WO2003080836A1 - Genes de regeneration des nerfs - Google Patents

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WO2003080836A1
WO2003080836A1 PCT/JP2003/003713 JP0303713W WO03080836A1 WO 2003080836 A1 WO2003080836 A1 WO 2003080836A1 JP 0303713 W JP0303713 W JP 0303713W WO 03080836 A1 WO03080836 A1 WO 03080836A1
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seq
protein
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acid sequence
polynucleotide
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PCT/JP2003/003713
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Sousuke Miyoshi
Junko Zenkoh
Susumu Satoh
Shintaro Nishimura
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Kazusa Dna Research Institute
Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an apoptosis-related factor having an activity of inducing apoptosis, differentiation of nerve cells, and proliferation of nerve cells, a polynucleotide encoding the factor, a method for producing the factor using the polynucleotide, An expression system involved in their production, a method for detecting apoptosis-inducing activity, neural cell differentiation, and neural cell proliferation activity using the expression system, or a method for evaluating a compound that regulates the activity;
  • the present invention relates to a therapeutic agent for a disease characterized by cell proliferation or cell death, comprising an apoptosis-related factor or a polynucleotide encoding the factor as an active ingredient.
  • the present invention also relates to an antibody recognizing the apoptosis-related factor of the present invention, an immunological assay for the factor using the antibody, and further characterized by cell proliferation or cell death using the compound obtained by the above-described evaluation method. And a therapeutic agent for the disease.
  • Apoptosis or programmed cell death, is the death of cells that they cause themselves under physiological conditions. The survival of multicellular organisms requires a mechanism to eliminate unwanted or unnecessary cells from the body. Apoptosis was understood to be the death of pre-produced cells to eliminate cells that are no longer needed during development or during cell generation. In apoptotic cells, shrinkage of the nucleus and fragmentation of DNA are observed, and the cells regress, leaving the membrane behind. In living organisms, phagocytic cells prey on and eliminate the regressed cells. In contrast to apoptosis, cell death, called death, involves the destruction of cellular structures. Therefore, apoptosis, in which cells die themselves, is often referred to as “clean cell death”.
  • TNF and Fas are typical cytokines that induce apoptosis.
  • Apoptosis is also induced by stimuli such as irradiation with ultraviolet rays, depletion of cell growth factors, and activation of certain oncogenes.
  • Diseases such as autoimmune diseases and cancer have also come to be understood as a result of the inability to kill harmful cells due to apoptotic dysfunction.
  • the process by which cells undergo apoptosis in response to external stimuli is roughly described as follows. That is, it has been revealed that the Caspase family activated by various causes causes cell death.
  • caspase families are roughly divided into three groups according to their substrate specificities. Of these, group 2 caspases are said to be involved in the execution of apoptosis. Group 3 caspases are activated in response to extracellular stimuli, upstream of the apoptotic execution cascade, and act to activate the more downstream group 2 caspases. Group 1 caspases, on the other hand, are said to have the effect of promoting cytokine production and secretion. Caspases classified into groups 2 and 3 and the amino acid sequences recognized by them are shown below.
  • Group 3 caspases are activated by binding of ligands to Fas and TNF receptors, cleave and activate group 2 caspases, and transmit signals downstream. Such signal transmission is called the apoptotic execution power scale. Downstream of the apoptotic execution cascade, it is speculated that a variety of signaled factors are acting as executive forces to cause cell death. However, there are many issues that need to be clarified about what factors actually cause cell death. For example, some Caspases are nuclease inhibitors
  • Disassemble ICAD inhibitor of CAD.
  • nuclease CAD Caspase Activated DNase
  • Apoptosis is also an important process in the development of the nervous system (Johnson EM and Deckworth, Ann. Rev. Neurosci., 16: 31-46 (1993); Oppenheim RW, Annu. Rev. Neurosci., 14: 453-501). (1991); Raff MC et al., Science 262: 695-700 (1993)).
  • Apoptosis is tightly regulated by physical and environmental signals. Apoptosis is inhibited by growth factors such as inulin-like growth factor I (IGF-1), which regulates the survival and proliferation of normal and abnormal nerve cells (D, Mello SR et al., J. Biol. Neurosci. 17: 1548-1560 (1997); Rukenstein A et al., J. Neurosci. 11: 2552-2563 (1991); Sc lessinger J et al., Neuron 9: 383-391 (1992); Yao R and Cooper GM, Science 267: 2003-2006 (1995)).
  • IGF-1 inulin-like growth factor I
  • Apoptosis is also thought to be related to neuronal cell death that occurs in ischemic diseases (Choi DW and Rothman SM., Annu. Rev. Neurosci., 13: 171-182 (1990)). ing.
  • Genes related to neuronal apoptosis include AATYK (Apoptosis
  • MTYK Associated Tyrosine Kinase
  • the 200 kDa protein encoded by the offspring has a tyrosine kinase domain at the N-terminus, a proline-rich C-terminus, and a 16 PXXP motif that constitutes a minimal SH3 binding motif. It has been reported that the expression of MTYK is strongly induced during apoptosis by removing the cytoplasmic force of blood cells.
  • MTYK gene is thought to be essential for inhibiting growth of spinal cord progenitor cells and inducing apoptosis.
  • the MTYK protein is particularly highly expressed in the brain, and its expression is known to increase with neuronal differentiation (Baker SJ et al., Oncogene, 20: 1015-1021 (2001); Tomura M et al. al., Oncogene, 20: 1022-1032 (2001)).
  • MTYK is an enzymatically active non-receptor kinase present in the cytoplasm near the nuclear envelope, and induces cell division of cells such as adrenergic neuroblastoma SH-SY5Y cells by overexpression, and Is known to promote neuronal differentiation induced by retinoic acid (RA), 12-0 “tetradecanoylphorbol 13-acetate, and IGF-1 etc.
  • CREB transcription factor
  • CRE cyclic AMP
  • the present inventors have identified two proteins that have motifs structurally similar to the kinase domain of mouse MTYK. A region common to both amino acid sequences was found, and it was considered to be an alternative splicin dafoam.
  • One of these proteins was a protein comprising a novel amino acid sequence discovered by the present inventors.
  • the present inventors have confirmed that these proteins have apoptosis-inducing activity.
  • the present inventors also analyzed the effects of these proteins on nerve cells. As a result, they have found that these proteins, in addition to the apoptosis-inducing action, strongly induce the differentiation and proliferation of nerve cells. Furthermore, AF06972 was highly expressed in the brain, indicating a close association with nerve cells.
  • the protein or a gene encoding the protein can be used to detect the apoptosis-inducing activity of a candidate substance or the effect of regulating the activity of inducing neuronal cell proliferation. This has been made clear and the present invention has been completed. Further, based on this detection method, the present inventors have established a method for evaluating a compound having an activity of regulating apoptosis-inducing activity or an activity of inducing differentiation or proliferation of nerve cells. Was.
  • the present invention relates to the following polynucleotides and proteins encoded by the polynucleotides.
  • the present invention relates to a detection method and use of the polynucleotide or the protein.
  • the present invention relates to a method for detecting an activity regulating these activities using a protein having an apoptosis-inducing activity or a neural cell differentiation / proliferation activity.
  • the present invention relates to a method for evaluating a compound having an activity of regulating these activities based on the detection method.
  • the present invention also relates to uses of the compound obtainable by the above evaluation method.
  • nucleotide sequence selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to a protein consisting of an amino acid sequence [2] a polynucleotide encoding an amino acid sequence selected from the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 6;
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 an amino acid comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and having one or several amino acids substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide comprising a sequence and encoding a protein having a dominant-negative trait with respect to the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • [6] A vector comprising the polynucleotide of any one of [1] to [4].
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, or a polynucleotide having a length of at least 15 nucleotides, comprising a nucleotide sequence complementary to the complementary strand thereof.
  • a method for detecting apoptosis controlling activity comprising the following steps.
  • step (3) A step of detecting an activity that suppresses or promotes apoptosis using the measurement result of step (2) as an index
  • a method for evaluating a substance having an activity of controlling apoptosis comprising the following steps.
  • a method for detecting an activity that controls any of apoptosis, neuronal cell differentiation, and neuronal cell proliferation comprising the following steps.
  • Apoptosis, neuronal differentiation, and ⁇ a step of detecting an activity that controls any of the proliferation of nerve cells.
  • a method for evaluating a substance having an activity of controlling any of apoptosis, neuronal cell differentiation, and neuronal cell proliferation comprising the following steps.
  • a method for detecting an activity controlling neuronal cell proliferation and / or proliferation comprising the following steps.
  • step (3) A step of detecting an activity that suppresses or promotes differentiation and / or proliferation of nerve cells using the measurement result of step (2) as an index -1 o-
  • a method for evaluating a substance having an activity of controlling neuronal cell proliferation and Z or proliferation comprising the following steps.
  • a therapeutic agent for a disease characterized by cell proliferation or cell death comprising as a main component a compound obtainable by the method according to (14) or (16). .
  • treatment for a disease characterized by nerve cell proliferation or cell death comprising as a main component a compound obtainable by the method according to [16] or [18].
  • Agent for a disease characterized by nerve cell proliferation or cell death, comprising as a main component a compound obtainable by the method according to [16] or [18].
  • (e) consists of a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 one or several amino acids consist of an amino acid sequence having substitution, deletion, insertion, Z or addition, and No .: 2, or a polynucleotide encoding a protein having a dominant negative character with respect to the protein consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
  • a model animal in which apoptosis, neuronal cell differentiation, and neuronal cell proliferation are regulated comprising a transgenic non-human animal in which expression of the protein according to any one of the following (a) to (d) is regulated: .
  • one or more amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 Is a protein functionally equivalent to the protein described in (a), which has an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • a method for detecting apoptosis comprising the step of measuring an apoptosis marker in a biological sample, wherein an increase in the measured level of the apoptosis marker indicates apoptosis in the biological sample.
  • an amino acid comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and having one or several amino acids substituted, deleted, inserted, Z or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • (d) comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 A polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein; and
  • (e) contains a base sequence selected from the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5, has at least 70% homology with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3, and is set forth in SEQ ID NO: 4
  • a method for diagnosing fulminant hepatitis comprising the following steps. (1) a step of detecting apoptosis using hepatocytes as a biological sample by the method according to (26), and
  • Step (1) Step of determining that fulminant hepatitis is progressing if apoptosis is detected in step (1)
  • HJ06941 (KIAA1078, GenBank Acc.No.AB029001)
  • HJ06972 (KIM1079, GenBank Acc.No.AB029002)
  • the tyrosine kinase encoded by the human MTYK gene was composed of 1317 amino acids, whereas the protein encoded by the HJ06972 gene was composed of 1451 amino acids. Like the MTYK, the protein encoded by the HJ06972 gene also had a kinase domain at the N-terminal and an SH3 ligand domain at the C-terminal (Fig. 1).
  • the nucleotide sequence of HJ06972 is shown in SEQ ID NO: 1, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the AF06972 gene of the present invention was found in the process of searching for the homologous gene of the HJ06972 gene.
  • the present inventors have assembled the EST base sequence using the base sequence information of the HJ06972 gene whose base sequence has already been determined. as a result, The presence of a gene having an insertion sequence of 94 bp was suspected for HJ06972.
  • the present inventors searched for a gene having this inserted sequence and found the AF06972 gene. Furthermore, the presence of a homolog of the AF06972 gene in mice and rats was also confirmed, confirming that AF06972 is a novel gene. The existence of a homolog of the AF06972 gene in mice and rats is not known.
  • the AF06972 gene has a nucleotide sequence in which 94 nucleotides are inserted at the 4623th position in the nucleotide sequence of the HJ06972 gene.
  • a frameshift occurs in the amino acid sequence encoded by the AF06972 gene due to the inserted base sequence.
  • the protein encoded by the AF06972 gene is 49 amino acid residues longer than the protein encoded by the HJ06972 gene. Therefore, the AF06972 gene can be said to be a novel gene with respect to the HJ06972 gene.
  • the protein consisting of the amino acid sequence encoded by AF06972 is also novel.
  • the present invention provides a protein comprising the following approximately 4.8 kb gene and a 1503 amino acid residue encoded by the gene.
  • the nucleotide sequence of AF06972 is shown in SEQ ID NO: 3, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also includes a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • “functionally equivalent” means that when the target protein has an apoptosis-inducing activity or has a neurite outgrowth activity, the protein is functionally equivalent to the active protein of the present invention. It can be said that.
  • a protein capable of producing an active protein having an apoptosis-inducing activity or a neurite outgrowth effect through some process is functionally equivalent to the protein of the present invention.
  • Processes for producing active protein from inactive protein are limited. Not determined.
  • the same protein exhibits an activity of inducing apoptosis (cell death) and, at the same time, an activity of inducing differentiation and proliferation of nerve cells.
  • apoptosis cell death
  • ASK-1 kinases thought to be involved in apoptosis
  • AATYK HJ03494
  • ASK-1 ASK-1
  • HJ06972 and AF06972 have newly found similar activities for HJ06972 and AF06972.
  • these proteins were considered to have an effect of inducing apoptosis by overexpression as well as a neurite outgrowth effect. Therefore, this kind of protein having kinase activity is expected to have an effect of leading to not only nerve cell death but also nerve cell regeneration through a mechanism such as regulation of expression level.
  • Apoptosis-inducing activity can be confirmed, for example, by expressing a gene encoding the protein in a mammalian cell and observing apoptosis of the cell, as described in Examples. Apoptosis can be confirmed using morphological changes of cells or breakage of chromosomal DNA as indicators. The neurite outgrowth effect was confirmed by, for example, expressing the gene encoding the protein in a cell line of the mammalian nervous system and observing the neurite outgrowth of the cell, as described in Examples. can do.
  • a protein functionally equivalent to the protein identified in this example for example, by introducing a mutation into the amino acid sequence in the protein.
  • a method for introducing a mutation for example, a site-directed mutagenesis method (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jonn Wiley & Sons Section 8.1-8.5) may be shown. it can.
  • proteins may be caused by amino acid mutations in nature.
  • one or several amino acids in its amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or 4
  • SEQ ID NO: 2 or 4 may be substituted, deleted, inserted, and / or added. Different proteins are also included.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in a protein are not particularly limited as long as the function is maintained.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution from the viewpoint of maintaining the function of the protein. For example, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, and Phe Trp are considered to have similar properties because they are all classified as nonpolar amino acids.
  • As the uncharged, Gly, Ser, Thr, Cys , Tyr N Asn include Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu.
  • Examples of the basic amino acid include Lys, Arg, and His.
  • a protein functionally equivalent to the protein of the present invention can be isolated using a hybridization technique or a gene amplification technique well known to those skilled in the art. That is, those skilled in the art can use the hybridization technology (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publisn. John Wiley & Sons Section 6.3-6.4) to carry out the present invention. Based on the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3) or a part thereof encoding a protein, a highly homologous polynucleotide is isolated, and a functionally equivalent polynucleotide is isolated from this polynucleotide. Obtaining a protein is something that can usually be done.
  • the present invention includes a protein encoded by a peptide as long as it has a function equivalent to that of the protein of the present invention.
  • the stringent conditions for hybridization to isolate a polynucleotide encoding a functionally equivalent protein are usually about lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C for washing.
  • the more severe condition is about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42, and the more severe condition is 0.1xSSC, 0.1% SDS N 65 ° C.
  • the hybridization conditions become stricter, isolation of DNA having higher homology to the probe sequence can be expected.
  • the combination of the above SSC, SDS and temperature conditions is an example, and those skilled in the art may use the above or other factors that determine the stringency of the hybridization. By combining them, it is possible to realize the same stringency as above.
  • Other conditions that affect stringency may include probe concentration, probe length, hybridization reaction time, and the like.
  • the protein isolated using such a hybridization technique is generally higher in the amino acid sequence or the base sequence encoding the protein than the protein of the present invention described in SEQ ID NO: 4.
  • Has homology refers to sequence identity of at least 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more (eg, 90% or more).
  • the homology can be specified using a BLAST2 search algorithm (Altschul, SF et al, 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.) I can do it.
  • nucleotide sequence identified in this example using gene amplification technology (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley Sons Section 6.1-6.4). (SEQ ID NO: 1 or 3), a primer is designed, and a DNA fragment having high homology to these nucleotide sequences or a part thereof is isolated. It is also possible to obtain functionally equivalent proteins.
  • the protein of the present invention and the functionally equivalent protein of the present invention can be used in a method for evaluating a compound that modifies the function of the protein, as described later. Polynucleotides encoding these proteins are also useful as primers or probes for knowing the production and expression status of the proteins.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding a protein having a dominant negative trait with respect to the protein of the present invention.
  • Dominant negative traits The polynucleotide encoding the protein has a function of eliminating or decreasing the activity of the endogenous wild-type protein originally provided in the cell by its expression. For example, if the amino acid sequence corresponding to a sequence that is thought to affect the activity of the protein, such as the kinase domain of the apoptosis-related factor of the present invention and the SH3 ligand domain, is modified, it has apoptosis-inducing activity and neurite outgrowth activity. It is thought that an inactive substance that does not have to be obtained can be obtained.
  • the expression of the apoptosis-related factor of the present invention can be suppressed by a dominant negative effect (inactive antagonistic inhibition). Therefore, by introducing an inactive gene into cells by gene transfer technology such as viral vector, the progression of apoptosis is inhibited or the differentiation or growth of nerve cells is suppressed. It becomes possible.
  • the present invention also provides a partial peptide of the protein of the present invention.
  • the partial peptide is useful as an immunogen for obtaining an antibody against the protein of the present invention.
  • a partial peptide containing an amino acid sequence unique to the protein of the present invention, which has low homology to other proteins, is expected to be an immunogen that provides an antibody with high specificity to the protein of the present invention.
  • An example of such an amino acid sequence is an amino acid sequence selected from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the partial peptides of the present invention comprise an amino acid sequence of at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids or more, more preferably 12 amino acids or more, more preferably 15 amino acids or more.
  • the partial peptide of the present invention can be produced, for example, by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the present invention also provides an expression vector containing any of the above polynucleotides. Furthermore, the present invention comprises a transformant carrying the polynucleotide or any of the expression vectors described above, and a step of culturing the transformant and isolating the protein of the present invention from the culture. , A protein of the present invention, or a partial peptide thereof And a method for producing the same. Further, the present invention provides a protein produced by the above method, or a partial peptide thereof.
  • polypeptides When producing polypeptides by genetic recombination techniques, depending on the type of host cell, the type and degree of glycosylation of the target polypeptide can be obtained, and in so-called secretory production of polypeptides, the The terminal (N-terminal and Z- or C-terminal) amino acid sequences of the precursor polypeptide expressed in the cells are processed by signinolepeptidase, etc., and various terminal amino acid sequences are added. It is well known to those skilled in the art that the resulting polypeptides can be obtained. Therefore, it is easily understood by those skilled in the art that such a polypeptide is also included in the scope of the protein of the present invention.
  • the present invention also includes an expression vector constructed based on the nucleic acid sequence of the present invention by a method known in the art.
  • Microbial cells that can be used to express a polynucleotide encoding the protein of the present invention include, for example, prokaryotic bacteria [E. coli (fe ⁇ ari ⁇ is and Bacillus subtil is) and eukaryotes]. There is a sexual yeast [for example, baker's yeast Saccar ces core's ae).
  • mammalian cells include cultured human cells and cultured animal cells. Furthermore, cultured plant cells can also be used.
  • microorganisms include bacteria belonging to the genus Escherichia and baker's yeast. More specifically, for example, the following strains can be mentioned as microbial hosts.
  • E. coli MM294 (ATCC 31446) K coli DH1 (ATCC 33849), etc.
  • mammalian cells examples include human embryonic kidney-derived HEK293 cells, mouse L929 cells, and Chinese Hamster Opry (CHO) cells.
  • the expression vector when a prokaryotic bacterium, particularly Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector includes at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, a stop codon, and self-replication. Consists of possible units.
  • the expression vector comprises at least a promoter, an initiation codon, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention, and a stop codon. Is preferred. It is also possible to insert an enhancer sequence, the 5'- and 3,1-noncoding regions of the protein of the present invention, a polyadenylation site and a self-replicatable unit.
  • the above self-replicatable unit preferably contains a transformant selection marker (for example, ampicillin resistance).
  • a transformant selection marker for example, ampicillin resistance
  • the term “promotor” refers to a promoter-operator region consisting of a promoter, an operator and a Shine-Danoregano (SD) sequence (eg, AAGG).
  • SD Shine-Danoregano
  • promoters include conventional promoter-operator regions. Specifically, ratatosupoperon, PL-promoter, trp-promoter, and the like can be shown.
  • An example of a promoter used in an expression vector using yeast as a host is the pho5 promoter.
  • a basic amino acid having an affinity for a metal ion chelate can be added to any terminal in the protein of the present invention for the purpose of easily performing purification.
  • PCR can be performed using a primer having a nucleotide sequence having a contiguous base sequence encoding the desired amino acid added to the 5 ′ side, and the primer can be added to any end of the target gene.
  • Oligopeptides can be added.
  • Basic amino acids For example, histidine, lysine, or argyun can be used.
  • promoters used for expression vectors in mammalian cells include the HTLV-LTR promoter, SV40 early and late promoter, CMV promoter, mouse metamouth thionine I (MMT) -promoter, and the like.
  • An example of a preferred initiation codon is methionine codon (ATG).
  • the self-enabling unit is a DNA sequence capable of autonomously replicating the entire DNA of the expression vector containing the same in a host cell, and includes a natural plasmid, an artificially modified plasmid, and a synthetic plasmid.
  • Artificially modified plasmids include, for example, DNA fragments prepared from natural plasmids.
  • Preferred examples of such a plasmid include, when Escherichia coli is used as a host cell, plasmid pBR322 or an artificially modified product thereof.
  • the artificially modified product can be, for example, a DNA fragment or the like obtained by treating pB322 with an appropriate restriction enzyme.
  • examples include pJDB219 and pJDB207.
  • examples include pJDB219 and pJDB207.
  • animal cell for plasmids such as plasmids pcDNA3.1 (Invitrogen), p ⁇ 324, plasmid P SV2dhfr (ATCC37145), plasmid pdBPV - MTneo (ATCC37224), plasmid pSV2neo (ATCC37149) and the like.
  • the enhancer sequence includes, for example, the enhancer sequence of SV40.
  • the polyadenylation site includes, for example, a polyadenylation site of SV40.
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained, for example, by partial or total synthesis using a DNA synthesizer. Alternatively, it can be obtained from a human cDNA library using a probe or primer set based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. Furthermore, a genomic DNA encoding the protein of the present invention can be prepared by treating the genomic DNA in a conventional manner. Methods for treating genomic DNA include, for example, digestion with restriction enzymes, dephosphorylation with bacterial bacteria / recaliphosphatase, and T4 polynucleotide kinase. A method of treatment including steps such as oxidation and ligation using T4 DNA ligase can be shown.
  • the transcription start site of the gene of the present invention in the genome can be clarified, and the expression control region located further upstream can be specified.
  • a control region such as the promoter Janhansa, which controls the expression of the gene encoding the protein of the present invention, is useful as a target region for detecting abnormal expression of the protein of the present invention.
  • the expression can be controlled by a decoy nucleic acid drug targeting these regions.
  • the host cells of the present invention also include cells intended for use in the function analysis of the apoptosis-related factor of the present invention and the method for evaluating a function inhibitor or a function promoter using the protein.
  • the introduction of a vector into a host cell can be performed, for example, by the calcium phosphate precipitation method, electrophoresis, “Norres burrowing L, fe (Current protocols in Molecular Biology edit. A subel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1) -9. 9), Lipofectamine method
  • Preparation of the protein of the present invention from the transformant can be carried out by using a protein separation / purification method known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof.
  • the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded polynucleotide consisting of A: T (A: U) and G: C base pairs with respect to the other strand.
  • the term “complementary” is not limited to a case where the sequence is completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions.
  • the homology may be 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, even more preferably 95% or more.
  • the algorithm described in this specification may be used as an algorithm for determining homology.
  • Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting and isolating DM and RNA encoding the protein of the present invention, and as a primer for amplifying the polynucleotide of the present invention.
  • ⁇ the normal, 15b P ⁇ 100b P, preferably having a chain length of 15Bp ⁇ 35bp.
  • a polynucleotide having at least a part or the entire sequence of the polynucleotide of the present invention and having a chain length of at least 15 bp is used.
  • the 3'-side region must be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence ⁇ tag or the like can be added to the 5'-side.
  • an oligonucleotide capable of hybridizing to the region containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or its complementary sequence is used for specifically detecting AF06972.
  • Useful as a probe or primer is used for specifically detecting AF06972.
  • a primer capable of amplifying a region consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 can be obtained by amplifying both HJ06972 and AF06972 with one set of primers. it can.
  • a difference of 94 bp which is the number of bases of SEQ ID NO: 3, occurs between HJ06972 and AF06972. Therefore, by using such a primer, HJ06972 and AF06972 can be detected or confirmed separately.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for testing and diagnosing abnormalities of the protein of the present invention.
  • abnormal expression can be tested by Northern hybridization-RT-PCR using the polynucleotide of the present invention as a probe or primer.
  • genomic DNA-PCR or RT-PCR can be performed by polymerase chain reaction (PCR) using the polynucleotide of the present invention as a primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the gene encoding the protein of the present invention and its expression control region can be amplified, and sequence abnormalities can be inspected and diagnosed by methods such as RFLP analysis, SSCP, and sequencing.
  • the polynucleotide encoding the factor is related to the apoptosis-related factor. It can also be used for gene therapy of a disease that occurs. That is, the apoptosis-related factor of the present invention can be expressed by introducing the polynucleotide so that it is appropriately expressed in the diseased site of the host, and the disease associated with the factor can be treated or prevented.
  • expression includes transcription and / or translation.
  • the expression at the transcription level of the gene can be examined and diagnosed.
  • the use of an antibody against the protein of the present invention described below allows the examination and diagnosis of the expression of the gene at the translation level.
  • HJ06972 or AF06972 in the present invention are genes encoding proteins closely related to apoptosis. For example, in blood cells that artificially induce apoptosis, the expression levels of these genes are increased as apoptosis progresses. Therefore, the expression level of these genes in a biological sample is useful as a diagnostic indicator of the progress of apoptosis. For example, in a disease such as fulminant hepatitis in which rapid progression of apoptosis is observed, a rapid increase in the expression level of HJ06972 or AF06972 can be used as a diagnostic index.
  • the present invention relates to a method for detecting apoptosis, comprising the step of measuring an apoptosis marker in a biological sample, wherein an increase in the measured level of the apoptosis marker indicates apoptosis in the biological sample.
  • an amino acid comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and having one or several amino acids substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and hybridizing with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions, and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein and
  • (e) contains a base sequence selected from the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and has a homology of 70% or more with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • AF06972 gene does not show constitutive expression in tissues other than brain.
  • the expression level of the AF06972 gene increases within a short period of time.
  • MTYK, AF06972 N or which functionally equivalent genes by measuring the apoptosis Ma one force one can detect apoptosis.
  • the apoptosis marker in the present invention is the polynucleotide described in any one of (a) and (e) above, or a protein encoded by these polynucleotides.
  • Methods for measuring a polynucleotide-protein having a specific structure are known.
  • the amount of a polynucleotide whose base sequence is clear can be measured by using hybridization II PCR.
  • a protein whose amino acid sequence is known can be obtained by using an immunoassay using an antibody that recognizes the protein.
  • the amount of protein can be measured using the biochemical activity of the protein as an index.
  • the measured value of the apoptosis marker is usually compared with the measured level of a healthy person.
  • Apoptosis markers can be measured for biological samples of a plurality of healthy subjects, and standard values can be set by statistical methods. If the subject's readings exceed the standard values, the subject is determined to have apoptosis.
  • Known apoptosis markers can be combined with the method for detecting apoptosis according to the present invention. By combining multiple apoptosis techniques, improvement of apoptosis detection accuracy can be expected.
  • the following markers can be shown as known apoptosis markers.
  • any sample collected from a living body can be used as the biological sample.
  • blood, urine, or biopsy samples of various organs can be shown.
  • an increase in the level of expression of the apoptotic marker in the biopsy sample is indicative of apoptosis in that tissue.
  • an increase in the level of an apoptosis marker in blood reflects the progression of apoptosis in vivo.
  • a method for diagnosing fulminant hepatitis is provided based on the method for detecting apoptosis of the present invention.
  • the method for diagnosing fulminant hepatitis of the present invention includes the following steps.
  • Step (1) Step of determining that fulminant hepatitis is progressing if apoptosis is detected in step (1)
  • polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide containing at least 15 nucleotides complementary to a complementary chain thereof” includes the present invention.
  • antisense polynucleotides for suppressing the expression of the protein includes the present invention.
  • antisense in the present invention means a polynucleotide that suppresses the expression of a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. That is, the antisense having such an activity suppresses the dephosphorylation of CREB and can be used as an inhibitor of the dephosphorylation reaction of CREB or a therapeutic or preventive agent for memory and neurodegenerative diseases. .
  • the antisense polynucleotide may be an antisense DNA or an antisense oligonucleotide.
  • Antisense DNA is at least 15bp, preferably at least 100b P, more preferably has a chain length of more than 500 bp, usually within 3000 bp, preferably having a chain length of less 2000b P.
  • the antisense DNA can be used alone or inserted into an appropriate betater such as a retrovirus / resetter or an adenovirus vector in the antisense direction.
  • the antisense oligonucleotide has a chain length of at least 10 bp or more, usually within 10 O bp, preferably 2 O bp or more, and 5 O bp or less.
  • the antisense oligonucleotide can be obtained, for example, by the phosphorothioate method (Stein "Physicochemical properties of phosphorotioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 16: 3209-) based on the nucleotide sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 3221 (1988)).
  • Such antisense is also considered to be applicable to gene therapy for diseases caused by abnormalities of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Abnormalities in the protein of the present invention include abnormal functions and abnormal expressions of the protein.
  • retroviral vectors, adenoviral vectors, ex vivo using a virus vector such as an adeno-associated virus vector, a non-viral virus such as a ribosome, and the like can be administered to patients according to the orrira method. Specifically, apoptosis is an important step in tissue damage due to ischemic disease.
  • the expression of the protein of the present invention can be inhibited in a tissue having a blood flow disorder, tissue damage associated with an ischemic disease can be reduced.
  • the polynucleotide or antisense polynucleotide of the present invention may be used, for example, in retrovirus vectors, adenovirus vectors, viral vectors such as adeno-associated virus vectors, and non-viral vectors such as ribosomes. Using the method described above, it can be administered to a patient by an ex vivo method or an in'ra method.
  • the present invention also provides an antibody that recognizes an antigenic determinant constituted by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the antigenic determinant constituted by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 includes, for example, an antigenic determinant consisting of an amino acid sequence selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • an antibody that recognizes an antigenic determinant composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and an amino acid sequence adjacent thereto in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is included in the antibody of the present invention. included.
  • the present invention also includes an antibody that recognizes an antigenic determinant composed of the three-dimensional structure of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which is constituted by the region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. It is.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence unique to the novel gene AF06972 discovered by the present inventors. Therefore, the antibody of the present invention that can specifically recognize this region is useful for detecting and purifying the protein encoded by AF06972. .
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a part thereof having antigen-binding properties. It also includes all classes of antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies. In the case of a polyclonal antibody, the antibody of the present invention can be obtained by immunizing a rabbit with the protein or partial peptide of the present invention (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publisn. John Wiley & Sons. Section 11.12-11.13).
  • a mouse in the case of a monoclonal antibody, a mouse can be immunized with the protein or the partial peptide of the present invention, and can be obtained from hybridoma cells obtained by fusing spleen cells and myeloma cells (Current protocols in Japan). Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4--11.11).
  • Antibodies that bind to the protein of the present invention may be used, for example, in the examination and diagnosis of abnormal expression or structural abnormality of these proteins, in addition to the purification of the protein of the present invention.
  • proteins are extracted from tissues, blood, cells, or the like, and the presence or absence of abnormal expression or structure is examined by detecting the proteins of the present invention by methods such as western blotting, immunoprecipitation, and ELISA. Can be diagnosed.
  • An antibody that binds to the protein of the present invention may be used for the treatment of diseases related to the protein of the present invention.
  • human antibodies or humanized antibodies are preferred because of their low immunogenicity.
  • Human antibodies are distinguished by their human immune system, including those of the functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice, Mendez, MJ et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146
  • the humanized antibody can be prepared by gene recombination using the hypervariable region of a monoclonal antibody (Methods in Enzymology 203, 99-). 121 (1991)).
  • the present invention relates to a method for detecting an activity of a candidate substance for controlling apoptosis, which comprises the following steps.
  • the protein functionally equivalent to the protein described in (a) means that the target protein has apoptosis-inducing activity.
  • the activity can be confirmed by the method described above.
  • any of eukaryotic cells and prokaryotic cells may be used as long as apoptosis is caused by expression of the protein of the present invention. Is possible. Animal cells are preferably used, and nerve cells such as PC12 are particularly preferable.
  • the condition under which apoptosis is induced is a condition under which the protein according to any one of the above (a) to (d) is expressed in a cell. Since expression of the protein of the present invention in cells is directly linked to apoptosis, efficient screening cannot be expected as it is. Thus, an expression plasmid in which a gene encoding the protein of the present invention is linked downstream of a controllable promoter sequence can be used.
  • a controllable promoter for example, a metallothionein promoter or the like can be shown. Under the control of such a promoter, cells are transformed with a plasmid expressing a gene encoding the active protein of the present invention.
  • the transformant thus obtained induces apoptosis under the condition where the promoter is activated.
  • a method of detecting a change in cell morphology or DNA fragmentation as an index.
  • the morphological change of cells due to apoptosis is observed as a change in stained images of Giemsa staining and fluorescent staining.
  • DNA fragmentation can be detected by the T-view method (Gavriel International, 1992 J Cell Biol, 119: 493-501).
  • the method for detecting an activity controlling apoptosis can be used for evaluating a substance having an activity controlling apoptosis. That is, the present invention relates to a method for evaluating a substance having an activity of controlling apoptosis, which comprises the following steps.
  • the present invention relates to a method for detecting an activity of a candidate substance, which controls any of apoptosis, differentiation of nerve cells, and proliferation of nerve cells, comprising the following steps.
  • an expression control region of a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and a reporter gene functionally linked downstream thereof are A step of expressing a vector containing the
  • the expression control region of the gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 can be cloned from chromosomal DNA by a known method.
  • the S1 matting method is known as a method for specifying the transfer start point.
  • the expression control region DNA of the gene uses a human chromosome library (genomic library) as a probe DNA, using 15 to 10 O bp, preferably 30 to 50 bp at the 5 'end of the gene. By screening, the gene is cloned as a gene clone containing the expression control region.
  • Clones obtained in this way often contain a 5 'untranslated region of the gene of interest, which is greater than 10 kbp. Therefore, the 5 'end of these clones is shortened or fragmented by exonuclease treatment or the like.
  • the minimum necessary unit for maintaining the activity of the expression control region can be obtained.
  • a program for predicting the expression control region of a gene using a neural network is known (nttp: // ww. Fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, Reese, MG, et al, "Large Scale Sequencing Spesif ic Neural Networks for Promoter and Splice Site Recognition "Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, edited by Lawrence Hunter and Terri E. Klein, World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996).
  • programs that search for transcription factor binding sequences such as Promoter Scan to predict the expression control region have been used to predict the minimum unit of activity.
  • An expression vector in which a reporter gene is functionally linked downstream of the thus isolated control region gene can be used for apoptosis, differentiation of nerve cells, or neuronal cells. It can be used to detect activity that regulates cell growth.
  • functional linkage means that both are linked so that the transcription of the reporter gene is started by the activity of the expression control region.
  • the reporter gene any gene can be used so long as it encodes a protein capable of observing the activity of the expression control region as gene expression. Specifically, for example, genes such as luciferase, catalase, galactosidase and GFP (Green Fluorescent Protein) are generally used as reporter genes.
  • the cell into which the vector is introduced for example, an animal cell from which the gene has been deleted can be used.
  • the promoter is activated under conditions that cause cell death (apoptosis) or cell differentiation or proliferation, and generate a signal from the reporter gene.
  • the obtained cells are seeded in a 96-well multiplate, and culture is started under conditions that cause apoptosis, or cell division or proliferation.
  • the activity that acts on the expression control region of the gene to suppress or promote the expression can be easily detected using the reporter gene as an index.
  • the effect on the expression control region can be evaluated by comparing the amount of GFP luminescence with and without the addition of a candidate substance.
  • a luminescence amount ratio of 2 times or more or 1/2 or less, preferably 5 times or 15 or less, more preferably 10 times or more and 1/10 or less has a significant difference.
  • This method can be applied to both eukaryotes and prokaryotes as long as the host causes cell death or cell differentiation or proliferation not only in animal cells but also in a similar system. At this time, the cells are cultured under conditions in which the reporter gene can be expressed. Further, the expression vector containing the reporter gene can be used in an experimental system of ⁇ ′ ⁇ .
  • a cell-free extract required for i'iro protein synthesis together with the expression vector, a buffer, amino acids, ATP and GTP can be supplied to assay for inhibition or enhancement of reporter gene expression by candidate compounds.
  • a host-derived extract that causes cell death or cell differentiation or proliferation by the same system as animal nerve cells can be used.
  • the conditions that cause apoptosis and the conditions that cause cell division or proliferation refer to conditions under which the expression of a reporter gene is induced by a command from the expression control region.
  • the method for detecting an activity that controls any of apoptosis, differentiation of nerve cells, and proliferation of nerve cells includes a method of detecting a substance having an activity of controlling any of apoptosis, differentiation of nerve cells, and proliferation of nerve cells.
  • Can be used for evaluation. That is, the present invention relates to a method for evaluating a substance having an activity of controlling any of apoptosis, differentiation of nerve cells, and proliferation of nerve cells, including the following steps.
  • the present invention relates to a method for detecting the activity of a candidate substance, which regulates differentiation and / or proliferation of nerve cells, comprising the following steps.
  • the protein functionally equivalent to the protein described in (a) means that the target protein has differentiation activity Z or proliferation activity of nerve cells.
  • the activity is carried out by using nerve cell division and Z or proliferation as an index. For example, it can be performed by detecting a neurite outgrowth action in nerve cells such as PC12 cells.
  • the detection method can be implemented, for example, as follows.
  • a candidate substance is brought into contact with cells encoded by the HJ06972 gene or AF06972, or cells such as PC12 that have been prepared to express a protein functionally equivalent to the protein.
  • observation is facilitated by using a cell transformed so as to express a protein capable of visualizing the cell.
  • GFP can be used as such a protein.
  • the target activity can be detected by observing changes in the number and differentiation of nerve cells.
  • Cell differentiation can be evaluated using the progression of neurites as an index.
  • any cells can be used as long as they are differentiation cells or nerve cells whose proliferation is induced by expression of the protein of the present invention. Is possible.
  • a cloned neural cell line such as PC12 is used.
  • the condition under which neurite outgrowth is induced is a condition under which the protein according to any one of the above (3) (a) to (d) is expressed in a cell.
  • the method for detecting the activity of controlling the differentiation and the Z or proliferation of a nerve cell can be used for evaluating a substance having an activity of controlling the screening and / or proliferation of a nerve cell. That is, the present invention relates to a method for evaluating a substance having an activity of controlling differentiation or proliferation of nerve cells, comprising the following steps.
  • the candidate substance used in the evaluation method of the present invention is not particularly limited. Specific examples include a cell extract, an expression product of a gene library, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, a natural compound, and the like. Alternatively, an antibody that recognizes the protein according to any one of (a) to (d) is also useful as a candidate substance used for screening. On the other hand, as a control in the evaluation method of the present invention, a compound that is known to affect (or not to affect) the function or expression level of the protein of the present invention can be used.
  • AF06972 has about 90% homology to HJ06972 at the amino acid sequence level. This confirms that all proteins having an amino acid sequence having 90% or more homology with these proteins have the same activity. Therefore, a protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 may be used as a preferred protein in the activity detecting method of the present invention. it can. Similarly, functionally equivalent proteins that can be obtained by substitution of the hybridized amino acid can also be used in the method for detecting the activity.
  • the evaluation method of the present invention can be used for a screening method of a compound having a desired activity, a characterization of a compound, and the like.
  • screening can be performed by performing the evaluation method according to the present invention on a wide range of substances and repeatedly selecting compounds having the desired activity.
  • the characteristics of a specific compound can be analyzed using the detection method described above.
  • the compound isolated by this evaluation is a candidate for a compound (agonist, antagonist) that promotes or inhibits the activity or expression of the protein of the present invention.
  • it is a candidate for a compound that inhibits the interaction between the protein of the present invention and a molecule that interacts with the protein in vivo.
  • These compounds can be applied as pharmaceuticals for preventing or treating diseases associated with the protein of the present invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical use of the substance obtainable by the evaluation method of the present invention. That is, the present invention relates to the use of a compound selected by the evaluation method in controlling cell death. Alternatively, the present invention relates to a therapeutic agent for a disease characterized by cell death, comprising these compounds as a main component. Furthermore, the present invention relates to a method for controlling cell death, which comprises a step of administering a compound selected by the above-mentioned evaluation method. In addition, the present invention relates to the use of a compound selected by the above-mentioned evaluation method in the manufacture of a therapeutic agent for a disease characterized by cell death.
  • the disease characterized by cell death means a disease caused by abnormal cell death.
  • diseases caused by cell death can include brain tissue damage caused by cerebral ischemia.
  • the compound that inhibits the function or production of the apoptosis-related factor of the present invention can be used for controlling the following cell death.
  • the compounds selected by the evaluation method of the present invention can be used for treating the following diseases.
  • Cerebrovascular disorder dementia multiple microcerebral infarction, cerebral thrombosis, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, myocardial infarction, cardiomyositis, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, cirrhosis, insulin-dependent diabetes mellitus by)
  • the compounds selected according to the present invention can be used for treating cancer such as leukemia.
  • Cancer is a condition in which the control of cell death in malignant cells is incomplete. Therefore, if the administration of the compound selected according to the present invention can induce cell death of malignant tumor cells, a therapeutic effect can be expected.
  • the present invention relates to use in controlling cell differentiation or proliferation, which contains a compound obtainable by the above-mentioned evaluation method as a main component.
  • the present invention relates to the treatment of a disease characterized by cell differentiation or proliferation, characterized by containing these compounds as a main component.
  • the present invention relates to a method for controlling cell differentiation or proliferation, comprising a step of administering a compound selected by the above-mentioned evaluation method.
  • the present invention relates to the use of a compound selected by the above-mentioned evaluation method in the manufacture of a therapeutic agent for a disease characterized by cell differentiation or proliferation.
  • a disease characterized by cell differentiation or proliferation means a disease caused by insufficient cell differentiation or proliferation.
  • Diseases caused by insufficient cell differentiation or proliferation include, for example, neurodegenerative diseases represented by Alzheimer's.
  • a state in which tissue damage caused by various causes is not completely repaired can also be referred to as a disease state due to insufficient cell differentiation or proliferation.
  • incomplete repair of nerve m disorders resulting from cerebral infarction or cerebral ischemia is included in neurodegenerative diseases.
  • neurons are desirable as cells to be induced to differentiate or proliferate.
  • the compounds selected according to the invention have different effects: cell death and cell differentiation or proliferation.
  • the target molecule HJ06972 or AF06972 in the evaluation method of the present invention has two functions of cell death and cell differentiation or proliferation. Therefore, a compound that regulates its activity or expression may also have two-sided effects. However, it is needless to say that these compounds can be used for treatment of various diseases if an appropriate compound is administered in a specific disease state.
  • the present invention relates to a method for inhibiting cell proliferation, cell differentiation, or cell death, comprising as a main component a polynucleotide described in any one of the following (a) to (g) or a protein encoded by the polynucleotide: And a therapeutic agent for a disease characterized by:
  • (e) consists of a nucleotide sequence having 90% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to the protein (f) an antisense polynucleotide of the polynucleotide according to (a) to (e),
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 one or several amino acids consist of an amino acid sequence having substitution, deletion, insertion, and / or addition, and No .: 2, or a polynucleotide encoding a protein having a dominant negative trait with respect to a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the therapeutic agent of the present invention is used for treating a disease characterized by any phenomenon selected from apoptosis, proliferation of nerve cells, and differentiation of nerve cells. Further, the present invention provides an apoptosis, a nerve cell proliferation, and a nerve cell, comprising a step of administering the polynucleotide according to any one of the above (a) to (g), or a protein encoded by the polynucleotide.
  • the present invention relates to a method for treating a disease characterized by any phenomenon selected from differentiation.
  • the present invention provides a method for selecting the polynucleotide according to any one of the above (a) to (g), or a protein encoded by the polynucleotide, from apoptosis, proliferation of nerve cells, and differentiation of nerve cells.
  • the proteins, nucleotides, antibodies and substances isolated by the above-described evaluation methods of the present invention are useful for regulating apoptosis, cell differentiation, or cell proliferation.
  • these can be used as pharmaceuticals themselves, but they can also be formulated and used by known pharmaceutical methods.
  • it can be considered to be formulated as a suitable combination with a pharmacologically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent and the like.
  • Administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection and the like. Dosage varies depending on patient weight, age, administration method, etc. However, those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a gene therapy vector to perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like. Those skilled in the art can appropriately select the dose and the administration method as needed.
  • the present invention is characterized in that apoptosis, nerve cell differentiation, and nerve cell proliferation are regulated by a transgenic non-human animal in which the expression of the protein according to any one of the following (a) to (d) is regulated: Model animals.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and being functionally equivalent to the protein of (a);
  • a transgenic animal in which the protein of the present invention is overexpressed can be used as a model animal for inducing a neurodegenerative disease to evaluate a therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the structures of the proteins encoded by mouse tyrosine kinase MTYK and HJ06972.
  • MTYK is an abbreviation for Apoptosis Associated Tyrosine Kinase.
  • FIG. 2 shows the HJ06972 gene, the protein encoded by the gene (SEQ ID NO: 2), its alternative splicing form, the AF06972 gene, and the protein encoded by the gene (SEQ ID NO: 4).
  • SEQ ID NO: 2 shows the HJ06972 gene, the protein encoded by the gene (SEQ ID NO: 2), its alternative splicing form, the AF06972 gene, and the protein encoded by the gene (SEQ ID NO: 4).
  • SEQ ID NO: 4 is a diagram comparing the structures of FIG.
  • FIG. 3 is a diagram comparing the sequences of the HJ06972 gene, the protein encoded by the gene, the alternative splicing form of the AF06972 gene, and the protein encoded by the gene.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the sequences of the HJ06972 gene and the protein encoded by the gene with the alternative splicing form of the AF06972 gene and the protein encoded by the gene (continuation of FIG. 3). .
  • FIG. 5 is a view showing the results of comparing the expression levels of HJ06972 gene and AF06972 gene in various cells.
  • FIG. 6 is a photograph showing the neurite outgrowth effect by introducing the HJ06972 gene into PC12 cells.
  • FIG. 7 is a graph comparing neurite outgrowth effects of various genes on PC12 cells.
  • the vertical axis shows the neuron outgrowth (% of neurite outgrowth), and the horizontal axis shows the introduced gene.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of the HJ06972 gene on the transcriptional activity of CREB.
  • the vertical axis shows the relative CREB transcription activity (ratio) with the control as 1, and the horizontal axis shows the introduced gene.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of analyzing the apoptosis-inducing effect of introducing various genes into Jurkat cells.
  • the vertical axis indicates the percentage of apoptotic cells (%), and the horizontal axis indicates the gene introduced into Jurkat cells.
  • the right side of the graph shows the results when Thapsigargin (1 ⁇ M) was added, and the left side shows the results when no Thapsigargin was added.
  • FIG. 10 is a photograph showing changes in the expression levels of mouse tyrosine kinase MTYK and mAF06972 following apoptosis induced by IL-3 depletion of mouse Ba / F3 cells.
  • M indicates the molecular weight marker
  • 0-48 indicates the elapsed time after removing IL-3.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of analyzing the apoptosis-inducing effect of SH-SY5Y cells by introducing various genes by measuring Ca SpaSe3 / 7 activity or LDH release activity.
  • the vertical axis indicates the activity of Caspase3 / 7 (top) or the release activity of LDH relative to the control (bottom).
  • the horizontal axis shows the gene introduced into SH-SY5Y cells.
  • the right side of daraf is the result when doxycycline (Dox) is added, and the left side is the result when no doxycycline (Dox) is added.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of the apoptosis-inducing effect of SH-SY5Y cells by the introduction of various genes by quantification of ATP or measurement of tetrazolium compound reduction reaction (MTS).
  • the vertical axis indicates MTS reducing ability (upper) or ATP amount (lower).
  • the horizontal axis indicates the gene introduced into SH-SY5Y cells.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of analysis of the apoptosis-inducing effect of SH-SY5Y cells by the introduction of various genes by quantification of histone / DNA fragment complexes (mono- and oligonucleosomes).
  • the vertical axis indicates the amount of mono- and oligonucleosomes.
  • the horizontal axis indicates the gene introduced into SH-SY5Y cells.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of analyzing the apoptosis-inducing effect of SH-SY5Y cells by introducing various genes by measuring Caspase-2, 8, 9 activities.
  • the vertical axis indicates the activity of Caspase-2, 8, 9 relative to the control.
  • the horizontal axis indicates the gene introduced into SH-SY5Y cells.
  • the HJ06972 (KIAA1079) gene obtained from Kazusa DNA Research Institute was excised with restriction enzymes Xhol and Notl, and inserted into the Xhol / Notl site of pcDNA3.1 (Invitrogen).
  • Human month 3 ⁇ 4 derived c DNA Factorous cDNA, Clontech ) force 3 ⁇ 4 et al, Atgacttcgagacacaggac (SEQ ID NO: 7) and Tcaggtgtgtgagggaaagct (SEQ ID NO: 8) by PCR using the primers, acquires AF06972 gene fragment of about 820b P did.
  • the obtained AF06972 gene fragment was subcloned into pT7-blue2, which is a TA vector, and the DNA sequence was confirmed using a DNA sequencer model 310 (PE Biosystems). Both the HJ06972 gene fragment cut out from the pcDNA3.1 vector into which the HJ06972 gene has been introduced using the restriction enzymes Xbal and Pvul, and the AF06972 gene fragment cut out using the restriction enzymes Pvul and Xhol, were converted into the Xbal-Xhol of the pBluescript II vector. By subcloning into the site, a full-length AF06972 gene of about 4.8 kb was obtained.
  • the expression distribution of the AF06972 gene in human tissues was analyzed using Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech) and quantitative RT-PCR, that is, the reagents of SYBR Green RT-PCR reagents (PE biosystems) and PRISM 7700 (PE The experiment was carried out under the following conditions using a device of Biosystems) according to the manufacturer's instructions.
  • hAATYK forward atcacgcacgtgtctgactc (Rooster U number ⁇ ": 1 1)
  • a SYBR Green mix 25 / i l PCR reaction solution was prepared. PCR conditions were 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. As a result, the strongest expression was observed in the brain, followed by expression in the kidney, spleen, lymph nodes, and fetal liver.
  • the brain-specific expression of the AF06972 gene similar to the MTYK gene, supports the hypothesis that the AF06972 gene may have a similar effect in the brain as the MTYK gene involved in apoptosis in blood cells.
  • HJ06972 gene and AF06972 gene Using a primer that can detect the difference between the expression of the HJ06972 gene and its alternative splicing form, the AF06972 gene, the difference in expression level between human brain and human cultured neurons (SH-SY5Y cells, NT2neuron cells) is evaluated. did. With this primer, a PCR product of about 395 bp for the HJ06972 gene and 315 bp for the AF06972 gene can be obtained. The HJ06972 gene showed very little force expression, and the majority was the AF06972 gene.
  • AF06972 a novel alternative splicing form discovered in the present invention, was considered to be a major expression product not only in humans but also in mice and rats.
  • Target gene 8 z g
  • the experiment was repeated three times, and the results were obtained using EGFP as a control for gene transfer and calculating the proportion of neurite outgrowth in 4 to 7 visual fields and 31 to 150 EGFP positive cells.
  • the results were expressed as the nerve cell outgrowth (% of neurite outgrowth) calculated by the following equation.
  • the effect of each gene on the neurite outgrowth effect of NGF at a low concentration was similarly evaluated.
  • Nerve cell extension rate (number of cells showing extension Z total number of cells) x 100
  • HJ06972 showed a neurite outgrowth effect when the gene was overexpressed as compared with the control.
  • the neurite outgrowth effect was observed to be even stronger than the previously reported HuC (Fig. 6).
  • the neurite outgrowth effect of low concentrations of NGF was also observed to be the strongest stimulatory effect as compared to the others (Fig. 7).
  • the number of apoptotic cells was determined by introducing the HJ06972 gene or a known apoptosis-related gene into Jurkat cells.
  • RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum (FBS) was used as the medium.
  • the gene of interest was introduced into Jurkat cells by electroporation. Specifically, the cells were collected by centrifugation and then resuspended in a medium to prepare a cell suspension of 5 ⁇ 10 6 cells / ml. The plasmid containing the gene of interest was added to the cell suspension so that the final concentration of the plasmid DNA was 10 g / 250 ⁇ 1, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes. Transfer 250 ⁇ l of this solution to a cuvette for electroporation and use Genepulserll
  • the gene was introduced by applying a pulse of 250 V and 950 F with (Bio-Rad). After allowing to stand on ice for 10 minutes, the cells were cultured for 24 hours using a medium supplemented with or without 4 ml of Mthapsigargin.
  • the cells were collected in a tube, and the supernatant was removed by centrifugation. 2 w M for each tube Add Rhodamine 123, 37. (:., After removal of the by Ri supernatant 5% C0 2 and incubated under for 20 minutes centrifugation, the cells were analyzed for apoptotic adding PI solution by FACS.
  • AATYK forward: aatcactccctacgttcctgg (Rooster column number: 16)
  • mAF06972 forward: agtacctgttgtagaagttc (Rooster column number: 18)
  • HPRT forward: gcatacctaatcattatgctg (SEQ ID NO: 20)
  • PCR conditions were 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds for the MTYK and AF06972 genes, The reaction was carried out for 30 cycles at 30 seconds at 72 ° C. For HPRT, 25 cycles were performed under the same conditions.
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis using a 2% agarose gel, and then stained with ethidium bromide (EtBr). The results are shown in FIG.
  • the expression levels of the MTYK and AF06972 genes were observed to increase over time with the induction of apoptosis of Ba / F3 cells by IL-3 removal.
  • An AF06972 gene fragment was obtained from human brain-derived cDNA (Quick clone cDNA, Clontech) by PCR using a primer having the following nucleotide sequence.
  • AF06972 gene fragment was digested with the enzyme Spel and Notl, and HJ06972 (KIM1079) in pBS (pBluescript II SK (+)) obtained from Kazusa DNA Laboratory (gene was inserted into Sal I-Notl site) was inserted into the rest cut out with the restriction enzymes Spel and Notl.
  • the DNA sequence of the inserted portion was confirmed by DNA Sequencer Model 310 (PE Biosystems). AF06972 in pBS.
  • An Xhol-FLAG-HJ06972-Sail fragment was obtained by PCR using primers having the following nucleotide sequences.
  • the resulting fragment was restriction enzyme digested with Xhol and Sail, and inserted into remainder of the cut in HJ0 6 972 in pBS and AF069 72 in pBS restriction enzymes Xhol and Sail.
  • Flag-HJ06972 in pBS or Flag-AF06972 in pBS was treated with the restriction enzyme Xhol, then blunted with T4 DNA polymerase, and further treated with Notl.
  • pTRE-3: 1: 16 is After treatment with bal, blunted with T4 DNA polymerase and further treated with Notl.
  • the blunt-Notl fragment of each gene was inserted into the Wunt-Notl site. Recombination of pTRE-3111116 to deno-X DNA was performed according to the attached manual of Adeno-X TM Tet-0ff M Expression System (Clontech).
  • the recombinant virus uses the Adeno-X TM Tet-Off TM Expression System (Clontech), which regulates gene expression by tetracitalin, and uses a regulatory virus (Tet-Off) and responsive recombinant viruses.
  • Cet-Off a regulatory virus
  • the added virus solution was removed, 100 ⁇ l of a new medium containing 1% of serum not containing tetracycline was added, and the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • a well containing a medium containing 1 ⁇ of doxycycline (tetracycline derivative) for suppressing gene expression was prepared.
  • Adeno-X TM Tet-Off TM Expression System (Clontech), which regulates gene expression by tetracycline, was used, and each recombinant virus responsive to the regulatory virus (Tet-Off) was used. Then, to remove the added virus solution, serum containing no tetra SITA phosphorus added new media ⁇ ⁇ containing 1%, and cultured at 37 ° C, 5% C0 2 conditions. At this time, as a control, a well to which a medium containing 1 ⁇ of doxycycline (tetracycline derivative) for suppressing gene expression was added was prepared.
  • ⁇ was quantified by CellTiter-Glo TM Luminescent Cell Viability Assay (Promega). MTS was quantified using CellTiter 96 ⁇ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega). All quantification methods followed the package insert.
  • Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells were seeded in a 96-well plate at 2.5 ⁇ 10 4 cells / well and cultured overnight at 37 ° C. and 5% C02. After confirming that the cells stick better on the plate, and the medium was removed from the culture plate, was added recombinant adenyl Roh virus solution 30 Mi diluted in medium at 37 ° C, 5% C0 2 under the conditions The cells were cultured for about 2 hours and infected.
  • the recombinant virus uses the Adeno-X TM Tet-Off TM Expression System (Kokuntech), which regulates gene expression by tetracycline, and uses the control virus (Tet-Off) and responsive recombinant viruses. Using.
  • Mononucleosomes and oligonucleosomes were quantified using Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche). The quantification method followed the package insert. The sample was prepared by adding 5 L of lysis buffer to 5 L of cell lysate.
  • Hitoni Euro neuroblastoma SH - SY5Y cells were seeded 2. 5 x 10 4 per 1 well to 96iell plate, and cultured overnight at 37 ° C, 5% C0 2 conditions. After confirming that the cells were well adhered to the plate, remove the medium from the culture plate and add 30 ⁇ of recombinant adenovirus solution diluted with the medium. C, and 5% C0 2 under conditions for about 2 hours incubation, were infected.
  • Recombinant virus uses Adeno-X TM Tet-0ff TM Expression System (Clontech), which regulates gene expression by tetracycline, and uses recombinant virus (Tet-Off) and responsive recombinant viruses. Was.
  • the added virus solution was removed, 100 ⁇ of a fresh medium containing 1% of serum without tetracitalin was added, and the cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • a well to which a medium containing 1 ⁇ of doxycycline (tetracycline derivative) for suppressing gene expression was added was prepared. Twenty-four hours later, intracellular Caspase-2, 8, and 9 activities were evaluated. The method was performed using the Caspase-2 Assay Kit, Fluorometric (Power, Rebiochem, Caspase-8 Activity Assay Fluorometric (Oncogene), Caspase-9 Activity Assay Fluorometric (Oncon)) and according to the package insert.
  • This gene encodes a protein having an activity of inducing apoptosis and an activity of inducing differentiation or proliferation of nerve cells. Furthermore, the present invention revealed that the HJ06972 gene encodes a protein having the same activity as the protein encoded by the AF06972 gene, although its structure is known but its function is not elucidated.
  • the protein itself, or a compound capable of regulating the activity or expression of the protein is a useful therapeutic agent in diseases involving neuronal cell death, dysfunction or proliferation.
  • proteins encoded by these genes are useful in treating diseases characterized by cell death or the differentiation and proliferation of nerve cells. More specifically, these polynucleotides, or the proteins encoded by the polynucleotides, can achieve a therapeutic effect by causing cell death in cells that have lost normal control. Alternatively, therapeutic effects can be achieved through neuronal cell differentiation and proliferation.
  • the present invention provides antisense of these polynucleotides or proteins having a dominant-negative form with respect to the proteins encoded by these polynucleotides, which are also characterized by cell death or neuronal cell differentiation or proliferation.
  • these polynucleotides or the proteins encoded by the polynucleotides can achieve a therapeutic effect by suppressing abnormal cell death that causes disease.
  • a therapeutic effect can be achieved by suppressing abnormal proliferation of nerve cells that cause the disease. .
  • the present invention provides an activity of inducing apoptosis and an activity of regulating the activity of inducing apoptosis or proliferation of nerve cells using the AF06972 gene, the HJ06972 gene, or a gene functionally equivalent to these genes. Provide a way to detect.
  • the present invention provides a method for evaluating a candidate substance having an activity of inducing apoptosis and an activity of regulating the activity of inducing differentiation or proliferation of neural cells by applying this method.
  • the compounds obtainable by the evaluation method of the present invention are also useful for treating diseases characterized by cell death or neuronal cell proliferation.
  • a compound that can be obtained according to the present invention and that suppresses the activity of inducing apoptosis and the activity of inducing nerve cell division or proliferation (down regulation) can cause abnormal cell death that causes disease. By suppressing it, a therapeutic effect can be achieved. Alternatively, a therapeutic effect can be achieved by suppressing abnormal differentiation and proliferation of nerve cells that cause the disease.
  • the apoptosis-inducing activity and the neuronal cell differentiation or proliferation-inducing activity that can be obtained by the present invention are the causes of disease.
  • Therapeutic effect can be achieved by suppressing abnormal cell death.
  • a therapeutic effect can be achieved by suppressing abnormal differentiation and proliferation of nerve cells that cause the disease.

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Description

神経再生遺䌝子 技術分野
本発明は、アポトヌシスを誘導する掻性、神経现胞の分化、および神経现胞の増 殖の掻Ÿを有するアポトヌシス関連因子、 該因子をコヌドするポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを甚いた該因子の補造方法、それらの補造に関わる発珟系、該 発珟系を甚いたアポトヌシスを誘導する掻性、神経现胞の分化、および神経现胞の 増殖の掻性の怜出方法、たたは該掻性を制埡する化合物の評䟡方法、䞊びに、該ァ ポトヌシス関連因子、たたは該因子をコヌドするポリヌクレオチドを有効成分ずす る现胞増殖、たたは现胞死に特城付けられる疟患の治療剀に関する。 たた、本発明 は本発明のアポトヌシス関連因子を認識する抗䜓、該抗䜓を甚いた該因子の免疫孊 的枬定法に関し、 さらに、 䞊蚘評䟡方法により埗られる化合物を甚いる现胞増殖、 たたは现胞死に特城付けられる疟患の治療剀に関する。 背景技術
アポトヌシス、たたはプログラム现胞死ずは生理的条件䞋で现胞自らが匕き起こ す现胞の死である。倚现胞生物の生存においおは、望たしくない、 あるいは必芁の 無い现胞を生䜓から排陀する機構が必芁である。アポトヌシスは、発生過皋や现胞 の䞖代亀代においお、䞍芁ずなった现胞を排陀するための予めプロダラムされた现 胞の死であるず理解されおいた。アポトヌシスを起こした现胞では、栞の収瞮や DNA の断片化が芳察され、膜を残したたた现胞が退瞮する。 生䜓䞭では、やがお退瞮し た现胞を食食现胞が捕食し排陀する。アポト䞀シスに察しお、壌死ず呌ばれる现胞 死は现胞構造の砎壊を䌎う。したがっお、现胞が自ら死滅しおいくアポトヌシスは、 しばしば、 「きれいな现胞死」 ず呌ばれる。 その埌、発生過皋で芳察される现胞死ず同様の现胞死力 现胞の倖から刺激によ ぀おも誘導されおいるこずが知られるようになった。䟋えば、 TNFや Fasは、 アポト —シスを誘導する代衚的なサむトカむンである。 たた、玫倖線ゃŸ1^線照射、现胞 増殖因子の枯枎、ある皮の癌遺䌝子の掻性ィ匕ずいった刺激によっおも、アポトヌシ スは誘導される。 自己免疫疟患や癌のような疟患も、アポトヌシスの機胜䞍党によ ぀お、 有害な现胞を死滅させられなか぀た結果ずしお理解されるようになった。 珟圚のずころ、现胞が倖界からの刺激に応答しおアポトヌシスに至る過皋は、お よそ次のように説明されおいる。 即ち、 様々な原因によっお掻性ィ匕された Caspase ファミリヌが现胞死をもたらすこずが明らかにされおいる。 Caspaseには基質特異 性の異なる耇数の酵玠の存圚が明らかにされおおり、 䞀矀の Caspaseを総称しお Caspaseファミリヌず呌んでいる。 Caspaseファミリ䞀は、基質特異性によっお倧き く 3぀のグルヌプに分類されおいる。 このうち、 グルヌプ 2の Caspaseが、 アポト 䞀シスの実行に関䞎するず蚀われおいる。 グルヌプ 3の Caspaseは、 アポトヌシス 実行カスケヌドの䞊流においお、现胞倖からの刺激に応答しお掻性化され、 より䞋 流のグルヌプ 2の Caspaseを掻性ィ匕する働きを持぀。 䞀方グルヌプ 1の Caspaseは、 サむトカむンの生成ず分泌を促進する䜜甚を持぀ずされおいる。グルヌプ 2ずダル ヌプ 3に分類される Caspaseず、 それが認識するアミノ酞配列を以䞋に瀺す。
グルヌプ 2 グルヌプ 3
Caspase— 2 DEHD Caspase- 6 VEHD
Caspase- 3 DEVD Caspase- 8 LETD
Caspase- 7 DEVD Caspase- 9 LETD
グルヌプ 3の Caspaseは、 Fasや TNFレセプタヌにリガンドが結合するこずにより 掻性化され、 グルヌプ 2の Caspaseを切断しお掻性化し、 より䞋流にシグナルを䌝 達する。 このようなシグナルの䌝達をアポトヌシス実行力スケヌドず呌ぶ。 ァポト 䞀シス実行カスケヌドの䞋流では、シグナルを䌝達された様々な因子が、现胞死を もたらすための実行郚隊ずしお機胜しおいるこずが掚枬される。 し力 し、実際にどのような因子が现胞の死をもたらしおいるのかに぀いおは、解 明すべき課題が倚い。 たずえば、 ある皮の Caspaseはヌクレアヌれ阻害因子
ICAD (inhibitor of CAD)を分解する。 その結果、 ヌクレアヌれである CAD(Caspase Activated DNase)の栞ぞの移行が可胜ずなり、 アポト䞀シスに特城的な染色䜓 DNA の切断を開始するこずが知られおいるEnari M, et al. , Nature, 391 :43 - 50, 1998)。 アポトヌシスは神経系の発達においおも重芁な過皋である Johnson EM and Deckworth, Ann. Rev. Neurosci. , 16 31 - 46 (1993)  Oppenheim RW, Annu. Rev. Neurosci. , 14 453-501 (1991)  Raff MC et al. , Science 262 695-700 (1993) ) 。 アポトヌシスは物理的おょぎ環境的シグナルにより厳密に調節されおいる。ィンシ ナリン様成長因子 I (IGF- 1)等の成長因子によりアポトヌシスは阻害され、それに より正垞および異垞な神経现胞の生存、䞊びに、増殖が調節される D Mello SR et al. J. Neurosci. 17 1548-1560 (1997)  Rukenstein A et al. , J. Neurosci. 11 2552-2563 (1991)  Sc lessinger J et al. , Neuron 9 383-391 (1992)  Yao R and Cooper GM Science 267 2003-2006 (1995) ) 。
アポトヌシス開始時の䞍党は、䞭枢おょぎ末梢神経系における腫瘍化の重芁な機 構の䞀"1 である (Fung K- and Trojanwski JQ, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 54 285-297 (1995) Yachnis AT et al. , J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53 61-71 (1994) ) 0 神経倉性疟患 White E Genes Dev. , 10 1-15 (1996)  Friedlander RM and Yuan J, Cell Death and Differentiation 5 823-831 (1998)  Jacobson MD, Curr. Biol. 8 R418-R421 (1998) Tatton WG et al. , J. Neural Transmission, Suppl. 49: 245-268 (1997) ) およぎ虚血性疟患 Choi DW and Rothman SM. Annu. Rev. Neurosci. , 13 171-182 (1990) ) においお起こる神経现胞死にもアポトヌシスは関連しおいるず考 えられおいる。
神経现胞のアポトヌシスに関連する遺䌝子ずしおは、 AATYK (Apoptosis
Associated Tyrosine Kinase) ず呌ばれるマりスの遺䌝子が脊髄前駆现胞から同定 されおいる (Gaozza E. et al. Oncogene, 15 3127—3135 (1997) ) 。 MTYK遺䌝 子によりコヌドされる 200kDaの蛋癜質は N末端にチロシンキナヌれドメむンを有し、 C末端にプロリンに富み、 最小 SH3結合モチヌフを構成する 16 PXXPモチヌフを有し おいる。 血球现胞のサむト力むン陀去によるアポトヌシス時に、 MTYKの発珟が匷 く誘導されるこずが報告されおいる。
MTYK遺䌝子の発珟は、 脊髄前駆现胞の生育抑制おょぎ Zたたはアポトヌシスの 誘導に䞍可欠ず考えられおいる。 MTYK蛋癜質は脳で特に倚く発珟されおおり、 神 経分ィ匕に䌎い発珟は増加するこずが知られおいる Baker SJ et al. Oncogene, 20: 1015-1021 (2001)  Tomura M et al. , Oncogene, 20 1022-1032 (2001) ) 。 たた、 MTYKは栞膜近くの现胞質䞭に存圚する酵玠的に掻性な非受容䜓キナヌれであり、 過剰発珟によりァドレナリン䜜動性神経芜腫 SH-SY5Y现胞等の现胞の分ィヒを誘導し、 そしお、 レチノむン酞 (RA)、 12 - 0"テトラデカノィルホルボヌル 13 -ァセタヌト、 および IGF - 1等により誘導される神経现胞分化を促進するこずが知られおいる
(Raghunath M et al. Molecular Brain Res. 77 151-162 (2000) ) 。
このように、アポトヌシス実行カスケヌドを構成する因子には、アポトヌシスの 実行、および神経系の発達 Z分ィ匕においお重芁な働きを持぀分子が倚く存圚するず 考えられる。 これらの因子は、 アポトヌシスの制埡、および神経系の発達 Z分化に おいお重芁な暙的ずなる可胜性がある。
たた最近では、 神経现胞の抗アポトヌシス掻性ず、 サむクリック AMP (cAMP)応答 配列CRE;cAMP responsive element)に結合する転写因子CREB  cAMP responsive element binding protein)の掻性䞊昇ずの結び぀きが瀺唆されおいる。 CREBは、 cAMP 䟝存性プロティンキナヌれにより Serl33がリン酞化され掻性ィ匕する。
その他、ァメフラシゃラットの行動蚘憶に぀いおの実隓結果より、 CREBのリン酞 化が蚘憶圢成においお重芁であるこずが知られおいる Silvia AJ et al. , Annu. Rev. Neurosci. 21 127 (1998) ) 。 たた、 アルツハむマヌ型痎呆では、 脳内のリ ン酞化 CREBの量が有意に枛少しおいるYamamoto- Sasaki M et al. Brain Res. 824 300-303 (1999) ) 。 以䞊のこずより CREB掻性の䞊昇が蚘憶圢成ず関連するこずも瀺 唆されおいる。 CREBの転写掻性の䞊昇を通じお蚘憶 ·神経倉性を改善し、幅広い神 経疟患に察する治療効果が期埅できる。 発明の開瀺
本発明の課題は、アポトヌシス、あるいは神経现胞の分化や増殖に関䞎する遺䌝 子を同定するこずである。たた本発明は、このような機胜を有する遺䌝子を甚いた、 アポトヌシスを誘導する掻性、あるいは神経现胞の分ィヒゃ増殖を誘導する掻性を調 節する化合物の評䟡方法の を課題ずする。 これらの遺䌝子そのもの、あるいは これらの掻性を制埡する化合物は、神経现胞の増殖、たたは现胞死に関連する疟患 に察する治療効果が期埅できる。
本発明者らは、 マりス MTYKのキナヌれドメむンず構造的に類䌌するモチヌフを 有する 2぀の蛋癜質を同定した。䞡者のアミノ酞配列には共通する領域が芋出され、 オルタナティブスプラむシンダフオヌムであるず考えられた。これらの蛋癜質のう ち、䞀方は本発明者らによ぀お芋出された新芏なァミノ酞配列からなる蛋癜質であ ぀た。他方は、既に構造が明らかにされおいる遺䌝子によっおコヌドされおいる力 その機胜は明らかにされおいない。
次に本発明者らは、これらの蛋癜質がアポトヌシス誘導掻性を有するこずを確認 した。たた本発明者らは、これら蛋癜質の神経现胞ぞの䜜甚を解析した。その結果、 これらの蛋癜質が、アポトヌシス誘導䜜甚に加えお、神経现胞の分化や増殖を匷力 に誘導するこずを有するこずを芋出した。曎に AF06972は、脳における発珟が高く、 神経现胞ずの密接な関連性が瀺された。
これらの知芋に基づいお、前蚘蛋癜質、あるいはそれをコヌドする遺䌝子を甚い お、候補物質の、 アポトヌシス誘導掻性、 あるいは神経现胞の分ィヒゃ増殖を誘導す る掻性を調節する䜜甚を怜出しうるこずを明らかにし、本発明を完成した。曎に本 発明者らは、 この怜出方法に基づいお、アポトヌシス誘導掻性、 あるいは神経现胞 の分化や増殖を誘導する掻性を調節する䜜甚を有する化合物の評䟡方法を確立し た。
すなわち本発明は、以䞋のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによっおコ ヌドされる蛋癜質に関する。 たた本発明は、前蚘ポリヌクレオチド、 あるいは前蚘 蛋癜質の、 怜出方法や甚途に関する。
曎に本発明は、アポトヌシス誘導掻性、あるいは神経蟆胞分化増殖掻性を有する 蛋癜質を甚いた、 これらの掻性を調節する掻性の怜出方法に関する。加えお本発明 は、前蚘怜出方法に基づく、 これらの掻性を調節する掻性を有する化合物の評䟡方 法に関する。たた本発明は、前蚘評䟡方法によっお埗るこずができる化合物の甚途 に関する。
〔1〕 䞋蚘 a ) 〜 e ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 3に蚘茉された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
( b )配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドするポリヌク レオチド、
( c ) 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のァ ミノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、 およ ぎ /たたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞 配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチ ド、、
( d ) 配列番号 5に蚘茉の塩基配列を含み、配列番号 3に蚘茉の塩基配列か らなるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズし、 配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質 をコヌドするポリヌクレオチド、 および
( e )配列番号 5に蚘茉の塩基配列から遞択された塩基配列を含み、 か぀配列 番号 3に蚘茉の塩基配列ず 7 0 %以䞊のホモロゞ䞀を有し、配列番号 4 に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドす るポリヌクレオチド、 〔2〕配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列から遞択されたアミノ酞配列をコヌドす るポリヌクレオチド。
〔3〕 配列番号 5から遞択された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔4〕 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のアミ ノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、 および/ たたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列か らなる蛋癜質に察しおドミナントネガティブの圢質を持぀蛋癜質をコヌドす るポリヌクレオチド。
〔5〕 〔1] 〜 〔4〕 のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチドによっおコヌドされる 蛋癜質。
〔6〕 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチドを含むベクタヌ。 〔7〕 〔1〕 〜 〔4〕 のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたは 〔6〕 に蚘茉 のベクタヌを保持する圢質転換䜓。
〔8〕 〔7〕に蚘茉の圢質転換䜓を培逊し、発珟産物を回収する工皋を含む、 〔5〕 に蚘茉の蛋癜質の補造方法。
〔 9〕配列番号 5に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレオチド、たたはその盞補 鎖に盞補的な塩基配列からなる少なくずも 1 5塩基の長さを有するポリヌク レオチド。
〔1 0〕配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列によっお構成される抗原決定基を認識 する抗䜓。
〔1 1〕 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含む蛋癜質を認識する抗䜓。
〔1 2〕 〔5〕 に蚘茉の蛋癜質ず、該蛋癜質を認識する抗䜓の免疫孊的な反応を芳 察する工皋を含む、 〔5〕 に蚘茉の蛋癜質の免疫孊的枬定法。
〔1 3〕 次の工皋を含む、 アポトヌシスを制埡する掻性を怜出する方法。
( 1 ) 次の a ) 〜 ( d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞に䟯補物質 を接觊させる工皋、 ( a )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列からなる蛋癜質、
(b)配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズするポリヌクレオチ ドによっおコヌドされる a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
(c)配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および/たたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
(d)配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊のホ モロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a)に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に 同等な蛋癜質
(2)アポトヌシスが誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞のアポト —シスを枬定する工皋、 および
(3) 工皋 (2) の枬定結果を指暙ずしお、 アポトヌシスを抑制、 たたは促進す る掻性を怜出する工皋
〔14〕 次の工皋を含む、 アポトヌシスを制埡する掻性を有する物質の評䟡方法。
(1) 〔1 3〕 に蚘茉の方法によっお候補物質のアポトヌシスを抑制、 たたは促 進する掻性を怜出する工皋、 および
(2)察照ず比范しお、前蚘现胞のアポトヌシスを抑制、 たたは促進する掻性を 有する候補物質を遞択する工皋
〔1 5〕 次の工皋を含む、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを制埡する掻性を怜出する方法。
(1) 候補物質の存圚䞋、 配列番号 1、 たたは、 配列番号 3に蚘茉の塩基配 列からなる遺䌝子の発珟制埡領域ず、その䞋流に機胜的に結合されたレポ䞀 タヌ遺䌝子を含むベクタヌを発珟させる工皋、
(2) 前蚘レポヌタヌ遺䌝子の掻性を枬定する工皋、 および
(3) 工皋 2) の枬定結果を指暙ずしお、 アポトヌシス、 神経现胞の分化、 及 ぎ、 神経现胞の増殖のいずれかを制埡する掻性を怜出する工皋。
〔1 6〕 次の工皋を含む、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを制埡する掻性を有する物質を評䟡する方法。
( 1 ) 〔1 5〕 に蚘茉の方法によっお、候補物質のアポトヌシス、神経现胞の分 ィ匕、および神経现胞の増殖のいずれかを抑制、たたは促進する掻性を怜出す る工皋、 䞊びに
(2) 察照ず比范しお、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを抑制、 .たたは促進する掻性を有する䟯補物質を遞択する工皋
〔1 7〕次の工皋を含む、神経现胞の分ィヒおよび/たたは増殖を制埡する掻性を怜 出する方法。
(1) 次の a)〜d) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する神経现胞に候補 物質を接觊させる工皋、
(a)配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質、
(b)配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズするポリヌクレオチ ドによっおコヌドされる a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
(c)配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および/たたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
(d)配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊のホ モロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に 同等な蛋癜質
(2)神経突起の䌞展が誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞の神経 突起の䌞展を枬定する工皋、 および
(3) 工皋2) の枬定結果を指暙ずしお、神経现胞の分化および/たたは増殖 を抑制、 たたは促進する掻性を怜出する工皋 - 1 o-
〔1 8〕次の工皋を含む、神経现胞の分ィヒおよび Zたたは増殖を制埡する掻性を有 する物質の評䟡方法。
( 1 ) 〔1 7〕に蚘茉の方法によっお候補物質の神経现胞の分化および Zたたは 増殖を制埡する掻性を怜出する工皋、 䞊びに
( 2 )察照ず比范しお、神経现胞の分化および Zたたは増殖を制埡する掻性を有 する候補物質を遞択する工皋
〔1 9〕 现胞増殖、 たたは现胞死の制埡における 〔1 4〕 、 たたは 〔1 6〕 に蚘茉 の方法によっお埗るこずができる化合物の䜿甚。
〔2 0〕 〔1 4〕 、 たたは 〔1 6〕 に蚘茉の方法によっお埗るこずができる化合物 を䞻成分ずしお含有するこずを特城ずする、现胞増殖、たたは现胞死に特城付 けられる疟患の治療剀。
〔2 1〕神経现胞の分化およぎ Zたたは増殖の制埡における、 〔 1 6〕、たたは〔 1
8〕 に蚘茉の方法によっお埗るこずができる化合物の䜿甚。
〔2 2〕 〔1 6〕 、 たたは 〔1 8〕 に蚘茉の方法によっお埗るこずができる化合物 を䞻成分ずしお含有するこずを特城ずする、神経现胞の増殖、たたは现胞死に 特城付けられる疟患の治療剀。
〔2 3〕现胞増殖、 たたは现胞死の制埡における 〔5〕蚘茉の蛋癜質、たたは〔1〕
〜 〔4〕 に蚘茉のポリヌクレオチドの䜿甚。
〔2 4〕 䞋蚘の a ) 〜 g ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたはその ポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質を䞻成分ずしお含有する、现胞 増殖、 现胞分化、 たたは现胞死によ぀お特城付けられる疟患の治療剀。
( a ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチド
( b ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列をコヌドするポ リヌクレオチド、
( c ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、およひンたたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポ リヌクレオチド、
( d ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズし、配列番号 2、配 列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質を コ䞀ドするポリヌクレオチド、
( e ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列ず 90%以䞊のホモ口 ゞヌを有する塩基配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉 のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、
( f ) ( a )〜e ) に蚘茉のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチ ド、、
( g ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお、 1若 しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、および Zたたは付加したァミノ 酞配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列 力 らなる蛋癜質に察しおドミナントネガティプの圢質を持぀蛋癜質をコ䞀 ドするポリヌクレオチド。
5〕以䞋の a )〜 d )のいずれかに蚘茉の蛋癜質の発珟を調節したトランスゞ ゚ニック非ヒト動物からなる、アポトヌシス、神経现胞の分化、および神経现 胞の増殖が調節されたモデル動物。
( a )配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質
( b )配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなる DNAずストリ ンゞェントな条件䞋でハむプリダむズする DNAによっおコヌドされるa )に 蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
( c )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若しく は耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および Zたたは付加したアミノ酞配 列を有し、 a)に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
(d)配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊のホ モロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a )に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同 等な蛋癜質
〔26〕生䜓詊料䞭のアポトヌシスマヌカヌを枬定し、該アポトヌシスマヌカヌの 枬定レベルの䞊昇が圓該生䜓詊料におけるアポトヌシスを瀺す工皋を含むァ ポトヌシスの怜出方法であっお、 アポトヌシスマヌカヌが次め (a) 侀 (e) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたは a) ― (e) のいずれかに蚘 茉のポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質である方法。
(a) 配列番号 3に蚘茉された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(b)配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドするポリヌクレ ォチド、
(c) 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のアミ ノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、 および Z たたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列か らなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチド、
(d) 配列番号 5に蚘茉の塩基配列を含み、 配列番号 3に蚘茉の塩基配列から なるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズし、配列 番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌ ドするポリヌクレオチド、 および
(e)配列番号 5に蚘茉の塩基配列から遞択された塩基配列を含み、 か぀配列番 号 3に蚘茉の塩基配列ず 70 %以䞊のホモロゞ䞀を有し、配列番号 4に蚘 茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、
〔2 7〕 次の工皋を含む、 劇症肝炎の蚺断方法。 ( 1 ) 〔2 6〕 に蚘茉の方法によっお、肝现胞を生䜓詊料ずしおアポトヌシスを 怜出する工皋、 および
( 2 ) 工皋 1 ) においおアポトヌシスが怜出された堎合に、劇症肝炎が進行し おいるず刀定する工皋
本発明者らは、 既に塩基配列が報告されおいるマりスチロシンキナヌれ MTYK遺 䌝子の情報に基づいお、かずさ DNA研究所のヒト脳組織由来の DNAデヌタベヌスから ヒト MTYKず思われる次のクロヌンを芋出した。
HJ06941 (KIAA1078, GenBank Acc. No. AB029001)
曎に、 この遺䌝子の塩基配列情報、䞊びに翻蚳アミノ酞配列情報を利甚しお、チ 口シンキナヌれドメむンにおいお、 4 1 %の盞同性を瀺す次のクロヌンを芋出すこ ずに成功した。
HJ06972 (KIM1079、 GenBank Acc. No. AB029002)
ヒト MTYK遺䌝子によりコヌドされるチロシンキナヌれは、 1317残基のアミノ酞 により構成されおいるのに察し、 HJ06972遺䌝子によりコヌドされる蛋癜質は、 1451 残基のアミノ酞より構成されおいた。 HJ06972遺䌝子にコヌドされる蛋癜質も MTYK ず同様に N末端郚分にキナヌれドメィンを有し、 C末端には SH3リガンドドメむンを 有しおいた 図 1 ) 。 HJ06972の塩基配列を配列番号 1に、 そのアミノ酞配列を 配列番号 2に瀺した。 この塩基配列ずァミノ酞配列は、 HJ06972 (KIAA1079)ずし お、 かずさ DNA研究所においお構造が明らかにされおいるDNA Research 30 6/3, 197-205, 1999, "Prediction of the coding sequences of unidentified human genes, XIV, The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large protein in vitro")。 しかしその機胜に぀いおはなにも解明され おいない。
本発明の AF06972遺䌝子は、䞊蚘 HJ06972遺䌝子のホモ口ヌグ遺䌝子の怜玢過皋に おいお芋出された。 本発明者らは、 既に塩基配列が明らかにされおいる HJ06972遺 䌝子の塩基配列情報を利甚しお、 ESTの塩基配列をアセンブルした。 その結果、 HJ06972に察しお 94bpからなる挿入配列を有する遺䌝子の存圚が疑われた。 本発明 者らは、この挿入配列を有する遺䌝子を探玢し、 AF06972遺䌝子を芋出した。曎に、 マりスやラットにおける AF06972遺䌝子のホモロヌグの存圚も確認し、 AF06972が新 芏な遺䌝子であるこずを確認した。 マりスゃラットにおける AF06972遺䌝子のホモ ロヌグの存圚は知られおいない。
AF06972遺䌝子は、 HJ06972遺䌝子の塩基配列䞭の第 4623番目に 94塩基が揷入され た塩基配列からなる。 挿入塩基配列によっお、 AF06972遺䌝子がコヌドするァミノ 酞配列には、 フレヌムシフトが生じおいる。その結果、 C末端郚䜍においお AF06972 遺䌝子によりコヌドされる蛋癜質の方が HJ06972遺䌝子によりコヌドされる蛋癜質 よりも 49アミノ酞残基長くなっおいる。 したがっお、 HJ06972遺䌝子に察しお AF06972遺䌝子は新芏な遺䌝子ず蚀うこずができる。 もちろん、 AF06972によっおコ ヌドされるアミノ酞配列からなる蛋癜質も新芏であるこずは蚀うたでも無い。 たた、 マりス MTYKずの比范では、 AF06972の方が HJ06972よりも盞同性が高いこ ずが刀明した 図 4 ) 。 ヒト MTYKず AF06972ずは、配列で 20数のホモロゞ䞀を有 し、 そのキナヌれドメむンに぀いおは 41 /0のホモロゞ䞀が認められた。 本発明は、 以䞋に瀺す玄 4. 8kbの遺䌝子、 およぎ該遺䌝子によりコ䞀ドされる 1503ァミノ酞残 基からなる蛋癜質を^^する。 AF06972の塩基配列を配列番号 3に、 そのアミノ 酞配列を配列番号 4に瀺した。
たた、本発明には、配列番号 4に瀺したアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的 に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドが含たれる。ここで「機胜的に同等」 ずは、察象ずなる蛋癜質がアポトヌシス誘導掻性を持぀堎合、たたは神経突起を䌞 展させる掻性を有する堎合、その蛋癜質は本発明の掻性型の蛋癜質ず機胜的に同等 であるず蚀うこずができる。
あるいは、なんらかのプロセスを経おアポトヌシス誘導掻性、たたは神経突起䌞 展䜜甚を持った掻性型の蛋癜質を生成し埗る蛋癜質は、本発明の蛋癜質ず機胜的に 同等である。䞍掻性型の蛋癜質から掻性型の蛋癜質を生成するためのプロセスは限 定されない。
本発明においおは、 同䞀の蛋癜質がアポトヌシス 现胞死 を誘導する掻性を瀺 すず同時に、神経现胞に察しおは分化や増殖を誘導する掻性を瀺す。 これらの機胜 は、逆の䜜甚のようにも思われる。アポトヌシスに関連するず考えられおいるキナ ヌれの䞭には、 AATYK (HJ03494)や ASK- 1などがある。 これらのキナヌれは、 過剰発 珟によ぀おアポトヌシスを誘導する䞀方、神経突起の䌞展にも関䞎しおいる。いず れの掻性がもたらされるのかは、シグナルの匷さず持続時間に倧きく圱響を受ける ず考えられおいる。
HJ06972およぎ AF06972に぀いおも、本発明者らによ぀お新たに同様の掻性が芋出 された。すなわちこれらの蛋癜質は、神経突起䌞展䜜甚ずずもに、過剰発珟による アポトヌシスの誘導䜜甚を有するものず考えられた。 したがっお、 この皮のキナヌ れ掻性を有する蛋癜質には、発珟レベルの調節等の機構を通じお、神経现胞死のみ ならず神経现胞の再生に぀ながるような䜜甚が期埅される。
アポトヌシス誘導掻性は、䟋えば実斜䟋に蚘茉したように、圓該蛋癜質をコヌド する遺䌝子を哺乳動物现胞に発珟させ、その现胞のアポトヌシスを芳察するこずに よっお確認するこずができる。 アポトヌシスは、现胞の圢態孊的な倉化や、染色䜓 DNAの切断を指暙ずしお確認するこずができる。 たた、 神経突起䌞展䜜甚は、 䟋え ば実斜䟋に蚘茉したように、圓該蛋癜質をコヌドする遺䌝子を哺乳動物の神経系の 株现胞に発珟させ、その现胞の神経突起の䌞展を芳察するこずにより確認するこず ができる。
これら本実斜䟋においお同定された蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質は、圓業者で あれば、䟋えば、蛋癜質䞭のアミノ酞配列に倉異を導入する方法を利甚しお調補す るこずができる。倉異の導入方法ずしおは、䟋えば、郚䜍特異的倉異誘発法 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jonn Wiley & Sons Section 8. 1- 8. 5)等を瀺すこずができる。 たた、 このような蛋癜質は自然 界におけるアミノ酞の倉異により生じるこずもある。本発明には、 このように本実 斜䟋においお同定された蛋癜質ず同等の機胜を有する限り、そのアミノ酞配列配 列番号 2、 たたは 4 ) においお 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、 欠倱、 揷入、 および/たたは付加等により異なる蛋癜質も含たれる。
蛋癜質におけるァミノ酞の倉異数や倉異郚䜍は、その機胜が保持される限り特に 制限されない。 倉異数は、兞型的には、党アミノ酞の 10%以内であり、奜たしくは 党アミノ酞の 5%以内であり、 さらに奜たしくは党アミノ酞の 1%以内である。眮換 されるアミノ酞は、蛋癜質の機胜保持の芳点から、眮換前のアミノ酞ず䌌た性質を 有するアミノ酞であるこずが奜たしい。 䟋えば、 Ala、 Val、 Leu, Ile、 Pro, Met、 Phe Trpは、共に非極性アミノ酞に分類されるため、互いに䌌た性質を有するず考 えられる。 たた、 非荷電性ずしおは、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 TyrN Asn、 Ginが挙げ られる。 たた、 酞性アミノ酞ずしおは、 Aspおよび Gluが挙げられる。 たた、塩基性 アミノ酞ずしおは、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。
たた、本発明の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質は、圓業者に呚知のハむプリダむ れヌション技術あるいは遺䌝子増幅技術を利甚しお単離するこずも可胜である。即 ち、 圓業者であれば、 ハむブリダィれヌシペン技術 (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publisn. John Wiley & Sons Section 6. 3- 6. 4)を甚いお本発明の蛋癜質をコヌドする塩基配列 配列番号 1、 たたは配列番号 3 )たたはその䞀郚をもずにこれず盞同性の高いポリヌクレオチ ドを単離しお、 このポリヌクレオチドから機胜的に同等な蛋癜質を埗るこずは、通 垞行い埗るこずである。 本発明には、 本発明の蛋癜質ず同等の機胜を有する限り、 チドによりコヌドされる蛋癜質も含たれる。
機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドを単離するためのハむブ リダむれヌシペンのストリンゞェントな条件は、 通垞は掗浄のための条件ずしお 「lxSSC、 0. 1% SDS、 37°C」 皋床であり、 より厳しい条件ずしおは 「0. 5xSSC、 0. 1% SDS、 42で」 皋床であり、 さらに厳しい条件ずしおは 「0. lxSSC、 0. 1% SDSN 65°C」 皋床であり、ハむプリダむれヌションの条件が厳しくなるほどプロヌプ配列ず高い 盞同性を有する DNAの単離を期埅し埗る。 䜆し、 䞊蚘 SSC、 SDSおよび枩床の条件の 組み合わせは䟋瀺であり、圓業者であれば、ハむプリダむれヌションのストリンゞ ェンシヌを決定する䞊蚘若しくは他の芁玠を適^䞔み合わせるこずにより、䞊蚘ず 同様のストリンゞ゚ンシヌを実珟するこずが可胜である。ストリンゞ゚ンシヌに圱 響を䞎えるその他の条件ずしお、プロヌブ濃床、プロヌブの長さ、ハむプリダむれ ヌション反応時間などを瀺すこずができる。
このようなハむプリダむれヌション技術を利甚しお単離される蛋癜質は、配列番 号 4に蚘茉の本発明の蛋癜質ず比范しお、通垞、そのアミノ酞配列たたは該蛋癜 質をコヌドする塩基配列においお高い盞同性を有する。高い盞同性ずは、少なくず も 60%以䞊、奜たしくは 70%以䞊、 さらに奜たしくは 80%以䞊䟋えば、 90%以䞊 の配列の同䞀性を指す。盞同性の特定は、 BLAST2怜玢アルゎリズムAltschul, S. F. et al, 1997 Gapped BLAST and PSI - BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. )を甚いお決定するこずがで きる。
たた、 遺䌝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley Sons Section 6. 1—6. 4) を甚いお、 本実斜䟋においお同定された塩基配列 配列番号 1、 たたは 3 ) の䞀郚をもずに プラむマヌを蚭蚈し、 これら塩基配列たたはその䞀郚ず盞同性の高い DNA断片を単 離しお、これをもずに本発明の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質を埗るこずも可胜で ある。本発明の蛋癜質、䞊びに本発明における機胜的に同等な蛋癜質は、埌に述べ るような、 圓該蛋癜質の機胜を修食する化合物の評䟡方法に甚いるこずができる。 たたこれらの蛋癜質をコ䞀ドするポリヌクレオチドは、圓該蛋癜質の補造、発珟状 態を知るためのプラむマヌたたはプロヌプずしお有甚である。
あるいは本発明は、本発明の蛋癜質に察しおドミナントネガティブの圢質を有す る蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドに関する。 ドミナントネガティブの圢質を 有する蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドは、その発珟によ぀お现胞がもずもず 備えおいる内圚性の野生型蛋癜質の掻性を消倱もしくは䜎䞋させる機胜を有する。 䟋えば、 本発明のアポトヌシス関連因子におけるキナヌれドメむン、 SH3リガンド ドメィン等、該蛋癜質の掻性に圱響するず考えられる配列に盞圓する郚分のァミノ 酞配列を改倉すれば、アポトヌシス誘導掻性や神経突起䌞展䜜甚を有さない䞍掻性 䜓を埗るこずができるず考えられる。このようなアミノ酞配列をコヌドする遺䌝子 を现胞内に発珟させれば、本発明のアポト䞀シス関連因子の発珟をドミナントネガ ティブ効果 (䞍掻性型の拮抗阻害により抑制するこずができる。埓っお、 りィルス べクタヌ等の遺䌝子導入技術によっお、䞍掻性䜓遺䌝子を现胞に導入発珟させるこ ずで、アポトヌシスの進行を阻害したり、神経现胞の分化おょぎ Zたたは増殖を抑 制したりするこずが可胜ずなる。
本発明は、 たた、 本発明の蛋癜質の郚分ペプチドを提䟛する。 郚分ペプチドは、 本発明の蛋癜質に察する抗䜓を埗るための免疫原ずしお有甚である。特に、他の蛋 癜質ずの盞同性が䜎い、本発明の蛋癜質に固有のァミノ酞配列を含む郚分べプチド は、 本発明の蛋癜質に察しお特異性の高い抗䜓を䞎える免疫原ずしお期埅される。 このようなアミノ酞配列ずしお、配列番号 6に瀺すアミノ酞配列から遞択される ァミノ酞配列を挙げるこずができる。
本発明の郚分べプチドは、 -少なくずも 7アミノ酞、奜たしくは 9ァミノ酞以䞊、 よ り奜たしくは 12ァミノ酞以䞊、より奜たしくは 15ァミノ酞以䞊のァミノ酞配列から なる。本発明の郚分ペプチドは、䟋えば、遺䌝子工孊的手法、公知のペプチド合成 法、あるいは本発明の蛋癜質を適圓なぺプチダヌれで切断するこずによっお補造す るこずができる。
たた本凳明は、前蚘ポリヌクレオチドのいずれかを含有する発珟ベクタヌを提䟛 する。 さらに、本発明は、前蚘ポリヌクレオチド、 あるいは前蚘いずれかの発珟べ クタ䞀を保持する圢質転換䜓、䞊びにその圢質転換䜓を培逊し、その培逊物から本 発明の蛋癜質を単離する工皋を含む、本発明の蛋癜質、あるいはその郚分ペプチド の補造方法に関する。 さらに本発明は、䞊蚘の方法で補造された蛋癜質、或いはそ の郚分べプチドを提䟛する。
遺䌝子組換え手法でポリベプチドを生産する堎合、宿䞻现胞の皮類により、 目的 ポリぺプチドのグリコシル化の皮類や皋床の異な぀たものが埗られるこずや、いわ ゆるポリぺプチドの分泌生産法においお、宿䞻现胞䞭で発珟された前駆䜓ポリぺプ チドの末端 (N—末端およぎ Zたたは C—末端)ァミノ酞配列がシグナノレ ·ぺプチダ ヌれ等によりプロセッシングを受け、皮々の末端ァミノ酞配列を持぀ポリベプチド が埗られるこずは圓業者に呚知である。埓っお、そのようなポリペプチドも本発明 の蛋癜質の範囲に含たれるこずは、 圓業者ならば容易に理解し埗るこずである。 䞋蚘実斜䟋には、発珟ベクタヌずしお哺乳類動物现胞内で機胜するべクタヌの構 築䟋のみが瀺されおいる。 しかしながら、本発明の蛋癜質をコヌドする D NAが開 瀺されおいる結果、 これらに基づいお、酵母等の真菌類、䞊びに原栞性现胞宿䞻に 導入したずき、該宿䞻に本発明の蛋癜質を発珟、産生させ埗る発珟ベクタヌを構築 するこずは圓業者にずっお容易である。埓っお、本発明は、本発明の栞酞配列に基 づき、 圓該技術分野既知の方法で構築される発珟べクタ䞀をも包含する。
本発明の蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチドを発珟させるために甚い埗る埮 生物现胞には、 䟋えば、 原栞性の现菌 [倧腞菌 (fe^ari^is や枯草菌 (Bacillus subtil is) ]およぎ真栞性の酵母 [䟋えばパン酵母菌 Saccar呵 ces core 's ae) ]がある。たた、哺乳類现胞には培逊ヒト现胞おょぎ培逊動物现胞が含 たれる。 さらには培逊怍物现胞も甚い埗る。
埮生物の䟋ずしおはェシ゚リキア属に属する现菌やパン酵母がある。より具䜓的 には、 䟋えば次のような菌株を埮生物宿䞻ずしお挙げるこずができる。
ェシェリキア属に属する现菌
K coli HB10KATCC 33694)
K coli HB101-16 (FERM BP- 1872)
E. coli MM294(ATCC 31446) K coli DH1 (ATCC 33849)等
パン酵母
S. cerevisiae AH22 (ATCC 38626)等
哺乳動物现胞の䟋ずしおはヒト胎児腎臓由来 H E K 2 9 3现胞、マりス L 9 2 9 现胞およびチャむニヌズ.ハムスタヌ ·ォパリヌC H O)现胞等がある。
通垞、原栞生物である现菌、特に倧腞菌を宿䞻现胞ずしお甚いる堎合、発珟べク タヌは少なくずもプロモヌタヌ、開始コドン、本発明の蛋癜質のアミノ酞配列をコ ヌドするポリヌクレオチド、終止コドンおょぎ自己耇補可胜ュニットから構成され る。真栞生物、即ち酵母や哺乳動物现胞を宿䞻现胞ずしお甚いる堎合、発珟べクタ 䞀は、少なくずもプロモヌタヌ、開始コドン、本発明の蛋癜質のアミノ酞配列をコ ヌドするポリヌクレオチドおよび終止コドンから構成されるのが奜たしい。さらに ェンハンサヌ配列、本発明の蛋癜質の 5 '—および 3䞀非コヌド領域、ポリアデニ ルむ匕郚䜍おょぎ自己耇補可胜単䜍を挿入するこずもできる。
䞊蚘の自己耇補可胜単䜍は、 圢質転換䜓の遞択マヌカヌ (䟋えば、 ァンピシリン 耐性を含有しおいるこずが奜たしい。 现菌を宿䞻ずする発珟ベクタヌの堎合、 プ 口モヌタヌずいう語句は、プロモヌタヌ、オペレヌタヌおょぎシャむン䞀ダノレガヌ ノ S D)配列 (䟋えば A AG G等からなるプロモヌタヌ ·オペレヌタヌ領域を意味 する。 そのようなプロモヌタヌの䟋ずしおは、慣甚のプロモヌタヌ ·オペレヌタ䞀 領域が挙げられる。 具䜓的には、 ラタトヌスォペロン、 P L—プロモヌタヌ、 ある いは trp—プロモヌタヌ等を瀺すこずができる。 酵母を宿䞻ずする発珟ベクタヌに 甚いられるプロモヌタヌの䟋ずしおは pho 5プロモヌタヌが拳げられる。 曎に、 粟 補を容易に行うこずを目的ずしお、金属むオンキレヌトに察する芪和性を持぀塩基 性ァミノ酞を、 本発明の蛋癜質におけるいずれかの末端に付加するこずができる。 塩基性アミノ酞を付加する堎合には、垌望のアミノ酞をコヌドする塩基配列が連続 した塩基配列を 5'偎に付加したプラむマヌを甚いお、 P C Rを行えば、 目的ずする 遺䌝子の任意の末端に、オリゎペプチドを付加するこずができる。塩基性アミノ酞 ずしおは、 ヒスチゞン、 リゞン、 あるいはアルギナンなどを甚いるこずができる。 哺乳動物现胞における発珟ベクタヌに甚いられるプロモヌタヌの䟋ずしおは、 H TLV— LTRプロモヌタ䞀、 SV40初期おょぎ埌期プロモヌタヌ、 CMVプロ モヌタヌ、 マりス ·メタ口チォネむン I(MMT)—プロモヌタヌ等が挙げられる。 奜たしい開始コドンの䟋ずしおメチォニンコドンATG)が挙げられる。
終止コドンの䟋ずしおは慣甚されおいる終止コドン䟋えば TAG、 TGA、等 が挙げられる。 自己 可胜ナニットずは、それを含有する発珟ベクタヌの党 DN Aを宿䞻现胞䞭で自己耇補し埗る DN A配列であっお、倩然のプラスミド、人工的 に修食したプラスミド、および合成プラスミドが挙げられる。人工的に修食したプ ラスミドには、䟋えば倩然プラスミドから調補した DNA断片等が含たれる。その ようなプラスミドの奜たしい䟋ずしおは、倧腞菌を宿䞻现胞ずする堎合、䟋えばプ ラスミド pBR322やその人工修食䜓が挙げられる。人工修食䜓ずは、たずえば p B 322の適圓な制限酵玠凊理によっお埗られた DN A断片等を瀺すこずがで きる。 たた酵母を宿䞻现胞ずする堎合には、䟋えば、 pJDB 219、 pJDB 20 7等が挙げられる。 さらに、 動物现胞甚プラスミドずしおは、 䟋えばプラスミド pcDNA3.1 (Invitrogen) 、 p顧 324、 プラスミド PSV2dhfr (ATCC37145) 、 プラスミ ド pdBPV - MTneo (ATCC37224) 、 プラスミド pSV2neo (ATCC37149) が挙げられる。 ェンハンサヌ配列ずしおは、 䟋えば SV40のェンハンサヌ配列が挙げられる。 ポリァデュル化郚䜍ずしおは、䟋えば S V 40のポリアデニル化郚䜍が挙げられる。 本発明の蛋癜質のアミノ酞配列をコ䞀ドするポリヌクレオチドは、䟋えば、 DN A合成装眮を甚いお、 郚分合成たたは党合成するこずによっお埗るこずができる。 或いは、 ヒト cDNAラむブラリヌより、配列番号 3に蚘茉の塩基配列に基づいお蚭 定したプロヌブやプラむマヌを甚いお取埗するこずができる。曎に、ゲノム DNA を垞法通り凊理するこずによっお、 本発明の蛋癜質をコヌドするゲノム DNAを調補 するこずができる。ゲノム DNAの凊理方法ずしおは、䟋えば、制限酵玠による消化、 现菌ァ /レカリホスファタヌれによる脱燐酞化、 T 4ポリヌクレオチドキナヌれによ る憐酞化、および T 4 D N Aリガヌれを甚いたラむゲヌション等の工皋を含む凊理 方法を瀺すこずができる。 曎にこのようにしお取埗したゲノム DNAを利甚し、 ゲノ ムにおける本発明の遺䌝子の転写開始点を明らかにし、より䞊流に䜍眮する発珟制 埡領域を特定するこずができる。本発明の蛋癜質をコヌドする遺䌝子の発珟を制埡 するプロモヌタヌゃェンハンサ䞀等の制埡領域は、本発明の蛋癜質の発珟異垞を怜 出するための暙的領域ずしお有甚である。或いは、 これらの領域を暙的ずするデコ ィ栞酞医薬などにより、 発珟制埡を実珟するこずができる。
本発明の実斜に必芁な、 D NAのクロヌナング、各プラスミドの構築、宿䞻のト ランスプクシペン、圢質転換䜓の培逊および培逊物からの蛋癜質の回収等の操䜜 は、圓業者既知の方法、あるいは文献蚘茉の方法 [Molecular Cloning 2nd. edition, J. Sambrook et. al, Cold Springs Harbor Laboratory (1989) , DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)他、 Molecular Cloning 3rd. edition, J. Sambrook et. al, Cold Springs Harbor Laboratory (2001) ]に準じお行なうこずができる。
たた、本発明の宿䞻现胞には、本発明のアポトヌシス関連因子の機胜解析やこの 蛋癜質を利甚したその機胜阻害剀や機胜促進剀の評䟡方法のために甚いる目的の 现胞も含たれる。宿䞻现胞ぞのベクタヌ導入は、䟋えば、リン酞カルシりム沈殿法、 電気" ^ノレス穿孑 L、fe (Current protocols in Molecular Biology edit. A subel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9. 1-9. 9) 、 リポプクタミン法
(GIBC0-BRLŸ ) 、 マむクロむンゞェクション法等の方法で行うこずが可胜であ る。圢質転換䜓からの本発明の蛋癜質の調補は、 圓業者に公知の蛋癜質の分離'粟 補法を利甚しお行なうこずができる。
本発明はたた、配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレオチドたたは その盞補鎖に盞補的な少なくずも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提䟛 する。 ここで 「盞補鎖」 ずは、 A:T (A:U) 、 G:Cの塩基察からなる 2本鎖ポリヌクレ ォチドの䞀方の鎖に察する他方の鎖を指す。 たた、 「盞補的」 ずは、少なくずも 15 個の連続したヌクレオチド領域で完党に盞補配列である堎合に限られず、少なくず も 70%、奜たしくは少なくずも 80%、 より奜たしくは 90%、 さらに奜たしくは 95%以 䞊の塩基配列䞊の盞同性を有すればよい。盞同性を決定するためのアルゎリズムは 本明现曞に蚘茉したものを䜿甚すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、 本発明の蛋癜質をコヌドする DMや RNAを怜出、 単離するためのプロヌブずしお、たた、本発明のポリヌクレオチドを増幅するため のプラむマヌずしお利甚するこずが可胜である。プラむマヌずしお甚いる;^には、 通垞、 15bP〜100bP、 奜たしくは 15bp〜35bpの鎖長を有する。 たた、 プロヌプずし お甚いる堎合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくずも䞀郚若しくは党郚の配 列を有し、少なくずも 15bpの鎖長のポリヌクレオチドが甚いられる。プラむマヌず しお甚いる堎合、 3'偎の領域は盞補的である必芁があるが、 5'偎には制限酵玠認識 配列ゃタグなどを付加するこずができる。
特に、配列番号 3に瀺す塩基配列のうち、配列番号 5に蚘茉された塩基配列 を含む領域、たたはその盞補配列にハむブリダィズするこずができるオリゎヌクレ ォチドは、 AF06972を特異的に怜出するためのプロヌブ、 あるいはプラむマヌずし お有甚である。
あるいは、配列番号 3に瀺す塩基配列のうち、配列番号 5に蚘茉された塩基 配列からなる領域を増幅するこずができるプラむマヌは、 HJ06972ず AF06972の䞡方 を 1組のプラむマヌによっお増幅するこずができる。しかも圓該プラむマヌによ぀ お埗られる増幅生成物には、 HJ06972ず AF06972ずでは配列番号 3の構成塩基数で ある 9 4 bpの盞違が生じる。 したがっお、 このようなプラむマヌを甚いるこずによ り、 HJ06972ず AF06972ずを区別しお怜出、 あるいは確認するこずができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の蛋癜質の異垞を怜査 ·蚺断するために利 甚するこずができる。䟋えば、本発明のポリヌクレオチドをプロヌブやプラむマヌ ずしお甚いたノヌザンハむプリダむれ䞀ションゃ RT - PCRにより、発珟異垞を怜査す るこずができる。たた本発明のポリヌクレオチドをプラむマ䞀ずしお甚いたポリメ ラヌれ連鎖反応 (PCR)により、ゲノム DNA - PCRや RT - PCRを実斜するこずができる。曎 に、 本発明の蛋癜質をコヌドする遺䌝子やその発珟制埡領域を増幅し、 RFLP解析、 SSCP、 シヌクェンシング等の方法により、配列の異垞を怜査'蚺断したりするこず ができる。
たた、 本発明のアポトヌシス関連因子 AF06972) は神経再生、 脳梗塞治療、 神 経軞玢再生、神経軞玢䌞展に甚いるこずができるこずから、該因子をコヌドするポ リヌクレオチドを、該因子が関連する疟患の遺䌝子治療に甚いるこずも可胜である。 即ち、宿䞻の疟患郚䜍においお適切に発珟されるよう該ポリヌクレオチドを導入す るこずにより、本発明のアポトヌシス関連因子を発珟させ、該因子が関連する疟患 を治療'予防するこずが可胜である。 本発明においお 「発珟」 ずは、 転写および/ たたは翻蚳が含たれる。本発明のポリヌクレオチドを甚いた発珟の解析により、遺 䌝子の転写レベルでの発珟を怜査.蚺断するこずができる。 たた、埌述の本発明の 蛋癜質に察する抗䜓を甚いれば、遺䌝子の翻蚳レベルでの発珟を怜査 ·蚺断するこ ずができる。
本発明における HJ06972あるいは AF06972は、いずれもアポトヌシスに密接に関連 する蛋癜質をコヌドする遺䌝子である。たずえば、人為的にアポトヌシスを誘導し た血液现胞では、これらの遺䌝子の発珟レベルがアポトヌシスの進行にずもなっお 増匷される。 したがっお、生䜓詊料䞭のこれらの遺䌝子の発珟レベルは、アポトヌ シスの進行状態の蚺断指暙ずしお有甚である。たずえば、劇症肝炎のような急激な アポトヌシスの進行が芋られる疟患においおは、 HJ06972あるいは AF06972の発珟レ ベルの急激な䞊昇を蚺断指暙ずするこずができる。
加えお本発明は、生䜓詊料䞭のアポトヌシスマヌカヌを枬定し、該アポト䞀シス マヌカ䞀の枬定レベルの䞊昇が圓該生䜓詊料におけるアポト䞀シスを瀺す工皋を 含むアポトヌシスの怜出方法であっお、アポトヌシスマヌカヌが次のa ) — ( e ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたは a ) — ( e ) のいずれかに蚘茉の ポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質である方法を提䟛する。
( a ) 配列番号 3に蚘茉された塩基配列を含むポリヌクレオチド、 ( b )配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドするポリヌクレ ォチド、
( c ) 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のアミ ノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、 および/ たたは付加したァミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列か らなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチド、
( d ) 配列番号 5に蚘茉の塩基配列を含み、配列番号 3に蚘茉の塩基配列から なるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズし、配列 番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌ ドするポリヌクレオチド、 および
( e )配列番号 5に蚘茉の塩基配列から遞択された塩基配列を含み、か぀配列番 号 3に蚘茉の塩基配列ず 7 0 %以䞊のホモロゞ䞀を有し、配列番号 4に蚘 茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、
AF06972遺䌝子は脳以倖の組織においおは恒垞的な発珟は芋られない。 他方、 ァ ポトヌシスを起こした现胞では短時間のうちに、 AF06972遺䌝子の発珟レベルが䞊 昇する。たずえばマりスの现胞を甚いた実隓においおは、血液现胞のアポトヌシス の誘導に䌎っお、 MTYKあるいは AF06972の発珟レベルが急激に䞊昇しおいる。 した がっお、 MTYK、 AF06972N あるいはこれず機胜的に同等な遺䌝子をアポトヌシスマ 䞀力䞀ずしお枬定するこずによっお、 アポトヌシスを怜出するこずができる。 本発明におけるアポトヌシスマヌカヌは、前蚘 ( a ) 侀 ( e ) のいずれかに蚘茉 のポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋 癜質である。特定の構造を有するポリヌクレオチドゃ蛋癜質を枬定する方法は公知 である。たずえば、塩基酉己列が明らかなポリヌクレオチドはハむプリダむれヌショ ンゃ PCRを利甚するこずによっお、 その量を枬定するこずができる。 たた、 ァミノ 酞配列が明らかな蛋癜質は、その蛋癜質を認識する抗䜓を利甚したィムノアッセィ によっお枬定するこずができる。曎に蛋癜質が有する生化孊的な掻性を指暙ずしお、 蛋癜質の量を枬定するこずもできる。
アポトヌシスマヌカヌの枬定倀は、通垞、健垞者の枬定レベルず比范される。耇 数の健垞者の生䜓詊料に぀いおアポトヌシスマヌカヌを枬定し、統蚈孊的な手法に よっお暙準倀を蚭定するこずができる。被怜者の枬定倀が暙準倀を越える には、 該被怜者はアポトヌシスを有するず刀定される。
本発明によるアポトヌシスの怜出方法には、公知のアポトヌシスマヌカヌを組み 合わせるこずができる。耇数のアポトヌシスマ䞀力䞀を組み合わせるこずによっお、 アポトヌシスの怜出粟床の向䞊が期埅できる。公知のアポトヌシスマヌカヌずしお は以䞋のマヌカヌを瀺すこずができる。
caspaseファミリヌ MTS還元胜
(たずえば aspase - 2/3/7/8/9) LDHリリヌス
ATP DMの断片化
本発明の怜出方法においお、生䜓詊料ずは、生䜓から採取されるあらゆる詊料を 甚いるこずができる。具䜓的には、血液、尿、 あるいは各皮臓噚の生怜詊料等を瀺 すこずができる。特に、生怜詊料におけるアポトヌシスマヌカヌの発珟レベルの䞊 昇は、その組織におけるアポトヌシスの蚌明ずなる。 たた、血液䞭のアポトヌシス マヌカ䞀のレベルの䞊昇は、 生䜓内におけるアポトヌシスの進行を反映しおいる。 本発明のアポトヌシスの怜出方法に基づいお、劇症肝炎の蚺断方法が提䟛される。 本発明の劇症肝炎の蚺断方法は、 次の工皋を含む。
( 1 )本発明のアポトヌシスの怜出方法によっお、肝现胞を生䜓詊料ずしおアポ トヌシスを怜出する工皋、 および
( 2 ) 工皋 ( 1 ) においおアポトヌシスが怜出された堎合に、劇症肝炎が進行し おいるず刀定する工皋
たた、 「配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレオチドたたはその盞 補鎖に盞補的な少なくずも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド」には、本発明 の蛋癜質の発珟を抑制するためのアンチセンスポリヌクレオチドが含たれる。䞀方、 本発明におけるァンチセンスずは、配列番号 2たたは配列番号 4に蚘蜜のァミノ 酞配列を有する蛋癜質の発珟を抑制するポリヌクレオチドを意味する。即ち、 この ような掻性を有するアンチセンスは、 CREBの脱リン酞化を抑制し、 CREBの脱リン酞 ィ匕反応の阻害剀、 たたは、蚘憶 ·神経倉性疟患の治療若しくは予防剀ずしお甚いる こずができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、 アンチセンス DNAでもアンチセンスオリゎヌ クレオチドであっおもよい。 アンチセンス DNAは、 少なくずも 15bp以䞊、 奜たしく は 100bP、 さらに奜たしくは 500bp以䞊の鎖長を有し、通垞、 3000bp以内、奜たしく は 2000bP以内の鎖長を有する。 該アンチセンス DNAを単独あるいは、 レトロりむ/レ スベタタヌ、アデノりィルスベクタヌ等の適圓なベタタヌにアンチセンス方向に揷 入しお甚いるこずができる。アンチセンスオリゎヌクレオチドは、少なくずも 1 0 bp以䞊、 通垞 1 0 O bp以内、 奜たしくは 2 O bp以䞊、 5 O bp以内の鎖長を有する。 該アンチセンスオリゎヌクレオチドは、䟋えば、配列番号 1たたは配列番号 3に 蚘茉の塩基配列情報を基にホスホロチォ゚ヌト法 Stein "Physicochemical properties of phosphorot ioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res. 16: 3209 - 3221 (1988) ) 等により調補するこずが可胜である。
このようなアンチセンスには、配列番号 2たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞 配列を有する蛋癜質の異垞に起因する疟患の遺䌝子治療ぞの応甚も考えられる。本 発明の蛋癜質の異垞には、蛋癜質の機胜異垞や発珟異垞などが含たれる。遺䌝子治 療に甚いる堎合には、䟋えば、レトロりィルスベクタヌ、アデノりィルスベクタヌ、 アデノ随䌎ゥィルスべクタ䞀等のゥィルスべクタ䞀やリボ゜ヌム等の非りむルス ベタタヌ等を利甚しお、 ex viv。 や in rira法等により患者ぞ投䞎するこずができ る。具䜓的には、虚血性疟患による組織の障害においおはアポトヌシスが重芁なス テツプずなっおいる。埓っお、血流障害を起こした組織における本発明の蛋癜質の 発珟を阻害できれば、 虚血性疟患に䌎う組織損傷を軜枛するこずができる。 本発明のポリヌクレオチドたたはァンチセンスポリヌクレオチドは、遺䌝子治療 に甚いる堎合には、 䟋えば、 レトロりむルスベクタヌ、 アデノりむルスベクタ^"、 アデノ随䌎りィルスべクタヌ等のりィルスべクタヌやリボ゜ヌム等の非りィルス べクタ䞀などを利甚しお、 ex vivo法や in 'ra法などにより患者ぞ投䞎するこずが できる。
本発明は、 たた、配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列によっお構成される抗原決 定基を認識する抗䜓を提䟛する。配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列によっお構成 される抗原決定基には、たずえば配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列から遞択され たアミノ酞配列からなる抗原決定基が含たれる。 このほか、配列番号 4に蚘茉の アミノ酞配列においお、配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列ずそれに隣接するアミ ノ酞配列ずで構成される抗原決定基を認識する抗䜓は、 本発明の抗䜓に含たれる。 曎に、配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列からなる領域によっお構成される、配列 番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質の立䜓構造からなる抗原決定基を認 識する抗䜓も、本発明に含たれる。 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列は、本発明 者らが芋出した新芏遺䌝子 AF06972に固有のアミノ酞配列である。 したがっお、 こ の領域を特異的に認識するこずができる本発明の抗䜓は、 AF06972によっおコヌド される蛋癜質の怜出や粟補に有甚で る。 。
本発明の抗䜓の圢態には特に制限はなく、ポリクロ䞀ナル抗䜓やモノクロヌナル 抗䜓たたは抗原結合性を有するそれらの䞀郚も含たれる。 たた、党おのクラスの抗 䜓が含たれる。さらに、本発明の抗䜓には、ヒト化抗䜓などの特殊抗䜓も含たれる。 本発明の抗䜓は、ポリクロヌナル抗䜓の堎合には、本発明の蛋癜質たたは郚分べ プチドを家兎に免疫するこずにより埗るこずが可胜である Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publisn. John Wiley & Sons. Section 11. 12〜11. 13) 。 䞀方、 モノクロヌナル抗䜓の堎合には、 本発明の蛋癜質 たたは郚分べプチドを甚いおマりスを免疫し、脟臓现胞ず骚髄腫现胞を现胞融合さ せたハむブリドヌマ现胞の䞭から埗るこずができる Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11. 4〜 11. 11) 。
本発明の蛋癜質に結合する抗䜓は、本発明の蛋癜質の粟補に加え、䟋えば、 これ ら蛋癜質の発珟異垞や構造異垞の怜査 ·蚺断に利甚するこずも考えられる。具䜓的 には、䟋えば組織、血液、 たたは现胞等から蛋癜質を抜出し、 りェスタンプロッテ むング、 免疫沈降、 ELISA等の方法による本発明の蛋癜質の怜出を通しお、 発珟や 構造の異垞の有無を怜査 ·蚺断するこずができる。
本発明の蛋癜質に結合する抗䜓は、本発明の蛋癜質に関連した疟患の治療等の目 的に利甚するこずも考えられる。抗䜓を患者の治療目的で甚いる堎合には、 ヒト抗 䜓たたはヒト化抗䜓が免疫原性の少ない点で奜たしい。 ヒト抗䜓は、免疫系をヒト のものず入れ傑 たマゥス (䟋 ί 、 「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice, Mendez, M. J. et al. (1997) Nat. Genet. 15 : 146-156 J 参照 に免疫するこずにより調補する こずができる。 たた、 ヒト化抗䜓は、モノクロヌナル抗䜓の超可倉領域を甚いた遺 䌝子組み換えによっお調補するこずができるMethods in Enzymology 203, 99 - 121 (1991) )。
本発明は、次の工皋を含む、候補物質のアポトヌシスを制埡する掻性を怜出する 方法に関する。
( 1 ) 次の a ) 〜 d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞に候補物質 を接觊させる工皋、
( a ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜
( b ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌク レオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズするポリヌクレ ォチドによっおコヌドされる a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜 ( c ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若 しくは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および Zたたは付加したアミ ノ酞配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
( d )配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊の ホモロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜 的に同等な蛋癜質
( 2 )アポトヌシスが誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞のアポト 䞀シスを枬定する工皋、 および
( 3 ) 工皋 ( 2 ) の枬定結果を指暙ずしお、候補物質のアポト䞀シスを抑制、 た たは促進する掻性を怜出する工皋。
前蚘怜出方法においお、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質ずは、察 象ずなる蛋癜質がアポトヌシス誘導掻性を持぀こずを蚀う。圓該掻性は先に述べた 方法により確認するこずができる。
前蚘 ( a )〜d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞ずしおは、 本発明 の蛋癜質の発珟によりアポトヌシスが匕き起こされる现胞であれば真栞现胞たた は原栞现胞のいずれをも甚いるこずが可胜である。奜たしくは動物现胞が甚いられ、 䞭でも PC12のような神経现胞が奜たしい。
前蚘怜出方法においお、アポトヌシスが誘導される条件ずは、前蚘 ( a )〜d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質が现胞内で発珟される条件である。本発明の蛋癜質の现 胞䞭での発珟はアポトヌシスに盎結するので、そのたたでは効率的なスクリヌニン グが期埅できない。そこで、制埡可胜なプロモヌタヌ配列の䞋流に本発明の蛋癜質 をコヌドする遺䌝子を結合させた発珟プラスミドを利甚するこずができる。制埡可 胜なプロモヌタヌずしおは、䟋えばメタロチォネィンプロモヌタ䞀等を瀺すこずが できる。このようなプロモヌタヌの制埡䞋に本発明の掻性型蛋癜質をコ䞀ドする遺 䌝子を発珟するプラスミドを现胞に圢質転換する。このようにしお埗られた圢質転 換䜓は、 プロモヌタヌを掻性ィ匕させた条件䞋でアポトヌシスが匕き起こされる。 前蚘现胞のアポトヌシスを枬定する工皋では、 现胞の圢態の倉化や DNAの断片化 を指暙ずしお怜出する方法を採甚するこずが䞀般的である。アポト䞀シスによる现 胞の圢態孊的な倉化は、 ギムザ染色や蛍光染色の染色像の倉化ずしお芳察される。 あるいは DNAの断片化は、 T觀 L法Gavriel Y rt al, 1992 J Cell Biol, 119 :493 - 501) によっお怜出するこずができる。 さらに、初期のアポトヌシスを怜出する方法ずし お、 構造倉化した现胞膜に結合する蛍光暙識 Annexin Vずフロヌサむトメ䞀タヌで 枬定する Annexin V法等があるVermes I, et al. J Immunol Methods. 1995 Jul 17 ; 184(1) : 39-51. ) 0
前蚘アポトヌシスを制埡する掻性の怜出方法は、アポトヌシスを制埡する掻性を 有する物質の評䟡に利甚するこずができる。 すなわち本発明は、 次の工皋を含む、 アポト䞀シスを制埡する掻性を有する物質の評䟡方法に関する。
( 1 )前蚘怜出方法によっお候補物質のアポトヌシスを抑制、たたは促進する掻性 を怜出する工皋、 および
( 2 )察照ず比范しお、前蚘现胞のアポトヌシスを抑制、 たたは促進する掻性を有 する候補物質を遞択する工皋。
あるいは本発明は、次の工皋を含む、䟯補物質のァポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖のいずれかを制埡する掻性を怜出する方法に関する。
( 1 )候補物質の存圚䞋、 配列番号 1、 たたは、 配列番号 3に蚘茉の塩基配 列からなる遺䌝子の発珟制埡領域ず、その䞋流に機胜的に結合されたレポ䞀 タ䞀遺䌝子を含むベクタ䞀を発珟させる工皋、
( 2 ) 前蚘レポ䞀タ䞀遺䌝子の掻性を枬定する工皋、 および
( 3 ) 工皋 ( 2 ) の枬定結果を指暙ずしお、候補物質のアポトヌシス、神経现胞 の分化、 及ぎ、 神経现胞の増殖のいずれかを制埡する掻性を怜出する工皋。 前蚘怜出方法においお、配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列か らなる遺䌝子の発珟制埡領域は、 染色䜓 DNAから公知の方法によっおクロヌナング するこずができる。たずえば S1マツビング法が転写開始点の特定方法ずしお公知で ある  「転写調節領域の単離」 および 「転写制埡因子の同定ず粟補」 、 「现胞工孊 別冊 8新现胞工孊実隓プロトコヌル」 、東京倧孊医科孊研究所制癌研究郚線秀最 瀟 1993幎、 362-374) 。 䞀般に圓該遺䌝子の発珟制埡領域 DNAは、 ヒト染色䜓ラむ ブラリヌ genomic library) を、 圓該遺䌝子の 5'末端の 1 5〜1 0 O bp、 奜たし くは 3 0〜5 0 bpをプロヌブ DNAに甚いおスクリヌナングするこずにより、 発珟制 埡領域を含む遺䌝子クロヌンずしおクロヌニングされる。
このようにしお埗られたクロヌンはしばしば 1 O kbp以䞊の圓該遺䌝子の 5'非翻 蚳領域を包含しおいる。そこで、 これらのクロヌンの 5'末端をェキ゜ヌクレアヌれ 凊理などによっお短瞮化、あるいは断片化する。短瞮された発珟制埡領域を含む配 列でレポヌタヌ遺䌝子の発珟の匷さや発珟の制埡に぀いおの評䟡を行うこずによ ぀お、 発珟制埡領域の掻性維持のための最小必芁単䜍を埗るこずができる
(deletion study) 0
たた、 遺䌝子の発珟制埡領域を Neural Network を甚いお予枬するプログラムが 公知である (nttp:// ww. fruitf ly. org/ seq_tools/promoter. html, Reese, M. G. et al, "Large Scale Sequencing Spesif ic Neural Networks for Promoter and Splice Site Recognition" Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, edited by Lawrence Hunter and Terri E. Klein , World Scientific Publishing Co, Singapore, January 2-7, 1996)。 あるいは Promoter Scanのような転写因子結 合配列を怜玢しお発珟制埡領域を予枬するプログラムを甚い掻性の最小単䜍を予 枬するこずも行われおいる
(http://biosci. cbs. umn. e du/ s of twar e/ pros can/pr omot er s can. htm, Prestridge, D. S. 1995 Prediction of Pol II Promoter Sequence using Transcription Facter Binding Sites. J. Mol. Biol. 249 923 - 932)。 たた、 予枬されたコアの郚分を䞭 心に deletion studyを実斜するこずもできる。
このようにしお単離された本制埡領域遺䌝子の䞋流に、レポヌタヌ遺䌝子を機胜 的に結合させた発珟ベクタヌは、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 あるいは神経现 胞の増殖を制埡する掻性の怜出に甚いるこずができる。本発明においお、機胜的な 結合ずは、前蚘発珟制埡領域の掻性ィヒによっお、 レポヌタヌ遺䌝子の転写が開始さ れるように䞡者を結合するこずを意味する。 レポヌタヌ遺䌝子には、前蚘発珟制埡 領域の掻性ィ匕を遺䌝子の発珟ずしお芳察するこずができる蛋癜質をコヌドするも のであれば任意の遺䌝子を利甚するこずができる。具䜓的には、䟋えばルシフェラ ヌれ、 カタラヌれ、 ガラクトシダ䞀れ、 GFP (Green Fluorescent Protein) 等の 遺䌝子がレポヌタヌ遺䌝子ずしお䞀般に甚いられる。ベクタヌを導入する现胞には、 䟋えば圓該遺䌝子を欠倱させた動物现胞を甚いるこずができる。
䞊蚘ベクタヌを導入した现胞は、现胞死 アポトヌシス、たたは现胞の分化も しくは増殖を匕き起こすような条件䞋でプロモヌタヌが掻性化され、レポヌタヌ遺 䌝子によるシグナルを生成する。埗られた现胞を 96りェルマルチプレヌトに播皮し、 アポトヌシス、たたは现胞の分ィ匕もしくは増殖を匕き起こす条件䞋で培逊を開始す る。 このずき評䟡すべき化合物を各ゥ゚ルに加えるこずにより、圓該遺䌝子の発珟 制埡領域に䜜甚しお、発珟を抑制する、あるいは促進する掻性をレポヌタヌ遺䌝子 を指暙ずしお容易に怜出するこずができる。
䟋えば、 レポヌタヌ遺䌝子ずしお GFPを甚いた堎合、 䟯補物質を加えた状態およ 加えない堎合での GFPの発光量の比范を行うこずにより、 発珟制埡領域に察する 圱響を評䟡するこずができる。比范にあたっおは、たずえば 2倍以䞊若しくは 1 / 2以䞋、奜たしくは 5倍若しくは 1 5以䞋、 より奜たしくは 1 0倍以䞊若しくは 1 / 1 0以䞋の発光量比を瀺す^ こ、 有意な差があるず刀定するこずができる。 本方法は動物现胞ばかりでなく同様なシステムで现胞死、たたは现胞の分化もしく は増殖を匕き起こすような宿䞻であれば、真栞生物 ·原栞生物を問わず応甚するこ ずができる。このずき、现胞はレポヌタヌ遺䌝子が発珟可胜な条件䞋で培逊される。 たた、 レポヌタヌ遺䌝子を含む前蚘発珟ベクタヌは、 ώ τ 'ίΐΌの実隓系においお 甚いるこずもできる。 すなわち、 i 'iro蛋癜質合成に必芁ずされる無现胞抜出液 に、 本発珟ベクタヌずずもに、 緩衝液、 アミノ酞、 ゚ネルギヌ源である ATPおよび GTPを䟛絊し、 䟯補物質によるレポヌタヌ遺䌝子の発珟の阻害たたは促進を怜定す るこずができる。本方法で甚いる無现胞抜出液ずしおは、動物神経现胞ず同様なシ ステムにより现胞死、たたは、现胞の分化もしくは増殖を匕き起こすような宿䞻由 来のものを甚いるこずができる。
ここで、アポトヌシスを匕き起こすような条件、现胞の分ィ匕もしくは増殖を匕き 起こすような条件ずは、前蚘発珟制埡領域からの指什によりレポ䞀タヌ遺䌝子の発 珟が誘導される条件を蚀う。
前蚘アポトヌシス、神経现胞の分化、および神経现胞の増殖のいずれかを制埡す る掻性の怜出方法は、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖のい ずれかを制埡する掻性を有する物質の評䟡に利甚するこずができる。すなわち本発 明は、次の工皋を含む、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖の いずれかを制埡する掻性を有する物質の評䟡方法に関する。
( 1 ) 前蚘怜出方法によっお、候補物質のアポトヌシス、神経现胞の分化、 およ ぎ神経现胞の増殖のいずれかを抑制、 たたは促進する掻性を怜出する工皋、 䞊びに
( 2 ) 察照ず比范しお、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを抑制、 たたは促進する掻性を有する候補物質を遞択する工皋。 カロえお、本発明は次の工皋を含む、候補物質の神経现胞の分化および/たたは増 殖を制埡する掻性の怜出方法に関する。
( 1 ) 次の a ) 〜 d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞に候補物質を 接觊させる工皋、
( a )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質、
( b )配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ 才チドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズするポリヌクレオチ ドによっおコヌドされる a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
( c ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および Zたたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
( d ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊のホ モロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に 同等な蛋癜質
( 2 )神経突起の䌞展が誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞の神経突 起の䌞展を枬定する工皋、 および
( 3 ) 工皋 ( 2 ) の枬定結果を指暙ずしお、候補物質の神経现胞の分化および/た たは増殖を抑制、 たたは促進する掻性を怜出する工皋。
前蚘怜出方法においお、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質ずは、察 象ずなる蛋癜質が神経现胞の分化おょぎ Zたたは増殖掻性を持぀こずを蚀う。圓該 掻性は、神経现胞の分ィ匕および Zたたは増殖を指暙ずしお行われる。䟋えば、 PC12 现胞等の神経现胞における神経突起䌞展䜜甚を怜出するこずにより行うこずがで さる。
前蚘怜出方法は、 䟋えば次のようにしお実斜するこずができる。 HJ06972遺䌝子 若しくは AF06972によりコヌドされる蛋癜質、 たたは該蛋癜質ず機胜的に同等な蛋 癜質を発珟するように䜜成された PC12等の现胞に察し候補物質を接觊させる。この ずき、现胞を可芖ィ匕できる蛋癜質を発珟させるように圢質転換した现胞を甚いるず 芳察が容易ずなる。 このような蛋癜質ずしおは、 GFPを甚いるこずができる。 その 埌、神経现胞の数や分化の倉ィヒを芳察するこずにより、 目的ずする掻性を怜出する こずができる。现胞の分化は神経突起の進展などを指暙ずしお評䟡するこずができ る。
前蚘 ( a )〜d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞ずしおは、本発明 の蛋癜質の発珟により分化おょぎ Zたたは増殖が匕き起こされる神経现胞であれ ばいずれの现胞を甚いるこずが可胜である。奜たしくは PC12等のクロヌン化された 神経现胞株が甚いられる。 前蚘怜出方法においお、神経突起の䌞展が誘導される条件ずは、前曟 3 ( a )〜 d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質が现胞内で発珟される条件である。
前蚘神経现胞の分化およぎ Zたたは増殖を制埡する掻性の怜出方法は、神経现胞 の分ィ匕および/たたは増殖を制埡する掻性を有する物質の評䟡に利甚するこずが できる。すなわち本発明は、次の工皋を含む、神経现胞の分化おょぎ Zたたは増殖 を制埡する掻性を有する物質の評䟡方法に関する。
( 1 )前蚘怜出方法によっお候補物質の神経现胞の分ィ匕および Zたたは増殖を制 埡する掻性を怜出する工皋、 䞊びに
( 2 )察照ず比范しお、神経现胞の分化おょぎ Zたたは増殖を制埡する掻性を有 する候補物質を遞択する工皋。
本発明の評䟡方法に甚いる候補物質は特に制限されない。具䜓的には、たずえば 现胞抜出液、 遺䌝子ラむブラリヌの発珟産物、 合成䜎分子化合物、 合成ペプチド、 倩然化合物等が挙げられる。 あるいは、 前蚘 a ) 〜 d ) のいずれかに蚘茉の蛋 癜質を認識する抗䜓も、スクリヌニングに甚いる候補物質ずしお有甚である。䞀方、 本発明の評䟡方法における察照には、本発明の蛋癜質の機胜、たたは発珟レベルに 圱響を䞎える もしくは䞎えない こずが刀明しおいる化合物を甚いるこずができ る。
曎に、本発明における蛋癜質の掻性を調節する掻性の怜出方法には、機胜的に同 等な蛋癜質を利甚するこずができる。 たずえば、 HJ06972に察しお AF06972は、 アミ ノ酞配列レベルで玄 90%の盞同性を備えおいる。 このこずは、これらの蛋癜質ず 90% 以䞊の盞同性を有するアミノ酞配列からなる蛋癜質が、いずれも同様の掻性を有し おいるこずを裏付けおいる。 したがっお、配列番号 2たたは配列番号 4に蚘茉 のアミノ酞配列に察しお、 90%以䞊の盞同性を有するアミノ酞配列からなる蛋癜質 は、本発明による掻性の怜出方法においお、奜たしい蛋癜質ずしお甚いるこずがで きる。たた同様に、ハむブリダむズゃァミノ酞の眮換によ぀お埗るこずができる機 胜的に同等な蛋癜質も、 䞊蚘掻性の怜出方法に甚いるこずができる。 本発明の評䟡方法は、 目的ずする掻性を有する化合物のスクリヌニング方法や、 化合物のキャラクタリれヌション等に利甚するこずができる。たずえば、幅広い物 質に察しお本発明に基づく評䟡方法を実斜し、目的ずする掻性に優れる化合物の遞 択を繰り返すこずにより、スクリヌニングを実斜するこずができる。 あるいは、前 蚘怜出方法を利甚しお、 特定の化合物の特性を解析するこずもできる。
この評䟡により単離される化合物は、本発明の蛋癜質の掻性、あるいはその発珟 を促進たたは阻害する化合物ァゎニスト、アンタゎニストの候補ずなる。たた、 生䜓内においお、本発明の蛋癜質ずこれず盞互䜜甚する分子ずの該盞互䜜甚を阻害 する化合物の候補ずなる。 これら化合物は、本発明の蛋癜質が関連する疟患の予防 や治療のための医薬品ずしお応甚が考えられる。
曎に本発明は、本発明の評䟡方法によっお埗るこずができる物質の医薬甚途に関 する。すなわち本発明は、前蚘評䟡方法によっお遞択される化合物の、现胞死の制 埡における䜿甚に関する。 あるいは本発明は、 これらの化合物を䞻成分ずしお含有 するこずを特城ずする、现胞死に特城付けられる疟患の治療剀に関する。曎に本発 明は、前蚘評䟡方法によっお遞択されるィ匕合物を投䞎する工皋を含む、现胞死の制 埡方法に関する。加えお本発明は、前蚘評䟡方法によっお遞択される化合物の、现 胞死に特城付けられる疟患の治療剀の補造における䜿甚に関する。
本発明においお现胞死に特城付けられる疟患ずは、異垞な现胞死によっおもたら される疟患を意味する。たずえば现胞死によ぀おもたらされる疟患ずしおは、脳虚 血によっおもたらされる脳組織障害などを瀺すこずができる。本発明のアポトヌシ ス関連因子の機胜や産生そのものを阻害する化合物は、次のような现胞死の制埡に 利甚するこずができる。
( 1 ) 虚血による现胞死
( 2 ) 慢性りィルス性疟患における现胞死、 あるいは
他の病原埮生物による慢性疟患における现胞死
( 3 ) 自己免疫反応による炎症ずそれに䌎う现胞死 (4) 原因䞍明だが现胞死ずそれに䌎う倉性による疟患 アルツハむマヌ等 これらの现胞死は、䟋えば次のような疟患によっおもたらされる。埓っお、本発 明の評䟡方法によ぀お遞択される化合物は、次のような疟患の治療に甚いるこずが できる。
脳血管障害性痎呆、 倚発性埮小脳梗塞、脳血栓症、脳梗塞、脳出血、 心筋梗塞、 心 筋炎、 りィルス性肝炎、 アルコヌル性肝炎、肝硬倉、 むンスリン䟝存性糖尿病 臓ランゲルハンス島现胞の免疫反応性现胞死による
この他、本発明によ぀お遞択される化合物を癜血病などの癌の治療に甚いるこず もできる。癌は、悪性腫瘍现胞における现胞死の制埡が䞍完党な病態である。 した がっお、本発明によっお遞択される化合物の投䞎によっお、悪性腫瘍现胞の现胞死 を誘導するこずができれば、 治療効果を期埅できる。
あるいは本発明は、前蚘評䟡方法によっお埗るこずができる化合物を䞻成分ずし お含有する、现胞分化、 たたは増殖の制埡における䜿甚に関する。 あるいは本発明 は、 これらの化合物を䞻成分ずしお含有するこずを特城ずする、现胞分化、たたは 増殖に特城付けられる疟患の治,に関する。曎に本発明は、前蚘評䟡方法によ぀ お遞択される化合物を投䞎する工皋を含む、现胞の分化たたは増殖の制埡方法に関 する。加えお本発明は、前蚘評䟡方法によっお遞択される化合物の、现胞の分化た たは増殖に特城付けられる疟患の治療剀の補造における䜿甚に関する。
本発明においお现胞の分化たたは増殖に特城付けられる疟患ずは、现胞分化や増 殖が䞍充分なこずによっおもたらされる疟患を意味する。现胞の分化、あるいは増 殖が䞍充分なこずによっおもたらされる疟患ずしおは、たずえばアルツハむマヌに 代衚される神経倉性疟患等を瀺すこずができる。 この他、皮々の原因によっお生じ た組織の障害が完党に修埩されない状態も、现胞の分化、あるいは増殖が䞍充分な こずによる病態ず蚀うこずができる。 より具䜓的には、脳梗塞や脳虚血の結果もた らされる神経 m の障害の修埩が䞍完党な状態は、神経倉性疟患に含たれる。本発 明に基づいお、分化、たたは増殖を誘導すべき现胞ずしおは、神経现胞が望たしい。 本発明によ぀お遞択される化合物は、现胞死ず、现胞の分化もしくは増殖ずいう、 異なる䜜甚を有する。既に述べたように、本発明の評䟡方法においお暙的ずする分 子である HJ06972あるいは AF06972は、いずれも现胞死ず现胞の分化もしくは増殖ず いう 2面的な機胜を有しおいる。 したがっおその掻性や発珟を調節する化合物も、 2面的な䜜甚を有する可胜性はある。 しかしながら、特定の病態においお、適切な 化合物を投䞎すれば、 これらのィ匕合物を、様々な疟患の治療に利甚するこずが可胜 であるこずは蚀うたでも無い。
曎に本発明は、 䞋蚘の a ) 〜 g ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 た たはそのポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質を䞻成分ずしお含有する、 现胞増殖、现胞分化、たたは现胞死によ぀お特城付けられる疟患の治療剀に関する。
( a ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチド
( b ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列をコヌドするポ リヌクレオチド、
( c ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および/たたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポ リヌクレオチド、
( d ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズし、配列番号 2、 た たは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋 癜質をコヌドするポリヌクレオチド、
( e ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列ず 90%以䞊のホモ口 ゞヌを有する塩基配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉 のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、 ( f ) ( a ) 〜 e ) に蚘茉のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチ ド、、
( g ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列においお、 1若 しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、 および/たたは付加したァミノ 酞配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列 からなる蛋癜質に察しおドミナントネガティブの圢質を持぀蛋癜質をコヌ ドするポリヌクレオチド。
本発明の治療剀は、 アポトヌシス、神経现胞の増殖、 および神経现胞の分化から 遞択されるいずれかの珟象によっお特城付けられる疟患の治療に甚いられる。曎に 本発明は、 前蚘 ( a ) 〜 g ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたはその ポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質を投䞎する工皋を含む、アポトヌシ ス、神経现胞の増殖、および神経现胞の分化から遞択されるいずれかの珟象によ぀ お特城付けられる疟患の治療方法に関する。 加えお本発明は、 前蚘 a ) 〜 g ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、たたはそのポリヌクレオチドによっおコヌ ドされる蛋癜質をの、 アポトヌシス、神経现胞の増殖、および神経现胞の分化から 遞択されるいずれかの珟象によっお特城付けられる疟患の治療剀の補造における 䜿甚に関する。
本発明の蛋癜質、ヌクレオチド、抗䜓および䞊蚘評䟡方法により単離される物質 は、アポトヌシス、现胞分化、たたは现胞増殖を調節するために有甚である。たた、 本発明においおこれらを医薬品ずしお甚いる堎合には、それ自䜓を医薬品ずしお甚 いるこずも可胜であるが、公知の補剀孊的方法により補剀化しお甚いるこずも可胜 である。 䟋えば、薬理孊䞊蚱容される担䜓もしくは媒䜓、具䜓的には、滅菌氎や生 理食塩氎、怍物油、乳化剀、懞濁剀などず適宜組み合わせお補剀化しお甚いるこず が考えられる。
患者ぞの投䞎は、䟋えば、動脈内泚射、 静脈内泚射、 皮䞋泚射等、 圓業者に公知 の方法により行い埗る。投䞎量は、患者の䜓重や幎霢、投䞎方法等により倉動する が、 圓業者であれば適圓な投䞎量を適宜遞択するこずができる。 たた、該化合物が DNAによりコヌドされ埗るものであれば、 該 DNAを遺䌝子治療甚ベクタヌに組蟌み、 遺䌝子治療を行うこずも考えられる。
投䞎量や投䞎方法は、患者の䜓重や幎霢、症状等により倉動する。 圓業者であれ ば、 必芁に応じお投䞎量や投䞎方法を適宜遞択するこずができる。
さらに本発明は、以䞋の a )〜 d )のいずれかに蚘茉の蛋癜質の発珟を調節した トランスゞ゚ニック非ヒト動物からなる、アポトヌシス、神経现胞の分化、および 神経现胞の増殖が調節されたモデル動物に関する。
( a )配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列からなる蛋癜質
( b )配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなる DNAずストリンゞ ェントな条件䞋でハむブリダむズする DNAによっおコヌドされるa )に蚘茉の 蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
( c )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若しくは耇 数のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、および Zたたは付加したアミノ酞配列を有 し、 a )に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
( d )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列ず 9 0 %以䞊のホモ口 ゞヌを有するァミノ酞配列からなり、 a )に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋 たずえば本発明の蛋癜質を過剰発珟させたトランスゞェニック動物は、神経倉性 疟患を誘導するモデル動物ずしお、神経倉性疟患の治療薬の評䟡に甚いるこずがで きる。 図面の簡単な説明
図 1は、マりスチロシンキナヌれ MTYKず HJ06972によりコヌドされる蛋癜質の構 造を比范した図である。 MTYKは、 Apoptosis Associated Tyrosine Kinaseの略語 である。 図 2は、 HJ06972遺䌝子、 およぎ該遺䌝子にコヌドされる蛋癜質 配列番号 2 ) ず、 その alternative splicing formである AF06972遺䌝子、 およぎ該遺䌝子にコヌ ドされる蛋癜質 配列番号 4 ) の構造を比范した図である。
図 3は、 HJ06972遺䌝子、 および該遺䌝子にコヌドされる蛋癜質ず、 その alternative splicing formである AF06972遺䌝子、 およぎ該遺䌝子にコヌドされる 蛋癜質の配列を比范した図である。
図 4は、 HJ06972遺䌝子、 および該遺䌝子にコヌドされる蛋癜質ず、 その alternative splicing formである AF06972遺䌝子、 およぎ該遺䌝子にコヌドされる 蛋癜質の配列を比范した図である 図 3の続き 。
図 5は、 HJ06972遺䌝子ず AF06972遺䌝子の各皮现胞における発珟レベルを比范し た結果を瀺す図である。
図 6は、 PC12现胞ぞの HJ06972遺䌝子導入による神経突起䌞展䜜甚を瀺す写真で ある。
図 7は、 PC12现胞ぞの各皮遺䌝子の神経突起䌞展䜜甚を比范するダラフである。 図䞭、 瞊軞は、 神経现胞の䌞展率 ( of neurite outgrowth)を、 暪軞は導入した遺 䌝子を瀺す。
図 8は、 HJ06972遺䌝子の CREBの転写掻性に察する䜜甚を瀺すグラフである。 図 䞭、 瞊軞は察照を 1ずする盞察的な CREB転写掻性率 を、暪軞は導入した遺䌝子 を瀺す。
図 9は、 Jurkat现胞における各皮遺䌝子導入によるアポト䞀シス誘導䜜甚を解析 した結果を瀺すダラフである。 瞊軞はアポトヌシスを起こした现胞の割合 (%)を、 暪軞は Jurkat现胞に導入した遺䌝子を瀺す。 グラフの右偎が Thapsigargin ( 1〃 M) を添加したずき、 そしお巊偎が無添加の堎合の結果である。
図 1 0は、マりス Ba/F3现胞の IL - 3の枯枎によっお誘導されるアポトヌシスに䌎 う、 マりスチロシンキナヌれ MTYKず mAF06972の発珟レベルの倉化を瀺す写真であ る。 Mは分子量マヌカヌを、たた 0— 4 8は IL-3を陀去埌の経過時間を瀺しおいる。 図 1 1は、 SH-SY5Y现胞における各皮遺䌝子導入によるアポトヌシス誘導䜜甚を CaSpaSe3/7掻性たたは LDHリリヌス掻性の枬定により解析した結果を瀺すグラフで ある。 瞊軞は Caspase3/7の掻性 䞊 、 たたはコントロヌルに察する盞察的な LDH のリ リヌス掻性 䞋 を瀺す。 暪軞は SH- SY5Y现胞に導入した遺䌝子を瀺す。 ダラ フの右偎が、 ドキシサむクリン Dox) を添加したずき、そしお巊偎が無添加の堎 合の結果である。
図 1 2は、 SH - SY5Y现胞における各皮遺䌝子導入によるアポトヌシス誘導䜜甚を ATPの定量たたはテトラゟリゥム化合物還元反応 (MTS) の枬定により解析した結果 を瀺すグラフである。 瞊軞は MTS還元胜 䞊 、 たたは ATP量 䞋 を瀺す。 暪軞は SH - SY5Y现胞に導入した遺䌝子を瀺す。
図 1 3は、 SH-SY5Y现胞における各皮遺䌝子導入によるアポトヌシス誘導䜜甚を ヒストン · DNA断片耇合䜓 モノ、 オリゎヌクレオ゜ヌム の定量により解析した 結果を瀺すグラフである。 瞊軞はモノ、 オリゎヌクレオ゜ヌム量を瀺す。 暪軞は SH - SY5Y现胞に導入した遺䌝子を瀺す。
図 1 4は、 SH - SY5Y现胞における各皮遺䌝子導入によるアポトヌシス誘導䜜甚を Caspase-2, 8, 9掻性の枬定により解析した結果を瀺すグラフである。 瞊軞はコン トロヌルに察する盞察的な Caspase- 2, 8 9の掻性を瀺す。 暪軞は SH- SY5Y现胞に導 入した遺䌝子を瀺す。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋本発明を実斜䟋ずしお曎に具䜓的に説明するが、本発明は該実斜䟋に限定さ れない。たた本明现曞においお匕甚された党おの先行技術文献は、参照ずしお本明 现曞に組み入れられる。
1 . AF06972遺䌝子のクロヌニング
かずさ DNA研究所より入手した HJ06972 (KIAA1079)遺䌝子を制限酵玠 Xholおよび Notlで切り出し、 pcDNA3. 1 (Invitrogen) の Xhol/Notlサむトに挿入した。 ヒト月 Ÿ由来 c DNA (Quick clone cDNA, Clontech) 力 Ÿら、 atgacttcgagacacaggac (配列番号 7 ) ず tcaggtgtgtgagggaaaagct (配列番号 8 ) のプラむマヌを甚い お PCR法により、玄 820bPの AF06972遺䌝子断片を取埗した。埗られた AF06972遺䌝子 断片は TA vectorである pT7-blue2にサブクロヌニングを行った埌、 DNAシヌクェン サヌモデル 310 (PE Biosystems) により DNA配列を確認した。 䞊蚘 HJ06972遺䌝子が 導入されおいる pcDNA3. 1ベクタヌから、制限酵玠 Xbalおよび Pvulを甚いお切り出し た HJ06972遺䌝子断片ず、制限酵玠 Pvulおよび Xholで切り出した AF06972遺䌝子断片 の䞡方を pBluescript IIベクタヌの Xbal - Xholサむトにサブクロヌニングし、 箄 4. 8kbの党長 AF06972遺䌝子を取埗した。
2 . MTYKおよび AF06972遺䌝子の組織発珟分垃
Multiple Tissue cDNA Panels (Clontech)ず定量型 RT- PCRを甚いお、 ヒトの組織 における AF06972遺䌝子の発珟分垃解析を行った、 即ち、 SYBR Green RT- PCR reagents (PE biosystems)の詊薬ず PRISM 7700 (PE Biosystems)の装眮を甚いお、 メ䞀力䞀の䜿甚説明曞に埓぀お以䞋の条件にお実隓を行぀た。
æ°Ž 18 ÎŒ 1、 Multiple Tissue cDNA Panels 5 ÎŒ 1、 プラむマヌ5 ;z M) 各 1 1 hAF06972 forward atgatgtcacagtctacctgt (配歹幡号 9 )
reverse cttggagctgagcaggttac (酉己列番"^ 1 0 )
hAATYK forward atcacgcacgtgtctgactc (酉己歹 U番^" : 1 1 )
reverse agaggcacctgaatctgctg (酉 3列番号 侄 2 )
SYBR Green mix 25 /i lの PCR反応液を調補した。 PCRの条件は、 94°Cで 30秒、 60°C で 30秒、 72°Cで 30秒ずしお行った。 その結果、脳で最も匷い発珟が芳察され、続い お腎臓、 脟臓、 リンパ節、 胎児肝でも発珟が芳察された。 MTYK遺䌝子ず同様な AF06972遺䌝子の脳特異的発珟は、血液现胞におけるアポトヌシスに関䞎する MTYK 遺䌝子ず同様な䜜甚を AF06972遺䌝子が脳においお行うのではないかずいう仮説を 肯定する。
3 · HJ06972遺䌝子ず AF06972遺䌝子の発珟解析 HJ06972遺䌝子ず、 その alternative splicing formである AF06972遺䌝子の発珟 の違いが怜出できるプラむマヌを甚いお、 ヒ ト脳、 ヒ ト培逊神経现胞 SH - SY5Y现 胞、 NT2neuron现胞における発珟量の差を評䟡した。このプラむマヌでは、 HJ06972 遺䌝子に぀いおは玄 395bp、 AF06972遺䌝子に぀いおは 315bpの PCR産物が埗られる。 HJ06972遺䌝子は非垞にわずかし力発珟が認められず、倧郚分は AF06972遺䌝子であ ぀た。 同様に、 MTYK遺䌝子においおも HJ06972遺䌝子に盞圓する郚分における alternative splicing formが存圚するか発珟解析を行った。 MTYKに぀いおは、 ほ ずんど alternative splicing formは怜出されず、 倧郚分が ATTYK遺䌝子であった。 (図 5 )
曎に、 HJ06972ず AF06972に盞圓するマりスずラットにおける alternative splicing formの探玢を詊みた。 すなわち、 AF06972の揷入塩基配列を挟んでプラむ マヌを蚭定し、挿入塩基配列の有無に関わらず、増幅が行えるようにした。 もしも HJ06972ず AF06972ずに盞圓する alternative splicingormが存圚すれば、 倧きさ の異なる 2぀の増幅産物が確認できるはずである。 PCRに甚いたプラむマヌの塩基 配列を以䞋に瀺す。
フット forward :aagccttctgggttccaag (酉己列番  1 3 )
reverse agttctccatcactcctgag (酉己列番号 1
マりス forward: aagccttctgggttccaag (目 G列番号 1 3
reverse cgctttccatcactcctgag (gG列番号 1 5
その結果、 マりスずラットにおいおは、 AF06972に盞圓するバンドのみが芳察さ れた。 ラットずマりスにおいおは、 HJ06972に盞圓する alternative splicing form は確認できなかった。 したがっお、 本発明においお芋出された新芏な alternative splicing formである AF06972は、 ヒトのみならず、 マりスずラットにおいおも䞻芁 な発珟産物であるず考えられた。
4 . PC12现胞における遺䌝子導入による神経突起䌞展䜜甚
PC12に EGFP (enhanced GFP, Clontech) ず目的の遺䌝子を゚レクトポレヌシペン 法を甚いお以䞋の条件にお導入した。
5 X 106现胞/ ml培地 RPIM 1640+ 10% HS+ 5% FBS) 250 1
EGFPプラスミド 4 g
目的遺䌝子 8 z g
250V、 950
Collagen type IVコヌティングを斜したゥ゚ルで 18〜24時間培逊した埌、 培地を 亀換した。 さらに 48時間培逊した埌、 G-418を添加した。 4日間培逊埌、顕埮鏡䞋で 芳察を行った。
実隓は 3回繰り返し、 結果は EGFPを遺䌝子導入のコントロヌルずし、 4〜7芖野、 31〜 150の EGFP positive现胞に぀いお、神経突起の䌞展が芋られるものの割合を算 出した。 結果は次の匏によっお算出した神経现胞の䌞展率 ( of neurite outgrowth)で衚した。 たた、 䜎濃床 lng/ml) の NGFの神経突起䌞展䜜甚に察する 各遺䌝子の圱響に぀いおも同様に評䟡した。
神経现胞の䌞展率 = (䌞展が芋られた现胞数 Z総现胞数 X 1 0 0
HuC、 PKA、 hAATKY (HJ03494) 、 HJ06972のいずれもがコントロヌルに比べお、 遺 䌝子を過剰発珟させた堎合においお、神経突起の䌞展䜜甚を瀺すこずが確認された。 HJ06972では、神経突起の䌞展䜜甚が埓来報告されおいる HuCよりもさらに匷い䜜甚 が芳察された 図 6 ) 。 䜎濃床の NGFによる神経突起䌞展䜜甚に察しおも他に比べ お最も匷い促進䜜甚が確認された 図 7 ) 。
5 . HJ06972の CREB転写掻性の枬定
䞊蚘の PC12を甚いた神経突起䌞展䜜甚の怜蚎により、 HJ06972が過剰発珟により 神経突起䌞展䜜甚を有するこずが明らかになった。 PC12现胞における神経突起の䌞 展には倚くの堎合、 CREB転写掻性が関䞎しおいるので HJ06972の CREB転写掻性に぀ いお怜蚎した。
たず、 PC12を各ゥ゚ルに 1 X 106现胞播き、 ヌ晚 37°Cでむンキュベヌションした。 PC12现胞ぞ CRE-ルシフェラヌれ レポヌタヌ遺䌝子 pCRE- Luc (Stratagene) 、 およ ぎ目的遺䌝子 (HJ06972) 発珟ベクタヌをリポプクトァミン法で導入した。 CRE - ルシフェラ䞀れレポヌタヌ遺䌝子を 2. 0 g、 および目的遺䌝子 (HJ06972)発珟べ クタ䞀 1. 0 gを现胞䞊枅RPMI1640+20%ゥマ血枅 + 10%ゥシ血枅 に力 Bえ、ヌ晚 むンキュベヌションしお现胞内にベクタ䞀を導入した。 埗られた圢質転換现胞を、 1日培逊した埌に lng/mlの NGFを添加し、 6時間埌に CREBの転写掻性をルシフェラ —れによるレポヌタヌ遺䌝子分析により怜蚎した。
その結果、 HJ06972遺䌝子の導入により、 CREBの転写がわずかに掻性化される傟 向が芳察された。 同様に MTYKでも非垞にわずかに CREB転写掻性が䞊昇するこずが 明らかになった 図 8 ) 。 このこずにより、 HJ06972の神経突起䌞展䜜甚には、 こ の CREB転写掻性促進が関䞎しおいる可胜性が考えられた。
6 . Jurkat现胞における遺䌝子導入によるアポトヌシス誘導䜜甚
HJ06972のアポトヌシス誘導掻性を調べるために、 Jurkat现胞に HJ06972遺䌝子た たは既知のアポトヌシス関連遺䌝子を導入し、アポトヌシスを起こした现胞の数を 調べた。
たず、 コンフルェントになるたで培逊した 2mlの Jurkat现胞を、 18mlの新しい培 地に加えるこずにより、现胞を培逊した。 培地には 10% ゥシ胎仔血枅 (FBS) 含有 RPMI 1640を甚いた。
次に、゚レクトロボレヌション法を甚いお、 Jurkat现胞に目的遺䌝子を導入した。 具䜓的には、 现胞を遠心しお回収した埌、 培地に再懞濁し、 5X 106现胞/ mlの现胞 懞濁液を調補した。 目的遺䌝子の組み蟌たれたプラスミドを、 プラスミド DNAの最 終濃床が 10 g/250^ 1になるように现胞懞濁液に加え、氷䞊で 10分間静眮した。 こ の溶液 250ÎŒ 1を゚レクトロポレヌシペン甚キュべットに移し、 Genepulserll
(Bio-Rad) で 250V、 950 Fのパルスを䞎えるこずにより、 遺䌝子を導入した。 æ°· 䞊で 10分間静眮した埌、 4mlの M thapsigargin添加、たたは䞍添加培地を甚いお、 24時間培逊した。
现胞をチュヌブに回収し、 遠心により䞊枅を陀いた。 各チュヌブに 2 w M Rhodamine 123を加え、 37。 (、 5% C02䞋にお 20分間むンキュベヌトした。 遠心によ り䞊枅を陀いた埌、 PI液を加えおアポトヌシスを起こした现胞を FACSで解析した。
Bad, Caspase3、 HJ06972の遺䌝子を過剰発珟させた堎合には、アポトヌシス誘導 掻性が芋られた。 これずは逆に、 Bcl2の遺䌝子を過剰発珟させた ^^には、 アポト 䞀シス抑制掻性が芋られた 図 9 )。 さらに、 1 /x Mの thapsigarginを添加した堎合 には、 thapsigarginを添加しなかった堎合ず同様の傟向が芋られた。 ただし、特に HJ06972遺䌝子を過剰発珟させた堎合に぀いおは、 thapsigarginのアポトヌシス誘 導掻性を促進する傟向が芋られた 図 9 )。
thapsigarginを添加するず现胞質内の Ca2+濃床が䞊昇し、 CREBがリン酞化を受け お掻性ィヒするず考えられるこずから、 HJ06972のアポトヌシス誘導䜜甚にも、 CREB 転写掻性促進が関䞎しおいる可胜性が瀺唆された。
7 . アポトヌシスの誘導に䌎う MTYKず mAF06972の発珟レベルの倉化
1 X106個のマゥス B现胞系培逊现胞である Ba/F3现胞RCB0805, RIKEN Cell Bank) を 10% FCSず 5 ng/mlのマりスむンタヌロむキン䞀 3 (IL - 3)を含む RPMI培地で 3 7 °C、 5 % C02の条件で培逊する。现胞を PBSで 3回掗浄した埌、 IL- 3を陀いた 10% FCSを含む RPMI培地に亀換しお 5 % C02の条件で培逊しアポトヌシスの誘導を行぀ た。 IL- 3を陀去埌、 0、 4、 8、 1 2、 2 4、および 4 8時間埌の现胞を回収しお、 RT - PCRによ぀お MTYKず AF06972遺䌝子の発珟解析を行぀た。 P C Rに甚いた primer の塩基配列はそれぞれ以䞋のずおりである。
AATYK  forward aatcactccctacgttcctgg (酉己列番号 1 6 )
reverse tctcaagcctctgtgtatc (目 d列 Ÿ·号 1 7ノ
mAF06972 forward agtacctgttgtagaagttc (酉己列番号 1 8 )
reverse ctggaactgggatggagctg (酉己列番号 1 9 )
HPRT  forward : gcatacctaatcattatgctg (配列番号 2 0 )
reverse gtctggaatttcaaatccaac (酉己列 Ÿ号 2 1 )
PCRの条件は、 MTYKず AF06972遺䌝子に぀いおは、 9 4 °C 3 0秒、 6 0 °C 3 0秒、 7 2 °C 3 0秒で 3 0サむクルの反応を行った。 HPRTに぀いおは、同条件で 2 5サむ クルの反応を行った。 反応液は 2 %ァガロヌスゲルを甚いた電気泳動を行った埌、 ェチゞゥムプロマむド (EtBr)で染色した。 結果を図 1 0に瀺した。
その結果、 MTYKず AF06972遺䌝子は IL- 3陀去による Ba/F3现胞のアポトヌシス の誘導にずもない、 経時的に発珟量の増加が芳察された。
8 . AF06972遺䌝子のクロヌ-ング
ヒト脳由来 cDNA(Quick clone cDNA, Clontech)から、次の塩基配列を有するプラ むマ䞀を甚いお PCR法により AF06972遺䌝子断片を取埗した。
ctactggactctttaggatc (配歹! |番号 2 2 )
agagcggccgctcaggtgtgtgagggaaaagct 歹 [j番号 : 2 3 )
埗られた AF06972遺䌝子断片は制 酵玠 Spelおよぎ Notlで消化し、かずさ DNA研究 所より入手した HJ06972 (KIM1079) in pBS (pBluescript II SK(+) ) (遺䌝子は Sal I - Notl siteに挿入 を制限酵玠 Spelおよび Notlで切り出した残りのものぞ挿入し た。挿入郚分は DNAシヌクェンサ䞀モデル 310 (PE Biosystems)により DNA配列を確認 した。 AF06972 in pBSずする。
9 . Flag- HJ06972あるいは Flag- AF06972の䜜補
次の塩基配列を有するプラむマヌを甚いお PCR法により Xhol- FLAG- HJ06972 - Sail 断片を取埗した。
agactcgaggccaccatggattacaaggatgacgacgataagatgccggggccgccggcgtt (6972 Xhol Fl :XhoI- FLAG- atg) (配列番号 2 4 )
gctgtttgtgttcggcttcaga (6972 Sail R) (配列番号 2 5 )
埗られた断片を Xholおよび Sailで制限酵玠消化し、 HJ06972 in pBSおよび AF069 72 in pBSを制限酵玠 Xholおよび Sailで切り出した残りのものぞ挿入した。
1 0 . 組換えアデノりィルス DNAの䜜補
Flag- HJ06972 in pBSあるいは Flag - AF06972 in pBSを制限酵玠 Xholで凊理した 埌に、 T4 DNA polymeraseで bluntィ匕し、 さらに Notlで凊理した。 pTRE - 3 1:1:16は balで凊理した埌に、 T4 DNA polymeraseで bluntィ匕し、 さらに Notlで凊理した。 W unt-Notl siteに各遺䌝子の䞊蚘 blunt- Notl断片を揷入した。 pTRE- 31111 16から 八 deno-X DNAの組換えは Adeno- X™ Tet-0ffM Expression System (Clontech) の添 付マニュアルに埓った。
1 1 . Caspase-3/7, LDH
ヒトュナヌロプラストヌマ311-3Â¥5¥现胞を961611 plateに 1 wellあたり 2. 5 x 104 個播き、 37°C 5% C02条件䞋でヌ晚培逊した。 现胞がプレヌト䞊によくはり぀いお いるこずを確認埌、 培逊プレヌトから培地を陀去しお、 培地で 3. 2倍系列垌釈した 組換えアデノりむルス液 30 Όΐを添加し、 37°C 5% C02条件䞋で玄 2時間培逊し、 感 染させた。 組換えりィルスはテトラサむタリンによっお遺䌝子発珟を調節する Adeno-X™ Tet-Off™ Expression System (クロンテック瀟 を利甚し、 調節りィル ス Tet- Off) ず応答性の各遺䌝子組換えりィルスを甚いた。 その埌、 添加したゥ ィルス液を陀去し、 テトラサむクリンを含たない血枅を 1%含む新しい培地 100 Όΐ を添加し、 37°C 5% C02条件䞋で培逊した。 このずき察照ずしお、 遺䌝子発珟を抑 制するドキシサむクリン テトラサむクリン誘導䜓 1 ΌΜを含む培地を加えたゥェ ルを甚意した。 48時間埌、现胞内の Caspase- 3/7の掻性ず现胞死に䌎っお遊離され る LDHの掻性を枬定するこずにより、 遺䌝子の過剰発珟による现胞死誘導に぀いお 平恀しに。 Caspase- 3 7掻性は、 Apo-0ne™ homogeneous Caspase-3/7 assay 、,口 メガによっお評䟡した。たた LDH掻' 14は、培逊䞊枅をサンプルずしお Cytotoxicity Detection Kit (LDH) (ロッシュ を甚いお評䟡した。 いずれの評䟡方法も、 添付 文曞に埓った。
その結果、 AF06972および HJ06972遺䌝子を導入した埌、テトラサむクリンを陀い お導入遺䌝子の発珟を誘導した SH- SY5Y现胞では、 lacZ遺䌝子を導入した现胞に察 しおりむルスの垌釈系列による遺䌝子の発珟量に比䟋した匷い LDHのリリヌス掻性. アポトヌシス実行プロテアヌれである Caspase3/7の匷い掻性化が認められた図 1 1 )。䞀方、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑制した SH- SY5Y现胞では、 LDHのリリ䞀ス掻性、 CasPase3/7掻性ずもに lacZ遺䌝子を導入した堎合ず同皋床で あり、アポトヌシス誘導は認められなかった図 1 1 )。以䞊のこずから、 AF06972 および HJ06972遺䌝子を過剰発珟させるこずにより、 SH - SY5Y现胞の Caspase - 3およ ぎ 7の掻性化を䌎う现胞死を誘導するこずが明らかずなった。
1 2 . ATP, MTS
ヒトュナヌロブラストヌマ311-3Â¥5¥现胞を961611 plateに 1 wellあたり 2. 5 x 104 個播き、 37°C, 5% C02条件䞋でヌ晚培逊した。 现胞がプレヌト䞊によくはり぀いお いるこずを確認埌、培逊プレヌトから培地を陀去しお、培地で垌釈した組換えアデ ノりィルス液 30 Όΐを添加し、 37°C 5% C02条件䞋で玄 2時間培逊し、 感染させた。 組換えりィルスはテトラサむクリンによっお遺䌝子発珟を調節する Adeno- X™ Tet- Off™ Expression System (クロンテック瀟を利甚し、調節りィルスTet- Off) ず応答性の各遺䌝子組換えりィルスを甚いた。その埌、添加したりィルス液を陀去 し、テトラサむタリンを含たない血枅を 1%含む新しい培地 ΙΟΟ ΌΙを添加し、 37°C 5% C02条件䞋で培逊した。 このずき察照ずしお、 遺䌝子発珟を抑制するドキシサむク リン テトラサむクリン誘導䜓 1 ΌΜを含む培地を加えたゥ゚ルを甚意した。 48 時間埌、 代謝掻性のある现胞に由来する Α΀Ρの定量あるいはテトラゟリゥム化合物 還元反応 (MTS) を枬定するこずにより、 遺䌝子の過剰発珟による现胞死誘導に぀ いお評䟡した。 Α΀Ρは、 CellTiter-Glo™ Luminescent Cell Viability Assay (プロ メガにより定量した。 MTSは、 CellTiter 96β AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (プロメガ を甚いお定量した。 いずれの定量方法も、 添付 文曞に埓った。
その結果、 AF06972遺䌝子を導入した埌、 テトラサむクリンを陀いお導入遺䌝子 の発珟を誘導した SH-SY5Y现胞では、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑 制した现胞に比范しお ATP量、 MTS還元胜ずもに枛少しおおり、代謝掻性の枛少が認 められた 図 1 2 ) 。 なお、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑制した现 胞の代謝掻性はりむルスによる遺䌝子の導入を行っおいない现胞 controlず同皋床 であった 図 1 2 ) 。 以䞊のこずから、 AF06972遺䌝子を過剰発珟させるこずによ り、 SH-SY5Y现胞の代謝掻性が枛少しおおり、 现胞死を誘導するこずが明らかずな ぀た。
1 3 . DNA fragmentation
ヒトニナヌロブラストヌマ SH-SY5Y现胞を 96- well plateに 1 wellあたり 2. 5 x 104 個播き、 37°C 5% C02条件䞋で䞀晩培逊した。 现胞がプレヌト䞊によくはり぀いお いるこずを確認埌、培逊プレヌトから培地を陀去しお、培地で垌釈した組換えアデ ノりィルス液 30 Όΐを添加し、 37°C, 5% C02条件䞋で玄 2時間培逊し、 感染させた。 組換えりむルスはテトラサむクリンによ぀お遺䌝子発珟を調節する Adeno-X™ Tet-Off™ Expression System (ク口ンテック瀟を利甚し、調節ゥィルス Tet-Off) ず応答性の各遺䌝子組換えりィルスを甚いた。その埌、添加したりィルス液を陀去 し、テトラサむクリンを含たない血枅を 1%含む新しい培地 100 Όΐを添加し、 37°C, 5% C02条件䞋で培逊した。 このずき察照ずしお、 遺䌝子発珟を抑制するドキシサむク リン テトラサむクリン誘導䜓 1 ΌΜを含む培地を加えたゥ゚ノレを甚意した。 48 時間埌、 现胞がアポトヌシスに陥った埌に现胞質に出珟するヒス トン ' DNA断片耇 合䜓 モノ、 才リゎヌクレオ゜ヌム) を定量するこずにより、遺䌝子の過剰発珟に よる现胞死誘導に぀いお評䟡した。モノヌクレオ゜ヌム、およびオリゎヌクレオ゜ ヌムは、 Cell Death Detection ELISA PLUS (ロッシュ を甚いお定量した。 定量 方法は、 添付文曞に埓った。 なお、 サンプルは现胞溶解液 5 Lに Lysis buffer 1 5 Lを添カ卩しお調補した。
その結果、 AF06972および HJ06972遺䌝子を導入した埌、テトラサむクリンを陀い お導入遺䌝子の発珟を誘導した SH- SY5Y现胞では、 lacZ遺䌝子を導入した现胞に比 范しおモノ、 オリゎヌクレオ゜ヌムの顕著な増加が認められた 図 1 3 ) 。 䞀方、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑制した SH-SY5Y现胞では、 lacZ遺䌝子 を導入した堎合ず同皋床であり、アポトヌシス誘導は認められなかった図 1 3 )。 以䞊のこずから、 AF06972および HJ06972遺䌝子を過剰発珟させるこずにより、 SH - SY5Y现胞の DNA断片化を䌎う现胞死を誘導するこずが明らかずなった。
1 4 . Caspase-2, 8, 9
ヒトニナヌロブラストヌマ SH - SY5Y现胞を 96iell plateに 1 wellあたり 2. 5 x 104 個播き、 37°C, 5% C02条件䞋で䞀晩培逊した。 现胞がプレヌト䞊によくはり぀いお いるこずを確認埌、培逊プレヌトから培地を陀去しお、培地で垌釈した組換えアデ ノりィルス液 30 Όΐを添加し、 37。C, 5% C02条件䞋で玄 2時間培逊し、 感染させた。 組換えりィルスはテトラサむクリンによ぀お遺䌝子発珟を調節する Adeno - X™ Tet-0f f™ Expression System (クロンテック瀟を利甚し、調節りィルスTet- Off) ず応答性の各遺䌝子組換えりィルスを甚いた。その埌、添加したりィルス液を陀去 し、テトラサむタリンを含たない血枅を 1%含む新しい培地 100 Όΐを添加し、 37°C, 5% C02条件䞋で培逊した。 このずき察照ずしお、 遺䌝子発珟を抑制するドキシサむク リン テトラサむクリン誘導䜓 1 ΌΜを含む培地を加えたゥ゚ルを甚意した。 24 時間埌、现胞内の Caspase - 2 8 9の各掻性を評䟡した。方法は Caspase- 2 Assay Kit, Fluorometric (力,レビオケム 、 Caspase-8 Activity Assay Fluorometric (オンコ ゞヌン) 、 Caspase- 9 Activity Assay Fluorometric (オンコンヌン) を甚レボお、 添付文曞に埓っお行った。
その結果、 AF06972遺䌝子を導入した埌、 テトラサむクリンを陀いお導入遺䌝子 の発珟を誘導した SH- SY5Y现胞では、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑 制した现胞に比范しお Caspase- 2 8 9の掻性化が認められた 図 1 4 ) 。 なお、 ドキシサむクリンを添加しお遺䌝子発珟を抑制した现胞の各掻性はりィルスによ る遺䌝子の導入を行っおいない现胞 controlず同皋床であった 図 1 4 ) 。 以䞊の 結果より、 AF06972遺䌝子を過剰発珟させるこずによりアポトヌシス誘導プロテア ヌれである Caspase- 2 8 9が掻性ィ匕し、 アポトヌシスシグナルが掻性ィ匕されるこ ずが明らかずなった。 産業䞊の利甚の可胜性 本努明により、 新芏な遺䌝子 AF06972が提䟛された。 この遺䌝子は、 アポトヌシ スを誘導する掻性、䞊びに神経现胞の分化あるいは増殖を誘導する掻性を有する蛋 癜質をコヌドしおいる。曎に本発明は、その構造は既知であるが機胜は解明されお いな 、HJ06972遺䌝子が、 AF06972遺䌝子によっおコヌドされる蛋癜質ず同じ掻性を 有する蛋癜質をコヌドしおいるこずを明らかにした。
本発明によっお芋出された、これらの蛋癜質の神経现胞の分化誘導掻'性は匷力で ある。 したがっお、 この蛋癜質は、神経现胞の分化や増殖においお重芁な圹割を有 するず思われる。そのため、 この蛋癜質そのもの、 あるいはこの蛋癜質をコヌドす る遺䌝子は、神経现胞の分化や増殖、あるいは现胞死が関連する倚くの疟患の蚺断 指暙ずしお重芁である。 これら蛋癜質や遺䌝子の枬定方法ず、その枬定方法に基づ く蚺断方法を実珟した本発明の意矩は倧きい。
あるいはこの蛋癜質そのもの、あるいはこの蛋癜質の掻性や発珟を調節するこず ができる化合物は、神経现胞の现胞死や分ィヒもしくは増殖が関䞎する疟患においお、 有甚な治療剀ずなる。
これらの遺䌝子によっおコヌドされる蛋癜質は、现胞死、あるいは神経现胞の分 化や増殖によっお特城付けられる疟患の治療に有甚である。 より具䜓的には、 これ らのポリヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質は、 正垞な制埡を倱぀た现胞に现胞死をもたらすこずによ぀お治療効果を達成するこ ずができる。 あるいは、神経现胞の分化や増殖を通じお、治療効果を達成するこず ができる。
曎に本発明は、 これらのポリヌクレオチドのアンチセンス、あるいはこれらのポ リヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質に察するドミナントネガティブの圢 質を有する蛋癜質も、现胞死、あるいは神経现胞の分化や増殖によっお特城付けら れる疟患の治療に有甚である。 より具䜓的には、 これらのポリヌクレオチド、 ある いはポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質は、疟病の原因ずなっおいる異 垞な现胞死を抑制するこずによっお治療効果を達成するこずができる。 あるいは、 疟患の原因ずなっおいる神経现胞の異垞な分ィヒゃ増殖を抑制するこずにより、治療 効果を達成するこずができる。 .
あるいは本発明は、 AF06972遺䌝子、 HJ06972遺䌝子、 あるいはこれらの遺䌝子ず 機胜的に同等な遺䌝子を利甚した、アポトヌシスを誘導する掻性、䞊びに神経现胞 の分ィ匕あるいは増殖を誘導する掻性を調節する掻性を怜出する方法を提䟛する。加 えお本発明は、 この方法を応甚した、 アポトヌシスを誘導する掻性、䞊びに神経现 胞の分化あるいは増殖を誘導する掻性を調節する掻性を有する候補物質の評䟡方 法を提䟛する。
本発明の評䟡方法によっお埗るこずができる化合物も、现胞死、あるいは神経现 胞の分ィヒゃ増殖によっお特城付けられる疟患の治療に有甚である。たずえば本発明 によっお埗るこずができる、アポトヌシスを誘導する掻性、䞊びに神経现胞の分ィ匕 あるいは増殖を誘導する掻性を抑制down regulation)する化合物は、 疟病の原因 ずなっおいる異垞な现胞死を抑制するこずによっお治療効果を達成するこずがで きる。 あるいは、疟患の原因ずなっおいる神経现胞の異垞な分化や増殖を抑制する こずにより、 治療効果を達成するこずができる。
逆に、本発明によっお埗るこずができる、アポト䞀シスを誘導する掻性、䞊びに 神経现胞の分化あるいは増殖を誘導する掻性を促進 (up regulation)するィ匕合物は、 疟病の原因ずなっおいる異垞な现胞死を抑制するこずによっお治療効果を達成す るこずができる。 あるいは、疟患の原因ずなっおいる神経现胞の異垞な分化や増殖 を抑制するこずにより、 治療効果を達成するこずができる。

Claims

請求の範囲
1 . 䞋蚘 a ) 〜 e ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 3に蚘茉された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
( b )配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドするポリヌクレ ォチド、
( c ) 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のアミ ノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、 および Z たたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列か らなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチド、
( d ) 配列番号 5に蚘茉の塩基配列を含み、配列番号 3に蚘茉の塩基配列から なるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズし、配列 番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌ ドするポリヌクレオチド、 および
( e )配列番号 5に蚘茉の塩基配列から遞択された塩基配列を含み、 か぀配列番 号 3に蚘茉の塩基配列ず 7 0 %以䞊のホモロゞ䞀を有し、配列番号 4に蚘 茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、
2 . 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列から遞択されたアミノ酞配列をコ䞀ドす るポリヌクレオチド。
3 . 配列番号 5から遞択された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
4. 配列番号 6に蚘茉のァミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のァミ ノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、 および/ たたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列か らなる蛋癜質に察しおドミナントネガティブの圢質を持぀蛋癜質をコヌドす るポリヌクレオチド。
5 . 請求項 1〜 4のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋 癜質。
6 . 請求項 1〜 4のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチドを含むベクタヌ。
7 . 請求項 1〜 4のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、たたは請求項 6に蚘茉 のべクタヌを保持する圢質転換䜓。
8 . 請求項 7に蚘茉の圢質転換䜓を培逊し、発珟産物を回収する工皋を含む、請 求項 5に蚘茉の蛋癜質の補造方法。
9 . 配列番号 5に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレオチド、 たたはその盞ネ甫 鎖に盞補的な塩基配列からなる少なくずも 1 5塩基の長さを有するポリヌク レオチド。
1 0 . 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列によっお構成される抗原決定基を認識 する抗䜓。
1 1 . 配列番号 6に蚘茉のァミノ酞配列を含む蛋癜質を認識する抗䜓。
1 2 . 請求項 5に蚘茉の蛋癜質ず、該蛋癜質を認識する抗䜓の免疫孊的な反応を 芳察する工皋を含む、 請求項 5に蚘茉の蛋癜質の免疫孊的枬定法。
1 3 . 次の工皋を含む、候補物質のアポトヌシスを制埡する掻性を怜出する方法。
( 1 ) 次の a ) 〜 d ) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する现胞に候補物質 を接觊させる工皋、
( a )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質、
( b ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむブリダむズするポリヌクレオチ ドによっおコヌドされる a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
( c )配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、および/たたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
( d ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊のホ モロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に 同等な蛋癜質
(2)アポトヌシスが誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞のアポト 䞀シスを枬定する工皋、 および
(3) 工皋 (2) の枬定結果を指暙ずしお、 候補物質のアポトヌシスを抑制、 た たは促進する掻性を怜出する工皋
14. 次の工皋を含む、 アポトヌシスを制埡する掻性を有する物質の評䟡方法。
(1)請求項 13に蚘茉の方法によっお候補物質のアポトヌシスを抑制、たたは 促進する掻性を怜出する工皋、 および
(2)察照ず比范しお、前蚘现胞のアポトヌシスを抑制、 たたは促進する掻性を 有する候補物質を遞択する工皋
15. 次の工皋を含む、候捕物質のアポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経 现胞の増殖のいずれかを制埡する掻性を怜出する方法。
(1) 䟯補物質の存圚䞋、 配列番号 1、 たたは、 配列番号 3に蚘茉の塩基配 列からなる遺䌝子の発珟制埡領域ず、その䞋流に機胜的に結合されたレポ䞀 タ䞀遺䌝子を含むベタタ䞀を発珟させる工皋、
(2) 前蚘レポヌタヌ遺䌝子の掻性を枬定する工皋、 および
(3) 工皋 2) の枬 果を指暙ずしお、 候補物質のアポトヌシス、 神経现胞 の分化、 及び、 神経现胞の増殖のいずれかを制埡する掻性を怜出する工皋。
16. 次の工皋を含む、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを制埡する掻性を有する物質を評䟡する方法。
(1)請求項 15に蚘茉の方法によっお、候補物質のアポトヌシス、神経现胞の 分化、および神経现胞の増殖のいずれかを抑制、たたは促進する掻性を怜出 する工皋、 䞊びに
(2) 察照ず比范しお、 アポトヌシス、神経现胞の分化、 および神経现胞の増殖 のいずれかを抑制、 たたは促進する掻性を有する候補物質を遞択する工皋 L 7. 次の工皋を含む、候補物質の神経现胞の分化および/たたは増殖を制埡す る掻性を怜出する方法。
(1) 次の a)〜d) のいずれかに蚘茉の蛋癜質を発珟する神経现胞に候補 物質を接觊させる工皋、
(a)配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜
(b) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌク レオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズするポリヌクレ ォチドによっおコヌドされる a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜 質、
(c) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若 しくは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、および Zたたは付加したアミ ノ酞配列を有し、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質、
(d) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列ず 90%以䞊の ホモロゞ䞀を有するアミノ酞配列からなり、 a) に蚘茉の蛋癜質ず機胜 的に同等な蛋癜質
(2)神経突起の䌞展が誘導される条件䞋で前蚘现胞を培逊し、前蚘现胞の神経 突起の䌞展を枬定する工皋、 および
(3) 工皋2) の枬定結果を指暙ずしお、候補物質の神経现胞の分ィ匕および Z たたは増殖を抑制、 たたは促進する掻性を怜出する工皋
8. 次の工皋を含む、神経现胞の分ィ匕および Zたたは増殖を制埡する掻性を有 する物質の評䟡方法。
( 1 )請求項 1 7に蚘茉の方法によっお候補物質の神経现胞の分化および/たた は増殖を制埡する掻性を怜出する工皋、 䞊びに
(2)察照ず比范しお、神経现胞の分ィ匕および Zたたは増殖を制埡する掻性を有 する候補物質を遞択する工皋
. 现胞増殖、 たたは现胞死の制埡における請求項 1 4、 たたは請求項 1 6に 蚘茉の方法によっお埗るこずができる化合物の䜿甚。
. 請求項 1 4、たたは請求項 1 6に蚘茉の方法によっお埗るこずができる化 合物を䞻成分ずしお含有するこずを特城ずする、现胞増殖、たたは现胞死に特 城付けられる疟患の治療剀。
. 神経现胞の分ィ匕および/たたは増殖の制埡における、請求項 1 6、 たたは 請求項 1 8に蚘茉の方法によっお埗るこずができる化合物の䜿甚。
. 請求項 1 6、たたは請求項 1 8に蚘茉の方法によ぀お埗るこずができる化 合物を䞻成分ずしお含有するこずを特城ずする、神経现胞の増殖、たたは现胞 死に特城付けられる疟患の治療剀。
. 现胞増殖、たたは现胞死の制埡における請求項 5蚘茉の蛋癜質、 たたは請 求項 1〜 4に蚘蜜のポリヌクレオチドの䜿甚。
. 䞋蚘の a ) 〜 g ) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたはその ポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質を䞻成分ずしお含有する、现胞 増殖、 现胞分化、 たたは现胞死によ぀お特城付けられる疟患の治療剀。
( a ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチド
( b ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列をコヌドするポ リヌクレオチド、
( c ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお 1若し くは耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、およひンたたは付加したアミノ酞 配列を有し、 a ) に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポ リヌクレオチド、
( d ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなるポリヌクレ ォチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズし、配列番号 2、配 列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質を コヌドするポリヌクレオチド、
( e ) 配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列ず 90%以䞊のホモ口 ゞヌを有する塩基配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉 のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリ ヌクレオチド、
( f ) ( a ) 〜 ( e ) に蚘茉のポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチ ド、、
( g ) 配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列においお、 1若 しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、揷入、および/たたは付加したァミノ 酞配列からなり、配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列 力 なる蛋癜質に察しおドミナントネガティブの圢質を持぀蛋癜質をコヌ ドするポリヌクレオチド。
5 . 以䞋の a )〜 d )のいずれかに蚘茉の蛋癜質の発珟を調節したトランスゞ ゚ニック非ヒト動物からなる、 アポト䞀シス、神経现胞の分化、および神経现 胞の増殖が調節されたモデル動物。
( a )配列番号 2、 たたは配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質
( b )配列番号 1、 たたは配列番号 3に蚘茉の塩基配列からなる DNAずストリン ゞ工ントな条件䞋でハむブリダむズする DNAによっおコヌドされる a )に蚘 茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
( c )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列においお 1若しくは 耇数のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、 および/たたは付加したアミノ酞配列 を有し、 a )に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質
( d )配列番号 2、たたは配列番号 4に蚘茉のァミノ酞配列ず 9 0 %以䞊のホモ 口ゞヌを有するアミノ酞配列からなり、a )に蚘茉の蛋癜質ず機胜的に同等 な蛋癜質
6 . 生䜓詊料䞭のアポトヌシスマヌカ䞀を枬定し、該アポトヌシスマヌカヌの 枬定レベルの䞊昇が圓該生䜓詊料におけるアポト䞀シスを瀺す工皋を含むァ ポトヌシスの怜出方法であっお、 アポトヌシスマヌカヌが次の a) — (e) のいずれかに蚘茉のポリヌクレオチド、 たたは a) — (e) のいずれかに蚘 茉のポリヌクレオチドによっおコヌドされる蛋癜質である方法。
( a ) 配列番号 3に蚘茉された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(b)配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質をコヌドするポリヌク レオチド、
(c) 配列番号 6に蚘茉のアミノ酞配列を含み、 か぀配列番号 4に蚘茉のァ ミノ酞配列においお、 1若しくは数個のアミノ酞が眮換、欠倱、挿入、 およ ぎノたたは付加したアミノ酞配列からなり、配列番号 4に蚘茉のァミノ酞 配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドするポリヌクレオチ ド、、
(d) 配列番号 5に蚘茉の塩基配列を含み、 配列番号 3に蚘茉の塩基配列か らなるポリヌクレオチドずストリンゞェントな条件䞋でハむプリダむズし、 配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質 をコヌドするポリヌクレオチド、 および
(e)配列番号 5に蚘茉の塩基配列から遞択された塩基配列を含み、カゝっ配列 番号 3に蚘茉の塩基配列ず 70%以䞊のホモロゞ䞀を有し、配列番号 4 に蚘茉のァミノ酞配列からなる蛋癜質ず機胜的に同等な蛋癜質をコヌドす るポリヌクレオチド、
27. 次の工皋を含む、 劇症肝炎の蚺断方法。
( 1 )請求項 26に蚘茉の方法によっお、肝现胞を生^;料ずしおアポトヌシス を怜出する工皋、 および
(2) 工皋 (1) においおアポトヌシスが怜出された堎合に、劇症肝炎が進行し おいるず刀定する工皋
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