JP5881065B2 - 新たに同定したインスリン分泌制御因子を用いた抗糖尿病薬剤のスクリーニング法 - Google Patents
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Description
[1] インスリン分泌制御因子を含むインスリン分泌制御用組成物であって、該インスリン分泌制御因子が、
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質
である組成物。
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
である組成物。
(a)インスリン分泌制御因子として、下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質
を用意し;
(b)被験物質と工程(a)で用意したタンパク質とを接触させ;
(c)該タンパク質に結合した被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換又は染色体に相同組換えされた形質転換細胞を用意し;
(b)工程(a)で用意した形質転換細胞及び形質転換されていない対照細胞と被験物質とを接触させ;
(c)前記各細胞におけるインスリン分泌量を測定し;そして
(d)前記対照細胞に相対する前記形質転換細胞のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを含むか、又は染色体に相同組換えされたヒト以外のトランスジェニック動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したトランスジェニック動物及び前記核酸を持たない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記トランスジェニック動物のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
(a)下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質
の遺伝子発現が部分的又は完全に抑制されているヒト以外のノックアウト動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したノックアウト動物及び前記遺伝子発現が抑制されていない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記ノックアウト動物のインスリン分泌を正常に戻す被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。
1.本発明のインスリン分泌制御因子
(1−1)本発明のインスリン分泌制御因子の特徴
本発明のインスリン分泌制御因子は、本発明者らによって、アルギニンによるインスリン分泌機構を探査中に見出されたタンパク質である。まず、本発明者らは、アルギニンがインスリン分泌の強力な因子であることを確認するための実験系を開発した。すなわち、蛍光標識インスリンを分泌するように形質転換された培養細胞を作製し、この細胞を用いることによって、アルギニン添加によるインスリンの分泌、及びインスリンの細胞内局在の経時的変化を蛍光顕微鏡により観察することができた。その結果、培養液中にアルギニンが存在しない場合には、インスリンは細胞核の周囲(小胞体の位置)に存在するが、この培養系にアルギニン(10mM)を添加すると、アルギニン投与後10秒ではインスリン同士が凝集し、アルギニン投与後の60秒ではゴルジ体に移動し、その後は細胞外に分泌されて蛍光が消失することが観察された(データ示さず)。以上の結果から、アルギニンによるインスリン分泌促進に関与するアルギニン標的因子が小胞体に存在することが示唆された。また、この実験系は、アルギニンに代えて、インスリン分泌を促進させる候補物質のスクリーニングに応用可能である。
本発明のインスリン分泌制御因子の発現、単離及び精製は、任意公知の技術(例えば、上述したAME固定化磁気ナノビーズ)を用いて行ってよい。例えば、非限定的に以下の手法を適用することができる。
本発明によれば、インスリン分泌制御因子を含むインスリン分泌制御用組成物が提供される。本発明の組成物は、インスリン分泌制御因子がインスリン分泌を負に制御することから、in vivo、in vitro又はex vivoにおいて、後述する抗糖尿病薬剤のスクリーニングに使用することができる。また、他の態様として、本発明の組成物を含む、インスリンの分泌を調節するためのキットとして使用することができる。キットは、所望により、適切な容器、製造者の説明書等を含んでもよい。
(2−1)インスリン分泌制御因子への結合活性に基づくスクリーニング法
本発明によれば、被験物質のインスリン分泌制御因子への結合活性に基づき、該結合活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、(a)本発明のインスリン分泌制御因子を用意し;(b)被験物質と工程(a)で用意したタンパク質とを接触させ;そして、(c)該タンパク質に結合した被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択することを含むスクリーニング法が提供される。
本発明によれば、被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換又は染色体に相同組換えされた形質転換細胞を用意し;
(b)工程(a)で用意した形質転換細胞及び形質転換されていない対照細胞と被験物質とを接触させ;
(c)前記各細胞におけるインスリン分泌量を測定し;そして
(d)前記対照細胞に相対する前記形質転換細胞のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法が提供される。一態様では、前記工程(a)における核酸は、(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸である。
本発明によれば、被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを含むか、又は染色体に相同組換えされたヒト以外のトランスジェニック動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したトランスジェニック動物及び前記核酸を持たない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記トランスジェニック動物のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法が提供される。一態様では、前記工程(a)における核酸は、(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸である。
本発明によれば、被験物質のインスリン分泌抑制活性に基づき、インスリン分泌抑制活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質
の遺伝子発現が部分的又は完全に抑制されているヒト以外のノックアウト動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したノックアウト動物及び前記遺伝子発現が抑制されていない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記ノックアウト動物のインスリン分泌を正常に戻す被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法が提供される。
(1)インスリン分泌制御因子の単離及び同定
アルギニンが生体内で多くの作用を有し、中でもインスリン分泌に関与していることは周知である。しかしながら、前記したように、アルギニンの生理作用を直接媒介するアルギニン標的因子(AIF)についてはほとんど知られていない。本発明者らは、従前、AME(アルギニンメチルエステル)固定化磁気ナノビーズを用いて、AIFとしてPFK(ホスホフルクトキナーゼ)、RBL2(RuvB様2)、及びRBL1(RuvB様1)を非インスリン分泌細胞であるHeLa細胞抽出液より同定した(非特許文献4)。非特許文献4に記載されるように、AMEは、アルギニンと同様にインスリン産生の強力な誘導因子であるが、AMEは、NAME(ニトロ−アルギニン−メチル)と同様にNOS(一酸化窒素合成酵素)のアンタゴニストである。一方で、アルギニンはNOSの基質であり、NOSによりアルギニンからNOが生成される。また、誘導型NOS(iNOS)は、転写、翻訳レベルで制御されているため、刺激後15〜30分は応答しないが、アルギニン誘導性のインスリン分泌促進は、僅か1〜5分程度で起こる。このようにして、インスリン分泌に関して、AMEとアルギニンとの作用機序は異なり、アルギニンのターゲットはNOSではなく、新規な物質であることが予想された。
AME固定化磁気ナノビーズ、及びアルギニン固定化アガロース(シグマ社製)を用いて、インスリン分泌制御因子のアルギニンに対する結合性を試験した。最初に、アルギニンに結合したインスリン分泌制御因子を容易に検出することができるように、予めインスリン分泌制御因子を35S標識した。35S標識したインスリン分泌制御因子試料をSDS−PAGEローディングバッファー(50mM Tris−HCl(pH6.8)、2%SDS、100mM β−メルカプトエタノール、10%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー)で希釈し、98℃5分で変性した。試料を5〜20%勾配のプレキャストゲル(和光純薬工業株式会社)に展開し、DPE−1020カセット電気泳動ユニット(ダイイチ)を用いて、200V、60分間泳動した。対照として、AMEを固定化していないビーズ、及びアルギニンを含まないアガロースを用いた。電気泳動した後、ゲルを銀染色した結果を図2Aに示す。図2Aのレーン3に示される通り、AME固定化磁気ビーズで捕捉されたインスリン分泌制御因子は1つのバンド(「ATIS1」として指示される)として現れ、本発明のインスリン分泌制御因子はアルギニンに結合することが分かる。また、アルギニン固定化アガロースを用いた場合には、ATIS1以外に複数のバンドが観察され、これらは、ATIS1の非特異的な分解を表すと考えられる(レーン5)。一方、対照のアルギニンを含まないビーズ及びアガロースでは、インスリン分泌制御因子が全く検出されなかったが(それぞれレーン2及び4)、AME固定化磁気ナノビーズ及びアルギニン固定化アガロースにおいて強いバンドが検出された(それぞれレーン3及び5)。レーン1は、ビーズ及びアガロースによる捕捉を行っていない試料を電気泳動したものである。
インスリン分泌制御因子を強制発現させたNIT−1細胞を用いて、アルギニン誘導性インスリン分泌活性を測定した。簡単には、約1×105個のNIT−1細胞(ATCCから入手)を予め10%FCS(ウシ胎児血清)を含まないF12K培地(通常のF12K培地のうちアルギニンのみを不含)で培養後、実施例1で得られたインスリン分泌制御因子をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをリポフェクタミン2000(インビトロジェン社)を用いてNIT−1細胞にトランスフェクトした。その後、0.1、0.2、0.6、2.0、及び20mMのアルギニンをこの培養系に添加し、10分培養後、培地を回収し、株式会社シバヤギ レビス インスリン測定用ELISAキットによって、分泌された単位時間あたりのインスリン量を測定した。結果を図4に示す。白丸の折れ線グラフがインスリン分泌制御因子を強制発現していない通常の発現量を持っている野生型NIT−1細胞のアルギニン誘導によるインスリン分泌量の変化を示す。野生型細胞では、アルギニン濃度に依存して、インスリン分泌が促進している。一方、黒丸の折れ線グラフで示されるインスリン分泌制御因子を強制発現されるNIT−1細胞(図中、ATIS1−NIT−1)では、アルギニンの濃度が0.6mMまでインスリンを分泌せず、2.0mM以上で過剰量のアルギニンにより、野生型細胞と同様にインスリン分泌を促進した(図4)。この結果から、本発明のインスリン分泌制御因子は、インスリン分泌を負に制御する機能を有し、インスリン分泌制御因子を発現しない野生型細胞と比較することにより、この細胞系は、インスリン分泌を回復させる物質のスクリーニングに使用することができる。
一般に、マウス及びヒトにおける血中のアルギニンの濃度は、摂食直後が最も高く、200μM程度であり、その後、絶食して時間経過とともに徐々にその濃度は減少し、50μM程度となる。実施例2において観察された、摂食直後はインスリン分泌制御因子の強制発現によりインスリン分泌は低くなるが、食後しばらくするとインスリン分泌は野生型と変化がなくなるという結果は、以下に示すように、インスリン分泌制御因子を強制発現させたマウスにおいても再現された。まず、膵臓β細胞においてインスリン分泌制御因子が発現するマウスを作製した。簡単には、ラットインスリンプロモーターの下流にインスリン分泌制御因子を連結させたベクターをpGSベクターベース(Imai, T., Jiang, M., Chambon, P. & Metzger, D., Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon Cre-ERT2-mediated selective ablation of RXR alpha in adipocytes., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 224-228, 2001)に作製し、受精卵へインジェクションし、いわゆるトランスジェニックマウスを通常の方法にて作製した(F0マウス)。F0マウスの尾よりDNAを抽出し、トランスジーンについての有無のジェノタイプを行った。トランスジーン陽性のものを野生型B6マウスへ掛け合わせて、F1マウスを得た。さらにF1マウスのジェノタイプも同様に行い、陽性のもののみさらにB6マウスへ掛け合わせを行った。繰り返してF6マウスにて解析を行った。ジェノタイプに用いたプライマーは、フォワードプライマー:5’−GGC AAA GTT TTC AGG GTG TTG TT−3’(配列番号8)及びリバースプライマー:5’−TTA GCA GAG GGG CCC GGT TTG GAC TCA GAG−3’(配列番号9)である。また、F6マウスはRT−PCRにて膵臓に特異的にトランスジーンが発現していることを確認した(データ示さず)。使用したプライマーは、フォワードプライマー:5’−GGA TCG ATC CTG AGA ACT TC−3’(配列番号10)及びリバースプライマー:5’−CAG CAG AAG GCT CTC CAG AGT GTC−3’(配列番号11)、並びにフォワードプライマー:5’−GGA TCG ATC CTG AGA ACT TC−3’(配列番号12)及びリバースプライマー:5’−GCT AAG AAC TCA CTG GCT TCC AGC−3’(配列番号13)である。
インスリン分泌制御因子を強制発現させたNIT−1細胞を用いて、本発明の抗糖尿病薬剤のスクリーニング法を検証した。検証に使用した化合物は、アルギニン、天然由来の精製したドルパニン(Dru)、天然由来の精製したバッカリン(Bac)、及び化学合成したバッカリン(sBac)である。このうち、ドルパニン及びバッカリンはともにブラジル産プロポリスの主成分として知られている(Tani, H., et al., Inhibitory activity of Brazilian green propolis components and their derivatives on the release of cys-leukotriens., Bioorg. Med. Chem., 18: 151-157, 2010参照)。一方、プロポリス抽出物は、インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病)を改善する作用を有することが知られている(例えば、特開2010−37211号公報)。そこで、実施例2と同様の細胞実験系を用いることによって、天然由来の精製したドルパニン(Dru)、天然由来の精製したバッカリン(Bac)、及び化学合成したバッカリン(sBac)がアルギニンと同様にインスリン分泌を促進するか否かを検討し、本発明のスクリーニング法が有益であることを以下に実証した。Dru及びBacは、ブラジル産プロポリス(アピ社製)から精製し、sBacは、本発明者らによって、上記Taniらの文献を参考にして合成した。
実施例4で示されたsBacのグルコース依存的なインスリン分泌促進活性をインビボにおいて確認した。より具体的には、野生型B6マウスを用いて、再摂食後のマウスと絶食12時間後のマウスの2系統を用意し、それぞれ、各種濃度のsBacを投与した後の血中インスリン量と血中グルコース量を測定した。絶食したマウスでは、いずれの濃度のsBacを投与した場合でも、対照(ビヒクルのみ)と比較して、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度に変化が見られなかった(図7A、それぞれ白四角と白丸)。これに対して、再摂食直後の高い血中グルコース濃度であるマウスにおいては、sBacの投与により、その濃度に依存して血中インスリン濃度が増加し、さらに、これに伴って血中グルコース濃度も減少している(図7A、それぞれ黒丸と黒四角)。これらの結果から、細胞培養系で行った実施例3の結果と同様に、マウスを用いた系においても、sBacがグルコース濃度依存的なインスリン分泌促進活性を有していることが示唆された。
アルギニン以外のアミノ酸及び糖が、インスリン分泌制御因子と相互作用をするのかどうかを検討した。実験は、実施例1と同様に行った。簡単には、アルギニン固定化アガロース(シグマ社製)に放射線標識したインスリン分泌制御因子を結合させ、その後、アルギニン(Arg)、オルニチン(Orn)、リジン(Lys)、フェニルアラニン(Phe)、シトルリン(Cit)、グルタミン(Glu)、グルコース(Glu)、及びUDP−グルコースで結合が外された放射線標識されたインスリン分泌制御因子の電気泳動後にゲルを銀染色した(図8A)。インスリン分泌制御因子と相互作用したアミノ酸はアルギニン以外にオルニチン及びリジンであり、ともにインスリン分泌促進活性を有することが知られているカチオン性アミノ酸である。インスリン分泌促進活性は、アルギニン>オルニチン、リジンの順であるため、ATIS1との結合活性と極めて高い正の相関が見られた。また、非カチオン性アミノ酸で、SUR(スルフォニルウレア受容体)を介してインスリン分泌促進を行うフェニルアラニンは、予想通りATIS1と結合しなかった。また、アルギニン、オルニチンとよく似ているがカチオン性ではないシトルリンはインスリン分泌促進活性を有しないことが知られているが、ATIS1結合活性も見られなかった。よって、種々のアミノ酸のうち、インスリン分泌促進活性を有するカチオン性アミノ酸のみATIS1との結合が見られた。一方、糖との相互作用では、興味深いことに、インスリン分泌制御因子は、グルコースよりも、UDP−グルコースとの親和性が非常に高いことが分かった。そこで、次に、UDP−グルコースのインスリン分泌促進活性をインビボの系で確認した。実施例5と同様に、野生型B6マウスを用いた。再摂食後のマウスにUPD−グルコースを4.2、12.5、及び37.5(mg/30g体重)で投与し、血中インスリン濃度を測定した。図8Bに示されるように、UPD−グルコース投与されたマウスでは、その濃度上昇に依存して、血中のインスリン濃度が増加している。このことから、UDP−グルコースがインスリン分泌促進因子として機能していることが示唆された。
Claims (13)
- インスリン分泌制御因子を含むインスリン分泌制御用組成物であって、該インスリン分泌制御因子が、
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質である組成物。 - インスリン分泌制御因子を含むインスリン分泌制御用組成物であって、該インスリン分泌制御因子が、
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
である組成物。 - 糖尿病を治療又は予防する薬剤をスクリーニングするための請求項1又は2に記載の組成物。
- 被験物質のインスリン分泌制御因子への結合活性に基づき、該結合活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)インスリン分泌制御因子として、下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質を用意し;
(b)被験物質と工程(a)で用意したタンパク質とを接触させ;
(c)該タンパク質に結合した被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。 - 前記工程(a)におけるタンパク質が、(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;又は(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質である、請求項4に記載のスクリーニング法。
- 被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換又は染色体相同組換えされた形質転換細胞を用意し;
(b)工程(a)で用意した形質転換細胞及び形質転換されていない対照細胞と被験物質とを接触させ;
(c)前記各細胞におけるインスリン分泌量を測定し;そして
(d)前記対照細胞に相対する前記形質転換細胞のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。 - 前記工程(a)における核酸が、(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸である、請求項6に記載のスクリーニング法。
- 被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法において使用するための形質転換細胞であって、該形質転換細胞は、下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸;
(iii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は
(iv)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換又は染色体相同組換えされた膵臓β細胞又は非肥満糖尿病マウス膵β細胞由来のNIT−1細胞。 - 被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;又は
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを含むか、又は染色体相同組換えされたヒト以外のトランスジェニック動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したトランスジェニック動物及び前記核酸を持たない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記トランスジェニック動物のインスリン分泌を回復させる被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。 - 前記工程(a)における核酸が、(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸である、請求項9に記載のスクリーニング法。
- 被験物質のインスリン分泌促進活性に基づき、インスリン分泌促進活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法において使用するためのヒト以外のトランスジェニック動物であって、下記の核酸:
(i)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸;
(ii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸;
(iii)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸;又は
(iv)配列番号1若しくは配列番号3で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質をコードする核酸
を組み込んだ組換えベクターを含むか、又は染色体相同組換えされ、前記核酸が膵臓β細胞において発現されたヒト以外のトランスジェニック動物。 - 被験物質のインスリン分泌抑制活性に基づき、インスリン分泌抑制活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法であって、
(a)下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質の遺伝子発現が部分的又は完全に抑制されているヒト以外のノックアウト動物を用意し;
(b)工程(a)で用意したノックアウト動物及び前記遺伝子発現が抑制されていない対照動物に被験物質を投与し;
(c)前記各動物における血中インスリン濃度を測定し;そして
(d)前記対照動物に相対する前記ノックアウト動物のインスリン分泌を正常に戻す被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択する
ことを含むスクリーニング法。 - 被験物質のインスリン分泌抑制活性に基づき、インスリン分泌抑制活性を有する被験物質を、糖尿病を治療又は予防するための薬剤に使用される候補物質として選択するスクリーニング法において使用するためのヒト以外のノックアウト動物であって、下記のタンパク質:
(i)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質;又は
(ii)配列番号2若しくは配列番号4で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつインスリン分泌を負に制御するタンパク質の遺伝子発現が、膵臓β細胞において部分的又は完全に抑制されているヒト以外のノックアウト動物。
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