JP2005287301A - 神経再生遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、アポトーシス、あるいは神経細胞の分化や増殖に関連する遺伝子の提供を課題とする。また、この遺伝子や、遺伝子によってコードされる蛋白質を用いた、該活性を調節する化合物の評価方法を提供することを課題とする。
【解決手段】アポトーシス、あるいは神経細胞の分化や増殖に関連する遺伝子として、HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子が同定された。この遺伝子は、細胞死、あるいは神経細胞の分化増殖を誘導する活性を有する蛋白質をコードする。これらの蛋白質の神経細胞分化誘導活性は強力である。
更に、これらの遺伝子、あるいは遺伝子によってコードされる蛋白質に基づいて、これらの活性を調節する活性を有する化合物の評価方法が提供された。
【選択図】なし
【解決手段】アポトーシス、あるいは神経細胞の分化や増殖に関連する遺伝子として、HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子が同定された。この遺伝子は、細胞死、あるいは神経細胞の分化増殖を誘導する活性を有する蛋白質をコードする。これらの蛋白質の神経細胞分化誘導活性は強力である。
更に、これらの遺伝子、あるいは遺伝子によってコードされる蛋白質に基づいて、これらの活性を調節する活性を有する化合物の評価方法が提供された。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシスを誘導する活性、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖の活性を有するアポトーシス関連因子、該因子をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを用いた該因子の製造方法、それらの製造に関わる発現系、該発現系を用いたアポトーシスを誘導する活性、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖の活性の検出方法、または該活性を制御する化合物の評価方法、並びに、該アポトーシス関連因子、または該因子をコードするポリヌクレオチドを有効成分とする細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。また、本発明は本発明のアポトーシス関連因子を認識する抗体、該抗体を用いた該因子の免疫学的測定法に関し、さらに、上記評価方法により得られる化合物を用いる細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス、またはプログラム細胞死とは生理的条件下で細胞自らが引き起こす細胞の死である。多細胞生物の生存においては、望ましくない、あるいは必要の無い細胞を生体から排除する機構が必要である。アポトーシスは、発生過程や細胞の世代交代において、不要となった細胞を排除するための予めプログラムされた細胞の死であると理解されていた。アポトーシスを起こした細胞では、核の収縮やDNAの断片化が観察され、膜を残したまま細胞が退縮する。生体中では、やがて退縮した細胞を貪食細胞が捕食し排除する。アポトーシスに対して、壊死と呼ばれる細胞死は細胞構造の破壊を伴う。したがって、細胞が自ら死滅していくアポトーシスは、しばしば、「きれいな細胞死」と呼ばれる。
【０００３】
その後、発生過程で観察される細胞死と同様の細胞死が、細胞の外から刺激によっても誘導されていることが知られるようになった。例えば、TNFやFasは、アポトーシスを誘導する代表的なサイトカインである。また、紫外線や放射線照射、細胞増殖因子の枯渇、ある種の癌遺伝子の活性化といった刺激によっても、アポトーシスは誘導される。自己免疫疾患や癌のような疾患も、アポトーシスの機能不全によって、有害な細胞を死滅させられなかった結果として理解されるようになった。
【０００４】
現在のところ、細胞が外界からの刺激に応答してアポトーシスに至る過程は、およそ次のように説明されている。即ち、様々な原因によって活性化されたCaspaseファミリーが細胞死をもたらすことが明らかにされている。Caspaseには基質特異性の異なる複数の酵素の存在が明らかにされており、一群のCaspaseを総称してCaspaseファミリーと呼んでいる。Caspaseファミリーは、基質特異性によって大きく３つのグループに分類されている。このうち、グループ２のCaspaseが、アポトーシスの実行に関与すると言われている。グループ３のCaspaseは、アポトーシス実行カスケードの上流において、細胞外からの刺激に応答して活性化され、より下流のグループ２のCaspaseを活性化する働きを持つ。一方グループ１のCaspaseは、サイトカインの生成と分泌を促進する作用を持つとされている。グループ２とグループ3に分類されるCaspaseと、それが認識するアミノ酸配列を以下に示す。
グループ２
Caspase-2 DEHD
Caspase-3 DEVD
Caspase-7 DEVD
グループ３
Caspase-6 VEHD
Caspase-8 LETD
Caspase-9 LETD
【０００５】
グループ３のCaspaseは、FasやTNFレセプターにリガンドが結合することにより活性化され、グループ２のCaspaseを切断して活性化し、より下流にシグナルを伝達する。このようなシグナルの伝達をアポトーシス実行カスケードと呼ぶ。アポトーシス実行カスケードの下流では、シグナルを伝達された様々な因子が、細胞死をもたらすための実行部隊として機能していることが推測される。
【０００６】
しかし、実際にどのような因子が細胞の死をもたらしているのかについては、解明すべき課題が多い。たとえば、ある種のCaspaseはヌクレアーゼ阻害因子ICAD(inhibitor of CAD)を分解する。その結果、ヌクレアーゼであるCAD(Caspase Activated DNase)の核への移行が可能となり、アポトーシスに特徴的な染色体DNAの切断を開始することが知られている(Enari M. et al.,Nature, 391 :43-50,1998)。
【０００７】
アポトーシスは神経系の発達においても重要な過程である（Johnson EM and Deckworth, Ann.Rev.Neurosci., 16: 31-46 (1993)；Oppenheim RW, Annu.Rev.Neurosci., 14: 453-501 (1991)；Raff MC et al., Science 262: 695-700 (1993)）。アポトーシスは物理的および環境的シグナルにより厳密に調節されている。インシュリン様成長因子I（IGF-I）等の成長因子によりアポトーシスは阻害され、それにより正常および異常な神経細胞の生存、並びに、増殖が調節される（D’Mello SR et al., J.Neurosci. 17: 1548-1560 (1997)；Rukenstein A et al., J.Neurosci. 11:2552-2563 (1991)；Schlessinger J et al., Neuron 9: 383-391 (1992)；Yao R and Cooper GM, Science 267: 2003-2006 (1995)）。
【０００８】
アポトーシス開始時の不全は、中枢および末梢神経系における腫瘍化の重要な機構の一つである（Fung K-M and Trojanwski JQ, J.Neuropathol.Exp.Neurol. 54: 285-297 (1995)；Yachnis AT et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol. 53: 61-71 (1994)）。神経変性疾患（White E, Genes Dev., 10: 1-15 (1996)；Friedlander RM and Yuan J, Cell Death and Differentiation 5: 823-831 (1998)；Jacobson MD, Curr.Biol. 8: R418-R421 (1998)；Tatton WG et al., J.Neural Transmission, Suppl.49:245-268 (1997)）および虚血性疾患（Choi DW and Rothman SM., Annu.Rev.Neurosci., 13: 171-182 (1990)）において起こる神経細胞死にもアポトーシスは関連していると考えられている。
【０００９】
神経細胞のアポトーシスに関連する遺伝子としては、AATYK（Apoptosis Associated Tyrosine Kinase）と呼ばれるマウスの遺伝子が脊髄前駆細胞から同定されている（Gaozza E. et al., Oncogene, 15: 3127-3135 (1997)）。AATYK遺伝子によりコードされる200kDaの蛋白質はN末端にチロシンキナーゼドメインを有し、C末端にプロリンに富み、最小SH3結合モチーフを構成する16 PXXPモチーフを有している。血球細胞のサイトカイン除去によるアポトーシス時に、AATYKの発現が強く誘導されることが報告されている。
【００１０】
AATYK遺伝子の発現は、脊髄前駆細胞の生育抑制および／またはアポトーシスの誘導に不可欠と考えられている。AATYK蛋白質は脳で特に多く発現されており、神経分化に伴い発現は増加することが知られている（Baker SJ et al., Oncogene, 20: 1015-1021 (2001)；Tomura M et al., Oncogene, 20: 1022-1032 (2001)）。また、AATYKは核膜近くの細胞質中に存在する酵素的に活性な非受容体キナーゼであり、過剰発現によりアドレナリン作動性神経芽腫SH-SY5Y細胞等の細胞の分化を誘導し、そして、レチノイン酸（RA）、12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート、およびIGF-I等により誘導される神経細胞分化を促進することが知られている（Raghunath M et al., Molecular Brain Res. 77: 151-162 (2000)）。
【００１１】
このように、アポトーシス実行カスケードを構成する因子には、アポトーシスの実行、および神経系の発達／分化において重要な働きを持つ分子が多く存在すると考えられる。これらの因子は、アポトーシスの制御、および神経系の発達／分化において重要な標的となる可能性がある。
【００１２】
また最近では、神経細胞の抗アポトーシス活性と、サイクリックAMP(cAMP)応答配列(CRE;cAMP responsive element)に結合する転写因子(CREB；cAMP responsive element binding protein)の活性上昇との結びつきが示唆されている。CREBは、cAMP依存性プロテインキナーゼによりSer133がリン酸化され活性化する。
その他、アメフラシやラットの行動記憶についての実験結果より、CREBのリン酸化が記憶形成において重要であることが知られている（Silvia AJ et al., Annu.Rev.Neurosci. 21: 127 (1998)）。また、アルツハイマー型痴呆では、脳内のリン酸化CREBの量が有意に減少している（Yamamoto-Sasaki M et al., Brain Res. 824: 300-303 (1999)）。以上のことよりCREB活性の上昇が記憶形成と関連することも示唆されている。CREBの転写活性の上昇を通じて記憶・神経変性を改善し、幅広い神経疾患に対する治療効果が期待できる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アポトーシス、あるいは神経細胞の分化や増殖に関与する遺伝子を同定することである。また本発明は、このような機能を有する遺伝子を用いた、アポトーシスを誘導する活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する化合物の評価方法の提供を課題とする。これらの遺伝子そのもの、あるいはこれらの活性を制御する化合物は、神経細胞の増殖、または細胞死に関連する疾患に対する治療効果が期待できる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウスAATYKのキナーゼドメインと構造的に類似するモチーフを有する２つの蛋白質を同定した。両者のアミノ酸配列には共通する領域が見出され、オルタナティブスプライシングフォームであると考えられた。これらの蛋白質のうち、一方は本発明者らによって見出された新規なアミノ酸配列からなる蛋白質であった。他方は、既に構造が明らかにされている遺伝子によってコードされているが、その機能は明らかにされていない。
【００１５】
次に本発明者らは、これらの蛋白質がアポトーシス誘導活性を有することを確認した。また本発明者らは、これら蛋白質の神経細胞への作用を解析した。その結果、これらの蛋白質が、アポトーシス誘導作用に加えて、神経細胞の分化や増殖を強力に誘導することを有することを見出した。更にAF06972は、脳における発現が高く、神経細胞との密接な関連性が示された。
【００１６】
これらの知見に基づいて、前記蛋白質、あるいはそれをコードする遺伝子を用いて、候補物質の、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する作用を検出しうることを明らかにし、本発明を完成した。更に本発明者らは、この検出方法に基づいて、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する作用を有する化合物の評価方法を確立した。
【００１７】
すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。また本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記蛋白質の、検出方法や用途に関する。
更に本発明は、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞分化増殖活性を有する蛋白質を用いた、これらの活性を調節する活性の検出方法に関する。加えて本発明は、前記検出方法に基づく、これらの活性を調節する活性を有する化合物の評価方法に関する。また本発明は、前記評価方法によって得ることができる化合物の用途に関する。
〔１〕下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔２〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕配列番号：５から選択された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔４〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔５〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔６〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔７〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔８〕〔７〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔５〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔９〕配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１５塩基の長さを有するポリヌクレオチド。
〔１０〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体。
〔１１〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を認識する抗体。
〔１２〕〔５〕に記載の蛋白質と、該蛋白質を認識する抗体の免疫学的な反応を観察する工程を含む、〔５〕に記載の蛋白質の免疫学的測定法。
〔１３〕次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞のアポトーシスを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程
〔１４〕次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔１３〕に記載の方法によって候補物質のアポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記細胞のアポトーシスを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１５〕次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する方法。
（１）候補物質の存在下、配列番号：１、または、配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを発現させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシス、神経細胞の分化、及び、神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する工程。
〔１６〕次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質を評価する方法。
（１）〔１５〕に記載の方法によって、候補物質のアポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１７〕次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する神経細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）神経突起の伸展が誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞の神経突起の伸展を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、神経細胞の分化および／または増殖を抑制、または促進する活性を検出する工程
〔１８〕次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔１７〕に記載の方法によって候補物質の神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１９〕細胞増殖、または細胞死の制御における〔１４〕、または〔１６〕に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
〔２０〕〔１４〕、または〔１６〕に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
〔２１〕神経細胞の分化および／または増殖の制御における、〔１６〕、または〔１８〕に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
〔２２〕〔１６〕、または〔１８〕に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、神経細胞の増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
〔２３〕細胞増殖、または細胞死の制御における〔５〕記載の蛋白質、または〔１〕〜４に記載のポリヌクレオチドの使用。
〔２４〕下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、細胞増殖、細胞分化、または細胞死によって特徴付けられる疾患の治療剤。
（ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔２５〕以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖が調節されたモデル動物。
(ａ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(ｂ)配列番号:１、または配列番号:３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｃ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｄ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
〔２６〕生体試料中のアポトーシスマーカーを測定し、該アポトーシスマーカーの測定レベルの上昇をアポトーシスと関連付ける工程を含むアポトーシスの検出方法であって、アポトーシスマーカーが次の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔２７〕次の工程を含む、劇症肝炎の診断方法。
（１）〔２６〕に記載の方法によって、肝細胞を生体試料としてアポトーシスを検出する工程、および
（２）工程（１）においてアポトーシスが検出された場合に、劇症肝炎が進行していると判定する工程
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、既に塩基配列が報告されているマウスチロシンキナーゼAATYK遺伝子の情報に基づいて、かずさDNA研究所のヒト脳組織由来のDNAデータベースからヒトAATYKと思われる次のクローンを見出した。
HJ06941 (KIAA1078、GenBank Acc.No. AB029001)
【００１９】
更に、この遺伝子の塩基配列情報、並びに翻訳アミノ酸配列情報を利用して、チロシンキナーゼドメインにおいて、４１%の相同性を示す次のクローンを見出すことに成功した。
HJ06972 (KIAA1079、GenBank Acc.No. AB029002)
ヒトAATYK遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼは、1317残基のアミノ酸により構成されているのに対し、HJ06972遺伝子によりコードされる蛋白質は、1451残基のアミノ酸より構成されていた。HJ06972遺伝子にコードされる蛋白質もAATYKと同様にN末端部分にキナーゼドメインを有し、C末端にはSH3リガンドドメインを有していた（図１）。HJ06972の塩基配列を配列番号：１に、そのアミノ酸配列を配列番号：２に示した。この塩基配列とアミノ酸配列は、HJ06972(KIAA1079)として、かずさDNA研究所において構造が明らかにされている。しかしその機能についてはなにも解明されていない。
【００２０】
本発明のAF06972遺伝子は、上記HJ06972遺伝子のホモローグ遺伝子の検索過程において見出された。本発明者らは、既に塩基配列が明らかにされているHJ06972遺伝子の塩基配列情報を利用して、ESTの塩基配列をアセンブルした。その結果、HJ06972に対して94bpからなる挿入配列を有する遺伝子の存在が疑われた。本発明者らは、この挿入配列を有する遺伝子を探索し、AF06972遺伝子を見出した。更に、マウスやラットにおけるAF06972遺伝子のホモローグの存在も確認し、AF06972が新規な遺伝子であることを確認した。マウスやラットにおけるAF06972遺伝子のホモローグの存在は知られていない。
AF06972遺伝子は、HJ06972遺伝子の塩基配列中の第4623番目に94塩基が挿入された塩基配列からなる。挿入塩基配列によって、AF06972遺伝子がコードするアミノ酸配列には、フレームシフトが生じている。その結果、C末端部位においてAF06972遺伝子によりコードされる蛋白質の方がHJ06972遺伝子によりコードされる蛋白質よりも49アミノ酸残基長くなっている。したがって、HJ06972遺伝子に対してAF06972遺伝子は新規な遺伝子と言うことができる。もちろん、AF06972によってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質も新規であることは言うまでも無い。
【００２１】
また、マウスAATYKとの比較では、AF06972の方がHJ06972よりも相同性が高いことが判明した（図２）。ヒトAATYKとAF06972とは、配列で20数％のホモロジーを有し、そのキナーゼドメインについては41％のホモロジーが認められた。本発明は、以下に示す約4.8kbの遺伝子、および該遺伝子によりコードされる1503アミノ酸残基からなる蛋白質を提供する。AF06972の塩基配列を配列番号：３に、そのアミノ酸配列を配列番号：４に示した。
【００２２】
また、本発明には、配列番号：４に示したアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がアポトーシス誘導活性を持つ場合、または神経突起を伸展させる活性を有する場合、その蛋白質は本発明の活性型の蛋白質と機能的に同等であると言うことができる。
あるいは、なんらかのプロセスを経てアポトーシス誘導活性、または神経突起伸展作用を持った活性型の蛋白質を生成し得る蛋白質は、本発明の蛋白質と機能的に同等である。不活性型の蛋白質から活性型の蛋白質を生成するためのプロセスは限定されない。
【００２３】
本発明においては、同一の蛋白質がアポトーシス（細胞死）を誘導する活性を示すと同時に、神経細胞に対しては分化や増殖を誘導する活性を示す。これらの機能は、逆の作用のようにも思われる。アポトーシスに関連すると考えられているキナーゼの中には、AATYK(HJ03494)やASK-1などがある。これらのキナーゼは、過剰発現によってアポトーシスを誘導する一方、神経突起の伸展にも関与している。いずれの活性がもたらされるのかは、シグナルの強さと持続時間に大きく影響を受けると考えられている。
HJ06972やAF06972についても、本発明者らによって新たに同様の活性が見出された。すなわちこれらの蛋白質は、神経突起伸展作用とともに、過剰発現によるアポトーシスの誘導作用を有するものと考えられた。したがって、この種のキナーゼ活性を有する蛋白質には、発現レベルの調節等の機構を通じて、神経細胞死のみならず神経細胞の再生につながるような作用が期待される。
【００２４】
アポトーシス誘導活性は、例えば実施例に記載したように、当該蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物細胞に発現させ、その細胞のアポトーシスを観察することによって確認することができる。アポトーシスは、細胞の形態学的な変化や、染色体DNAの切断を指標として確認することができる。また、神経突起伸展作用は、例えば実施例に記載したように、当該蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物の神経系の株細胞に発現させ、その細胞の神経突起の伸展を観察することにより確認することができる。
【００２５】
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法を利用して調製することができる。変異の導入方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を示すことができる。また、このような蛋白質は自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（配列番号：２、または４）において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加等により異なる蛋白質も含まれる。蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００２６】
また、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4)を用いて本発明の蛋白質をコードする塩基配列（配列番号：１、または配列番号：３）またはその一部をもとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、このポリヌクレオチドから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行い得ることである。本発明には、本発明の蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も含まれる。
【００２７】
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常は洗浄のための条件として「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.1xSSC、0.1% SDS、65℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待し得る。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ストリンジェンシーに影響を与えるその他の条件として、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間などを示すことができる。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号：４に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列または該蛋白質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、90％以上）の配列の同一性を指す。相同性の特定は、BLAST2検索アルゴリズム(Altschul, S.F. et al, 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.)を用いて決定することができる。
【００２８】
また、遺伝子増幅技術（PCR）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）を用いて、本実施例において同定された塩基配列（配列番号：１、または３）の一部をもとにプライマーを設計し、これら塩基配列またはその一部と相同性の高いDNA断片を単離して、これをもとに本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。本発明の蛋白質、並びに本発明における機能的に同等な蛋白質は、後に述べるような、当該蛋白質の機能を修飾する化合物の評価方法に用いることができる。またこれらの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、当該蛋白質の製造、発現状態を知るためのプライマーまたはプローブとして有用である。
【００２９】
あるいは本発明は、本発明の蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、その発現によって細胞がもともと備えている内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。例えば、本発明のアポトーシス関連因子におけるキナーゼドメイン、SH3リガンドドメイン等、該蛋白質の活性に影響すると考えられる配列に相当する部分のアミノ酸配列を改変すれば、アポトーシス誘導活性や神経突起伸展作用を有さない不活性体を得ることができると考えられる。このようなアミノ酸配列をコードする遺伝子を細胞内に発現させれば、本発明のアポトーシス関連因子の発現をドミナントネガティブ効果(不活性型の拮抗阻害)により抑制することができる。従って、ウイルスベクター等の遺伝子導入技術によって、不活性体遺伝子を細胞に導入発現させることで、アポトーシスの進行を阻害したり、神経細胞の分化および／または増殖を抑制したりすることが可能となる。
【００３０】
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対する抗体を得るための免疫原として有用である。特に、他の蛋白質との相同性が低い、本発明の蛋白質に固有のアミノ酸配列を含む部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対して特異性の高い抗体を与える免疫原として期待される。このようなアミノ酸配列として、配列番号：６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明の部分ペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは9アミノ酸以上、より好ましくは12アミノ酸以上、より好ましくは15アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造する。
【００３１】
また本発明は、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記いずれかの発現ベクターを保持する形質転換体、並びにその形質転換体を培養し、その培養物から本発明の蛋白質を単離することからなる、本発明の蛋白質、或いはその部分ペプチドの製造方法に関する。さらに本発明は、上記の方法で製造された蛋白質、或いはその部分ペプチドを提供する。
遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で発現された前駆体ポリペプチドの末端(Ｎ−末端および／またはＣ−末端)アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の蛋白質の範囲に含まれることは、当業者ならば容易に理解し得ることである。
【００３２】
下記実施例には、発現ベクターとして哺乳類動物細胞内で機能するベクターの構築例のみが示されている。しかしながら、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが開示されている結果、これらに基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に導入したとき、該宿主に本発明の蛋白質を発現、産生させ得る発現ベクターを構築することは当業者にとって容易である。従って、本発明は、本発明の核酸配列に基づき、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクターをも包含する。
【００３３】
本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌[大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)]および真核性の酵母[例えばパン酵母菌(Saccaromyces cerevisiae)]がある。また、哺乳類細胞には培養ヒト細胞および培養動物細胞が含まれる。さらには培養植物細胞も用い得る。
微生物の例としてはエシェリキア属に属する細菌やパン酵母がある。より具体的には、例えば次のような菌株を微生物宿主として挙げることができる。
エシェリキア属に属する細菌
E.coli HB101(ATCC 33694)
E.coli HB101-16(FERM BP-1872)
E.coli MM294(ATCC 31446)
E.coli DH1(ATCC 33849)等
パン酵母
S.cerevisiae AH22(ATCC 38626)等
哺乳動物細胞の例としてはヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、マウスＬ９２９細胞およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー(ＣＨＯ)細胞等がある。
【００３４】
通常、原核生物である細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよび自己複製可能ユニットから構成される。真核生物、即ち酵母や哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが好ましい。さらにエンハンサー配列、本発明の蛋白質の５'−および３'−非コード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
【００３５】
上記の自己複製可能単位は、形質転換体の選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性)を含有していることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペレーターおよびシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列(例えばＡＡＧＧ等)からなるプロモーター・オペレーター領域を意味する。そのようなプロモーターの例としては、慣用のプロモーター・オペレーター領域が挙げられる。具体的には、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、あるいはtrp−プロモーター等を示すことができる。酵母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモーターの例としてはpho５プロモーターが挙げられる。更に、精製を容易に行うことを目的として、金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性アミノ酸を、本発明の蛋白質におけるいずれかの末端に付加することができる。塩基性アミノ酸を付加する場合には、希望のアミノ酸をコードする塩基配列が連続した塩基配列を5'側に付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行えば、目的とする遺伝子の任意の末端に、オリゴペプチドを付加することができる。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、あるいはアルギニンなどを用いることができる。
【００３６】
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス・メタロチオネインI(ＭＭＴ)−プロモーター等が挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニンコドン(ＡＴＧ)が挙げられる。
【００３７】
終止コドンの例としては慣用されている終止コドン(例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等)が挙げられる。自己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクターの全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製し得るＤＮＡ配列であって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミド、および合成プラスミドが挙げられる。人工的に修飾したプラスミドには、例えば天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片等が含まれる。そのようなプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドpＢＲ３２２やその人工修飾体が挙げられる。人工修飾体とは、たとえばpＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られたＤＮＡ断片等を示すことができる。また酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、pＪＤＢ２１９、pＪＤＢ２０７等が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとしては、例えばプラスミドpcDNA3.1（Invitrogen）pＭＭ３２４、プラスミドpＳＶ２dhfr ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドpＳＶ２neo ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。
エンハンサー配列としては、例えばＳＶ４０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙げられる。
【００３８】
本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって得ることができる。或いは、ヒトcDNAライブラリーより、配列番号：３に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得することができる。更に、ゲノムＤＮＡを常法通り処理することによって、本発明の蛋白質をコードするゲノムDNAを調製することができる。ゲノムDNAの処理方法としては、例えば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション等の工程を含む処理方法を示すことができる。更にこのようにして取得したゲノムDNAを利用し、ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を明らかにし、より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサー等の制御領域は、本発明の蛋白質の発現異常を検出するための標的領域として有用である。或いは、これらの領域を標的とするデコイ核酸医薬などにより、発現制御を実現することができる。
【００３９】
本発明の実施に必要な、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収等の操作は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法[Molecular Cloning 2nd. edition, J.Sambrook et.al,Cold Springs Harbor Laboratory (1989), DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985)他、Molecular Cloning 3rd. edition,J.Sambrook et.al,Cold Springs Harbor Laboratory (2001)]に準じて行なうことができる。
また、本発明の宿主細胞には、本発明のアポトーシス関連因子の機能解析やこの蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤の評価方法のために用いる目的の細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法等の方法で行うことが可能である。形質転換体からの本発明の蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。
【００４０】
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T（A:U）、G:Cの塩基対からなる2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするDNAやRNAを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的である必要があるが、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００４１】
特に、配列番号：３に示す塩基配列のうち、配列番号：５に記載された塩基配列を含む領域、またはその相補配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、AF06972を特異的に検出するためのプローブ、あるいはプライマーとして有用である。
あるいは、配列番号：３に示す塩基配列のうち、配列番号：５に記載された塩基配列からなる領域を増幅することができるプライマーは、HJ06972とAF06972の両方を１組のプライマーによって増幅することができる。しかも当該プライマーによって得られる増幅生成物には、HJ06972とAF06972とでは配列番号：３の構成塩基数である９４bpの相違が生じる。したがって、このようなプライマーを用いることにより、HJ06972とAF06972とを区別して検出、あるいは確認することができる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質の異常を検査・診断するために利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCRにより、発現異常を検査することができる。また本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ゲノムDNA-PCRやRT-PCRを実施することができる。更に、本発明の蛋白質をコードする遺伝子やその発現制御領域を増幅し、RFLP解析、SSCP、シークエンシング等の方法により、配列の異常を検査・診断したりすることができる。
【００４３】
また、本発明のアポトーシス関連因子（AF06972）は神経再生、脳梗塞治療、神経軸索再生、神経軸索伸展に用いることができることから、該因子をコードするポリヌクレオチドを、該因子が関連する疾患の遺伝子治療に用いることも可能である。即ち、宿主の疾患部位において適切に発現されるよう該ポリヌクレオチドを導入することにより、本発明のアポトーシス関連因子を発現させ、該因子が関連する疾患を治療・予防することが可能である。本発明において「発現」とは、転写および/または翻訳が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを用いた発現の解析により、遺伝子の転写レベルでの発現を検査・診断することができる。また、後述の本発明の蛋白質に対する抗体を用いれば、遺伝子の翻訳レベルでの発現を検査・診断することができる。
【００４４】
本発明におけるHJ06972あるいはAF06972は、いずれもアポトーシスに密接に関連する蛋白質をコードする遺伝子である。たとえば、人為的にアポトーシスを誘導した血液細胞では、これらの遺伝子の発現レベルがアポトーシスの進行にともなって増強される。したがって、生体試料中のこれらの遺伝子の発現レベルは、アポトーシスの進行状態の診断指標として有用である。たとえば、劇症肝炎のような急激なアポトーシスの進行が見られる疾患においては、HJ06972あるいはAF06972の発現レベルの急激な上昇を診断指標とすることができる。
【００４５】
加えて本発明は、生体試料中のアポトーシスマーカーを測定し、該アポトーシスマーカーの測定レベルの上昇をアポトーシスと関連付ける工程を含むアポトーシスの検出方法であって、アポトーシスマーカーが次の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法を提供する。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
【００４６】
AF06972遺伝子は脳以外の組織においては恒常的な発現は見られない。他方、アポトーシスを起こした細胞では短時間のうちに、AF06972遺伝子の発現レベルが上昇する。たとえばマウスの細胞を用いた実験においては、血液細胞のアポトーシスの誘導に伴って、AATYKあるいはAF06972の発現レベルが急激に上昇している。したがって、AATYK、AF06972、あるいはこれと機能的に同等な遺伝子をアポトーシスマーカーとして測定することによって、アポトーシスを検出することができる。
【００４７】
本発明におけるアポトーシスマーカーは、前記（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である。特定の構造を有するポリヌクレオチドや蛋白質を測定する方法は公知である。たとえば、塩基配列が明らかなポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションやPCRを利用することによって、その量を測定することができる。また、アミノ酸配列が明らかな蛋白質は、その蛋白質を認識する抗体を利用したイムノアッセイによって測定することができる。更に蛋白質が有する生化学的な活性を指標として、蛋白質の量を測定することもできる。
【００４８】
アポトーシスマーカーの測定値は、通常、健常者の測定レベルと比較される。複数の健常者の生体試料についてアポトーシスマーカーを測定し、統計学的な手法によって標準値を設定することができる。被検者の測定値が標準値を越える場合には、該被検者はアポトーシスを有すると判定される。
【００４９】
本発明の検出方法において、生体試料とは、生体から採取されるあらゆる試料を用いることができる。具体的には、血液、尿、あるいは各種臓器の生検試料等を示すことができる。特に、生検試料におけるアポトーシスマーカーの発現レベルの上昇は、その組織におけるアポトーシスの証明となる。また、血液中のアポトーシスマーカーのレベルの上昇は、生体内におけるアポトーシスの進行を反映している。
本発明のアポトーシスの検出方法に基づいて、劇症肝炎の診断方法が提供される。本発明の劇症肝炎の診断方法は、次の工程を含む。
（１）本発明のアポトーシスの検出方法によって、肝細胞を生体試料としてアポトーシスを検出する工程、および
（２）工程（１）においてアポトーシスが検出された場合に、劇症肝炎が進行していると判定する工程
【００５０】
また、「配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド」には、本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。一方、本発明におけるアンチセンスとは、配列番号:２または配列番号:４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現を抑制するポリヌクレオチドを意味する。即ち、このような活性を有するアンチセンスは、CREBの脱リン酸化を抑制し、CREBの脱リン酸化反応の阻害剤、または、記憶・神経変性疾患の治療若しくは予防剤として用いることができる。
【００５１】
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスDNAでもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスDNAは、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、通常、3000bp以内、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。該アンチセンスDNAを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の適当なベクターにアンチセンス方向に挿入して用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０bp以上、通常１００bp以内、好ましくは２０bp以上、５０bp以内の鎖長を有する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号:１または配列番号:３に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオエート法（Stein "Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides." Nucleic Acids Res. 16:3209-3221 (1988)）等により調製することが可能である。
【００５２】
このようなアンチセンスには、配列番号:２または配列番号:４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の異常に起因する疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。本発明の蛋白質の異常には、蛋白質の機能異常や発現異常などが含まれる。遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ex vivo法やin vivo法等により患者へ投与することができる。具体的には、虚血性疾患による組織の障害においてはアポトーシスが重要なステップとなっている。従って、血流障害を起こした組織における本発明の蛋白質の発現を阻害できれば、虚血性疾患に伴う組織損傷を軽減することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与することができる。
【００５３】
本発明は、また、配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体を提供する。配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基には、たとえば配列番号：６に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる抗原決定基が含まれる。このほか、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、配列番号：６に記載のアミノ酸配列とそれに隣接するアミノ酸配列とで構成される抗原決定基を認識する抗体は、本発明の抗体に含まれる。更に、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる領域によって構成される、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の立体構造からなる抗原決定基を認識する抗体も、本発明に含まれる。配列番号：６に記載のアミノ酸配列は、本発明者らが見出した新規遺伝子AF06972に固有のアミノ酸配列である。したがって、この領域を特異的に認識することができる本発明の抗体は、AF06972によってコードされる蛋白質の検出や精製に有用である。。
【００５４】
本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを家兎に免疫することにより得ることが可能である（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12〜11.13）。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを用いてマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4〜11.11）。
【００５５】
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞等から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療等の目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice, Mendez, M.J. et al.(1997) Nat.Genet.15:146-156」参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる(Methods in Enzymology 203, 99-121(1991))。
【００５６】
本発明は、次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を検出する方法に関する。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞のアポトーシスを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程。
【００５７】
前記検出方法において、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、対象となる蛋白質がアポトーシス誘導活性を持つことを言う。当該活性は先に述べた方法により確認することができる。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞としては、本発明の蛋白質の発現によりアポトーシスが引き起こされる細胞であれば真核細胞または原核細胞のいずれをも用いることが可能である。好ましくは動物細胞が用いられ、中でもPC12のような神経細胞が好ましい。
【００５８】
前記検出方法において、アポトーシスが誘導される条件とは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質が細胞内で発現される条件である。本発明の蛋白質の細胞中での発現はアポトーシスに直結するので、そのままでは効率的なスクリーニングが期待できない。そこで、制御可能なプロモーター配列の下流に本発明の蛋白質をコードする遺伝子を結合させた発現プラスミドを利用することができる。制御可能なプロモーターとしては、例えばメタロチオネインプロモーター等を示すことができる。このようなプロモーターの制御下に本発明の活性型蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドを細胞に形質転換する。このようにして得られた形質転換体は、プロモーターを活性化させた条件下でアポトーシスが引き起こされる。
【００５９】
前記細胞のアポトーシスを測定する工程では、細胞の形態の変化やDNAの断片化を指標として検出する方法を採用することが一般的である。アポトーシスによる細胞の形態学的な変化は、ギムザ染色や蛍光染色の染色像の変化として観察される。あるいはDNAの断片化は、TUNEL法(Gavriel Y rt al, 1992 J Cell Biol, 119:493-501)によって検出することができる。さらに、初期のアポトーシスを検出する方法として、構造変化した細胞膜に結合する蛍光標識Annexin Vとフローサイトメーターで測定するAnnexin V法等がある(Vermes I,et al. J Immunol Methods. 1995 Jul 17;184(1):39-51.)。
【００６０】
前記アポトーシスを制御する活性の検出方法は、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって候補物質のアポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記細胞のアポトーシスを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００６１】
あるいは本発明は、次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する方法に関する。
（１）候補物質の存在下、配列番号：１、または、配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを発現させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシス、神経細胞の分化、及び、神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する工程。
【００６２】
前記検出方法において、配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域は、染色体DNAから公知の方法によってクローニングすることができる。たとえばS1マッピング法が転写開始点の特定方法として公知である（「転写調節領域の単離」および「転写制御因子の同定と精製」、「細胞工学 別冊8 新細胞工学実験プロトコール」、東京大学医科学研究所制癌研究部編 秀潤社1993年、p362-374）。一般に当該遺伝子の発現制御領域DNAは、ヒト染色体ライブラリー (genomic library) を、当該遺伝子の5'末端の１５〜１００bp、好ましくは３０〜５０bpをプローブDNAに用いてスクリーニングすることにより、発現制御領域を含む遺伝子クローンとしてクローニングされる。
【００６３】
このようにして得られたクローンはしばしば１０kbp以上の当該遺伝子の5'非翻訳領域を包含している。そこで、これらのクローンの5'末端をエキソヌクレアーゼ処理などによって短縮化、あるいは断片化する。短縮された発現制御領域を含む配列でレポーター遺伝子の発現の強さや発現の制御についての評価を行うことによって、発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を得ることができる(deletion study)。
【００６４】
また、遺伝子の発現制御領域をNeural Network を用いて予測するプログラムが公知である(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, Reese, M.G.,et al, "Large Scale Sequencing Spesific Neural Networks for Promoter and Splice Site Recognition" Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, edited by Lawrence Hunter and Terri E. Klein , World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996)。あるいはPromoter Scanのような転写因子結合配列を検索して発現制御領域を予測するプログラムを用い活性の最小単位を予測することも行われている(http://biosci.cbs.umn.edu/software/proscan/promoterscan.htm, Prestridge, D.S. 1995, Prediction of Pol II Promoter Sequence using Transcription Facter Binding Sites. J. Mol. Biol. 249: 923-932)。また、予測されたコアの部分を中心にdeletion studyを実施することもできる。
【００６５】
このようにして単離された本制御領域遺伝子の下流に、レポーター遺伝子を機能的に結合させた発現ベクターは、アポトーシス、神経細胞の分化、あるいは神経細胞の増殖を制御する活性の検出に用いることができる。本発明において、機能的な結合とは、前記発現制御領域の活性化によって、レポーター遺伝子の転写が開始されるように両者を結合することを意味する。レポーター遺伝子には、前記発現制御領域の活性化を遺伝子の発現として観察することができる蛋白質をコードするものであれば任意の遺伝子を利用することができる。具体的には、例えばルシフェラーゼ、カタラーゼ、βガラクトシダーゼ、GFP（Green Fluorescent Protein）等の遺伝子がレポーター遺伝子として一般に用いられる。ベクターを導入する細胞には、例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞を用いることができる。
【００６６】
上記ベクターを導入した細胞は、細胞死（アポトーシス）、または細胞の分化／増殖を引き起こすような条件下でプロモーターが活性化され、レポーター遺伝子によるシグナルを生成する。得られた細胞を96ウエルマルチプレートに播種し、アポトーシス、または細胞の分化／増殖を引き起こす条件下で培養を開始する。このとき評価すべき化合物を各ウエルに加えることにより、当該遺伝子の発現制御領域に作用して、発現を抑制する、あるいは促進する活性をレポーター遺伝子を指標として容易に検出することができる。
【００６７】
例えば、レポーター遺伝子としてGFPを用いた場合、候補物質を加えた状態および加えない場合でのGFPの発光量の比較を行うことにより、発現制御領域に対する影響を評価することができる。比較にあたっては、たとえば２倍以上若しくは１／２以下、好ましくは５倍若しくは１／５以下、より好ましくは１０倍以上若しくは１／１０以下の発光量比を示す場合に、有意な差があると判定することができる。本方法は動物細胞ばかりでなく同様なシステムで細胞死、または細胞の分化／増殖を引き起こすような宿主であれば、真核生物・原核生物を問わず応用することができる。このとき、細胞はレポーター遺伝子が発現可能な条件下で培養される。
【００６８】
また、レポーター遺伝子を含む前記発現ベクターは、in vitroの実験系において用いることもできる。すなわち、in vitro蛋白質合成に必要とされる無細胞抽出液に、本発現ベクターとともに、緩衝液、アミノ酸、エネルギー源であるATPおよびGTPを供給し、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の阻害または促進を検定することができる。本方法で用いる無細胞抽出液としては、動物神経細胞と同様なシステムにより細胞死、または、細胞の分化／増殖を引き起こすような宿主由来のものを用いることができる。
ここで、アポトーシスを引き起こすような条件、細胞の分化／増殖を引き起こすような条件とは、前記発現制御領域からの指令によりレポーター遺伝子の発現が誘導される条件を言う。
【００６９】
前記アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性の検出方法は、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって、候補物質のアポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００７０】
加えて、本発明は次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性の検出方法に関する。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）神経突起の伸展が誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞の神経突起の伸展を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、神経細胞の分化および／または増殖を抑制、または促進する活性を検出する工程。
【００７１】
前記検出方法において、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、対象となる蛋白質が神経細胞の分化および／または増殖活性を持つことを言う。当該活性は、神経細胞の分化および／または増殖を指標として行われる。例えば、PC12細胞等の神経細胞における神経突起伸展作用を検出することにより行うことができる。
【００７２】
前記検出方法は、例えば次のようにして実施することができる。HJ06972遺伝子若しくはAF06972によりコードされる蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を発現するように作成されたPC12等の細胞に対し候補物質を接触させる。このとき、細胞を可視化できる蛋白質を発現させるように形質転換した細胞を用いると観察が容易となる。このような蛋白質としては、GFPを用いることができる。その後、神経細胞の数や分化の変化を観察することにより、目的とする活性を検出することができる。細胞の分化は神経突起の進展などを指標として評価することができる。
【００７３】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞としては、本発明の蛋白質の発現により分化および／または増殖が引き起こされる神経細胞であればいずれの細胞を用いることが可能である。好ましくはPC12等のクローン化された神経細胞株が用いられる。
前記検出方法において、神経突起の伸展が誘導される条件とは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質が細胞内で発現される条件である。
【００７４】
前記神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性の検出方法は、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって候補物質の神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００７５】
本発明の評価方法に用いる候補物質は特に制限されない。具体的には、たとえば細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等が挙げられる。あるいは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を認識する抗体も、スクリーニングに用いる候補物質として有用である。一方、本発明の評価方法における対照には、本発明の蛋白質の機能、または発現レベルに影響を与える（もしくは与えない）ことが判明している化合物を用いることができる。
更に、本発明における蛋白質の活性を調節する活性の検出方法には、機能的に同等な蛋白質を利用することができる。たとえば、HJ06972に対してAF06972は、アミノ酸配列レベルで約90%の相同性を備えている。このことは、これらの蛋白質と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質が、いずれも同様の活性を有していることを裏付けている。したがって、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列に対して、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質は、本発明による活性の検出方法において、好ましい蛋白質として用いることができる。また同様に、ハイブリダイズやアミノ酸の置換によって得ることができる機能的に同等な蛋白質も、上記活性の検出方法に用いることができる。
本発明の評価方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。たとえば、幅広い物質に対して本発明に基づく評価方法を実施し、目的とする活性に優れる化合物の選択を繰り返すことにより、スクリーニングを実施することができる。あるいは、前記検出方法を利用して、特定の化合物の特性を解析することもできる。
この評価により単離される化合物は、本発明の蛋白質の活性、あるいはその発現を促進または阻害する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）の候補となる。また、生体内において、本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。これら化合物は、本発明の蛋白質が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応用が考えられる。
【００７６】
更に本発明は、本発明の評価方法によって得ることができる物質の医薬用途に関する。すなわち本発明は、前記評価方法によって選択される化合物の、細胞死の制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【００７７】
本発明において細胞死に特徴付けられる疾患とは、異常な細胞死によってもたらされる疾患を意味する。たとえば細胞死によってもたらされる疾患としては、脳虚血によってもたらされる脳組織障害などを示すことができる。本発明のアポトーシス関連因子の機能や産生そのものを阻害する化合物は、次のような細胞死の制御に利用することができる。
（１）虚血による細胞死
（２）慢性ウイルス性疾患における細胞死、あるいは
他の病原微生物による慢性疾患における細胞死
（３）自己免疫反応による炎症とそれに伴う細胞死
（４）原因不明だが細胞死とそれに伴う変性による疾患（アルツハイマー等）
【００７８】
これらの細胞死は、例えば次のような疾患によってもたらされる。従って、本発明の評価方法によって選択される化合物は、次のような疾患の治療に用いることができる。
脳血管障害性痴呆、多発性微小脳梗塞、脳血栓症、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、心筋炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、インスリン依存性糖尿病（膵臓ランゲルハンス島細胞の免疫反応性細胞死による）
この他、本発明によって選択される化合物を白血病などの癌の治療に用いることもできる。癌は、悪性腫瘍細胞における細胞死の制御が不完全な病態である。したがって、本発明によって選択される化合物の投与によって、悪性腫瘍細胞の細胞死を誘導することができれば、治療効果を期待できる。
【００７９】
あるいは本発明は、前記評価方法によって得ることができる化合物を主成分として含有する、細胞分化、または増殖の制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞分化、または増殖に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【００８０】
本発明において細胞の分化または増殖に特徴付けられる疾患とは、細胞分化や増殖が不充分なことによってもたらされる疾患を意味する。細胞の分化、あるいは増殖が不充分なことによってもたらされる疾患としては、たとえばアルツハイマーに代表される神経変性疾患等を示すことができる。この他、種々の原因によって生じた組織の障害が完全に修復されない状態も、細胞の分化、あるいは増殖が不充分なことによる病態と言うことができる。より具体的には、脳梗塞や脳虚血の結果もたらされる神経組織の障害の修復が不完全な状態は、神経変性疾患に含まれる。本発明に基づいて、分化、または増殖を誘導すべき細胞としては、神経細胞が望ましい。
【００８１】
本発明によって選択される化合物は、細胞死と、細胞の分化・増殖という、異なる作用を有する。既に述べたように、本発明の評価方法において標的とする分子であるHJ06972あるいはAF06972は、いずれも細胞死と細胞の分化・増殖という２面的な機能を有している。したがってその活性や発現を調節する化合物も、２面的な作用を有する可能性はある。しかしながら、特定の病態において、適切な化合物を投与すれば、これらの化合物を、様々な疾患の治療に利用することが可能であることは言うまでも無い。
【００８２】
更に本発明は、下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、細胞増殖、細胞分化、または細胞死によって特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
（ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の治療剤は、アポトーシス、神経細胞の増殖、および神経細胞の分化から選択されるいずれかの現象によって特徴付けられる疾患の治療に用いられる。
【００８３】
本発明の蛋白質、ヌクレオチド、抗体および上記評価方法により単離される物質は、アポトーシス、細胞分化、または細胞増殖を調節するために有用である。また、本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。
【００８４】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等、当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することができる。また、該化合物がDNAによりコードされ得るものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する。当業者であれば、必要に応じて投与量や投与方法を適宜選択することができる。
【００８５】
さらに本発明は、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖が調節されたモデル動物に関する。
(ａ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(ｂ)配列番号:１、または配列番号:３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｃ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｄ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
たとえば本発明の蛋白質を過剰発現させたトランスジェニック動物は、神経変性疾患を誘導するモデル動物として、神経変性疾患の治療薬の評価に用いることができる。
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８６】
【実施例】
１．AF06972遺伝子のクローニング
かずさDNA研究所より入手したHJ06972（KIAA1079）遺伝子を制限酵素XhoIおよびNotIで切り出し、pcDNA3.1（Invitrogen）のXhoI／NotIサイトに挿入した。
ヒト脳由来ｃDNA（Quick clone cDNA, Clontech）から、atgacttcgagacacaggac（配列番号：７）とtcaggtgtgtgagggaaaagct（配列番号：８）のプライマーを用いてPCR法により、約820bpのAF06972遺伝子断片を取得した。得られたAF06972遺伝子断片はTA vectorであるpT7-blue2にサブクローニングを行った後、DNAシークエンサーモデル310（PE Biosystems）によりDNA配列を確認した。上記HJ06972遺伝子が導入されているpcDNA3.1ベクターから、制限酵素XbaIおよびPvuIを用いて切り出したHJ06972遺伝子断片と、制限酵素PvuIおよびXhoIで切り出したAF06972遺伝子断片の両方をpBluescript IIベクターのXbaI-XhoIサイトにサブクローニングし、約4.8kbの全長AF06972遺伝子を取得した。
【００８７】
２．AATYKおよびAF06972遺伝子の組織発現分布
Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech)と定量型RT-PCRを用いて、ヒトの組織におけるAF06972遺伝子の発現分布解析を行った、即ち、SYBR Green RT-PCR reagents (PE biosystems)の試薬とPRISM 7700(PE Biosystems)の装置を用いて、メーカーの使用説明書に従って以下の条件にて実験を行った。
水 18μl、Multiple Tissue cDNA Panels 5μl、プライマー(5μM) 各1μl hAF06972 forward：atgatgtcacagtctacctgt（配列番号：９）
SYBR Green mix 25μlのPCR反応液を調製した。PCRの条件は、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒として行った。その結果、脳で最も強い発現が観察され、続いて腎臓、脾臓、リンパ節、胎児肝でも発現が観察された。AATYK遺伝子と同様なAF06972遺伝子の脳特異的発現は、血液細胞におけるアポトーシスに関与するAATYK遺伝子と同様な作用をAF06972遺伝子が脳において行うのではないかという仮説を肯定する。
【００８８】
３．HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子の発現解析
HJ06972遺伝子と、そのalternative splicing formであるAF06972遺伝子の発現の違いが検出できるプライマーを用いて、ヒト脳、ヒト培養神経細胞（SH-SY5Y細胞、NT2neuron細胞）における発現量の差を評価した。このプライマーでは、HJ06972遺伝子については約395bp、AF06972遺伝子については315bpのPCR産物が得られる。HJ06972遺伝子は非常にわずかしか発現が認められず、大部分はAF06972遺伝子であった。同様に、AATYK遺伝子においてもHJ06972遺伝子に相当する部分におけるalternative splicing formが存在するか発現解析を行った。AATYKについては、ほとんどalternative splicing formは検出されず、大部分がATTYK遺伝子であった。（図３）
【００８９】
更に、HJ06972とAF06972に相当するマウスとラットにおけるalternative splicing formの探索を試みた。すなわち、AF06972の挿入塩基配列を挟んでプライマーを設定し、挿入塩基配列の有無に関わらず、増幅が行えるようにした。もしもHJ06972とAF06972とに相当するalternative splicing formが存在すれば、大きさの異なる２つの増幅産物が確認できるはずである。PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
【００９０】
その結果、マウスとラットにおいては、AF06972に相当するバンドのみが観察された。ラットとマウスにおいては、HJ06972に相当するalternative splicing formは確認できなかった。したがって、本発明において見出された新規なalternative splicing formであるAF06972は、ヒトのみならず、マウスとラットにおいても主要な発現産物であると考えられた。
【００９１】
４．PC12細胞における遺伝子導入による神経突起伸展作用
PC12にEGFP（enhanced GFP, Clontech）と目的の遺伝子をエレクトポレーション法を用いて以下の条件にて導入した。
5×106 細胞/ml 培地（RPIM 1640+ 10% HS+ 5% FBS） 250μl
EGFP プラスミド 4μg
目的遺伝子 8μg
250V、950μF
Collagen type IVコーティングを施したウェルで18〜24時間培養した後、培地を交換した。さらに48時間培養した後、G-418を添加した。4日間培養後、顕微鏡下で観察を行った。
【００９２】
実験は３回繰り返し、結果はEGFPを遺伝子導入のコントロールとし、4〜7視野、31〜150のEGFP positive細胞について、神経突起の伸展が見られるものの割合を算出した。結果は次の式によって算出した神経細胞の伸展率(% of neurite outgrowth)で表した。また、低濃度（1ng/ml）のNGFの神経突起伸展作用に対する各遺伝子の影響についても同様に評価した。
神経細胞の伸展率＝（伸展が見られた細胞数／総細胞数）×１００
【００９３】
HuC、PKA、hAATKY（HJ03494）、HJ06972のいずれもがコントロールに比べて、遺伝子を過剰発現させた場合において、神経突起の伸展作用を示すことが確認された。HJ06972では、神経突起の伸展作用が従来報告されているHuCよりもさらに強い作用が観察された（図４）。低濃度のNGFによる神経突起伸展作用に対しても他に比べて最も強い促進作用が確認された（図５）。
【００９４】
５．HJ06972のCREB転写活性の測定
上記のPC12を用いた神経突起伸展作用の検討により、HJ06972が過剰発現により神経突起伸展作用を有することが明らかになった。PC12細胞における神経突起の伸展には多くの場合、CREB転写活性が関与しているのでHJ06972のCREB転写活性について検討した。
まず、PC12を各ウェルに1×106細胞播き、一晩37℃でインキュベーションした。PC12細胞へCRE-ルシフェラーゼ レポーター遺伝子pCRE-Luc（Stratagene）、および目的遺伝子（HJ06972）発現ベクターをリポフェクトアミン法で導入した。CRE-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を2.0μｇ、および目的遺伝子（HJ06972）発現ベクター1.0μgを細胞上清（RPMI1640＋20％ウマ血清＋10％ウシ血清）に加え、一晩インキュベーションして細胞内にベクターを導入した。得られた形質転換細胞を、１日培養した後に1ng/mlのNGFを添加し、６時間後にCREBの転写活性をルシフェラーゼによるレポーター遺伝子分析により検討した。
その結果、HJ06972遺伝子の導入により、CREBの転写がわずかに活性化される傾向が観察された。同様にAATYKでも非常にわずかにCREB転写活性が上昇することが明らかになった（図６）。このことにより、HJ06972の神経突起伸展作用には、このCREB転写活性促進が関与している可能性が考えられた。
【００９５】
６．Jurkat細胞における遺伝子導入によるアポトーシス誘導作用
HJ06972のアポトーシス誘導活性を調べるために、Jurkat細胞にHJ06972遺伝子または既知のアポトーシス関連遺伝子を導入し、アポトーシスを起こした細胞の数を調べた。
まず、コンフルエントになるまで培養した2mlのJurkat細胞を、18mlの新しい培地に加えることにより、細胞を培養した。培地には10％ ウシ胎仔血清（FBS）含有RPMI 1640を用いた。
【００９６】
次に、エレクトロポレーション法を用いて、Jurkat細胞に目的遺伝子を導入した。具体的には、細胞を遠心して回収した後、培地に再懸濁し、5×106細胞/mlの細胞懸濁液を調製した。目的遺伝子の組み込まれたプラスミドを、プラスミドDNAの最終濃度が10μg/250μlになるように細胞懸濁液に加え、氷上で10分間静置した。この溶液250μlをエレクトロポレーション用キュベットに移し、GenepulserII（Bio-Rad）で250V、950μFのパルスを与えることにより、遺伝子を導入した。氷上で10分間静置した後、4mlの1μM thapsigargin添加、または不添加培地を用いて、24時間培養した。
細胞をチューブに回収し、遠心により上清を除いた。各チューブに2μM Rhodamine 123を加え、37℃、5％ CO2下にて20分間インキュベートした。遠心により上清を除いた後、PI液を加えてアポトーシスを起こした細胞をFACSで解析した。
【００９７】
Bad、Caspase3、HJ06972の遺伝子を過剰発現させた場合には、アポトーシス誘導活性が見られた。これとは逆に、Bcl2の遺伝子を過剰発現させた場合には、アポトーシス抑制活性が見られた（図７）。さらに、1μMのthapsigarginを添加した場合には、thapsigarginを添加しなかった場合と同様の傾向が見られた。ただし、特にHJ06972遺伝子を過剰発現させた場合については、thapsigarginのアポトーシス誘導活性を促進する傾向が見られた（図７）。
thapsigarginを添加すると細胞質内のCa2+濃度が上昇し、CREBがリン酸化を受けて活性化すると考えられることから、HJ06972のアポトーシス誘導作用にも、CREB転写活性促進が関与している可能性が示唆された。
【００９８】
７．アポトーシスの誘導に伴うAATYKとmAF06972の発現レベルの変化
１X106個のマウスB細胞系培養細胞であるBa/F3 細胞（RCB0805, RIKEN Cell Bank)を10％ FCSと５ng/mlのマウスインターロイキン−３(IL-3)を含むRPMI培地で３７℃、５％ CO2の条件で培養する。細胞をPBSで３回洗浄した後、IL-3を除いた10％ FCSを含むRPMI培地に交換して５％ CO2の条件で培養しアポトーシスの誘導を行った。IL-3を除去後、０、４、８、１２、２４、および４８時間後の細胞を回収して、RT-PCRによってAATYKとAF06972遺伝子の発現解析を行った。ＰＣＲに用いたprimerの塩基配列はそれぞれ以下のとおりである。
PCRの条件は、AATYKとAF06972遺伝子については、９４℃ ３０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒で３０サイクルの反応を行った。HPRTについては、同条件で２５サイクルの反応を行った。反応液は２％アガロースゲルを用いた電気泳動を行った後、エチジウムブロマイド(EtBr)で染色した。結果を図８に示した。
その結果、 AATYKとAF06972遺伝子はIL-3除去によるBa/F3 細胞のアポトーシスの誘導にともない、経時的に発現量の増加が観察された。
【００９９】
【発明の効果】
本発明により、新規な遺伝子AF06972が提供された。この遺伝子は、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を有する蛋白質をコードしている。更に本発明は、その構造は既知であるが機能は解明されていないHJ06972遺伝子が、AF06972遺伝子によってコードされる蛋白質と同じ活性を有する蛋白質をコードしていることを明らかにした。
【０１００】
本発明によって見出された、これらの蛋白質の神経細胞の分化誘導活性は強力である。したがって、この蛋白質は、神経細胞の分化や増殖において重要な役割を有すると思われる。そのため、この蛋白質そのもの、あるいはこの蛋白質をコードする遺伝子は、神経細胞の分化や増殖、あるいは細胞死が関連する多くの疾患の診断指標として重要である。これら蛋白質や遺伝子の測定方法と、その測定方法に基づく診断方法を実現した本発明の意義は大きい。
あるいはこの蛋白質そのもの、あるいはこの蛋白質の活性や発現を調節することができる化合物は、神経細胞の細胞死や分化・増殖が関与する疾患において、有用な治療剤となる。
【０１０１】
これらの遺伝子によってコードされる蛋白質は、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、これらのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、正常な制御を失った細胞に細胞死をもたらすことによって治療効果を達成することができる。あるいは、神経細胞の分化や増殖を通じて、治療効果を達成することができる。
【０１０２】
更に本発明は、これらのポリヌクレオチドのアンチセンス、あるいはこれらのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対するドミナントネガティブの形質を有する蛋白質も、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、これらのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０３】
あるいは本発明は、AF06972遺伝子、HJ06972遺伝子、あるいはこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用した、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を調節する活性を検出する方法を提供する。加えて本発明は、この方法を応用した、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を調節する活性を有する候補物質の評価方法を提供する。
【０１０４】
本発明の評価方法によって得ることができる化合物も、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。たとえば本発明によって得ることができる、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を抑制(down regulation)する化合物は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０５】
逆に、本発明によって得ることができる、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を促進(up regulation)する化合物は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスチロシンキナーゼAATYKとHJ06972によりコードされる蛋白質の構造を比較する図である。
【図２】 HJ06972遺伝子、および該遺伝子にコードされる蛋白質と、そのalternative splicing formであるAF06972遺伝子、および該遺伝子にコードされる蛋白質の構造を比較する図である。
【図３】 HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子の各種細胞における発現レベルを比較した図である。
【図４】 PC12細胞へのHJ06972遺伝子導入による神経突起伸展作用を示す写真である。
【図５】 PC12細胞への各種遺伝子の神経突起伸展作用を比較するグラフである。図中、縦軸は、神経細胞の伸展率(% of neurite outgrowth)を、横軸は導入した遺伝子を示す。
【図６】 HJ06972遺伝子のCREBの転写活性に対する作用を示すグラフである。図中、縦軸は対照を１とする相対的なCREB転写活性（率）を、横軸は導入した遺伝子を示す。
【図７】 Jurkat細胞における核種遺伝子導入によるアポトーシス誘導作用を解析した結果を示すグラフである。縦軸はアポトーシスを起こした細胞の割合(%)を、横軸はJurkat細胞に導入した遺伝子を示す。グラフの右側がThapsigargin(１μM)を添加したとき、そして左側が無添加の場合の結果である。
【図８】 マウスBa/F3 細胞のIL-3の枯渇によって誘導されるアポトーシスに伴う、マウスチロシンキナーゼAATYKとmAF06972の発現レベルの変化を示す写真である。Mは分子量マーカーを、また０−４８はIL-3を除去後の経過時間を示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシスを誘導する活性、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖の活性を有するアポトーシス関連因子、該因子をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを用いた該因子の製造方法、それらの製造に関わる発現系、該発現系を用いたアポトーシスを誘導する活性、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖の活性の検出方法、または該活性を制御する化合物の評価方法、並びに、該アポトーシス関連因子、または該因子をコードするポリヌクレオチドを有効成分とする細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。また、本発明は本発明のアポトーシス関連因子を認識する抗体、該抗体を用いた該因子の免疫学的測定法に関し、さらに、上記評価方法により得られる化合物を用いる細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス、またはプログラム細胞死とは生理的条件下で細胞自らが引き起こす細胞の死である。多細胞生物の生存においては、望ましくない、あるいは必要の無い細胞を生体から排除する機構が必要である。アポトーシスは、発生過程や細胞の世代交代において、不要となった細胞を排除するための予めプログラムされた細胞の死であると理解されていた。アポトーシスを起こした細胞では、核の収縮やDNAの断片化が観察され、膜を残したまま細胞が退縮する。生体中では、やがて退縮した細胞を貪食細胞が捕食し排除する。アポトーシスに対して、壊死と呼ばれる細胞死は細胞構造の破壊を伴う。したがって、細胞が自ら死滅していくアポトーシスは、しばしば、「きれいな細胞死」と呼ばれる。
【０００３】
その後、発生過程で観察される細胞死と同様の細胞死が、細胞の外から刺激によっても誘導されていることが知られるようになった。例えば、TNFやFasは、アポトーシスを誘導する代表的なサイトカインである。また、紫外線や放射線照射、細胞増殖因子の枯渇、ある種の癌遺伝子の活性化といった刺激によっても、アポトーシスは誘導される。自己免疫疾患や癌のような疾患も、アポトーシスの機能不全によって、有害な細胞を死滅させられなかった結果として理解されるようになった。
【０００４】
現在のところ、細胞が外界からの刺激に応答してアポトーシスに至る過程は、およそ次のように説明されている。即ち、様々な原因によって活性化されたCaspaseファミリーが細胞死をもたらすことが明らかにされている。Caspaseには基質特異性の異なる複数の酵素の存在が明らかにされており、一群のCaspaseを総称してCaspaseファミリーと呼んでいる。Caspaseファミリーは、基質特異性によって大きく３つのグループに分類されている。このうち、グループ２のCaspaseが、アポトーシスの実行に関与すると言われている。グループ３のCaspaseは、アポトーシス実行カスケードの上流において、細胞外からの刺激に応答して活性化され、より下流のグループ２のCaspaseを活性化する働きを持つ。一方グループ１のCaspaseは、サイトカインの生成と分泌を促進する作用を持つとされている。グループ２とグループ3に分類されるCaspaseと、それが認識するアミノ酸配列を以下に示す。
グループ２
Caspase-2 DEHD
Caspase-3 DEVD
Caspase-7 DEVD
グループ３
Caspase-6 VEHD
Caspase-8 LETD
Caspase-9 LETD
【０００５】
グループ３のCaspaseは、FasやTNFレセプターにリガンドが結合することにより活性化され、グループ２のCaspaseを切断して活性化し、より下流にシグナルを伝達する。このようなシグナルの伝達をアポトーシス実行カスケードと呼ぶ。アポトーシス実行カスケードの下流では、シグナルを伝達された様々な因子が、細胞死をもたらすための実行部隊として機能していることが推測される。
【０００６】
しかし、実際にどのような因子が細胞の死をもたらしているのかについては、解明すべき課題が多い。たとえば、ある種のCaspaseはヌクレアーゼ阻害因子ICAD(inhibitor of CAD)を分解する。その結果、ヌクレアーゼであるCAD(Caspase Activated DNase)の核への移行が可能となり、アポトーシスに特徴的な染色体DNAの切断を開始することが知られている(Enari M. et al.,Nature, 391 :43-50,1998)。
【０００７】
アポトーシスは神経系の発達においても重要な過程である（Johnson EM and Deckworth, Ann.Rev.Neurosci., 16: 31-46 (1993)；Oppenheim RW, Annu.Rev.Neurosci., 14: 453-501 (1991)；Raff MC et al., Science 262: 695-700 (1993)）。アポトーシスは物理的および環境的シグナルにより厳密に調節されている。インシュリン様成長因子I（IGF-I）等の成長因子によりアポトーシスは阻害され、それにより正常および異常な神経細胞の生存、並びに、増殖が調節される（D’Mello SR et al., J.Neurosci. 17: 1548-1560 (1997)；Rukenstein A et al., J.Neurosci. 11:2552-2563 (1991)；Schlessinger J et al., Neuron 9: 383-391 (1992)；Yao R and Cooper GM, Science 267: 2003-2006 (1995)）。
【０００８】
アポトーシス開始時の不全は、中枢および末梢神経系における腫瘍化の重要な機構の一つである（Fung K-M and Trojanwski JQ, J.Neuropathol.Exp.Neurol. 54: 285-297 (1995)；Yachnis AT et al., J.Neuropathol.Exp.Neurol. 53: 61-71 (1994)）。神経変性疾患（White E, Genes Dev., 10: 1-15 (1996)；Friedlander RM and Yuan J, Cell Death and Differentiation 5: 823-831 (1998)；Jacobson MD, Curr.Biol. 8: R418-R421 (1998)；Tatton WG et al., J.Neural Transmission, Suppl.49:245-268 (1997)）および虚血性疾患（Choi DW and Rothman SM., Annu.Rev.Neurosci., 13: 171-182 (1990)）において起こる神経細胞死にもアポトーシスは関連していると考えられている。
【０００９】
神経細胞のアポトーシスに関連する遺伝子としては、AATYK（Apoptosis Associated Tyrosine Kinase）と呼ばれるマウスの遺伝子が脊髄前駆細胞から同定されている（Gaozza E. et al., Oncogene, 15: 3127-3135 (1997)）。AATYK遺伝子によりコードされる200kDaの蛋白質はN末端にチロシンキナーゼドメインを有し、C末端にプロリンに富み、最小SH3結合モチーフを構成する16 PXXPモチーフを有している。血球細胞のサイトカイン除去によるアポトーシス時に、AATYKの発現が強く誘導されることが報告されている。
【００１０】
AATYK遺伝子の発現は、脊髄前駆細胞の生育抑制および／またはアポトーシスの誘導に不可欠と考えられている。AATYK蛋白質は脳で特に多く発現されており、神経分化に伴い発現は増加することが知られている（Baker SJ et al., Oncogene, 20: 1015-1021 (2001)；Tomura M et al., Oncogene, 20: 1022-1032 (2001)）。また、AATYKは核膜近くの細胞質中に存在する酵素的に活性な非受容体キナーゼであり、過剰発現によりアドレナリン作動性神経芽腫SH-SY5Y細胞等の細胞の分化を誘導し、そして、レチノイン酸（RA）、12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート、およびIGF-I等により誘導される神経細胞分化を促進することが知られている（Raghunath M et al., Molecular Brain Res. 77: 151-162 (2000)）。
【００１１】
このように、アポトーシス実行カスケードを構成する因子には、アポトーシスの実行、および神経系の発達／分化において重要な働きを持つ分子が多く存在すると考えられる。これらの因子は、アポトーシスの制御、および神経系の発達／分化において重要な標的となる可能性がある。
【００１２】
また最近では、神経細胞の抗アポトーシス活性と、サイクリックAMP(cAMP)応答配列(CRE;cAMP responsive element)に結合する転写因子(CREB；cAMP responsive element binding protein)の活性上昇との結びつきが示唆されている。CREBは、cAMP依存性プロテインキナーゼによりSer133がリン酸化され活性化する。
その他、アメフラシやラットの行動記憶についての実験結果より、CREBのリン酸化が記憶形成において重要であることが知られている（Silvia AJ et al., Annu.Rev.Neurosci. 21: 127 (1998)）。また、アルツハイマー型痴呆では、脳内のリン酸化CREBの量が有意に減少している（Yamamoto-Sasaki M et al., Brain Res. 824: 300-303 (1999)）。以上のことよりCREB活性の上昇が記憶形成と関連することも示唆されている。CREBの転写活性の上昇を通じて記憶・神経変性を改善し、幅広い神経疾患に対する治療効果が期待できる。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、アポトーシス、あるいは神経細胞の分化や増殖に関与する遺伝子を同定することである。また本発明は、このような機能を有する遺伝子を用いた、アポトーシスを誘導する活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する化合物の評価方法の提供を課題とする。これらの遺伝子そのもの、あるいはこれらの活性を制御する化合物は、神経細胞の増殖、または細胞死に関連する疾患に対する治療効果が期待できる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マウスAATYKのキナーゼドメインと構造的に類似するモチーフを有する２つの蛋白質を同定した。両者のアミノ酸配列には共通する領域が見出され、オルタナティブスプライシングフォームであると考えられた。これらの蛋白質のうち、一方は本発明者らによって見出された新規なアミノ酸配列からなる蛋白質であった。他方は、既に構造が明らかにされている遺伝子によってコードされているが、その機能は明らかにされていない。
【００１５】
次に本発明者らは、これらの蛋白質がアポトーシス誘導活性を有することを確認した。また本発明者らは、これら蛋白質の神経細胞への作用を解析した。その結果、これらの蛋白質が、アポトーシス誘導作用に加えて、神経細胞の分化や増殖を強力に誘導することを有することを見出した。更にAF06972は、脳における発現が高く、神経細胞との密接な関連性が示された。
【００１６】
これらの知見に基づいて、前記蛋白質、あるいはそれをコードする遺伝子を用いて、候補物質の、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する作用を検出しうることを明らかにし、本発明を完成した。更に本発明者らは、この検出方法に基づいて、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞の分化や増殖を誘導する活性を調節する作用を有する化合物の評価方法を確立した。
【００１７】
すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に関する。また本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記蛋白質の、検出方法や用途に関する。
更に本発明は、アポトーシス誘導活性、あるいは神経細胞分化増殖活性を有する蛋白質を用いた、これらの活性を調節する活性の検出方法に関する。加えて本発明は、前記検出方法に基づく、これらの活性を調節する活性を有する化合物の評価方法に関する。また本発明は、前記評価方法によって得ることができる化合物の用途に関する。
〔１〕下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔２〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕配列番号：５から選択された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔４〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔５〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔６〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔７〕〔１〕〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または〔６〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔８〕〔７〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔５〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔９〕配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１５塩基の長さを有するポリヌクレオチド。
〔１０〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体。
〔１１〕配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を認識する抗体。
〔１２〕〔５〕に記載の蛋白質と、該蛋白質を認識する抗体の免疫学的な反応を観察する工程を含む、〔５〕に記載の蛋白質の免疫学的測定法。
〔１３〕次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞のアポトーシスを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程
〔１４〕次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔１３〕に記載の方法によって候補物質のアポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記細胞のアポトーシスを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１５〕次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する方法。
（１）候補物質の存在下、配列番号：１、または、配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを発現させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシス、神経細胞の分化、及び、神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する工程。
〔１６〕次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質を評価する方法。
（１）〔１５〕に記載の方法によって、候補物質のアポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１７〕次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する神経細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）神経突起の伸展が誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞の神経突起の伸展を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、神経細胞の分化および／または増殖を抑制、または促進する活性を検出する工程
〔１８〕次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）〔１７〕に記載の方法によって候補物質の神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する候補物質を選択する工程
〔１９〕細胞増殖、または細胞死の制御における〔１４〕、または〔１６〕に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
〔２０〕〔１４〕、または〔１６〕に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
〔２１〕神経細胞の分化および／または増殖の制御における、〔１６〕、または〔１８〕に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
〔２２〕〔１６〕、または〔１８〕に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、神経細胞の増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
〔２３〕細胞増殖、または細胞死の制御における〔５〕記載の蛋白質、または〔１〕〜４に記載のポリヌクレオチドの使用。
〔２４〕下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、細胞増殖、細胞分化、または細胞死によって特徴付けられる疾患の治療剤。
（ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔２５〕以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖が調節されたモデル動物。
(ａ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(ｂ)配列番号:１、または配列番号:３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｃ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｄ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
〔２６〕生体試料中のアポトーシスマーカーを測定し、該アポトーシスマーカーの測定レベルの上昇をアポトーシスと関連付ける工程を含むアポトーシスの検出方法であって、アポトーシスマーカーが次の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
〔２７〕次の工程を含む、劇症肝炎の診断方法。
（１）〔２６〕に記載の方法によって、肝細胞を生体試料としてアポトーシスを検出する工程、および
（２）工程（１）においてアポトーシスが検出された場合に、劇症肝炎が進行していると判定する工程
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、既に塩基配列が報告されているマウスチロシンキナーゼAATYK遺伝子の情報に基づいて、かずさDNA研究所のヒト脳組織由来のDNAデータベースからヒトAATYKと思われる次のクローンを見出した。
HJ06941 (KIAA1078、GenBank Acc.No. AB029001)
【００１９】
更に、この遺伝子の塩基配列情報、並びに翻訳アミノ酸配列情報を利用して、チロシンキナーゼドメインにおいて、４１%の相同性を示す次のクローンを見出すことに成功した。
HJ06972 (KIAA1079、GenBank Acc.No. AB029002)
ヒトAATYK遺伝子によりコードされるチロシンキナーゼは、1317残基のアミノ酸により構成されているのに対し、HJ06972遺伝子によりコードされる蛋白質は、1451残基のアミノ酸より構成されていた。HJ06972遺伝子にコードされる蛋白質もAATYKと同様にN末端部分にキナーゼドメインを有し、C末端にはSH3リガンドドメインを有していた（図１）。HJ06972の塩基配列を配列番号：１に、そのアミノ酸配列を配列番号：２に示した。この塩基配列とアミノ酸配列は、HJ06972(KIAA1079)として、かずさDNA研究所において構造が明らかにされている。しかしその機能についてはなにも解明されていない。
【００２０】
本発明のAF06972遺伝子は、上記HJ06972遺伝子のホモローグ遺伝子の検索過程において見出された。本発明者らは、既に塩基配列が明らかにされているHJ06972遺伝子の塩基配列情報を利用して、ESTの塩基配列をアセンブルした。その結果、HJ06972に対して94bpからなる挿入配列を有する遺伝子の存在が疑われた。本発明者らは、この挿入配列を有する遺伝子を探索し、AF06972遺伝子を見出した。更に、マウスやラットにおけるAF06972遺伝子のホモローグの存在も確認し、AF06972が新規な遺伝子であることを確認した。マウスやラットにおけるAF06972遺伝子のホモローグの存在は知られていない。
AF06972遺伝子は、HJ06972遺伝子の塩基配列中の第4623番目に94塩基が挿入された塩基配列からなる。挿入塩基配列によって、AF06972遺伝子がコードするアミノ酸配列には、フレームシフトが生じている。その結果、C末端部位においてAF06972遺伝子によりコードされる蛋白質の方がHJ06972遺伝子によりコードされる蛋白質よりも49アミノ酸残基長くなっている。したがって、HJ06972遺伝子に対してAF06972遺伝子は新規な遺伝子と言うことができる。もちろん、AF06972によってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質も新規であることは言うまでも無い。
【００２１】
また、マウスAATYKとの比較では、AF06972の方がHJ06972よりも相同性が高いことが判明した（図２）。ヒトAATYKとAF06972とは、配列で20数％のホモロジーを有し、そのキナーゼドメインについては41％のホモロジーが認められた。本発明は、以下に示す約4.8kbの遺伝子、および該遺伝子によりコードされる1503アミノ酸残基からなる蛋白質を提供する。AF06972の塩基配列を配列番号：３に、そのアミノ酸配列を配列番号：４に示した。
【００２２】
また、本発明には、配列番号：４に示したアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がアポトーシス誘導活性を持つ場合、または神経突起を伸展させる活性を有する場合、その蛋白質は本発明の活性型の蛋白質と機能的に同等であると言うことができる。
あるいは、なんらかのプロセスを経てアポトーシス誘導活性、または神経突起伸展作用を持った活性型の蛋白質を生成し得る蛋白質は、本発明の蛋白質と機能的に同等である。不活性型の蛋白質から活性型の蛋白質を生成するためのプロセスは限定されない。
【００２３】
本発明においては、同一の蛋白質がアポトーシス（細胞死）を誘導する活性を示すと同時に、神経細胞に対しては分化や増殖を誘導する活性を示す。これらの機能は、逆の作用のようにも思われる。アポトーシスに関連すると考えられているキナーゼの中には、AATYK(HJ03494)やASK-1などがある。これらのキナーゼは、過剰発現によってアポトーシスを誘導する一方、神経突起の伸展にも関与している。いずれの活性がもたらされるのかは、シグナルの強さと持続時間に大きく影響を受けると考えられている。
HJ06972やAF06972についても、本発明者らによって新たに同様の活性が見出された。すなわちこれらの蛋白質は、神経突起伸展作用とともに、過剰発現によるアポトーシスの誘導作用を有するものと考えられた。したがって、この種のキナーゼ活性を有する蛋白質には、発現レベルの調節等の機構を通じて、神経細胞死のみならず神経細胞の再生につながるような作用が期待される。
【００２４】
アポトーシス誘導活性は、例えば実施例に記載したように、当該蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物細胞に発現させ、その細胞のアポトーシスを観察することによって確認することができる。アポトーシスは、細胞の形態学的な変化や、染色体DNAの切断を指標として確認することができる。また、神経突起伸展作用は、例えば実施例に記載したように、当該蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物の神経系の株細胞に発現させ、その細胞の神経突起の伸展を観察することにより確認することができる。
【００２５】
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法を利用して調製することができる。変異の導入方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)等を示すことができる。また、このような蛋白質は自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列（配列番号：２、または４）において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加等により異なる蛋白質も含まれる。蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り特に制限されない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００２６】
また、本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4)を用いて本発明の蛋白質をコードする塩基配列（配列番号：１、または配列番号：３）またはその一部をもとにこれと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、このポリヌクレオチドから機能的に同等な蛋白質を得ることは、通常行い得ることである。本発明には、本発明の蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も含まれる。
【００２７】
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常は洗浄のための条件として「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.1xSSC、0.1% SDS、65℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待し得る。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ストリンジェンシーに影響を与えるその他の条件として、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間などを示すことができる。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号：４に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列または該蛋白質をコードする塩基配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、90％以上）の配列の同一性を指す。相同性の特定は、BLAST2検索アルゴリズム(Altschul, S.F. et al, 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.)を用いて決定することができる。
【００２８】
また、遺伝子増幅技術（PCR）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4）を用いて、本実施例において同定された塩基配列（配列番号：１、または３）の一部をもとにプライマーを設計し、これら塩基配列またはその一部と相同性の高いDNA断片を単離して、これをもとに本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を得ることも可能である。本発明の蛋白質、並びに本発明における機能的に同等な蛋白質は、後に述べるような、当該蛋白質の機能を修飾する化合物の評価方法に用いることができる。またこれらの蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、当該蛋白質の製造、発現状態を知るためのプライマーまたはプローブとして有用である。
【００２９】
あるいは本発明は、本発明の蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。ドミナントネガティブの形質を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、その発現によって細胞がもともと備えている内在性の野生型蛋白質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する。例えば、本発明のアポトーシス関連因子におけるキナーゼドメイン、SH3リガンドドメイン等、該蛋白質の活性に影響すると考えられる配列に相当する部分のアミノ酸配列を改変すれば、アポトーシス誘導活性や神経突起伸展作用を有さない不活性体を得ることができると考えられる。このようなアミノ酸配列をコードする遺伝子を細胞内に発現させれば、本発明のアポトーシス関連因子の発現をドミナントネガティブ効果(不活性型の拮抗阻害)により抑制することができる。従って、ウイルスベクター等の遺伝子導入技術によって、不活性体遺伝子を細胞に導入発現させることで、アポトーシスの進行を阻害したり、神経細胞の分化および／または増殖を抑制したりすることが可能となる。
【００３０】
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対する抗体を得るための免疫原として有用である。特に、他の蛋白質との相同性が低い、本発明の蛋白質に固有のアミノ酸配列を含む部分ペプチドは、本発明の蛋白質に対して特異性の高い抗体を与える免疫原として期待される。このようなアミノ酸配列として、配列番号：６に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明の部分ペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは9アミノ酸以上、より好ましくは12アミノ酸以上、より好ましくは15アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造する。
【００３１】
また本発明は、前記ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、前記ポリヌクレオチド、あるいは前記いずれかの発現ベクターを保持する形質転換体、並びにその形質転換体を培養し、その培養物から本発明の蛋白質を単離することからなる、本発明の蛋白質、或いはその部分ペプチドの製造方法に関する。さらに本発明は、上記の方法で製造された蛋白質、或いはその部分ペプチドを提供する。
遺伝子組換え手法でポリペプチドを生産する場合、宿主細胞の種類により、目的ポリペプチドのグリコシル化の種類や程度の異なったものが得られることや、いわゆるポリペプチドの分泌生産法において、宿主細胞中で発現された前駆体ポリペプチドの末端(Ｎ−末端および／またはＣ−末端)アミノ酸配列がシグナル・ペプチダーゼ等によりプロセッシングを受け、種々の末端アミノ酸配列を持つポリペプチドが得られることは当業者に周知である。従って、そのようなポリペプチドも本発明の蛋白質の範囲に含まれることは、当業者ならば容易に理解し得ることである。
【００３２】
下記実施例には、発現ベクターとして哺乳類動物細胞内で機能するベクターの構築例のみが示されている。しかしながら、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが開示されている結果、これらに基づいて、酵母等の真菌類、並びに原核性細胞宿主に導入したとき、該宿主に本発明の蛋白質を発現、産生させ得る発現ベクターを構築することは当業者にとって容易である。従って、本発明は、本発明の核酸配列に基づき、当該技術分野既知の方法で構築される発現ベクターをも包含する。
【００３３】
本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを発現させるために用い得る微生物細胞には、例えば、原核性の細菌[大腸菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis)]および真核性の酵母[例えばパン酵母菌(Saccaromyces cerevisiae)]がある。また、哺乳類細胞には培養ヒト細胞および培養動物細胞が含まれる。さらには培養植物細胞も用い得る。
微生物の例としてはエシェリキア属に属する細菌やパン酵母がある。より具体的には、例えば次のような菌株を微生物宿主として挙げることができる。
エシェリキア属に属する細菌
E.coli HB101(ATCC 33694)
E.coli HB101-16(FERM BP-1872)
E.coli MM294(ATCC 31446)
E.coli DH1(ATCC 33849)等
パン酵母
S.cerevisiae AH22(ATCC 38626)等
哺乳動物細胞の例としてはヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、マウスＬ９２９細胞およびチャイニーズ・ハムスター・オバリー(ＣＨＯ)細胞等がある。
【００３４】
通常、原核生物である細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよび自己複製可能ユニットから構成される。真核生物、即ち酵母や哺乳動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが好ましい。さらにエンハンサー配列、本発明の蛋白質の５'−および３'−非コード領域、ポリアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入することもできる。
【００３５】
上記の自己複製可能単位は、形質転換体の選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性)を含有していることが好ましい。細菌を宿主とする発現ベクターの場合、プロモーターという語句は、プロモーター、オペレーターおよびシャイン−ダルガーノ(ＳＤ)配列(例えばＡＡＧＧ等)からなるプロモーター・オペレーター領域を意味する。そのようなプロモーターの例としては、慣用のプロモーター・オペレーター領域が挙げられる。具体的には、ラクトースオペロン、ＰＬ−プロモーター、あるいはtrp−プロモーター等を示すことができる。酵母を宿主とする発現ベクターに用いられるプロモーターの例としてはpho５プロモーターが挙げられる。更に、精製を容易に行うことを目的として、金属イオンキレートに対する親和性を持つ塩基性アミノ酸を、本発明の蛋白質におけるいずれかの末端に付加することができる。塩基性アミノ酸を付加する場合には、希望のアミノ酸をコードする塩基配列が連続した塩基配列を5'側に付加したプライマーを用いて、ＰＣＲを行えば、目的とする遺伝子の任意の末端に、オリゴペプチドを付加することができる。塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、あるいはアルギニンなどを用いることができる。
【００３６】
哺乳動物細胞における発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーター、マウス・メタロチオネインI(ＭＭＴ)−プロモーター等が挙げられる。好ましい開始コドンの例としてメチオニンコドン(ＡＴＧ)が挙げられる。
【００３７】
終止コドンの例としては慣用されている終止コドン(例えばＴＡＧ、ＴＧＡ、等)が挙げられる。自己複製可能ユニットとは、それを含有する発現ベクターの全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製し得るＤＮＡ配列であって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラスミド、および合成プラスミドが挙げられる。人工的に修飾したプラスミドには、例えば天然プラスミドから調製したＤＮＡ断片等が含まれる。そのようなプラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とする場合、例えばプラスミドpＢＲ３２２やその人工修飾体が挙げられる。人工修飾体とは、たとえばpＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得られたＤＮＡ断片等を示すことができる。また酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、pＪＤＢ２１９、pＪＤＢ２０７等が挙げられる。さらに、動物細胞用プラスミドとしては、例えばプラスミドpcDNA3.1（Invitrogen）pＭＭ３２４、プラスミドpＳＶ２dhfr ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドpＳＶ２neo ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。
エンハンサー配列としては、例えばＳＶ４０のエンハンサー配列が挙げられる。ポリアデニル化部位としては、例えばＳＶ４０のポリアデニル化部位が挙げられる。
【００３８】
本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて、部分合成または全合成することによって得ることができる。或いは、ヒトcDNAライブラリーより、配列番号：３に記載の塩基配列に基づいて設定したプローブやプライマーを用いて取得することができる。更に、ゲノムＤＮＡを常法通り処理することによって、本発明の蛋白質をコードするゲノムDNAを調製することができる。ゲノムDNAの処理方法としては、例えば、制限酵素による消化、細菌アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる燐酸化、およびＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション等の工程を含む処理方法を示すことができる。更にこのようにして取得したゲノムDNAを利用し、ゲノムにおける本発明の遺伝子の転写開始点を明らかにし、より上流に位置する発現制御領域を特定することができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターやエンハンサー等の制御領域は、本発明の蛋白質の発現異常を検出するための標的領域として有用である。或いは、これらの領域を標的とするデコイ核酸医薬などにより、発現制御を実現することができる。
【００３９】
本発明の実施に必要な、ＤＮＡのクローニング、各プラスミドの構築、宿主のトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からの蛋白質の回収等の操作は、当業者既知の方法、あるいは文献記載の方法[Molecular Cloning 2nd. edition, J.Sambrook et.al,Cold Springs Harbor Laboratory (1989), DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985)他、Molecular Cloning 3rd. edition,J.Sambrook et.al,Cold Springs Harbor Laboratory (2001)]に準じて行なうことができる。
また、本発明の宿主細胞には、本発明のアポトーシス関連因子の機能解析やこの蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤の評価方法のために用いる目的の細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法等の方法で行うことが可能である。形質転換体からの本発明の蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。
【００４０】
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T（A:U）、G:Cの塩基対からなる2本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70% 、好ましくは少なくとも80% 、より好ましくは90% 、さらに好ましくは95% 以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするDNAやRNAを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、3'側の領域は相補的である必要があるが、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００４１】
特に、配列番号：３に示す塩基配列のうち、配列番号：５に記載された塩基配列を含む領域、またはその相補配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドは、AF06972を特異的に検出するためのプローブ、あるいはプライマーとして有用である。
あるいは、配列番号：３に示す塩基配列のうち、配列番号：５に記載された塩基配列からなる領域を増幅することができるプライマーは、HJ06972とAF06972の両方を１組のプライマーによって増幅することができる。しかも当該プライマーによって得られる増幅生成物には、HJ06972とAF06972とでは配列番号：３の構成塩基数である９４bpの相違が生じる。したがって、このようなプライマーを用いることにより、HJ06972とAF06972とを区別して検出、あるいは確認することができる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質の異常を検査・診断するために利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして用いたノーザンハイブリダイゼーションやRT-PCRにより、発現異常を検査することができる。また本発明のポリヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、ゲノムDNA-PCRやRT-PCRを実施することができる。更に、本発明の蛋白質をコードする遺伝子やその発現制御領域を増幅し、RFLP解析、SSCP、シークエンシング等の方法により、配列の異常を検査・診断したりすることができる。
【００４３】
また、本発明のアポトーシス関連因子（AF06972）は神経再生、脳梗塞治療、神経軸索再生、神経軸索伸展に用いることができることから、該因子をコードするポリヌクレオチドを、該因子が関連する疾患の遺伝子治療に用いることも可能である。即ち、宿主の疾患部位において適切に発現されるよう該ポリヌクレオチドを導入することにより、本発明のアポトーシス関連因子を発現させ、該因子が関連する疾患を治療・予防することが可能である。本発明において「発現」とは、転写および/または翻訳が含まれる。本発明のポリヌクレオチドを用いた発現の解析により、遺伝子の転写レベルでの発現を検査・診断することができる。また、後述の本発明の蛋白質に対する抗体を用いれば、遺伝子の翻訳レベルでの発現を検査・診断することができる。
【００４４】
本発明におけるHJ06972あるいはAF06972は、いずれもアポトーシスに密接に関連する蛋白質をコードする遺伝子である。たとえば、人為的にアポトーシスを誘導した血液細胞では、これらの遺伝子の発現レベルがアポトーシスの進行にともなって増強される。したがって、生体試料中のこれらの遺伝子の発現レベルは、アポトーシスの進行状態の診断指標として有用である。たとえば、劇症肝炎のような急激なアポトーシスの進行が見られる疾患においては、HJ06972あるいはAF06972の発現レベルの急激な上昇を診断指標とすることができる。
【００４５】
加えて本発明は、生体試料中のアポトーシスマーカーを測定し、該アポトーシスマーカーの測定レベルの上昇をアポトーシスと関連付ける工程を含むアポトーシスの検出方法であって、アポトーシスマーカーが次の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法を提供する。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
【００４６】
AF06972遺伝子は脳以外の組織においては恒常的な発現は見られない。他方、アポトーシスを起こした細胞では短時間のうちに、AF06972遺伝子の発現レベルが上昇する。たとえばマウスの細胞を用いた実験においては、血液細胞のアポトーシスの誘導に伴って、AATYKあるいはAF06972の発現レベルが急激に上昇している。したがって、AATYK、AF06972、あるいはこれと機能的に同等な遺伝子をアポトーシスマーカーとして測定することによって、アポトーシスを検出することができる。
【００４７】
本発明におけるアポトーシスマーカーは、前記（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である。特定の構造を有するポリヌクレオチドや蛋白質を測定する方法は公知である。たとえば、塩基配列が明らかなポリヌクレオチドはハイブリダイゼーションやPCRを利用することによって、その量を測定することができる。また、アミノ酸配列が明らかな蛋白質は、その蛋白質を認識する抗体を利用したイムノアッセイによって測定することができる。更に蛋白質が有する生化学的な活性を指標として、蛋白質の量を測定することもできる。
【００４８】
アポトーシスマーカーの測定値は、通常、健常者の測定レベルと比較される。複数の健常者の生体試料についてアポトーシスマーカーを測定し、統計学的な手法によって標準値を設定することができる。被検者の測定値が標準値を越える場合には、該被検者はアポトーシスを有すると判定される。
【００４９】
本発明の検出方法において、生体試料とは、生体から採取されるあらゆる試料を用いることができる。具体的には、血液、尿、あるいは各種臓器の生検試料等を示すことができる。特に、生検試料におけるアポトーシスマーカーの発現レベルの上昇は、その組織におけるアポトーシスの証明となる。また、血液中のアポトーシスマーカーのレベルの上昇は、生体内におけるアポトーシスの進行を反映している。
本発明のアポトーシスの検出方法に基づいて、劇症肝炎の診断方法が提供される。本発明の劇症肝炎の診断方法は、次の工程を含む。
（１）本発明のアポトーシスの検出方法によって、肝細胞を生体試料としてアポトーシスを検出する工程、および
（２）工程（１）においてアポトーシスが検出された場合に、劇症肝炎が進行していると判定する工程
【００５０】
また、「配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド」には、本発明の蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。一方、本発明におけるアンチセンスとは、配列番号:２または配列番号:４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の発現を抑制するポリヌクレオチドを意味する。即ち、このような活性を有するアンチセンスは、CREBの脱リン酸化を抑制し、CREBの脱リン酸化反応の阻害剤、または、記憶・神経変性疾患の治療若しくは予防剤として用いることができる。
【００５１】
アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンスDNAでもアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスDNAは、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、通常、3000bp以内、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。該アンチセンスDNAを単独あるいは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の適当なベクターにアンチセンス方向に挿入して用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０bp以上、通常１００bp以内、好ましくは２０bp以上、５０bp以内の鎖長を有する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号:１または配列番号:３に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオエート法（Stein "Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides." Nucleic Acids Res. 16:3209-3221 (1988)）等により調製することが可能である。
【００５２】
このようなアンチセンスには、配列番号:２または配列番号:４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の異常に起因する疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。本発明の蛋白質の異常には、蛋白質の機能異常や発現異常などが含まれる。遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクター等を利用して、ex vivo法やin vivo法等により患者へ投与することができる。具体的には、虚血性疾患による組織の障害においてはアポトーシスが重要なステップとなっている。従って、血流障害を起こした組織における本発明の蛋白質の発現を阻害できれば、虚血性疾患に伴う組織損傷を軽減することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターやリポソーム等の非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与することができる。
【００５３】
本発明は、また、配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体を提供する。配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基には、たとえば配列番号：６に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなる抗原決定基が含まれる。このほか、配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、配列番号：６に記載のアミノ酸配列とそれに隣接するアミノ酸配列とで構成される抗原決定基を認識する抗体は、本発明の抗体に含まれる。更に、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなる領域によって構成される、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の立体構造からなる抗原決定基を認識する抗体も、本発明に含まれる。配列番号：６に記載のアミノ酸配列は、本発明者らが見出した新規遺伝子AF06972に固有のアミノ酸配列である。したがって、この領域を特異的に認識することができる本発明の抗体は、AF06972によってコードされる蛋白質の検出や精製に有用である。。
【００５４】
本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを家兎に免疫することにより得ることが可能である（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.12〜11.13）。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明の蛋白質または部分ペプチドを用いてマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4〜11.11）。
【００５５】
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞等から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療等の目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス（例えば、「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice, Mendez, M.J. et al.(1997) Nat.Genet.15:146-156」参照）に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる(Methods in Enzymology 203, 99-121(1991))。
【００５６】
本発明は、次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を検出する方法に関する。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞のアポトーシスを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程。
【００５７】
前記検出方法において、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、対象となる蛋白質がアポトーシス誘導活性を持つことを言う。当該活性は先に述べた方法により確認することができる。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞としては、本発明の蛋白質の発現によりアポトーシスが引き起こされる細胞であれば真核細胞または原核細胞のいずれをも用いることが可能である。好ましくは動物細胞が用いられ、中でもPC12のような神経細胞が好ましい。
【００５８】
前記検出方法において、アポトーシスが誘導される条件とは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質が細胞内で発現される条件である。本発明の蛋白質の細胞中での発現はアポトーシスに直結するので、そのままでは効率的なスクリーニングが期待できない。そこで、制御可能なプロモーター配列の下流に本発明の蛋白質をコードする遺伝子を結合させた発現プラスミドを利用することができる。制御可能なプロモーターとしては、例えばメタロチオネインプロモーター等を示すことができる。このようなプロモーターの制御下に本発明の活性型蛋白質をコードする遺伝子を発現するプラスミドを細胞に形質転換する。このようにして得られた形質転換体は、プロモーターを活性化させた条件下でアポトーシスが引き起こされる。
【００５９】
前記細胞のアポトーシスを測定する工程では、細胞の形態の変化やDNAの断片化を指標として検出する方法を採用することが一般的である。アポトーシスによる細胞の形態学的な変化は、ギムザ染色や蛍光染色の染色像の変化として観察される。あるいはDNAの断片化は、TUNEL法(Gavriel Y rt al, 1992 J Cell Biol, 119:493-501)によって検出することができる。さらに、初期のアポトーシスを検出する方法として、構造変化した細胞膜に結合する蛍光標識Annexin Vとフローサイトメーターで測定するAnnexin V法等がある(Vermes I,et al. J Immunol Methods. 1995 Jul 17;184(1):39-51.)。
【００６０】
前記アポトーシスを制御する活性の検出方法は、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって候補物質のアポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記細胞のアポトーシスを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００６１】
あるいは本発明は、次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する方法に関する。
（１）候補物質の存在下、配列番号：１、または、配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを発現させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシス、神経細胞の分化、及び、神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する工程。
【００６２】
前記検出方法において、配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域は、染色体DNAから公知の方法によってクローニングすることができる。たとえばS1マッピング法が転写開始点の特定方法として公知である（「転写調節領域の単離」および「転写制御因子の同定と精製」、「細胞工学 別冊8 新細胞工学実験プロトコール」、東京大学医科学研究所制癌研究部編 秀潤社1993年、p362-374）。一般に当該遺伝子の発現制御領域DNAは、ヒト染色体ライブラリー (genomic library) を、当該遺伝子の5'末端の１５〜１００bp、好ましくは３０〜５０bpをプローブDNAに用いてスクリーニングすることにより、発現制御領域を含む遺伝子クローンとしてクローニングされる。
【００６３】
このようにして得られたクローンはしばしば１０kbp以上の当該遺伝子の5'非翻訳領域を包含している。そこで、これらのクローンの5'末端をエキソヌクレアーゼ処理などによって短縮化、あるいは断片化する。短縮された発現制御領域を含む配列でレポーター遺伝子の発現の強さや発現の制御についての評価を行うことによって、発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を得ることができる(deletion study)。
【００６４】
また、遺伝子の発現制御領域をNeural Network を用いて予測するプログラムが公知である(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, Reese, M.G.,et al, "Large Scale Sequencing Spesific Neural Networks for Promoter and Splice Site Recognition" Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, edited by Lawrence Hunter and Terri E. Klein , World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996)。あるいはPromoter Scanのような転写因子結合配列を検索して発現制御領域を予測するプログラムを用い活性の最小単位を予測することも行われている(http://biosci.cbs.umn.edu/software/proscan/promoterscan.htm, Prestridge, D.S. 1995, Prediction of Pol II Promoter Sequence using Transcription Facter Binding Sites. J. Mol. Biol. 249: 923-932)。また、予測されたコアの部分を中心にdeletion studyを実施することもできる。
【００６５】
このようにして単離された本制御領域遺伝子の下流に、レポーター遺伝子を機能的に結合させた発現ベクターは、アポトーシス、神経細胞の分化、あるいは神経細胞の増殖を制御する活性の検出に用いることができる。本発明において、機能的な結合とは、前記発現制御領域の活性化によって、レポーター遺伝子の転写が開始されるように両者を結合することを意味する。レポーター遺伝子には、前記発現制御領域の活性化を遺伝子の発現として観察することができる蛋白質をコードするものであれば任意の遺伝子を利用することができる。具体的には、例えばルシフェラーゼ、カタラーゼ、βガラクトシダーゼ、GFP（Green Fluorescent Protein）等の遺伝子がレポーター遺伝子として一般に用いられる。ベクターを導入する細胞には、例えば当該遺伝子を欠失させた動物細胞を用いることができる。
【００６６】
上記ベクターを導入した細胞は、細胞死（アポトーシス）、または細胞の分化／増殖を引き起こすような条件下でプロモーターが活性化され、レポーター遺伝子によるシグナルを生成する。得られた細胞を96ウエルマルチプレートに播種し、アポトーシス、または細胞の分化／増殖を引き起こす条件下で培養を開始する。このとき評価すべき化合物を各ウエルに加えることにより、当該遺伝子の発現制御領域に作用して、発現を抑制する、あるいは促進する活性をレポーター遺伝子を指標として容易に検出することができる。
【００６７】
例えば、レポーター遺伝子としてGFPを用いた場合、候補物質を加えた状態および加えない場合でのGFPの発光量の比較を行うことにより、発現制御領域に対する影響を評価することができる。比較にあたっては、たとえば２倍以上若しくは１／２以下、好ましくは５倍若しくは１／５以下、より好ましくは１０倍以上若しくは１／１０以下の発光量比を示す場合に、有意な差があると判定することができる。本方法は動物細胞ばかりでなく同様なシステムで細胞死、または細胞の分化／増殖を引き起こすような宿主であれば、真核生物・原核生物を問わず応用することができる。このとき、細胞はレポーター遺伝子が発現可能な条件下で培養される。
【００６８】
また、レポーター遺伝子を含む前記発現ベクターは、in vitroの実験系において用いることもできる。すなわち、in vitro蛋白質合成に必要とされる無細胞抽出液に、本発現ベクターとともに、緩衝液、アミノ酸、エネルギー源であるATPおよびGTPを供給し、候補物質によるレポーター遺伝子の発現の阻害または促進を検定することができる。本方法で用いる無細胞抽出液としては、動物神経細胞と同様なシステムにより細胞死、または、細胞の分化／増殖を引き起こすような宿主由来のものを用いることができる。
ここで、アポトーシスを引き起こすような条件、細胞の分化／増殖を引き起こすような条件とは、前記発現制御領域からの指令によりレポーター遺伝子の発現が誘導される条件を言う。
【００６９】
前記アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性の検出方法は、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって、候補物質のアポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００７０】
加えて、本発明は次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性の検出方法に関する。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）神経突起の伸展が誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞の神経突起の伸展を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、神経細胞の分化および／または増殖を抑制、または促進する活性を検出する工程。
【００７１】
前記検出方法において、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質とは、対象となる蛋白質が神経細胞の分化および／または増殖活性を持つことを言う。当該活性は、神経細胞の分化および／または増殖を指標として行われる。例えば、PC12細胞等の神経細胞における神経突起伸展作用を検出することにより行うことができる。
【００７２】
前記検出方法は、例えば次のようにして実施することができる。HJ06972遺伝子若しくはAF06972によりコードされる蛋白質、または該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を発現するように作成されたPC12等の細胞に対し候補物質を接触させる。このとき、細胞を可視化できる蛋白質を発現させるように形質転換した細胞を用いると観察が容易となる。このような蛋白質としては、GFPを用いることができる。その後、神経細胞の数や分化の変化を観察することにより、目的とする活性を検出することができる。細胞の分化は神経突起の進展などを指標として評価することができる。
【００７３】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞としては、本発明の蛋白質の発現により分化および／または増殖が引き起こされる神経細胞であればいずれの細胞を用いることが可能である。好ましくはPC12等のクローン化された神経細胞株が用いられる。
前記検出方法において、神経突起の伸展が誘導される条件とは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質が細胞内で発現される条件である。
【００７４】
前記神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性の検出方法は、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価に利用することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価方法に関する。
（１）前記検出方法によって候補物質の神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する候補物質を選択する工程。
【００７５】
本発明の評価方法に用いる候補物質は特に制限されない。具体的には、たとえば細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物等が挙げられる。あるいは、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を認識する抗体も、スクリーニングに用いる候補物質として有用である。一方、本発明の評価方法における対照には、本発明の蛋白質の機能、または発現レベルに影響を与える（もしくは与えない）ことが判明している化合物を用いることができる。
更に、本発明における蛋白質の活性を調節する活性の検出方法には、機能的に同等な蛋白質を利用することができる。たとえば、HJ06972に対してAF06972は、アミノ酸配列レベルで約90%の相同性を備えている。このことは、これらの蛋白質と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質が、いずれも同様の活性を有していることを裏付けている。したがって、配列番号：２または配列番号：４に記載のアミノ酸配列に対して、90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質は、本発明による活性の検出方法において、好ましい蛋白質として用いることができる。また同様に、ハイブリダイズやアミノ酸の置換によって得ることができる機能的に同等な蛋白質も、上記活性の検出方法に用いることができる。
本発明の評価方法は、目的とする活性を有する化合物のスクリーニング方法や、化合物のキャラクタリゼーション等に利用することができる。たとえば、幅広い物質に対して本発明に基づく評価方法を実施し、目的とする活性に優れる化合物の選択を繰り返すことにより、スクリーニングを実施することができる。あるいは、前記検出方法を利用して、特定の化合物の特性を解析することもできる。
この評価により単離される化合物は、本発明の蛋白質の活性、あるいはその発現を促進または阻害する化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）の候補となる。また、生体内において、本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。これら化合物は、本発明の蛋白質が関連する疾患の予防や治療のための医薬品として応用が考えられる。
【００７６】
更に本発明は、本発明の評価方法によって得ることができる物質の医薬用途に関する。すなわち本発明は、前記評価方法によって選択される化合物の、細胞死の制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【００７７】
本発明において細胞死に特徴付けられる疾患とは、異常な細胞死によってもたらされる疾患を意味する。たとえば細胞死によってもたらされる疾患としては、脳虚血によってもたらされる脳組織障害などを示すことができる。本発明のアポトーシス関連因子の機能や産生そのものを阻害する化合物は、次のような細胞死の制御に利用することができる。
（１）虚血による細胞死
（２）慢性ウイルス性疾患における細胞死、あるいは
他の病原微生物による慢性疾患における細胞死
（３）自己免疫反応による炎症とそれに伴う細胞死
（４）原因不明だが細胞死とそれに伴う変性による疾患（アルツハイマー等）
【００７８】
これらの細胞死は、例えば次のような疾患によってもたらされる。従って、本発明の評価方法によって選択される化合物は、次のような疾患の治療に用いることができる。
脳血管障害性痴呆、多発性微小脳梗塞、脳血栓症、脳梗塞、脳出血、心筋梗塞、心筋炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、インスリン依存性糖尿病（膵臓ランゲルハンス島細胞の免疫反応性細胞死による）
この他、本発明によって選択される化合物を白血病などの癌の治療に用いることもできる。癌は、悪性腫瘍細胞における細胞死の制御が不完全な病態である。したがって、本発明によって選択される化合物の投与によって、悪性腫瘍細胞の細胞死を誘導することができれば、治療効果を期待できる。
【００７９】
あるいは本発明は、前記評価方法によって得ることができる化合物を主成分として含有する、細胞分化、または増殖の制御における使用に関する。あるいは本発明は、これらの化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞分化、または増殖に特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
【００８０】
本発明において細胞の分化または増殖に特徴付けられる疾患とは、細胞分化や増殖が不充分なことによってもたらされる疾患を意味する。細胞の分化、あるいは増殖が不充分なことによってもたらされる疾患としては、たとえばアルツハイマーに代表される神経変性疾患等を示すことができる。この他、種々の原因によって生じた組織の障害が完全に修復されない状態も、細胞の分化、あるいは増殖が不充分なことによる病態と言うことができる。より具体的には、脳梗塞や脳虚血の結果もたらされる神経組織の障害の修復が不完全な状態は、神経変性疾患に含まれる。本発明に基づいて、分化、または増殖を誘導すべき細胞としては、神経細胞が望ましい。
【００８１】
本発明によって選択される化合物は、細胞死と、細胞の分化・増殖という、異なる作用を有する。既に述べたように、本発明の評価方法において標的とする分子であるHJ06972あるいはAF06972は、いずれも細胞死と細胞の分化・増殖という２面的な機能を有している。したがってその活性や発現を調節する化合物も、２面的な作用を有する可能性はある。しかしながら、特定の病態において、適切な化合物を投与すれば、これらの化合物を、様々な疾患の治療に利用することが可能であることは言うまでも無い。
【００８２】
更に本発明は、下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、細胞増殖、細胞分化、または細胞死によって特徴付けられる疾患の治療剤に関する。
（ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
本発明の治療剤は、アポトーシス、神経細胞の増殖、および神経細胞の分化から選択されるいずれかの現象によって特徴付けられる疾患の治療に用いられる。
【００８３】
本発明の蛋白質、ヌクレオチド、抗体および上記評価方法により単離される物質は、アポトーシス、細胞分化、または細胞増殖を調節するために有用である。また、本発明においてこれらを医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。
【００８４】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等、当業者に公知の方法により行い得る。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することができる。また、該化合物がDNAによりコードされ得るものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
投与量や投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動する。当業者であれば、必要に応じて投与量や投与方法を適宜選択することができる。
【００８５】
さらに本発明は、以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖が調節されたモデル動物に関する。
(ａ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(ｂ)配列番号:１、または配列番号:３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｃ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｄ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
たとえば本発明の蛋白質を過剰発現させたトランスジェニック動物は、神経変性疾患を誘導するモデル動物として、神経変性疾患の治療薬の評価に用いることができる。
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、本発明は該実施例に限定されない。また本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８６】
【実施例】
１．AF06972遺伝子のクローニング
かずさDNA研究所より入手したHJ06972（KIAA1079）遺伝子を制限酵素XhoIおよびNotIで切り出し、pcDNA3.1（Invitrogen）のXhoI／NotIサイトに挿入した。
ヒト脳由来ｃDNA（Quick clone cDNA, Clontech）から、atgacttcgagacacaggac（配列番号：７）とtcaggtgtgtgagggaaaagct（配列番号：８）のプライマーを用いてPCR法により、約820bpのAF06972遺伝子断片を取得した。得られたAF06972遺伝子断片はTA vectorであるpT7-blue2にサブクローニングを行った後、DNAシークエンサーモデル310（PE Biosystems）によりDNA配列を確認した。上記HJ06972遺伝子が導入されているpcDNA3.1ベクターから、制限酵素XbaIおよびPvuIを用いて切り出したHJ06972遺伝子断片と、制限酵素PvuIおよびXhoIで切り出したAF06972遺伝子断片の両方をpBluescript IIベクターのXbaI-XhoIサイトにサブクローニングし、約4.8kbの全長AF06972遺伝子を取得した。
【００８７】
２．AATYKおよびAF06972遺伝子の組織発現分布
Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech)と定量型RT-PCRを用いて、ヒトの組織におけるAF06972遺伝子の発現分布解析を行った、即ち、SYBR Green RT-PCR reagents (PE biosystems)の試薬とPRISM 7700(PE Biosystems)の装置を用いて、メーカーの使用説明書に従って以下の条件にて実験を行った。
水 18μl、Multiple Tissue cDNA Panels 5μl、プライマー(5μM) 各1μl hAF06972 forward：atgatgtcacagtctacctgt（配列番号：９）
【００８８】
３．HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子の発現解析
HJ06972遺伝子と、そのalternative splicing formであるAF06972遺伝子の発現の違いが検出できるプライマーを用いて、ヒト脳、ヒト培養神経細胞（SH-SY5Y細胞、NT2neuron細胞）における発現量の差を評価した。このプライマーでは、HJ06972遺伝子については約395bp、AF06972遺伝子については315bpのPCR産物が得られる。HJ06972遺伝子は非常にわずかしか発現が認められず、大部分はAF06972遺伝子であった。同様に、AATYK遺伝子においてもHJ06972遺伝子に相当する部分におけるalternative splicing formが存在するか発現解析を行った。AATYKについては、ほとんどalternative splicing formは検出されず、大部分がATTYK遺伝子であった。（図３）
【００８９】
更に、HJ06972とAF06972に相当するマウスとラットにおけるalternative splicing formの探索を試みた。すなわち、AF06972の挿入塩基配列を挟んでプライマーを設定し、挿入塩基配列の有無に関わらず、増幅が行えるようにした。もしもHJ06972とAF06972とに相当するalternative splicing formが存在すれば、大きさの異なる２つの増幅産物が確認できるはずである。PCRに用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
その結果、マウスとラットにおいては、AF06972に相当するバンドのみが観察された。ラットとマウスにおいては、HJ06972に相当するalternative splicing formは確認できなかった。したがって、本発明において見出された新規なalternative splicing formであるAF06972は、ヒトのみならず、マウスとラットにおいても主要な発現産物であると考えられた。
【００９１】
４．PC12細胞における遺伝子導入による神経突起伸展作用
PC12にEGFP（enhanced GFP, Clontech）と目的の遺伝子をエレクトポレーション法を用いて以下の条件にて導入した。
5×106 細胞/ml 培地（RPIM 1640+ 10% HS+ 5% FBS） 250μl
EGFP プラスミド 4μg
目的遺伝子 8μg
250V、950μF
Collagen type IVコーティングを施したウェルで18〜24時間培養した後、培地を交換した。さらに48時間培養した後、G-418を添加した。4日間培養後、顕微鏡下で観察を行った。
【００９２】
実験は３回繰り返し、結果はEGFPを遺伝子導入のコントロールとし、4〜7視野、31〜150のEGFP positive細胞について、神経突起の伸展が見られるものの割合を算出した。結果は次の式によって算出した神経細胞の伸展率(% of neurite outgrowth)で表した。また、低濃度（1ng/ml）のNGFの神経突起伸展作用に対する各遺伝子の影響についても同様に評価した。
神経細胞の伸展率＝（伸展が見られた細胞数／総細胞数）×１００
【００９３】
HuC、PKA、hAATKY（HJ03494）、HJ06972のいずれもがコントロールに比べて、遺伝子を過剰発現させた場合において、神経突起の伸展作用を示すことが確認された。HJ06972では、神経突起の伸展作用が従来報告されているHuCよりもさらに強い作用が観察された（図４）。低濃度のNGFによる神経突起伸展作用に対しても他に比べて最も強い促進作用が確認された（図５）。
【００９４】
５．HJ06972のCREB転写活性の測定
上記のPC12を用いた神経突起伸展作用の検討により、HJ06972が過剰発現により神経突起伸展作用を有することが明らかになった。PC12細胞における神経突起の伸展には多くの場合、CREB転写活性が関与しているのでHJ06972のCREB転写活性について検討した。
まず、PC12を各ウェルに1×106細胞播き、一晩37℃でインキュベーションした。PC12細胞へCRE-ルシフェラーゼ レポーター遺伝子pCRE-Luc（Stratagene）、および目的遺伝子（HJ06972）発現ベクターをリポフェクトアミン法で導入した。CRE-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を2.0μｇ、および目的遺伝子（HJ06972）発現ベクター1.0μgを細胞上清（RPMI1640＋20％ウマ血清＋10％ウシ血清）に加え、一晩インキュベーションして細胞内にベクターを導入した。得られた形質転換細胞を、１日培養した後に1ng/mlのNGFを添加し、６時間後にCREBの転写活性をルシフェラーゼによるレポーター遺伝子分析により検討した。
その結果、HJ06972遺伝子の導入により、CREBの転写がわずかに活性化される傾向が観察された。同様にAATYKでも非常にわずかにCREB転写活性が上昇することが明らかになった（図６）。このことにより、HJ06972の神経突起伸展作用には、このCREB転写活性促進が関与している可能性が考えられた。
【００９５】
６．Jurkat細胞における遺伝子導入によるアポトーシス誘導作用
HJ06972のアポトーシス誘導活性を調べるために、Jurkat細胞にHJ06972遺伝子または既知のアポトーシス関連遺伝子を導入し、アポトーシスを起こした細胞の数を調べた。
まず、コンフルエントになるまで培養した2mlのJurkat細胞を、18mlの新しい培地に加えることにより、細胞を培養した。培地には10％ ウシ胎仔血清（FBS）含有RPMI 1640を用いた。
【００９６】
次に、エレクトロポレーション法を用いて、Jurkat細胞に目的遺伝子を導入した。具体的には、細胞を遠心して回収した後、培地に再懸濁し、5×106細胞/mlの細胞懸濁液を調製した。目的遺伝子の組み込まれたプラスミドを、プラスミドDNAの最終濃度が10μg/250μlになるように細胞懸濁液に加え、氷上で10分間静置した。この溶液250μlをエレクトロポレーション用キュベットに移し、GenepulserII（Bio-Rad）で250V、950μFのパルスを与えることにより、遺伝子を導入した。氷上で10分間静置した後、4mlの1μM thapsigargin添加、または不添加培地を用いて、24時間培養した。
細胞をチューブに回収し、遠心により上清を除いた。各チューブに2μM Rhodamine 123を加え、37℃、5％ CO2下にて20分間インキュベートした。遠心により上清を除いた後、PI液を加えてアポトーシスを起こした細胞をFACSで解析した。
【００９７】
Bad、Caspase3、HJ06972の遺伝子を過剰発現させた場合には、アポトーシス誘導活性が見られた。これとは逆に、Bcl2の遺伝子を過剰発現させた場合には、アポトーシス抑制活性が見られた（図７）。さらに、1μMのthapsigarginを添加した場合には、thapsigarginを添加しなかった場合と同様の傾向が見られた。ただし、特にHJ06972遺伝子を過剰発現させた場合については、thapsigarginのアポトーシス誘導活性を促進する傾向が見られた（図７）。
thapsigarginを添加すると細胞質内のCa2+濃度が上昇し、CREBがリン酸化を受けて活性化すると考えられることから、HJ06972のアポトーシス誘導作用にも、CREB転写活性促進が関与している可能性が示唆された。
【００９８】
７．アポトーシスの誘導に伴うAATYKとmAF06972の発現レベルの変化
１X106個のマウスB細胞系培養細胞であるBa/F3 細胞（RCB0805, RIKEN Cell Bank)を10％ FCSと５ng/mlのマウスインターロイキン−３(IL-3)を含むRPMI培地で３７℃、５％ CO2の条件で培養する。細胞をPBSで３回洗浄した後、IL-3を除いた10％ FCSを含むRPMI培地に交換して５％ CO2の条件で培養しアポトーシスの誘導を行った。IL-3を除去後、０、４、８、１２、２４、および４８時間後の細胞を回収して、RT-PCRによってAATYKとAF06972遺伝子の発現解析を行った。ＰＣＲに用いたprimerの塩基配列はそれぞれ以下のとおりである。
その結果、 AATYKとAF06972遺伝子はIL-3除去によるBa/F3 細胞のアポトーシスの誘導にともない、経時的に発現量の増加が観察された。
【００９９】
【発明の効果】
本発明により、新規な遺伝子AF06972が提供された。この遺伝子は、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を有する蛋白質をコードしている。更に本発明は、その構造は既知であるが機能は解明されていないHJ06972遺伝子が、AF06972遺伝子によってコードされる蛋白質と同じ活性を有する蛋白質をコードしていることを明らかにした。
【０１００】
本発明によって見出された、これらの蛋白質の神経細胞の分化誘導活性は強力である。したがって、この蛋白質は、神経細胞の分化や増殖において重要な役割を有すると思われる。そのため、この蛋白質そのもの、あるいはこの蛋白質をコードする遺伝子は、神経細胞の分化や増殖、あるいは細胞死が関連する多くの疾患の診断指標として重要である。これら蛋白質や遺伝子の測定方法と、その測定方法に基づく診断方法を実現した本発明の意義は大きい。
あるいはこの蛋白質そのもの、あるいはこの蛋白質の活性や発現を調節することができる化合物は、神経細胞の細胞死や分化・増殖が関与する疾患において、有用な治療剤となる。
【０１０１】
これらの遺伝子によってコードされる蛋白質は、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、これらのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、正常な制御を失った細胞に細胞死をもたらすことによって治療効果を達成することができる。あるいは、神経細胞の分化や増殖を通じて、治療効果を達成することができる。
【０１０２】
更に本発明は、これらのポリヌクレオチドのアンチセンス、あるいはこれらのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質に対するドミナントネガティブの形質を有する蛋白質も、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。より具体的には、これらのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０３】
あるいは本発明は、AF06972遺伝子、HJ06972遺伝子、あるいはこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用した、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を調節する活性を検出する方法を提供する。加えて本発明は、この方法を応用した、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を調節する活性を有する候補物質の評価方法を提供する。
【０１０４】
本発明の評価方法によって得ることができる化合物も、細胞死、あるいは神経細胞の分化や増殖によって特徴付けられる疾患の治療に有用である。たとえば本発明によって得ることができる、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を抑制(down regulation)する化合物は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０５】
逆に、本発明によって得ることができる、アポトーシスを誘導する活性、並びに神経細胞の分化あるいは増殖を誘導する活性を促進(up regulation)する化合物は、疾病の原因となっている異常な細胞死を抑制することによって治療効果を達成することができる。あるいは、疾患の原因となっている神経細胞の異常な分化や増殖を抑制することにより、治療効果を達成することができる。
【０１０６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスチロシンキナーゼAATYKとHJ06972によりコードされる蛋白質の構造を比較する図である。
【図２】 HJ06972遺伝子、および該遺伝子にコードされる蛋白質と、そのalternative splicing formであるAF06972遺伝子、および該遺伝子にコードされる蛋白質の構造を比較する図である。
【図３】 HJ06972遺伝子とAF06972遺伝子の各種細胞における発現レベルを比較した図である。
【図４】 PC12細胞へのHJ06972遺伝子導入による神経突起伸展作用を示す写真である。
【図５】 PC12細胞への各種遺伝子の神経突起伸展作用を比較するグラフである。図中、縦軸は、神経細胞の伸展率(% of neurite outgrowth)を、横軸は導入した遺伝子を示す。
【図６】 HJ06972遺伝子のCREBの転写活性に対する作用を示すグラフである。図中、縦軸は対照を１とする相対的なCREB転写活性（率）を、横軸は導入した遺伝子を示す。
【図７】 Jurkat細胞における核種遺伝子導入によるアポトーシス誘導作用を解析した結果を示すグラフである。縦軸はアポトーシスを起こした細胞の割合(%)を、横軸はJurkat細胞に導入した遺伝子を示す。グラフの右側がThapsigargin(１μM)を添加したとき、そして左側が無添加の場合の結果である。
【図８】 マウスBa/F3 細胞のIL-3の枯渇によって誘導されるアポトーシスに伴う、マウスチロシンキナーゼAATYKとmAF06972の発現レベルの変化を示す写真である。Mは分子量マーカーを、また０−４８はIL-3を除去後の経過時間を示している。
Claims (27)
- 下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 - 配列番号：６に記載のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号：５から選択された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載のベクターを保持する形質転換体。
- 請求項７に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項５に記載の蛋白質の製造方法。
- 配列番号：５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１５塩基の長さを有するポリヌクレオチド。
- 配列番号：６に記載のアミノ酸配列によって構成される抗原決定基を認識する抗体。
- 配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を認識する抗体。
- 請求項５に記載の蛋白質と、該蛋白質を認識する抗体の免疫学的な反応を観察する工程を含む、請求項５に記載の蛋白質の免疫学的測定法。
- 次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）アポトーシスが誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞のアポトーシスを測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程 - 次の工程を含む、アポトーシスを制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項１３に記載の方法によって候補物質のアポトーシスを抑制、または促進する活性を検出する工程、および
（２）対照と比較して、前記細胞のアポトーシスを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程 - 次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する方法。
（１）候補物質の存在下、配列番号：１、または、配列番号：３に記載の塩基配列からなる遺伝子の発現制御領域と、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを発現させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、アポトーシス、神経細胞の分化、及び、神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を検出する工程。 - 次の工程を含む、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを制御する活性を有する物質を評価する方法。
（１）請求項１５に記載の方法によって、候補物質のアポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖のいずれかを抑制、または促進する活性を有する候補物質を選択する工程 - 次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する方法。
（１）次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の蛋白質を発現する神経細胞に候補物質を接触させる工程、
（ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質、
（ｄ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列と90％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
（２）神経突起の伸展が誘導される条件下で前記細胞を培養し、前記細胞の神経突起の伸展を測定する工程、および
（３）工程（２）の測定結果を指標として、神経細胞の分化および／または増殖を抑制、または促進する活性を検出する工程 - 次の工程を含む、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する物質の評価方法。
（１）請求項１７に記載の方法によって候補物質の神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を検出する工程、並びに
（２）対照と比較して、神経細胞の分化および／または増殖を制御する活性を有する候補物質を選択する工程 - 細胞増殖、または細胞死の制御における請求項１４、または請求項１６に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
- 請求項１４、または請求項１６に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、細胞増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
- 神経細胞の分化および／または増殖の制御における、請求項１６、または請求項１８に記載の方法によって得ることができる化合物の使用。
- 請求項１６、または請求項１８に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として含有することを特徴とする、神経細胞の増殖、または細胞死に特徴付けられる疾患の治療剤。
- 細胞増殖、または細胞死の制御における請求項５記載の蛋白質、または請求項１〜４に記載のポリヌクレオチドの使用。
- 下記の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質を主成分として含有する、細胞増殖、細胞分化、または細胞死によって特徴付けられる疾患の治療剤。
（ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、（ａ）に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基配列と90％以上のホモロジーを有する塩基配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に対してドミナントネガティブの形質を持つ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。 - 以下の(ａ)〜(ｄ)のいずれかに記載の蛋白質の発現を調節したトランスジェニック非ヒト動物からなる、アポトーシス、神経細胞の分化、および神経細胞の増殖が調節されたモデル動物。
(ａ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
(ｂ)配列番号:１、または配列番号:３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｃ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質
(ｄ)配列番号:２、または配列番号:４に記載のアミノ酸配列と９０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列からなり、(ａ)に記載の蛋白質と機能的に同等な蛋白質 - 生体試料中のアポトーシスマーカーを測定し、該アポトーシスマーカーの測定レベルの上昇をアポトーシスと関連付ける工程を含むアポトーシスの検出方法であって、アポトーシスマーカーが次の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質である方法。
（ａ）配列番号：３に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：５に記載の塩基配列を含み、配列番号：３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｅ）配列番号：５に記載の塩基配列から選択された塩基配列を含み、かつ配列番号：３に記載の塩基配列と７０％以上のホモロジーを有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、 - 次の工程を含む、劇症肝炎の診断方法。
（１）請求項２６に記載の方法によって、肝細胞を生体試料としてアポトーシスを検出する工程、および
（２）工程（１）においてアポトーシスが検出された場合に、劇症肝炎が進行していると判定する工程
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