JP2001504349A - レセプターチロシンキナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本明細書は、キナーゼ類をコードする特定の遺伝子に対応する、単離された、精製された、または濃縮された核酸分子、およびそのような遺伝子のフラグメント、ならびにそのような核酸によりコードされるポリペプチド、およびこれらのポリペプチドに特異的な抗体を記載する。また、これらのキナーゼの全長コード配列を単離するために、これらの遺伝子の発現パターンおよびレベルを決定するために、またはキナーゼの１つの活性を調節する薬剤をスクリーニングするために、およびキナーゼの１つに関連する疾患を診断または治療するために、そのような核酸分子、ポリペプチド、または抗体を使用する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプターチロシンキナーゼ遺伝子発明の分野 本発明は、新規な関連したチロシンキナーゼに関する。特に、本発明は、ヒト および齧歯類のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、対応する相補的なＤＮＡ(ｃ ＤＮＡ)配列、およびコードされるポリペプチドを含む。発明の背景 発明の背景の以下の記述は、読者の理解を助けるためにのみ提供される。与え られる情報または引用される参考文献のいずれも、本発明に対する先行技術であ ると認めるものではない。 細胞シグナル伝達は、多様な細胞過程を調節する外部刺激が細胞内部へ中継さ れる基本的機構である。シグナル伝達の生化学的機構の鍵となるものの一つは蛋 白質の可逆的リン酸化を含み、これは成熟蛋白質の構造および機能を変化させる ことにより成熟蛋白質の活性の制御を可能とする。（総説として、Ｐｏｓａｄａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３：５８３−３９２（１ ９９２）およびＨａｒｄｉｅ，Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．４４：２ ４１−２５５（１９９０）を参照されたい。）真核生物において最もよく特徴づ けされている蛋白質キナーゼは、セリン、トレオニンおよびチロシン残基のアル コール部分で蛋白質をリン酸化する。これらのキナーゼは、おおまかに２つの群 に分けられる。すなわち、セリンおよびトレオニンのリン酸化に特異的なキナー ゼ、およびチロシンのリン酸化に特異的なキナーゼである。チロシンキナーゼは さらにレセプター蛋白質および非レセプター蛋白質に分けられる。 蛋白質キナーゼは、真核生物蛋白質の最も大きいファミリーの１つであり、数 百のメンバーが知られている。これらの蛋白質の一次ペプチド配列のアライメン トは、これらが共通触媒コア構造を含む１２個の別々のサブドメイン（Ｉ−ＸＩ Ｉ）に分けることができる２５０−３００アミノ酸ドメインを共有していること を示す。これらの保存蛋白質モチーフは、最近ＰＣＲに基づくクローニング戦略 を用いて開発され、既知のキナーゼを著しく拡大させた。蛋白質キナーゼの触媒 ドメイン中の配列の多重アライメント、および続く系統発生学的分析により、こ れらを系統発生樹形に分離することが可能となった。このようにして、関連する キナーゼは別々の枝またはサブファミリーに群化することができる。これには以 下のものが含まれる：チロシンキナーゼ、サイクリックヌクレオチド依存性キナ ーゼ、カルシウム／カルモジュリンキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼおよび ＭＡＰ−キナーゼ、ならびにいくつかの他のあまりよく明確にされていないサブ ファミリー（Ｈａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：５７６ −５９５（１９９５）を参照）。 レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は膜貫通性蛋白質のファミリーに属し ており、多くの細胞シグナリングル経路に関係している。いくつかのＲＴＫの主 な生物学的活性は細胞成長および増殖の刺激であるが、他のＲＴＫは分化の促進 に関与している。場合によっては、単一のチロシンキナーゼが、それが発現され る細胞環境に依存して細胞増殖を阻害または刺激することができる。ＲＴＫは、 少なくとも３つのドメインからなる：細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメ イン、およびチロシン残基をリン酸化しうる少なくとも１つの酵素的ドメインを 含む細胞質ドメイン。膜結合レセプターへのリガンド結合は、レセプターダイマ ーの形成および細胞内キナーゼドメインを活性化するアロステリックな変化を誘 導し、チロシン残基上でのレセプターの自己リン酸化（自動リン酸化および／ま たはトランスリン酸化）を引き起こす。また、ＲＴＫはヘテロダイマーを形成す ることが知られている。レセプターのヘテロダイマー形成についての可能性のあ る役割は、Ｃａｒｒａｗａｙ ａｎｄ Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ ７８：５− ８９（１９９４）に記載されている。 非レセプターチロシンキナーゼは、膜貫通ドメインまたは細胞外ドメインを含 まず、その触媒的キナーゼドメインを共有するのに加えて、非触媒的ドメインも 共有する。このような非触媒的ドメインには、ＳＨ２ドメイン（Ｓｒｃ相同ドメ イン２）およびＳＨ３ドメイン（Ｓｒｃ相同ドメイン３）が含まれる。非触媒的 ドメインはシグナル伝達における蛋白質と蛋白質との相互作用の制御に重要であ ると考えられている。 レセプターチロシンキナーゼは、多くの細胞タイプの増殖、分化および／また は生存において役割を果たすことが知られている。１つの例は、レセプターのＴ ｒｋファミリーである。Ｔｒｋは、神経成長因子（ＮＧＦ）を含むいくつかの既 知の神経栄養因子のためのレセプターである。ＮＧＦのＴｒｋＡへの結合は、レ セプターのリン酸化を誘導し、続いてニューロン発生のモデルであるＰＣ１２ク ロム親和性細胞株の分化を誘導する（Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５２：５５４−５５８（１９９１）；Ｙａｎ，ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２５２：５６１−５６３（１９９１））。Ｔｒｋファミリーの他のメンバー には、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣが含まれ、これらは神経系において種々の構造で 発現され、他の神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子およびニューロトロフ ィン−３の結合に応答する（Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １０９：８４５−８５０（１９９０）；Ｇｌａｓｓ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ６ ６：４０５−４１３（１９９１）；Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ６６： ３９５−４０３（１９９１））。 いくつかのＲＴＫおよび成長因子は、最初、活性化オンコジンとして同定され （Ａａｒｏｎｓｏｎ,Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４:１１４６−１１５３(１９９１); Ｂｉｓｈｏｐ，Ｃｅｌｌ ６４：２３５−２４８（１９９１））、いくつかのＲ ＴＫは癌の発達に関与しているかもしれないと長い間信じられてきた。いくつか の研究はこの概念を支持するようである。これらには、ＲＴＫ過剰発現とある種 のヒト癌との高度の関連、例えば、ＨＥＲ２と乳癌および卵巣癌（Ｓｌａｍｏｎ ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−１８２（１９８７））、Ｐ ＤＧＦおよびそのレセプターと肉腫および神経膠由来新生物の高い割合、および ＥＧＦ−Ｒと扁平上皮癌および神経膠脛（Ａａｒｏｎｓｏｎ，（１９９１）によ り論評されている）の関連が含まれる。 いくつかのＲＴＫは、肺癌細胞の成長および発達と関連づけられてきた。例え ば、ｃ−ｋｉｔ(Ｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎ．Ｏ(ｓｕｐｐ ８ )：１０８−１０９（１９９４）；Ｋｒｙｓｔａｌ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎ．Ｒｅ ｓ．５６（２）；３７０−３７６（１９９６）），ｔｒｋ（Ｏｅｌｍａｎｎ，ｅ ｔ ａｌ，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５５（１０）：２２１２−２２１９（１９９５）） ，Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｔｓａｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５６（５）：１ ０６８ −１０７４（１９９６））およびＥＧＦ−Ｒ（Ｍｏｏｄｙ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １７（３）：５４５−５５５（１９９６））。肺癌特異的ＲＴＫの同定は、ＲＴ Ｋのシグナル伝達活性を阻害し、このことにより癌のＲＴＫ推進性成長を抑制す ることができる特異的薬剤の開発に有利であろう。発明の概要 本発明は、チロシンキナーゼをコードする、ユニークな発現されている哺乳動 物遺伝子の少なくとも一部に各々が対応する複数の核酸分子に関する。特定のキ ナーゼに対応する遺伝子の核酸配列の一部を入手するだけでも、特異的プローブ を提供し、遺伝子を特定の染色体にマッピングすること、遺伝子をその染色体上 の位置にマッピングすること、および、例えば相補的な（ｃＤＮＡ）または相補 的な配列を含むゲノムライブラリからクローンを同定することを可能とする。さ らに、特定の遺伝子に対応する配列を入手することは、その遺伝子の発現パター ンを決定することを可能とし、このことにより関連する組織の生物学に関する価 値ある情報を提供することができる。癌は不適当に制御された細胞増殖であり、 したがってしばしば異常なキナーゼ遺伝子発現を伴うため、分析により、ある疾 患の状態、特に癌を部分的に特徴決定することも可能である。本明細書に開示さ れる遺伝子は、ニューロン組織において高度に発現される関連するレセプターチ ロシンキナーゼの新規な群を規定するようである。これらの新規遺伝子のいくつ かはまた、癌性組織、特に肺癌および卵巣癌において高度に発現される。１つの 遺伝子は正常組織は全く発現されないようであるが、種々の腫瘍タイプにおいて 発現され、このことは、この遺伝子が癌の形成または維持において役割を果たし ているかもしれないことを示唆する。 すなわち、開示される配列の１つの一部、またはこれらの配列の１つの一部に 相補的な、約１３または１７塩基の長さより大きい長さ、好ましくは、２５、５ ０、または１００塩基の長さを有する配列を入手することにより、対応する遺伝 子を唯一のものとして同定することができる。これは、部分核酸配列の配列が対 応する遺伝子の配列の一部に対応し、本質的に同等のものを除く他のすべての遺 伝子に対応しないためである。低いレベルのミスマッチを許容するように、ハイ ブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを調節することができるため、部 分核酸配列の記載される配列が実際のヌクレオチド配列の配列と少ないパーセン テージ、例えば、約３％または１％未満で異なっていてもなお、遺伝子を唯一の ものとして同定することができる。すなわち、記載される配列の１つの一部の配 列を有するプローブは、適当にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件 下で、依然としてそれぞれの対応する遺伝子に唯一のものとしてハイブリダイズ するであろう。 さらに、特異的ＤＮＡプローブを入手することにより、遺伝子のより長いＤＮ Ａ配列、例えばｃＤＮＡの全長配列、全長の成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ Ａ）に対応する全長ｃＤＮＡまたはその有用な部分、またはゲノム遺伝子配列の 全長コピーが提供される。これらのより長い配列は、特異的プローブを用いて日 常的な方法により得ることができるためである。 すなわち、本発明においては、特定のレセプターチロシンキナーゼ遺伝子に対 応する核酸配列が提供される。配列は、以下に詳細に記載するように、配列分析 により、先に同定されているチロシンキナーゼに基づいて、チロシンキナーゼを コードすると同定された。各配列は、その配列が由来する遺伝子にユニークに特 徴的であり、標準的な方法により遺伝子の完全コード配列の単離が提供される。 すなわち、本発明は特に、そのような遺伝子を同定し提供する。そのような遺伝 子は、標準的技術によりベクター中にクローン化することができ、スクリーニン グ、診断または治療方法、ならびに他の用途において用いることができる。一般 に、ＤＮＡは、クローン化遺伝子を有用な様式で発現するように、または所望の 標的核酸の特異的検出を可能とするように特別に設計されたベクター中にクロー ン化する。 特に、第１の観点においては、本発明は、関連したチロシンキナーゼの群の１ つをコードする発現された哺乳動物遺伝子に対応する、少なくとも２５ヌクレオ チドの長さの、精製された、濃縮された、または単離された核酸分子を提供する 。核酸分子はチロシンキナーゼポリペプチドをコードし、その各々は、配列番号 １−９の１つに対応する遺伝子の１つによりコードされるチロシンキナーゼのア ミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列を有する。そのような核酸分子の各々は、 遺伝子の対応する部分または相補的な配列と少なくとも９５％の配列同一性を有 す る。関連する観点においては、精製された、単離された、または濃縮された核酸 分子は、配列番号１−９の１つの一部、またはこれに相補的な配列と少なくとも ９５％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性はより高く、例えば少な くとも９７％または９９％または１００％である。核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ（ ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、およびＲＮＡを含む。核酸は、好 ましくはＤＮＡであり、好ましくは少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有し、 より好ましくは少なくとも２０−３０ヌクレオチドの長さを有し、最も好ましく は少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有する。核酸は、ストリンジェントな条 件下で、配列番号１−９に挙げられる配列、またはこれに相補的な配列を有する ＤＮＡ鎖、または配列番号１−９のいずれかに対応するキナーゼをコードする遺 伝子に特異的にハイブリダイズしうる。上述の観点の好ましい態様においては、 核酸分子はより長く、例えば少なくとも５０、１００、２００、４００またはよ り長いヌクレオチド長さのものである。 核酸分子の配列は、標準的な日常的な配列決定手法を用いて、対応するｃＤＮ Ａの相補鎖の両方を重複配列決定することにより、決定および確認することがで きる。このような重複配列決定は、一方向配列決定により生ずる可能性があり、 本明細書に記載される配列中に存在するかもしれない配列エラーを研究者が排除 することを可能とする。 このような核酸分子は、対応するヒト遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの位 置および発現を決定するためのユニークなプローブとして有用である。したがっ て、このようなプローブ試薬は、ヒト生物学の分析において、および遺伝子、ｍ ＲＮＡ、およびポリペプチド発現産物のマッピングおよび分析を助ける道具とし て、新規治療薬の開発において有用である。このようなプローブは、本明細書に おいて同定される遺伝子の１つの一部の核酸配列またはこれに相補的な配列を含 み、追加の核酸配列および／または標識、または特異的ハイブリダイゼーション を妨害しない他の成分を含んでいてもよい。 さらに、このような核酸分子は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡをコピー、転写 、または逆転写するためのプライマーの起源として有用である。ヒトゲノムＤＮ Ａ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの対応する特定の部位へのこのような核酸分子の ハイ ブリダイゼーションは、慣用的に用いられている条件下で実施することができる （例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）を参照）。 すなわち、一旦当業者が配列番号１−９のいずれかの配列を知ったならば、ま たはこの配列に基づく、対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに 特異的にハイブリダイズするであろうプローブを所有したならば、その者は、ポ リペプチドをコードする対応する全長配列を容易に同定し、得ることができる。 同様に、その者は、特定のｍＲＮＡの全長に対応するｃＤＮＡおよびその配列を 得ることができ、続いてそのｃＤＮＡの多数の部分の任意のものを得ることがで きる。関連する方法により、その者は、ゲノムＤＮＡの探索、クローニング、お よび配列決定を含む適当な方法により、全長遺伝子およびその配列をも得ること ができる。そのような方法は当該技術分野においてよく知られており慣用的に用 いられている。 上述したように、配列番号１−９のいずれかにおける低レベルの配列決定エラ ーの存在（もし存在する場合には）は、これらの方法において困難を生じさせな い。これは、配列番号１−９の配列の１つに基づくプローブまたはプライマーは 、十分にストリンジェントな条件下で、対応するｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、また はｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするであろうし、これを用いてＤＮＡを再 び配列決定してプローブ配列を確認するかまたは記載される配列におけるエラー を発見することができるからである。 上述の配列相関の結果、全長コード配列を含むｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡの全 長に対応するｃＤＮＡを、上述の観点の１つに含まれるより短いユニークなプロ ーブから得ることができる。より長いｃＤＮＡ配列を得るための方法が適切に実 施されれば、そのようなより長い配列が実質上の確実性をもって得られ、完全コ ード配列または全長ｃＤＮＡを含むことを日常的に確認することができる。 したがって、そのようなコード配列および全長ｃＤＮＡは本発明に含まれる。 もちろん、全長コード配列または全長ｃＤＮＡは、その配列を得るための特定の 方法には限定されない。当業者は、種々のアプローチおよび方法の変更もまた、 本質的に同一の最終産物を与えることを知るであろう。すなわち、本発明は、そ れを得るためにどのような方法を用いても、これらのＤＮＡ産物を含む。 上述の観点は、チロシンキナーゼの一部であるポリペプチドをコードするヌク レオチドの配列を各々が含むＤＮＡ分子を含むことに特に注意すべきである。し かし、上述の観点はまた、例えばポリペプチドコード配列の一部のみを含む、よ り短いＤＮＡ分子をも含む。 また、上述の観点の核酸分子は、標準的クローニング方法により得て、ＰＣＲ 等により増幅することができるが、所望の配列が一旦知られたならば、そのよう な分子（特にＤＮＡ鎖）は、日常的な方法により化学的に合成して、特定の配列 を提供することができる。これは約１００ヌクレオチドより短い配列について特 に適当である。一旦合成されれば、そのような核酸分予は、プローブおよびプラ イマーとして通常の方法において用いることができる。 すなわち、上述の観点から、本発明は、全長または部分コード配列またはｃＤ ＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を含みうる核酸分子を提供する。本発明はまた、ヌ クレオチド配列の位置決定、マッピング、同定、増幅、および入手のためのプロ ーブまたはプライマーとして用いることができる核酸分子を提供する。本発明は また、種々の細胞性ｍＲＮＡの全体のまたは個々の合成状態を検出するために、 および疾患に起因する細胞性異常を診断するために用いることができるプローブ およびプライマーを提供する。同様に、本発明はまた、種々の対応する細胞性ｍ ＲＮＡの全体のまたは個々の合成状態を検出するためのプローブまたはプライマ ーとして用いることができる核酸分予、好ましくはＤＮＡ分子を提供する。 ”単離された”との用語の使用は、天然に生ずる物質または生物（例えばＤＮ Ａ配列）がその通常の環境から除去されていることを示す。すなわち、単離され たＤＮＡ配列は、その通常の細胞環境から除去されており、例えば無細胞溶液中 に存在していてもよく、または異なる細胞環境中に置かれていてもよい。分子、 例えばＤＮＡ配列については、この用語は、その分子（配列）が、存在している そのタイプの分子の中の唯一のものであることを意味しない。 目的によっては、生物または分子（例えばヌクレオチド配列）が精製された形 態であることも有益であろう。用語”精製された”とは、絶対的な純度を必要と するものではなく、配列、生物、または分子が天然の環境におけるよりも比較的 純粋であることを示す。すなわち、本発明のＤＮＡは、ヒト全ＤＮＡからまたは ヒト全ＲＮＡから直接得ることはできなかった。本発明のＤＮＡ配列は天然に生 ずるものではなく、部分的に精製された天然に生ずる物質（ゲノムＤＮＡクロー ン）の操作により得られる。染色体ＤＮＡからのゲノムライブラリの構築は、ゲ ノムＤＮＡ挿入物を含むベクターの作成を含み、そのようなベクターを有する純 粋な個々のクローンは、ライブラリを有する細胞のクローン選択によりライブラ リから単離することができる。 本発明の開示の文脈においては、”ヒト遺伝子”とは、ヒト染色体に見いださ れる遺伝的物質の遺伝しうる単位を表すと理解すべきである。各遺伝子は、デオ キシリボヌクレオチドの直鎖からなり、これは鎖を形成するヌクレオチドの配列 により表すことができる。すなわち、”配列”とは、鎖を形成するヌクレオチド の順序づけられたリスト、およびヌクレオチドのその配列を有する鎖それ自身の 両方を示すように用いられる。（”配列”は、ＲＮＡ鎖、すなわちリボヌクレオ チドからなる直鎖を表す場合も同様に用いられる）。遺伝子は、制御および調節 配列、ＲＮＡ分子に転写されることができる配列を含み、機能が未知である配列 を含んでいてもよい。ＲＮＡ産物のいくつか（ＤＮＡからの転写産物）はメッセ ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、これは最初には、ポリペプチドに翻訳され るリボヌクレオチド配列および翻訳されないリボヌクレオチド配列を含む。翻訳 されない配列には、調節配列が含まれ、機能の知られていない配列を含んでいて もよい。多くの哺乳動物遺伝子のコード配列は不連続であり、コード配列である エクソンを、非コード配列であるイントロンと交互に含む。ｍＲＮＡ分子がＤＮ Ａから転写された際には、イントロンがその分子中に存在するが、イントロンは 除去され、エクソンはスプライシングされて一緒に成熟ｍＲＮＡを形成する。す なわち、成熟ｍＲＮＡは翻訳に適したｍＲＮＡであり、イントロンが除去されて おり、通常は他の修飾がなされている。異なる個人の間、または正常細胞と癌化 細胞との間には、遺伝子の同一性を変えることなく、同じ遺伝子についてヌクレ オチド配列のわずかな相違が存在しうることが認識されるべきである。 すなわち、”発現される遺伝子”とは、問題とする細胞または組織において、 その遺伝子が翻訳されてＲＮＡ分子が形成され、成熟ｍＲＮＡが翻訳されてポリ ペプチドが形成されるであろうことを意味する。発現には、核酸の転写および翻 訳が含まれる。どの遺伝子が特定の細胞株または組織で発現されるかは、組織ま たは細胞のタイプ、細胞、組織、または個体の発生の段階、および細胞が正常細 胞であるかまたは例えば癌性細胞にトランスフォームしているか等の因子に依存 する。 互いに”対応する”核酸分子または配列、またはポリペプチドと核酸との間の ”対応”に関連して、対応は転写および／または翻訳、または逆転写の関係によ り示される。上述したように、多くの遺伝子は転写されてｍＲＮＡ分子を形成す ることができる。したがって、遺伝子のＤＮＡ配列とその遺伝子から転写される かまたは転写されるかもしれないｍＲＮＡとの間には対応がある。逆の関係につ いても対応が存在し、メッセンジャーＲＮＡは遺伝子のＤＮＡと対応する。この 対応は遺伝子の全長配列とｍＲＮＡの全長配列との間の関係に限定されず、遺伝 子のＤＮＡ配列の一部とｍＲＮＡのＲＮＡ配列の一部との間にも対応が存在する 。特に、この対応は、通常はポリペプチドに翻訳されないｍＲＮＡの一部と、遺 伝子のＤＮＡ配列のすべてまたは一部との間にも存在することに注意すべきであ る。 同様に、メッセンジャーＲＮＡと、逆転写酵素を用いる逆転写によりｍＲＮＡ から得られるまたは得ることができる一本鎖ＤＮＡとの間に対応が存在する。す ぐ前に述べたように、ＤＮＡのすべてまたは一部とメッセンジャーＲＮＡのすべ てまたは一部との間には対応が存在する。同様に、メッセンジャーＲＮＡのすべ てまたは一部と、逆転写により得られたＤＮＡの配列に相補的な配列を有するＤ ＮＡ鎖のすべてまたは一部との間には対応が存在する。さらに、メッセンジャー ＲＮＡのすべてまたは一部と、逆転写により得られるＤＮＡおよびその相補鎖を 含む二本鎖ＤＮＡのすべてまたは一部との間には対応が存在する。 同様に、遺伝子またはｃＤＮＡのＤＮＡは、またはｍＲＮＡのＲＮＡは、その 遺伝子およびｍＲＮＡおよびｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドと"対応 する"。ｍＲＮＡとポリペプチドとの間のこの対応は、翻訳の関係を通して確立 される。すなわち、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列はポリペプチドのアミノ酸配列 に翻訳される。次に、遺伝子またはｃＤＮＡのＤＮＡとｍＲＮＡとの間の転写ま たは逆転写の関係のため、ＤＮＡとポリペプチドとの間には”対応”がある。こ の ような用語には、参照される核酸に類似するかまたは相同な核酸、ならびに相補 的な核酸が含まれる。 ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の”一部”とは、その一部との用語が表す鎖の配列の連 続したサブセットと同じヌクレオチド配列を有する線状の鎖を意味する。（ポリ ペプチド鎖の一部との用語とアミノ酸配列とは類似の意味を有する。）このよう なサブセットは、一次鎖の配列のすべてを含んでいてもよく、またはより短い配 列のみを含んでいてもよい。サブセットは、一本の鎖中に少なくとも１３−２５ 、５０、または１００塩基を含むであろうが、好ましくは対応するｍＲＮＡから の全長コード配列を含むであろう。 しかし、”同じ”との用語は、全長配列の小さいパーセンテージにしか影響せ ず、かつ配列を実質的に同じに保つ、配列の特定のヌクレオチドの欠失、付加、 または置換、またはこれらの変化の組み合わせを含むことを意味する。好ましく は、この変化のパーセンテージは１０％未満であり、より好ましくは５％未満で あり、さらに好ましくは３％未満であり、最も好ましくは１％未満である。この ような変化は、その配列によりコードされる蛋白質の性質に影響を与えない。し たがって、”同じ”とは、”同一”とは区別される；同一の配列については、ヌ クレオチド配列の相違はあり得ない。”同じ”ということができる配列の例は、 機能においてある程度の類似性を有し、高度の類似性を有するが正確には同一の 配列ではない、異なる種からの相同蛋白質をコードする配列である。 上で用いたように、”相補的な”とは、分子生物学からの通常の意味を有する 。２つのヌクレオチド配列または鎖は、これらが通常の対形成規則にしたがって 塩基対を形成する（ワトソン−クリックまたはフーグスティン）ことを可能とす るような配列を有する場合、相補的である。これは、必ずしも鎖がすべてのヌク レオチドで塩基対形成することを必要としない。１つまたは数個（例えば２５塩 基の直鎖では５塩基まで）のヌクレオチドの欠失、付加または置換、またはその ような変更の組み合わせにより形成されるような、低レベル（例えば１−３％） の塩基ミスマッチを有する２つの配列はなお相補的でありうる。しかし、好まし くは、相補的な配列は正確に相補的であり、これは塩基対形成が鎖中の特定の配 列の各塩基で生じうることを意味する。 別の観点においては、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション 条件下で、配列番号１−９からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこ れに相補的な配列の、その組織からのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションによ り得ることができる、組織中で発現されるポリペプチドをコードする、単離され たまたは精製された核酸分子を提供する。 別の観点においては、本発明は、チロシンキナーゼのすべてのアミノ酸または 少なくとも２５個の連続するアミノ酸をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列に 転写的に連結された、細胞中で機能的な転写開始領域、および細胞中で機能的な 転写終止領域を有する組換え核酸分子を提供する。チロシンキナーゼは、配列番 号１−９のいずれかに対応する遺伝子によりコードされる。 さらに、ＤＮＡ配列を種々のベクターのいずれかの中に挿入することはしばし ば有用である。したがって、本発明の別の観点においては、ベクター中の、上述 の観点のいずれかのＤＮＡが提供される。ベクターは多くの異なる目的のために 選択することができ、これにはベクター挿入物の配列を有するＤＮＡをより多く 製造することが含まれうるが、特に、ベクター挿入物から転写されたｍＲＮＡを ポリペプチド産物に翻訳する手段、すなわち、発現ベクターを含むこともできる 。発現ベクター中に挿入されたＤＮＡは、好ましくは対応する全長ｃＤＮＡのコ ード領域の少なくとも６０％を含み、より好ましくは少なくとも７５％、さらに より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは対応する全長ｃＤＮＡのコー ド配列のすべてを含む。 さらに、ベクターは通常、ベクターを細胞中に挿入することにより用いられる ため、これらの観点はまた、上述の観点の任意のＤＮＡが挿入されたベクターを 含む細胞をも含む。このような細胞中では、ベクターは染色体外（例えば、プラ スミドまたはミニ染色体として）に存在してもよく、またはベクターまたはベク ターの一部が宿主細胞の染色体中にインテグレートされていてもよい。 本明細書においては、”ベクター”とは、その作用物質のＤＮＡ中に取り込む ことによりその中に本発明のＤＮＡを挿入しうる作用物質を表す。すなわち、各 種ベクターの例は、プラスミド、コスミド、およびウイルス（例えばバクテリオ ファージ）でありうる。典型的には、この作用物質は本発明のＤＮＡを宿主細胞 （例えば、細菌、酵母、高等真核生物細胞）に渡すために用いられる。ベクター は、所望の挿入物の大きさ、ならびに意図される用途に基づいて選択することが できる。特定のＤＮＡ配列の保存（例えばｃＤＮＡライブラリ中に）または特定 のＤＮＡ配列の多数のコピーの生成のためには、クローニングベクターが選択さ れるであろう。ＲＮＡの転写または翻訳してコードされるポリペプチドを生成す るためには、発現ベクターが選択されるであろう。細胞をトランスフェクトした 後、挿入ＤＮＡを含むベクタ−ＤＮＡのすべてまたは一部は、宿主細胞染色体中 に取り込まれてもよく、またはベクターは染色体外に維持されてもよい。 別の観点においては、本発明は、単離された、濃縮された、または精製された キナーゼポリペプチドに関し、ここで、チロシンキナーゼは、配列番号１−９（ 図４Ａ−Ｃを参照）のいずれかに対応する遺伝子によりコードされる。ポリペプ チドは、好ましくは、チロシンキナーゼのアミノ酸配列の少なくとも２５個の、 より好ましくは少なくとも５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１０ ０アミノ酸の連続するアミノ酸を含む。最も好ましくは、ポリペプチドは、天然 分子と類似する生物学的活性を有するような、天然のキナーゼのアミノ酸配列の 十分に複製的なアミノ酸配列を含み、これには、天然分子の全長アミノ酸配列を 有するポリペプチドが含まれる。 開示される配列は対応するチロシンキナーゼ遺伝子のそれぞれの全長コード配 列を同定し提供するため、本発明はまた、既知の遺伝コードにしたがってコード されるポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列番号１０−配列番号１８（図７ Ａ−Ｃ）に示されるようなアミノ酸配列を提供する。また、全長コード配列のす べてまたは一部を含む核酸を所有すれば、天然のチロシンキナーゼポリペプチド 上のエピトープを認識する抗体の産生が可能である。 したがって、本発明の別の観点においては、配列番号１０−配列番号１８のチ ロシンキナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体が提供され る。これにはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。 ほとんどの使用については、抗体が精製され単離されていることが有益である。 さらに、細胞培養中で抗体を製造することはしばしば有益である（すなわちモノ クローナル抗体）。したがって、本発明はまた、そのような抗体を産生するハイ ブリドーマを提供する。 さらに、本発明は、本明細書において同定されるキナーゼ遺伝子によりコード されるポリペプチド等のキナーゼポリペプチドに結合する、および／またはその 活性に影響を与える化合物を同定し分析するための試験およびスクリーニング方 法を提供する。 ”含む”とは、”含む”との単語の前にあるすべてのものを含むがこれに限定 されないことを意味する。すなわち、”含む”との用語の使用は、挙げられる要 素が必要または必須であるが、他の要素は任意であり、存在していても存在して いなくてもよいことを示す。”からなる”とは、”からなる”との用語の前にあ るすべてのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。すなわち、”か らなる”との用語は、挙げられる要素が必要または必須であり、かつ他の要素が 存在しないことを示す。”本質的に・・・からなる”との用語は、この用語によ り規定されるすべての要素を含み、挙げられる要素について本明細書において特 定される活性または作用を妨害せず寄与しない他の要素に限定されることを意味 する。すなわち、”本質的に・・・からなる”との用語は、挙げられる要素が必 要または必須であるが、他の要素は任意であり、これらが挙げられる要素の活性 または作用に影響を及ぼすか否かに依存して、存在していても存在していなくて もよいことを示す。本発明の態様に関連して”含む”との用語を使用することは 、特定される要素”からなる”または”本質的に特定される要素からなる”態様 を含み、同様に、”本質的に・・・からなる”は、”からなる”を含むことが理 解されるべきである。 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい態様の詳細な説明および特許 請求の範囲から明らかであろう。図面の簡単な説明 図１は、ヒトＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３（配列番号１１、１４、１８ ）のアミノ酸配列のアライメントおよび比較を示す。 図２は、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの同定および配列を示す 。 図３Ａおよび３Ｂは、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３についての、ヒト正 常組織対腫瘍の発現プロファイル（ノーザンブロット）を示す。 図４は、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３についての、ラット胚における発 現分析（インサイチオ）を提供する。 図５は、ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３についての、成人ラット脳におけ る発現分析（インサイチオ）を提供する。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、６Ｇ、６Ｈ、６１は、以下のＬＭＲ のヌクレオチド配列を提供する；ＬＭＲ１ ｒ（ラット）、ＬＭＲ１ ｈ（ヒト ）、ＬＭＲ１ ｍ（マウス）、ＬＭＲ２ ｒ（ラット）、ＬＭＲ２ ｈ（ヒト） 、ＬＭＲ２ ｍ（マウス）、ＬＭＲ３ ｒ（ラット）、ＬＭＲ３ ｈ（ヒト）、 およびＬＭＲ３ ｍ（マウス）。 図７は、ＬＭＲのアミノ酸配列を提供する；ＬＭＲ１ ｒ（ラット）、ＬＭＲ １ ｈ（ヒト）、ＬＭＲ１ ｍ（マウス）、ＬＭＲ２ ｒ（ラット）、ＬＭＲ２ ｈ（ヒト）、ＬＭＲ２ ｍ（マウス）、ＬＭＲ３ ｒ（ラット）、ＬＭＲ３ ｈ（ヒト）、およびＬＭＲ３ ｍ（マウス）。好ましい態様の説明 本発明は、チロシンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする哺乳動物 核酸、これらの核酸によりコードされるポリペプチド、そのような核酸を含む細 胞、組織および動物、そのようなポリペプチドに対する抗体、そのようなポリペ プチドを用いるアッセイ、および以上のすべてに関連する方法に関する。 Ｉ． クローニング、プロービングおよび配列決定 一般に、上述したように、本発明の核酸は、シグナル伝達経路の成分を特徴づ ける配列を有する哺乳動物チロシンキナーゼ類をコードする。このような核酸配 列は、多くの異なる方法により、例えば公共データベースからの配列決定されて いるが同定されていないＤＮＡまたはＲＮＡまたはポリペプチド配列を分析する ことにより、またはＤＮＡライブラリ（例えばｃＤＮＡおよびゲノムライブラリ ）を、そのようなキナーゼの種々のファミリーおよびサブファミリーで保存され ている配列に対する縮重プローブを用いて探索することにより、または種々のフ ァミリーおよびサブファミリーの保存配列に対する縮重プライマーを用いるＰＣ Ｒに基づくクローニングにより、同定することができる。探索またはＰＣＲに基 づくアプローチのためには、プローブまたはプライマーに対応する配列を有する １ つまたはそれ以上のクローンが一旦同定されたならば、そのクローン中のゲノム またはｃＤＮＡ挿入物を日常的な方法により少なくとも部分的に配列決定して、 クローン配列が実際にチロシンキナーゼに対応していることを確認し、全長遺伝 子を同定するユニーク配列を提供することができる。そのようなユニーク配列を 所有すれば、日常的な技術により、全長遺伝子配列が得られる。例えば、適当な プローブ配列を選択し、合成することができる。プローブを用いて、ストリンジ ェントなハイブリダイゼーション条件下でｃＤＮＡまたはゲノムライブラリを探 索し、完全な対応オープンリーディングフレームを含む配列を含むクローン（単 数または複数）を同定することができる。 同様に、異なる哺乳動物種からの特定の相同なチロシンキナーゼ配列に基づく プローブ配列を用いて、その遺伝子の対応ヒト遺伝子を検出することができる。 例えば、以下の実施例の節に記載されるように、ラット遺伝子に相補的なプロー ブを用いて、相同のヒトキナーゼ配列を同定した。このプローブは、十分にスト リンジェントな条件下で、ＬＭＲ１として同定されたクローンの相同５’配列に ハイブリダイズすることができた。 同定された遺伝子のヒト、ラット、およびマウス同族体の、示された配列相同 性は、本発明が日常的な方法により他の哺乳動物同族体をも提供するものである ことを示す。例えば、本明細書に記載される遺伝子に基づいて、好ましくは高い 配列保存性を有する領域から、プローブ配列を得ることができる。そのようなプ ローブを用いて、そして必要ならば更なる縮重プローブを用いて、他の哺乳動物 種の対応する遺伝子を容易に得ることができる。ウシからの相同な遺伝子が得ら れている。 ＩＩ． 遺伝子同定 上述したように、本発明のチロシンキナーゼをコードする遺伝子は、そのよう な酵素の特定のクラスに特徴的なヌクレオチド配列を有するものとして、または 先に同定された１つまたはそれ以上の他の哺乳動物種からの相同遺伝子に対応す る配列を有するものとして最初に同定された。すなわち、本発明の遺伝予および 対応する発現産物は、これまでに知られている遺伝子または蛋白質との配列相関 により、チロシンキナーゼとして区別され特徴づけられる。そのような配列比較 は、容易に入手可能なコンピュータ配列分析プログラムを用いて日常的に実施す ることができる。そのような分析は、部分配列が遺伝子および遺伝子産物を特性 決定し分類するのに十分な情報を提供するであろうため、一般には酵素について の全長ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を必要としない。 したがって、本明細書に記載される同定方法は、新規キナーゼ遺伝子を、例え ばｃＤＮＡライブラリ中のクローン化されたヌクレオチド配列から、ならびに配 列決定されたが機能的には同定されていない遺伝子配列の配列データベース情報 から区別することを可能とする。 ＩＩＩ． プローブおよびプライマーの構築 本発明の核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション方法により適当な染 色体またはｃＤＮＡライブラリを探索して、本発明の別の核酸分子を得るために 用いることができる。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリは、当該技術分野 において認識されている方法にしたがって、適当な細胞から調製することができ る（例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉ ｓ編集，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １ ９８９を参照）。 別法においては、目的とするポリペプチのアミノ酸配列のＮ−末端およびＣ− 末端部分に対応するヌクレオチド配列を有する核酸プローブを得るために化学合 成を実施する。すなわち、合成された核酸プローブをプライマーとして用いて、 認識されているＰＣＲ技術にしたがって、本質的にＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ，”Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ”，Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１ ９９０にしたがって、適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリを用いてポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、本発明のフラグメントを得ることができる。 当業者は、本明細書に開示される配列に基づいて、当該技術分野において知ら れるコンピュータアライメントおよび配列分析の方法を用いて、そのようなプロ ーブを容易に設計することができる（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ編集，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９を参照）。本発明のハイブリダイゼー ションプローブは、標準的な標識技術、例えば放射性標識、酵素標識、蛍光標識 、ビオチン−アビジン標識、化学発光等を用いて標識することができる。ハイブ リダイゼーションの後、既知の方法を用いてプローブを可視化することができる 。 本発明の核酸プローブは、ＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含み、このような プローブは当該技術分野において知られる技術を用いて生成することができる。 核酸プローブは、固体支持体上に固定化することができる。そのような固体支持 体の例には、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロースおよびセファロー ス等の複合炭水化物およびポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ等のアク リル樹脂が含まれるが、これらに限定されない。核酸プローブをこのような固体 支持体にカップリングさせる技術は、当該技術分野においてよく知られている。 本発明の核酸探索方法に適した試験試料としては、例えば、細胞または細胞の 核酸抽出物、または生物学的液体が含まれる。上述の方法において用いられる試 料は、アッセイフォーマット、検出方法、およびアッセイすべき組織、細胞また は抽出物の性質により様々であろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は、当該 技術分野においてよく知られており、用いられる方法に適合した試料を得るため に容易に適用することができる。 ＩＶ． 開示されるキナーゼ遺伝子を検出するためのプローブに基づく方法およ びキット 試料中における開示される遺伝子の１つの存在を検出する１つの方法は、次の 工程を含む： （ａ）ハイブリダイゼーションが生ずるような条件下で、試料を 上述の核酸プローブと接触させ、そして（ｂ）核酸分子に結合したプローブの存 在を検出する。当業者は、上述したように、当該技術分野において知られる技術 にしたがって核酸プローブを選択することができる。試験すべき試料には、ヒト 組織のＲＮＡ試料が含まれるが、これに限定されない。 試料中における開示される遺伝子の１つの存在を検出するためのキットは、上 述の核酸プローブを含む少なくとも１つの容器手段を含む。キットはさらに、以 下のものの１つまたはそれ以上を含む他の容器を含んでいてもよい：洗浄剤およ び結合した核酸プローブの存在を検出しうる試薬。検出試薬の例としては、放射 性標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホ スファターゼ）、およびアフィニティー標識プローブ（ビオチン、アビジンまた はストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されない。 詳細には、区画化されたキットには、試薬が別々の容器に入れられている任意 のキットが含まれる。そのような容器には、小さいガラス容器、プラスチック容 器またはプラスチックもしくは紙のストリップが含まれる。そのような容器は、 試料および試薬が相互夾雑しないように、かつ各容器の薬剤または溶液を定量的 様式で１つの区画から他の区画に加えられるように、試薬を１つの区画から他の 区画に効率的に移すことを可能とする。このような容器には、試験試料を受け取 る容器、アッセイにおいて用いられるプローブまたはプライマーを含む容器、洗 浄試薬（リン酸緩衝食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液等）を含む容器、およびハイブリダ イズしたプローブ、結合した抗体、増幅された産物等を検出するために用いられ る試薬を含む容器が含まれるであろう。当業者は、本発明において記載される核 酸プローブを、当該技術分野においてよく知られている確立されたキットフォー マットの１つに容易に取り込ませることができることを容易に認識するであろう 。 Ｖ． 全長遺伝子配列の取得 当業者によく知られる方法および本発明において同定される配列の一部を用い ることにより、全長遺伝子配列を容易に得ることができる。そのような全長配列 は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列またはゲノム配列でありうる。 プローブは、通常の考慮にしたがって、長いＤＮＡ挿入物を含有するクローン を特異的に検出するように選択することができる。好ましくは、コード配列の５ ’または３’末端でまたはその近くで配列に結合する少なくとも１つのプローブ を得る。ｃＤＮＡライブラリ中のｃＤＮＡクローンの場合、ライブラリベクター は、挿入物に隣接するベクター配列をＰＣＲプライマーとして用いて、慣用方法 による挿入物の直接増幅および便利な配列決定を可能とすることができるように 選択することができる。この工程は、しばしば全長コード配列を与えるであろう が、場合により、２つまたはそれ以上の重複するクローンを用いて全長コード配 列を構築することが必要であろう。 同様に、ゲノムライブラリを用いて全長ゲノム配列を得ることができる。しか し、この場合、ほとんどのヒト遺伝子に存在するイントロンにより付加される長 さのため、重複するクローン化配列に基づいて全長配列を構築することがしばし ば必要であろう。 ＶＩ． 発現パターン 多くのヒト遺伝子は、異なる組織中で異なるレベルで発現される。場合によっ ては、遺伝子はある細胞または組織では全く発現されず、他では高ベルで発現さ れる。すなわち、種々の組織起源からの種々の異なるヒト細胞株、ならびにいく つかの異なる正常ヒト組織を、本発明において同定されたチロシンキナーゼ遺伝 子の発現レベルについて分析した。一般に、遺伝子の発現レベルは、特異的ハイ ブリダイゼーション条件下で標識されたプローブを用いるハイブリダイゼーショ ンに基づいて、細胞中に存在する対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の 量を測定することにより判定された。 このような分析の結果は、以下の実施例の部において議論される。これらの発 現レベルは、このような特定の酵素の機能についての理解にしたがって、開示さ れるチロシンキナーゼの１つの活性レベルの調節により影響されうる疾患および 病状のタイプを示唆する。以下に議論されるように、本発明のチロシンキナーゼ の３つは、ニューロン起源の組織においてある程度のレベルで発現される。その １つであるＬＭＲ２は、正常組織では発現されないが、種々の癌組織において発 現される。ＬＭＲ２はまた肺および卵巣腫瘍試料において高度に発現され、この ことはこのＲＴＫがこれらの癌の増殖において役割を果たしているかもしれない ことを示唆する。 ＶＩＩ． 核酸配列変種 本発明の範囲に含まれるものは、本明細書に記載される単離された核酸分子の 機能的等価物である。遺伝コードの縮重は、あるコドンを、同じアミノ酸を規定 し、したがって、同じ蛋白質を生ずる他のコドンで置換することを許容する。既 知のアミノ酸はメチオニンとトリプトファンを除いて２以上のコドンでコードす ることができるため、核酸配列は実質的に多様でありうる。すなわち、開示され る遺伝子のいずれかの一部または全部を合成して、配列番号１−９のいずれかに 示されるものとは著しく異なった核酸配列を得ることができる。しかし、コード されるアミノ酸配列は保存されるであろう。 さらに、核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドを、示される核酸配列ま たはその誘導体の１つの５’−末端および／または３’−末端で付加、欠失、ま たは置換することにより生ずるヌクレオチド配列を含むことができる。このよう に、任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いることができるが、ただ し、その付加、欠失または置換は、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペ プチドのアミノ酸配列を変更しない。例えば、本発明は、本発明の核酸配列また はその誘導体の５’−末端にＡＴＧを開始コドンとして付加することにより得ら れる、または開示されるヌクレオチド配列またはその誘導体の３’−末端にＴＴ Ａ、ＴＡＧまたはＴＧＡを終止コドンとして付加することにより得られるすべて の核酸配列を含むことを意図する。さらに、本発明の核酸分子は、必要に応じて 、その５’−末端および／または３’−末端に制限エンドヌクレアーゼ認識部位 を有していてもよい。 所定の核酸配列のこのような機能的変更は、これに融合された外来核酸配列に よりコードされる異種蛋白質の分泌および／またはプロセシングを促進する機会 を与える。したがって、開示される遺伝子のヌクレオチド配列およびそのフラグ メントの、遺伝コードにより許容されるすべての変種は本願発明に含有される。 さらに、コドンを削除するかまたは１つまたはそれ以上のコドンを縮重コドン 以外のコドンで置換して、構造的に改変されているが非改変核酸分子により生成 されるポリペプチドと実質的に同じ用途または活性を有するポリペプチドを生成 することが可能である。当該技術分野において認識されているように、２つのポ リペプチドは機能的に等価であり、核酸分子の間の相違が遺伝コードの縮重と関 係していなくても、その生成を引き起こす２つの核酸分子も機能的に等価である 。 ＶＩＩＩ． 核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含有する細胞 本発明はまた、宿主細胞において転写を開始するのに有効なプロモーターおよ び上述の核酸分子を５’から３’方向に含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに 、本発明は、ベクターおよび上述の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。 本発明はまた、細胞において機能的な転写領域、上述のポリペプチドに対応する ア ミノ酸配列をコードするｍＲＮＡ配列に相補的な配列、および前記細胞において 機能的な転写終止領域を含む核酸分子に関する。上述の分子は、単離されたおよ び／または精製されたＤＮＡ分子でありうる。 本発明はまた、上述の核酸分子を含み、このことによりペプチドを発現しうる 細胞または生物に関する。ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するよう変更さ れている細胞から精製することができる。細胞が、遺伝的操作によって、この細 胞が通常は産生しない蛋白質または通常は低いレベルで産生する蛋白質を産生す るように作成されるとき、細胞は、”所望のポリペプチドを発現するよう変更さ れる”と言われる。当業者は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成配列を真核生物ま たは原核生物細胞内に導入し発現させる方法を容易に適用することができる。 核酸分子、例えばＤＮＡは、転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列 を含有し、かつそのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に ”動作可能なように連結”されている場合、ポリペプチドを”発現しうる”と言 われる。動作可能な連結とは、制御ＤＮＡ配列および発現が求められるＤＮＡ配 列が、遺伝子配列の発現を許容するように接続されている連結である。遺伝子配 列の発現に必要な制御領域の詳細な性質は生物によって異なるであろうが、一般 には、プロモーター領域は、原核生物においてはプロモーター（これはＲＮＡ転 写の開始を指示する）ならびにＲＮＡに転写されたときに合成開始を指示するＤ ＮＡ配列を含む。そのような領域は、通常は、転写および翻訳の開始に関与する ５’−非コード配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャピング配列、ＣＡＡＴ配列 等を含む。 所望ならば、開示される遺伝子のいずれかのコード配列の３’側の非コード領 域を上述の方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル 化等の転写終止制御配列を保持することができる。すなわち、開示される遺伝子 の１つをコードするＤＮＡ配列に天然に連続する３’−領域を保持することによ り、転写終止シグナルを与えることができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞 において十分に機能的ではない場合、宿主細胞において機能的な３’領域で置き 換えることができる。 ２つのＤＮＡ配列（例えばプロモーター領域配列およびコード配列）は、２つ のＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異を導入しない、（ ２）プロモーター領域配列が遺伝子配列の転写を指示する能力を妨害しない、ま たは（３）遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写される能力を妨害しな い、である場合、動作可能なように連結されていると言われる。すなわち、プロ モーター領域は、プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写を行うことができる場合 、ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されている。すなわち、開示される遺伝子 の１つを発現させるためには、適当な宿主により認識される転写および翻訳のシ グナルが必要である。 本発明は、開示される遺伝子（またはその機能的誘導体）の１つを原核生物ま たは真核生物細胞のいずれかにおいて発現させることを包含する。原核生物宿主 は一般に、組換え蛋白質の製造に非常に有効かつ便利であり、したがって、開示 される遺伝子の１つについて好ましい発現系の１種である。原核生物は、非常に しばしばＥ．ｃｏｌｉの種々の株で代表される。しかし、他の細菌株を含む他の 微生物株も用いることができる。 原核生物系においては、宿主と適合性のある種に由来する複製部位および制御 配列を含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクタ ーの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等が含まれ；適当なフ ァージまたはバクテリオファージベクターには、ラムダｇｔ１０、ラムダｇｔ１ １等が含まれ、適当なウイルスベクターには、ｐＭＡＭ−ｎｅｏ、ｐＫＲＣ等が 含まれる。好ましくは、本発明の選択されたベクターは、選択された宿主細胞中 において複製する能力を有する。 認められている原核生物宿主には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒ ｒａｔｉａ等の細菌が含まれる。しかし、このような条件下で、ペプチドはグリ コシル化されないであろう。原核生物宿主は発現プラスミド中のレプリコンおよ び調節配列と適合性がなければならない。 開示される遺伝子の１つ（またはその機能的誘導体）を原核生物細胞中で発現 させるためには、コード配列を機能的原核生物プロモーターに動作可能なように 連結する。そのようなプロモーターは、構成的であってもよく、より好ましくは 制御可能である（すなわち、誘導可能または脱抑制可能）。構成的プロモーター の例には、バクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のべ ータ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のク ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴプロモータ ー等が含まれる。誘導可能な原核生物プロモーターの例には、バクテリオファー ジラムダの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、Ｅ．Ｃｏｌｉのｔ ｒｐ、ｒｅｃＡ、ベータｌａｃＺ、ｌａｃＩ，およびｇａｌプロモーター、ベー ターアミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６２：１７６−１８２（１９８５））およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの（−２８ −特異的プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎ ｃｅ ３２：１１−２０（１９８４））、バチラスのバクテリオファージのプロ モーター（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ ｆｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（ １９８２））、および放線菌プロモーター（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８（１９８６））が含まれる。原核 生物プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ．１：２７ ７−２８２（１９８７））；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８ ：５０５−５１６（１９８６））；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４））により論評されている。 原核生物細胞における正しい発現にはまた、遺伝子配列をコードする配列の上 流に、リボソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリボソーム結合部位 は、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．３５：３６５−４０４（１９８１））に開示されている。調節配列、発現ベク ター、形質転換方法等の選択は、遺伝子を発現させるために用いられる宿主細胞 のタイプに依存する。本明細書において用いられてる場合、”細胞”、”細胞株 ”、および”細胞培養物”は、互いに交換可能なように用いられ、すべてのその ような呼称は子孫を含む。すなわち、”形質転換体”または”形質転換された細 胞”との用語は、移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の数に関わらず、初代対象細胞およ びそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的なまたは偶然の変異の ため、 ＤＮＡ含有物が精密に同一ではないかもしれないことが理解されるであろう。し かし、定義されるように、変異体子孫は、最初に形質転換された細胞と同じ機能 性を有する。 本発明の発現系において用いられる宿主細胞は、厳密に限定されるものではな いが、ただし所望のペプチドの発現に適したものである。適当な宿主は、しばし ば、真核生物細胞を含む。好ましい真核生物宿主には、例えば、インビボまたは 組織培養中の、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞が含まれる。宿主として有 用でありうる哺乳動物細胞には、ＨｅＬａ細胞、繊維芽細胞起源の細胞、例えば ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋ１、またはリンパ球起源の細胞およびそれらの誘導体 が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＳＰ２／０およびＪ５５８Ｌ、な らびに神経芽細胞種細胞株、例えばＩＭＲ３３２が含まれ、これらは正しい翻訳 後プロセシングに関してよりよい能力を提供するであろう。 さらに、植物細胞もまた宿主として利用可能であり、植物細胞に適合可能な調 節配列、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、およびノ パリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列が利用可能で ある。別の好ましい宿主は、昆虫細胞、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｌａｒｖ ａｅである。昆虫細胞を宿主として用いる場合、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアルコー ルデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Ｒｕｂｉｎ，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２４０：１４５３−１４５９（１９８８））。あるいは、バキュロウイ ルスベクターを遺伝子操作して、所望の遺伝子の１つを昆虫細胞中で大量に発現 させることができる（Ｊａｓｎｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６５３（１９８ ７）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ （１９８６），Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕ ｍ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２９７）。 酵母をグルコースの豊富な培地中で成長させるときに大量に産生される解糖系 酵素をコードする、活発に発現される遺伝子配列からのプロモーターおよび終止 要素を取り込んだ一連の酵母遺伝子配列発現系のいずれも用いることができる。 既知の解糖系遺伝子配列はまた非常に効率的な転写制御シグナルを提供すること ができる。酵母は、翻訳後ペプチド修飾をも実施することができる点において、 実質的な利点を提供する。強いプロモーター配列および高いコピー数のプラスミ ドを用いる多数の組換えＤＮＡ戦略が存在し、所望の蛋白質を酵母中で発現させ るためにこれらを用いることができる。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝 子配列産物中のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわ ちプレ−ペプチド）を分泌する。哺乳動物宿主については、開示される遺伝子の １つの発現のために、いくつかの可能なベクター系が利用可能である。 宿主の性質に依存して、広範な種類の転写および翻訳制御配列を用いることが できる。転写および翻訳制御シグナルは、アデノウイルス、ウシパピローマウイ ルス、サイトメガロウイルス、サルウイルス等の、ウイルス起源に由来するもの でもよい。この場合、制御シグナルは、高いレベルの発現を有する特定の遺伝子 配列と関連している。あるいは、哺乳動物発現産物、例えばアクチン、コラーゲ ン、ミオシン等からのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナ ルは、遺伝子配列の発現を調節しうるように、抑制または活性化を可能とするよ うに選択することができる。興味あるものは、温度を変化させることにより発現 を抑制または開始させるような温度感受性、または化学的に（代謝物等）制御さ れる制御シグナルである。 開示される遺伝子の１つの真核生物宿主における発現には、真核生物制御領域 の使用が必要である。このような領域は、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指示する のに十分なプロモーター領域を含む。好ましい真核生物プロモーターには、例え ば、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター(Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２）)； ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ ３１：３ ５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター(Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅ ｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０（１９８１ ）)；酵母ｇａｌ４遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７ ５（１９８２）；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））が含まれる。 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドンで開始され る。この理由のため、真核生物プロモーターと、キナーゼ（またはその機能的誘 導体）をコードするＤＮＡ配列との間の結合が、メチオニンをコードしうる介在 コドン（すなわちＡＵＧ）を含まないことを確実にすることが好ましい。そのよ うなコドンの存在は、融合蛋白質（ＡＵＧコドンがコード配列と同じリーディン グフレームにある場合）またはフレームシフト変異（ＡＵＧコドンがコード配列 と同じリーディングフレームにない場合）のいずれかを引き起こす。 核酸分子および動作可能なように連結されたプロモーターは、非複製ＤＮＡ（ またはＲＮＡ）分子として、受容原核生物または真核生物細胞に導入することが でき、これは線状分子であってもよく、または好ましくは閉じた共有環状分子で あってもよい。このような分子は自動複製をすることができないため、遺伝子の 発現は導入された配列の過渡的発現により生ずるであろう。あるいは、導入され たＤＮＡ配列の宿主染色体中へのインテグレーションにより、永久発現が生ずる かもしれない。 所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中にインテグレートしうるベクターを用い ることができる。その染色体中に導入されたＤＮＡを安定にインテグレートして 有する細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１つまたは それ以上のマーカーをも導入することにより、選択することができる。マーカー は、栄養要求性宿主への栄養、抗生物質等の殺生物剤または銅等の重金属に対す る耐性を与えることができる。選択マーカー遺伝子配列は、発現すべきＤＮＡ遺 伝子配列に直接連結してもよく、またはコトランスフェクションにより同じ細胞 に導入してもよい。一本鎖の結合蛋白質ｍＲＮＡの最適な合成にはさらなる要素 が必要であろう。これらの要素には、スプライシングシグナル、ならびに転写プ ロモーター、エンハンサー、および終止シグナルが含まれる。このような要素を 取り込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａ（Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ．Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））により記載されたものが含まれる。 導入された核酸分子は、受容宿主において自動複製可能なプラスミドまたはウ イルスベクター中に取り込むことができる。広範な種類のベクターの任意のもの をこの目的に用いることができる。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを 選択する上で重要な因子には、ベクターを含む受容細胞をベクターを含まない受 容細胞から認識し選択することの容易さ；特定の宿主中において所望されるベク ターのコピー数；およびベクターを異なる種の宿主細胞間で”シャトル”しうる ことが望ましいか否かが含まれる。 好ましい原核生物ベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ中で複製可能なプラスミド等の プラスミドが含まれる（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１，ｐ ＡＣＹＣ１８４、”ＶＸ）。このようなプラスミドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ（例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉ ｓ編集，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９ ８９）を参照）により開示されている。バチラスプラスミドには、ｐＣ１９４、 ｐＣ２２１、ｐＴ１２７等が含まれる。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａ ｎ（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌ ｌｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８２），ｐｐ．３０７−３２ ９）により開示されている。適当な放線菌プラスミドには、ｐ１Ｊ１０１（Ｋｅ ｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１ ８３（１９８７）），およびＣ３１（Ｃｈａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙ ｃｅｔａｌｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｋａｄｅｍｉａｉ Ｋａｉｄｏ，Ｂｕｄａ ｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ（１９８６），ｐｐ．４５−５４）等の放線菌バクテ リオファージが含まれる。シュードモナスプラスミドは、Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ ．（Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））、およ びＩｚａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９ ７８））により論評されている。 好ましい真核生物プラスミドには、例えば、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０、 ２−ミクロン環等、またはこれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは 当該技術分野においてよく知られている（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍ ｉａｍｉ Ｗｎｔｒ．Ｓｙｍｐ．１９：２６５−２７４（１９８２）；Ｂｒｏａ ｃｈ，”Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａ ｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｉｎｈｅ ｒｉｔａｎｃｅ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ｐ．４４５−４７０（１ ９８１）；Ｂｒｏａｃｈ，Ｃｅｌｌ ２８：２０３−２０４（１９８２）；Ｂｏ ｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｔｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１０： ３９−４８(１９８０)；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃ ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐ ｐ．５６３−６０８（１９８０）。 構築物を含有するベクターまたは核酸分子が一旦発現用に調製されたら、種々 の適当な手段のいずれか、例えば形質転換、トランスフェクション、コンジュゲ ーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸 カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等により、ＤＮＡ構築物を適当 な宿主細胞中に導入する。ベクターを導入した後、ベクターを含有する細胞の成 長を選択する選択培地中で受容細胞を成長させる。クローン化遺伝子分子の発現 は、コードされるアミノ酸配列の生成を引き起こす。これは形質転換した細胞に おいてそのまま起こりうるが、これらの細胞を誘導して分化させた後に行うこと もできる（例えば、神経芽細胞種の細胞にブロモデオキシウラシルを投与するこ とによる等）。本発明のペプチドを形成するために、種々のインキュベーション 条件を用いることができる。最も好ましい条件は、生理学的条件を模倣するもの である。 ＩＸ． 精製されたポリペプチド 当該技術分野において知られる種々の方法論を用いて、本発明のペプチドを得 ることができる。ペプチドは、天然にペプチドを産生する組織または細胞から精 製してもよい。あるいは、上述の単離された核酸フラグメントを用いて、キナー ゼ蛋白質を任意の生物中で発現させることができる。本発明の試料には、細胞、 細胞の蛋白質抽出物または膜抽出物、または生物学的液体が含まれる。試料は、 アッセイフォーマット、検出方法および試料として用いられる組織、細胞または 抽出物の性質により様々であろう。 起源生物が天然に本発明のペプチドを含有する限り、任意の真核生物を本発明 のペプチドの起源として用いることができる。本明細書において用いられる場合 、“起源生物”とは、その生物中でサブユニットが発現される生物、および最終 的にその生物から単離される生物にかかわらず、サブユニットのアミノ酸配列が その生物に由来する元の生物を表す。 当業者は、天然の夾雑物を含まずにペプチドを得るために、蛋白質を単離する ための既知の方法に容易にしたがうことができる。これらには、サイズ排除クロ マトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフ ィニティークロマトグラフィーが含まれるが、限定されるものではない。 Ｘ． キナーゼポリペプチドに対して結合親和性を有する抗体および該抗体を含 むハイブリドーマ 本発明は、同定されたチロシンキナーゼポリペプチドの１つに対して結合親和 性を有する抗体に関する。ポリペプチドは、配列番号１０−配列番号１８に示さ れるアミノ酸配列、またはその機能的誘導体、またはその少なくとも９個の連続 するアミノ酸（好ましくは、その少なくとも２０、３０、３５、または４０個の 連続するアミノ酸）を有することができる。 本発明はまた、開示される遺伝子の１つによりコードされるポリペプチドに対 して特異的結合親和性を有する抗体に関する。このような抗体は、特定のコード されるポリペプチドに対する抗体の結合親和性を別のポリペプチドに対するその 結合親和性と比較することにより単離することができる。特定のコードされるポ リペプチドに選択的に結合する抗体を、その特定のポリペプチドと他のポリペプ チドとを区別することを必要とする方法において用いるために選択することがで きる。このような方法は、他のポリペプチドを含有する組織における特定のポリ ペプチドの変化した発現の分析を含みうるが、これに限定されない。 本発明のチロシンキナーゼ蛋白質は、種々の手順および方法、例えば抗体の生 成、医薬組成物の同定における使用、およびＤＮＡ／蛋白質相互作用の研究にお いて用いることができる。 本発明のペプチドを用いて、抗体またはハイブリドーマを製造することができ る。当業者は、抗体が望まれる場合、そのようなペプチドを本明細書に記載され るように生成し、免疫原として用いることができることを認識するであろう。本 発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにこれ らの抗体のフラグメント、およびヒト化形態が含まれる。本発明の抗体のヒト化 形態は、キメラ化またはＣＤＲグラフト等の、当該技術分野において知られる方 法の１つを用いて生成することができる。本発明はまた、上述のモノクローナル 抗体またはその結合フラグメントを産生するハイブリドーマに関する。ハイブリ ドーマは特定のモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である 。 一般に、モノクローナル抗体およびハイブリドーマを調製する技術は当該技術 分野においてよく知られている(Ｃａｍｐｂｅｌｌ、” Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８４）；Ｓｔ ．Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５：１ −２１（１９８０）)。抗体を産生することが知られている任意の動物（マウス 、ウサギ等）を、選択されたポリペプチドで免疫感作することができる。免疫感 作の方法は当該技術分野においてよく知られている。このような方法には、ポリ ペプチドの皮下または腹膜内注射が含まれる。当業者は、免疫感作に用いるポリ ペプチドの量が、免疫感作される動物、ポリペプチドの免疫原性、および注射部 位により様々であることを認識するであろう。 ポリペプチドは、ペプチドの抗原性を増加させるために、修飾するかまたはア ジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増加させる方法 は当該技術分野においてよく知られている。このような方法には、抗原を異種蛋 白質（例えばグロビンまたはβ−ガラクトシダーゼ）とカップリングさせること 、または免疫感作の間にアジュバントを含有させることが含まれる。 モノクローナル抗体については、免疫した動物からの脾臓細胞を除去し、ミエ ローマ細胞、例えばＳＰ２／０−Ａｇｌ４ミエローマ細胞と融合させ、モノクロ ーナル抗体産生ハイブリドーマ細胞となるようにする。当該技術分野においてよ く知られている多くの方法の任意のものを用いて、所望の特性を有する抗体を産 生するハイブリドーマ細胞を同定することができる。これらには、ハイブリドー マをＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセ イ（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１７５：１０９−１ ２４（１９８８））でスクリーニングすることが含まれる。所望の抗体を分泌す るハイブリドーマをクローニングし、当該技術分野において知られる方法を用い てクラスおよびサブクラスを決定する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎ ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，上掲（１９８４））。 ポリクローナル抗体については、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単 離し、上述の方法の１つを用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてス クリーニングする。上述の抗体は、検出可能なように標識することができる。抗 体は、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、 酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、 蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等を用いることに より、検出可能なように標識することができる。このような標識を行う方法は当 該技術分野においてよく知られており、例えば、以下のものを参照されたい（Ｓ ｔｅｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅ ｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｍｎｏｌ ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ ．１３：２１５（１９７６））。標識された本発明の抗体は、インビトロ、イン ビボおよびインサイチオアッセイにおいて用いて、特定のペプチドを発現する細 胞または組織を同定することができる。 上述の抗体はまた、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体 の例には、ポリカーボネート等のプラスチック、アガロースおよびセファロース のような複合炭水化物、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアク リル樹脂が含まれる。抗体をそのような固体支持体にカップリングさせる技術は 、当該技術分野においてよく知られている（Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｈａｎ ｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”４ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ．Ｃｈａｐｔｅｒ １０（１９８６）；Ｊａ ｃｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ ｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９７４））。本発明の固定化された抗体は、インビトロ 、インビボおよびインサイチオアッセイ、ならびに免疫クロマトグラフィーにお いて用いることができる。 さらに、当業者は、現在利用可能な方法ならびに抗体に関して上述した技術、 方法およびキットを容易に適用して、合理的に設計された抗ペプチド−ペプチド を生成するために、特定のペプチド配列に結合しうるペプチドを生成することが できる。例えば、Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ.,”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ”，Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕ ｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＮＹ，ｐｐ．２８９−３０７（１９９２）， およびＫａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９ ２３０−８（１９８９）を参照されたい。 抗ペプチド−ペプチドは、開示される遺伝子の１つによりコードされるペプチ ド配列中に見いだされる塩基性アミノ酸残基を、疎水性および非荷電極性基を維 持しながら、酸性残基で置き換えることにより生成することができる。例えば、 リジン、アルギニンおよび／またはヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグル タミン酸で置き換え、グルタミン酸残基をリジン、アルギニンまたはヒスチジン で置き換える。 ＸＩ． 抗体に基づく方法およびキット 本発明は、（ａ）試料を免疫複合体が形成するような条件下で上述の抗体と接 触させ、そして（ｂ）ポリペプチドに結合した前記抗体の存在を検出することに より、試料中の、開示される遺伝子の１つによりコードされるポリペプチドを検 出する方法を包含する。詳細には、該方法は、試験試料を１つまたはそれ以上の 本発明の抗体とともにインキュベートし、抗体が試験試料に結合するか否かをア ッセイすることを含む。試料中のキナーゼの、正常レベルと比較して変化したレ ベルは、疾患を表すであろう。 抗体を試験試料とともにインキュベートする条件は様々である。インキュベー ト条件は、アッセイにおいて用いられるフォーマット、用いられる検出方法、お よびアッセイにおいて用いられる抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者は 、慣用的に利用可能な免疫学的アッセイフォーマット（例えばラジオイムノアッ セイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ、拡散系オクタロニー、またはロケッ ト免疫蛍光アッセイ）の任意のものを容易に適用して、本発明の抗体を用いるこ とができることを認識するであろう。 このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，”Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌ ｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ，”Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙ ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ ｏｇｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓ ｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に見られる。 本発明の免疫学的アッセイ試験試料には、細胞、蛋白質または細胞の膜抽出物 、または血液、血清、血漿、または尿等の生物学的液体が含まれる。上述の方法 において用いられる試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法、およびアッ セイすべき試料として用いられる組織、細胞または抽出物の性質により様々であ ろう。細胞の蛋白質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当該技術分野におい てよく知られており、用いられる系に適合しうる試料を得るために、容易に適用 することができる。 キットは、先に記載した検出の方法を実施するために必要な試薬のすべてを含 む。キットは、（ｉ）上述の抗体を含む第１の容器手段、および（ｉｉ）抗体の 結合パートナーおよび標識を含むコンジュゲートを含む第２の容器手段を含むこ とができる。別の好ましい態様においては、キットはさらに、洗浄試薬および結 合した抗体の存在を検出しうる試薬の１つまたはそれ以上を含む１つまたはそれ 以上の他の容器を含む。 検出試薬の例には、標識二次抗体が含まれるが、これに限定されるものではな く、あるいはまた、一次抗体が標識されている場合、標識された抗体と反応する ことができる発色団、酵素、または抗体結合試薬が含まれる。区画化されたキッ トは、核酸プローブキットについて上述したとおりである。当業者は、本発明に おいて記載される抗体を、当該技術分野においてよく知られた確立されたキット フォーマットの１つの中に容易に取り込ませることができることを容易に認識す るであろう。 ＸII．同定されたＲＴＫと相互作用する化合物の単離 本発明は、化合物とポリペプチドをインキュベートし、ポリペプチドに結合し た化合物の存在を検出することによる、同定されたキナーゼ遺伝子の一つからの ＲＴＫポリペプチドヘ結合できる化合物の検出法にも関している。化合物は複雑 な混合物、例えば、血清、体液または細胞抽出液内に存在していてもよい。結合 アッセイ法には、標識された既知の結合化合物に対する試験化合物または化合物 混合物の影響が決定される競合結合アッセイを含む種々の異なった様式が存在す る。他の様式としてはレセプター活性化の検出、標識されたまたは分光学的に検 出可能な試験化合物のキナーゼに対する結合の検出が含まれる。特定のキナーゼ が天然に膜結合されているかまたは細胞質に遊離しているかに依存して、結合ア ッセイは単離された膜で、そのままの細胞で、または細胞および膜を含まない溶 液で、または固形支持体に結合させて実施されるであろう。加えて、膜結合キナ ーゼは、膜貫通部分を除去するようなことによりしばしば膜を除くことができ、 結合は溶液中または固形支持体に結合されてアッセイされる。 本発明はまた、化合物存在下で特定のＲＴＫを産生する細胞をインキュベート し、特定のＲＴＫの活性またはＲＴＫ結合パートナー活性のレベル変化を検出す ることによる、ＲＴＫのアゴニストまたはアンタゴニスト活性またはＲＴＫ結合 パートナー活性を検出する方法にも関している。そのようにして同定された化合 物は化合物存在の指標である活性変化を生み出すであろう。化合物は複雑な混合 物、例えば、血清、体液または細胞抽出液内に存在していてもよい。化合物が一 度同定されたら、それは本分野でよく知られている技術を用いて単離できる。 本発明はまた、アゴニズムまたはアンタゴニズムに影響する十分な量で哺乳類 に特定のＲＴＫに対するアゴニストまたはアンタゴニストを投与することによる 、哺乳類中の特定のＲＴＫに付随する活性をアゴナイズする（刺激する）または アンタゴナイズする方法も包含している。ＲＴＫに付随する機能をアゴナイズま たはアンタゴナイズするのに十分な量で哺乳類にアゴニストまたはアンタゴニス トを投与することによる、特定のＲＴＫに関する活性のアゴニストまたはアンタ ゴニストで哺乳類の疾患を処置する方法も本発明に含まれている。 ＸIII．トランスジェニック動物 本発明に関連したトランスジェニック動物の生産には種々の方法が利用可能で ある。オスおよびメス前核融合の前にＤＮＡは受精卵の前核内に注入でき、また は細胞分割後の胚細胞の前核（例えば、二細胞胚の前核）内に注入できる（Ｂｒ ｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２（１９８５））。胚は本発明のウイルス（特にレテロ ウイルス）で感染でき、無機イオンレセプターヌクレオチド配列を運ぶように修 飾される。 胚の内部細胞塊から誘導され、培養で安定化された多分化能性幹細胞は培養で 本発明のヌクレオチド配列を取り込むように操作できる。そのような細胞を胚盤 胞内へ移植し、それを偽母内へ移植して出産させることによりトランスジェニッ ク動物が生産できる。トランスジェニック実験に適した動物はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔ ｏｗｎ，ＮＹ）、Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎ ａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）その他の普通の商業的供給源から入手可能である。 齧歯類胚の操作および接合体の前核内へのＤＮＡのマイクロインジェクション の方法は当業者にはよく知られている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，前記文献） 。魚、両生類卵および鳥類のためのマイクロインジエクション法はＨｏｕｄｅｂ ｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ４７：８９７ −９０５（１９９１）に詳述されている。動物の組織内へＤＮＡを導入する他の 方法が米国特許第４，９４５，０５０号（Ｓａｎｄｆｏｒｄら、１９９０年７月 ３ ０日）に記載されている。 例示のためのみに示すのであるが、トランスジェニックマウスを製造するには メスを過排卵に誘導する。メスをオスとともに置き、交尾したメスをＣＯ₂窒息 または断頭により殺して切除した卵管から胚を回収する。取り囲んでいる卵丘細 胞を取り除く。前核胚は次に洗浄し、インジェクションの時まで保存する。不定 周期の成体メスマウスを精管切除したオスと対にする。受容メスは供与メスと同 じ時に交尾させる。胚は手術により移される。トランスジェニックラットを発生 させる方法はマウスと同様である。Ｈａｍｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−１１１２（１９９０）を参照されたい。 胚幹（ＥＳ）細胞を培養し、続いてエレクトロポレーション、リン酸カルシウ ム／ＤＮＡ沈殿および直接的注入のような方法を用いたＥＳ細胞内へのＤＮＡ導 入によるトランスジェニック動物の製造も当業者にはよく知られている。例えば 、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅ ｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）。 ランダム遺伝子組込みが含まれる場合、本発明の配列を含んでいるクローンは 耐性をコードしている遺伝子と同時にトランスフェクトされる。もしくは、ネオ マイシン耐性をコードしている遺伝子が本発明の配列に物理的に連結される。所 望のクローンのトランスフェクションおよび単離は、当業者にはよく知られてい るいくつかの方法の一つにより実施される（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、上記 文献）。 ＥＳ細胞内へ導入されたＤＮＡ分子は相同的組換えの過程を通して染色体内へ 組込むこともできる。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８− １２９２（１９８９）。組込みの陽性選択（即ちｎｅｏ耐性）および二重陽性− 陰性選択（即ちｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）および続いてのＰＣＲに よる所望のクローンの同定のための方法はＣａｐｅｃｃｈｉ（前記文献）および Ｊｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：１５３−１５６（１９８ ９）に記載されており、それらの教えは本明細書において援用される。本方法の 最後の段階は胚盤胞内への標的化されたＥＳ細胞の注入および偽妊娠メスへの胚 盤胞の移送である。得られたキメラ動物を繁殖させ、子孫は導入遺伝子を運んで いる個体を同定するためにサザンブロッティングにより分析する。非齧歯類哺乳 類および他の動物生産のための方法は別のところに記載されている。Ｈｏｕｄｅ ｂｉｎｅ ａｎｄ Ｃｈｏｕｒｒｏｕｔ（前記文献）；Ｐｕｒｓｅｌ ｅｔ ａ ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８１−１２８８（１９８９）およびＳｉｒ ｎｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１７９−１８３（ １９８８）を参照されたい。 このように、本発明は開示されている遺伝子の一つによりコードされているポ リペプチドをコードしている導入遺伝子、またはそのようなポリペプチドの発現 に影響している遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。その ようなトランスジェニック非ヒト哺乳類は、そのようなポリペプチドを導入する 、そのようなポリペプチドの発現を調節する（即ち、追加の遺伝子、アンチセン ス核酸またはリボザイムの導入を通して）影響を研究するためのインビボ試験系 として特に有用である。 ”トランスジェニック動物”とは、人工的に細胞内へ挿入され、動物のゲノム の一部となり、細胞から発現されるＤＮＡを含む細胞を持っている動物である。 好適なトランスジェニック動物は霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、 ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡは、開示され ている遺伝子の一つによりコードされているヒトポリペプチドをコードしていて もよい。動物における天然の発現は、レセプターの発現を減少させるのに有効量 のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを提供することにより減少するであろう。 ＸIV．遺伝子治療 開示された遺伝子に対応する遺伝子配列はまた遺伝子治療（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ ａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０，（１９９２）に概説されている）にも有 用であろう。Ｍｉｌｌｅｒは実用的な最初の結果を示したヒト遺伝子治療へ実際 に応用されるまでに進歩したことを述べている。遺伝子治療の基本的科学はＭｕ ｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６-９３１，（１９９３）に記載 されている。 一つの好適な態様において、開示された遺伝子の一つのコード配列を含んでい る発現ベクターが細胞内へ挿入され、細胞はインビトロで増殖され、多数の細胞 が患者に注入された。別の好適な態様においては、選択されたプロモーター（例 えば、強力なプロモーター）を含んでいるＤＮＡセグメントが、開示された遺伝 子の一つの内在性コピーを含んでいる細胞内へ、プロモーターセグメントが内在 性遺伝子の発現を促進するような様式で細胞内へ導入される（例えば、プロモー ターセグメントは内在性遺伝子へ直接連結する様に細胞へ導入される）。 遺伝子治療は、腫瘍を標的とした開示された遺伝子の一つに対応するｃＤＮＡ を含んでいるアデノウイルスの使用、遺伝子工学処理した細胞の移植による開示 された遺伝子の一つの発現の全身的増加、開示された遺伝子の一つの組換え型を 持つウイルスの注射、または開示された遺伝子の一つの裸のＤＮＡの適当な組織 への注射を含んでいるであろう。 標的細胞集団は蛋白質複合体の活性を調節するために、蛋白質複合体の一つま たはそれ以上の成分の改変形を導入することにより修飾されてもよい。例えば、 標的細胞内の複合体成分活性を減少または阻害させることにより、ある状態へ導 く異常なシグナル伝達を減少、阻害または反転させるであろう。蛋白質複合体の 他の成分と相互作用する活性は保持しているが、シグナル伝達に機能することが できない成分の欠失またはミスセンス突然変異体は異常な、有害なシグナル伝達 を阻害するために使用できるであろう。 レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス 、ヘルペスウイルス、いくつかのＲＮＡウイルス、またはウシパピローマウイル スのようなウイルスから誘導される発現ベクターは、組換え体蛋白質をコードし ているヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）を標的細胞集団（例えば、腫瘍細 胞）内へ送達するために使用されるであろう。当業者にはよく知られている方法 がコード配列を含んでいる組換え体ウイルスベクターを構築するために使用でき る。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ,Ｎ.Ｙ.(１９８９)およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載 されている技術を参照されたい。もしくは、蛋白質配列をコードしている組換え 体核酸分子は裸のＤＮＡとして、または再構築系（例えば、標的細胞へ送達する ためのリポソームまたはその他の脂質系）で使用できる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７−８，１９８９を参照された い）。ヒト遺伝子治療で使用するための、細胞内へのプラスミド直接送達のため のいくつかの他の方法が存在し、蛋白質へのプラスミドＤＮＡの複合体化による 細胞上のレセプターへのＤＮＡの標的化が含まれる。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ、前 記文献、を参照されたい。 その最も単純な形において、遺伝子導入はマイクロインジェクション法により 、単に微量のＤＮＡを細胞の核内へ注入することにより実施できる。Ｃａｐｅｃ ｃｈｉ ＭＲ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９−８８（１９８０）。組換え体遺伝子が 一度細胞内へ導入されたら、転写および翻訳のための細胞の通常機構により認識 でき、遺伝子産物が発現されるであろう。多数の細胞にＤＮＡを導入するための 他の方法も試みられた。これらの方法には以下のものが含まれている：ＤＮＡは ＣａＰＯ₄と沈殿され、ピノサイトーシスにより細胞内へ取り込まれるトランス フェクション（Ｃｈｅｎ Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ Ｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２（１９８７））；膜内に穴をあけるために細胞 が高電圧パルスに曝されるエレクトロポレーション（Ｃｈｕ Ｇ．ｅｔ ａｌ． ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５：１３１１−２６（１９８７） ）；ＤＮＡが親油性ベシクル内へ包み込まれ、それが標的細胞と融合するリポフ ェクション／リポソーム融合（Ｆｅｌｇｎｅｒ ＰＬ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：７４１３−７（１９８７）） ；および小さな弾丸に結合されているＤＮＡを用いる粒子衝撃法（Ｙａｎｇ Ｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８− ７２（１９９０））。細胞内へＤＮＡを導入する別の方法は、ＤＮＡを化学的に 修飾した蛋白質に結合させるものである。 アデノウイルス蛋白質はエンドソームを不安定化して細胞内へのＤＮＡの取り 込みを促進させることも示されている。ＤＮＡ複合体を含んでいる溶液へのアデ ノウイルスの混合、または蛋白質架橋剤を用いるアデノウイルスヘ共有結合で結 合されているポリリジンへのＤＮＡの結合は実質的に組換え体遺伝子の取り込み および発現を改良する。Ｃｕｒｉｅｌ ＤＴ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓ ｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６：２４７−５２（１９９２）。 本明細書で使用される場合、”遺伝子導入”とは細胞内へ外来核酸分子を導入 する過程を意味している。遺伝子導入は通常、遺伝子によりコードされている特 定の生成物の発現を可能にするために実施される。生成物には蛋白質、ポリペプ チド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡまたは酵素的に活性なＲＮＡが含まれる 。遺伝子導入は培養細胞または動物への直接投与で実施できる。一般的に、遺伝 子導入は非特異的またはレセプター媒介相互作用による標的細胞と核酸の接触過 程、膜を通してのまたはエンドサイトーシスによる細胞内への核酸の取り込み、 および原形質膜またはエンドソームから細胞質内への核酸の放出を含んでいる。 加えて発現は、細胞核内への核酸の移動および転写のための適当な核因子への結 合を必要とするであろう。 本明細書で使用される場合、”遺伝子治療”とは遺伝子導入の一つの形であり 、本明細書で使用される遺伝子導入の定義内に含まれており、特に、インビボま たはインビトロにおいて細胞から治療的生成物を発現するための遺伝子導入を指 している。遺伝子導入は細胞にエクスビボでも実施でき、それは次に患者に移植 されるか、または患者への核酸または核酸−蛋白質複合体の直接投与により実施 できる。 別の好適な態様において、開示された遺伝子の一つの核酸配列も持つベクター が提供され、そこでは核酸配列は特定の組織でのみ発現される。組織特異的遺伝 子発現を達成するための方法は例えば、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ ９３／０９２３６に示されている。 上に示した前記ベクターのすべてにおいて、本発明のさらなる特色は、ベクタ ーに含まれている核酸配列が前に定義されたように核酸の配列のいくつかまたは すべてに付加、欠失または修飾を含んでいることである。 別の好適な態様において、遺伝子置換の方法が示されている。本明細書で使用 される場合、”遺伝子置換”とは動物でインビボ発現させることができる核酸配 列を供給し、それにより動物に失われているまたは欠損している内在性遺伝子機 能を提供または増大させることを意味している。実施例 以下の実施例は何ら制限するものではなく、単に本発明の種々の様相および特 色を表しているものである。以下の実施例は一群の新規な関連したチロシンキナ ーゼに対応する遺伝子配列の単離および特徴付けを示している。実施例１ 三つの新規ヒトＲＴＫをコードしているｃＤＮＡの単離 蛋白質キナーゼは数百の既知の構成物を持つ真核生物蛋白質の最も大きなファ ミリーの一つである。これらの蛋白質は、共通触媒コア構造から成る１２の異な ったサブドメインへ副分割できる２５０−３００のアミノ酸ドメインを共有して いる。これらの保存蛋白質モチーフはＰＣＲに基づいたクローニング戦略を用い て開発され、既知のキナーゼの著しい拡大を導いた。蛋白質キナーゼの触媒ドメ イン配列の多アラインメント、および続いての系統発生的分析はそれらの系統発 生樹への分離を可能にする。このようにして、関連したキナーゼは以下の異なっ た枝またはサブファミリーに群分けされる：チロシンキナーゼ、サイクリックヌ クレオチド依存性キナーゼ、カルシウム／カルモジュリンキナーゼ、サイクリン 依存性キナーゼおよびＭＡＰ−キナーゼ、ならびにいくつかの他の余りよく定義 されていないサブファミリー。 最初に、ＴＲＫ、チロシンキナーゼの別個のファミリーを示すレセプター、の 同族体の同定に着手した。三つの哺乳類レセプターのこのファミリーのキナーゼ サブドメインＩおよび・内の保存配列に対する縮重プライマーが設計された。サ ブドメインＩはキナーゼドメインのＮ末端であり、キナーゼのすべての組の触媒 単位へＡＴＰを繋ぎ止めるのに関与する共通モチーフＧＸＧＸＸＧＸＶを含んで いる。サブドメインVIIIは高度に保存されているＡＰＥモチーフを含んでおり、 その上流は多数の同じ組のキナーゼ（セリンキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ またはレセプターチロシンキナーゼ）間でよく保存されている残基である。すべ ての既知蛋白質キナーゼの比較に基づいて、三つのＴＲＫキナーゼのみを拾い出 すであろうサブドメインＩおよび・に対する縮重オリゴヌクレオチドプライマー が 設計された。材料および方法 細胞株および培養条件 すべての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）またはＮＣＩから入手され、それらの推奨条件に従って 増殖させた。分子クローニング 全ＲＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ｐ．Ｃｈｏｍｃｚｙ ｎｓｋｉ ａｎｄ Ｎ．Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１ ５６（１９８７）のグアニジン塩／フェノール抽出プロトコールを用いて、ヒト 、ラットまたはマウス組織から、および特定の組織型に起因するヒト腫瘍細胞株 から単離された。これらのＲＮＡは、ＧｉｂｃｏＢＲＬから購入されたＦｉｒｓ ｔ Ｓｔｒａｎｄ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒ ｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｉｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｇｅｒａｒｄ，ＧＦ ｅｔ ａｌ．（１９８９），ＦＯ ＣＵＳ １１，６６）を用いて製造元により推奨されている条件下、一本鎖ｃＤ ＮＡを発生させるための鋳型として使用された。典型的反応は、６０μｌの反応 容量に１０μｇのＲＮＡまたは２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡと１．５μｇのオリ ゴ（ｄＴ）_12-18を使用した。生成物はＲＮａｓｅＨで処理されＨ₂Ｏで１００μ ｌに希釈された。続いてのＰＣＲ増幅のため、各々の反応においてこれらのｓｓ ｃＤＮＡの１−４μｌが使用された。 オリゴヌクレオチドは確立されたホスホロアミダイト化学を用いるＡｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３９４ＤＮＡ合成機で合成され、エタノールで沈殿 後、未精製のまま使用された。縮重オリゴヌクレオチドプライマーは表Ｉに掲げ られている。各々の縮重オリゴヌクレオチドに掲げられているのは長さ、配向、 ヌクレオチド配列、およびプライマーが誘導されるアミノ酸配列である。縮重ヌ クレオチド残基指定は：Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ；およびＹ＝ ＣまたはＴである。ＴＲＫを鋳型として用いると、これらのプライマーは５５０ ｂｐの生成物を生成した。 ＰＣＲ反応は上に掲げたいくつかの一本鎖源に応用したプライマーＴＲＫａお よびＴＲＫｂを用いて実施された。プライマーは、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２００μＭ各々のデオ キシヌクレオシド三リン酸、０．００１％ゼラチンおよび１．５Ｕ Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）、およ び１−４μｌｃＤＮＡを含む混合物へ５μＭの最終濃度で加えられた。９５℃で ３分の変性に続いて、サイクリング条件は９４℃で３０秒、５０℃で１分、およ び７２℃で１分４５秒であり、３５サイクル行った。４５０−５５０ｂｐ間に移 動するＰＣＲ断片がＧｅｎｅＣｌｅａｎを用いる２％アガロースゲルから単離さ れ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＳＫII＋内のＥｃｏＲＶ部位（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）内へブラントクローン化された。Ｑｉａｇｅｎカラムを用いてミニプラス ミドＤＮＡ調製試料のためにコロニーが選択され、プラスミドＤＮＡはＡｍｐｌ ｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ）によるサイクルシークエンシング色素−ターミネーターキットを用いて配列決 定された。配列決定生成物はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡシークエンサ ーにかけ、ＢＬＡＳＴアラインメントアルゴニズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を用いて分析 した。 鋳型としたラット成体脳黒質から一本鎖上のプライマーＴＲＫａおよびＴＲＫ ｂを用いるＰＣＲにより新規クローン（＃１３５−３１−２）が単離された。こ のクローンはその後ラットＬＭＲＩ断片と称された。 ｐＣＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のラットＰＣ１２ｃＤＮＡライブラリーお よびラット胎児脳ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をこの断片をプ ローブとしてスクリーニングし、いくつかのより大きいｃＤＮＡクローンが単離 された。ＬＭＲ１＿ｒのＤＮＡ配列分析はいくつかのチロシンキナーゼレセプタ ーへの相同性を示し、それはこの組の酵素に特徴的なすべてのモチーフを持って いた。この配列の５’末端は二つの疎水性領域をコードしており、タイプＩａト ランスメンブラン蛋白質のシグナル配列およびトランスメンブランドメインの存 在と一致していた。これら二つの疎水性ドメイン間の領域は１８アミノ酸のみで あり、この蛋白質は非常に短い細胞外ドメインを含んでいることを示唆している 。 ＬＭＲ１＿ｒは推定チロシンキナーゼドメインの高度に保存された部位に非定 型アミノ酸置換を持っている。これらはドメインII中のＶＡＶＫからＶＶＶＫへ の変化、ドメインVII中のＤＦＧからＤＹＧへの変化およびドメインIX中のＳＤ ＶＷからＳＮＶＷへの変化である。非関連レセプターチロシンキナーゼＴＥＫお よびＲＯＳに特異的な他のプライマーと合同させるため、いくつかのＬＭＲ１＿ ｒ独特のモチーフに対するいくつかの追加のプライマーが設計された。プライマ ー配列は図２に示されている。これらのプライマーの多数の組み合わせがいくつ かのラット、マウスおよびヒト起源の一本鎖ｃＤＮＡに応用され、追加のＬＭＲ １の相同体が単離された。ノーザンブロット分析 ６０のヒト腫瘍細胞株および２６の正常ヒト組織から単離された１０μｇの総 ＲＮＡを変性ホルムアミド１．２％アガロースゲルにかけ、ナイロン膜へ移すこ とによりノーザンブロットを準備した。フィルターは、ヒトＬＭＲ１、ＬＭＲ２ およびＬＭＲ３の挿入物から合成されたランダムプライム［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ標 識プローブでハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションは１−２ｘ１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌの³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いて、６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ 、１Ｘデンハート溶液、１００μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中、４２℃で一 夜実施された。フィルターは０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃、で洗浄 され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ 上で暴露させた。ＬＭＲ１の半定量的ＰＣＲ検出 ＲＮＡは種々のラット細胞株および新鮮な凍結組織から単離された。一本鎖ｃ ＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓ ｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して前記のように１０μｇの各々のＲＮＡか ら合成された。これらの一本鎖鋳型は次に二つのＬＭＲＩ＿ｒ特異的オリゴヌク レオチド５’−ＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＴＴＡＣＧＧＡＡＴＡおよび５’− ＧＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＴＡＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣを用いた２５サイクルのＰ ＣＲ反応に使用された。反応生成物は２％アガロースゲルで電気泳動され、エチ ジウムブロミドで染色してＵＶ光ボックスで写真を撮った。各々の試料について ＬＭＲＩ特異的バンドの相対強度が見積もられた。インシトゥハイブリダイゼーション分析 ＯＣＴ包理凍結ラット胎児（Ｅ１６、Ｅ２０）および成体ラット脳のクライオ スタット切片をポリリジン被覆スライド上に置き、４℃で４％パラホルムアミド ＰＢＳ溶液で固定した。スライドは０．２５％無水酢酸／０．１Ｍ ＴＥＡで１ ０分間処理して２ＸＳＳＣで洗浄し、水続いて３０％、５０％、８５％、９５％ および１００％ＥｔＯＨで各々１５秒洗浄して脱水した。スライドは次に風乾し 、ＰＢＳ／５ｍＭ ＭｇＣｌ₂に１０分、続いて０．２５Ｍトリス／０．１Ｍグ リシンに１０分、および５０％ホルムアミド／２ＸＳＥＴで３７℃にて１０分処 理してプリハイブリダイズした。スライドは次に、ラットＬＭＲ１、ＬＭＲ２ま たはＬＭＲ３をコードしている３００−５００断片から発生させた２百万ｃｐｍ の［³⁵Ｓ］ＣＴＰ標識センスおよびアンチセンスリボプローブを含むハイブリダ イゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド／２ＸＳＥＴ／１０Ｘデンハート／ｍ ｌ当たり０．５ｍｇのｔＲＮＡ／１００ｍＭ ＤＴＴ）中でハイブリダイズされ た。スライド当たり６滴のハイブリダイゼーション混合物を加え、４５℃で４時 間インキュベートした。スライドは４ＸＳＳＣ、続いて５０％ホルムアミド／２ ＸＳＥＴで６０℃にて１５分間洗浄した。スライドを再び４ＸＳＳＣで洗浄した 後、４ＸＳＥＴ中、３７℃にて２０μｇ／ｍｌ ＲＮＡａｓｅＡで２０分処理し 、次に１ＸＳＳＣで洗浄した。スライドは次に、３０％ＥｔＯＨ／０．３Ｍ Ｎ Ｈ₄ＨＯＡＣ、５０％ＥｔＯＨ／０．３Ｍ ＮＨ₄ＨＯＡＣ、７０％ＥｔＯＨ／０ ．３Ｍ ＮＨ₄ＨＯＡＣ、８５％ＥｔＯＨ、９５％ＥｔＯＨ、１００％ＥｔＯＨ で脱水し、風乾して乾燥剤を入れた気密箱で、室温にて保存した。スライドはＫ ｏｄａｋ ＮＴＢ２乳剤に浸し、現像に先立って２−５週間暴露した。染色体局在化およびＬＭＲ２のゲノムクローニング 一対のオリゴヌクレオチドプライマーが、ゲノムＤＮＡからの５２１ｂｐＬＭ Ｒ２特異的断片増幅のためにヒトＬＭＲ２の３’−非翻訳領域配列から誘導され た。本プライマーはヒトＬＭＲ２配列の８２３２−８２５４（センス）および８ ７３２−８７５２（アンチセンス）に渡っている。このプライマー対はＳｔａｎ ｆｏｒｄヒトゲノムセンタ−Ｇ３放射ハイブリッドパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）およびヒト細菌人工染色体（ ＢＡＣ）ＤＮＡプールのライブラリー（Ｒｅｌｅａｓｅ ＩＩＩ，Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）に応用された。ＰＣＲ 反応は、販売元が推奨したように、６４℃のアニーリング温度で３０−３５サイ クル実施された。加えて、ＬＭＲ２ｃＤＮＡクローンの５’末端に拡がっている ゲノムクローンを単離するため、ヒトＬＭＲ２の５’末端からの１５８ｂｐＸｈ ｏＩ−ＰｓｔＩ断片がラムダＦＩＸＩＩ中のヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリー の探査に使用された。結果 三つの新規ＲＴＫをコードしているｃＤＮＡクローンの配列分析 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた新規キナーゼの同定に使用するため レセプターチロシンキナーゼＴＲＫのキナーゼドメイン内の保存残基に基づいて 縮重プライマーＴＲＫａおよびＴＲＫｂが設計された。鋳型としてラット黒質ｓ ｓｃＤＮＡに応用された場合、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢおよびＴＲＫＣ ｃＤＮＡの 多数のコピーならびにセリンキナーゼに相同的ないくつかのＤＮＡ断片が単離さ れた。ＲＴＫ、インシュリンレセプター、ＩＧＦ１レセプター、ＴＲＫＡおよび ＲＯＳに最も類似している配列を持つ新規５５０ｂｐクローン（１３５−３１− ２）はＬＭＲ１＿ｒと名付けられた。 この断片をプローブとして使用し、ノーザンブロットにより多数のラットから のＲＮＡがスクリーニングされ、このクローンのラット脳における明らかな発現 の選択性が示された。ＬＭＲ１＿ｒプローブはまた、ＬＭＲ１＿ｒの３’末端に 広がる重複クローンを単離するためにＰＣ１２細胞株ＲＮＡから構築されたｃＤ ＮＡライブラリーのスクリーニングにも使用された。 ２，５７２ｂｐ ＬＭＲ１＿ｒヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１）は図７ に示されており、８４８アミノ酸をコードしている一つの読みとり枠を含んでい る。追加の３’クローンがＬＭＲ１＿ｒの完全配列を解明するために必要であろ うが、ＬＭＲ１のＣ末端部分がその後ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離された （下記参照）。 ＬＭＲ１＿ｒアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１０）は真核生物蛋白質キナーゼ に特徴的な１２のサブドメインすべてを保存している。以下に説明するように、 それは他の蛋白質キナーゼ触媒ドメイン内の三つの高度に保存された残基に非定 型を持っている。推定蛋白質キナーゼドメインの上流はシグナル配列およびトラ ンスメンブランドメインに特徴的な二つの疎水性配列が存在する。 非関連レセプターチロシンキナーゼＴＥＫおよびＲＯＳに特異的な他のプライ マーと合同させるため、いくつかのＬＭＲ１＿ｒ独特のモチーフに対するいくつ かの追加のプライマーが設計された。プライマー配列は表Ｉに示されている。こ れらのプライマーの多数の組み合わせがいくつかのラット、マウスおよびヒト起 源の一本鎖ｃＤＮＡに応用され、追加のＬＭＲ１の相同体が単離された。特に、 ＬＭＲ１＿ｒのヒトおよびマウス相対物に対応する断片が同定された（プライマ ーＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ６で単離されたヒト小脳からのＬＭＲ１＿ｈ； １１日目のマウス胎児ｃＤＮＡに同じプライマーを使用したＬＭＲ１＿ｍ）。７ つの追加の独特な断片が、これらの縮重プライマーの種々の対を用いるＰＣＲで 単離された。配列比較は、これらの７つのクローンは二つの追加的ヒト遺伝子お よびそれらのラットまたはマウスからのオルトログを意味していることを示唆し ている。特にこれらはＬＭＲ２＿ｈ（ＯＶＣＡＲ−３卵巣腫瘍細胞株ｃＤＮＡ上 のプライマーＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ６）、ＬＭＲ２＿ｍ（１０日目のマ ウス胎児ｃＤＮＡ上のプライマーＲＯＳ１およびＩＲＯＳＤ５）、ＬＭＲ２＿ｒ （ラットＰＣ１２ｃＤＮＡ上のＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ６）、ＬＭＲ２＿ ｈ（ヒト心臓ｃＤＮＡ上のプライマーＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ６）、ＬＭ Ｒ２＿ｒ（ラットＰＣ１２ｃＤＮＡ上のＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ５）、Ｌ ＭＲ３＿ｈ（ヒト胎児脳ｃＤＮＡ上のプライマーＩＲＯＳＤ３およびＩＲＯＳＤ ６）およびＬＭＲ３＿ｍ（１２日目のマウス胎児ｃＤＮＡ上のプライマーＴＥＫ １およびＩＲＯＳＤ５）と称される。 ヒトＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３からの部分ｃＤＮＡクローンが、完全 長ヒトｃＤＮＡクローンを単離するためにｃＤＮＡライブラリーのプローブとし て使用された。ＬＭＲ１＿ｈの５，０４８ｂｐクローン（配列ＩＤ番号：２）が ＳＮＢ７５細胞株ＲＮＡから構築されたラムダＺＡＰｃＤＮＡから単離された。 このクローンは予想される１３８４アミノヒトＬＭＲ１蛋白質の始めの２７アミ ノ酸を除くすべてに及んでいる。しかしながら、真のＬＭＲ１ Ｎ末端はラット ｃＤＮＡクローンに含まれている。４，３４９ｂｐおよび５，４８２ｂｐの二つ のＬＭＲ２＿ｈ ｃＤＮＡクローンが各々ＮＣＩ−Ｈ４６０ヒト肺癌腫細胞株ｃ ＤＮＡライブラリーおよびＳＮＢ７５ ｃＤＮＡライブラリーから単離された。 共にこれらのクローンは完全８，９８２ｂｐヒトＬＭＲ２ｃＤＮＡ（配列ＩＤ番 号：５）に及んでおり、１５０４アミノ酸（配列ＩＤ番号：１４）の蛋白質をコ ードしている。最後に、ラムダｇｔ１１ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＬＭＲ ３＿ｈの１，５８３ｂｐクローン（配列ＩＤ番号：８）が単離された。このクロ ーンはヒトＬＭＲ３のＮ末端４７３アミノ酸（配列ＩＤ番号：１７）に及んでい る。ヒトＬＭＲ３ｃＤＮＡの３’末端を単離するためにさらなるスクリーニング が進行中である。 三つのＬＭＲ蛋白質の各々は二つの空間的に近い疎水性領域で始まっている。 ＬＭＲ１（ａａ１−２０）、ＬＭＲ２（ａａ１−２６）およびＬＭＲ３（ａａ１ −２０）の第一の疎水性配列はシグナルペプチドの範鴫に入り、ＭｃＧｅｏｃｈ （Ｄ．Ｊ．ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３，２７１，１９ ８５）の方法を使用すると各々８．７８、１８．９５および１０．７６の判別評 点を持ち、およびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅのアルゴリズム（Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｊ ｎｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４，４６８３，１９８６）を使用す ると各々＋３．４５、９．０３および８．６６（閾値＝３．５）を持っている。 ＬＭＲ１（ａａ３８−６４）、ＬＭＲ２（ａａ３９−６９）およびＬＭＲ３（ａ ａ３５−６２）の第二の疎水性領域はトランスメンブランドメインを予期するた めのＫｌｅｉｎら（Ｐ．Ｋｌｅｉｎ，Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，ａｎｄ Ｃ．Ｄｅ Ｌｉｓｉ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１５，４６８，１９ ８５）のＡＬＯＭ法を使用すると各々−９．１８、−１７．０９および−１１． ２５（閾値＝−２．０）の可能性評点が得られる。これらの分析に基づいて、Ｌ ＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３はすべて各々１８（ＡＦＳＳＨＦＤＰＤＧＡＰ ＬＳＥＬＳＷ）、１２（ＡＰＬＰＱＴＧＡＧＥＡＰ）および１４（ＳＰＡＨＰＤ ＧＦＡＬＧＲＡＰ）アミノ酸の非常に短い細胞外ドメインを持つタイプＩａ膜蛋 白質であると予期される。あるいは、これらのレセプターは多くのＧＰＩ−固定 サイトカインレセプター、ＧＤＮＦレセプターに存在するような追加のコレセプ ター、またはコンタクチン関連付着分子を含んでいるかもしれない。共免疫沈殿 研究はこの問題を追求することを可能にするであろう。 ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３はすべて真核生物蛋白質キナーゼに特徴的 な１２すべてのサブドメインを保存するドメインを共有している。三つのヒト蛋 白質はこの推定キナーゼドメイン内に５２−５９％のアミノ酸配列同一性を共有 しており、一方、ＬＭＲ１のラット、マウスおよびヒトオルトログは９２−９３ ％のアミノ酸同一性を共有している。ＬＭＲの推定キナーゼドメインは他のレセ プターチロシンキナーゼのものと最も相関している。それらはＴＲＫＡ，ＴＲＫ ＢおよびＴＲＫＣと３３−３６％のアミノ酸同一性、インシュリンレセプター、 ＩＧＦ１Ｒ、Ｍｕｓｋ、Ｔｙｒｏ１０、ＤＤＲおよびＲＯＳと３１−３５％の同 一性を共有している。しかしながら、細胞質チロシンキナーゼ、ＩＴＫおよびＢ ＭＸはＬＭＲ２のキナーゼ様ドメインと３３−３４％同一である。この分析は、 ＬＭＲレセプターはＲＴＫの独特の部類を表すようであることを示唆している。 三つのＬＭＲのキナーゼ様ドメインは、すべての蛋白質キナーゼ間で高度に保存 されている残基に非定型置換を確かに含んでいる：キナーゼドメインII中のＶＡ ＶＫからＶ（Ｖ／Ｉ）ＶＫ（ＬＭＲ２中のａａ１６３−１６６）、ＤＦＧからＤ ＹＧ（ＬＭＲ２中のａａ２８１−２８３）およびＤＶＷＳからＮＶＷＳ（ＬＭＲ ２中のａａ３２９−３３２）。第一の置換はＡＴＰのアデノシン環のための接触 残基であり、この位置での疎水性残基の存在はすべての既知蛋白質キナーゼに特 有である。残りの二つの置換はキナーゼの触媒機能に直接関与しているかどうか は知られていないが、ＰＩＭ１およびＰＫＣのような他の活性化キナーゼにも存 在している。これらの置換がキナーゼ様ドメインの活性特異性に影響するかどう かは、インビトロキナーゼおよびＦＳＢＡ結合実験から追求することができる。 ＬＭＲ１およびＬＭＲ２のＣ末端ドメインは各々９７５および１０９３アミノ 酸である。ＬＭＲ３のＣ末端ドメインは少なくとも１５３ａａである（残ってい るＬＭＲ３のＣ末端領域の配列分析は進行中である）。これらの蛋白質はそれら の長い触媒外Ｃ末端尾部を反映してレムール（Ｌｅｍｕｒ）（ＬＭＲ）と名付け られた。Ｃ末端内には７のチロシン残基を含むアミノ酸が同一であるいくつかの 保存されたポケットがある（図１）。これらの各々はチロシンリン酸化部位とし て機能する可能性があり、ＬＭＲ特異的シグナル伝達に重要なものであろう。こ れらの”尾部”はまた非常に親水性で陰性に荷電されているが、他の蛋白質への 有意な相同性を欠いている。ＬＭＲ１およびＬＭＲ２では多数のアイソフォーム が同定されており、Ｃ末端ドメインのフレームシフトおよび先端の切り取りの結 果である代わりのスプライシングまたは一つの塩基の付加から生じている。ヒトＬＭＲの発現プロフィール 成人ヒト組織試料およびヒト腫瘍細胞株からのＲＮＡのノーザンブロットをヒ トＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３に特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイ ズさせた。単一のｍＲＮＡ転写体が各々の遺伝子について同定され（ＬＭＲ１＝ ７ｋｂ；ＬＭＲ２＝９ｋｂ；ＬＭＲ３＝５．１ｋｂ）、すべてが特異的細胞型で の異なったおよび制限された発現を示した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＬＭＲ１はま た種々のラット組織ＲＮＡ試料について定量的ＰＣＲにより分析された。正常成 人組織におけるＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３発現は神経器官（成人脳、皮 質および小脳）に限られており、試験されたすべての他の成人組織には存在しな かった。ＬＭＲ１は三つの肺腫瘍、一つのＣＮＳ腫瘍、一つの結腸腫瘍および二 つのメラノーマからの細胞株で低レベルで発現された。ＬＭＲ３発現は５９の腫 瘍細胞株のどれにも検出されなかった。対照的に、ＬＭＲ２は多数の腫瘍細胞株 、特に肺、乳房および結腸起源のものに広くおよび多量に発現された。ＬＭＲ発現のインシトゥ分析 ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３の発生的発現は１６日目のラット胎児のイ ンシトゥハイブリダイゼーションにより分析された（図４）。ＬＭＲ１発現は後 根神経節（ＤＲＧ）および突出した神経に堅く制限されており、試験されたすべ ての他の神経性および非神経性組織には存在しなかった。ＬＭＲ３もまたＤＲＧ で豊富に発現されていたが、脊椎、視床および脳幹を含む他の胎児神経構造物で 匹敵した発現があり、中脳および皮質の特定の領域でのレベルは低かった。ＬＭ Ｒ３はまた胎児の胃および結腸でも発現された。ＬＭＲ２は１６日目の胎児にお いてＬＭＲ１またはＬＭＲ３よりも広い発現プロフィールを持っていた。ＬＭＲ ２はＬＭＲ３と同一の神経性組織（ＤＲＧ、脊椎、脳幹、視床、中脳および皮質 ）において高レベルで発現され、しかもＬＭＲ２発現は三叉神経核、視神経およ び嗅上皮でも強かった。ＬＭＲ２はまた胃、腸および結腸、肺、腎臓、肝臓およ び膵臓を含む種々の非神経胎児組織でも豊富に発現されていた。 ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３の発現はまた成体ラット脳の頭頂および頭 頂骨間の縫合線切片でのインシトゥハイブリダイゼーションによっても分析され た（図５）。ＬＭＲ１は中脳、皮質、視床および扁桃核、および中脳で弱く発現 されていた。ＬＭＲ３は成体脳でより豊富に発現されており、海馬、小脳、前方 皮質、扁桃核、視床核、尾状核、顔面神経核および乳頭上核で最も高い発現があ った。成体ラット脳におけるＬＭＲ２発現はＬＭＲ１またはＬＭＲ３よりも強く 、特に、小脳のプルキンエ層、外部皮質、海馬および視床、尾状／被殼、扁桃、 顔面神経および三叉神経核で強かった。ＬＭＲ２はまた梨状皮質および黒質の領 域でも検出された。 全体で、ＬＭＲ１およびＬＭＲ３の発現は高度に神経性組織に制限されており 、他の成体または胎児器官またはヒト腫瘍細胞株では最少の発現しかなかった。 対照的に、ＬＭＲ２の発現は成体神経性組織に制限されていたが、他の非神経性 胎児組織および多数の脛瘍細胞株で非常に豊富に発現されている。ＬＭＲ２の腫 瘍−胎児パターンは、それが癌治療のための選択的標的として働くかもしれない ことを示唆している。ＬＭＲ２のゲノム分析および染色体局在化 ゲノムＤＮＡからのＬＭＲ２を特異的に認識するＰＣＲプライマー対が設計さ れた。これらのプライマーはＬＭＲ２遺伝子位置の地図を作るため、ハムスター −ヒト体細胞ハイブリッドから単離されたＤＮＡのＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３放射 ハイブリッドパネルのスクリーニングに使用された。ＬＭＲ２は染色体７ｑ２２ ．１に位置していた。この染色体領域は膵臓癌、多薬剤耐性細胞および悪性固形 腫瘍で増幅されることが報告されている。７ｑ２２領域中の転座が骨髄性白血病 および子宮内膜ポリープで観察されており、染色体喪失が乳房、卵巣、前立腺お よび食道癌および子宮平滑筋腫で報告されている。これらの腫瘍源から単離され た標本からのＬＭＲ２遺伝子／配列分析が、これらの腫瘍型におけるＬＭＲ２の 関 与を確認するために必要であろう。 ＬＭＲ２特異的プライマーはまた全ヒトＬＭＲ２遺伝子に及ぶ〜１３０ｋｂＢ ＡＣ（細菌人工染色体）クローンを単離するためにも使用された。総計で四つの ＢＡＣクローンがＬＭＲ２遺伝子の３’ＵＴＲを含んでいると同定された（プレ ートプール３４５−３５２／列Ｂ／段１０；プレートプール４５７−４６４／列 Ｊ／段２２；プレートプール５６９−５７６／列Ｎ／段１８；およびプレートプ ール９−１６／列Ｌ／段６）。これらのＢＡＣクローンの最後のものはＬＭＲ２ ｃＤＮＡクローンの５’末端を含んでいることも観察された。ｃＤＮＡクローン の最も５’の領域を含んでいる追加の１２ｋｂラムダヒトゲノムクローンもまた 単離された。ＢＡＣクローンの部分配列分析はＬＭＲ２中の多数のエキソンの所 在を明らかにし、ＬＭＲ２のＣ末端アイソフォームはそのどれか一つがスプライ スされた転写体であったことを証明した。ラムダゲノムクローンおよびＢＡＣク ローンのさらなる配列分析でＬＭＲ２のＮ末端コード領域に二つの小さなイント ロン（一つは予期されるシグナル配列の結合部の近くに）が同定され、予期され るＬＭＲ２の５’ＵＴＲが予期される開始メチオニンと隣接していることおよび 終止コドンが我々の最も遠いｃＤＮＡクローンのすぐ上流の枠内に存在すること を明らかにした。上流イントロンがないのは明らかで、共通”ＴＡＴＡボックス ”は最も５’のｃＤＮＡ配列の２５９ｂｐ上流にあり、これが上流ＬＭＲ２プロ モーター領域であるに違いないことを暗示している。まとめると、ゲノムおよｃ ＤＮＡクローンの分析は、存在する配列（配列ＩＤ番号：５）はヒトＬＭＲ２の 完全コード配列を表しており、それは非常に短い細胞外ドメインを持つ通常では ない膜コンフィグレーションを持っていることを示唆している。この結論は、Ｌ ＭＲ１およびＬＭＲ３クローン中の予期されるシグナルペプチドが続く開始メチ オニンの一致した存在によりさらに支持される。しかしながら、これらのクロー ンが全ＬＭＲコード領域を表すことの確認は、組換え体蛋白質が内在性ＬＭＲ２ と同じ大きさのポリペプチドをコードしていること、および免疫局在化研究でＬ ＭＲ２が細胞表面レセプターに先端で触れているのを示すことの証明が必要であ る（下記参照）。実施例２ 新規ＲＴＫ物質の組換え体発現および発現ベクター構築法 ａ）ｐＣＤＮＡ発現ベクター中の完全長ＬＭＲ２＿ｈ；ｂ）アデノウイルス発 現ベクター中のニワトリＴｒｋＡ細胞外ドメインおよびヒトＬＭＲ２のトランス メンブランおよび細胞質ドメイン間のキメラ；ｃ）ＧＳＴ発現カセットのＣ終末 端に融合されたＬＭＲ２の膜近傍および細胞質ドメインを含むＧＳＴ融合構築物 ；ｄ）ＧｙｒＢ発現カセットに融合されたＬＭＲ２＿ｈのキナーゼドメイン；ｅ ）ｐＣＤＮＡベクターに挿入された、ＬＭＲ２キナーゼドメインの予想ＡＴＰ結 合部位にＬｙｓからＡｌａ（ＫからＡ）への突然変異を持つ完全長ＬＭＲ２＿ｈ 構築物；ｆ）段々に大きくなるＣ末端欠損を含んでいる、ｐＣＤＮＡベクター中 の種々に端を切り取られたＬＭＲ２構築物：を含むいくつかの発現構築物がヒト ＬＭＲ２ｃＤＮＡから発生された。 ＬＭＲ２の”ＫからＡ”突然変異体およびＣ末端切断突然変異体は優勢陰性構 築物として機能し、ＬＭＲ２の機能を評価するために使用されるであろう。三つの新規ＲＴＫに対する特異的免疫試薬の発生 ヒトＬＭＲ２に対応するＫＬＨ−またはＭＡＰ−結合合成ペプチドに対する特 異的免疫試薬をウサギで発生させた。Ｃ末端ペプチドはグルタルアルデヒドでＫ ＬＨと結合され、遊離Ｃ末端が残された。内部ペプチドはＭＡＰ結合されたもの であり、Ｎ末端はブロックされている。さらなる免疫試薬もまた、ＬＭＲ１、Ｌ ＭＲ２およびＬＭＲ３の細胞質ドメインを含んでいる、細菌発現ＧＳＴ融合蛋白 質でウサギを免疫化して発生させることができる。 ＬＭＲ２に対し、ヒトＬＭＲ２蛋白質のアミノ酸７１−８４０をコードしてい るＧＳＴ融合構築物が発生された。ヒトＬＭＲ２のためのペプチド免疫原には次 にものが含まれる： 哺乳類細胞におけるＬＭＲ１、２、３の過渡的発現 ＬＭＲ２を含んでいるｐｃＤＮＡ発現プラスミド（１０μｇ／１００ｍｍプレ ート）が、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により２９３細胞内へ導入 された。７２時間後、細胞は０．５ｍｌの可溶化緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ −１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭフェニルメチル スルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌアポロチニン）中に採取された。試料の一 部は６％アクリルアミド／０．５％ビス−アクリルアミドによるＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、電気泳動的にニトロセルロース に移された。非特異的結合はブロットをＢｌｏｔｔｏ（５％ ｗ／ｖ脱脂乾燥ミ ルクおよび０．２％ ｖ／ｖノニデットＰ−４０（Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩 衝液）中で前もってインキュベートすることによりブロックし、組換え体蛋白質 は種々の抗ペプチドまたは抗ＧＳＴ融合特異的抗血清を用いて検出した。免疫染色 内在性蛋白質の細胞内位置を決定するため、免疫ブロット分析に基づいて内在 性ＬＭＲを発現している細胞をスライドガラスに置き、ＬＭＲ特異的抗血清で染 色した。細胞はメタカルン（６０％メタノール／３０％クロロホルム／１０％氷 酢酸）で２０分間固定し、０．２５％トウィーン２０を含むＰＢＳで後固定した 。スライドは次に５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ／０．２５％トウィーン２０で ４５分間ブロックした。スライドは次に、ペプチド４９４Ａまたは４９７Ａで免 役したウサギの５番目の採血からのＬＭＲ２特異的抗血清の１：５００希釈液と 室温で４５分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．２５％トウィーン２０中で５回 洗浄した。ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’）２ＩｇＧ−サイアニンＣＹ３（Ｊａｃｋｓ ｏ ｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇ ｒｏｖｅ，ＰＡ）の１：５００希釈液を３０分間加え、続いてＰＢＳ／０．２５ ％トウィーン２０で６回、およびＨ₂Ｏで２回洗浄した。スライドは次に風乾し 、蛍光顕微鏡による分析のために装着された。インビトロキナーゼアッセイ ＬＭＲ２発現構築物で３日間トランスフェクション後、２９３細胞の１０ｃｍ プレートをＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤を含んでいる２ｍｌのＰＢＳ ＴＤＳ（１０ｍＭ ＮａＨＰＯ₄、７．２５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリ トンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、０．２％アジ化 ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭオルトバナジン酸ナト リウム、１％アプロチニン、５μｇ／ｍｌロイペプチン）にて氷上で可溶化した 。細胞破片は遠心分離（１２０００ｘｇ、１５分、４℃）により除去し、溶解物 は各々５０μｌのプロテインＡ−セファロースの１：１スラリーで１時間、２回 続けてインキュベーションすることにより前もって透明化した。透明化上清の０ ．５ｍｌを１０μｌのプロテインＡ精製ＬＭＲ２抗血清（ＧＳＴ融合蛋白質から 発生させた）に５０μｌのプロテインＡ−セファロースの１：１スラリーを加え たものと４℃で２時間反応させた。ビーズはＰＢＳＴＤＳで２回、およびＨＮＴ Ｇ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０，１％トリ トンＸ−１００、１０％グリセロール）で２回洗浄した。セファロースゲル上の 免疫精製ＬＭＲ２は２０μｌの３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂およ び２０μＣｉ［ｇ³²Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を加えたＨＮＴＧに 再懸濁した。キナーゼ反応は室温で３０分間行われ、５０ｍＭ ＥＤＴＡを補給 したＨＮＴＧの添加により停止させた。試料はＨＮＴＧで６回洗浄し、ＳＤＳ試 料緩衝液中で５分間煮沸し、６％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ続いてオートラジオグラフィ ーにより分析した。ホスホアミノ酸分析はＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルから切り出した^{3 2} Ｐ標識ＬＭＲ２に対する標準２Ｄ法により実施された。ＦＳＢＡ標識 免疫沈殿ＬＭＲ２はＡｎｏｓｔａｒｉｏ，Ｍ Ｊｒ ｅｔ ａｌ （Ａｎａｌ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９０，６０−６５，１９９０）により記載されているよう に， ＡＴＰ競合剤の存在下または不在下で、ＡＴＰ類似体ＦＳＢＡにより標識された 。ＦＳＢＡ結合ＬＭＲ２は抗ＦＳＢＡ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈ ｅｉｍ）を用いる免疫ブロットにより検出された。結果 三つの新規ＲＴＫの各々の見かけの分子量はヒト２９３胎児腎臓上皮細胞での 過渡的発現、続いてのＬＭＲ特異的抗血清によるイムノブロッティングにより決 定できる。驚くことに、完全長ＬＭＲ２ｃＤＮＡ構築物は６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルで〜２３０ｋＤａに移動する蛋白質をコードしており、一方、ｃＤＮＡは１ ６４．９ｋＤａの非修飾蛋白質を予想させた。キメラＴｒｋＡ−ＬＭＲ２構築物 は６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで２５０ｋＤａより上に移動する蛋白質をコードし ており、一方、ｃＤＮＡは〜２０７ｋＤａ（１３の潜在的グリコシル化部位が加 わる）の蛋白質を予言させた。予想されたＬＭＲ２の細胞外ドメインは１２アミ ノ酸のみであるので（グリコシル化部位なし）、より遅いゲル移動度の理由は明 らかではない。一連のＣ末端欠失突然変異体に基づいて、計算および見かけのゲ ル移動度間の不一致は、長い、陰性に荷電されたＬＭＲ２のＣ末端尾部存在の結 果であることが明らかになった。しかしながらこの分析により、組換え体蛋白質 は哺乳類細胞で安定的に産生できることが確認され、抗血清の特異性を確認する ための組換え体蛋白質源が提供される。 抗ＧＳＴ融合およびペプチド抗血清は、組換え体蛋白質に対するその感度およ び特異性が試験された。ＬＭＲ１およびＬＭＲ２抗ＧＳＴ融合抗体は、免疫沈降 およびウェスタンブロットにおいて両方とも適切な組換え体蛋白質を特異的に認 識することが確認された。しかしながら、それらのウェスタン反応性は弱く、そ れらの免疫染色性は弱かった。ＬＭＲ２ぺプチド４８９Ａおよび４９１Ａ（配列 ＩＤ番号：１９および２０）から誘導された抗ペプチド抗血清はウェスタンブロ ットはうまくいくが免疫沈降はうまくいかず、一方、ＬＭＲ２ペプチド４９４Ａ および４９７Ａ（配列ＩＤ番号：２１および２２）はウェスタンブロット、免疫 沈降および細胞染色でうまくいった。すべてのＬＭＲ２免疫試薬２３０ｋＤａ組 換え体蛋白質を認識し、４９７Ａペプチド抗血清はさらにウェスタンブロットで １３０ｋＤａバンドも検出した。 すべての発現構築物はウェスタンブロットおよび免疫沈降によりコードされて いる蛋白質を生成することが確認された。ヒト腫瘍細胞株のパネルはウェスタン ブロットにより内在性ＬＭＲ２の発現がスクリーニングされた。ウェスタンブロ ット分析はノーザンと一致し、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＣＯＬＯ２０５およびＭＣＦ ７細胞で最も高い内在性ＬＭＲ２発現が検出された。内在性蛋白質は〜２３０ｋ Ｄａに移動し（組換え体ＬＭＲ２と区別できない）、このｃＤＮＡが完全長ＬＭ Ｒ２をコードしていること、および蛋白質が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で異常 に遅い移動度を持っていることを支持した。これらの細胞株はＬＭＲ２の活性お よび生物学の特徴付けに有用であろう。 過渡的および安定にトランスフェクトされた２９３細胞中での組換え体ＬＭＲ ２の免疫局在化は、それが膜および小胞体の両方に会合していることを示唆して いる。Ｈ４４１細胞における内在性ＬＭＲ２の位置づけの評価は進行中である。 インビボおよびインビトロリン酸化アッセイは、ＬＭＲ２特異的抗血清による 免疫沈降に続いて、組換え体および内在性ＬＭＲ２について実施された。現在ま で、セリンおよびスレオニンリン酸化のみがＬＭＲ２に関して検出されている。 いくつかの異なった抗体すべてが同等の活性を検出し、活性はＬＫＲ２に付随し ていて抗血清の交叉反応性のためではないことを示唆している。しかしながら、 同等の量のリン酸化が”キナーゼを殺した”ＫからＡの構築物でも観察された。 これらの結果は、”キナーゼを殺した”構築物が未だに活性であるか、または活 性がＬＭＲ２に非常に強固に付随しているセリンキナーゼによるものであるかを 示唆している。異なったアッセイ条件下でのキナーゼ活性を再評価する（ｐＨ５ −８、ＡＴＰ濃度変化、および不可逆的ホスファターゼ阻害剤の存在）、および ＬＭＲ２がＡＴＰ類似ＦＳＢＡを結合できるかどうかを決定する実験が進行中で ある。 ＬＭＲ２特異的抗血清はまた、³⁵Ｓ−メチオニン／システインまたは³²Ｐ標識 溶解物からのＬＭＲ２に会合する基質またはコレセプターを同時免疫沈降するた めにも使用できる。ＬＭＲ２はそのような異常に短い細胞外ドメインを持ってい るので、付随するコレセプターの存在は可溶性または細胞外会合リガンドによる 調節を可能にしている。ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３間で保存されている アミノ酸配列中の潜在的チロシンリン酸化部位の存在のため、これらの蛋白質は 独特の特異的基質を持っているであろう。同時免疫沈殿、ランダムペプチドライ ブラリー、ファージディスプレイおよび酵母２ハイブリッド技術はすべてＬＭＲ ２−選択的基質を同定するための方法である。 ＬＭＲ１、ＬＭＲ２およびＬＭＲ３は、レセプターチロシンキナーゼに構造的 に相関したレセプターの新規ファミリーの輪郭を明瞭に示している。それらの固 有の触媒活性は未だに研究中であるが、これらはすべて、酵素のこの部類に典型 的に特徴付けられる別個のモチーフを共有している。加えて、これらは非常に短 い細胞外ドメインおよびＲＴＫ間では予想できない長さのＣ末端尾部を持ってい る。いくつかの保存されたＣ末端の潜在的チロシンリン酸化部位に加えて、これ らの構造的特色は、これらの生物学が他のレセプターの中でも独特であろうこと を示唆している。三つすべてのＬＭＲの成人神経組織に限られた発現、および広 範囲の腫瘍細胞株におけるＬＭＲ２のアップレギュレーションに基づくと、これ らの蛋白質は神経変性傷害または癌に重要な標的であるようである。進行中の実 験は、増殖速度、ＤＮＡ合成、細胞接触抑制（フォーカス形成）、足場非依存性 増殖（軟寒天アッセイ）およびヌードマウスにおける腫瘍発生性に対するそれら の効果、および細胞生存、アポトーシスまたは神経突起成育におけるそれらの役 割を特徴付けるであろう。さらに、優勢陰性構築物、中和抗血清またはアンチセ ンスオリゴヌクレオチドは、正常発育および疾患の両方で、種々の生物学的過程 におけるこれらの新規ＲＴＫの関与を扱う際に使用できる。 本発明は目的を成し遂げるおよび記述された結論および利点、ならびに本明細 書に固有のものを得るためによく適合していることを当業者は容易に理解するで あろう。分子複合体および本明細書に記載されている方法、過程、処置、分子、 特定の化合物は現在のところ好適な態様の代表であり、例示として示されている ものであり本発明の範囲を制限することは意図されていない。当業者により行わ れるであろうその中の変化およびその他の使用は本発明の精神に包含されており 、請求の範囲に定義されている。 当業者には、本発明の範囲および精神から離れることなく、本明細書に開示さ れている発明に種々の置換や修正が行えるであろうことが容易に明らかになるで あろう。 本明細書に述べられているすべての特許および出版物は、本発明が関係する当 業者の水準の指標である。すべての特許および出版物は、各々個々の出版物が特 別におよび個々に援用されることが示されるように、同じ程度で本明細書におい て援用される。 本明細書に例示的に記載されている本発明は、本発明に特に開示されていない 要素または制限なしで実行されるであろう。それ故、例えば、本明細書の各々の 例において、用語”から成る”、”本質的に成る”および”のみから成る”のど れもが他の二つの用語で置き換えられてもよい。用いられている用語および表現 は制限ではなく記述の用語として使用されており、そのような用語および表現の 使用は示され、記載された特色の均等物またはそれらの一部を排除することは意 図されておらず、請求された本発明の範囲内の種々の修正が可能であると認識さ れている。従って、本発明は好適な態様および随意の特色で特別に開示されてき たが、本明細書に開示した概念の修正および変形が当業者により行われるかもし れず、そのような修正および変形は添えられた請求の範囲により定義されるよう に本発明の範囲内に含まれると考えられることを理解しなければならない。 加えて、本発明の特色または様相はマーカッシュ群の用語で記載されてきたが 、当業者は本発明はまた任意の個々のメンバーまたはマーカッシュ群のメンバー のサブ群の用語でも記載されることを認識するであろう。例えば、もしＸが臭素 、塩素およびヨウ素から成る群より選択されると記載されるならば、Ｘが臭素で あるのに対する請求の範囲およびＸが臭素および塩素であるのに対する請求の範 囲は完全に記載されている。 前に本明細書で援用されていない参照文献（特許および非特許参照文献）もす べての目的のために特別に本明細書で援用される。他の態様は以下の請求の範囲 に含まれている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月２４日（１９９８．１２．２４） 【補正内容】 請求の範囲 １． 少なくとも２５ヌクレオチド長さの、精製された、単離された、または濃 縮された核酸分子であって、 前記核酸分子の配列はキナーゼをコードする遺伝子の一部と少なくとも９５％の 配列同一性を有するかまたはこれに相補的であり、 前記遺伝子は、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子からなる群より選択 される、 ことを特徴とする核酸分子。 ２． 前記核酸分子が、前記遺伝子の少なくとも５０個の連続するアミノ酸をコ ードする配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１記載の核酸分 子。 ３． 前記核酸分子が、前記遺伝子の少なくとも１００個の連続するアミノ酸を コードする配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２記載の核酸 分子。 ４． 試料中のキナーゼポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プ ローブであって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子 によりコードされていることを特徴とする核酸プローブ。 ５． 前記プローブが、前記核酸の一部に相補的な少なくとも２５ヌクレオチド 長さの配列を含む、請求項４記載の核酸プローブ。 ６． 前記プローブが、前記核酸の一部に相補的な少なくとも５０ヌクレオチド 長さの配列を含む、請求項５記載の核酸プローブ。 ７． ヒト組織において発現されるヒトポリペプチドをコードする、単離された または精製された核酸分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件における、配列番号１−９からなる群より選択されるヌクレオチド配列ま たはこれに相補的な配列の、前記ヒト組織からのｍＲＮＡへのハイブリダイゼー ションにより得ることが可能であり、 ハイブリダイゼーションが、６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、１×デンハルト溶 液、１００μｇ／ｍｌ変性ニシン精子ＤＮＡ中で、４２℃で一夜実施されること を特徴とする核酸分子。 ８． キナーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞 内で機能的な転写終止領域に転写的に連結された、細胞内で機能的な転写開始領 域を含む組換え核酸分子であって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれか に対応する遺伝子によりコードされることを特徴とする組換え核酸分子。 ９． 前記キナーゼポリペプチドが、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝 子によりコードされる前記キナーゼのアミノ酸配列を含む、請求項８記載の組換 え核酸分子。 １０． 単離された、濃縮されたまたは精製されたキナーゼポリペプチドであっ て、 前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子または遺伝子の一 部によりコードされ、 前記ポリペプチドは、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも２５個の連続す るアミノ酸を含む、 ことを特徴とするキナーゼポリペプチド。 １１． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも５０個 の連続するアミノ酸を含む、請求項１０記載のキナーゼポリペプチド。 １２． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１００ 個の連続するアミノ酸を含む、請求項１１記載のキナーゼポリペプチド。 １３． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼの全長アミノ酸配列を含む、請求項 １２記載のキナーゼポリペプチド。 １４． 前記ポリペプチドが、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子によ りコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１３記載のキナーゼポリペプチド。 １５． キナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体であって 、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子によりコードさ れる、ことを特徴とする抗体。 １６． キナーゼポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生す るハイブリドーマであって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応 する遺伝子によりコードされることを特徴とするハイブリドーマ。 【手続補正書】 【提出日】平成１１年７月７日（１９９９．７．７） 【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも２５ヌクレオチド長さの、精製された、単離された、または濃 縮された核酸分子であって、 前記核酸分子の配列はキナーゼをコードする遺伝子の一部と少なくとも９５％の 配列同一性を有するかまたはこれに相補的であり、 前記遺伝子は、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子からなる群より選択 される、 ことを特徴とする核酸分子。 ２． 前記核酸分子が、前記遺伝子の少なくとも５０個の連続するアミノ酸をコ ードする配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１記載の核酸分 子。 ３． 前記核酸分子が、前記遺伝子の少なくとも１００個の連続するアミノ酸を コードする配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２記載の核酸 分子。 ４． 少なくとも２５ヌクレオチド長さの、精製された、単離された、または濃 縮された核酸分子であって、 前記核酸分子の配列は、配列番号１−９またはこれに相補的な配列から選択され る配列の一部と少なくとも９５％の配列同一性を有する、 ことを特徴とする核酸分子。 ５． 試料中のキナーゼポリペプチドをコードする核酸を検出するための核酸プ ローブであって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝予 によりコードされていることを特徴とする核酸プローブ。 ６． 前記プローブが、前記核酸の一部に相補的な少なくとも２５ヌクレオチド 長さの配列を含む、請求項５記載の核酸プローブ。 ７． 前記プローブが、前記核酸の一部に相補的な少なくとも５０ヌクレオチド 長さの配列を含む、請求項６記載の核酸プローブ。 ８． ヒト組織において発現されるヒトポリペプチドをコードする、単離された または精製された核酸分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーショ ン条件における、配列番号１−９からなる群より選択されるヌクレオチド配列ま たはこれに相補的な配列の、前記ヒト組織からのｍＲＮＡへのハイブリダイゼー ションにより得ることが可能な核酸分子。 ９． キナーゼポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に相補的な配列および細胞 内で機能的な転写終止領域に転写的に連結された、細胞内で機能的な転写開始領 域を含む組換え核酸分子であって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれか に対応する遺伝子によりコードされることを特徴とする組換え核酸分子。 １０． 前記キナーゼポリペプチドが、配列番号１−９のいずれかに対応する遺 伝子によりコードされる前記キナーゼのアミノ酸配列を含む、請求項９記載の組 換え核酸分子。 １１． 単離された、濃縮されたまたは精製されたキナーゼポリペプチドであっ て、 前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子または遺伝子の一 部によりコードされ、 前記ポリペプチドは、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも２５個の連続す るアミノ酸を含む、 ことを特徴とするキナーゼポリペプチド。 １２． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも５０個 の連続するアミノ酸を含む、請求項１１記載のキナーゼポリペプチド。 １３． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくとも１００ 個の連続するアミノ酸を含む、請求項１２記載のキナーゼポリペプチド。 １４． 前記ポリペプチドが、前記キナーゼの全長アミノ酸配列を含む、請求項 １３記載のキナーゼポリペプチド。 １５． 前記ポリペプチドが、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子によ りコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１４記載のキナーゼポリペプチド。 １６． キナーゼポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体であって 、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応する遺伝子によりコードさ れる、ことを特徴とする抗体。 １７． 前記キナーゼポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくと も３個の連続するアミノ酸を含む、請求項１６記載の抗体。 １８． 前記キナーゼポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくと も２５個の連続するアミノ酸を含む、請求項１７記載の抗体。 １９． キナーゼポリペプチドに対する特異的結合親和性を有する抗体を産生す るハイブリドーマであって、前記キナーゼは、配列番号１−９のいずれかに対応 する遺伝子によりコードされることを特徴とするハイブリドーマ。 ２０． 前記キナーゼポリペプチドが、前記キナーゼのアミノ酸配列の少なくと も２５個の連続するアミノ酸を含む、請求項１９記載のハイブリドーマ。