために平滑末端または付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄ）を使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、望ましくない結合を避けるための適切なアルカリホスファターゼ処理のような付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）の埋まり（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、および酵素的連結によって）インフレームでともに連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニール化され、そして再増幅され得る２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的突出部を生じるアンカープライマーを使用して実施され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターは、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードして市販されている。ＨＫＩＤ−１をコードする核酸は、このような発現ベクターへクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームでＨＫＩＤ−１タンパク質に連結される。
【００７１】
本発明はまた、ＨＫＩＤ−１タンパク質の改変体（すなわち、ＨＫＩＤ−１アミノ酸配列の配列とは異なる配列を有するタンパク質）を提供する。このような改変体は、ＨＫＩＤ−１アゴニスト（模倣物）またはＨＫＩＤ−１アンタゴニストのいずれかとして機能し得る。ＨＫＩＤ−１タンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質の個々の点変異または切断）によって、生成され得る。ＨＫＩＤ−１タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＨＫＩＤ−１タンパク質の生物学的活性（例えば、（１）タンパク質キナーゼによりリン酸化される能力、（２）Ｎ−ミリストイル化される能力、（３）ＡＴＰに結合する能力、（４）タンパク質をリン酸化する能力、（５）セリン残基およびスレオニン残基上でタンパク質を特異的にリン酸化する能力、（６）ＨＫＩＤ−１を発現する細胞（例えば、神経系の細胞）と関連するシグナル伝達経路において役割を果たす能力、（７）ＨＫＩＤ−１が発現される細胞において発現されるその基質タンパク質との、タンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力、ならびに（８）ＨＫＩＤ−１が発現される細胞に存在するシグナル伝達経路および生物学的経路におけるタンパク質とのタンパク質−タンパク質相互作用を形成する能力）と実質的に同じであるか、またはそのサブセットであり得る。ＨＫＩＤ−１タンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流メンバーまたは上流メンバーに競合的に結合することによって、天然に存在する形態のＨＫＩＤ−１タンパク質の活性の１つ以上を阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限定される機能の改変体での処置により引き起こされ得る。天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する改変体を用いる被験体の処置は、天然に存在する形態のＨＫＩＤ−１タンパク質を用いる処置と比較して、被験体における副作用がより少なくあり得る。
【００７２】
処置は、患者への治療剤の適用もしくは投与、または患者から単離した組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与と定義され、この患者は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有し、この適用または投与は、この疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を、治療するか、治癒するか、活性化するか、軽減するか、変更するか、改善するか、回復するか、改善するかまたは影響を与える目的で行われる。本明細書中で使用する場合、「被験体」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）、または実験動物もしくは疾患モデルをいい得る。この被験体はまた、非ヒト動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、または他の家畜）であり得る。治療剤としては、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
ＨＫＩＤ−１アゴニスト（模倣物）として、またはＨＫＩＤ−１アンタゴニストとしてのいずれとして機能するＨＫＩＤ−１タンパク質の改変体は、ＨＫＩＤ−１タンパク質のアゴニスト活性もしくはアンタゴニスト活性についてのＨＫＩＤ−１タンパク質の変異体（例えば、短縮化変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施態様において、ＨＫＩＤ−１改変体の変化を与えた（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリーは、核酸レベルでコンビナトリアルな変異誘発により生成され、そして変化を与えられた遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＨＫＩＤ−１改変体の変化を与えられたライブラリーは、潜在的なＨＫＩＤ−１配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいはそこにあるＨＫＩＤ−１配列のセット（例えば、ファージディスプレイのための）を含むより大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、例えば、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより生成され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＨＫＩＤ−１改変体のライブラリーを生成するために使用され得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機で行われ得、次いで、合成遺伝子が適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＨＫＩＤ−１配列の所望のセットをコードする配列の全ての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【００７４】
さらに、ＨＫＩＤ−１タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを使用して、スクリーニングおよび引き続いてＨＫＩＤ−１タンパク質の改変体の選択のための、変化を与えたＨＫＩＤ−１フラグメントの集団を生成し得る。１つの実施態様において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＨＫＩＤ−１コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニックが１分子につき約１回だけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニック化産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するように再生し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成され得る。この方法によって、この発現ライブラリーが誘導され得、このライブラリーは、ＨＫＩＤ−１タンパク質の種々のサイズのＮ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする。
【００７５】
点変異または短縮化により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、そして選択された特性を有する遺伝子産物についてのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術は、当該分野で公知である。このような技術は、ＨＫＩＤ−１タンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適合される。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広範に使用される技術（これは、高スループット分析になじみやすい）としては、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、適切な細胞を、得られるベクターのライブラリーで形質転換し、そして所望の活性の検出が、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現することが挙げられる。ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を増強する技術である反復的な全体変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイとの組み合わせで使用して、ＨＫＩＤ−１改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【００７６】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの全体的に機能的なタンパク質、部分的に機能的なタンパク質、または非機能的タンパク質を含む、天然に存在する対立遺伝子改変体である単離されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内であり、ここでこのポリペプチドは、配列番号１、配列番号３またはその相補体を含む核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。ＨＫＩＤ−１の対立遺伝子改変体は、遺伝子によってコードされ、この遺伝子は、Ｄ２２Ｓ１１６９とＤ２２Ｓ ｑｔｅｒマーカーとの間の第２２染色体であり、この第２２染色体の連結部分の上から１９６．７０ｃｅｎｔｉＲａｙにあることが実施例５で示されているＨＫＩＤ−１の遺伝的かつ物理的位置に物理的かつ遺伝子的マッピングされる。
【００７７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、ＨＫＩＤ−１の種オルソログである単離されたポリペプチドもまた、本発明の範囲内であり、このポリペプチドは、配列番号１、配列番号３またはその相補体を含む核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。ＨＫＩＤ−１の種オルソログは、これらが由来するゲノムの、Ｄ２２Ｓ１１６９とＤ２２Ｓ ｑｔｅｒマーカーとの間のヒト第２２染色体にシンテニーであり、この第２２染色体の連結基の上から１９６．７０ｃｅｎｔｉＲａｙである領域に、しばしば物理的かつ遺伝子的にマッピングされる。
【００７８】
（ＩＩＩ．抗ＨＫＩＤ−１抗体）
本発明は、本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫学的に活性な免疫グロブリン分子の一部（すなわち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、ＨＫＩＤ−１））をいう。ＨＫＩＤ−１に特異的に結合する分子は、ＨＫＩＤ−１を結合する分子であるが、天然にＨＫＩＤ−１を含むサンプル（例えば、生物学的サンプル）中の他の分子とは実質的に結合しない。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、ＨＫＩＤ−１を結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、ＨＫＩＤ−１の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定のＨＫＩＤ−１タンパク質に対する単一の結合親和性を提示する。
【００７９】
単離されたＨＫＩＤ−１タンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用して、ＨＫＩＤ−１を結合する抗体を作製するために、免疫原として使用され得る。全長ＨＫＩＤ−１タンパク質が、用いられエルカ、あるいは、本発明は、免疫源として使用するためのＨＫＩＤ−１の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＨＫＩＤ−１の抗原性ペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の少なくとも８（好ましくは、１０、１５、２０または３０）のアミノ酸残基を含み、かつＨＫＩＤ−１のエピトープを包含し、その結果、このペプチドに対して惹起された抗体は、ＨＫＩＤ−１との特異的免疫複合体を形成する。
【００８０】
抗原性ペプチドにより含まれるエピトープは、タンパク質の表面に位置するＨＫＩＤ−１の領域である。ヒトＨＫＩＤ−１タンパク質のポリペプチド配列（配列番号２）の、図３に示される表面確率分析は、以下の可能な抗原性領域；アミノ酸２８〜３９、アミノ酸１２４〜１２９およびアミノ酸２７７〜２８３が、このタンパク質の表面に存在する可能性が特に高く、従って、抗体作製の標的化のために有用な表面残基をコードする可能性があることを同定する。
【００８１】
ＡＮ ＨＫＩＤ−１免疫原は、代表的に、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）をこの免疫原で免疫することによって、抗体を調製するために使用される。適切な免疫原の調製は、例えば、組換え発現されたＨＫＩＤ−１タンパク質または化学的に合成されたＨＫＩＤ−１ポリペプチドを含み得る。この調製物は、さらに、アジュバンド（例えば、フロイト完全アジュバンドもしくはフロイント不完全アジュバント、または類似の免疫刺激剤）を含み得る。適切な被験体の免疫原性ＨＫＩＤ−１調製物での免疫は、ポリクローナル抗ＨＫＩＤ−１抗体応答を誘発する。
【００８２】
ポリクローナル抗ＨＫＩＤ−１抗体は、適切な被験体をＨＫＩＤ−１免疫原で免役することによって、上記の様にして調製され得る。この免疫された被験体における抗ＨＫＩＤ−１抗体の力価は、標準的な技術によって（例えば、固定化ＨＫＩＤ−１を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）、経時的にモニタリングされ得る。所望の場合、ＨＫＩＤ−１に対して指向される抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離し得、そしてさらに、周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）により精製し得る。免疫後、適切な時間に、例えば、抗ＨＫＩＤ−１抗体の力価が最も高いときに、抗体生成細胞を被験体から獲得し得、そしてこれを使用して、標準的技術（例えば、初めは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）によりモノクローナル抗体を調製し得る。ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。簡潔には、不死化細胞株（代表的には骨髄腫細胞）を、上記のようにＨＫＩＤ−１免疫原で哺乳動物由来の免疫したリンパ球（代表的には、脾臓細胞）と融合し、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＨＫＩＤ−１を結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
【００８３】
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルは、抗ＨＫＩＤ−１モノクローナル抗体を生成する目的で適用され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、前出；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５２；Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、これらがまた有用であることを理解する。代表的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物を免疫したマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性である骨髄腫細胞株）とを融合することにより作製され得る。多くの骨髄腫細胞株のうち任意のものが、標準的技術に従う融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合する。次いで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する（このことにより、融合していない細胞および生成性でない融合骨髄腫細胞は死ぬ（融合していない脾臓細胞は、形質転換していないので数日後に死ぬ））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、ＨＫＩＤ−１を結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより（例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して）検出される。
【００８４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、モノクローナル抗ＨＫＩＤ−１抗体を同定し得、そして組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を、ＨＫＩＤ−１を用いてスクリーニングすることにより単離し得、それによってＨＫＩＤ−１を結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際の使用に特になじみやすい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４に見出され得る。
【００８５】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗ＨＫＩＤ−１抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の技術範囲内であり、これは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願１８４，１８７号；欧州特許出願１７１，４９６号；欧州特許出願１７３，４９４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して）生成され得る。
【００８６】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置のために特に望ましい。このような抗体は、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて生成され得る。このトランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えば、ＨＫＩＤ−１の全てまたは一部分）を用いて通常の様式で免疫される。この抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得られ得る。トランスジェニックマウスにより保有されるこのヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配置され、そして続いてクラススイッチおよび体細胞変異を受ける。従って、このような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生成することは可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概観については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成することに関するこの技術ならびにそのような抗体を生成するためのプロトコールについての詳細な議論については、例えば、米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，５６９，８２５号；米国特許第５，６６１，０１６号；および米国特許第５，５４５，８０６号を参照のこと。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）のような会社は、上記に記載の技術に類似の技術を使用する選択された抗体に対して指向されるヒト抗体を提供することを保証し得る。
【００８７】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「導かれた選択」として言及される技術を用いて生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を使用して、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を導く。
【００８８】
第１に、選択された抗原（エピトープ）を結合する非ヒトモノクローナル抗体（例えば、ＨＫＩＤ−１活性を阻害する抗体）が同定される。非ヒト抗体の重鎖および軽鎖はクローニングされ、そしてこれを使用してファージディスプレイＦａｂフラグメントを作製する。例えば、重鎖遺伝子は、重鎖が細菌から分泌され得るように、プラスミドベクターへクローニングされ得る。軽鎖遺伝子は、軽鎖がファージの表面上に発現され得るように、ファージコートタンパク質遺伝子にクローニングされ得る。ファージに融合したヒト軽鎖レパートリー（無作為収集物）を使用して、非ヒト重鎖を発現する細菌に感染させる。得られる子孫ファージは、ハイブリッド抗体（ヒト軽鎖／非ヒト重鎖）を提示する。選択された抗原をパニングスクリーニングにおいて使用して、選択された抗原に結合するファージを選択する。このようなファージを同定するために、数回の選択が必要であり得る。次いで、ヒト軽鎖遺伝子は、選択された抗原を結合する選択されたファージから単離される。次いで、これらの選択されたヒト軽鎖遺伝子を使用して、以下のとおり、ヒト重鎖遺伝子の選択を導く。選択されたヒト軽鎖遺伝子は、細菌による発現のためにベクターに挿入される。選択されたヒト軽鎖を発現する細菌を、ファージに融合されたヒト重鎖のレパートリーで感染させる。得られる子孫ファージは、ヒト抗体（ヒト軽鎖／ヒト重鎖）を提示する。
【００８９】
次いで、選択された抗原をパニングスクリーニングにおいて使用して、選択された抗原を結合するファージを選択する。この工程で選択されたファージは、最初に選択された非ヒトモノクローナル抗体により認識される同じエピトープを認識する完全なヒト抗体を提示する。重鎖および軽鎖の両方をコードする遺伝子は、容易に単離され、そしてヒト抗体を生成するためにさらに操作され得る。この技術は、Ｊｅｓｐｅｒｓら（１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３）に記載される。
【００９０】
抗ＨＫＩＤ−１抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して、標準的技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィーもしくは免疫沈降）によりＨＫＩＤ−１を単離し得る。抗ＨＫＩＤ−１抗体は、細胞からの天然のＨＫＩＤ−１および宿主細胞中で発現される、組換え生成されたＨＫＩＤ−１の生成を容易にし得る。さらに、抗ＨＫＩＤ−１抗体を使用して、ＨＫＩＤ−１タンパク質の発現量および発現パターンを評価するために、ＨＫＩＤ−１タンパク質（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）を検出し得る。抗ＨＫＩＤ−１抗体を、例えば、診断的に使用して、（例えば、所定の処置レジメンの有効性を決定するために）臨床試験手順の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニターし得る。検出可能な物質に抗体を結合することにより、検出は容易になり得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニラミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）、フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【００９１】
（ＩＶ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、さらに、本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする核酸またはその一部を含むベクター、好ましくは、発現ベクターを提供する。
【００９２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自発的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有するウイルスベクターまたはエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターである発現ベクターは、それらに作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。一般に、発現ベクターの組換えＤＮＡ技術における有用性は、しばしばプラスミド（ベクター）の形態である。しかし、本発明は、このような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）、これらは等価な機能に貢献する）を含むように意図される。
【００９３】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適する形態で含む。これは、この組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現のために用いられるべき宿主細胞を基礎に選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、調節配列（単数または複数）に、ヌクレオチド配列の発現を可能にするような様式（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞中に導入されるとき宿主細胞において）で連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され得、それによって本明細書に記載されるような核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質、ＨＫＩＤ−１タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を含む、タンパク質またはペプチドを生成する。
【００９４】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＨＫＩＤ−１タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞中で発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（前出）でさらに論議されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳され得る。
【００９５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ中で最も頻繁に実施される。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、その中にコードされるタンパク質に（通常、組換えタンパク質のアミノ末端に）付加する。代表的には、このような融合タンパク質は、３つの目的の役に立つ：１）組換えタンパク質の発現を増加すること；２）組換えタンパク質の溶解度を増加すること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を支援すること。しばしば、融合発現ベクターにおいては、タンパク質切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との融合の接続部に導入され、この融合タンパク質の精製の次に融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。このような酵素、およびそれらの同族起源の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含む。
【００９６】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１遺伝子を有する、常在性λプロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって補充される。
【００９７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する減弱した能力を有する宿主細菌中でタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別のストラテジーは、各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉ中で優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成技術によって行われ得る。
【００９８】
別の実施形態において、ＨＫＩＤ−１発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。
【００９９】
あるいは、ＨＫＩＤ−１は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に適切なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１００】
なお別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、前出の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１０１】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）、および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清ホエープロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開番号２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））もまた、含まれる。
【０１０２】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、（ＤＮＡ分子の転写によって）ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡに対してアンチセンスのＲＮＡ分子の発現を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列が、選択され得、この調節配列は、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を指向し、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な、組織特異的なまたは細胞型特異的な発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはウイルスエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、これらのベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、（Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６）を参照のこと。
【０１０３】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいう。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でなくてもよく、本明細書中で使用されるようなこの用語の範囲内になお含まれる。
【０１０４】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１０５】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、および他の実験説明書において見出され得る。
【０１０６】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、小さい割合の細胞のみが、そのゲノム中に外来のＤＮＡを組み込み得ることが公知である。これらの組み込みを同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般に、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート）に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＨＫＩＤ−１をコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、または別個のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１０７】
本発明の宿主細胞（例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）は、ＨＫＩＤ−１タンパク質を生成する（すなわち、発現する）ために使用され得る。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてＨＫＩＤ−１タンパク質を産生する方法をさらに提供する。１つの実施形態では、この方法は、本発明の宿主細胞（これにＨＫＩＤ−１をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適切な培地中で、ＨＫＩＤ−１タンパク質が産生されるように培養する工程を包含する。別の実施形態では、この方法は、上記培地または宿主細胞からＨＫＩＤ−１を単離する工程をさらに包含する。
【０１０８】
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、受精卵または胚性幹細胞であり、この細胞に、ＨＫＩＤ−１コード配列が導入される。次いで、このような宿主細胞を使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製し得、ここにおいて、外因性のＨＫＩＤ−１配列が、それらのゲノムまたは相同な組換え動物に導入され、ここで、内因性のＨＫＩＤ−１配列が、変更される。このような動物は、ＨＫＩＤ−１の機能および／または活性を研究するため、ならびにＨＫＩＤ−１活性のモジュレーターを同定および／または評価するために、有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、ここで、これらの動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、外因性ＤＮＡであり、この外因性ＤＮＡは、トランスジェニック動物が成長する細胞のゲノムに取り込まれ、かつ成熟動物のゲノムにおいて維持され、それによってこのトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織における、コードされた遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同な組換え動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、マウスであり、ここで、内因性のＨＫＩＤ−１遺伝子は、この内因性遺伝子と、動物の成長前にこの動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入される外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更される。
【０１０９】
本発明のトランスジェニック動物は、ＨＫＩＤ−１のコード核酸を、受精卵の雄前核に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって導入し、そして卵母細胞を偽妊娠雌養母動物において成長させることによって作製され得る。ＨＫＩＤ−１のｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号１または配列番号３の配列）は、導入遺伝子として、非ヒト動物のゲノムに導入され得る。あるいは、ヒトのＨＫＩＤ−１遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＨＫＩＤ−１遺伝子）は、ヒトＨＫＩＤ−１のｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現の効力を増加させるように、この導入遺伝子に含まれ得る。組織特異的調節配列は、ＨＫＩＤ−１導入遺伝子に作動可能に連結されて、ＨＫＩＤ−１タンパク質の発現を特定の細胞に指向し得る。胚操作およびマイクロインジェクションを介して、トランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野において慣習的であり、例えば、以下に記載されている：米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにＨｏｇａｎ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）。類似の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用され得る。トランスジェニックファウンダー（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＨＫＩＤ−１導入遺伝子の存在、および／あるいは動物の組織または細胞におけるＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定され得る。次いで、トランスジェニックファウンダー動物を使用して、導入遺伝子を保有するさらなる動物を産出し得る。さらに、ＨＫＩＤ−１をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物はさらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を産出し得る。
【０１１０】
相同な組換え動物を作製するために、ＨＫＩＤ−１遺伝子（例えば、ＨＫＩＤ−１遺伝子（例えば、マウスＨＫＩＤ−１遺伝子）のヒトホモログまたは非ヒトホモログ）の少なくとも一部を含むベクターが調製され、このベクターに、欠失、付加または置換が導入されて、それによって、ＨＫＩＤ−１遺伝子が変更される（例えば、機能的に破壊される）。１つの実施形態において、ベクターは、相同組換えの際に、内因性のＨＫＩＤ−１遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように、設計される。あるいは、ベクターは、相同組換えの際に、内因性のＨＫＩＤ−１遺伝子が変異されるか、さもなければ変更されるが依然として機能的タンパク質をコードする（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性のＨＫＩＤ−１タンパク質の発現を変更し得る）ように、設計され得る。相同な組換えベクターにおいて、ＨＫＩＤ−１遺伝子の変更された部分は、ＨＫＩＤ−１遺伝子のさらなる核酸配列によって、その５’末端および３’末端に隣接し、ベクターによって保有される外因性のＨＫＩＤ−１遺伝子と、胚性幹細胞における内因性ＨＫＩＤ−１遺伝子との間に、相同組換えが生じることを可能にする。さらなる隣接のＨＫＩＤ−１核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さの核酸である。代表的には、隣接したＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）の数キロベースが、このベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの記載については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは、胚性幹細胞株に、（例えば、エレクトロポーションによって）導入され、そして導入されたＨＫＩＤ−１遺伝子が内因性のＨＫＩＤ−１遺伝子と相同に組み換わる細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。次いで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注射され、凝集キメラを形成し得る。（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）１１３−１５２頁）を参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌養母動物に移植され得、そしてこの胚は、生殖（ｔｅｒｍ）され得る。生殖細胞において相同組換えされたＤＮＡを含む子孫を使用して、動物を繁殖させ得、ここにおいて、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む。相同な組換えベクターおよび相同な組換え動物を構築するための方法は、以下にさらに記載される：Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３−８２９、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ９０／１１３５４；ＷＯ ９１／０１１４０；ＷＯ ９２／０９６８およびＷＯ ９３／０４１６９。
【０１１１】
別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物が作製され得、これは、導入遺伝子の調節された発現を可能にする、選択された系を含む。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要とされる。このような動物は、「二重」トランスジェニック動物の構築によって（例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードするトランスジーンを含み、他方は、リコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む）を交配させることによって）提供され得る。
【０１１２】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ公報番号ＷＯ ９７／０７６６８およびＷＯ ９７／０７６６９に記載される方法に従って産生され得る。まとめると、トランスジェニック動物に由来する細胞（例えば、体細胞）は、単離され得、そして増殖サイクルを出てＧ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、静止細胞が単離されたのと同じ種の動物に由来する、徐核した卵母細胞に融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、桑実胚または胚盤胞に発達するように培養され、次いで、偽妊娠の雌性里親（ｆｏｓｔｅｒ）動物に移植される。この雌性里親動物の子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０１１３】
（Ｖ．薬学的組成物）
本発明のＨＫＩＤ−１核酸分子、ＨＫＩＤ−１タンパク質、および抗ＨＫＩＤ−１抗体（本明細書中で「活性化合物」ともいわれる）は、投与に適切な薬学的組成物中に取り込まれ得る。このような組成物は、代表的には、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、言語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤がこの活性化合物と非適合性である範囲を除いて、この組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的な活性化合物はまた、この組成物中に取り込まれ得る。
【０１１４】
本発明の薬学的組成物は、投与のその意図された経路と適合性であるように処方される。投与の経路の例には、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が挙げられ得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）、および張度を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されるアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量のバイアル中に含まれ得る。
【０１１５】
注射用の使用に適切な薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散液の即時調製物のための滅菌水溶液（ここでは水溶性）または分散液、および滅菌粉末を含む。静脈内注射については、適切なキャリアには、生理学的な生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合では、この組成物は、滅菌されなければならず、そして容易なシリンジ能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度にまで流動的にされるべきである。これは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。このキャリアは、溶媒または分散培地（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなどを含む）、ならびにそれらの安定な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、塩化ナトリウム）をこの組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の延長した吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をこの組成物中に含むことによって、もたらされ得る。
【０１１６】
滅菌注射用溶液は、活性化合物（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質または抗ＨＫＩＤ−１抗体）を、上記で列挙した成分の１以上の組合せで、必要とされる量において適切な溶媒中に取り込ませ、必要とされる場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒体および上記に列挙された成分のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に取り込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これらは、活性成分の粉末およびその以前に滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分を生じる。
【０１１７】
経口組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用キャリアを含む。それらは、ゼラチンカプセル中に含まれるか、または錠剤へと圧縮される。経口治療投与のために、この活性化合物は、賦形剤とともに取り込まれ、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用される。経口組成物はまた、口内洗浄としての使用のための流体キャリアを使用して調製され得、ここでこの流体キャリア中の化合物は、経口で適用され、そして口内洗浄され（ｓｗｉｓｈ）、吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、または同様の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはトウモロコシデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；滑動剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド二酸化珪素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。吸入による投与については、これらの化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のようなガスまたはネブライザ）を含む加圧した容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレの形態で送達される。
【０１１８】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によってであり得る。経粘膜投与または経皮投与については、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤（ｐｅｎｅｔｒａｎｔ）が、この処方物中にて使用され得る。このような浸透剤は、一般に、当該分野において公知であり、そして例えば、経粘膜投与、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、これらの活性化合物は、当該分野において一般に公知である、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤、またはクリーム剤に処方される。
【０１１９】
これらの化合物はまた、直腸送達のために、坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤とともに）または貯留注腸の形態で調製され得る。
【０１２０】
１つの実施形態において、これらの活性化合物は、身体からの化合物の迅速な除去に対してこの化合物を保護するキャリアとともに調製される（例えば、制御放出処方物（移植片およびマイクロカプセル化送達系を含む））。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物の調製の方法は、当業者に明らかである。この物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販され得る。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、当業者に公知の方法（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される）に従って調製され得る。
【０１２１】
投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で経口組成物または非経口組成物を処方することは、特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態は、処置される被検体に対して単回投薬として適切な物理的に分離した単位をいう；各々の単位は、必要とされる薬学的キャリアと一緒に所望の治療効果を生じるように算定された所定量の活性化合物を含む。疾患の型および重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１つ以上の別個の投与であろうと、連続した注入であろうと、患者への投与のための開始候補投薬量である。代表的な一日投薬量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得、これは上記の要因に依存する。数日またはより長い期間にわたる繰り返し投与のために、状態に依存して、処置は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続される。しかし、他の投薬レジメンが有用であり得る。この治療の進行は、慣用的な技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。例示的な投薬レジメンは、ＷＯ ９４／０４１８８に開示される。本発明の投薬単位形態についての詳細は、活性化合物の独特な特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を混合する当該分野に固有の制限によって示され、そして直接的に依存する。
【０１２２】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）によってか、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４〜３０５７）によって被検体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている緩徐な放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞（レトロウイルスベクター）からインタクトで産生され得る場合、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０１２３】
薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサー内に、投与のための使用説明書と一緒に含まれ得る。
【０１２４】
（ＶＩ．本発明の使用および方法）
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体は、１以上の以下の方法に使用され得る：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医学標本）；ｃ）予測的な医薬品（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリング、および薬理遺伝学）；ならびにｄ）処置方法（例えば、治療および予防）。ＨＫＩＤ−１タンパク質は、他の細胞タンパク質と相互作用し、従って、ＨＫＩＤ−１タンパク質を発現する細胞またはＨＫＩＤ−１経路に関与する細胞（例えば、神経系の細胞）において、ＨＫＩＤ−１タンパク質を調節するための治療的分子を開発するための標的として使用され得る。本発明の単離された核酸分子は、ＨＫＩＤ−１タンパク質を（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞中での組換え発現ベクターを通じて）発現するため、（例えば、生物学的サンプル中の）ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡまたはＨＫＩＤ−１遺伝子における遺伝的損傷を検出するために、ならびにＨＫＩＤ−１活性を調節するために使用され得る。さらに、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、ＨＫＩＤ−１活性または発現を調節するために薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびにＨＫＩＤ−１タンパク質の不十分または過剰な産生、あるいはＨＫＩＤ−１野生型タンパク質と比較して減少したかまたは異常な活性を有するＨＫＩＤ−１タンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置する使用され得る。さらに、本発明の抗ＨＫＩＤ−１抗体は、ＨＫＩＤ−１タンパク質を検出かつ単離するために、かつＨＫＩＤ−１活性を調節するために使用され得る。
【０１２５】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのその使用に提供する。
【０１２６】
（Ａ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、ＨＫＩＤ−１タンパク質に結合するか、または例えば、ＨＫＩＤ−１発現もしくはＨＫＩＤ−１活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有するモジュレーター、すなわち候補または試験化合物または因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）を提供する。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明は、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはそのポリペプチドもしくは生物学的に活性な部分に結合するか、あるいはその活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー方法（生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な対応する固相または溶液相ライブラリー；デコンボルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法を含む）における任意の多くのアプローチを使用して得られ得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定され、一方、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１２８】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、例えば、以下において、当該分野で見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０１２９】
化合物のライブラリーは、溶液中に存在し得るか（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、ビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌上（米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞上（特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３８７〜６３８２；ならびにＦｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０）であり得る。
【０１３０】
１つの実施形態では、本発明のアッセイは、無細胞ベースのアッセイであり、ここでＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、試験化合物とを接触させる工程、およびＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する試験化合物の能力を決定する工程を包含する。ＨＫＩＤ−１タンパク質への試験化合物の結合は、本明細書中に記載されるように、直接的にかまたは間接的にかのいずれかによって決定され得る。１つの実施形態では、このアッセイは、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、ＨＫＩＤ−１を結合する既知の化合物とを接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、およびこの試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここでこの試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、既知の化合物と比較した場合、試験化合物がＨＫＩＤ−１またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する。
【０１３１】
別の実施形態において、アッセイは、以下を含む無細胞アッセイである：ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触する工程、およびＨＫＩＤ−１またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激するまたは阻害する）試験化合物の能力を決定する工程。ＨＫＩＤ−１の活性を調節する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、直接的な結合を決定するために上述の方法の１つによって、ＨＫＩＤ−１標的分子に結合するＨＫＩＤ−１タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。代替の実施形態において、ＨＫＩＤ−１の活性を調節する試験化合物の能力を決定する工程は、ＨＫＩＤ−１標的分子をさらに調節するＨＫＩＤ−１タンパク質の能力を決定する工程によって達成され得る。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒的／酵素的活性は、先に記載されたように決定され得る。
【０１３２】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＨＫＩＤ−１に結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、ＨＫＩＤ−１タンパク質が、ＨＫＩＤ−１標的分子に優先的に結合するか、またはＨＫＩＤ−１標的分子の活性を調製する能力を決定する工程を包含する。
【０１３３】
リン酸化基質のホスホアミノ酸分析はまた、ＨＫＩＤ−１基質上のどの残基がリン酸化されるかを決定するために、実施され得る。簡単に述べると、放射リン酸化タンパク質バンドは、ＳＤＳゲルから切り出され得、そして部分的な酸加水分解に供され得る。次いで、この生成物は、１次元電気泳動によって分離され得、そして例えば、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）において分析され得、そしてニンヒドリン染色ホスホアミノ酸標準と比較される。
【０１３４】
本発明のなお別の実施形態において、無細胞アッセイは、例えば、インビトロキナーゼアッセイによって、ＨＫＩＤ−１タンパク質が、ＨＫＩＤ−１標的分子をリン酸化する能力を決定する。簡単に述べると、ＨＫＩＤ−１標的分子（例えば、このような分子を発現する細胞株由来の免疫沈降したＨＫＩＤ−１標的分子）を、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２（例えば、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＭｎＣｌ２）を含む緩衝液中で、ＨＫＩＤ−１タンパク質および放射活性ＡＴＰ（例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）とともにインキュベートし得る。インキュベーションに続いて、免疫沈降したＨＫＩＤ−１標的分子は、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され得、膜（例えば、ＰＶＤＦ膜）に移され、そしてオートラジオグラフされ得る。オートラジオグラフ上の検出可能なバンドの出現は、ＨＫＩＤ−１基質がリン酸化されたことを示す。
【０１３５】
１つの実施形態では、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここでＨＫＩＤ−１タンパク質の可溶性形態、またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞は、試験化合物と接触され、そしてＨＫＩＤ−１タンパク質に結合する試験化合物の能力が決定される。例えば、細胞は、酵母細胞または哺乳動物起源の細胞であり得る。試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質に結合する能力の決定は、例えば、試験化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせ、その結果、ＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する試験化合物の結合が、複合体における標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてこの放射性同位体が、放射線放射の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素標識は、適切な基質の産物への転換を決定することによって検出され得る。１つの実施形態では、このアッセイは、ＨＫＩＤ−１タンパク質の可溶性形態、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞と、ＨＫＩＤ−１を結合する既知の化合物とを接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、およびこの試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程であって、ここでこの試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、既知の化合物と比較した場合、試験化合物がＨＫＩＤ−１またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を決定する工程を包含する、工程を包含する。
【０１３６】
別の実施形態では、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ＨＫＩＤ−１タンパク質の可溶性形態、またはその生物学的に活性な部分を発現している細胞と、試験化合物とを接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＨＫＩＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力を決定する工程を包含する。試験化合物がＨＫＩＤ−１またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力を決定する工程は、例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質がＨＫＩＤ−１標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する能力を決定することによって達成され得る。本明細書中で使用され得る場合、「標的分子」は、ＨＫＩＤ−１タンパク質が天然で結合するかまたは相互作用する分子（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質を発現する細胞の内部においてＨＫＩＤ−１タンパク質によってリン酸化される基質分子、細胞膜の内部表面に会合している分子または細胞質分子）である。ＨＫＩＤ−１標的分子は、非ＨＫＩＤ−１分子、または本発明のＨＫＩＤ−１タンパク質もしくはポリペプチドであり得る。１つの実施形態では、ＨＫＩＤ−１標的分子は、シグナル伝達を媒介するシグナル伝達経路の構成要素である。
【０１３７】
ＨＫＩＤ−１タンパク質がＨＫＩＤ−１標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する能力を決定する工程は、直接的な結合を決定するための、上記の方法のうちの１つによって達成され得る。１つの実施形態では、このＨＫＩＤ−１タンパク質がＨＫＩＤ−１標的分子に結合するかまたはそれと相互作用する能力を決定する工程は、この標的分子の活性を決定することによって達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、この標的の細胞セカンドメッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質に対するこの標的の触媒／酵素活性を検出すること、レセプター遺伝子（例えば、検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＨＫＩＤ−１応答性調節エレメント）の誘導を検出すること、あるいは細胞応答（例えば、細胞分化、または細胞増殖）を検出することによって決定され得る。
【０１３８】
本発明のアッセイ方法の種々の実施形態において、ＨＫＩＤ−１またはその標的分子のいずれかを固定し、このタンパク質の１つまたは両方の複合体化されていない形態からの複合体化された形態の分離を促進すること、およびアッセイの自動化に適応することが所望され得る。候補化合物の存在下および非存在下でのＨＫＩＤ−１に対する標的化合物の結合、またはＨＫＩＤ−１と標的分子との相互作用は、反応物質を含むために適切な任意の容器において達成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、このタンパク質の１つまたは両方をマトリックスに結合させるドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＨＫＩＤ−１融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次にこれらは、試験化合物または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＨＫＩＤ−１タンパク質のいずれかと組み合わされ、そしてこの混合物は、複合体形成を誘導する条件下で（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件下で）インキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは任意の非結合成分を除去するために洗浄され、そして複合体形成は、例えば、上記のように直接または間接的にのいずれかで測定される。あるいは、その複合体は、マトリックスから解離され得、そしてＨＫＩＤ−１結合または活性のレベルは、標準的技術を用いて決定される。
【０１３９】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。例えば、ＨＫＩＤ−１またはその標的分子のいずれかは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定され得る。ビオチン化ＨＫＩＤ−１または標的分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジン被膜９６−ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルにおいて固定され得る。あるいは、ＨＫＩＤ−１または標的分子と反応性だが、ＨＫＩＤ−１タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体は、プレートのウェル、および抗体結合体化によりこのウェル中に閉じ込められた非結合の標的またはＨＫＩＤ−１に誘導体化され得る。このような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ−固定複合体について上記された方法に加えて、ＨＫＩＤ−１または標的分子と反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＨＫＩＤ−１または標的分子に関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを含む。
【０１４０】
別の実施形態において、ＨＫＩＤ−１発現の調節因子は、細胞が候補化合物と接触される方法において同定され、そして細胞中のＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される。候補化合物の存在下におけるＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルが、候補化合物の非存在下におけるＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、この候補化合物は、この比較に基づき、ＨＫＩＤ−１発現の調節因子として同定され得る。例えば、候補化合物の存在下におけるＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が非存在下におけるその発現よりも大きい（統計学的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、候補化合物の存在下におけるＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が非存在下におけるその発現よりも少ない（統計学的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞におけるＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書において記載された方法により決定され得る。
【０１４１】
本発明のなお別の局面において、ＨＫＩＤ−１タンパク質は、ＨＫＩＤ−１に結合するかまたは相互作用し（「ＨＫＩＤ−１結合タンパク質」または「ＨＫＩＤ−１−ｂｐ」）そしてＨＫＩＤ−１活性を調節する他のタンパク質を同定するため、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として用いられ得る（例えば、米国特許番号第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｏｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）。このようなＨＫＩＤ−１結合タンパク質はまた、ＨＫＩＤ−１タンパク質によるシグナルの伝達（例えば、ＨＫＩＤ−１経路の上流エレメントまたは下流エレメント）に関与するようである。本発明はまた、２ハイブリットスクリーニングにおけるベイトとしてのＨＫＩＤ−１と相互作用するタンパク質（例えば、ＨＫＩＤ−１との２ハイブリットインタラクター）の使用およびＨＫＩＤ−１相互作用タンパク質相互作用タンパク質の同定を提供する。ＨＫＩＤ−１相互作用タンパク質相互作用タンパク質は、ＨＫＩＤ−１シグナル伝達経路に関与するようである。
【０１４２】
本発明は、本明細書に記載される処置について上記のスクリーニングアッセイおよびその使用により同定される新規の因子にさらに提供する。
【０１４３】
（Ｂ．検出アッセイ）
本明細書において同定されたｃＤＮＡ配列（および対応する完全遺伝子配列）の部分またはフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で用いられ得る。例えば、これらの配列は以下のために用いられ得る：（ｉ）染色体上のそれぞれの遺伝子をマッピングし、それにより遺伝病に関連する遺伝子領域の位置付けをするため；（ｉｉ）わずかな生物学的サンプルから個体を同定する（組織タイピング）ため；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的な同定を補助するため。これらの適用は以下の小節において記載される。
【０１４４】
（１．組織タイピング）
本発明のＨＫＩＤ−１配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を同定するために用いられ得る。例えば、合衆国軍は、その職員の同定のために制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）の使用を検討している。この技術では、個体のゲノムＤＮＡが１つ以上の制限酵素で消化され、そしてサザンブロット上にプローブされ、同定のための特有のバンドを生じる。この方法であれば、失われ、入れ替えられまたは盗まれ得る、ポジティブな同定を困難にする「ドッグタグ（Ｄｏｇ Ｔａｇ）」の現在の制限をうけない。本発明の配列はＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０１４５】
さらに、本発明の配列は、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定する代替技術を提供するために用いられ得る。従って、本明細書において記載されるＨＫＩＤ−１配列は、その配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製するために用いられ得る。次いで、これらのプライマーは、個体のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列決定するために用いられ得る。
【０１４６】
この様式で調製された、個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特有の個体の同定を提供し得る。なぜなら、それぞれの個体は対立遺伝子の差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の特有のセットを有するからである。本発明の配列は、個体由来、および組織由来のこのような同定配列を得るために用いられ得る。本発明のＨＫＩＤ−１配列は、ヒトゲノムの部分を特有に示す。対立遺伝子改変は、これらの配列のコード領域においてある程度まで生じ、そして非コード領域においてより大きい程度まで生じる。個々のヒトの間の対立遺伝子改変は、５００塩基あたりおよそ１個の頻度で生じると推定される。本明細書において記載される配列のそれぞれは、同定目的のために比較され得る個体由来のＤＮＡに対して、ある程度まで、標準物として用いられ得る。非コード領域においては、より多数の多型性が生じるので、個体を区別するのに必要な配列はより少なくなる。配列番号１の非コード配列は、１００塩基の非コードの増幅された配列をそれぞれ生じる、おそらく１０〜１，０００のプライマーのパネルを用いて、ポジティブ個体同定を十分に提供する。推定コード配列（例えば、配列番号３）が用いられる場合、ポジティブ個体同定のためのプライマーのより適切な数は５００〜２，０００である。
【０１４７】
本明細書において記載されるＨＫＩＤ−１配列からの試薬のパネルが、個体のための特有の同定データベースを生成するために用いられる場合、これらの同じ試薬は、その個体由来の組織を同定するために後で用いられ得る。特有の同定データベースを用いて、個体（生存または死亡している）のポジティブ同定は、非常にわずかな組織サンプルからなされ得る。
【０１４８】
（２．法医生物学における部分ＨＫＩＤ−１配列の使用）
ＤＮＡに基づく同定技術はまた、法医生物学において用いられ得る。法医生物学は、例えば犯罪の加害者をポジティブに同定するための手段として、犯罪現場で発見された生物学的証拠の遺伝子タイピングを使用する科学分野である。このような同定を行うため、ＰＣＲ技術が、犯罪現場で発見された、組織（例えば、毛髪または皮膚）または体液（例えば、血液、唾液または精液）のような非常に少量の生物学的サンプルから取り出されたＤＮＡ配列を増幅するために用いられ得る。次いで、増幅された配列は、標準物と比較され得、これにより、生物学的サンプルの起源の同定が可能になる。
【０１４９】
本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座に標的化される、ポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供するために用いられ得、これは例えば、別の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に特有の別のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡに基づく法医同定の信頼性を増強し得る。上記のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素が生成したフラグメントにより形成されたパターンに対する正確な代替物として同定のために用いられ得る。配列番号１の非コード領域に対して標的された配列は、この非コード領域でより多数の多型性が生じる場合、この用途のために特に適切である。このことは、この技術を用いて個体を区別することを容易にする。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＨＫＩＤ−１配列またはその部分（例えば、少なくとも２０または３０塩基の長さを有する、配列番号１の非コード領域由来のフラグメント）が挙げられる。
【０１５０】
本明細書において記載されるＨＫＩＤ−１配列は、さらにポリヌクレオチド試薬、例えば、標識プローブまたは標識可能プローブ（これは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術において、特定の組織（例えば、脳組織）を同定するために用いられ得る）を提供するために用いられ得る。これは、法医病理学者が不明の起源の組織を提示される場合に非常に有用であり得る。このようなＨＫＩＤ−１プローブのパネルは、種のタイプおよび／または器官の型により組織を同定するために用いられ得る。
【０１５１】
類似の様式で、これらの試薬（例えば、ＨＫＩＤ−１のプライマーまたはプローブ）は、混入物について組織培養物をスクリーニング（すなわち、培養中の異なる型の細胞の混合物の存在についてスクリーニング）するために用いられ得る。
【０１５２】
（Ｃ．予測医学）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノム学および臨床試験モニタリングが予後（予測的）目的のために用いられる予測医学の分野を提供し、それにより個体を予防的に処置する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の状況で、ＨＫＩＤ−１タンパク質および／または核酸の発現ならびにＨＫＩＤ−１活性を決定するための診断アッセイに関し、これにより、個体が、異常なＨＫＩＤ−１発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、または障害を発生する危険性があるか否かを決定する。本発明はまた、個体がＨＫＩＤ−１タンパク質、核酸発現または活性に関連する障害を発症する危険性があるか否かを決定するための予後（すなわち予測的）アッセイを提供する。例えば、ＨＫＩＤ−１遺伝子における変異は、生物学的サンプル中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後目的または診断目的のために用いられ得、これによりＨＫＩＤ−１タンパク質、核酸発現または活性により特徴づけられるかまたはこれらに関連する障害の発現の前に個体を予防的に処置する。
【０１５３】
本発明の別の局面は、個体におけるＨＫＩＤ−１タンパク質、核酸発現またはＨＫＩＤ−１活性を決定し、これにより、その個体について適切な治療的薬剤または予防的薬剤を選択するための方法（本明細書において「薬理ゲノム」とよぶ）を提供する。薬理ゲノムは、個体の遺伝子型（例えば、個体が特定の薬剤に応答する能力を決定するために試験された個体の遺伝子型）に基づく個体の治療的処置または予防的処置のための薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０１５４】
本明細書のなお別の局面は、臨床試験におけるＨＫＩＤ−１の発現または活性に対する、薬剤（例えば、薬物または他の化合物）の影響のモニタリングを提供する。
【０１５５】
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０１５６】
（１．診断アッセイ）
生物学的サンプル中におけるＨＫＩＤ−１の存在または非存在を検出するための例示的方法は、試験被験体から生物学的サンプルを入手する工程、およびこの生物学的サンプルを、ＨＫＩＤ−１のタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）（ＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする）を検出し得る化合物または因子と接触させ、これにより生物学的サンプル中でＨＫＩＤ−１の存在が検出される工程を含む。ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための因子は、ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識された核酸プローブであり得る。核酸プローブは、例えば、全長ＨＫＩＤ−１核酸（例えば、配列番号１または３の核酸）またはその部分（例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、そしてＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用に適切な他のプローブが、本明細書に記載される。
【０１５７】
ＨＫＩＤ−１タンパク質を検出するための因子は、ＨＫＩＤ−１タンパク質に結合し得る抗体（好ましくは検出可能標識を有する抗体）であり得る。抗体は、ポリクローナル抗体、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が用いられ得る。プローブまたは抗体に関して、用語「標識された」は、プローブまたは抗体への検出可能な物質の結合（すなわち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識されている別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むことが意図される。間接的標識化の例としては、蛍光的に標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、およびビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識化（これにより、このプローブは蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出され得る）が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および生物学的流体、ならびに被験体中に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボにおいて生物学的サンプル中のＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するために用いられ得る。例えば、ＨＫＩＤ−１のｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＨＫＩＤ−１タンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法が挙げられる。ＨＫＩＤ−１ゲノムＤＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＨＫＩＤ−１タンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識した抗ＨＫＩＤ−１抗体を被験体に導入する工程を含む。例えば、抗体は、被験体における存在および位置が標準的画像化技術により検出され得る放射性マーカーで標識され得る。
【０１５８】
１つの実施形態において、生物学的サンプルは、試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、この生物学的サンプルは、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。生物学的サンプルは、被験体から従来の手段により単離された末梢血白血球サンプルである。
【０１５９】
別の実施形態において、この方法はさらに、以下の工程を包含する：コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、このコントロールサンプルを、ＨＫＩＤ−１のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、その結果、ＨＫＩＤ−１のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在がこの生物学的サンプルにおいて検出される工程、およびこのコントロールサンプル中のＨＫＩＤ−１のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中のＨＫＩＤ−１のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在と比較する工程。
【０１６０】
本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中のＨＫＩＤ−１の存在を検出するためのキットを包含する。このようなキットを使用して、被験体がＨＫＩＤ−１の異常な発現と関連する障害（例えば、免疫学的障害）を罹患しているか、またはこのような障害を発症する危険性が増加しているか否かを検出し得る。例えば、このキットは、生物学的サンプル中のＨＫＩＤ−１のタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識された化合物または薬剤、およびこのサンプル中のＨＫＩＤ−１の量を決定するための手段（例えば、抗ＨＫＩＤ−１抗体、またはＨＫＩＤ−１をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１または配列番号３）に結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を備え得る。キットはまた、試験される被験体が、ＨＫＩＤ−１のタンパク質またはｍＲＮＡの量が正常レベルより高いかまたはそれ未満の場合に、ＨＫＩＤ−１の異常な発現と関連する障害に罹患しているか、またはそのような障害を発症する危険性にあるかを観察するための指示書を備え得る。
【０１６１】
抗体ベースのキットについて、このキットは、例えば、以下を備える：（１）ＨＫＩＤ−１タンパク質に結合する第１抗体（例えば、固体支持体に付着されている）；および必要に応じて、（２）ＨＫＩＤ−１タンパク質または第１抗体に結合し、かつ検出可能な薬剤に結合体化されている、第２の異なる抗体。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドベースのキットについて、このキットは、例えば、以下を備え得る：（１）ＨＫＩＤ−１核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）、または（２）ＨＫＩＤ−１核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマー。
【０１６３】
このキットはまた、例えば、緩衝化剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤を備え得る。このキットはまた、検出可能な薬剤を検出するために必要な成分（例えば、酵素または基質）を備え得る。このキットはまた、アッセイされそして含まれる試験サンプルと比較され得るコントロールサンプルまたは一連のコントロールサンプルを備え得る。このキットの各成分は、通常、個別の容器内に包含され、そして様々な容器の全ては、試験される被験体がＨＫＩＤ−１の異常な発現に関連する障害に罹患しているかまたはそのような障害を発症する危険性にあるか否かを観察するための指示書とともに、単一のパッケージ内にある。
【０１６４】
（２．予後アッセイ）
本明細書中に記載される方法はさらに、異常なＨＫＩＤ−１の発現または活性に関連する疾患または障害を有するか、またはそれを発症する危険性のある被験体を同定するための診断アッセイまたは予後アッセイとして利用され得る。例えば、本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイ）は、ＨＫＩＤ−１のタンパク質、核酸発現もしくは活性に関連する障害を有するか、またはそれを発症する危険性にある被験体を同定するために利用され得る。あるいは、予後アッセイは、このような疾患または障害を有するか、またはそれを発症する危険性にある被験体を同定するために利用され得る。従って、本発明は、試験サンプルが被験体から得られ、そしてＨＫＩＤ−１のタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ，ゲノムＤＮＡ）が検出される方法を提供し、ここでＨＫＩＤ−１のタンパク質または核酸の存在は、異常なＨＫＩＤ−１の発現または活性と関連する疾患または障害を有するか、またはそれを発症する危険性にある被験体についての診断である。本明細書中使用される場合、「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られる生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０１６５】
さらに、本明細書中に記載される予後アッセイは、被験体が異常なＨＫＩＤ−１の発現または活性と関連する疾患または障害を処置するために薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補体）を投与され得るか否かを決定するために使用され得る。例えば、このような方法は、被験体が、特定の薬剤または薬剤のクラス（例えば、ＨＫＩＤ−１活性を減少する型の薬剤）を用いて効果的に処置され得るか否かを決定するために使用され得る。従って、本発明は、被験体が、異常なＨＫＩＤ−１の発現または活性と関連する障害について、薬剤を用いて効果的に処置され得るか否かを決定するための方法を提供し、ここで、試験サンプルが得られ、そしてＨＫＩＤ−１のタンパク質または核酸が検出される（例えば，ここで、ＨＫＩＤ−１のタンパク質または核酸の存在は、異常なＨＫＩＤ−１の発現または活性と関連する障害を処置するために薬剤を投与され得る被験体についての診断である）。
【０１６６】
本発明の方法はまた、ＨＫＩＤ−１遺伝子における遺伝子損傷または変異を検出するために使用され得、それにより、損傷した遺伝子を有する被験体が、異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる傷害についての危険性にあるか否かを決定する。実施形態において、この方法は、被験体由来の細胞のサンプルにおいて、ＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする遺伝子の完全性またはＨＫＩＤ−１遺伝子の誤った発現に影響する少なくとも１つの変更によって特徴付けられる遺伝子損傷または変異の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、このような遺伝子損傷または変異は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：１）ＨＫＩＤ−１遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；２）ＨＫＩＤ−１遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；３）ＨＫＩＤ−１遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換；４）ＨＫＩＤ−１遺伝子の染色体再編成；５）ＨＫＩＤ−１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、ＨＫＩＤ−１遺伝子の異常な修飾；７）ＨＫＩＤ−１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＨＫＩＤ−１タンパク質の非野生型レベル；９）ＨＫＩＤ−１遺伝子の対立遺伝子欠損；および１０）ＨＫＩＤ−１タンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書中に記載されるように、ＨＫＩＤ−１遺伝子における損傷を検出するために使用され得る当該分野で公知の多数のアッセイ技術が存在する。生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された、末梢血白血球サンプルである。
【０１６７】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいはリガーゼ（ｌｉｇａｔｉｏｎ）連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照のこと）における、プローブ／プライマーの使用を含む。この後者は、ＨＫＩＤ−１遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（例えば、Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者からサンプル細胞を収集する工程、サンプル細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離する工程、核酸サンプルを、（存在する場合）ＨＫＩＤ−１遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で、ＨＫＩＤ−１遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーに接触させる工程、および増幅産物の存在または非存在を検出する工程、または増幅産物のサイズを検出しそしてコントロールサンプルと長さを比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異の検出に用いられる任意の技術との組合せで、予備増幅工程としての使用が所望され得ることが予測される。
【０１６８】
代替的増幅方法としては、自己持続性配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）または任意の他の核酸増幅方法、それに続く、当業者に周知の技術を使用するその増幅された分子の検出が挙げられる。これらの検出スキームは、核酸分子が、非常に少数で存在する場合に、そのような分子の検出に特に有用である。
【０１６９】
代替の実施形態において、サンプル細胞由来のＨＫＩＤ−１遺伝子における変異は、制限酵素切断様式の変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡを単離し、（必要に応じて）増幅し、１種類以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてゲル電気泳動によってフラグメント長サイズが決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の違いは、サンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）の使用を用いて、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特定の変異の存在についてスコアリングし得る。
【０１７０】
他の実施形態において、ＨＫＩＤ−１における遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイ（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３〜７５９）にハイブリダイズさせることよって同定され得る。例えば、ＨＫＩＤ−１における遺伝的変異は、Ｃｒｏｉｎら（前出）に記載されるように、発光ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。簡単にいうと、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプル中およびコントロール中の長いＤＮＡ鎖を通じて走査し、配列が重複するプローブの直線アレイを作製することによって配列間の塩基変換を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に引き続き、検出される全ての改変体または変異体と相補的な、より小さく、特化したプローブアレイを使用して、特定の変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイを行う。各変異アレイは、平行プローブセット（一方は、野生型遺伝子に相補的であり、他方は、変異体遺伝子に相補的である）からなる。
【０１７１】
なお別の実施形態において、当該分野に公知の任意の種々の配列決定反応を用いて、ＨＫＩＤ−１遺伝子を直接的に配列決定し、そしてサンプルＨＫＩＤ−１の配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３）によって開発された技術に基づく配列決定反応が挙げられる。任意の種々の自動配列決定手順が、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ子会番号ＷＯ ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７〜１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７〜１５９を参照のこと）を含む、診断のアッセイ（（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：４４８）を行う場合に利用され得ることがまた、意図される。
【０１７２】
ＨＫＩＤ−１遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）が挙げられる。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、組織サンプル由来の潜在的な変異ＲＮＡまたは変異ＤＮＡと、野生型ＨＫＩＤ−１配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖の提供を必要とする。この２本鎖二重鎖を、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二重鎖の１本鎖領域を切断する薬剤で処理する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理することで、ミスマッチ領域が消化され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域が消化され得る。他の実施態様において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかが、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムとピペリジンとを用いて処理され得る。ミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を、変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズによって分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施態様において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０１７３】
なお別の実施態様において、このミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルから得られたＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするための規定されたシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる、「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら、（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＨＫＩＤ−１配列（例えば、野生型ＨＫＩＤ−１配列）に基づくプローブを、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、そして、存在する場合に、この切断産物を電気泳動プロトコルなどから検出し得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０１７４】
他の実施形態において、電気泳動移動度における変化を使用して、ＨＫＩＤ−１遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖配座多型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度における差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６；またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＨＫＩＤ−１核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変動し、そして電気泳動移動度において生じた変化は、単一の塩基変化さえ検出することが可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識したプローブを用いて検出され得る。このアッセイの感度は、（ＤＮＡよりむしろ）ＲＮＡを使用することによって増強され得、ここで、その二次構造が、配列における変化に対してより感受性である。実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動移動度における変化に基づいて二本鎖へテロ二重鎖分子を分離する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｓ．７：５）。
【０１７５】
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型のフラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）を使用してアッセイされる。ＤＧＧＥが分析方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって高融点のＧＣリッチなＤＮＡの約４０ｐのＧＣクランプを付加することによって、ＤＮＡが完全には変性しないことを確証するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配を、変性勾配の代わりに用いて、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
【０１７６】
点変異を検出するための他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中央に配置されて調製され得、次いで完全な一致が見出される場合のみにハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズメンブランに付着され、そして標識化標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡ、または多数の異なる変異にハイブリダイズされる。
【０１７７】
あるいは、対立遺伝子特異的増幅技術（これは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する）は、本発明と共に用いられ得る。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、分子の中央において目的の変異を保有し得る（その結果、増幅は、示差的ハイブリダイゼーション（Ｇｉｂｂｓら、（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を防止もしくは減少させ得る、１つのプライマーの一番端の３’末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）に依存する）。さらに、変異の領域に新規の制限部位を導入して、切断に基づく検出を生じることが望ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて行われ得ることが予測され得る（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９）。このような場合において、連結は、５’側配列の３’末端に完全一致が存在する場合にのみ生じ、特定の部位での既知の変異の存在を、増幅の存在または非存在を探すことによって検出可能にする。
【０１７８】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予めパッケージ化された診断キットを利用することによって、行われ得る。このキットは、例えば、臨床的設定において、ＨＫＩＤ−１遺伝子に関する疾患もしくは疾病の症状または家族歴を示す患者を診断するために、都合良く使用され得る。
【０１７９】
さらに、ＨＫＩＤ−１が発現される任意の細胞型または組織、好ましくは末梢血白血球は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。
【０１８０】
（３．薬理ゲノム学）
本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるような、ＨＫＩＤ−１活性（例えば、ＨＫＩＤ−１遺伝子発現）に対する刺激または阻害効果を有する試薬もしくはモジュレーターは、個体に投与されて、異常なＨＫＩＤ−１活性と関連する障害（例えば、ＨＫＩＤ−１が発現される細胞および組織（例えば、神経系の細胞）を含む障害）を処置（予防的にまたは治療的に）し得る。このような処置と共に、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と、外来の化合物もしくは薬物に対するその個体の応答との間の関連性の研究）が、考察され得る。治療薬の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関連性を変化させることによって、重篤な毒性または治療的失敗を引き起こし得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考察に基づいて、予防的または治療的な処置のための有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学をさらに用いて、適切な投薬量および治療レジメンを決定し得る。従って、個体における、ＨＫＩＤ−１タンパク質の活性、ＨＫＩＤ−１核酸の発現、またはＨＫＩＤ−１遺伝子の変異量を決定して、それによって個体の治療的または予防的な処置のための適切な薬剤を選択し得る。
【０１８１】
薬理ゲノム学は、罹患した人における変化された薬物分布および異常な作用に起因する、薬物に対する応答における臨床的に有意な遺伝的バリエーションを扱う。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理遺伝的状態は区別され得る。身体に対する薬物作用の様式を変化させる単一の因子として伝達される遺伝状態は、「変化された薬物作用」といわれる。薬物に対する身体作用の様式を変化させる単一の因子として伝達される遺伝状態は、「変化された薬物代謝」といわれる。これらの薬理遺伝的状態は、まれな欠損または多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝酵素病である。この主な臨床的合併症は、酸化薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費の後の溶血である。
【０１８２】
例示的な実施形態として、酵素を代謝する薬物の活性は、薬物作用の効力および持続時間の両方の主な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、ならびにシトクロムＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、何人かの患者が、薬物の標準的かつ安全な用量を得た後に、予想される薬物効果を得ないか、または過度の薬物応答および重篤な毒性を示す理由に関しての説明を提供した。これらの多型は、集団における２つの表現型（高代謝群（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低代謝群（ＰＭ）（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ））で表される。ＰＭの有病率は、種々の集団について異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高度な多型であり、そして、いくつかの変異がＰＭにおいて同定されており、これは、全て機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、それらが、標準的な用量を受ける場合に、過度の薬物応答および副作用を、きわめて頻繁に経験する。代謝産物が、活性な治療用分子である場合、ＰＭは、そのＣＹＰ２Ｄ６型代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるような、治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる、超迅速代謝群（ｕｌｔｒａ−ｒａｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）である。最近、超迅速代謝の分子的な基礎は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであることが確認された。
【０１８３】
従って、個体における、ＨＫＩＤ−１タンパク質の活性、ＨＫＩＤ−１核酸の発現、ＨＫＩＤ−１遺伝子の変異量を決定して、それによって個体の治療的または予防的な処置のための適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理遺伝的研究を用いて、個体の薬物応答性表現型の同定に、薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型決定を適用し得る。この知見により、投薬量または薬物の選択に適用する場合に、有害な反応または治療的失敗を避け得、従って被験体をＨＫＩＤ−１モジュレーター（例えば、本明細書中に記載される例示的スクリーニングアッセイの１つによって同定されるモジュレーター）を用いて処置する場合に、治療的または予防的な効果を増大させ得る。
（４．臨床試験の間の効果のモニタリング）
ＨＫＩＤ−１の発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）をモニターすることは、基本的薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においても適用され得る。例えば、ＨＫＩＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を、増大させるための、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定されるような、薬剤の有効性は、低下したＨＫＩＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、もしくはタンパク質活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定されるような、ＨＫＩＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を、低下させるための薬剤の有効性は、増加したＨＫＩＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、もしくはタンパク質活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＨＫＩＤ−１発現または活性は、そして好ましくは、例えば、細胞増殖障害に関与する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の免疫応答性のマーカーとして用いられ得る。
【０１８４】
例えば、そして限定を意味しないが、ＨＫＩＤ−１活性を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物、または低分子）での処理によって細胞において調節される遺伝子（ＨＫＩＤ−１を含む）が、（例えば、本明細書中に記載されているスクリーニングのアッセイにおいて同定されるように）同定され得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞は、単離され得、そしてＲＮＡが調製され、そしてＨＫＩＤ−１遺伝子、およびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析される。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによって定量され得るか、実施例２において記載されるような多重組織発現アレイにハイブリダイズすることによって、または、あるいは、産生されるタンパク質の量を測定することによって、本明細書中に記載されるような方法の１つによって、またはＨＫＩＤ−１遺伝子もしくは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示す、マーカーとして役立ち得る。従って、この応答状態は、薬剤での個体の処置の前、およびその間の様々な時点で測定され得る。
【０１８５】
実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供する。この方法は、（ｉ）薬剤の投与の前に被験体由来の投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）投与前サンプルにおいて、ＨＫＩＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）被験体由来の１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後のサンプルにおいてＨＫＩＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡの発現もしくは活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与後のサンプルにおけるＨＫＩＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと、投与前サンプルにおけるＨＫＩＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現もしくは活性のレベルを比較する工程；ならびに（ｖｉ）被験体への薬剤の投与を変化させる工程を包含する。例えば、薬剤の増加した投与は、検出されるより高いレベルまで、ＨＫＩＤ−１の発現または活性を増加（すなわち、薬剤の有効性を増加）させることが望まれ得る。あるいは、薬剤の低下した投与は、検出されるより低いレベルまで、ＨＫＩＤ−１の発現または活性を低下（すなわち、薬剤の有効性を低下）させることが望まれ得る。
【０１８６】
（Ｄ．処置の方法）
本発明は、異常なＨＫＩＤ−１発現または活性と関連する障害の危険性のある、またはその障害を有する被験体を処置する予防的および治療的な方法の両方を提供する。
【０１８７】
（１．予防法）
１つの局面において、本発明は、ＨＫＩＤ−１発現、または少なくとも１つのＨＫＩＤ−１活性を調節する薬剤を被験体に投与することによって、異常なＨＫＩＤ−１発現もしくは活性と関連する疾患または状態を、患者において防止する方法を提供する。異常なＨＫＩＤ−１発現もしくは活性によって、引き起こされるか、または異常なＨＫＩＤ−１発現もしくは活性に寄与する疾患の危険性のある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような診断または予防のアッセイのいずれか、もしくは組合せによって同定され得る。予防的薬剤の投与は、ＨＫＩＤ−１異常性の特徴的な症状の徴候の前に行われ得、その結果、疾患または障害は、その進行において予防され得るか、あるいは遅延され得る。ＨＫＩＤ−１異常性の型に依存して、例えば、ＨＫＩＤ−１アゴニストまたはＨＫＩＤ−１アンタゴニストは、被験体を処置するために用いれられ得る。適切な薬剤は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて、決定され得る。
【０１８８】
（２．治療法）
本発明の別の局面は、治療目的のためのＨＫＩＤ−１発現または活性を調節する方法を提供する。本発明の調節方法は、細胞と関連するＨＫＩＤ−１タンパク質活性の１つ以上の活性を調節する薬剤と、細胞とを接触させる工程を包含する。ＨＫＩＤ−１タンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書中に記載される薬剤（例えば、低分子（例えば、ＨＫＩＤ−１のタンパク質キナーゼ活性を調節する低分子）核酸もしくはタンパク質、ＨＫＩＤ−１タンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＨＫＩＤ−１ペプチド模倣物）であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＨＫＩＤ−１タンパク質の１つ以上の生物学的活性を刺激する。このような刺激性薬剤の例としては、ＨＫＩＤ−１の１つ以上の活性（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質キナーゼ活性）を刺激する低分子、活性なＨＫＩＤ−１タンパク質および細胞に導入されたＨＫＩＤ−１タンパク質をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＨＫＩＤ−１タンパク質の１つ以上の生物学的活性を阻害する。このような阻害性薬剤の例としては、１つ以上のＨＫＩＤ−１活性（例えば、ＨＫＩＤ−１タンパク質キナーゼ活性）を阻害する低分子、アンチセンスＨＫＩＤ−１核酸分子および抗ＨＫＩＤ−１抗体が挙げられる。これらの調節方法は、（例えば、この薬剤で細胞を培養することによって）インビトロで、あるいは（例えば、被験体にこの薬剤を投与することによって）インビトロで行われ得る。このように、本発明は、ＨＫＩＤ−１タンパク質または核酸分子の異常な発現もしくは活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。本発明はまた、ＨＫＩＤ−１およびＨＫＩＤ−１タンパク質または核酸分子の活性を調節することによって処置され得る疾患または障害に罹患する個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、ＨＫＩＤ−１発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートするか、もしくはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、低分子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤））、または薬剤の組合せを投与することを包含する。
【０１８９】
ＨＫＩＤ−１活性の刺激は、ＨＫＩＤ−１が異常にダウンレギュレートされる状況、および／または増大したＨＫＩＤ−１活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。逆に、ＨＫＩＤ−１活性の阻害は、ＨＫＩＤ−１活性が異常にアップレギュレートされる状況、および／または低下したＨＫＩＤ−１活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。
【０１９０】
本発明は、限定として解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例示される。本出願の全体を通じて引用される全ての参照、特許および公開特許出願の内容は、本明細書で参考として援用される。
【実施例】
【０１９１】
（実施例１：ＨＫＩＤ−１のヌクレオチド配列の決定）
標準的なクローニングベクターにおいて構築されたｃＤＮＡライブラリーから単離されたヒトＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡを配列決定した。ｃＤＮＡ配列を、コンティグへとアセンブリし、ＨＫＩＤ−１配列を、このコンティグのコンセンサス配列から決定した。コンティグの分析により、新規の３２６アミノ酸タンパク質をコードすると予想される９７８塩基対のオープンリーディングフレームを有する、約２１２６ｋｂのＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡ配列が明らかとなった。非翻訳領域を含む約２１２６のヌクレオチド長であるヒトＨＫＩＤ−１配列（図１Ａ；配列番号１）は、予想されたメチオニン開始コード配列（停止コドンを含む約９８１のヌクレオチド（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１７１〜１１５１；配列番号３のヌクレオチド１〜９８１））を含む。コード配列は、３２６アミノ酸タンパク質（配列番号１）をコードする。
【０１９２】
（実施例２：ヒト組織におけるＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの分布）
ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡ発現を、ナイロンメンブレン上（ヒト多重組織発現（ＭＴＥ）アレイ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）にアレイされたヒトポリＡ＋ＲＮＡに対して、放射性標識されたＨＫＩＤ−１特異的ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせることによって分析した。以下のヒト組織および細胞株由来のポリＡ＋ＲＮＡが、ＭＴＥアレイに存在する：脳の全体、大脳皮質、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、大脳皮質の中心傍回、橋、左小脳、右小脳、脳梁、扁桃、尾状核、海馬、延髄、被殻、黒質、側坐核、視床、下垂体、脊髄、心臓、大動脈、左心房、右心房、左心室、右心室、心室中隔、心尖、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸（ｉｌｏｃｅｃｕｍ）、虫垂、上行結腸、横行結腸、下行結腸、直腸、骨格筋、脾臓、胸腺、末梢血白血球、リンパ節、骨髄、気管、肺、胎盤、膀胱、子宮、前立腺、精巣、卵巣、肝臓、膵臓、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、ＨＬ−６０白血球細胞株、Ｓ３ ＨｅＬａ細胞株、Ｋ−５６２白血球細胞株、ＭＯＬＴ−４白血球細胞株、ラージバーキット（Ｒａｊｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ細胞株、ダウジバーキット（Ｄａｕｄｉ Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ細胞株、ＳＷ４８０結腸直腸腺癌、Ａ５４９肺癌細胞株、胎児脳、胎児心臓、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児脾臓、胎児胸腺、胎児肺。
【０１９３】
発現分析を行うために、ＨＫＩＤ−１ ｃＤＮＡの一部分を、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途目的で、ＰＣＲを用いて合成した。ＨＫＩＤ−１特異的ＤＮＡを、供給業者の指示書に従い、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、３２Ｐ−ｄＣＴＰにより放射能標識した。ＭＴＥアレイフィルターを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で、放射標識したＨＫＩＤ−１特異的ＤＮＡプローブによりプローブし、製造業者の推奨に従い、高ストリンジェントに洗浄した。これらの試験は、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡは、ＭＴＥアレイに含まれる全ての組織において発現されることを明らかにした。次いで、成体組織における高い発現を、胎盤において検出し、次いで、気管、次いで、肺、次いで、末梢血白血球、次いで、心臓の順で検出した。胎児組織において、最も高い発現を、肺において検出し、次いで、心臓、次いで、腎臓、次いで、脾臓の順で検出した。ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの低い発現を、分析した全ての組織において検出した。ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡ発現は、成体黒質および成体下垂体（これらでは、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡレベルは、中程度であった）を除いて、成体および胎児脳の両方において全体で弱いものであった。
【０１９４】
（実施例３：ＨＫＩＤ−１タンパク質の特徴付け）
この実施例において、ヒトＨＫＩＤ−１タンパク質のアミノ酸配列を、タンパク質に存在する公知のモチーフおよび／またはドメインのアミノ酸配列および公知のタンパク質のポリペプチド配列と比較した。ＨＫＩＤ−１中に存在するポリペプチドドメインおよび／またはポリペプチドモチーフを、ＨＫＩＤ−１と有意に類似のアミノ酸を有するタンパク質であると同定した。さらに、ヒトＨＫＩＤ−１タンパク質の分子量を予想した。
【０１９５】
上記のように同定されたヒトＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列（図１；配列番号１）は、３２６アミノ酸タンパク質（図１；配列番号２）をコードする。ＨＫＩＤ−１は、翻訳後改変を含まない約３５．８６ｋＤａと予想されるＭＷを有する。配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列を用い、タンパク質パターンのＰＲＯＳＩＴＥデータベースに問合わせ、そして共通タンパク質ドメインおよびファミリーを認識し得る隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）のライブラリーに問い合わせた。ＰＲＯＳＩＴＥデータベースの検索により、配列番号２のアミノ酸２６０〜２６３から１つのｃＡＭＰ−依存的タンパク質キナーゼリン酸化部位およびｃＧＭＰ−依存的タンパク質キナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００４；配列番号４）；配列番号５；配列番号２のアミノ酸１３７〜１３９、２７５〜２７７、および２７９〜２８１から３つのタンパク質キナーゼＣリン酸化部位（ＰＳ００００５；配列番号６）；配列番号７〜９；配列番号２のアミノ酸２０２〜２０５、２１１〜２１４、および３２１〜３２４から３つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（ＰＳ００００６；配列番号１０）；配列番号１１〜１３；配列番号２のアミノ酸３３〜４０から１つのチロシンキナーゼリン酸化部位（ＰＳ００００７；配列番号１４）；配列番号１５；配列番号２のアミノ酸４３〜４８、４９〜５４、５７〜６２、６３〜６８、８０〜８５、９８〜１０３、および２９５〜３００から７つのＮ−ミリストイル化部位（ＰＳ００００８；配列番号１６）；配列番号１７〜２３；配列番号２のアミノ酸４６〜５４から１つのタンパク質キナーゼＡＴＰ結合領域特性（ＰＳ００１０７；配列番号２４）；配列番号２５；配列番号２のアミノ酸１６６〜１７８から１つのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ活性部位特性（ＰＳ００１０８；配列番号２６）；配列番号２７の存在が明らかになった。ＰＦＡＭ分析は、ＨＫＩＤ−１が、真核生物タンパク質キナーゼドメインを有することを示す。ＨＭＭデータベースの検索により、配列番号２のアミノ酸４０〜２９３から１つの真核生物タンパク質キナーゼドメイン；配列番号２９の存在が、２６２．４のスコアおよび５．９×１０７５のＥ値（図２を参照のこと）で明らかになった。ＰＦＡＭ識別子に関する一般的な情報について、ＰＳ識別記号およびＰＦ識別記号モチーフ同定数は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ ２８：４０５〜４２０およびｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｐｆａｍ／ｐｆａｍ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【０１９６】
配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列を、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスおよびタンパク質ワード長３を有するＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して、タンパク質配列のＰＲＯＴＯＴデータベースをクエリするために使用した。このＢＬＡＳＴＰ分析によって同定された、ＨＫＩＤ−１に対して最も密接に関連する５つのタンパク質を列挙する：ＨＫＩＤ−１は、ラットＫＩＤ−１（ＡＦ０８６６２４；配列番号３７）に対して１６４６のスコアで３２６アミノ酸にわたって９５％同一であり、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（カエル）ＰＩＭ−１（Ｑ９１８２２；配列番号３８）に対して９２２のスコアで７７％同一であり、マウスＰＩＭ−１（Ｐ０６８０３；配列番号３９）に対して８７３のスコアで類似しており、ラットＰＩＭ−１（Ｐ２６７９４；配列番号４０）に対して８８４のスコアで類似しており、そしてヒトＰＩＭ−１（Ｐ１１３０９；配列番号４１）に対して８８３のスコアで類似していることが見出された。
【０１９７】
図４は、ＰＡＭ２５０残基加重表を用いるＪ．Ｈｅｉｎ法を使用してＤＮＡＳＴＡＲ配列分析パッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムで実施された、配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列のアライメントを示し、そしてＢＬＡＳＴＰ分析によって同定された最も近いＨＫＩＤ−１関係物を５つのみ列挙する。表１は、ＨＫＩＤ−１とＢＬＡＳＴＰ分析によって同定されたその最も近い５つの関係物との間の、ポリペプチド配列類似性パーセントおよびポリペプチド配列分岐パーセントの両方ならびにこのＨＫＩＤ−１関係物と各他のものとの間のポリペプチド配列類似性パーセントおよびポリペプチド配列分岐パーセントを示す。配列対の距離を、ＰＡＭ２５０残基加重表を用いるＪ．Ｈｅｉｎ法を使用してＤＮＡＳＴＡＲ配列分析パッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムで実施した。これらの分析は、ＨＫＩＤ−１が、ラットＫＩＤ−１（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５３５−１６５４３）およびカエルＫＩＤ−１の種オルソログであることを示す。なぜなら、ＨＫＩＤ−１は、ＰＩＭ−１タンパク質よりもこれら２つのタンパク質により密接に関連するからである。カエルＰＩＭ−１およびラットＫＩＤ−１が、種オルソログであることは報告された（Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５３５−１６５４３）。ＨＫＩＤ−１は、ヒトＰＩＭ−１、マウスＰＩＭ−１、およびラットＰＩＭ−１のパラログである。ＨＫＩＤ−１は、その種オルソログ（ラットＫＩＤ−１およびカエルＰＩＭ−１）が、これらが由来する種において果たす、いくつかまたは全ての役割をヒトにおいて果たす。
【０１９８】
ラットＫＩＤ−１、カエルＰＩＭ−１、ならびにヒトＰＩＭ−１およびマウスＰＩＭ−１は、インビトロリン酸化アッセイにおいてセリン／トレオニンプロテインキナーゼ活性を有することが全て公知である。ＨＫＩＤ−１とラットＫＩＤ−１、カエルＰＩＭ−１、ならびにヒトＰＩＭ−１、ＨＫＩＤ−１およびマウスＰＩＭ−１、ＨＫＩＤ−１との間の高いポリペプチド配列類似性は、ＨＫＩＤ−１が、セリン／トレオニンプロテインキナーゼであることを示す。
【０１９９】
ラットＫＩＤ−１は、Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９８）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５３５−１６５４３に記載される。ラットＫＩＤ−１は、カイニン酸および電気痙攣ショックに応答して、海馬および皮質の特定の領域において誘導され、このことは、ラットＫＩＤ−１が、神経機能、シナプス形成性、学習および記憶ならびにカイニン酸発作およびいくつかの神経系関連疾患（例えば、発作および癲癇）に関連することを示唆する。ＨＫＩＤ−１がラットＫＩＤ−１の種オルソログであるので、ＨＫＩＤ−１は、ラットＫＩＤ−１が関連するプロセスおよび疾患のいくつかまたは全てに関連する。さらに、ＨＫＩＤ−１パラログ（ＰＩＭ−１タンパク質）は、癌原遺伝子である。従って、ＨＫＩＤ−１が、細胞増殖制御、癌、ならびに関連する経路および疾患に関連することは可能である。
【０２００】
【表１】
Figure 2005504830
（表１）
ＢＬＡＳＴＰ分析において同定されたＨＫＩＤ−１の対距離および最も密接に関連する５つのタンパク質。類似性パーセントを、上向き三角形象限で示し、分岐パーセントを、上向き三角形象限で示す。配列対距離を、ＰＡＭ２５０残基加重表を用いるＪ．Ｈｅｉｎ法を使用してＤＮＡＳＴＡＲ配列分析パッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムで実施した。
【０２０１】
（実施例４：ＨＫＩＤ−１融合タンパク質の調製）
組換えＨＫＩＤ−１を、種々の発現系で産生する。１つの実施形態において、成熟ＨＫＩＤ−１ペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現し、この融合タンパク質を、単離し得、特徴付け得る。ＨＫＩＤ−１を、ＧＳＴに融合し、この融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＰＥＢ１９９において発現する。ＧＳＴ−ＨＫＩＤ−１融合タンパク質のＰＥＢ１９９における発現を、ＩＰＴＧで誘導する。組換え融合タンパク質を、誘導されたＰＥＢ１９９株の粗細菌溶解物から、グルタチオンビーズでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。細菌溶解物から精製したポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を使用して、得られた融合ポリペプチドの分子量を、決定する。
【０２０２】
（実施例５：ＨＫＩＤ−１の染色体位置の同定）
ＨＫＩＤ−１の染色体位置を決定するために、配列番号１のＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴＮプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）をワード長１２で使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクス（ヒトゲノム上にマップされた核酸分子由来のヒトヌクレオチド配列のデータベース）を使用するクエリのために使用した。ＷＩ−１１７９８ヌクレオチド配列は、ＨＫＩＤ−１配列を含むことが見出され、ＷＩ−１１７９８およびＨＫＩＤ−１が同じ染色体位置（第２２染色体の結合群の最初から１９６．７０センチレイ（ｃｅｎｔｉＲａｙ）の、Ｄ２２Ｓ１１６９とＤ２２Ｓ＿ｑｔｅｒマーカーとの間の第２２染色体）にマップされることが確立された。
【０２０３】
（実施例６：大スケール組織特異的ライブラリースクリーニングによるＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの組織分布）
標準的分子生物学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｆｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）を、多くのヒト組織由来の、プラスミドベクター中のｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用した。各ライブラリーからの個々のｃＤＮＡクローンを、単離し、そして配列決定し、これらのヌクレオチド配列を、データベースに入力した。配列番号１のＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴＮプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）をワード長１２で使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用して、組織特異的ライブラリーｃＤＮＡクローンヌクレオチド配列データベースをクエリするために使用した。配列番号１のＨＫＩＤ−１ヌクレオチド配列の部分に同一であるヌクレオチド配列を、ヒトの、皮膚、腎臓、肺、心臓、胸腺、内皮細胞、前立腺、子宮、リンパ節、ニューロン、胎盤、Ｔ細胞、胸部および筋肉に由来するｃＤＮＡライブラリーに見出した。この結果は、ＨＫＩＤ−１ ｍＤＮＡ、またはこれらのフラグメントが、列挙される組織に発現されることを示すが、この組織におけるＨＫＩＤ−１ ｍＤＮＡの発現レベルについてのなんらかの結論を引き出すことは可能ではない。さらに、ＨＫＩＤ−１同一配列が、他の組織由来のライブラリーにおいて検出されなかったという事実は、ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡが、これらの組織において発現されないということを意味しない。ＨＫＩＤ−１核酸配列、このフラグメント、これらの配列によってコードされるタンパク質、およびこのフラグメントならびにＨＫＩＤ−１遺伝子またはタンパク質活性のモジュレーターは、ＨＫＩＤ−１ ｍＤＮＡが発現される組織に関連する疾患を診断または処置するために有用であり得る。
【０２０４】
（実施例７：ＨＫＩＤ−１ ｍＲＮＡの組織分布）
ＨＫＩＤ−１（すなわち、「２１９０」または「ＭＩＤ２１９０」）を、いくつかの転写プロファイリング（Ｔ×Ｐ）実験によって同定した。正常なヒト卵巣上皮細胞（ＮＯＥ）が数人の患者由来の臨床的腹水サンプルと比較される場合、ＨＫＩＤ−１がＮＯＥに比べて腹水サンプルの２／２において、アップレギュレートされることが見出された。この結果を、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ブランド定量的ＰＣＲキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用して、続いての定量的ＰＣＲ実験によって確認した（表２）。定量的ＰＣＲ反応を、キットの製造業者の指示書に従って実施した。
【０２０５】
【表２】
Figure 2005504830
（表２）
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ブランド定量的ＰＣＲキット、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用した、正常卵巣細胞および卵巣腹水における２１９０発現。定量的ＰＣＲ反応を、キットの製造業者の指示書に従って実施した。
【０２０６】
同様に、形質転換可能細胞株Ｈｓ５７８Ｔに比べて正常なＨｓ５７８Ｂｓｔ乳房細胞株を使用する、乳部モデルプロファイリング実験は、Ｈｓ５７８Ｂｓｔに比べてＨｓ５７８Ｔ株において、ＨＫＩＤ−１の高い発現を示した（表３）。軟寒天中で増殖する場合、ＭＣＦ１０Ａ細胞株はまた、プラスチック上で増殖する場合より高いＨＫＩＤ−１の発現を示した（表３）。
【０２０７】
【表３−１】
Figure 2005504830
【０２０８】
【表３−２】
Figure 2005504830
（表３）
上記、表２に記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターされる、種々の胸部組織および細胞株の発現。
【０２０９】
重要なことに、ＨＫＩＤ−１は、血清添加によって、オンコジーンｃＭｙｃと類似する発現パターンで、ＨＥＹ卵巣細胞株において誘導されることが示された。ＨＫＩＤ−１の発現はまた、ＨＣＴ１１６ ＮＯＣ同期化細胞における時間経過実験において研究された（表４）。
【０２１０】
【表４】
Figure 2005504830
（表４）
Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ（Ｎｏｃ）で同期化された、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞の発現。発現を、上記、表２において記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターした。
【０２１１】
実験はまた、種々の組織および細胞型におけるＨＫＩＤ−１の発現を決定するために実施された（表４〜６を参照のこと）。ＨＫＩＤ−１は、卵巣サンプル、胸部サンプル、肺サンプルおよび少しの結腸腫瘍臨床サンプルにおいて高度に発現されることが示された（下記）。
【０２１２】
【表５】
Figure 2005504830
（表５）
正常な（Ｎ）および腫瘍の（Ｔ）、組織および細胞を含む、種々の組織および細胞株における、２１９０発現。略語一覧：ＩＤＣ（侵襲性腺管癌）；ＩＬＣ（侵襲性小葉癌）；ＳＣＣ（扁平上皮細胞癌）；Ｌｉｖｅｒ Ｍｅｔ（結腸癌肝臓転移）；ＨＭＶＥＣ Ａｒｒ（ヒト微小血管内皮細胞停止性）；ＨＭＶＥＣ Ｐｒｏｌ（ＨＭＶＥＣ増殖性）。発現を、上記、表２に記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターした。
【０２１３】
【表６−１】
Figure 2005504830
【０２１４】
【表６−２】
Figure 2005504830
（表６）
種々の組織および細胞株における２１９０の発現。略語一覧：ＳＭＣ（平滑筋細胞）；ＣＨＦ（うっ血性心不全）；ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）；ＩＢＤ（炎症性腸疾患）；ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞（休止））。発現を、上記、表２に記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターした。
【０２１５】
【表７】
Figure 2005504830
（表７）
種々の組織および細胞株における２１９０発現。発現を、上記、表２に記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターした。
【０２１６】
このデータを、２／２正常卵巣サンプル（低発現）、７／７卵巣腫瘍（中程度から高発現）、３／３正常肺（低発現）、４／４肺腫瘍（中程度の発現）、１／１正常結腸（低発現）２／２結腸腫瘍（高発現）、および２／２結腸から肝臓転移（高発現）にＨＫＩＤ−１を局在化するＩＳＨによって確認した。発現を、上記、表２に記載されるように、定量的ＰＣＲによってモニターした。
【０２１７】
従って、データは、ＨＫＩＤ−１が、卵巣細胞モデル系においてｃＭｙｃと類似して制御されることを示す。さらに、ＨＫＩＤ−１の過剰発現は、多くのヒト臨床腫瘍サンプルにおいて観察される。従って、ＭＩＤ２１９０（ＫＩＤ−１）セリン／トレオニンキナーゼの阻害は、Ｍｙｃ依存性様式で腫瘍細胞増殖の低下を補助し得る。
【０２１８】
（実施例８：ＣＯＳ細胞における組換えＨＫＩＤ−１タンパク質の発現）
ＣＯＳ細胞中でＨＫＩＤ−１遺伝子を発現するために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によるｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクターを使用する。このベクターは、ＳＶ４０複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、ＣＭＶプロモーターおよび続くポリリンカー領域、ならびにＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。全ＨＫＩＤ−１タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントおよびインフレームでこのフラグメントの３’末端に融合されたＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７）またはＦＬＡＧタグを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化し、それによってＣＭＶプロモーターの制御下に組換えタンパク質の発現を配置する。
【０２１９】
プラスミドを構築するために、ＨＫＩＤ−１ ＤＮＡ配列を、２つのプライマーを使用してＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、目的の制限部位および続く開始コドンから開始する約２０ヌクレオチドのＨＫＩＤ−１コード配列を含み；３’末端配列は、他の目的の制限部位に相補的な配列、翻訳終止コドン、ＨＡタグまたはＦＬＡＧタグおよびＨＫＩＤ−１コード配列の最後２０ヌクレオチドを含む。ＰＣＲ増幅フラグメントおよびｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターを、適切な制限酵素で消化し、ベクターを、ＣＩＡＰ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して脱リン酸化する。好ましくは、選択された２つの制限部位は異なり、その結果、ＨＫＩＤ−１遺伝子を正しい方向で挿入する。ライゲーション混合物で、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能なＨＢ１０１株、ＤＨ５α株、ＳＵＲＥ株を使用し得る）を形質転換し、形質転換された培養物を、アンピシリン培地プレート上にプレートし、耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを、形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在について制限分析によって試験する。
【０２２０】
その後、ＣＯＳ細胞を、リン酸カルシウム共沈降法または塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを使用して、ＨＫＩＤ−１−ｐｃＤＮＡ／ＡｍｐプラスミドＤＮＡでトランスフェクトする。宿主細胞をトランスフェクトするための他の適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に見出され得る。２２３４８ポリペプチド、２３５５３ポリペプチド、２５２７８ポリペプチド、または２６２１２ポリペプチドの発現を、放射標識（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから入手可能な３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインが使用され得る）およびＨＡ特異的モノクローナル抗体を使用する免疫沈降（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）によって検出する。簡潔には、細胞を、３５Ｓ−メチオニン（または３５Ｓ−システイン）で８時間標識する。次いで、培養培地を、回収し、細胞を、界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を使用して溶解する。細胞溶解物および培養培地の両方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈殿する。次いで、沈殿されたポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２２１】
あるいは、ＨＫＩＤ−１コード配列を含むＤＮＡを、適切な制限部位を使用してｐＣＤＮＡ／Ａｍｐベクターのポリリンカーに直接クローン化する。得られたプラスミドを、上記される様式でＣＯＳ細胞中にトランスフェクトし、ＨＫＩＤ−１ポリペプチドの発現を、放射標識およびＨＫＩＤ−１特異的モノクローナル抗体を使用する免疫沈降によって検出する。
【０２２２】
本発明は、多くの異なる形態で実施され得、そして本明細書中に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、本発明が、当業者に本発明を十分に知らせるために提供される。本発明の多くの改変および他の実施形態は、本発明が関係する、前述の記載に示される教示の利益を有する当業者に思い浮かぶ。特定の用語が使用されるが、これらは、他に示されない限り当該分野での用語として使用される。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１ａ】図１ａは、ヒトＨＫＩＤ−１の配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。配列番号１のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１７１〜ヌクレオチド１２５９（配列番号３）に及ぶ。
【図１ｂ】図１ａは、ヒトＨＫＩＤ−１の配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。配列番号１のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１７１〜ヌクレオチド１２５９（配列番号３）に及ぶ。
【図２】図２は、ＨＫＩＤ−１のアミノ酸配列の一部（配列番号２９；配列番号２のアミノ酸４０〜２９３に対応する）と、隠されたＭａｒｋｏｖモデル（ＰＦ０００６９；配列番号２８）由来の真核生物プロテインキナーゼドメインコンセンサス配列との整列を示す。整列における上側の配列は、ＰＦ０００６９配列であるが、下側の配列は、配列番号２のアミノ酸４０からアミノ酸２９３である。
【図３】図３は、配列番号２のＨＫＩＤ−１アミノ酸配列のＰｒｏｔｅａｎ分析を示す。示されているものは、以下である：Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎアルゴリズムを用いて同定されたα領域、β領域、ターン領域およびコイル領域；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムを用いて同定されたα領域、β領域およびターン領域；Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズムを用いて作成された親水性および疎水性プロット；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇアルゴリズムを用いて同定されたα両親媒性領域およびβ両親媒性領域；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚアルゴリズムを用いて同定された可撓性領域；Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆアルゴリズムを用いて計算された抗原性指数；ならびにＥｍｉｎｉアルゴリズムを用いて計算された表面確率プロット。疎水性プロットについては、相対的疎水性が破線の上に示され、相対的親水性が、破線の下に示される。
【図４】図４は、ＰＡＭ２５０残基重み表とともにＪ．Ｈｅｉｎ法を用いるＤＮＡＳＴＡＲ配列分析パッケージのＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムによって行われた、配列番号２のＨＫＩＤ−１ポリペプチド配列およびラットＫＩＤ−１（ＡＦ０８６６２４；配列番号３７）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（カエル）ＰＩＭ−１（Ｑ９１８２２；配列番号３８）、マウスＰＩＭ−１（Ｐ０６８０３；配列番号３９）、ラットＰＩＭ−１（Ｐ２６７９４；配列番号４０）、およびヒトＰＩＭ−１（Ｐ１１３０９；配列番号４１）のポリペプチド配列整列を示す。

Claims (22)

  1. 細胞におけるポリペプチドのレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、薬剤が、該ポリペプチドのレベルまたは活性を調節することを可能にする条件下で、該ポリペプチドを発現する細胞を、該薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、方法。
  2. 前記薬剤が、抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞がインビトロにある、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞がインビボにある、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞が、該細胞に関連する増殖性障害を有する被験体由来である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記調節が、癌に関連する障害を有するか、または該障害を有する素因を有する被験体における調節である、請求項１に記載の方法。
  7. 細胞におけるポリペプチドのレベルまたは活性を調節するための方法であって、該方法は、薬剤が、該ポリペプチドのレベルまたは活性を調節することを可能にする条件下で、該ポリペプチドを発現する細胞を、該薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、以下：
    （ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで該配列改変体は、キナーゼ活性を有し、そして配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、ポリペプチド；
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで該配列改変体は、キナーゼ活性を有し、そして配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、ポリペプチド；および
    （ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の配列改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで該配列改変体は、キナーゼ活性を有し、そして配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、ポリペプチド、
    からなる群より選択される、方法。
  8. 前記薬剤が、抗体である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記細胞がインビトロにある、請求項７に記載の方法。
  10. 前記細胞がインビボにある、請求項７に記載の方法。
  11. 前記細胞が、該細胞に関連する増殖性障害を有する被験体由来である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記調節が、癌に関連する障害を有するか、または該障害を有する素因を有する被験体における調節である、請求項７に記載の方法。
  13. 細胞における核酸分子のレベルを調節するための方法であって、該方法は、薬剤が、該核酸分子のレベルを調節することを可能にする条件下で、該核酸分子を含む細胞を、該薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、該核酸分子は、以下：
    （ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列；
    （ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、方法。
  14. 前記細胞がインビトロである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記細胞がインビボである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記細胞が、該細胞に関連する増殖性障害を有する被験体由来である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記調節が、癌に関連する障害を有するか、または該障害を有する素因を有する被験体における、請求項１３に記載の方法。
  18. 細胞における核酸分子のレベルを調節するための方法であって、該方法は、薬剤が、該核酸分子のレベルを調節することを可能にする条件下で、該核酸分子を含む細胞を、該薬剤と接触させる工程を包含し、ここで、該核酸分子は、以下：
    （ａ）キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；
    （ｂ）キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；および
    （ｃ）キナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、該ヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約９８％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、方法。
  19. 前記細胞がインビトロである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記細胞がインビボである、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記細胞が、該細胞に関連する増殖性障害を有する被験体由来である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記調節が、癌に関連する障害を有するか、または該障害を有する素因を有する被験体における調節である、請求項１９に記載の方法。
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