JP2006506067A - 新規ｐｔｈ反応性遺伝子 - Google Patents

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Abstract

本発明は新規ＰＴＨ遺伝子に関する。本発明はさらに、骨関連障害の治療法のスクリーニング、診断および開発法に関する。

Description

本発明は分子生物学の分野である。さらに詳細には、本発明は骨関連障害の診断、予後、予防、治療、および治療法を評価するための方法および組成物に関する。
ヒトおよび他の哺乳動物をはじめとする動物は、多くの骨関連障害、例えば骨粗鬆症およびパジェット病にかかり得る。骨関連障害の原因はあまりよく理解されていないが、骨形成と骨再吸収（骨破壊）の間に不均衡がある可能性があると考えられる。例えば、骨粗鬆症状態にかかっている動物において、骨再吸収は骨形成を上回る。骨形成と骨再吸収の複雑なプロセスは２種の細胞：骨形成に関与する骨芽細胞および骨再吸収に関与する破骨細胞により媒介され得る。
骨関連障害の治療に有望な治療法は、骨形成速度の骨再吸収速度に対する割合が増大するように骨形成速度と骨再吸収速度間のバランスを修正し、その結果、全体的な骨損失がないようにするために設計された薬剤の投与である。例えば、骨再吸収の阻害（例えば破骨細胞の活性の阻害）または骨形成の誘発（例えば、骨芽細胞の活性の誘発）により骨損失を抑制することができる。すでに起こった骨損失が回復された後、骨産生速度と骨再吸収速度が等しい定常状態に達する。このような修正は、骨堆積、すなわち骨形成の生理学的メカニズムを刺激することによるか、または骨再吸収のメカニズムを遅らせることによるか、あるいはその両方により行うことができる。現在使用されているかまたはこれらの目的を達成するための実験段階の医薬は、ホルモン置換療法、選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭｓ）（例えば、Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート）およびカルシトニンを包含する。これらの治療法は、破骨細胞生成を減少させ、破骨細胞活性を減少させることにより骨再吸収を減少させる（Ｃａｎａｌｉｓ Ｅ、２０００、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、１０６（２）：ｐｐ１７７−１７９）。骨再吸収における結果として生じる減少は、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の若干の増加につながるが、これらの医薬は骨マトリックス堆積または骨体積を増大させない（Ｔａｓｈｊｉａｎ、Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１７：１１５１−１１６１ ２００２）。ある薬剤、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、毎日１回投与すると、骨マトリックス形成を刺激する（Ｃｏｓｍａｎ、Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．６２：４７５−４８０、１９９８、Ｎｅｅｒ、Ｒ．Ｍ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１４３４−１４４１、２００１）。
ＰＴＨおよびその生物学的に活性なフラグメントＰＴＨ１−３４は、１９３０年から強力な骨形成能を示すことが認識されている。ＰＴＨの骨形成能への興味関心は、多くの臨床試験によりＰＴＨの骨形成活性が主に骨梁内で見られるが、皮質骨ではほとんどまたは全く見られないことが示された後、１９７０年代および１９８０年代に論評されている（Ｂａｕｅｒら、１９２９、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、４９：１４５−１６２ページ、Ｓｅｌｙｅ Ｈ、１９３２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６：５４７−５５８ページ、Ｄｅｍｐｓｔｅｒら、１９９３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１４（６）：６９０−７０９ページ、Ｂａｕｅｒら、１９２９、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、４９：１４５−１６２ページ、Ｓｅｌｙｅ Ｈ、１９３２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６：５４７−５５８ページ）。さらに最近の研究により、ＰＴＨによる骨形成における増加は、骨量を増大させるだけでなく、骨の構造および骨の生体力学的性質を向上させることが示された（Ｂｒｏｍｍａｇｅ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：３７５７：３７６３、１９９９．、Ｓａｔｏ、Ｍ．ら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．１１：８７１−８８０、２０００．、Ｂｕｒｒ、Ｄ．Ｂ．、ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１６：１５７−１６５、２００１．、Ｊｅｒｏｍｅ、Ｃ．Ｐ．、ら、Ｂｏｎｅ ２８：１５０−１５９、２００１）。ＰＴＨはこれらの同化（骨形成）特性を有するが、ある種の治療レジメ下で異化（骨分解）活性を有し得るので、その作用は複雑である（Ｄｅｍｐｓｔｅｒ 、Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１４：６９０−７０９、１９９３）。
骨調節または形成の分子メカニズムの解明、新規医薬のスクリーニングおよび開発、骨の発達および骨量減少障害の診断、予後、予防および治療、ならびに骨粗鬆症などの骨関連障害の治療法を評価するために、新規遺伝子およびそのタンパク質生成物を同定する必要性がある。さらに、骨関連障害の治療用化合物のスクリーニングおよび同定を可能にするために、動物モデルをはじめとする骨関連障害のモデルが現在、業界で必要とされている。本発明は、これらの問題を克服し、必要とされる手段を提供する。
Ｃａｎａｌｉｓ Ｅ、２０００、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、１０６（２）：ｐｐ１７７−１７９ Ｔａｓｈｊｉａｎ、Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１７：１１５１−１１６１ ２００２ Ｃｏｓｍａｎ、Ｆ．ら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．６２：４７５−４８０、１９９８ Ｎｅｅｒ、Ｒ．Ｍ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１４３４−１４４１、２００１ Ｂａｕｅｒら、１９２９、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、４９：１４５−１６２ページ Ｓｅｌｙｅ Ｈ、１９３２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６：５４７−５５８ページ Ｄｅｍｐｓｔｅｒら、１９９３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１４（６）：６９０−７０９ページ Ｂａｕｅｒら、１９２９、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、４９：１４５−１６２ページ Ｓｅｌｙｅ Ｈ、１９３２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６：５４７−５５８ページ Ｂｒｏｍｍａｇｅ、Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４：３７５７：３７６３、１９９９ Ｓａｔｏ、Ｍ．ら、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．１１：８７１−８８０、２０００． Ｂｕｒｒ、Ｄ．Ｂ．、ら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１６：１５７−１６５、２００１ Ｊｅｒｏｍｅ、Ｃ．Ｐ．、ら、Ｂｏｎｅ ２８：１５０−１５９、２００１ Ｄｅｍｐｓｔｅｒ 、Ｄ．Ｗ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗ、１４：６９０−７０９、１９９３。
本発明は、新規ＰＴＨ反応性遺伝子（ＰＡＩＧＢ）およびＰＴＨの同化活性により調節されるその変異体を提供する。本発明はさらに ＰＡＩＧＢタンパク質またはそのフラグメントをコード化する単離された核酸フラグメントを提供する。
本発明は：（ａ）配列番号２、４、６、８および１０をコード化する単離された核酸フラグメント、（ｂ）配列番号２、４、６、８および１０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコード化する単離された核酸フラグメント、（ｃ）６ＸＳＳＣ（１Ｍ ＮａＣｌ）、４５〜５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、３７℃のハイブリダイゼーション条件下、および０．５×〜１×ＳＳＣ中５５〜６０℃での洗浄で、（ａ）の単離された核酸フラグメントとハイブリッド形成する単離された核酸分子；および（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）と相補性の単離された核酸フラグメントからなる群から選択されるＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化する単離された核酸フラグメントに関する。核酸分子および対応するポリペプチドフラグメントは添付の配列リストに含まれ、本発明の簡単な説明に記載されている。
もう一つの具体例において、本発明はＰＡＩＧＢポリペプチドを提供する。
もう一つの具体例において、本発明はＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化するキメラ構築物に関する。
さらに別の具体例において、本発明はＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化するキメラ構築物を含む宿主細胞に関する。
別の具体例において、本発明は、ＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化する核酸フラグメントを得る方法であって、（ａ）配列番号３に記載される核酸フラグメントの全部または一部でゲノムライブラリーをプローブし；（ｂ）工程（ａ）の核酸フラグメントとハイブリッド形成するＤＮＡクローンを識別し；工程（ｂ）において識別されたＤＮＡクローンを含む核酸フラグメントの配列を決定することを含む方法を提供する。
もう一つの具体例において、本発明はＰＡＩＧＢポリペプチドを得る方法を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明は（ｉ）ＰＡＩＧＢ核酸フラグメント（ｉｉ）ＰＡＩＧＢポリペプチド、または（ｉｉｉ）かかるポリペプチドまたはその一部から形成される抗体の少なくとも一つを含む哺乳動物における骨形成活性を調節するための組成物を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明はＰＡＩＧＢ遺伝子またはポリペプチドの発現を変更する薬剤を提供する。
さらにもう１つの具体例において、本発明は薬剤がＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現を変更するかどうかを決定する方法を提供し、該方法は：ａ）該薬剤と接触していない試験サンプル中に存在するＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルを測定し；ｂ）該薬剤と接触する試験サンプル中に存在するＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルを測定し；ｃ）工程ａ）において測定されたＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現のレベルが工程ｂ）において測定されたＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルと異なる場合に該薬剤がＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルを変更すると判断することを含む。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、ＰＡＩＧＢ核酸フラグメントの発現の変更において有効な薬剤をスクリーニングする方法であって、ａ）ＰＡＩＧＢ核酸フラグメントを含む試験サンプルをＰＡＩＧＢ核酸フラグメントの発現に適した条件下で薬剤と接触させ、ｂ）変更されたＰＡＩＧＢ核酸フラグメントの発現を検出し、ｃ）様々な量の薬剤の存在下および化合物の不在下でのＰＡＩＧＢ核酸フラグメントの発現を比較することを含む方法を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、骨関連障害の治療に有用な薬剤をスクリーニングする方法であって、ａ）ＰＡＩＧＢ遺伝子を発現するように遺伝子操作された、培養された宿主細胞と薬剤を接触させ；ｂ）ＰＡＩＧＢ遺伝子の発現、ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡまたはＰＡＩＧＢポリペプチドレベルにおける変化を検出することを含む方法を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、被験者における骨関連障害の治療の有効性を評価する方法であって；所定のプロトコルで治療される被験者について、ＰＡＩＧＢ核酸フラグメントまたはＰＡＩＧＢポリペプチドの発現レベルを評価することを含む方法を提供し、ここにおいて、治療前のレベルに対する、治療後のＰＡＩＧＢ核酸フラグメントまたはＰＡＩＧＢポリペプチドの発現レベルにおける変化は、骨関連障害の治療の有効性の指標である。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、ＰＡＩＧＢと結合できるポリペプチドを同定する方法であって、前記ＰＡＩＧＢをコード化する配列が一つのハイブリッドベクターにより担持され、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから得られる配列が第二のハイブリッドベクターにより担持されている２−ハイブリッド法を哺乳動物に適用し、該ベクターを次いで宿主細胞を形質転換するために使用し、正の形質転換された細胞を単離し、続いて前記の第二のハイブリッドベクターを抽出して、前記ＰＡＩＧＢと結合するポリペプチドをコード化する配列を得ることを含む方法を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、骨関連剤での患者の治療の有効性をモニターする方法であって、（ａ）薬剤の投与前の被験者から投与前サンプルを得；（ｂ）投与前サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し；（ｃ）被験者から１以上の投与後サンプルを得、（ｄ）投与後サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し、（ｅ）投与前サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性と比較し；（ｆ）それに応じて被験者への薬剤の投与を変更することを含む方法を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、本発明のＰＡＩＧＢ ＤＮＡを含むトランスジェニック動物を提供する。
さらにもう一つの具体例において、本発明はトランスジェニック動物を提供し、ここにおいて、前記動物は、ホモローガスな組み換えまたは遺伝子ターゲティングにより動物のＰＡＩＧＢ遺伝子の一つの一方または両方のコピーが部分的または完全に欠失しているか、あるいは外因性配列の挿入またはホモローガスな組み換えによる置換または遺伝子ターゲティングにより不活化されている「ノックアウト」動物である。
さらにもう一つの具体例において、本発明は、本発明の動物モデルを使用した、骨量決定因子の研究、骨量のおよび／またはＰＡＩＧＢの骨障害に対する影響を調節する方法を提供する。
本発明は、詳細な説明および本出願の一部をなす添付の図面と配列リストからさらによく理解できる。
図１は、ＰＴＨの断続的注射による脛骨における全ＢＭＤに対するＰＴＨ１−３４の影響を示す（実施例１に記載）。
図２Ａは、ＰＴＨ１−３４の断続的および連続的投与から得られるラット脛骨ＲＮＡを用いたＲＡＤＥ実験からのＰＡＩＧＢの同定を示す（実施例２に記載）。
図２Ｂは、ＰＴＨ １−３４の断続的な投与により制御されるＰＡＩＧＢの確認ノザンブロットを示す（実施例２および７に記載）。
図３は、５’ＵＴＲから終止コドンまでを含むヒト、マウスおよびラット配列のＰＡＩＧＢ ｃＤＮＡ配列を示す（実施例５に記載）。
図４は、ラット、マウスおよびヒトＰＡＩＧＢのタンパク質配列を示す（実施例５に記載）。
図５は、ＰＡＩＧＢの発現パターンを示すマウスの複数組織ノザンブロットを示す。
図６は、ヒトＯｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡパネルを用いたＰＡＩＧＢ完全長およびスプライス変異体の発現パターンを示す（実施例７に記載）。
図７は、マウスＯｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡパネルを用いたＰＡＩＧＢ完全長およびスプライス変異体の発現パターンを示す（実施例７に記載）。
図８は、非骨組織におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ発現の調節の欠失を示す（実施例８に記載）。
図９は、マウス頭蓋冠におけるインサイチュハイブリダイゼーション分析によるＰＴＨ１−３４でのＰＡＩＧＢ発現の誘発を示す（実施例９に記載）。
図１０Ａは、断続的ＰＴＨ１−３４治療中のラット脛骨におけるＰＡＩＧＢ発現の経時変化を示す（実施例１０に記載）。
図１０Ｂは、ＰＴＨのｓｃ投与によるラット脛骨におけるＰＡＩＧＢ発現の調節が用量依存性であることを示す（実施例１０に記載）。
図１１Ａは、ＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ発現の制御はＲＯＳ１７／２．８骨芽細胞において用量依存性であることを示す（実施例１２に記載）。
図１１Ｂは、ＲＯＳ１７／２．８骨芽細胞におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ誘発の経時変化を示す（実施例１２に記載）。
図１２は、タンパクキナーゼＣ（ＰＫＣ）経路がＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢの調節に関与しないことを示す（実施例１３に記載）。
図１３は、ＰＴＨ１−３４がＲＯＳ１７／２．８細胞におけるアデニルシクラーゼおよびｃＡＭＰシグナル化によりＰＡＩＧＢ発現に対して影響を及ぼすことを示す（実施例１３に記載）。
図１４は、ＲＯＳ１７／２．８細胞におけるＰＡＩＧＢ発現に対する他の骨関連剤の影響を示す（実施例１４に記載）。
図１５は、ＵＭＲ１０６細胞におけるＰＡＩＧＢ発現に対する他の骨関連剤の影響を示す（実施例１４に記載）。
図１６Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＵ２ＯＳおよびラットＵＭＲ骨芽細胞におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ発現の誘発を示す（実施例１５に記載）。
図１６Ｂは、ＴａｑＭａｎ分析によるヒトＵ２ＯＳ骨芽細胞におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ発現の誘発を示す（実施例１５に記載）。
図１７は、ヒトＵ２ＯＳ骨芽細胞におけるＰＡＩＧＢのタンパク質発現を示す（実施例１７に記載）。
図１８は、Ｕ２ＯＳ細胞において発現されたＰＡＩＧＢタンパク質を検出するためのＰＡＩＧＢウサギポリクローナル抗体の能力を示す（実施例１７に記載）。
図１９は、Ｕ２ＯＳ細胞における免疫組織化学的分析によるＰＡＩＧＢタンパク質発現を検出するためのＰＡＩＧＢポリクローナル抗体の能力を示す（実施例１８に記載）。
図２０は、ＰＴＨ１−３４で処置されたマウス頭蓋冠の骨膜および骨内膜におけるＰＡＩＧＢタンパク質の誘発を示す（実施例１９に記載）。
図２１は、ＰＴＨ１−３４で処置されたマウス頭蓋冠からの骨膜の骨芽細胞におけるＰＡＩＧＢタンパク質の誘発（実施例１９に記載）。
図２２は、ＰＴＨ１−３４で処置されたマウス頭蓋冠からの骨内膜の骨芽細胞におけるＰＡＩＧＢタンパク質の誘発を示す（実施例１９に記載）。
図２３は、リアルタイムＰＴ−ＰＣＲにより測定される脛骨における非トランスジェニックマウスと比較して、ライン２およびライン５４からのヘテロ接合ＰＡＩＧＢトランスジェニックマウスはＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡを過剰発現することを示す（実施例２２に記載）。
図２４は、非トランスジェニックマウスと比較して、ＰＡＩＧＢヘテロ接合ライン２マウスは、頭蓋冠の骨膜における骨芽細胞においてＰＡＩＧＢタンパク質を過剰発現することを示す（実施例２２に記載）。
図２５は、非トランスジェニックマウスと比較して、ＰＡＩＧＢヘテロ接合ライン２マウスは、頭蓋冠の矢状縫合部分における骨芽細胞においてＰＡＩＧＢタンパク質を過剰発現することを示す（実施例２２に記載）。
図２６は、非トランスジェニックマウスと比較した、ＰＡＩＧＢヘテロ接合ライン２マウスの頭蓋冠の骨膜および骨内膜におけるアルカリホスファターゼ活性の増大を示す。図はさらに、非トランスジェニックマウスと比較した、ヘテロ接合における頭蓋冠厚さの増大を示す（実施例２２に記載）。
図２７は、非トランスジェニックマウスと比較した、ＰＡＩＧＢヘテロ接合ライン５４マウスの頭蓋冠の骨膜および骨内膜におけるアルカリホスファターゼ活性の増大を示す。図はさらに、非トランスジェニックマウスと比較した、ヘテロ接合における頭蓋冠厚さにおける増大を示す（実施例２２に記載）。
次の６３の配列の説明および配列リストは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１１．８２５．に記載されている特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を支配する法則（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ”）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ２５（１９８８）と一致し、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（ルール５．２および４．９５（ａ−ｂｉｓ）およびセクション２０８および配列および／またはアミノ酸配列を含有する特許出願の要件および実施細則の附録Ｃ）と一致する。配列の説明は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）（出典明示により本発明の一部として参照される）に記載されているＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ標準に準拠して定義されるヌクレオチド配列特性についての一文字コードおよびアミノ酸についての３文字コードを含む。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに関して用いられる記号および様式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載されている法則に従う。
配列番号１は、ラットＰＡＩＧＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、ラットＰＡＩＧＢ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＰＡＩＧＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、ヒトＰＡＩＧＢ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５は、ヒトエクソン２スプライス変異体のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ヒトＰＡＩＧＢエクソン２スプライス変異体によりコードされるアミノ酸晴いつである。
配列番号７は、マウスＰＡＩＧＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、マウスＰＡＩＧＢ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９は、マウスＰＡＩＧＢエクソン２スプライス変異体のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、マウスＰＡＩＧＢエクソン２スプライス変異体によりコードされるアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ポリクローナル抗体産生のために動物を免疫化するために用いられるＰＡＩＧＢアミノ酸ペプチド配列である。
配列番号１２は、ポリクローナル抗体産生のために動物を免疫化するために用いられるＰＡＩＧＢアミノ酸ペプチド配列である。
配列番号１３は、ポリクローナル抗体産生のために動物を免疫化するために用いられるＰＡＩＧＢアミノ酸ペプチド配列である。
配列番号１４は、ポリクローナル抗体産生のために動物を免疫化するために用いられるＰＡＩＧＢアミノ酸ペプチド配列である。
配列番号１５は、ＢＡＣクローンをスクリーンするために用いられるマウスヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、ラットＰＡＩＧＢ ＴａｑＭａｎプローブのヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた前進プライマーのラットＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた逆プライマーのラットＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号１９は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた前進プライマーのマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２０は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた逆プライマーのマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられたプローブ５’６ＦＡＭのマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２２は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた前進プライマーのヒトＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられた逆プライマーのヒトＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ＴａｑＭａｎ分析において用いられたプローブ５’６ＦＡＭのヒトＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、５’ＲＡＣＥに用いたアダプタープライマーＡＰ１のヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、５’ＲＡＣＥに用いたＰＡＩＧＢヌクレオチド配列の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ１）である。
配列番号２７は、５’ＲＡＣＥに用いたＰＡＩＧＢヌクレオチド配列の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ２）である。
配列番号２８は、５’ＲＡＣＥに用いたＰＡＩＧＢヌクレオチド配列の遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ３）である。
配列番号２９は、マウスＰＡＩＧＢ相同体をクローンするために前進ＲＴ−ＰＣＲプライマーとして使用したマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、マウスＰＡＩＧＢ相同体をクローンするために逆ＲＴ−ＰＣＲプライマーとして使用したマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、マウスＰＡＩＧＢをクローンするために前進ＲＴ−ＰＣＲプライマーとして使用したマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、マウスＰＡＩＧＢをクローンするためにＲＴ−ＰＣＲ逆プライマーとして使用したマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、ヒトＰＡＩＧＢの１０８６ｂｐヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、エクソン２スプライス変異体をクローンするためにＰＣＲにおいて用いられるＰＡＩＧＢヒト前進プライマーである。
配列番号３５は、エクソン２スプライス変異体をクローンするためにＰＣＲにおいて用いられるＰＡＩＧＢヒト逆プライマーである。
配列番号３６は、Ｏｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡ発現パネルでのＰＣＲにおいて用いられるＰＡＩＧＢヒト前進プライマーである。
配列番号３７は、Ｏｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡ発現パネルでのＰＣＲにおいて用いられるＰＡＩＧＢヒト逆プライマーである。
配列番号３８は、Ｏｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡ発現パネルのＰＣＲにおいて前進プライマーとして用いられるマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、Ｏｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡ発現パネルのＰＣＲにおいて逆プライマーとして用いられるマウスＰＡＩＧＢヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、インサイチュリボプローブを生成させるために用いたマウスＰＡＩＧＢクローンのヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるヒトＰＡＩＧＢエクソン２前進プライマーである。
配列番号４２は、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるヒトＰＡＩＧＢエクソン２逆プライマーである。
配列番号４３は、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるラットＰＡＩＧＢエクソン２前進プライマーである。
配列番号４４は、ＲＴ−ＰＣＲに用いられるラットＰＡＩＧＢエクソン２逆プライマーである。
配列番号４５は、トランスジェニック動物におけるＰＡＩＧＢトランス遺伝子発現を評価するためにＴａｑｍａｎにおいて用いられるラットＰＡＩＧＢエクソン２前進プライマーである。
配列番号４６は、トランスジェニック動物におけるＰＡＩＧＢトランス遺伝子発現を評価するためにＴａｑｍａｎにおいて用いられるラットＰＡＩＧＢエクソン２逆プライマーである。
配列番号４７は、トランスジェニック動物におけるＰＡＩＧＢトランス遺伝子発現を評価するためにＴａｑｍａｎにおいて用いられるラットＰＡＩＧＢプローブである。
配列番号４８は、ラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号４９は、配列番号４８のラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５０は、ラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５１は、配列番号５０のラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５２は、ラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５３は、配列番号５２のラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５４は、ラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５５は、配列番号５４のラットＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５６は、ヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５７は、配列番号５６のヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５８は、ヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号５９は、配列番号５８のヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号６０は、ヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号６１は、配列番号６０のヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号６２は、ヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
配列番号６３は、配列番号６２のヒトＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドである。
本出願者らは、ＰＴＨの同化活性により調整される新規ＰＴＨ応答性遺伝子およびその変異体を同定し、特徴づけることに成功した。この新たに同定された遺伝子は、骨におけるＰＴＨ同化誘発遺伝子（ＰＡＩＧＢ）とよばれる。ＰＡＩＧＢ遺伝子は、ヒトＰＴＨのフラグメント１〜３４をラット中に断続的に投与することによるＰＡＩＧＢの発現に基づいて、また当該分野において周知のアルゴリズムを用いて公的ＮＣＢＩデータベース（ＧｅｎｅＢａｎｋ）とヌクレオチド配列を比較することにより同定された。
一具体例において、本出願者らは、ＰＡＩＧＢがＰＴＨの同化活性により調節され、同化ＰＴＨ活性に関与する分子の代表であることを証明した。骨におけるＰＡＩＧＢの発現は、ＰＴＨが断続的に投与された場合に劇的に増大したが、連続ＰＴＨ投与はこの新規遺伝子の発現レベルにおいてなんら変化を誘発しなかった。
もう一つ別の具体例において、正常で処置されていないか、または疾患にかかっていない骨におけるＰＡＩＧＢの発現は、Ｔａｑ−ｍａｎ分析により測定した場合に非常に低いかまたは検出不能であった。しかしながら、断続的ＰＴＨ治療の後、ＰＡＩＧＢのｍＲＮＡのレベルは用量および時間に依存して著しく誘発された。さらに、ＰＴＨの連続投与でＰＡＩＧＢ発現は誘発されなかった。断続的ＰＴＨ治療中、ＰＡＩＧＢの増大した発現は、ＰＴＨ処理により誘発された、増大した骨形成を反映する。本発明はさらに、骨形成を誘発するような方法でのＰＴＨ治療により発現された遺伝子の調節に関与する事象の同定およびシグナル化を記載する。
さらにもう一つの具体例において、本発明の新規ＰＴＨ応答性遺伝子、ＰＡＩＧＢは、脳において発現レベルが高く、腎臓および肺において発現レベルが低い、制限された方法で発現された。断続的に投与されたＰＴＨは、腎臓、心臓および脳においてＰＡＩＧＢの情報における変化を誘発せず、このデータは、ＰＴＨ誘発性ＰＡＩＧＢ発現が骨組織について特異的であることを示す。興味深いことに、骨におけるＰＡＩＧＢの発現は、断続的ＰＴＨ投与でのＢＭＤ（骨ミネラル密度）における変化に関連する。ＰＡＩＧＢ発現ならびに特に骨膜における骨芽細胞特異性発現のレベルはＰＡＩＧＢの有効な役割を明らかに示す。
さらにもう一つ別の具体例において、ＰＡＩＧＢ発現のＰＴＨ誘発は、ＰＴＨレセプター特異性である。さらに、ＰＡＩＧＢ発現に対するＰＴＨの影響は、ｃＡＭＰ蓄積およびその後のＰＫＡの活性化により媒介され；したがってＰＡＩＧＢは、ＰＴＨ骨形成活性がその根底にある分子メカニズムに関与することが再度確認される。
さらにもう一つ別の具体例において、ＰＡＩＧＢポリペプチドの発現は、ウェスタンブロット、免疫組織化学法、免疫蛍光顕微鏡検査法およびフローサイトメトリーなどの様々な技術を用いて検出される。
本発明はＰＡＩＧＢ遺伝子に対する変更を有する遺伝子修飾された動物に関する。これらの骨疾患に関連するＰＡＩＧＢ変更発現の動物モデルは、骨同化機能により特徴づけられる主な表現型を示し、ヒトの疾患の治療用化合物の同定に有用である。従って、本発明はさらに、骨関連障害の治療に有効な化合物を同定するための動物を使用した方法およびその化合物に関する。
略語および用語の定義
次の定義は本明細書において用いられる用語および略語を完全に理解するために提供する。
本明細書および請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は特に明記しない限り複数も包含する。従って、例えば「宿主細胞」についての言及は、複数のこのような宿主細胞を包含し、「抗体」についての言及は当業者に公知の１以上の抗体およびその等価物であるなど。
本明細書における略語は、次のような測定、技術、性質または化合物の単位に対応する：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「℃」は摂氏度を意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「ｐＬ」はピコリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌｅ」はミリモルを意味し、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ＲＴ」は室温を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ＳＥＭ」は標準誤差を意味し、「Δ」は変化を意味し、「ｃｔ」は閾値サイクルを意味し、「ＩＵ」は国際単位を意味する。
「高速液体クロマトグラフィー」はＨＰＬＣと略記される。
「差次的に発現された遺伝子の急速な増幅」はＲＡＤＥと略記される。
「高スループットスクリーニング」はＨＴＳと略記される。
「ポリアクリルアミドゲル電気泳動法」はＰＡＧＥと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応」はＲＴ−ＰＣＲと略記される。
「酵素結合免疫吸着検定法」はＥＬＩＳＡと略記される。
「放射免疫測定法」はＲＩＡと略記される。
「質量分析法」はＭＳと略記される。
「タンデム質量分析法」はＭＳ／ＭＳと略記される。
ＳＱ２２５３６アデニレートシクラーゼ阻害剤はＳＱＩｎｈと略記される。
液体クロマトグラフィーはＬＣと略記される。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法はＬＣ−ＭＳ−ＭＳと略記される。
「ドデシル硫酸ナトリウム」はＳＤＳと略記される。
「Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液Ｔｗｅｅｎ２０」はＴＢＳＴと略記される。
「Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液」はＴＢＳと略記される。
「ドデシル硫酸ナトリウム」はＳＤＳと略記される。
「グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ」はＧＡＰＤＨと略記される。
「未翻訳領域」はＵＴＲと略記される。
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略記される。
「副甲状腺ホルモン」はＰＴＨと略記される。
「骨におけるＰＴＨ同化誘発遺伝子」はＰＡＩＧＢと略記される。
「骨ミネラル密度」はＢＭＤと略記される。
「遺伝子特異性プライマー」はＧＳＰと略記される。
「皮下」はｓｃまたはｓ．ｃ．と略記される。
「プロスタグランジンＥ２」はＰＧＥ２と略記される。
「非トランスジェニック」はＮＴＧと略記される。
「異種接合」はＨＥＴと略記される。
この開示に関連して、多くの用語が用いられる。本明細書において用いられる場合、「核酸分子」なる用語は、一本鎖形態、または二重螺旋のいずれかの、リボヌクレオチド（ＲＮＡ分子）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ分子）のリン酸エステル形態、または任意のホスホエステル類似体を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡ螺旋が可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子なる用語は、分子の一次および二次構造を意味し、特定の三次構造に限定されない。したがって、この用語は、特に直線状（例えば、制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体において見いだされる二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の議論において、配列はＤＮＡの転写されていない鎖（すなわち、ｍＲＮＡと配列相同性を有する鎖）にそって５’から３’の方向での配列のみをもたらす常法に従って記載することができる。
「組換え核酸分子」は分子生物学的操作を受けた核酸分子、すなわち、自然に存在しない核酸分子である。さらに、「組換えＤＮＡ分子」なる用語は、自然に存在しないか、または他の方法では別個の２つの配列のセグメントの人工的結合、すなわち、通常、連続していないＤＮＡの断片を結紮することにより調製できる核酸配列を意味する。「組み換えにより産生された」なる用語は、核酸の分離された断片の化学合成手段、または人工的操作、例えば制限酵素、リガーゼを用いた遺伝子操作技術、および例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；（１９８９））、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９８９）、およびＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）ＩＲＥＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５）により記載されている類似の組み換え技術により行われることが多い人工的結合を意味する。これらは通常、典型的には配列認識部位を導入または除去しつつ、同一または保存アミノ酸をコード化する重複コドンとコドンを置換するために行われる。別法として、一般的な天然の形態においては見られない所望の機能の組み合わせを含む一つの遺伝子を生成させるために、所望の機能を有する核酸セグメントを結合させるために行うことができる。制限酵素認識部位は、このような人工的操作の標的であることが多いが、他の部位特異性標的、例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、あるいは他の有用な特性を設計により組み入れることができる。組み換え核酸分子の例としては、組み換えベクター、例えば５’から３’（センス）方向または３’から５’（アンチセンス）方向であるｐｈ１遺伝子タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を含有するクローニングまたは発現ベクターが挙げられる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、核酸、核酸分子、核酸配列、オリゴヌクレオチド、またはその任意のフラグメントは、ＤＮＡおよびＲＮＡにおける一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）を意味し、２以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は典型的には、タンパク質および酵素を調製するための細胞機構により使用される情報をはじめとする遺伝子情報を担持する。これらの用語は、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作されたポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を包含する。これは、一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびに塩基をアミノ酸主鎖と結合させることにより形成される「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を包含する。これはまた、修飾された塩基、例えばチオウラシル、チオグアニンおよびフルオロウラシルを含有するか、または糖質、または脂質を含有する核酸を包含する。
特定のポリヌクレオチドの「アンチセンス」コピーは、ポリヌクレオチドと水素結合でき、従ってポリヌクレオチドの発現を調節できる相補配列を意味する。これらは前記のようなＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体（変更された主鎖を有する類似体を包含する）である。アンチセンスコピーが結合するポリヌクレオチドは、一本鎖形態であっても、二本鎖形態であってもよい。「アンチセンスの方向」にプロモーターと結合したＤＮＡ配列は、標的遺伝子のコーディングｍＲＮＡに対して相補性であるＲＮＡ分子が産生されるようにプロモーターと結合させることができる。
「センス」なる用語は、コーディングｍＲＮＡ核酸配列と同じ方向である核酸の配列を意味する。プロモーターと「センス方向」で結合したＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡと同一の配列を含有するＲＮＡ分子が転写されるように結合される。しかしながら、産生されたＲＮＡ分子は機能的タンパク質中に転写される必要はない。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼによって触媒された転写の結果得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の相補的コピーである場合は、一次転写物を意味するか、または一次転写物の転写後処理から誘導されるＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称する。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンがなく、細胞によりポリペプチド中に翻訳することができるＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートと相補性であり、これから誘導されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは一本鎖または、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖形態に変換できる。「センスＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを包含し、細胞によりポリペプチドに翻訳できるＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部と相補性であり、標的遺伝子の発現をブロックできるＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５、出典明示により本発明の一部として参照される）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定のヌクレオチド配列の任意の部分、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、またはコーディング配列に関してである。「機能的ＲＮＡ」は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが、細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを意味する。
「センス」鎖および「アンチセンス」鎖は同じ文脈で使用される場合、互いに相補性である一本鎖ＰＡＩＧＢポリヌクレオチドを意味する。これらは二本鎖ポリヌクレオチドの相対する鎖であるか、または一方の鎖は一般に承認された塩基ペアリング則に従って他方から予想できる。特に記載しない限り、一方または他方の鎖を「センス」または「アンチセンス」と指定することは任意である。
「ｓｉＲＮＡ」は、干渉を引き起こすことができ、細胞、例えば哺乳動物細胞（ヒト細胞を包含する）および体内、例えば哺乳動物体内（ヒトを包含する）において特定の遺伝子の転写後抑制を引き起こすことができる小さな干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を意味する。ＲＮＡ干渉の現象は、Ｂａｓｓ、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−２９（２００１）；Ｅｌｂａｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−９８（２００１）；およびＦｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−１１（１９９８）に記載され、論議され、干渉ＲＮＡの製造法も議論されている。「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」は二本鎖ＲＮＡを形成し、該二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞において発現される場合に遺伝子または標的遺伝子の発現を軽減または阻害する能力を有する。「ｓｉＲＮＡ」は従って、相補鎖により形成される二本鎖ＲＮＡを意味する。ハイブリッド形成して、二本鎖分子を形成するｓｉＲＮＡの相補部分は、典型的には実質的または完全な同一性を有する。一具体例において、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子と実質的または完全な同一性を有し、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成する核酸を意味する。ｓｉＲＮＡの配列は完全長標的遺伝子、またはその部分配列に対応し得る。
ポリヌクレオチドは、自然の調節（発現制御）配列により側面が接しているか、またはプロモーター、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’−および３’−非コーディング領域などをはじめとするヘテロローガスな配列と結合していてもよい。核酸はまた、当該分野で公知の多くの手段によって修飾できる。このような修飾の非制限的例としては、メチル化、「ｃａｐ」、１以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、およびヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合での修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド、カーバメートなど）および荷電結合での修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、１以上の追加の共有結合した部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）、およびアルキル化剤などを含有することができる。ポリヌクレオチドは、メチルまたはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミデート結合の形成により誘導化することができる。さらに、本発明におけるポリヌクレオチドは、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供できる標識で修飾することもできる。標識の例としては、放射性同位元素、螢光分子、ビオチンなどが挙げられる。
「核酸」または「核酸配列」、「核酸分子」、「核酸フラグメント」または「ポリヌクレオチド」なる用語は、遺伝子、遺伝子によってコード化されたｍＲＮＡおよびｃＤＮＡと交換可能に用いることができる。
「ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド」なる用語は、コーディング配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコーディングまたは非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを含む。
核酸分子は、核酸分子の一本鎖形態が適当な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子とアニールできる場合に、もう一つ別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡと「ハイブリッド形成可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．第１〜３巻（ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ホモローガスな核酸の予備スクリーニングに関して、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件（Ｔｍ５５℃に相当）、例えば５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアルデヒドなし；または３０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを使用できる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、さらに高いＴｍ、例えば４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに相当する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最高Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに相当する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリッド形成するために適当なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補度、当該分野において周知の変数に依存する。２つの核酸配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（さらに高いＴｍに相当）は次の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドよりも大きいハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための等式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．第１〜３巻（ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）、９．５０−９．５１）。さらに短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置がさらに重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．第１−３巻（ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６），１１．７−１１．８）。
「相補性」なる用語は、互いにハイブリッド形成できるヌクレオチド塩基間の関係を記載するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補性であり、シトシンはグアニンと相補性である。
「同一性」または「類似性」は当該分野において公知のように配列を比較することにより決定される２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、同一性はまた、場合によってはかかる配列の鎖間の合致により決定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の配列関連性の程度を意味する。同一性と類似性はどちらも、たとえばＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１などに記載されているような公知方法により容易に計算できる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、これらに限定されるわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））を包含する。
「ホモローガス」とは、２つのポリマー（すなわち、ポリペプチド分子または核酸分子）間の配列類似性の程度を意味する。相同性（％）は本明細書においては２つのポリマー間で可能な最大相同性を反映する、すなわち、２つのポリマーが最大数の合致した（ホモローガスな）位置数を有するように並んでいる場合の相同性（％）を表す。
「相同性（％）」なる用語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を意味する。任意の２つのポリペプチド間の相同性は何れかの配列における所定の位置での合致するアミノ酸の総数の一次関数である。例えば、いずれかの配列におけるアミノ酸の総数の半分が同じであるならば、２つの配列は５０％相同性を示すと言われる。
「フラグメント」、「類似体」、および「誘導体」なる用語は、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６、８、１０）について言及する場合、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類似体は、前駆タンパク質部分を開裂させて活性成熟ポリペプチドを生成させることにより活性化できる前駆タンパク質を包含する。本発明のポリペプチド（例えば配列番号２、４、６、８、１０）のフラグメント、類似体、または誘導体は、１以上のアミノ酸が保存または非保存アミノ酸残基で置換されているものであって、かかるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコード化されてもよいし、されなくてもよいもの、あるいは１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいはポリペプチドの半減期を増大させるためにポリペプチドがポリエチレングリコールなどの化合物と融合しているもの、あるいはさらなるアミノ酸がポリペプチド、例えばシグナルペプチドまたは配列、例えばポリペプチドまたは前駆タンパク質の精製に用いられるポリヒスチジンタグと融合しているものであってもよい。かかるフラグメント、類似体、または誘導体は、本発明の範囲内に含まれると見なされる。
ポリヌクレオチド配列の「保存された」残基は、比較される２以上の関連する配列の同じ位置において変更されていない残基である。比較的保存された残基は、配列のどこか他の場所で現れる残基よりもより関連した配列の中で保存されたものである。
関連するポリヌクレオチドは、かなりの割合の同一の残基を共有するポリヌクレオチドである。
異なるポリヌクレオチドは、あるものが最終的に他のものから誘導されるならば互いに「対応する」。例えば、メッセンジャーＲＮＡは、そこから転写される遺伝子に対応する。ｃＤＮＡは、例えば逆転写反応、またはＲＮＡ配列の情報に基づいたＤＮＡの化学合成によるなど、そこから産生されるＲＮＡに対応する。ポリヌクレオチドはまた、比較される異なる種、株または変異体においてこれらが関連したポリペプチドをコード化するなど類似した働きをする場合にも互いに「対応する」。
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、当該分野において周知の手順により均質になるまで精製することができる。
「単離された」なる用語は、物質がその最初または生来の環境（例えば、天然に存在するならば、自然環境）から取り出されることを意味する。従って、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系において共存する物質の一部または全部から人間の介入により分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。例えば、「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖であり、所望により合成、非天然または変更されたヌクレオチド塩基を含有してもよいＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上の部分からなり、炭水化物、脂質、タンパク質または他の物質と組み合わせられる。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部である、および／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、かかるベクターまたは組成物が、そこにおいて事実上見られない環境の一部でない点で単離されている。同様に、「実質的に精製された」なる用語は、そこにおいて事実上存在する当座の化学的環境から人間の介入により分離または他の方法で除去された物質を意味する。実質的に精製されたポリペプチドまたは核酸は当該分野において一般的に公知の多くの技術または手順の何れかにより得られるか、または生成させることができる。
「実質的に純粋」または「単離された」なる用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと本質的に結合しない物質と該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの混合物を排除するものではない。
「コーディング配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現生成物を「コード化」する配列は、発現されると、その結果、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、または酵素を産生するヌクレオチド配列である。すなわち、ヌクレオチド配列はポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコード化する。
「コーディング縮重」は、コード化されたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくポリヌクレオチド配列の変化を許容する遺伝子コードにおける相違を意味する。従って、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０に記載される本発明のＰＡＩＧＢタンパク質のアミノ酸配列の全部または実質的な部分をコード化する任意の核酸フラグメントに関する。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためにヌクレオチドコドンを使用するために特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」を認識するであろう。従って、宿主細胞における向上された発現のための遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計するのが望ましい。
当業者による配列の手作業での評価によるか、またはコンピューター自動化配列比較およびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴＯも参照）などのアルゴリズムを使用した同定によるかの何れにより、ポリペプチドまたは遺伝子を推定上同定するために十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」。
従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定および／または単離するために十分な配列を含む。本明細書は、１以上の特定のＰＡＩＧＢ変異体をコード化する部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を示唆する。本明細書に報告されている配列の恩恵を受ける当業者は、当業者に公知の目的のために開示された配列の全部または実質的な部分を使用できる。従って、本発明は添付の配列リストに記載されている完全配列、ならびに前記定義のような配列の実質的な部分を含む。
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから構成することができる。これらのビルディングブロックは、結紮され、アニールされて、遺伝子断片を形成し、これを次いで酵素により組み立てて、完全遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列との関連での「化学的に合成された」とは、成分ヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は周知の手順を用いて達成することができるか、または自動化化学合成は多くの商業的に入手可能な機械の一つを用いて行うことができる。従って、遺伝子は宿主細胞のコドンバイアスを反映するためにヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適の遺伝子発現のために調整することができる。当業者は、コドン使用が宿主にとって有利なコドンに偏っているならば、遺伝子発現の成功の可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞から誘導される遺伝子の調査に基づく。
「遺伝子」とは、コーディング配列の先行（５’非コーディング配列）および後続（３’非コーディング配列）の調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味する。「天然の遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する、自然界において見られる遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」または「キメラ構築物」とは、自然界において一緒に見られない調節およびコーディング配列を含む、天然の遺伝子でない任意の遺伝子または構築物を意味する。従って、キメラ遺伝子またはキメラ構築物は、異なる供給源から誘導される調節配列およびコーディング配列、または同じ供給源から誘導されるが、自然界において見いだされるものと異なる方法で配列された調節配列およびコーディング配列を含んでもよい。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおけるその自然の位置の天然の遺伝子を意味する。「外来」遺伝子とは、宿主生物において通常見いだされないが、遺伝子導入により宿主生物中に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランス遺伝子」は、形質転換によりゲノム中に導入された遺伝子である。
「調節配列」とは、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、コーディング配列内、またはコーディング配列の下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むことができる。
「遺伝子調節配列」とは、遺伝子転写を開始するために必要なＤＮＡ配列と開始が起こる速度を調節するために必要な配列を意味する。従って、遺伝子調節配列は、一般的転写ファクターおよびポリメラーゼが組み立てられる場合、プロモーター、およびプロモーターでのこれらのアセンブリープロセスの速度を調節するために遺伝子調節タンパク質が結合する全ての調節配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、および／またはポリアデニル化シグナルを利用することができる。
「プロモーター」とは、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を調節できるヌクレオチド配列を意味する。一般に、コーディング配列はプロモーター配列の３’に位置する。プロモーター配列は近位およびさらに遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称する。従って、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激でき、プロモーターの本来のエレメントまたはプロモーターのレベルまたは組織特異性を向上させるために挿入されたヘテロローガスなエレメントであってもよいヌクレオチド配列である。プロモーターは天然の遺伝子からその全体において誘導することができるか、または天然において見られる異なるプロモーターから誘導される異なるエレメントからなるか、または合成ヌクレオチド断片を含んでもよい。当業者らは、異なるプロモーターが異なる組織または細胞種において、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を行うことができることを理解する。
「骨特異性プロモーター」とは、ＭｃＶｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１，１１１−１１，１１６（１９８８）により記載されているオステオネクチンプロモーターまたはＢＭＰなどのプロモーターを意味する。
「３’非コーディング配列」とは、コーディング配列の下流に位置するヌクレオチド配列を意味し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコード化する他の配列を包含する。ポリアデニル化シグナルは通常、ポリアデニル酸トラクトのｍＲＮＡ前駆体の３’末端への添加に影響を及ぼすことにより特徴づけられる。
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列の間に位置するヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全に処理されたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
「操作可能に結合した」なる用語は、一方の機能が他により影響を受けるような単一の核酸フラグメント上の２以上の核酸フラグメントの結合を意味する。例えば、プロモーターはコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コーディング配列がプロモーターの転写調節下にある）場合に、コーディング配列と操作可能に結合する。コーディング配列はセンスまたはアンチセンス方向で調節配列と操作可能に結合できる。
「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼにより触媒された転写の結果から得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補コピーである場合、一次転写物と称するか、または一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称する。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが無く、ポリペプチドに翻訳することができるＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補性であり、ｍＲＮＡから誘導される二本鎖ＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によりポリペプチドに翻訳することができるＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補性であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号（出典明示により本発明の一部とする）参照）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定のヌクレオチド配列の一部に関して、すなわち、５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロン、またはコーディング配列に関してであってよい。「機能的ＲＮＡ」とは、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳することができないが、それでも細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを意味する。
「発現」なる用語は、本発明の核酸フラグメントから誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの翻訳および安定な蓄積を意味する。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も意味する。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。
「過剰発現」とは、通常または非形質転換生物における産生のレベルを超える生物における遺伝子産物の産生を意味する。「同時抑制」とは、同一または実質的に類似した外来または内因性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する（米国特許第５２３１０２０号（本発明の一部とする）参照）。
「変更されたレベル」とは、通常または非形質転換生物のものと異なる量または割合での生物における遺伝子産物の産生を意味する。本発明のポリペプチドの過剰発現は、まず、コーディング領域が、発生の所望の段階で所望の組織において遺伝子または構築物の発現を行うことができるプロモーターと操作可能に結合したキメラ遺伝子またはキメラ構築物を構築することにより行うことができる。利便性の理由から、キメラ遺伝子またはキメラ構築物は同じ遺伝子から誘導されるプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含むことができる。転写停止シグナルをコード化する３’非コーディング配列も提供することができる。本キメラ遺伝子またはキメラ構築物は遺伝子発現を促進するために１以上のイントロンを含むこともできる。本キメラ遺伝子またはキメラ構築物を含むプラスミドベクターを次いで構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。当業者は、キメラ遺伝子またはキメラ構築物を含有する宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるために、遺伝子エレメントがプラスミドベクター上に存在しなければならないことを認識する。当業者は、異なる独立した形質転換事象の結果、異なるレベルおよびパターンの発現が得られ（Ｊｏｎｅｓら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１２４１８；ＤｅＡｌｍｅｉｄａら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８８６）、従って、所望の発現レベルおよびパターンを示す系を得るために、複数の事象をスクリーンしなければならないことも認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析により行うことができる。
「カセット」とは、所定の制限部位でベクター中に挿入することができる発現産物についてコードするＤＮＡコーディング配列またはＤＮＡの断片を意味する。カセット制限部位は、適当なリーディングフレーム中へのカセットの挿入を確実にするために設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位で挿入され、次いでベクターにより伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞中へ運ばれる。発現ベクターなどのＤＮＡが挿入または付加されたＤＮＡの断片または配列も、「ＤＮＡ構築物」と呼ぶことができる。
本明細書において用いられる場合、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は交換可能に用いることができる。これらの用語は全て、その後の世代の何れかおよび全部であるその子孫を包含する。全ての子孫は、故意または故意でない突然変異のために同一でなくてもよいと理解される。ヘテロローガスな核酸配列の発現に関して、「宿主細胞」とは、インビトロであろうと、インビボであろうと、原核または真核細胞（例えば、イー・コリなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞、および昆虫細胞）を意味する。例えば、宿主細胞はトランスジェニック動物中に位置してもよい。宿主細胞はベクターのレシピエントとして使用することができ、ベクターの複製および／またはベクターによりコード化されるヘテロローガスな核酸の発現が可能な任意の形質転換可能な生物を含んでもよい。
「クローン」とは、単一の細胞または共通の祖先から有糸分列により誘導される細胞の集団を意味する。
「発現系」なる用語は、宿主細胞および、例えばベクターにより運ばれる外来ＤＮＡによりコードされ、宿主細胞中に導入されるタンパク質の発現などの適当な条件下で適合性のベクターを意味する。一般的な発現系としては、これらに限定されるわけではないが、イー・コリ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバクロウイルスベクター、および哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
「修飾された表現型」なる用語は、環境因子の特定の組み合わせの下で宿主細胞により示される物理的または生化学的特性の形態、特徴、または強度における変化を意味する。表現型は、これらに限定されるわけではないが、温度、ある分子への暴露、または細胞外分子（例えばホルモン）、または別の細胞によるシグナル化をはじめとする任意の数の環境因子に反応して所定の宿主細胞により示される。ある具体例において、所定のあらかじめ決められた表現型、および該表現型の任意の修飾は所定の宿主細胞において自然に起こるものであってよい。別の具体例において、宿主細胞は、さらに容易に検出可能な表現型が、興味のある転写経路中に置換されるように操作される。例えば、レポーター遺伝子は、興味のある細胞調節経路においてプロモーターとの操作可能な結合中に挿入できる。いずれかの場合において、興味のある表現型、および意図される該表現型の任意の修飾は、「あらかじめ決められている」、すなわち、これらは公知であり、よく特徴づけられており、本発明のそのレギュレーター分子をスクリーンおよび／または選択するために用いられる宿主細胞において容易に検出可能である。
「形質転換」とは、核酸フラグメントを宿主生物のゲノム中に導入し、その結果、遺伝子的に安定な遺伝形質が得られることを意味する。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と称する。
「遺伝子誘発可能な系」なる用語は、遺伝子発現を調節するためのリガンドの使用を意味する。遺伝子発現を誘発するために小分子を利用するいくつかの調節系が開発されているＣｌａｃｋｓｏｎ Ｔ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９７；１：２１０−２１８；Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ Ｍ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：７４３−７５５に論評）。遺伝子誘発可能な系は、該系が活性化されない場合には標的遺伝子の低い発現から検出できない基礎発現、系が活性化される場合には増大した標的遺伝子の発現レベルを許容する分子手段である。
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理されたポリペプチド；すなわち、一次翻訳産物において存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているものを意味する。「前駆」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物；すなわちプレペプチドおよびプロペプチドが依然として存在しているものを意味する。プレペプチドおよびプロペプチドは、これらに限定されないが、細胞内局在化シグナルを包含する。
本発明のポリペプチドはさらに、対立遺伝子形態およびスプライス変異体を包含する前記ポリペプチドの変異体も包含する。かかるポリペプチドは、保存的または非保存的、またはその任意の組み合わせである挿入、欠失、および置換により参照ペプチドから変化する。「変異体」なる用語は、一つの「変異体」または「複数の変異体」を意味し、ＰＡＩＧＢ分子の核酸またはアミノ酸配列の変形物を意味する。「変異体」なる用語には、ＰＡＩＧＢ分子のヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加、または欠失が含まれる。さらに、「変異体」なる用語には、化学的に修飾された天然および合成のＰＡＩＧＢ分子が含まれる。例えば、変異体はそれぞれ参照ポリペプチドから異なるポリペプチドを意味する。一般に、参照ポリペプチドからアミノ酸配列が異なるポリペプチドと参照ポリペプチド間の差異は、参照および変異体のアミノ酸配列が全体的に非常に類似し、ある領域においては同一であるように制限される。変異体および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在する、保存的または非保存的である１以上の置換、欠失、付加、融合および切断によりアミノ酸配列が異なる。例えば、変異体は、いくつか、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１のアミノ酸が任意の組み合わせで挿入、置換、または欠失しているものであってもよい。さらに、変異体は、末端または内部欠失によるなど、参照配列より短いことにより、参照ポリペプチド配列と異なる本発明のポリペプチドのフラグメントであってもよい。本発明のポリペプチドの変異体はさらに、活性な成熟ポリペプチドを産生するために前駆部分の開裂により活性化できる前駆タンパク質などのかかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドも包含する。これらの変異体は、タンパク質をコード化する構造遺伝子のヌクレオチド配列における差異により特徴づけられる対立遺伝子変異体であるか、または差次的スプライシングまたは翻訳後修飾を含んでもよい。変異体はさらに、本質的に同じ生物学的活性を有するが、異なる種から得られる関連するタンパク質も含む。
当業者は、一つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付加、または交換を有する変異体を産生できる。これらの変異体は、特に：（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されたもの（このような置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによりコード化されるものであっても、なくてもよい）、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸がポリペプチドまたはタンパク質に付加されている物、または（ｉｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｖ）成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増大させる化合物（例えばポリエチレングリコール）に融合されているもの、または（ｖ）追加のアミノ酸が成熟ポリペプチド、例えばリーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドまたは前駆タンパク質配列の精製に用いられる配列と融合されているものを包含する。ポリペプチドの変異体はまた、天然に存在する変異体、例えば天然に存在する対立遺伝子変異体であってもよく、あるいは天然に存在しないと思われている変異体であってもよい。この点においてポリペプチド変異体には、アミノ酸置換、欠失または付加により前記ポリペプチドと異なる変異体がある。置換、欠失または付加は１以上のアミノ酸を含み得る。アミノ酸配列における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加であっても良い。前記定義のこのような変異体すべては本明細書における示唆および当該技術から当業者の想定内であると見なされる。
本発明のポリペプチドは、すべての対立遺伝子形態およびスプライス変異体を包含する前記ポリペプチドの変異体を包含する。ＰＡＩＧＢ（配列番号５または９）核酸配列から誘導されるスプライス変異体も本発明に含まれる。スプライス変異体とは、ゲノムＤＮＡの一次転写物の差次的プロセッシングにより産生され、その結果、１種以上のｍＲＮＡが産生される変異体ＰＡＩＧＢ核酸およびポリペプチドを意味する。差次的に処理されたＤＮＡから誘導されるｃＤＮＡは完全なアミノ酸同一性の領域および異なるアミノ酸配列を有する領域を有するＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化する。別のＲＮＡスプライシングは、一般にイントロンを除去するために一次ＲＮＡ転写がスプライシングを受ける場合に起こり、その結果、そのそれぞれが異なるアミノ酸配列をコード化し得る１以上のｍＲＮＡ分子が産生される。従って、同じゲノム配列は複数の関連したｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に至る。結果として得られるｍＲＮＡおよびタンパク質はどちらも本明細書において「スプライス変異体」と称する。スプライス変異体は、一つの組織タイプ内または組織間において見出すことができる（組織特異性変異体）。
スプライス変異体は、例えば、本明細書において開示されたＰＡＩＧＢの任意の配列（配列番号５、６、９、または１０）を含むことができる。スプライス変異体はさらに、当業者により決定できるＰＡＩＧＢのイントロン／エクソンの他の組み合わせも含み得る。スプライス変異体は、実験的に、例えば、細胞ＲＮＡを単離し、分析（たとえば、サザンブロッティングまたはＰＣＲ）することにより、あるいはＰＡＩＧＢ関連核酸プローブまたは本明細書に記載されたプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより決定することができる。別の方法において、スプライス変異体は、様々な方法、コンピュータープログラム、または当業者が入手可能なコンピューターシステムを用いて予想することができる。
変異体なる用語は、たとえば配列番号１、３、５、７、および９などの本発明のヌクレオチド配列からその配列が異なるポリヌクレオチドも意味する。ポリヌクレオチド配列相違は、突然変異変化、たとえば１以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加の結果生じ得る。これらの変化のそれぞれは、単独、または組み合わせにおいて、所定の配列において１回以上起こり得る。
「突然変異タンパク質」とは、たとえば、部位特異性突然変異誘発または他の操作、転写または翻訳における誤差により起こるアミノ酸配列における小さな変化を有するか；または合理的デザインにより合成により調製されるＰＡＩＧＢタンパク質またはポリペプチドを意味する。これらの小さな変更の結果、タンパク質またはポリペプチドの生物学的活性が、野生型または天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質と比較して変更されているアミノ酸配列が得られる。
「ＰＡＩＧＢ分子」とは、ＰＡＩＧＢポリペプチド、ＰＡＩＧＢペプチド、そのフラグメントまたは変異体またはＰＡＩＧＢペプチド、およびＰＡＩＧＢポリペプチド、ＰＡＩＧＢペプチド、そのフラグメントまたは変異体をコード化する核酸を意味する。「ＰＡＩＧＢ分子」はまた、ＰＡＩＧＢポリヌクレオチド、遺伝子およびその変異体も意味する。
ＰＡＩＧＢ ＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリヌクレオチドの「類似体」とは、形態および／または機能（たとえば相補ポリヌクレオチド配列上の塩基対との配列特異性水素に関与する能力）において天然に存在するポリヌクレオチドと類似しているが、たとえば、通常でないかまたは非天然の塩基または変更された主鎖を保持する点でＤＮＡまたはＲＮＡと異なる分子を意味する。たとえば、Ｕｈｌｍａｎｎら、０９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ９０：５４３−５８４参照。
「調節」なる用語は、機能の抑制、向上、または誘発を意味する。たとえば、遺伝子発現の「調節」または「制御」とは、遺伝子の活性における変化を意味する。発現の調節は、これらに限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子退化を含み得る。
「調節」または「制御」は、方法、状態、またはタンパク質、酵素、阻害剤、シグナルトランスデューサー、レセプター、転写アクチベーター、コファクターなどの生物学的活性を増大または減少させる物質も意味する。活性におけるこの変化は、ｍＲＮＡ翻訳、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ転写、および／またはｍＲＮＡまたはタンパク質分解の増大または減少であり得、これは次いで生物学的活性の増大または減少に対応する。このような向上または阻害は、特定の事象、たとえば、シグナル変換経路の活性化の発生に左右される、および／または特定の細胞型においてのみ明らかになる。モジュレーターは任意の化合物、たとえば、抗体、小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、好ましくは小分子またはペプチドを含むことを意図される。
「調節された活性」とは、たとえばタンパク質の生物学的活性な形態により調節された任意の活性、状態、疾患または表現型を意味する。調節は、たとえば、発現または分解の調節、あるいは、たとえば阻害、結合、または基質の放出よる直接作用または拮抗効果、化学的または構造的のいずれかの修飾、あるいはさらなる因子を含む直接または間接的相互作用により生物学的に活性なタンパク質の濃度に影響を及ぼすことにより行うことができる。
「化合物」、「医薬」、「医薬的に活性な薬剤」、「活性剤」、「薬剤」、「組成物」または「薬品」なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、被験者（人間または動物）に投与された場合に局所および／または全身性作用により所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する化合物または組成物を意味する。本発明における薬剤は、ＰＡＩＧＢ分子を誘発でき、ＰＴＨ同化効果を含有することができる。
「医薬的に許容される担体」なる用語は、医薬担体、たとえばリン酸塩緩衝塩溶液、水、およびエマルジョン、たとえば油／水または水／油エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤のいずれかを包含する。組成物はさらに、安定剤および保存料を含むことができる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，第５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ０９７５）参照。
「医薬的に許容される塩」なる用語は、無機塩、および有機塩をはじめとする、医薬的に許容される非毒性酸から調製される塩を意味する。適当な非有機塩は、これらに限定されるわけではないが、無機および有機酸、たとえば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩化水素酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などを含む。
「断続的」投与、注射または治療とは、投与間、または結果が評価されるまでの期間をともなって、これらを含有する化合物または組成物を被験者に散発的に提供することを意味する。たとえば、化合物または組成物が投与される任意の２日の間に１日の間隔、３日の間隔、または５日の間隔があるか、あるいは一回量のみが投与されるか、あるいは結果が評価されるまで投与後一定期間がある。すなわち、１日に複数の投薬（または１回のみ）を行うことができるが、翌日には投薬しなくてもよい。あるいは、投薬が毎日ベースであるならば、結果が評価されるまで間隔をあけてもよい。治療を施す時間枠は、初回治療と結果の評価の間の時間により測定することができる。断続的投与の多くのバリエーションは当業者には明らかであろう；本発明はこのようなバリエーションを包含することを意図される。
本明細書において用いられる場合、「治療」なる用語は、薬剤（たとえば、治療薬または治療組成物）の被験者への適用または投与、あるいは薬剤の被験者への適用または投与、あるいは疾患、疾患の症状または疾患にかかりやすい傾向の治療、治癒、軽減、緩和、変更、治療、改善、向上または影響を目的として、疾患、疾患の症状を有するかまたは疾患にかかりやすい傾向を有する患者から単離された組織または細胞系として定義される。「治療薬」なる用語は、たとえば骨関連障害などの疾患の治療において助けとなる任意の分子、化合物または治療を意味する。従って、治療剤は、これらに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明の組成物は、特定の疾患、たとえば骨関連障害などの症状を防止および／または軽減する医薬的に許容される形態において化合物を含むこともできる。本発明の治療組成物は、任意の適当な形態において提供されると考えられる。組成物の形態は、投与様式をはじめとする多くの因子に依存する。組成物は、いくつかの成分のなかでも特に希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を含むことができる。
骨強度は、骨密度（ミネラル（グラム）／体積（ｃｍ３））および骨の質（鉱化作用、骨の構造、骨のターンオーバー、微細構造）により決定することができる。骨強度の尺度として、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が通常用いられる。たとえば、そのＢＭＤが若い白人成人女性のＢＭＤの平均より下、標準誤差２．５を超えるならば、骨は骨粗鬆症であると断言できる（世界保健機構、１９９４、Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｒａｃｔｕｒｅ Ｒｉｓｋ ａｎｄ ｉｔ’ｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ ８４３．Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）。
「ＰＴＨ」なる用語は、副甲状腺ホルモンまたはその誘導体を意味する。本発明において用いられる副甲状腺ホルモンは、たとえば天然の種類のＰＴＨ、遺伝子操作技術により産生されるＰＴＨ、または化学的に合成されたＰＴＨなどの様々な形態において存在し得る。ヒトＰＴＨ（１−８４）は８４のアミノ酸残基からなる。ＰＴＨ誘導体の例は、前記定義のＰＴＨの部分ペプチド、他のアミノ酸により部分的に置換されていてもよいその部分ペプチドのＰＴＨの構成アミノ酸、部分的に除去されていてもよいＰＴＨの構成アミノ酸またはその部分ペプチド、ならびに少なくともＰＴＨに付加されたアミノ酸を有するペプチドまたはその部分ペプチドであり；ＰＴＨ誘導体としてのペプチドはＰＴＨそれ自体と類似した活性を有し得る。ＰＴＨの部分ペプチドの例としては、ヒトＰＴＨ（１−３４）、ヒトＰＴＨ（１−６４）、ヒトＰＴＨ（３５−８４）およびウシＰＴＨ（１−３４）が挙げられる。ヒトＰＴＨ（１−３４）はＰＴＨのＮ末端から数えると３４アミノ酸からなるＰＴＨである。ｈＰＴＨはヒトＰＴＨを意味する。
「ＰＴＨ反応性遺伝子」とは、その発現がＰＴＨにより影響を受けることができる遺伝子を意味する。
「骨関連障害または疾患」とは、骨形成障害、骨再吸収障害および／または骨密度障害を意味する。骨関連障害の例としては、これらに限定されるわけではないが、当業者に公知の骨折または非骨折関連状態（本明細書に記載の組成物に対して治療的に反応する）、変性骨障害、神経変性、筋変性、骨変性、骨減少症、骨癌、関節炎、くる病、骨折、歯周病、骨分節欠損、溶骨性骨疾患、一次および二次上皮小体機能高進症、パジェット病、骨軟化症、骨増殖症、および骨粗鬆症が挙げられる。
「骨関連剤」とは、骨代謝、たとえば骨形成または骨崩壊活性または両者に影響を及ぼす薬剤を意味する。「骨関連剤」は、同化または異化効果を誘発するか、骨再吸収を阻害してＢＭＤを増大させるか、または骨形成と骨再吸収間のバランスを維持することができる。
骨形成活性は、骨芽細胞活性の増大、骨先祖細胞からの骨芽分化、および骨芽細胞増殖の増大、骨芽細胞アポトーシスの減少およびその任意の組み合わせにより誘発することができる。加えて、「骨形成活性」とは、骨再吸収の減少または新規骨形成の増大または両者の組み合わせを意味する。骨形成活性は、様々な骨組織または細胞において誘発することができる。
「骨同化剤」とは、骨形成活性を誘発または増大させる薬剤、たとえば副甲状腺ホルモンを意味する。
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ））およびそのシグナル化システムは成人骨格における骨再形成の主なレギュレーターである（ＭａｓｉｕｋｉｅｗｉｃｚおよびＩｎｓｏｇｎａ（１９９８）Ａｇｉｎｇ１０：２３２−２３９；ＭｉｅｒｋｅおよびＰｅｌｌｅｇｒｉｎｉ（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ５：２１−３６）。血流内のカルシウムの恒常性において重大な役割を有し、ＰＴＨの急性インビボ効果は骨再吸収を増大させることであるが、その循環レベルが持続的に増大することにより、骨形成および再吸収のどちらも加速される。ＰＴＨシグナル化経路は、骨形成中の軟骨形成の調節にも関与する（Ｖｏｒｔｋａｍｐら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：６１３−６２２；Ｌａｎｓｋｅら（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０４：３９９−４０７）。「ＰＴＨシグナル化経路」とは、ＰＴＨがＰＫＣまたはＰＫＡ経路などに関与する任意の経路を意味する。骨細胞におけるＰＴＨによるこれらの経路の活性化は、当業者に公知の様々な方法により測定できる多くの生物学的反応を調節する。測定できるこれらの活性のいくつかは、これらに限定されないが、ｃＡＭＰの誘発、イノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）の誘発、細胞内遊離Ｃａ＋２の誘発および多くのレポーター遺伝子の遺伝子転写の調節を含む（Ｓｗａｒｔｈｏｕｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｇｅｎｅ ２８２：１−１７ ２００２において論評）。
「骨組織」とは、石灰化組織（たとえば、頭蓋冠、脛骨、大腿、脊椎、歯）、骨梁、骨梁以外の空洞である骨髄腔、骨梁の外周および骨髄腔を覆う皮質骨などを意味する。骨組織はまた、一般に鉱化コラーゲンのマトリックス内に位置する骨細胞；骨細胞に栄養を提供する血管；骨髄穿刺液、滑液、骨組織から誘導される骨細胞を意味し；脂肪骨髄を含み得る。骨組織は、全骨、全骨の部分、骨チップ、骨粉、骨組織バイオプシー、コラーゲン調製物、またはその混合物などの骨生成物を包含する。本発明の目的に関して、「骨組織」なる用語は、特に記載しない限り、ヒトまたは動物であるかによらず、前記骨組織および生成物のすべてを包含するために用いられる。
「生物学的サンプル」なる用語は、任意の細胞、組織、生物学的液体、組織、多細胞生物などを含むように広範囲に定義される。生物学的サンプルは、たとえばインビトロの細胞または組織培養物から誘導することができる。あるいは、生物学的サンプルは生きている生物または単細胞生物の集団から誘導することができる。生物学的サンプルは生きている組織、たとえば生きている骨であってもよい。「生物学的サンプル」なる用語は、被験者から単離された、細胞、組織、生物学的液体、ならびに被験者内に存在するサンプルを包含することを意図される。すなわち、本発明の検出法は、インビトロならびにインビボで生物学的サンプル中のＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。たとえば、ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＰＡＩＧＢタンパク質を検出するためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法を包含する。ＰＡＩＧＢゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを包含する。さらに、ＰＡＩＧＢタンパク質を検出するためのインビボ技術は、被験者中に標識された抗ＰＡＩＧＢ抗体を導入することを包含する。たとえば、被験者におけるその存在が標準的イメージ化技術により検出できる放射性マーカーで抗体を標識することができる。
「抗体」は、これに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、霊長類化ＴＭ抗体を包含することを意味する。「抗体」なる用語は、好ましくは、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメント、およびＰＡＩＢＧタンパク質およびそのフラグメントまたはＰＡＩＧＢ領域またはその部分からの核酸配列と結合できるその免疫学的結合等価物を意味する。抗体なる用語は、均一分子、または複数の異なる分子から構成される血清生成物などの混合物の両方を意味するために用いられる。タンパク質は、タンパク質合成器において合成により調製することができ、担体分子とカップリングされ、数ヶ月にわたってウサギに注射される。ウサギ血清をＰＡＩＧＢタンパク質またはそのフラグメントに対する免疫活性について試験する。モノクローナル抗体は、マウスにタンパク質またはそのフラグメントを注射することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡによりスクリーンされ、ＰＡＩＧＢタンパク質またはそのフラグメントについての特異的免疫活性について試験される。Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）。
「試験サンプル」とは、興味のある対象から得られる生物学的サンプルを意味する。たとえば、試験サンプルは細胞サンプル、または組織サンプルであることができる。「試験サンプル」および「生物学的サンプル」は本明細書においては交換可能に用いられる。
一具体例において、生物学的サンプルは試験対象から得られるタンパク質分子を含有する。あるいは、生物学的サンプルは試験対象から得られるｍＲＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子を含有することができる。生物学的サンプルは対象から慣例の手段により単離される骨サンプルであってもよい。
もう一つ別の具体例において、方法はさらに、対照被験者から対照生物学的サンプルを得、ＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生物学的サンプルにおいて検出されるようにＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または薬剤と対照サンプルを接触させ、対照サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。
「試験化合物（本明細書において「試験剤」と交換可能に使用）は、生物学的プロセスまたは特異的結合容量の推定上の調節などの少なくとも一つの活性について本発明の少なくとも一つの方法により試験される化合物、組成物または抽出物を意味する。
「試験化合物」は被験者に対する影響を決定する目的で被験者に投与することができる。試験化合物は純粋な調製物として、または１以上の他の分子との混合物として投与することができる。たとえば、試験化合物は、有機溶媒、たとえばＤＭＳＯまたはエタノール；または水性溶媒、たとえば水、または緩衝水性溶液；または食物などの該化合物の被験者による吸収を促進する物質と組み合わせるか、該物質中に溶解させることができる。
「試験化合物」は、特定の生化学的システムに影響を及ぼすその能力についてスクリーンされる化合物または化合物の集合を意味する。試験化合物は、化合物、化合物の混合物、たとえば多糖類、小有機または無機分子、またはその任意の組み合わせ；生物学的巨大分子、たとえばペプチド、タンパク質、核酸、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせ、アンチセンス分子またはリボザイム；または細菌、植物、真菌、または動物細胞または組織、天然に存在するかまたは合成の組成物、抗体またはそのフラグメントまたは活性なフラグメントなどの生物学的物質から調製される抽出物をはじめとする様々な異なる化合物を包含する。核酸分子を含む試験化合物は、ベクター、たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム、プラスミドにおいて、またはリポフェクション剤とともに提供することができる。試験化合物は、一旦同定されると、標的の作用物質、拮抗物質、部分作用物質または逆作用物質であり得る。実施される特定の具体例に応じて、試験化合物、たとえば注射するか、溶液中に遊離させるなどで提供されるか、または所望により担体、またはビーズなどの固体支持体と結合させてもよい。多くの適当な固体支持体が試験化合物の固定化に用いられる。適当な固体支持体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとして商業的に利用可能）、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、濾紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ガラスビーズ、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが挙げられる。さらに、本明細書に記載する方法に関して、試験化合物は個々に、またはグループでスクリーンすることができる。
本発明はさらに、生物学的サンプルにおけるＰＡＩＧＢ分子の存在を検出するためのキットに関する。たとえば、キットは、生物学的サンプル中のＰＡＩＧＢポリペプチドまたはｍＲＮＡを検出できる標識された化合物または薬剤；サンプル中のＰＡＩＧＢの量を決定するための手段；および試験サンプル中のＰＡＩＧＢの量を標準と比較するための手段を含むことができる。化合物または薬剤は、適当な容器中に包装することができる。キットはさらに、ＰＡＩＧＢポリペプチドまたは核酸を検出するためにキットを使用するための使用説明書を含むことができる。
本発明はさらに、本発明の核酸分子、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞を含むベクター、および組み換え技術による本発明のポリペプチドの産生法に関する。
核酸分子：
本発明の核酸フラグメントは、同じまたは他の種からｃＤＮＡまたは遺伝子を単離するために使用できる。配列に依存したプロトコルを使用したホモローガスな遺伝子の単離は、当該分野において周知であり、これらに限定されないが、核酸ハイブリダイゼーション、およびＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応を包含する。特に、本発明のポリヌクレオチドは、骨分化中に調節される遺伝子を同定するために使用できる。たとえば、ＰＡＩＧＢは当該分野において公知の方法により（たとえば、アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ技術を導入することによる）減少調節することができ、この減少調節の分化関連遺伝子に対する影響は、骨合成またはＰＴＨシグナル化経路のＰＴＨ誘発における遺伝子の位置を示す。
一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を公知タンパク質または遺伝子に対してホモローガスであると推定上確認するために１０以上の連続したアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列を使用できる。たとえば、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０の連続したヌクレオチドを含む遺伝子特異性オリゴヌクレオチドプローブを遺伝子同定（たとえば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（たとえば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列に依存した方法において用いることができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおいて増幅プライマーとして使用できる。
さらに、本発明と類似したポリペプチドをコード化する遺伝子は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのいずれかとして、当業者に周知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ．Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（全体にわたって、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」と称する））を用いて、ＤＮＡハイブリダイゼーションローブとして本発明の核酸フラグメントの全部または一部を使用することにより直接単離し、細菌、哺乳動物細胞、λファージなどの任意の所望の供給源からライブラリーをスクリーンすることができる。さらに、当業者に公知の方法、たとえばランダムプライマーＤＮＡ標識、または末端標識技術、ニック翻訳、または入手可能なインビトロ転写システムにおけるＲＮＡプローブなどにより、ＤＮＡプローブを合成するために全配列を直接使用できる。加えて、本配列の一部または完全長を増幅するために特定のプライマーを設計し、使用できる。結果として得られる増幅生成物を、増幅反応中に直接標識するか、または増幅反応後に標識し、適当なストリンジェンシーの条件下で完全長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを単離するためにプローブとして使用できる。
本発明のヌクレオチド配列の２つの短い断片を、ＤＮＡまたはＲＮＡからホモローガスな遺伝子をコード化するさらに長い核酸フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて用いることができる。あるいは、第二のプライマー配列はクローニングベクターから誘導される配列に基づくことができる。たとえば、当業者は、転写物における１点と３’または５’末端間の領域のコピーを増幅するためにＰＣＲを用いることによりｃＤＮＡを生成させるためのＲＡＣＥプロトコルに従うことができる。３’および５’方向に配列されたプライマーは、本発明の配列から設計することができる。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（ＢＲＬ）を使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Ｏｈａｒａら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８６：５６７３；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：２１７）。
ＰＣＲタイプの増幅技術において、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補性でない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の有効かつ信頼できる複製を提供するために設計できる。ＰＣＲプライマー設計の方法は、当該分野において一般的であり、周知である（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ １２ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（１９８６）ｐｐ．３３−５０、−ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ（編）ＭＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（１９９３）１５：３１−３９）。別法として、本配列は相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として使用することができる。核酸ハイブリダイゼーションの基本成分は、プローブ、興味のある遺伝子または遺伝子フラグメントを含有すると思われるサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には検出される核酸配列と相補性である一本酸核酸配列である。プローブは検出される核酸配列（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）と「ハイブリッド形成可能」である。プローブの長さは、５塩基から数万塩基まで変化することができ、長さは行われる特定の試験に依存する。プローブ分子の一部のみが検出される核酸配列と相補性である必要がある。加えて、プローブと標的配列間の相補性は、完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全に相補性の分子間で起こり、その結果、ハイブリッド形成された領域における塩基のあるフラクションは適切な相補性塩基と対合しない。
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、複製コピーが、１以上のプライマー、および重合の触媒、例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ、および特に熱安定性ポリメラーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドからなる反応である。
一般に、ＰＣＲは３つの工程：すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーが増幅されるポリヌクレオチドと二本鎖を形成できるように温度が調節される「アニーリング」；二本鎖を形成したオリゴヌクレオチドが、テンプレートとして二本鎖を形成したポリヌクレオチドを使用してＤＮＡポリメラーゼで伸長される「伸長」；およびポリヌクレオチドおよび伸長されたオリゴヌクレオチドが分離するように温度が調節される「融解」を繰り返し形成することを含むことができる。サイクルは次いで、所望の量の増幅されたポリヌクレオチドが得られるまで繰り返される。ＰＣＲの方法は、米国特許第４，６８３，１９５ 号（Ｍｕｌｌｉｓ）および米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）に示唆されている。遺伝子内の要素は、これらに限定されるわけではないが、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー結合領域、転写開始部位、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、タンパク質コード化領域、イントロンおよびエクソン、および転写および翻訳の終止部位をふくむ。
ハイブリダイゼーション法は当該分野において周知である（Ｍａｎｉａｔｉｓ、特に第１１章および表１１．１）。典型的には、核酸ハイブリダイゼーションが可能な条件下でプローブおよびサンプルを混合する。これは、プローブおよびサンプルを無機または有機塩の存在下、適当な温度およびイオン強度条件下で接触させることを含む。プローブとサンプル核酸を、プローブとサンプル核酸間の任意の可能なハイブリダイゼーションが起こり得るために十分な時間接触させる。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが起こるために必要な時間を決定する。プローブまたは標的の濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーション・インキュベーション時間は短くなる。所望により、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤は室温での短いオリゴヌクレオチドプローブの感受性でストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１，９：５１４３−５１５１）。適当なカオトロピック剤としては、グアニジニウム、塩化物、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムなどが挙げられる。典型的には、カオトロピック剤は最終濃度約３Ｍで存在する。望ましいならば、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加することができる。
様々なハイブリダイゼーション溶液を使用できる。典型的には、これらは約２０〜６０体積％、すなわち、好ましくは３０％の極性溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲は約６〜９である）、約０．０５〜０．２％の界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンを含む。典型的なハイブリダイゼーション溶液中には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識担体核酸、フラグメント化核ＤＮＡ、例えば子牛胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および所望により約０．５〜２％ｗ／ｖのグリシンも含まれる。他の添加剤、例えば様々な極性水溶性または膨性剤、例えばポリエチレングリコール、アニオン性サッカライドポリマー、例えば硫酸デキストランおよびアニオン性ポリマー、たとえばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートを含む体積排除剤なども含まれる。
核酸ハイブリダイゼーションを様々な検定様式に適応させることができる。最も適当な内の一つはサンドイッチ検定様式である。サンドイッチ検定は、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適合性である。サンドイッチタイプの検定の主成分は固体支持体である。固体支持体は、これに吸着されるか、またはこれに共有結合し、標識されておらず、配列の一部分に対して相補性で核酸プローブを固定化する。
本発明は特にストリンジェントな条件下で本明細書に記載されるＰＡＩＧＢコーディング配列およびその相補性配列とハイブリッド形成する核酸配列に関する。本発明の目的に関して、「ストリンジェントな条件」なる用語は、核酸配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。従って、本発明は添付の配列リストにおいて記載されているような完全配列に対して相補性である単離された核フラグメント、ならびにかかる配列と少なくとも９０％同一であるもの、および前記ポリヌクレオチドと相補性である配列を有するポリヌクレオチドも含む。本明細書に記載されるＰＡＩＧＢコーディング配列の相補体とハイブリッド形成する本発明のポリヌクレオチドは好ましくは、配列番号１、３、５、７および９のｃＤＮＡによりコード化されるＰＡＩＧＢポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコード化する。
いくつかの用途については、本発明のポリペプチドをコード化する遺伝子の発現を減少または排除するのが望ましい場合もある。これを達成するために、本発明のポリペプチドの同時抑制のために設計されたキメラ遺伝子またはキメラ構築物を、ポリペプチドをコード化する遺伝子または遺伝子フラグメントをプロモーター配列と結合させることにより構築することができる。別法として、本発明の核酸フラグメントの全部または一部についてアンチセンスＲＮＡを発現するために設計されたキメラ遺伝子またはキメラ構築物は、逆方向の遺伝子または遺伝子フラグメントをプロモーター配列と結合させることにより構築することができる。同時抑制またはアンチセンスキメラ遺伝子のいずれかを形質転換により所望の細胞中に導入することができ、ここにおいて内因性遺伝子は減少または排除される。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態であってもよく、該ＤＮＡはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖であるならば、これはコーディング鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であってもよい。コーディング配列は配列番号１、３、５、７、９のコーディング配列と同一であってもよいし、あるいは遺伝子コードの縮重または過剰の結果、コーディング配列が同じポリペプチドに関してコード化する異なるコーディング配列であってもよい。
本発明はさらに、配列番号５および９の推定アミノ酸により特徴づけられるポリヌクレオチドのフラグメント、類似体、および誘導体をコード化する前記ポリヌクレオチドの変異体も包含する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体であってもよいし、あるいはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１および９のＤＮＡ配列により特徴づけられるコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有することができる。対立遺伝子変異体は、コード化されたポリペプチドの機能を実質的に変更しない、１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチドの別の形態である。
成熟ポリペプチド、すなわちＰＡＩＧＢタンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ、または成熟ポリペプチドのコーディング配列と追加の配列、例えば遺伝子調節配列、制御または分泌配列を含むことができる。
本発明は、従って、成熟ポリペプチドのコーディング配列が同じリーディングフレーム中で宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列と操作可能に結合することができるポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドは前駆タンパク質もコード化することができる。
ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドは、例えば、ホモローガスな組み換え、部位指向性またはＰＣＲ突然変異誘発、およびこれらに限定されないが脊椎動物（例えば、ウサギ、ラット、ネズミ、ブタ、ラクダ、爬虫類、ヤギ、鳥類、魚類、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒト以外の霊長類など）ならびに無脊椎動物をはじめとする他の動物、および前記種およびヒト配列のＰＡＩＧＢの対立遺伝子または他の天然に存在する変異体および相同体の組み換えＰＡＩＧＢタンパク質またはポリペプチドフラグメントによる、あらかじめ決められた突然変異を含有するものを包含する。
本発明のポリヌクレオチドは、フレーム内でマーカー配列、例えばヘキサヒスチジンタグ（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）と、遺伝子の３’または５’末端のいずれかで融合して、本発明のポリペプチドの精製を可能にするコーディング配列を有することができる。
宿主細胞：
宿主細胞は本発明のベクターで操作することができる。宿主生物（組み換え宿主細胞）は、任意の真核または原核細胞、または多細胞生物であってもよい。これらは哺乳動物、酵母、真菌、またはウイルスから誘導することができる。適当な宿主細胞は、これらに限定されるわけではないが、哺乳動物細胞（例えば、サル腎臓（ＣＯＳ−７）、ヒト腎臓（２９３）、ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト肝臓（ＨｅｐＧ２）、ヒト子宮頸部（ＨｅＬａ）、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウス線維芽細胞（ＭＧ−６３））、哺乳動物骨芽細胞（例えば一次骨芽細胞、ヒト骨芽細胞（例えばＴＥ−８５、Ｕ２ＯＳおよびＳＡＯＳ−２）、ラット骨芽細胞（例えばＵＭＲ１０６、ＲＯＳ１７／２．８）、マウス骨芽細胞細胞（例えばＭＣ３Ｔ３）、および間葉肝細胞を包含する。さらに、分子生物学的操作のために、イー・コリ（例えば、ＤＨ５アルファ、ＢＬ２１、ＤＨ１０Ｂ）、酵母菌細胞（例えば シザサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚａｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉｃｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）および昆虫細胞ＳＦ９またはＳＦ２１−Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ２シュナイダー細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｅｇｇからのハイファイブ（Ｈｉｇｈ ｆｉｖｅ）細胞）などの様々な種を宿主細胞として使用できる。
ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、またはファージの形態などのクローニングベクターまたは発現ベクター、または宿主細胞において複製可能であり、生存可能である任意の他のベクターであってもよい。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または本発明のポリヌクレオチドの増幅のために適当に修飾された通常の栄養培地において培養することができる。培養条件、例えばｐＨ、温度などは、当業者に公知のポリヌクレオチドの発現に関して選択された宿主細胞に関する使用に適したものである。
プラスミドは一般に、本明細書においては、当業者によく知られた標準的命名法にしたがって、大文字および／または数字の後および／または前の小文字「ｐ」で表される。本発明におけるプラスミドは、商業的に入手可能であるか、または未制限塩基に関して公的に入手可能であるか、または周知の公開された手順の慣例的使用により入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、本発明に従って用いることができる多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは周知であり、当業者には容易に入手可能である。さらに、当業者らは本発明における使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。本発明におけるかかるプラスミド、ならびに他のベクターの性質、構造および使用は、本開示から当業者には容易に明らかになるであろう。
適当なＤＮＡ配列を、当該分野において公知の様々な手順によりベクター中に挿入することができる。
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を行うために適当な発現調節エレメントと操作可能に結合することができる。発現調節エレメントは当該分野において公知であり、これらに限定されるわけではないが、誘発性プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントを包含する。好ましくは、誘発性プロモーターは、宿主細胞の培地における栄養に反応しやすいものなど、容易に制御できる。プロモーターの例は、ＳＶ４０、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば ｐｃＤＮＡ３．１ベクターまたはｐｃＤＮＡシリーズの任意の形態）、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。この発現構築物を含有するベクターにより形質転換される宿主細胞においてＲＮＡ中にタンパク質をコード化ずるＤＮＡ配列が転写されるように、遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現について）、適当な遺伝子制御配列、または調節配列下におくことができる。かかるプロモーターとしては、これらに限定されるわけではないが、ＳＶ４０、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えばｐｃＤＮＡ３．１ベクターまたはｐｃＤＮＡシリーズの任意の形態）、ＳＰ６、Ｔ７およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。場合によっては、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を引き起こす配列を添加し、その後分泌シグナルを開裂させるのが望ましい。
発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写ターミネーター、および発現を増幅するための適当な配列も含む。発現ベクターはさらに、真核細胞についてはネオマイシン耐性またはイー・コリについてはアンピシリン耐性などの形質転換された宿主細胞を選択するための特定の表現型を提供するために１以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
酵母発現における使用に適当なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３６７５Ａに記載されている。ベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ６、ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ、およびｐＣＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯが挙げられる。適当な外来種哺乳動物プロモーターは、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３（１９７８））またはモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマから誘導されるプロモーターを包含する。加えて、遺伝子の複数のコピーが調製されるように構築物を増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）と結合させることができる。適当なエンハンサーおよび他の発現調節配列については、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８３）参照。好ましい骨関連プロモーターは、ヒトＨＢＭ、Ｚｍａｘ１またはＬＲＰ６ ｃＤＮＡの発現を行うためのＣＭＶｂＡｃｔｉｎまたはＩ型コラーゲンプロモーターを含む。哺乳動物の発現のための他の好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）およびＥＦ−１ａ（ヒト伸長因子１ａ−サブユニット）から得られる。
加えて、ＰＡＩＧＢは様々な細胞機能におけるその役割を確認するために異なる細胞系においてウイルスプロモーター下で過剰発現することができる。例えば、ＰＡＩＧＢは骨芽細胞系において過剰発現され、石灰化におけるその役割を次いで標準的技術によりモニターすることができる。
さらに、ＰＡＩＧＢが過剰発現される場合に骨分化中に調節される遺伝子をモニターすることができる。加えて、ＰＡＩＧＢ減少調節の分化関連遺伝子に対する影響（アンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ技術を導入することによる）は骨合成のＰＴＨ誘発におけるこのタンパク質の位置を示す。
ｃＤＮＡまたは他の組み換え核酸を用いた組み換えペプチドまたはポリペプチドの産生：
本発明はさらに本発明のポリペプチドの産生法に関する。本発明のポリペプチドは、前記の発現ベクターにより興味のあるポリペプチドが発現される条件下で適当な宿主細胞を成長させることにより産生させることができる。細胞培養物からのタンパク質の精製法は当該分野において公知であり、これらに限定されないが、硫酸アンモニウム沈降法、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを包含する。
本発明のポリペプチドはペプチド合成器により合成することができる。加えて、本発明の核酸分子から誘導されるＲＮＡを用いて本発明のポリペプチドを産生するために無細胞翻訳系を用いることができる。
本発明のポリペプチドは完全長ＰＡＩＧＢタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントを含む。これらのタンパク質は哺乳動物タンパク質および／またはヒトタンパク質であってもよい。別の具体例は、一般的なポリペプチド配列からの少なくとも約３、５、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸残基の連続したアミノ酸；アミノ酸残基がＮ−またはＣ−末端、またはポリペプチド配列またはそのフラグメント内に挿入されている一般的なポリペプチド配列のアミノ酸配列変異体；および別の保存残基により置換されている一般的なポリペプチド配列またはそのフラグメントのアミノ酸配列変異体を有するポリペプチドフラグメントを含む。
いくつかの用途に関しては、本発明のポリペプチドを異なる細胞区画へ向けるか、または細胞からのその分泌を促進することが有用である場合がある。従って、一過性配列などの適当な細胞内ターゲティング配列が付加されているおよび／または既に存在しているターゲティング配列が除去されている本発明のポリペプチドをコード化するためにコーディング配列を変更することにより、前記のキメラ遺伝子をさらに補足することができる。記載された参考文献はこれらのそれぞれの例を提供するが、リストは非網羅的であり、さらに有用なターゲティングシグナルが将来発見される可能性がある。
タンパク質発現検出：
タンパク質発現の検出のために、ＰＡＩＧＢポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体を、例えばフローサイトメトリー、免疫組織化学的染色法または免疫蛍光顕微鏡検査法において用いることができる。ＰＡＩＧＢポリペプチドのフラグメント、突然変異体または変異体の発現のスクリーニングはいくつかの異なる検定法の１以上を用いて行うことができる。例えば、適当な細胞、例えばヒト骨芽細胞を当該分野において公知の方法、例えばｃＤＮＡトランスフェクション、クローンされた変異体を用いたウイルス感染により細胞中に導入することができる。直接または間接的免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いて、細胞表面ＰＡＩＧＢ発現について細胞を分析することができる。トランスフェクトされた細胞の細胞表面発現は、ＰＡＩＧＢポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて評価することができる。ｃＤＮＡ、合成的に産生されたＤＮＡまたは染色体ＤＮＡも、当業者に公知で、実施されている方法およびプロトコルを利用することにより細胞を一時的にトランスフェクトするために用いることができる。例えば、細胞溶解物からのＰＡＩＧＢのタンパク質レベルは、ＰＡＩＧＢに対する抗体を用いて慣例のＥＬＩＳＡおよびＲＩＡベースの分析法により定量化することができる。ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ分析の様々な方法は容易に入手可能であり、当該分野において公知である。
抗体および抗体フラグメント：
本発明のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の利用可能性により、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。本発明のポリペプチドまたはこれらを発現する細胞は、当業者に公知の方法により抗体を調製するための免疫原として用いることができる。前記抗体は、前記または当該分野において公知の検出技術の何れかを用いて、ＰＡＩＧＢの局在化および活性に関連する当該分野で公知の方法、例えばウェスタンブロッティング、ＰＡＩＧＢそのままのイメージ化、適当な生理学的または生物学的サンプルにおけるそのレベルの測定などにおいて用いることができる。一具体例において、ＰＡＩＧＢタンパク質機能を調節または阻害するために、ＰＡＩＧＢタンパク質について特異性であり、その活性を妨害する抗体を使用することができる。このような抗体は本明細書に記載される標準的技術を用いて、ＰＡＩＧＢタンパク質それ自身に対してか、またはタンパク質の部分に対応するペプチドに対して生成させることができる。このような抗体としては、これらに限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体Ｆａｂ、フラグメント、一本鎖抗体、またはキメラ抗体が挙げられる。
もう一つ別の具体例において、本発明の抗体は、フローサイトメトリー研究、免疫組織化学的染色、および免疫沈降において用いることができ、正常細胞または組織あるいは、骨疾患にかかっているかまたはかかりやすい患者からの細胞または組織におけるＰＡＩＧＢの発現レベルの決定を助ける働きをする。例えば、本発明のアミノ酸配列の一部を表す合成ペプチドを合成することができる。これらのペプチドは、アミノ酸配列を含むペプチドまたはタンパク質に対して特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するために動物を免疫化するために用いることができる。これらの抗体を次いで、興味のある完全長ｃＤＮＡを単離するためにｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーンするためにことができる（Ｌｅｒｎｅｒ、Ａｄｖ．ｌｍｍｕｎｏＬ ３６：１（１９８４）；およびＭａｎｉａｔｉｓ）。
さらに、配列番号２、４、６、８、１０のポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０および／または配列番号１、３、５、７、９によりコード化される任意の部分、または前記ポリペプチドの何れかを発現する細胞を免疫源として用いることができる。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり、キメラ、一本鎖、およびＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含することができる。抗体は、細胞においてそのままで、または細胞抽出物におけるインビトロで、本発明のポリペプチドを検出するために有用である。
このように、ＰＡＩＧＢポリペプチドが発現され、ウサギポリクローナル抗体が産生される。さらに詳細には、ＲＡＤＡＩＥＰＲＹＹＥＳＷＴＲＥ（配列番号１１）、ＥＤＧＬＰＳＮＧＶＰＲＳ（配列番号１２）、ＥＡＫＲＤＡＫＲＭＰＡＫＥ（配列番号１３）およびＱＭＤＲＳＲＲＩＴＫＮＣＶＮ（配列番号１４）配列が合成され、動物を免疫化するために用いられる。産生された抗体はタンパク質レベルでＰＡＩＧＢの発現を分析するための有用な手段である。かかる分析の結果は、ＢＭＤの変化を観察する前に、骨同化剤の潜在的な有効性を迅速にモニターするための有用なマーカーとしての働きをする。
スクリーニング、診断および治療：
本発明のＰＡＩＧＢの様々な用途は、これらに限定されないが、病態生理学的ＰＴＨシグナル化経路の治療的調節（例えば、遺伝子導入法、遺伝子抑制法、タンパク質治療抗体治療法）、診断的有用性、医薬標的、作用物質または拮抗物質の同定、およびＰＴＨ作用の分子機構の研究が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドは、既存の骨粗鬆症の治療または更年期前の女性における骨折および骨粗鬆症の発生の危険性を軽減するための予防的治療における医薬として有用な化合物の設計および／または同定を容易にするための標的として用いることができる。
これらの化合物は、骨形成を誘発することにより、骨のそれ以上の劣化を防止するために、更年期の女性の骨粗鬆症の治療において用いることができる。これは単剤治療として、および／または骨損失を阻害する既存の治療法との組み合わせにおいて、またはエストロゲンについてのさらなる治療法として提供することができる。
これらの化合物は ＰＴＨによるＰＡＩＧＢ発現の調節に関与するシグナル化経路における変更から生じる骨関連障害を治療するために使用できる。例えば、骨形成を支援する様式においてその機能を変更するＰＡＩＧＢに作用する化合物を、骨の強度を増大させ、骨折の危険性を低下させるために、男女両方における予防治療として用いることができる。化合物は、ＰＡＩＧＢ機能を模倣し、骨形成活性を増大させることもできる。
加えて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＰＴＨによるＰＡＩＧＢ発現の調節に関与するシグナル化経路に影響を及ぼし得るさらなる標的（例えば相互作用するタンパク質）を同定するために使用できる。さらに詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＰＴＨの同化作用を模倣する新規化合物を開発するための標的を表す。このような化合物は、開発された化合物の活性がＰＴＨの同化活性に対して特異性であるので、ＰＴＨへの連続的暴露の影響が問題にならない新規治療薬を表す。このような化合物は本明細書において既に定義された薬剤または化合物であろう。
一具体例において、配列番号１、３、５、７および９に記載される核酸配列を有するポリヌクレオチドとハイブリッド形成できるポリヌクレオチドプローブを、サンプルにおけるＰＡＩＧＢの存在または不在を検出することを含む哺乳動物宿主細胞から誘導されるサンプルにおけるＰＡＩＧＢポリヌクレオチドを検出するための診断法においてが用いることができる。
さらに、クローンされたＰＡＩＧＢの大規模な産生が多数のＰＡＩＧＢ類似体のスクリーニングを可能にし、代謝性骨疾患の臨床治療における新規または改良作用および／または拮抗化合物の開発を促進するであろう。さらに詳細には、ＰＡＩＧＢ活性についての多数の類似体のスクリーニングは、骨粗鬆症または他の骨関連障害の臨床治療において用いられる改良薬の開発につながり得る。
発明の化合物はすべて、医薬的に許容される塩またはエステルの形態であることができる。塩は、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２などであり；エステルは一般的に１〜６の炭素を有するアルコールのエステルである。
活性化についてスクリーンするためのＰＡＩＧＢプロモーター：
ＰＡＩＧＢの組織特異性調節に関与する転写調節エレメント（プロモーター）の同定および単離は、ＰＡＩＧＢの発現を促進する薬剤（例えば医薬、化合物、ペプチド）をスクリーニングするための手段を提供する。プロモーターの調節は、反応エレメントと直接結合しないが、転写活性に影響を及ぼす（トランス作用因子）因子（コアクチベーターまたはコレプレッサー）の発現および／または活性を調節することにより達成することができる。転写活性は、ＤＮＡ調節応答エレメントと直接結合する因子（シス作用因子）の発現および／または活性の調節によっても調節することができる。高スループットスクリーンは、ＰＡＩＧＢプロモーター内の組織特異的調節エレメントを活性化するその能力について薬剤を試験することを含み得る。このような薬剤はＰＡＩＧＢの転写レベルを誘発し、骨粗鬆症の治療に有用である。薬剤をスクリーンするために組織特異性ＰＡＩＧＢ ＤＮＡ調節エレメントを利用するために、当該分野において公知の技術およびプラスミドを使用して、プロモーターエレメントを単離し、レポータープラスミド（ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼなど）中にクローンする。骨芽細胞において完全な転写活性選択性を付与するＤＮＡ調節エレメントは、骨芽細胞および非骨芽細胞において調節エレメントを含有するＤＮＡレポーター構築物を一時的に発現することにより同定される。転写活性は、公知の骨芽細胞分化剤または骨芽細胞活性を促進する薬剤で処理された骨芽細胞において測定される。これらの薬剤は、これらに限定されるわけではないが、ＰＴＨ、デキサメタゾン、プロスタグランジンＥ２、ビタミンＤ３および骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）を包含する。当該分野において公知の方法によりＰＡＩＧＢ骨特異性プロモーターを単離し、骨芽細胞中に（一時的に、安定に、ウイルスにより）導入する。任意の薬剤を、このＰＡＩＧＢプロモーターによるレポーターを活性化する能力についてスクリーンすることができる。
遺伝子誘発可能な系：
前記の本発明の核酸、ベクターおよび調節領域のさらなる用途は、様々な遺伝子についてのその化学的に誘発可能な発現系（遺伝子誘発可能な系または標的遺伝子の制御された発現）としての使用である。この目的のために、核酸を前記のように宿主細胞において発現することができる。標的遺伝子を、調節領域を有する適当なプロモーターを備えた発現ベクター中にクローンする。これらの発現ベクターを次いで宿主細胞中に導入する。誘発可能な安定な細胞系（遺伝子誘発系）は：１）骨芽細胞機能（骨芽細胞特異性遺伝子の発現に関して）、細胞増殖およびアポトーシスに対するＰＡＩＧＢ過剰発現の影響を評価するため２）ＰＡＩＧＢと相互作用し、それによりその活性を調節する薬剤についてスクリーンするため、３）小分子の活性がＰＡＩＧＢの発現に依存することを証明するための二次スクリーンとして、４）ＰＡＩＧＢが高度に発現された場合の骨芽細胞機能に対する他の骨関連ホルモン／因子（エストロゲン、ＰＧＥ２、ＢＭＰ、ＰＴＨ、デキサメタゾン、ビタミンＤ３等）の影響を評価するため、５）ＰＡＩＧＢタンパク質の供給源として、６）ＰＡＩＧＢと相互作用するタンパク質を同定するため、７）生物学的検証のための一時的トランスフェクションとして、８）ＰＡＩＧＢの異なる形態を発現するため、および９）遺伝子導入において（Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ ＲＶら．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９；１０：１４９９−１５０７；Ａｂｒｕｚｚｅｓｅ ＲＡら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０００；２：２７６−２８７）、使用することができる。
特に、ＰＡＩＧＢは、骨関連剤がＰＡＩＧＢ分子発現に依存する骨代謝に対して効果があるかどうか、またはＰＴＨシグナル化経路に影響するかどうかを決定するために、一時的トランスフェクション分析における遺伝子誘発系において使用することができる。
ＰＡＩＧＢポリヌクレオチドは、トランスジェニック動物を作るために遺伝子誘発系において用いることができる。安定な細胞系を、かかるトランスジェニック動物の組織からさらに確立することができる。
本発明の遺伝子誘発系は、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現がフロックス化遺伝子の一時的に調節された骨特異性欠失を得るために骨組織（例えば、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシンプロモーター）においてＭＦＰ依存性にできるような動物モデルの開発に用いることができる。
遺伝子誘発性は、該系が活性化されない場合の標的遺伝子の低レベルから検出不能な基礎発現、および該系が活性化された場合の標的の発現レベルの増大を可能にする分子手段であり得る（Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９７；１：２１０−２１８；Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ Ｍ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：７４３−７５５に論評）。したがって、成分は、エフェクターと結合するリガンドおよび標的遺伝子（ＰＡＩＧＢ遺伝子）により活性化することができるエフェクター（レギュレータータンパク質）を含む。ミフェプリストン誘発系は、プロゲステロンにより活性化される能力を失っているが、ミフェプリストン（ＭＦＰ）などの抗プロゲスチンにより活性化される能力を獲得した、切断されたヒトプロゲステロンレセプター（ＰＲ）リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に基づく。プロゲステロンレセプターの切断されたリガンド結合ドメインが、ＤＮＡ結合（例えば、酵母ＧＡＬ４）および活性化ドメイン（例えば、ＶＰ１６；ヒトＮＦＫＢのｐ６５サブユニット）と結合した場合に、同族ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位でプロモーターと結合した遺伝子の転写を特異的に誘発するリガンド特異性転写因子（レギュレータータンパク質）が産生される（Ｗａｎｇ Ｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９４；９１：８１８０−８１８４；Ｄｅｌｏｒｔ Ｊら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１９９６；７：８０９−８２０）。
抗プロゲスチン調節系は、エフェクターまたは好ましい組織（例えば、骨組織および細胞）においてエフェクターの発現を行うための組織特異性プロモーターの偏在的発現のために構成プロモーター（例えばＣＭＶ、ＴＫ）を利用できる遺伝子系の一例である。リガンドの存在下で、エフェクターは二量化し、最小Ｅ１ｂ ＴＡＴＡプロモーターおよびＧＡＬ４ ＤＮＡ結合エレメントの数コピーを含有する標的遺伝子（ＰＡＩＧＢ遺伝子）におけるその同族ＤＮＡ結合配列と結合する。エフェクターのこのような結合が起こる場合、ＰＡＩＧＢ遺伝子の転写は増大して、ＰＡＩＧＢ発現の増大に至る。
トランスジェニック動物は、当該分野において公知の遺伝子誘発可能な技術を用いて調製することができる（Ｗａｎｇ．Ｙ．、ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７；１５：２３９−２４３）。
当該分野において記載されている遺伝子誘発系を用いてノックアウト動物を調製することができる（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；２８５：１７５−１８２、Ｍｉｎａｍｉｎｏら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２００１、８８：５８７−５９２）。
医薬組成物：
本発明はまた、前記タンパク質、突然変異タンパク質、フラグメント、抗体、このようなタンパク質、突然変異タンパク質、抗体またはそのフラグメントをコード化する核酸分子、ならびにこのような核酸分子を発現するベクターおよび宿主細胞、および許容される固体または液体、担体緩衝剤、または希釈剤の任意のものを含有する組成物も提供する。
本発明の組成物は、これらに限定されるわけではないが、静脈内、皮下、筋肉内、髄膜、頭蓋内および局所をはじめとする多くの経路により、促進された神経、筋肉、軟骨および骨の成長を必要とする個体に投与することができる。組成物は、インビボまたはエクスビボ法により器官または器官細胞に直接投与することができる。
これらの組成物は、可溶性または微粒子形態であるか、またはミセルおよびリポソームを包含する微小球または微小嚢中に組み入れることができる。
本発明の医薬組成物は、１以上の追加の活性成分を含むことができ、好ましくは医薬的に許容される担体を含む。前記のような１以上のＰＡＩＧＢに基づく活性物質との組み合わせで作用するように追加の活性成分を提供することができる。別の具体例において、追加の活性物質は、これらのＰＡＩＧＢベースの活性物質と異なる作用様式によるが、ＰＡＩＧＢと同じ疾患または障害に作用するので、これを添加するか、あるいは追加の活性物質は、ヒトまたは動物において存在する他の疾患または障害に作用することができる。
発明の方法において用いられる活性化合物は、投与に適した医薬組成物中に組み入れることができる。本明細書において用いられる場合、「活性化合物」なる用語は、ＰＡＩＧＢ核酸分子、ＰＡＩＧＢタンパク質またはそのフラグメント、および抗ＰＡＩＧＢ抗体、ならびにＰＡＩＧＢ遺伝子発現、合成、および／または活性を調節する同定された化合物を包含する。このような組成物は、典型的には、化合物、核酸分子、タンパク質、抗体、ならびにかかる核酸分子を発現するベクターおよび宿主細胞、および医薬的に許容される担体を含む。本発明の組成物は、１以上の活性化合物を１以上の骨関連剤との組み合わせにおいて含むことができる。例えば、ＰＡＩＧＢ分子を誘発する薬剤をエストロゲン、ビスホスホネート、組織選択的エストロゲンと組み合わせることができる。
骨形成活性またはアポトーシス活性に対して所望の調節効果を達成するために十分である有効量の１以上の活性成分が用いられる。有効量は、所望の活性についての通常の用量応答曲線により決定することができる。組成物が医薬的に用いられる場合、これらは診断および治療用の「医薬的に許容される担体」と組み合わせられる。かかる組成物の処方は当業者には周知である。本発明の医薬組成物は、１以上の追加の活性成分を含み、好ましくは医薬的に許容される担体を含む。
適当な医薬的に許容される担体および／または希釈剤は、ありとあらゆる従来の溶媒、分散媒体、フィラー、固体担体、水性溶液、コーティング、殺菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。「医薬的に許容される担体」なる用語は、これが投与される患者においてアレルギー反応または他の不利な効果を引き起こさない担体を意味する。適当な医薬的に許容される担体は、例えば、１以上の水、食塩水、リン酸塩緩衝塩溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組み合わせを含む。医薬的に許容される担体は、組成物の１以上の活性成分の貯蔵寿命または有効性を向上させる、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝剤をさらに含むことができる。医薬的に活性な物質の媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。任意の従来のこのような媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路と適合性であるように処方される。投与経路の例としては、例えば、静脈内，皮内、皮下、経口、吸入、口腔、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用水、塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性調節剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアル中に封入することができる。
注射可能な用途に適した医薬組成物は、無菌注射溶液または分散液を即座に調製するための無菌水性溶液（水溶性である場合）または分散液および無菌粉末を含む。静脈内投与について、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）または燐酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒体、およびその適当な混合物を含む。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいであろう。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより注射可能な組成物の吸収が延長される。
ある具体例において、骨関連疾患または障害を治療するために、ＰＡＩＧＢタンパク質の全部または一部を結合する抗体が組成物において用いられる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は通常の方法により調製することができる。一般に、（ａ）ＰＡＩＧＢタンパク質に対して特異性であり、（ｂ）より抗原性である可能性が高いアミノ酸配列に対して抗体が惹起される。配列分析を行い、配列構造および配列比較のための任意の慣用のプログラムを用いることにより、ＰＡＩＧＢポリペプチドに対して特異性の配列を選択することができる。１以上の末端（好ましくは両端）で親水性であるアミノ酸配列が抗体を惹起するために一般的に好ましい。親水性であるアミノ酸を用いることに加えて、好ましい具体例において、親水性アミノ酸はまた塩基性（非酸性）でもある。抗原性を増大させる任意のアミノ酸も使用できる。例えば、しばしばプロリンが配列の中心部分において用いられる。抗原性は、抗体を初期試験配列に対して生成させる場合に産生される抗体の量の減少における増大により測定することができる。本発明のある具体例において、抗体はＰＡＩＧＢタンパク質の少なくとも８の連続したアミノ酸を含む配列、好ましくはＰＡＩＧＢタンパク質の少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む配列に対して惹起される。さらに好ましい具体例において、抗体は約１５〜約３０のアミノ酸を含むアミノ酸配列に対して惹起される。
医薬の有効性を評価するためのＰＡＩＧＢ分子の使用
本発明は、薬剤（例えば、作用物質、拮抗物質、ペプチド模倣物質、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書に記載されるスクリーニング検定により同定される他の医薬候補物質）での患者の治療の有効性をモニターする方法であって、（ａ）薬剤の投与前に被験者から投与前サンプルを得る工程；（ｂ）投与前サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｃ）１以上の投与後サンプルを被験者から得る工程；（ｄ）投与後サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｅ）投与前サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；および（ｆ）対応して被験者への薬剤の投与を変更する工程を含む方法を提供する。例えば、増大した薬剤の投与前に検出されたｍＲＮＡ発現のレベルよりも上昇させるためにＰＡＩＧＢの発現または活性を増大させるために、すなわち、薬剤の有効性を増大させるために、増大した薬剤の投与が望ましい。このような具体例によると、ＰＡＩＧＢ発現または活性は、観察可能な表現型応答が存在しない場合でさえも、薬剤の有効性の指標として用いることができる。
本発明はさらに、薬剤の有効性を評価し、骨関連障害の治療のための臨床試験に関係する患者の進行状態をモニターするための方法も提供する。薬剤（例えば医薬）のＰＡＩＧＢタンパク質の発現または活性に対する影響（例えば、細胞増殖および／または移動の調節）のモニタリングは、基本的医薬スクリーニングにおいてだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、本明細書に記載されるスクリーニング検定により決定される薬剤のＰＡＩＧＢ遺伝子発現、またはタンパク質レベルを増大させる有効性は、増大したＰＡＩＧＢ遺伝子発現、またはタンパク質発現レベルを示す被験者の臨床試験においてモニターすることができる。別法として、ＰＡＩＧＢ遺伝子発現、またはタンパク質発現レベルを増大させるためのスクリーニング検定により決定される薬剤の有効性は、増大したＰＡＩＧＢ遺伝子発現、またはタンパク質発現レベルを示す被験者の臨床試験においてモニターすることができる。このような臨床試験において、ＰＡＩＧＢ遺伝子、および例えばＰＡＩＧＢ関連疾患に関与する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞、例えば骨の表現型の「読み出し」またはマーカーとして用いることができる。加えて、ＰＡＩＧＢ遺伝子の発現、またはＰＡＩＧＢタンパク質発現のレベルは、骨関連疾患状態に対する特定の医薬または薬剤の影響の読み出しとして用いることができる。
例えば、制限するのではないが、ＰＡＩＧＢ発現または活性（例えば、本明細書において記載されるスクリーニング検定により同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、医薬または小分子）での処理により細胞において調節されるＰＡＩＧＢを包含する遺伝子を同定することができる。したがって、薬剤のＰＡＩＧＢ関連障害（例えば骨関連障害）に対する影響を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＰＡＩＧＢおよびＰＡＩＧＢ関連障害に関与する他の遺伝子の発現レベルについてそれぞれ分析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、当該分野において公知のノザンブロット分析またはリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは当該分野において公知の方法の一つにより、産生されるタンパク質の量を測定することによるか、またはＰＡＩＧＢまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量することができる。このように、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答のマーカー、指標としての働きをすることができる。従って、この応答状態は、個体の薬剤での治療前、および治療中の様々な時点で決定することができる。
生化学マーカーとしてのＰＡＩＧＢ分子の使用：
本発明のＰＡＩＧＢ分子は、骨関連障害または疾患状態のマーカーとして、疾患状態の前兆のマーカーとして、疾患状態の傾向のマーカーとして、医薬活性のマーカーとして、または被験者の薬理ゲノム学的特性のマーカーとしても有用である。本明細書に記載された方法を用いて、本発明のＰＡＩＧＢ分子の存在、不在および／または量を検出することができ、１以上のインビボの生物学的状態と関連づけることができる。例えば、本発明のＰＡＩＧＢ分子は、１以上の骨障害または疾患状態または疾患状態につながる状態のマーカーとしての働きをすることができる。本明細書において用いられる場合、生化学的マーカーは、疾患または障害の不在または存在、あるいは疾患または障害の進行（例えば減少したＢＭＤ）と相関する。従って、これらのマーカーは特定の治療単位が疾患状態または障害を緩和するのに有効であるかどうかを示す働きをすることができる。
本発明は、分子および細胞生物学の分野で周知の標準法および技術により組み入れることができる。これらの技術としては、これらに限定されるわけではないが、以下の刊行物に記載されている技術が挙げられる：Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｐｒｉｎｃｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第３版、１９８５）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ｖ．２：４０９ｐｐ（ＩＳＢＮ０−６３２−０１３１８−４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、Ｊ．ら編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ 第１〜３巻（ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ １６９ページ（ＩＳＢＮ０−８７９６９−１９８−０）。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、本発明の前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むならば任意のものであってよい。
潜在的な骨同化作用を有する薬剤の同定：
一つの具体例において、本発明は、ＰＡＩＧＢ活性を調節する試験薬または化合物を同定する方法を含む。該方法において、まず、試験薬を含む試験培地中でＰＡＩＧＢを含むサンプルをインキュベートすることにより哺乳動物における骨形成活性を調節する薬剤を分析する。次の工程は、ＰＡＩＧＢ活性を決定することであり、ここにおいて、ＰＡＩＧＢ単独に対する活性の増大は該薬剤がＰＡＩＧＢアクチベーターであることを示し、活性の減少は、該薬剤がＰＡＩＧＢ阻害剤であることを示す。
ＰＡＩＧＢ分子発現を変更する薬剤を同定するための手段として、ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現を用いることができる。一例において、これらの薬剤（例えば、ＰＴＨ１−３４）は同化作用性であり、骨組織または骨細胞、例えば骨発生または骨形成活性を有する間葉系（例えば、骨髄間葉幹細胞、前骨芽または成熟骨芽細胞、例えば、ＲＯＳ１７／２．９、ＵＭＲ１０６、ＭＣ３Ｔ３、ＳＡＯＳ−２、ＭＧ−６３、ＴＥ８５およびＵ２ＯＳ）におけるＰＡＩＧＢのレベルを増大させる。特に、高スループットスクリーンは、これらの骨芽細胞を小分子化合物（例えば、１０〜３０ｕＭ）、天然の生成物またはペプチドベースの化合物で処理することを含む。１０％ＦＢＳを含有する増殖培地中で細胞を４〜１８時間処理する。培地を除去し、細胞をＦＢＳで洗浄し、続いて自動化ＲＮＡ抽出装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ６７００）を用いた全ＲＮＡの単離を行う。１×１０６細胞からのＲＮＡの典型的な収量は、２０ｕｇの全ＲＮＡである。ＲＮＡ単離後、本出願において既に記載したようにして、または当該分野において公知の他の方法により、１００ｎｇのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ分析）によって分析する。このようにして、全ＲＮＡの相補性を被験者骨組織、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトから単離することができる。分析のための組織を提供するために、当該分野において公知の様々な技術、例えば骨髄穿刺液、または骨核バイオプシーを用いることができる。ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡ発現を誘発する薬剤は骨同化可能性を有する薬剤を示す。
ＰＡＩＧＢ誘発剤が同定されると、骨髄間葉幹細胞、前骨芽細胞または成熟骨芽細胞における骨特異性遺伝子（これらに限定されるわけではないが、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、骨シャロ蛋白およびＩ型コラーゲンを包含する）の発現を誘発することにより、化合物を、その骨細胞の機能的活性を誘発する能力について試験することができる。化合物は、Ｖｏｎ ＫｏｓｓａまたはＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色により評価されるように、骨髄幹細胞、前骨芽細胞および成熟骨芽細胞を用いてインビトロで鉱化を誘発するその能力について試験することもできる。骨同化剤はまた、骨先祖細胞または骨芽細胞増殖の増大によるか、またはこれらの細胞におけるアポトーシスの抑制によるかの何れかでその効果を惹起することもできる。３Ｈ−チミジン組み入れ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み入れ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）検定、Ｃａｓｐａｓｅ３／７検定、ＴＵＮＥＬ検定（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ 、Ｚ．ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２７：１−２０ １９９７）またはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ検定（Ｍａｒｔｉｎ、Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１５４５−１５５６、１９９５およびＲａｙｎａｌ、Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９７：６３−９３、１９９４）を包含するが、これに限定されない、これらのパラメーターを測定するための商業的に入手可能な方法が当該分野においては多数ある。マウス頭蓋冠への薬剤の局所注射、成熟マウスまたは若年ラットにおける薬剤の全身性投与および卵巣切除されたラットまたは確立された骨減少症を有するマウスへの全身性投与を包含する当該分野において公知の動物モデルを用いて、化合物を次いでインビトロで骨形成を促進するその能力について試験することができる。
２ハイブリッドスクリーニング
哺乳動物および酵母菌の２ハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用を研究するために有用である。例えば、米国特許第６，２５１，６０２号、米国特許第５，９８９，８０８号、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９５７８−８２（１９９１）；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１０：２８６−９２（１９９４）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｃｅｌｌ７５：８０５−１６（１９９３）；Ｖｏｊｔｅｋら、Ｃｅｌｌ７４：２０５−１４（１９９３）；Ｌｕｂａｎら、Ｃｅｌｌ７３：１０６７−７８（１９９３）；Ｌｉら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：９５７−６３（１９９３）；Ｚａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ３６４：３０８−１３（１９９３）；Ｇｏｌｅｍｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３００６−１４（１９９２）；Ｓａｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９２３８−４２（１９９４）；Ｃｏｇｈｌａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：１０８−１１１（１９９５）；Ｋａｌｐａｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：２００２−６（１９９４）；Ｈｅｌｐｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４０：９３−８（１９９４）；Ｙｅｕｎｇら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．８：２０８７−９（１９９４）；Ｄｕｒｆｅｅら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｐａｅｔｋａｕら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．８：２０３５−４５；Ｓｐａａｒｇａｒｅｎら、１９９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１２６０９−１３（１９９４）；および Ｙｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１２６２９−３３（１９９４）参照。
システムのバリエーションは、酵母ファージミド（例えば、Ｈａｒｐｅｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１５３−１７９（１９９３）；Ｅｌｌｅｄｇｅら、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１７３１−５（１９９１）参照）またはプラスミド（Ｂａｒｔｅｌ、１９９３およびＢａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ １４：９２０−４（１９９３）参照）；Ｆｉｎｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１２９８０−４（１９９４））、タンパク質と相互作用するクローンのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに公知タンパク質対の研究に利用可能である。
ＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＬａｃＺ、ＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＨＩＳ３またはＧＡＬ．ｆｗｄａｒｗ．ＵＲＡ３（Ｂａｒｔｅｌ，ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１５３−１７９（１９９３）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｃｅｌｌ ７５：８０５−１６（１９９３）；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：２８６−９２（１９９４））などの種々のレポーター遺伝子カセットのコピーが組み入れられた酵母株を、それぞれが異なる融合タンパク質を発現する２つのプラスミドで同時形質転換することができる。一方のプラスミドはタンパク質「Ｘ」と、例えばＧＡＬ４酵母転写アクチベーターのＤＮＡ結合部位間の融合をコード化し（Ｂｒｅｎｔら、Ｃｅｌｌ ４３：７２９−３６（１９８５）；Ｍａら、Ｃｅｌｌ ４８：８４７−５３（１９８７）；Ｋｅｅｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：６９９−７０４（１９８６））、他方はタンパク質「Ｙ」とＧＡＬ４のＲＮＡポリメラーゼ活性化ドメイン間の融合をコード化する（Ｋｅｅｇａｎら、１９８６）。プラスミドを、その調節領域がＧＡＬ４結合部位を含有するｌａｃＺなどのレポーター遺伝子を含有する酵母株中に形質転換することができる。タンパク質ＸおよびＹが相互作用するならば、これらは転写を活性化するために２つのＧＡＬ４成分を十分接近させることにより、機能的ＧＡＬ４転写アクチベータータンパク質を再構成する。
いずれかのハイブリッドタンパク質単独ではレポーター遺伝子の転写、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド（活性化機能を提供しないので）、および活性化ドメインハイブリッド（ＧＡＬ４結合部位に局在化できないので）を活性化することができない。２つの試験タンパク質の相互作用は、ＧＡＬ４の機能を再構成し、その結果、レポーター遺伝子が発現される。レポーター遺伝子カセットは、そのＴＡＴＡボックスの５’にクローンされたＧＡＬ４ＤＮＡ認識部位を含有する最小のプロモーターを含有する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−８（１９８４）；Ｌｏｒｃｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：８２１−８２４（１９８４））。転写産物、例えばＵＲＡ３（ウラシル選択）またはＨＩＳ３（ヒスチジン選択）についての栄養素要求性選択を可能にする特定の栄養素が欠損した最小培地上でのβ−ガラクトシダーゼの発現または形質転換体の成長のいずれかを測定することにより、転写活性化を採点する。例えば、Ｂａｒｔｅｌ 、１９９３；Ｄｕｒｆｅｅら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ．７：５５５−５６９（１９９３）；Ｆｉｅｌｄｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０：２８６−２９２（１９９４）；および米国特許第５，２８３，１７３号参照。
２ハイブリッド分析またはスクリーニングのさらなる方法は、当業者には明らかであろう。例えば、Ｆｉｎｌｅｙら、「Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ，」ｉｎ Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編、Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）；Ｍｅｉｊｉａ Ｙａｎｇ，「Ｕｓｅ ｏｆ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ，」 ｉｎ Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｕｌ Ｌ．Ｂａｒｔｅｌら編、Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）；Ｇｉｅｔｚら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ，」Ｍｏｌ．＆ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：６７−９（１９９７）；Ｋ．Ｈ．Ｙｏｕｎｇ，「Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ：Ｓｏ Ｍａｎｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，（ｉｎ）ｓｏ Ｌｉｔｔｌｅ Ｔｉｍｅ，」Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５８：３０２−３１１（１９９８）；Ｒ． Ｂｒｅｎｔら、「Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ａｌｌｅｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３−７０４（１９９７）参照。活性化ドメイン融合ライブラリーの連続スクリーンを行うことにより、タンパク質ネットワークを解明することができると理解される。
一般に、これらの方法は、細胞の核においてハイブリッドとして発現される相互作用について試験される２つのタンパク質を含むことができる。タンパク質の一方を転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と融合させ、他方を転写活性化ドメイン（ＡＤ）と融合させる。タンパク質が相互作用するならば、これらはＤＢＤの結合部位を含有する一以上のレポーター遺伝子を活性化する機能的転写因子を再構成する。
例えば、可能なＰＡＩＧＢ相互作用タンパク質は、２ハイブリッド法により同定することができる。転写因子ＤＢＤ＋タンパク質Ｘを含有するベクターを調製することができる。レポーター遺伝子を有する細胞中に入れる場合、この融合タンパク質はレポーター遺伝子プロモーターと結合できるが、転写を活性化することができない。未知のｃＤＮＡが転写因子の活性化ドメインの隣に配置されている第二のベクターを調製することができる。レポーラー遺伝子を含有する細胞中に入れられた場合、ＤＮＡ結合ドメインを有さないので転写を活性化することができない。２つのベクターが同じ細胞中にある場合、第二のプラスミドにより調製されるタンパク質がＸタンパク質と結合するならば、レポーター遺伝子を活性化できる転写因子が形成される。
ＰＡＩＧＢの完全長（長および短い形態）または異なる部分を２ハイブリッドベクター中にクローンすることができる。これらのベクターは、これらに限定されないが、ｐＡＳ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＢＴ９、ｐＧＢＫＴ７を包含する。クローンされたＰＡＩＧＢは、公知の結合ドメイン（例えばＧＡＬ４またはＬｅｘＡ）（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ Ｉ．Ｇ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０：６３４−６５５ ２００１）との融合タンパク質として発現される公知または未知のバイト（ｂａｉｔ）を表す。活性化ドメイン（例えばＧＡＬ４またはＶＰ１６）（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ Ｉ．Ｇ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３０：６３４−６５５ ２００１）ベクター中にクローンされたｃＤＮＡは、異なる骨芽細胞系、骨、脳、およびＰＡＩＧＢが発現される他の組織から調製されｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。
相互作用パートナーが同定されると、完全長ｃＤＮＡを単離し、クローンすることができる。加えて、相互作用は哺乳動物２ハイブリッド系において確認することができる。さらに、ＰＡＩＧＢ内の結合ドメイン、ならびにＰＴＨおよび／または他の骨形成剤が相互作用を調節するかどうかをより明らかに確定する実験を行うことができる。
ＰＡＩＧＢの相互作用パートナーが骨芽細胞において発現される新規遺伝子であるならば、ＰＴＨシグナル化においてタンパク質を配置するためにさらなる実験法を行うことができる。しかしながら、ＰＡＩＧＢ相互作用パートナーが公知生物学的機能を有する公知遺伝子であるならば、これはＰＴＨシグナル化および骨形成の誘発におけるＰＡＩＧＢの役割を示す。
ＰＡＩＧＢ遺伝子に対する変更を有する遺伝子修飾された動物：
遺伝子操作された動物は、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックインおよびトランスジェニックを包含する。「動物」なる用語は、トランスジェニック動物において言及する場合、ヒト以外の全ての脊椎動物を包含する。これはまた、胚形成期および胎児期をはじめとする発生のあらゆる段階における個々の動物を包含する。「トランスジェニック動物」とは、マイクロインジェクションによるかまたは組み換えウイルスでの感染など、細胞以下のレベルでの慎重な遺伝子操作により、直接的または間接的に受容された遺伝子情報を有する１以上の細胞を含有する動物である。この導入されたＤＮＡ分子は、染色体内に組み入れることができるか、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。
ゲノム源から単離するか、単離されたＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを調製するか、直接合成によるか、またはその組み合わせにより、遺伝子を得ることができる。
発現するために、遺伝子は調節領域に操作可能に結合される。ある組織または遺伝子の発現の発生のある段階を増大、減少、調節または指定するために、調節領域、例えばプロモーターを用いることができる。プロモーターは天然に存在するプロモーターである必要はない。
ＤＮＡの細胞中への導入を可能にする方法は、一般に利用可能であり、当該分野において周知である。ＤＮＡの細胞中への導入を可能にする方法は一般に利用可能であり、当該分野において周知である。トランス遺伝子を導入する異なる方法を用いることができる。一般に、受精卵がマイクロインジェクションの最良の標的である。例えば、マウスにおいて、雄性前核は直径約２０μｍのサイズに達し、これにより１〜２ｐＬのＤＮＡ溶液の再現可能な注入が可能になる。遺伝子導入の標的としての受精卵の使用は大きな利点を有する。ほとんどの場合、注入されたＤＮＡは第一卵割前に宿主遺伝子中に組み入れられる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５）。従って、トランスジェニック非ヒト動物のほとんど全ての細胞は組み入れられたトランス遺伝子を有する。一般に、この結果、胚細胞の５０％がトランス遺伝子を有するので、病気にかかった子孫へトランス遺伝子が有効に伝達されるであろう。受精卵のマイクロインジェクションは、本発明の実施においてトランス遺伝子を組み入れるための好ましい方法である。
トランス遺伝子をヒト以外の動物に導入するためにレトロウイルス感染も用いることができる。発育中のヒト以外の胚をインビトロで胞胚期まで培養することができる。この期間中、分割細胞はレトロウイルス感染の標的であり得る（Ｊａｅｎｉｃｈ、Ｒ．１９７６）。分割細胞の有効な感染は、透明帯を除去するための酵素処理により得られる（Ｈｏｇａｎら、１９８６）。トランス遺伝子を導入するために用いられるウイルスベクター系は、典型的にはトランス遺伝子を有する複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、１９８５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５）。分割細胞をウイルス産生細胞の単層上で培養することによりトランスフェクションは容易かつ効率よく得られる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ、前出；Ｓｔｅｗａｒｔら、１９８７）。別法として、感染を後の段階で行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞を分割腔中に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒら、１９８２）。組み入れはトランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにおいてのみ起こるので、ほとんどの病気にかかった動物はトランス遺伝子についてモザイクである。さらに、病気にかかった動物はゲノム中の様々な位置でトランス遺伝子のレトロウイルス挿入を含有し；これらは一般的に子孫において分離する。加えて、効率は低いが、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染により、トランス遺伝子を生殖細胞系中に導入することも可能である（Ｊａｈｎｅｒら（１９８２）前出）。
ノックアウトおよびノックイン動物を発生させるために一般的に用いられるトランス遺伝子導入の標的細胞の第三のタイプは、胚幹細胞（ＥＳ）である。本明細書において用いられる場合、「胚幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、通常、多分化能の胚から誘導される細胞または細胞系であり、未分化細胞であることを意味する（Ｅｖａｎｓ、Ｍ．Ｊ．ら、１９８１；Ｂｒａｄｌｅｙ、Ａ．ら；１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒら、１９８６；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６）。これらの細胞は、ホモローガスな組み換えにより外因性ＤＮＡを組み入れることができ、その後宿主胚中に組み入れると体内の任意の組織に発達することができる。胚組織以外の供給源から当該分野において十分理解されている方法により多分可能細胞を単離することが可能である。トランス遺伝子にはＤＮＡトランスフェクションによるか、またはレトロウイルスによる変換によりＥＳ細胞中に効率よく導入することができる。結果として得られる形質転換されたＥＳ細胞をその後、ヒト以外の動物から得られる胚盤胞と組み合わせることができる。ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、結果として得られるキメラ動物の生殖細胞に寄与する（論評については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｒ．、１９８８参照）。
マウスにおける胚幹細胞により、トランスジェニック細胞について選択し、遺伝子ターゲティングを行うことが可能になった。これにより、他のトランスジェニック技術で可能であるよりもさらに遺伝子操作が可能になる。例えば、マウスＥＳ細胞はインビトロでコロニーとして成長させるのが比較的容易である。細胞を２５の標準的手順によりトランスフェクトし、トランスジェニック細胞を抗生物質耐性によりクローン的に選択することができる（例えば、Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９９４、Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；Ｉｎ Ｐｉｎｋｅｒｔ（編）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．ｌｌ５−１４６参照）。さらに、このプロセスの効率により．十分なトランスジェニックコロニー（数百から数千）を産生することができ、ホモローガスな組み換え体についての第二の選択が可能になる。マウスＥＳ細胞をついで正常宿主胚と組み合わせ、これらはその有効性を保持するので、生殖細胞をはじめとする結果として得られる動物におけるあらゆる組織に発達することができる。トランスジェニック修飾を次いでその後の５世代に伝達することができる。
早期着床前マウス胚幹細胞からインビトロで胚幹（ＥＳ）細胞を誘導する方法は周知である。例えば、Ｅｖａｎｓら、１９８１ Ｎａｔｕｒｅ２９：１５４−１５６およびＭａｒｔｉｎ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：７６３４ ７６３８参照。線維芽細胞のフィーダー１０層または分化阻害源が存在するならば、ＥＳ細胞を未分化状態において継代することができる。「体細胞」なる用語は、精子または卵細胞でないか、または精子または卵細胞になることができる任意の動物またはヒト細胞を示す。「生殖細胞」または「生殖細胞系」なる用語は、精子または卵細胞の何れかであるか、または精子または卵細胞に発達することができ、従ってその遺伝子情報を子孫に伝えることができる任意の細胞を意味する。「生殖細胞系トランスジェニック動物」なる用語は、遺伝子情報が生殖細胞系中に組み入れられ、これにより情報を子孫に伝える能力を付与するトランスジェニック動物を意味する。このような子孫が実際に情報の一部または全部を有するならば、これらもトランスジェニック動物である。
遺伝子情報の遺伝子変更は、受容体が所属する動物の種について異種であってもよいし、特定の個々の受容体に対してのみ異種であってもよい。後者の場合、変更または導入された遺伝子を本来の遺伝子と異なるように発現することができる。
本明細書において用いられる場合、「トランス遺伝子」は、人間の介入により動物の生殖細胞系中に導入されたＤＮＡ配列である。
本明細書において用いられる場合、「表現型」とは、生物の観察可能な性質（遺伝子型と対照的に、すなわち、生物の遺伝子組成）を意味する。一具体例において、「表現型」とは、細胞の全体的な、物理的、生化学的、および生理学的構造、例えば任意の特性または特性群を有するものを意味する。
トランスジェニック動物を調製するための一般法は当該分野において公知であり、例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｌｅｎｎ Ｍ．ＭｏｎａｓｔｅｒｓｋｙおよびＪａｍｅｓ Ｍ．Ｒｏｂｌ編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９５）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｃａｒｌ Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９９４）；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｌｏｕｉｓ Ｍａｒｉｅ Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ（Ｃｈａｉｍ Ｏ．Ｊａｃｏｂ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９４）；Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）（Ａｎｇｅｌ Ｃｉｄ−ＡｒｒｅｇｕｉおよびＡｌｅｊａｎｄｒｏ Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｒａｎｃａ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ１９９８）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂｒｉｇｉｄ Ｈｏｇａｎら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ１９９４）に記載されている。導入されたＤＮＡの存在ならびにその発現を評価する方法は容易に利用可能であり、当該分野において周知である。このような方法は、これらに限定されるわけではないが、外因性ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を検出するためのウエスタンブロットを包含する。該方法は、ＰＡＩＧＢ遺伝子の発現を検出するための免疫学的および組織化学的技術を包含する。
ＰＡＩＧＢが骨関連障害において役割を果たすかどうか決定するために、骨において完全長遺伝子（エクソン１、２、３）を過剰発現したトランスジェニックマウスを調製した。骨において前記配列の任意のフラグメント、例えばエクソン２スプライス変異体を過剰発現するトランスジェニックマウスも調製することができる。骨ならびに骨以外の組織におけるＰＡＩＧＢの両形態の広範囲の過剰発現を確立するために、ユビキタスプロモーター（例えば、ＣＭＶ β−アクチン）を用いることができる。加えて、ＰＡＩＧＢの発現は、ミフェプリストン依存性遺伝子誘発可能な系を用いて条件付にすることができる。ラットｃＤＮＡの骨特異性過剰発現は、ラット３．６ｋｂＩ型コラーゲンまたはラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモーターなどのプロモーターにより行うことができる。ラット３．６ｋｂＩ型コラーゲンプロモーターは、発達中の骨において早期発現を提供するのに有用であるが、ラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモーターはさらに骨限定性パターンの発現を付与する。同じ構築物は、トランスジェニックラットを生成させるためにも用いられる。ＰＡＩＧＢの条件付発現について、オステオカルシンプロモーター（Ｃａｐｐａｒｅｌｌｉ、Ｆ．Ｂ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：２１０９−２１１６、１９９７）は遺伝子誘発系を推進し、Ｇａｌ４最小プロモーターはＰＡＩＧＢを推進する。独立したトランスジェニック系を交配し、要求に応じてＰＡＩＧＢ発現を調節するために二重トランスジェニックマウスをミフェプリストンで処置する。トランスジェニックマウスの表現型検査は、インビボおよびエクスビボ検定の組み合わせを含み得る。このような表現型検査はＢＭＤ分析（ｐＱＣＴ）、ミクロＣＴ分析により測定される微細構造分析（骨体積、伝導性密度、梁数、梁間隔、梁太さなど）を包含し得る。他の分析は、活発に鉱化する骨中に組み入れるカルセインにより決定されるミネラル付加率を測定することを含む。さらに、トランス遺伝子の骨表現型に対する影響は、骨芽細胞数、破骨細胞数、ならびにアポトーシス骨芽細胞の数を測定することにより組織学的レベルについて評価することができる。同化作用は、ＰＡＩＧＢ分子が確かに骨粗鬆症の有望な新規標的であるという考えの証拠を提供する。さらに、ＰＡＩＧＢ過剰発現がこれらの確立された骨減少症モデルにおいてラットおよびマウスにおける卵巣切除による誘発された骨減少症を救うことができるかどうかを決定するためにこれらのトランスジェニック動物が用いられる（Ｙ．Ｐ．Ｋｈａｒｏｄｅら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１４（１）：Ｓ５２３、１９９９、Ｙ．Ｐ．Ｋｈａｒｏｄｅら、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１６（１）：Ｓ５４０、２００１）。
トランスジェニック動物を、扁平骨（頭蓋骨、肩甲骨、下顎骨および回腸）および長骨または軸骨（脛骨、大腿骨および上腕骨）およびその他当該分野において公知の様々な組織形態測定パラメータを有するものを包含する骨格の様々な骨の骨表現型の分析に用いることができる。骨表現型は、オステオカルシン、アルカリホスファターゼ、Ｉ型コラーゲンの産生ならびに骨量および骨パラメータにおける変化により特徴づけることができる。オステオカルシン、アルカリホスファターゼおよびＩ型コラーゲンは骨芽細胞、または骨組織についての公知マーカーである。
骨パラメータは、骨密度、骨強度、骨梁数、骨サイズ、骨組織結合性などを意味する。
加えて、ＰＡＩＧＢトランスジェニック動物を、卵巣切除により誘発される骨減少症、グルココルチコイドにより誘発される骨減少症をはじめとする様々な骨損失モデル、および様々な廃用モデルおよびその他当該分野において公知のものにおいて骨損失から保護されるかどうかを試験することができる。同化様式（相乗的、付加的）または異化的方法で骨表現型をさらに修飾するために、様々な骨同化剤（例えば、同定された小分子）の組み合わせの有効性を調査し、測定することができる。
ＰＡＩＧＢトランスジェニック動物は、骨関連障害の治療に有効な薬剤を同定するために用いることができる。薬剤を本発明のトランスジェニック動物に投与することができる。処置された動物における細胞におけるＰＡＩＧＢ発現における変更を測定し、未処置対照動物におけるＰＡＩＧＢ発現と比較することができる。
ＰＡＩＧＢトランスジェニック動物は、骨先祖および骨芽細胞活性、増殖速度およびアポトーシス速度（これらは集合的に骨形成に影響を及ぼす）におけるＰＡＩＧＢの役割を研究するために使用できる。
本発明はさらに、ＰＡＩＧＢ遺伝子が不活化された動物を提供する。これはマウスにおいて、例えば不活化されたＰＡＩＧＢの結果のインビボ試験のための試験モデルとして生じ得る。野生型動物における結果（すなわち、不活化ＰＡＩＧＢ以外はノックアウト動物に対応する）をノックアウト動物における結果と比較して、薬剤または化合物が試験されたかどうかを確認することができる。先行技術において提供されたデータに基づいて、ノックアウト系は、例えば遺伝子修飾を用いて達成することができる。例えば、動物のＰＡＩＧＢ遺伝子の１つの一方または両方のコピーは、ホモローガスな組み換えまたは遺伝子ターゲティングにより部分的または完全に欠失させることができるか、またはホモローガスな組み換えまたは外因性配列の遺伝子ターゲティングにより不活化させることができる。
一具体例において、本発明はノックアウトＰＡＩＧＢマウスを発生させるための遺伝子情報を提供する。加えて、ＰＡＩＧＢ配列中に突然変異を導入し、これにより機能的ＰＡＩＧＢ遺伝子をもはや発現しない動物を生成させることにより、ノックアウト動物を発生させることができる。このようなノックアウト動物は、例えば骨関連障害におけるＰＡＩＧＢの役割を研究するために有用である。
可能性のある致死率の問題を回避するために、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（Ａｎｄｒａｓ Ｎａｇｙ，Ｇｅｎｅｓｉｓ２６：９９−１０９，２０００）システムを使用できる。これにより、標的遺伝子の組織特異性または誘発可能な発現が可能になる。
従って、特に骨におけるＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する条件付１２９Ｓｖ／Ｅｖマウスノックアウトを調製する。脳において発現されたＰＡＩＧＢ遺伝子およびこの組織において発現されたヌル対立遺伝子は胎児死亡率につながり得る。従って、ＰＡＩＧＢが無い動物を調製するために条件付方法を選択する。骨における標的とされる対立遺伝子の欠失は、遺伝子標的動物をＣｒｅを特に骨において発現するトランスジェニックマウスと交配することにより行われる。Ｃｒｅが、ラット３．６ｋｂＩ型コラーゲンプロモーターまたはラット１．７ｋｂオステオカルシンプロモーターの何れかにより促進される１２９Ｓｖ／Ｅｖトランスジェニックマウスを調製する。これらのＣｒｅトランスジェニック動物の機能性を、ＲＯＳＡトランスジェニックマウスとの交配種（これらのマウスはｌｏｘ Ｐ部位で両端を挟まれたｌａｃＺを有する）において試験し、その結果、Ｃｒｅ活性の指標として骨においてｌａｃＺが発現される。加えて、ｌａｃＺおよびＥＧＦＰを含有するＺ／ＥＧダブルレポータートランスジェニックマウスを用いることができる。エクソン１および追加の５’配列（配列番号１５）を含む７９０ｂｐのＰＡＩＧＢプローブを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングにより、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからマウスＢＡＣクローンを入手する。ＰＡＩＧＢ遺伝子が存在すると確認されるならば、ＢＡＣクローンを用いて遺伝子ターゲティングベクターを構築することができる。遺伝子ターゲティングベクターは、ｆｒｔ部位（必要ならばｆｌｐリコンビナーゼ依存性除去のために）および欠失される領域の上流および下流に位置するｌｏｘＰ部位に挟まれたネオマイシン選択カセットを含む。
予想される表現型は、骨発生が正常でないか、または骨疾患において見られる骨損失に類似しているものである。標的とされる動物の表現型検査は、インビボおよびエクスビボ検定の組み合わせを含む。成人において正常な骨または再形成骨が正常に発生しないことにより、骨発生におけるＰＡＩＧＢの役割が提供され、骨関連障害の新規標的としての使用が提供される。
扁平骨（頭蓋骨、肩甲骨、下顎骨および回腸）および長骨または軸骨（脛骨、大腿骨と上腕骨）およびその他、当該分野において公知の様々な組織形態測定パラメータを含む骨格の様々な骨の骨表現型を分析するためにノックアウト動物を用いることができる。
加えて、ＰＡＩＧＢノックアウト動物は、小分子などの様々な薬剤のＰＡＩＧＢ活性の調節に対する効果、特異性および依存性を分析するために用いることができる。
さらに、ＰＡＩＧＢノックアウト動物は、ＰＡＩＧＢの不在下での骨先祖および骨芽細胞活性、増殖速度およびアポトーシス速度を評価するために用いることができる。
実施例
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に定義する。実施例においては、特に記載しない限り、全ての部および百分率は重量基準であり、度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好ましい具体例を示すが、例示のためだけに提供されると理解すべきである。前記論議、具体例およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の新規示唆から実質的に逸脱することなく、その精神および範囲から逸脱することなく、例において多くの修正
が可能であることを確認でき、これを様々な用途および条件に適用するために多くの変更および修正を行うことができる。従って、このような修正は全て以下の請求の範囲において定義されるような本発明の範囲内に含まれることを意図される。
一般法
差次的に発現された遺伝子の迅速増幅（ＲＡＤＥ）
全ＲＮＡを単離し、各ＲＮＡサンプルを次いで２０単位のＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＺＸ）で処理した。ＲＮＡ洗浄後、サンプルを３つの逆転写酵素（ＲＴ）反応に分割した。各ＲＴ反応物は、４μｇのＲＮＡ、１０００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴ（Ｇｉｂｃｏ）、１００μＭのｄＮＴＰおよび０．２μＭのアンカープライマーを最終体積１００μｌ中に含んでいた。アンカープライマーは配列（５’→３’）Ｔ１１Ａ、Ｔ１１Ｃ、またはＴ１１Ｇを有していた。差次的発現のために、各ｃＤＮＡサンプルを二回ずつ、適当なアンカープライマーおよび８０の任意のプライマー（ＨＡＰｓ１〜８０；Ｇｅｎｈｕｎｔｅｒ）のうちの一つを用いて８０ＰＣＲ反応に付した。ＰＣＲ反応は、最終体積２０ｕｌ、２０ｎｇのｃＤＮＡ、２μＭのｄＮＴＰ、０．２μＭのアンカープライマー、０．２μＭの任意のプライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢ）、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および２．５μＣｉの［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰ（２０００Ｃｉ／ミリモル）を含んでいた。ＰＣＲ条件は、次の通りであった：９２℃／２’を１サイクル；［９２℃／１５”、４０℃／２’、７２℃／３０”］を４０サイクル、および７２℃／５’を１サイクル。ＰＣＲサンプルを次いで５０ｃｍ６％シーケンシングゲル上にロードし、２００ボルト一定で行った。差次的に発現されたバンドを乾燥したゲルから切り取った。差次的発現ゲルから回収されたＤＮＡサンプルを再増幅するために、もとの反応と同じプライマーおよびＰＣＲ条件を用いた。生成物をｐＧｅｍ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に結紮した。
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ単離を骨ならびに実験中に使用した異なる細胞系に関して行った。ＲＮＡをラット脛骨から次のようにして単離した。ＣＯ２窒息により安楽死させた後、加熱滅菌された器具でできるだけ迅速に脛骨から軟組織を切除し、エタノールをしみこませた加熱滅菌されたガーゼで拭き、骨端を成長板に近いところで手で砕き、捨てた。脛骨を次いで横方向に骨用カッターで、近接した成長板から遠位および遠位の脛骨−腓骨接合部の近位で切り、骨梁および骨髄を露出させた。Ｌａｎｃｅｒ液体トランスファーピペット（Ｏｘｆｏｒｄ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｓｔ Ｌｕｉｓ，ＭＯ）を用いて骨梁および髄腔を氷冷無菌ＰＢＳで洗い流して骨髄を除去し、洗浄された骨を液体窒素中に入れた。
１００％エタノールでリンスし、液体窒素中であらかじめ冷却されたＢｅｓｓｍａｎ組織微粉砕器（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を使用して、４の脛骨を同時に粉末にし、これを次いで４ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含む５０ｍｌの試験管中に移した。粉末を次いで、携帯型Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｅｒホモジナイザー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いてさらに均質化し、その後、ＲＮＡを回収できるまで試験管をドライアイス上に置いた。ＲＮＡを同じ日に回収するか；またはサンプルをＴｒｉｚｏｌ中、−８０℃で保存した。
凍結サンプルを室温にし、１２０００ｇで１０分間遠心分離して、過剰のミネラルを除去した。上清を集め、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌあたり０．２ｍｌのクロロホルムを添加した。試験管を激しく振とうし、室温で２〜３分間静置した後、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。水性層（上層）を次いで新しい試験管に移し、使用したＴｒｉｚｏｌ１ｍｌあたり０．５ｍｌのクロロホルムを添加した。これをＲＴで１０分間インキュベートし、次いで４℃、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、ＲＮＡペレットを冷７５％エタノール：２５％無ＲＮＡｓｅ水（使用したトリゾール１ｍｌあたり１ｍｌのエタノール）で撹拌することにより洗浄し、次いで７５００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。上清を除去した後、ペレットを簡単に乾燥し、無菌水中に再懸濁させ、−８０℃で保存した。
他の実験において、ＲＯＳ１７／２．８およびＵＭＲ１０６ラット骨芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６６１）、Ｃ３ＨＴ１０１／２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２６から得られるマウス繊維芽細胞）およびヒトＵ２ＯＳ骨芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ９６）を使用した。処理された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲＮＡ−Ｂｅｅ試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ Ｉｎｃ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、ＴＸ）の何れかで単離した。ＲＮＡの最終単離は、製造業者の指示に従って行った。
ノザンブロット
単離されたＲＮＡを１×ＭＯＰＳ（（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液）およびホルムアミド中、１．２％アガロースゲルにかけた。ＲＮＡゲルを１×ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ）中で流した。製造業者（Ｓ＆Ｓ）により提供された使用説明書に従ってＴｕｒｂｏ−ｂｌｏｔを用いてＲＮＡをナイロン膜（Ｓ＆Ｓ）上に移した。使用説明書に従ってランダムプライム標識キット（Ｇｉｂｃｏ，ＢＲＬ）を用いてＲＡＤＥフラグメントならびにＧＡＰＤＨまたはシクロフィリンを標識した。標識されたプローブでのハイブリダイゼーションを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｓｉｇｍａ）を用いて６８℃で一夜行った。ブロットを、室温で１５分間、低強度緩衝液（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で２回、６５℃で１５分間、低強度緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で１回洗浄した。Ｋｏｄａｋフィルムを用いてブロットを一夜露光した。
ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）
ＰＡＩＧＢポリヌクレオチド配列およびＧＡＰＤＨならびに１８ＳリボソームＲＮＡに対するプローブおよびプライマーを用いてＲＮＡサンプルをＲＴ−ＰＣＲおよびＴａｑ−ｍａｎ分析に付した。製造業者の勧告に従ってＴａＫａＲａキット（Ｐａｎｖｅｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ反応は、次の条件下で行った：３０℃で１０分、４２℃で５０分、９９℃で５分、および４℃で５分。ＰＣＲ条件は次のとおりであった：９４℃で５分、９４℃で２分、６２℃で３０”、７２℃で１分３０秒、および７２℃で１０分を３５サイクル。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で分離した。
出願者らは、遺伝子特異性プローブおよびプライマーおよび１８ＳリボソームＲＮＡプローブおよびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入したプライマー組を用いて、あらかじめＤＮＡｓｅ処理したサンプル上で多重リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析を行なった。サンプルをＡｍｂｉｏｎ（無ＤＮＡキット）により提供されたプロトコルにしたがってＤＮＡｓｅ処理した。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＡＩＧＢのプライマーを、プライマー発現コンピュータープログラムを用いて同定した。ラットＰＡＩＧＢ ＴａｑＭａｎプローブの配列は、６ＦＡＭ−５’ＣＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＡ（配列番号１６）であり、前進および逆プライマーはそれぞれ、５’ＣＣＡＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＴＴ３’（配列番号１７）および５’ＴＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＡＣ３’（配列番号１８）であった。プローブの最終濃度は、ＰＡＩＧＢおよび１８ＳリボソームＲＮＡまたはＧＡＰＤＨについては５００ｎＭおよび４０ｎＭであった。プライマーの濃度は、ＰＡＩＧＢ前進および逆プライマーについては５００ｎＭ、１８Ｓプライマーは前進および逆プライマーについてはそれぞれ１０および２０ｎＭまたはＧＡＰＤＨプライマーについては４０ｎＭであった。ラットサンプルの標準をラット脛骨または脳ＲＮＡから２５０ｎｇ〜０．１ｎｇの範囲で調製し、マウス特異性ＴａｑＭａｎの標準は、マウス脳ＲＮＡから調製し、ヒト標準は、同じ濃度範囲に及ぶヒト脳ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から調製した。マウスＰＡＩＧＢのプライマーおよびプローブは次の通りであった：前進５’ＴＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＧ３’（配列番号１９）、逆５’ＧＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＧＧ３’（配列番号２０）アンチセンスおよびプローブ５’６ＦＡＭ−ＴＧＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＧＡ（配列番号：２１）。ヒトＰＡＩＧＢについてのプライマーおよびプローブは次の通りであった：５’ＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＡ３’（配列番号２２）、逆５’ＧＡＴＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡ３’（配列番号２３）、およびＰＲＯＢＥ５’６ＦＡＭ−ＡＣＣＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＡＧＡＣＡＴＴＧＣ３’（配列番号２４）。Ｔａｑ−ｍａｎ分析は、ＡＢＩ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いて次の条件下で行った：４８℃で３０分、９５℃で１０分、および９５℃で１５秒および６０℃で６０秒を４０サイクル。リアルタイムＰＣＲ分析を、（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）プログラムを用いて行った。
５’ＲＡＣＥ
５’ＲＡＣＥを、製造業者の勧告に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ５’ＲＡＣＥキットを用いてラット脳および脛骨から得られるＲＮＡサンプルに関して行った。簡単に説明すると、３ラウンドの５’ＲＡＣＥを、アダプタープライマーＡＰ１ ５’ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＣＡＧＡ ＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号２５）および遺伝子特異性プライマー：ＧＳＰ１ ５’ＧＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡ ＡＴＧＧＴＴＧＧＴＣＣＴ ３’（配列番号２６）、ＧＳＰ２ ５’ＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＣＧＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧ ３’（配列番号２７）およびＧＳＰ３ ５’ＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＧ ３（配列番号２８’）を用いて行った。第一のｃＤＮＡ鎖を合成するためにＰｏｌｙＡ ＲＮＡを用いた。第二のｃＤＮＡ鎖を合成し、アダプターをこれと結紮した。ＡＰ１（アダプタープライマー１）および遺伝子特異性プライマーをそれぞれ前進および逆プライマーとして使用し、次の条件を用いて５’ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った：９４℃で３０秒、９４℃で５秒、７２℃で４分を５サイクル、９４℃で５秒、７０℃で４分を５サイクル、９４℃で５秒および６８℃で４分を２５サイクル。ＰＣＲ反応物をＴ−Ａクローニングベクター中に結紮した。異なるサイズの挿入物を含有するクローンから単離されたＤＮＡをシーケンシングに付した。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＰＡＩＧＢを表す完全長ｃＤＮＡクローンを得るために、ラムダＺＡＰ ＩＩラット脳ｃＤＮＡライブラリーを使用した。ラムダＺＡＰ ＩＩベクターから効率よくインビボ切除ができるようにし、ラムダベクター内に含まれる任意のクローンされた挿入物の再環化されてクローン挿入物を含有するファージミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−））を形成できるように、このライブラリーを選択した。ライブラリースクリーンは、製造業者の勧告にしたがって行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。ＲＡＤＥ挿入物をプローブとして用いて、３ラウンドのスクリーニングを行った。正のクローンが同定されたら、Ｔ３およびＴ７プライマーならびに内部プライマーを用いたシーケンシングに挿入物を付した。
細胞培養
本発明者らの実験においては５の細胞種を主に使用した。中程度のレベルのＰＴＨレセプター１（Ｒｏｄａｎら、Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １：８５−９８、１９９１）を発現するラット骨芽細胞系（ＲＯＳ１７／２．８）を用いてインビトロ実験を行った。ＲＯＳ細胞を標準細胞培養条件下に維持した：ダルベッコの修飾イーグル培地と栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）培地中１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘ。代表的マウス先祖細胞系としてマウス細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２２６）を、１０％熱不活化ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中に維持した。ＵＭＲ１０６ラット骨芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６６１）を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘで補足したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｕ２ＯＳヒト骨芽細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ９６）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘで補足したマッコイの５Ａ Ｍｄｉｕｍ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ中で培養した。ヒトＨＯＢ−Ｏ３−ＣＥ６細胞系（Ｂｏｄｉｎｅ、Ｖ．Ｎ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５：３６８−３８７、１９９７）を、１０％熱不活化ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｇｌｕｔａｍａｘで補足したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。
インビトロ細胞培養実験において使用した化合物は次の通りであった：Ｂｉａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）から購入したヒトＰＴＨ（１−３４）、ＳＱ２２５３６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、イソプロテレノールおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、）から購入し、カルシトニン（Ｓａｌｍｏｎ Ｔ−３６６０）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、骨形成タンパク質２および６（ＢＭＰ２、ＢＭＰ６）およびＰＫＣ１９−２７の阻害物質はＣａｌｂｉｃｈｅｍ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、）から入手した。
近位脛骨における全および骨梁ＢＭＤの測定
近位脛骨の合計密度を、周辺定量的コンピューター断層撮影法（ｐＱＣＴ）とＸＣＴ−９６０Ｍ（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて麻酔したラットにおいて評価した。基準および治療後測定を麻酔したラットにおいて次のようにして行った：右後脚を直径２５ｍｍのポリカーボネートチューブ中に通し、脚関節９０°、膝関節１８０°でアクリル製フレームにテープで固定した。ポリカーボネートチューブをｐＱＣＴの開口部に対して垂直に維持されたスライド式の台に貼り付けた。大腿骨の遠位端および脛骨の近位端が走査範囲に入るように台を調節した。二次元スカウトビュー（ｓｃｏｕｔ ｖｉｅｗ）を長さ１０ｃｍ、線解像度０．２ｍｍで実行した。スカウトビューがモニターに表示された後、脛骨の近位端の位置を確認した。ｐＱＣＴスキャンをこの地点から３．４ｍｍ離れたところで開始した。ｐＱＣＴスキャンは１ｍｍ厚さであり、０．１４０ｍｍのボクセル（３次元ピクセル）サイズを有し、１４５のスライスを貫通する突起物からなっていた。ｐＱＣＴスキャンが完了した後、画像がモニターに表示された。脛骨を含むが、腓骨を排除した興味のある領域の概要を示した。反復アルゴリズムを用いて軟組織を自動的に除去した。残存する骨の密度（合計密度）をｍｇ／ｃｍ３で報告した。合計密度における変化を各動物について、治療後および基準合計密度値を差し引くことにより計算した。
動物実験
４週令のメスＷｉｓｔｅｒラットをビヒクル（食塩水）およびヒトＰＴＨ（１−３４）で体重１ｋｇあたり４０μｇの用量で８日間処置した。ＰＴＨ投与前に、動物は卵巣切除された（ＯＶＸ）。ＯＶＸ後３週間で、骨減少症が確立したかどうかを確認するために全ＢＭＤを測定した。１日１回皮下注射がＰＴＨの断続的投与に相当し、皮膚の下に埋め込まれた浸透圧ポンプ（放出速度４０μｇ／ｋｇ／日）がＰＴＨ投与の連続的方法に相当した。治療の第８日に、治療後６時間の動物を殺し、さらに分析するためにサンプルを集めた。各治療群は８匹の動物を含んでいた。
ＰＴＨ（１−３４）の断続的投与による全ＢＭＰの効果
ＰＴＨ（１−３４）を４０μｇ／ｋｇの用量で、８日から３週間、ＯＸＶラットに断続的および連続的方法で投与して、それぞれ同化および異化ＰＴＨ作用を誘発した。一般法の部分に記載したように、ＰＴＨの断続的投与は１日１回ＰＴＨを皮下注射することにより得られ、連続投与は、１日当たり４０μｇ／ｋｇの放出速度で皮膚の下に埋め込まれた浸透圧ポンプを用いて得られた。ｐＱＣＴを用いて全骨ミネラル密度を測定した。断続的ＰＴＨ注射は全ＢＭＤにおいて顕著な増加を誘発し、ΔＢＭＤは８０ｇ／ｃｍ２であった（図１）。連続ＰＴＨ投与はすでに骨減少症である骨において変化を誘発しなかった（図１）。従って、ＰＴＨはその投与法に依存して骨同化および異化作用（すなわち、ＢＭＤにおける減少を引き起こす）に対して影響を及ぼす。
ＲＡＤＥ
断続的および連続的投与後の骨サンプルから全ＲＮＡを単離し、差次的発現分析に付した。２４の差次的に発現された遺伝子は２倍以上の差次的変化を有することが確認された。ＲＡＤＥから得られるＰＡＩＧＢ遺伝子は、断続的注射後の骨から得られるＲＮＡにおいて誘発され（図２）、連続ＰＴＨ注射はＰＡＩＧＢの発現レベルにおいて変化を誘発しなかった。この遺伝子の発現の基礎レベルは、図２Ａ（レーン１、２、５、６）および２Ｂ（レーン１、３）において見られるように非常に低かった。本発明者らの結果から、ＰＡＩＧＢ発現はＰＴＨが断続的方法で投与された場合にのみ誘発されることが示された。ＰＡＩＧＢを表すＤＮＡをＲＡＤＥゲルから単離し、ＰＣＲに付した。４００ｂｐのバンドをよく相関させて、ＲＡＤＥゲルから得られるＰＣＲ産物のサイズを評価した。Ｔ−Ａクローニング後、４００ｂｐのバンドを配列決定し、生物情報工学的分析（ＢＬＡＳＴ検索（ＮＣＢＩ））に付した。初回ＢＬＡＳＴ検索によりＰＡＩＧＢは公知の遺伝子のいずれともマッチしないことが示された。ＥＳＴデータベース検索により、２つの配列が同定され、一方はラットＡｃｃ＃ＡＡ８５０６４０から得られるものであり、もう一方はマウスＡｃｃ＃Ａ１０７０５３３から得られるもので、それぞれＰＡＩＧＢ配列と９８および９９％同一であり、ＰＡＩＧＢは発現された遺伝子であることが確認された。
ラットＰＡＩＧＢのクローニング
脳λＺＡＰ ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）のスクリーニングならびに５’ＲＡＣＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用により、ＰＡＩＧＢの完全長ｃＤＮＡをクローンした。断続的ＰＴＨ処理後の骨ならびに脳（Ｃｌｏｎｏｔｅｃｈ（ＣＡ）複数組織ブロットに関する初回限定ノザンブロット分析は脳におけるＰＡＩＧＢの発現を示した）から得られるＲＮＡサンプルに関して３ラウンドの５’ＲＡＣＥを行った。オリジナルの放射標識されたＰＡＩＧＢ（４００ｂｐ）をライブラリースクリーンのプローブとして使用した。異なるサイズの挿入物を含有する４組のプラスミドから得られるＤＮＡを単離し、両端から配列が少なくとも１００ｂｐ重複するまで配列決定した。異なるクローン間の配列および配置に基づいて、ＯＲＦを含有する２．２ｋｂクローンが得られた。完全長配列を配列番号１に示す。
マウスおよびヒトＰＡＩＧＢのクローニング
ＰＡＩＧＢのラット配列を、マウスおよびヒトＥＳＴデータベースを使用したブラスト分析に付した。同定されたいくつかのＥＳＴはラットＰＡＩＧＢに対して両５’および３’末端で９８％マッチした。ラットおよびマウスと比較したヒトＰＡＩＧＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内のＤＮＡ配列同一性は８７％であった。さらに、ラットおよびマウスと比較したヒトＰＡＩＧＢのアミノ酸配列同一性は８２％であった。ラットＰＡＩＧＢをマウスと比較した場合、ＯＲＦ内に９５％のＤＮＡ配列同一性があり、アミノ酸レベルでは９７％の配列同一性がある。ＰＡＩＧＢのマウス相同体（配列番号７）をクローンするためにＲＴ−ＰＣＲについてマウス特異性プライマー（配列番号２９、３０、３１、３２）を設計した。ヒトＰＡＩＧＢ（配列番号３３）の１０８６ｂｐのフラグメントを、内部設計されたプライマーを用いてクローンした。完全長配列（配列番号３）をその後Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｃＤＮＡクローンをヌクレオチド配列と共にｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６プラスミド中に提供した。ヒトＰＡＩＧＢ配列を完全長ラットＰＡＩＧＢ配列と整列させ、同一性および類似性のレベルを評価した。
ヒト、ラットおよびマウスＰＡＩＧＢの生物情報工学的分析
公的データベースを検索するためにヒトＨＯＢ Ｏ３−ＣＥ６ ｃＤＮＡ（１０８６ｂｐ、配列番号３３）から得られるヒトＰＡＩＧＢ配列を使用した。ヒットテンプレートＩＤ−４６４６１６．１９のＩｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ Ｇｏｌｄ Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｉｎｃｙｔｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、２８２４ｂｐフラグメントを見いだした。Ｅ値は０．０であり、同一性は１０９３／１０９４（９９％）であった。これは１４５アミノ酸タンパク質をコード化する。４７４６１６．１９をｂｌａｓｔｎ Ｃｅｌｅｒａヒトゲノム配列データベースに対して使用することにより、ヒト完全長ＰＡＩＧＢは３つのエクソンを有し、最初のメチオニンはエクソン１中にあることが見いだされた。
マウスＰＡＩＧＢは、ヒトタンパク質配列をｂｌａｓｔｎ Ｃｅｌｅｒａマウスゲノムフラグメント配列データベースに対して使用することにより見いだされた。さらに、完全長ラットクローンを配列化し、その配列は、ヒトよびマウスオルトログとマッチした。
転写の開始を確認するために、マウス、およびヒトの５’配列をＣｅｌｅｒａデータベースから抽出し、互いに、ならびにラット配列と比較した。３種の全てにおいて、最初のメチオニンの前に長い５’リーディングフレームがある。４７４６１６．１９をｂｌａｓｔ公的ＥＳＴデータベースＥＳＴ ＡＵ１２０９１７に対して使用することにより、５’末端に５ｂｐが付加され、リーディングフレームはオープンに保たれていることが確認された（予想値＝０．０、同一性＝７４０／７４４（９９％））。しかしながら、ヒト５’転写配列と高い相同性を有するマウス５’配列において、停止コドンが見いだされた。このことは、本出願者らがマウスにおいて完全長遺伝子を得たことを示す。ｃＤＮＡおよびタンパク質配列を、図３および４においてヒト、マウスおよびラットについて示す。
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複ＧｅｎＢｎａｋ ＣＤＳ翻訳、３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含む）に含まれる配列に対する類似性に関してＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３）；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照）検索を行うことにより、生成した遺伝子配列を同定した。得られた４．５×ＤＮ配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｒｏｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて分析した。簡便のために、ＢＬＡＳＴにより計算される可能性によってのみｃＤＮＡ配列と検索データベースに含まれる配列との合致が認められる予想値を本発明において「Ｅ」値として記録する。Ｅ値は、合致の統計的優位性を評価し、このサイズのデータベースの検索において全く偶然に予想される合致数を所定の点数で明示する。
ヒトおよびマウスＰＡＩＧＢスプライス変異体の同定およびクローニング
ヒトおよびマウス脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を逆転写反応のテンプレート（Ｔａｋａｒａ，Ｐａｎｖｅｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）として使用して、ヒト（配列番号５）およびマウス（配列番号９）のクローニングを行った。逆転写反応を、ヒト（配列番号３４、３５）およびマウス（配列番号３１、３２）特異性プライマー、エロンガーゼ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いたＰＣＲ増幅に付し、ＧＣ溶融物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で補足した。ＰＣＲ産物を続いてｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローンした。クローンされた配列はヒトおよびマウスＰＡＩＧＢを含み、これはエクソン１、３を含有し、エクソン２が無かった。
ＰＡＩＧＢ発現のノザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＡＤＥ実験データから得られるデータを確認するために、断続的および連続的ＰＴＨ注射後のラット脛骨から得られるＲＮＡサンプルに関してノザンブロット分析を行った。図２Ｂに示されるように、ＰＡＩＧＢ発現は断続的に処置されたラットから得られるサンプルにおいてのみ検出され、ビヒクルまたは連続的ＰＴＨ処置を受けたラットにおいては検出されなかった。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒ分析により、ビヒクル処理されたラットの脛骨ＲＮＡサンプルからのものと比較した場合に３６倍の増加が明らかになった。加えて、複数組織ノザンブロットを商業的に入手可能なブロットにより提供されるサンプルについて行った。ノザンブロット分析により、脳においてはＰＡＩＧＢの非常に豊富な発現が示されたが、心臓および肺においてはほとんど発現されなかった。脾臓、肝臓、骨格筋、腎臓および精巣はＰＡＩＧＢの発現を示さなかった（図５）。
ＰＡＩＧＢのヒトおよびマウス完全長および類似体の発現パターンを決定するために、本発明者らは一般法に記載されたヒトおよびマウスプライマー（配列番号３６、３７、３８、３９）を使用した。ヒトおよびマウス起源の２４の組織から得られるＯｒｉｇｅｎｅ ｃＤＮＡパネルを使用した。図６および７に示すデータは、ヒトおよびマウスＰＡＩＧＢの発現パターンが、マウス複数組織ノザンブロットにおいて見られるものと類似していることを示す。脳においては高レベルの発現があり、心臓および肝臓においては、発現はより少なかった。加えて、Ｏｒｉｇｅｎｅパネルは成人副腎ならびに１２．５および１９日令の胚から得られるサンプルにおいて著しいレベルのＰＡＩＧＢ発現を示した。これらのデータは、胎生後期におけるＰＡＩＧＢの発現を示す。加えて、データは試験された組織のほとんどにおいて、ＰＡＩＧＢ完全長およびエクソン２スプライス変異体はどちらも同時発現されることを示す。
異なる組織におけるＰＡＩＧＢの発現に対する断続的ＰＴＨ注射の効果
断続的ＰＴＨ投与後の骨において観察されるＰＡＩＧＢの発現の増大が、脳、腎臓および心臓、ＰＡＩＧＢ発現が観察される組織においても見られるかどうかを調べるために、本発明者らはこれらの組織から得られるＲＮＡについてリアルタイムＰＣＲ分析を行った。図８についてみられるように、ＰＴＨの断続的注射は試験された組織においてＰＡＩＧＢ発現の変化を生じず、このことは、ＰＴＨのＰＡＩＧＢ発現に対する効果は骨特異的であることを示す。
ＰＴＨ処置−インサイチュハイブリダイゼーションの前後での頭蓋冠におけるＰＡＩＧＢ発現の調査
ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡ発現のインサイチュ分析を、ヒト骨バイオプシーサンプルをはじめとする様々な動物種において、または骨形成剤で処理されたマウス、ラット、イヌ骨サンプルなどから評価することができる。１００μｇ／ｋｇ／日のＰＴＨ１−３４で３０日間皮下的に処理されたＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス。マウス頭蓋冠をやさしく解剖し、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。固定後、骨をＴＢＤ−２脱灰剤（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中で７〜８時間脱灰し、次いで等級品アルコール中で脱水した。頭蓋冠を続いて、ラムダ形縫合および冠状縫合に平行に頭頂骨の中心部分を通って矢状縫合に対して垂直に二分し、パラフィン中に埋め込んだ（大腿骨および脛骨サンプルはパラフィン中に縦方向に埋め込んだ）。４〜６の５μｍ厚さの代表的非連続工程断片をさらに分析するために切断した。選択された断片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で染色し、隣接する部分をインサイチュハイブリダイゼーションに使用した。ＥＣＯＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫプラスミド（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）中に結紮することによりｐＣＲ−Ｂｌｕｔ ＩＩ−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からマウスＰＡＩＧＢ配列のフラグメント（３９８ｂｐ産物）（配列番号４０）をサブクローニングすることにより、インサイチュハイブリダイゼーションのプローブを調製した。０．５ｍＣｉの３５Ｓ標識されたα−ＵＴＰとＴ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をそれぞれ使用してアンチセンスおよびセンスプローブを続いて調製するためにプラスミドを直線化するためにＳａｌ Ｉ部位を使用した。３×１０４ｃｐｍ／μｌのプローブ濃度を用いて断片をハイブリッド形成させた。厳重に洗浄した後、標準的オートラジオグラフィーのために断片を処理した。明視野または暗視野のいずれかのＮｉｋｏｎ顕微鏡を用いてｍＲＮＡの発現を評価した。明視野および暗視野画像により示されるように、ＯＶＸマウスの頭蓋冠においてはＰＡＩＧＢの発現は微量ないしゼロであり、一方、ＰＴＨ処理されたマウスにおいて骨膜における骨表面に隣接する骨芽細胞においてはＰＡＩＧＢが誘発された（図９）。
ラットにおける断続的ＰＴＨ投与中の骨におけるＰＡＩＧＢ発現の経時変化
最初の実験は処置後８日のラット脛骨におけるＰＡＩＧＢの発現を測定した。ＰＡＩＧＢ発現に対するＰＴＨ作用の経時変化を調べるために、断続的ＰＴＨ注射（体重１ｋｇあたり４０μｇ）で処置されたラットに関して実験を行い、ＲＮＡ単離ならびにＢＭＤ変化における評価のために脛骨を集めた。サンプル収集の時点は断続的ＰＴＨ処置の６時間後、２日後、４日後および８日後であった。前記プライマーを用いて単離されたＲＮＡサンプルに関してリアルタイムＰＣＲ分析を行った。図１０Ａに示されるデータは、ＰＴＨで２日処理した後に約２０倍のＰＡＩＧＢの増加が観察されたことを示す。同じ規模のＰＴＨの効果は、ＰＴＨ処理後４日および８日にも観察された。
ＰＴＨで処理された骨におけるＰＡＩＧＢ発現において観察される増加は用量依存性である（図１０Ｂ）。骨減少症が確立されたＯＶＸラットを、ヒトＰＴＨ（１−３４）の濃度を増加させて処理した：体重１ｋｇあたり５、１０、２０、４０および８０μｇ、一日１回注射。最後の注射の６時間後、動物を殺し、実験法の部分において記載されるようなＲＮＡ単離のために骨サンプルを収穫した。ＰＡＩＧＢ発現のリアルタイムＰＣＲ分析により、ＰＴＨ５、１０および２０μｇ／ｋｇの低用量ではＰＡＩＧＢ発現に対して効果はなかったが、４０および８０μｇ／ｋｇではそれぞれ１０倍および２０倍の増加に至った。これらのデータは骨形成を誘発したＰＴＨの用量に関する開示された報告とよく一致する（同化ＰＴＨ効果）。
骨におけるＰＡＩＧＢの発現
断続的ＰＴＨ処理でのＰＡＩＧＢ発現における変化がＰＴＨの骨に対する効果と相関するかどうかを調べるために、ＰＴＨで２、４および８日処理したラットから得られるサンプルを全骨および骨梁の両方に関するＢＭＤ測定に付した（近位頸骨の骨梁密度を測定した）。２日のＰＴＨ処理はＰＡＩＧＢの発現を増大させた。同じ時点で、骨梁ＢＭＤにおいて著しい増加が検出され（Δ骨梁密度：６．９８±１７．９０（ＰＴＨ処理）ｖｓ−２７．１±９．２７（ビヒクル処理））、全ＢＭＤにおいては有意な変化は無かった（Δ全密度：−９．１５±２．９４（ＰＴＨ）ｖｓ０．６９±４．１０（ビヒクル））（表１）。
断続的ＰＴＨ注射の４日後、ＰＡＩＧＢの発現はビヒクル処理されたラットの２０倍であった。全身体および骨梁ＢＭＤを同じ時点で測定した。ＰＴＨは全ＢＭＤ（１０．５６±３．１１（ＰＴＨ）ｖｓ−２．９５±−２．２０（ビヒクル））および骨梁ＢＭＤ（８．７０±９．９８（ＰＴＨ）ｖｓ−２０．８±６．６２（ビヒクル））のどちらにおいても有意な増加を誘発した（表２）。骨におけるＰＡＩＧＢの発現はＰＴＨの断続的処置の２および４日後に観察されるＢＭＤにおける変化とよく相関した（表１および表２）。
Figure 2006506067
ａ平均（ｍｇ／ｃｍ３）±ＳＥＭ
Figure 2006506067
 ａ平均（ｍｇ／ｃｍ３）±ＳＥＭ
＊ｐ＜０．０５ｖｓ対応するビヒクル値
＊＊ｐ＜０．０１ｖｓ対応するビヒクル値
ＲＯＳ１７／２．８細胞のＰＴＨ処理
ＰＴＨレセプター（〜８００００レセプター／細胞）を発現するＲＯＳ１７／２．８ラット骨芽細胞系を、ＰＴＨの量を増大させて処理した：１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ。ＰＴＨ処理でのＰＡＩＧＢ発現における変化を調べるために、ラット特異性Ｔａｑ−ｍａｎプローブおよびプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲを使用した。ＰＴＨの濃度を増加させると、図１１Ａに示すようにＰＡＩＧＢ情報における用量依存性増加が誘発された。
ＰＡＩＧＢ発現のＰＴＨ誘発の経時変化を調べた。ＲＯＳ１７／２．８細胞を１０ｎＭ ＰＴＨで処理し、ＲＮＡを処理後１、２、４、６、８および２４時間で収穫した。ＰＡＩＧＢ発現の最大の増加は、４時間であった（２．６６±０．３）。ＰＴＨのＰＡＩＧＢ発現に対する効果は、処理後８時間で完全に無くなった（図１１Ｂ）。
ＰＴＨによるＰＡＩＧＢ発現の調節に関与するシグナル化経路
ＰＴＨによるＰＡＩＧＢ発現の調節に関与するシグナル化経路を調べるために、本出願者らはＳＱ２２５．３６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、アデニレートシクラーゼ阻害剤およびタンパクキナーゼＣ阻害剤（ＰＫＣ）１９−２７、ＰＫＣシグナル化経路の阻害剤の存在下または不在下で１０ｎＭのＰＴＨで処理したＲＯＳ１７／２．８細胞を使用した。細胞を２時間２００μＭのＳＱ２２５３６および１０μＭのＰＫＣ阻害剤で前処理し、ＰＴＨで４時間処理した。この条件下でのＰＡＩＧＢ発現における変化を検出するためにリアルタイムＰＣＲを使用した。阻害剤およびＳＱ２２５３６に関して図１２および１３に示されたデータは、ＰＫＣ阻害剤はＰＴＨにより誘発されたＰＡＩＧＢのブロックにごくわずかから全く影響を及ぼさなかったので、ｃＡＭＰシグナル化経路を活性化することによりＰＴＨはＰＡＩＧＢ発現に対して影響を及ぼすことを示す（図１２）。加えて、ＳＱ２２５３６化合物でのプレインキュベーションはＰＴＨのＰＡＩＧＢに対する効果を完全にブロックする（図１３）。これらのデータは、アデニレートシクラーゼ活性化に対して最小からゼロの影響を及ぼすＰＴＨ３−３４の効果と一致する。
本出願者らは、別のＧ−結合タンパク質レセプター（β−アドレナリン作用性レセプター）の作用物質（イソプロテレノール）は、１０ｎＭ ＰＴＨでの６倍の誘発（データは省略）と比較すると、ＰＡＩＧＢ発現において２倍の増加しか示さないので、ＰＡＩＧＢ発現のＰＴＨ誘発はＰＴＨレセプター特異性であることを明らかにした。ＰＡＩＧＢ発現における増加は、ＲＯＳ１７／２．８およびＵＭＲ１０６骨芽細胞とＦｏｒｓｋｏｌｉｎおよびホスホジエステラーゼＩＶ阻害剤Ｒｏｌｉｐｒａｍにおいても観察され（データは省略）、このことはこれらの薬剤により観察されるＰＡＩＧＢ発現における増加は細胞におけるｃＡＭＰレベルの増加によるものであることを示唆する。まとめると、結果から、ＰＴＨのＰＡＩＧＢ発現に対する効果は、ｃＡＭＰにより媒介されるが、ＰＫＣによって媒介されないことが示唆された。
ＰＡＩＧＢ発現に対する骨形成剤の効果
増加したＰＡＩＧＢ発現がＰＴＨ活性の直接的結果であるか、または骨形成の誘発の結果であるかを調べるために、異なる同化剤をＲＯＳ細胞において試験した。ＲＯＳ細胞を：エストロゲン（１０ｎＭ）、ＰＴＨと組み合わせたエストロゲン、タモキシフェン（０．１μＭ）単独およびＰＴＨとの組み合わせ、カルシトニン（５ｎｇ／ｍｌ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（２種の濃度１０ｎＭおよび１０μＭを使用）およびデキサメタゾン（１００ｎＭ）で処理した。細胞を４時間処理し、ＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ分析のために単離した。加えて、ＲＯＳ細胞をＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）（３００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。ＢＭＰ２での処理は４および２４時間であった。全細胞ＲＮＡを処理された細胞系からＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて単離した。汚染ゲノムＤＮＡをＤＮａｓｅ処理（Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により除去し、製造業者により記載されているようにしてＱｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを続いて洗浄した。一般法の部分に記載されているようにしてサンプルのＴａｑＭａｎ分析を行った。ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡ発現を誘発した薬剤を分析した。
エストロゲン、タモキシフェン、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）およびカルシトニンは４時間の処理後にＰＡＩＧＢ発現に対して影響を及ぼさなかった（図１４）。ＢＭＰ２は処理の２４時間後でさえもＰＡＩＧＢ発現を誘発しなかった。ＰＧＥ２の低い用量でのみＰＧＥ２はＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡ発現を誘発した。加えて、デキサメタゾン処理はＰＡＩＧＢ発現において２〜３倍の増大につながった。試験した骨関連剤において同様の反応がＵＭＲ１０６細胞においても観察された（図１５）。しかしながら、これらの反応の規模はＲＯＳ１７／２．８細胞と比較してＵＭＲ１０６細胞においてはさらに大きかった。加えて、ＵＭＲ１０６細胞において、ビタミンＤ３（ＶｉｔＤ３）とそれほどではないにせよＢＭＰ６はＰＡＩＧＢ発現を誘発した。ＰＧＥ２、ビタミンＤ３およびデキサメタゾンはｃＡＭＰの蓄積を誘発することが知られており、このことにより、なぜＰＡＩＧＢ発現がこれらの薬剤により誘発されるかを説明できる。まとめると、これらのデータは、他の公知同化剤はＰＡＩＧＢ発現に対する影響が著しく小さいので、ＰＴＨの骨芽細胞に対する同化効果によりＰＡＩＧＢ誘発が優先的に媒介されることを強力に示唆する。
ヒトＵ２ＯＳ骨芽細胞におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢ発現の誘発
ヒト骨芽細胞Ｕ２ＯＳ細胞およびラットＵＭＲ１０６細胞を１または１０ｎＭのＰＴＨ１−３４で処理した。ヒトのエクソン２（配列番号４１および４２）およびラットＰＡＩＧＢ（配列番号４３、４４）に対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析は、対照ＵＭＲ１０６ラット骨芽細胞と比較してのヒト骨芽Ｕ２ＯＳ細胞におけるＰＡＩＧＢ発現の誘発を示した（図１６Ａ）。図１６Ｂは、リアルタイムＰＣＲにより測定されるＵ２ＯＳ細胞におけるＰＡＩＧＢ発現の誘発を示す。これらの結果は、ＰＴＨ１−３４がヒト骨芽細胞においてＰＡＩＧＢ発現を誘発できることを示す。
ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡを誘発する薬剤の同定
ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現を誘発できる薬剤の高スループットスクリーンは、間葉系の細胞の処理を含む。これらの細胞は、未分化幹細胞、前骨芽細胞または成熟骨芽細胞と小分子化合物（典型的には１０〜３０ｕＭ）、天然の生成物またはペプチドベースの化合物のいずれかである。１０％ＦＢＳを含有する増殖培地中で細胞を４〜１８時間処理した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて自動化ＲＮＡを単離抽出装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ７００）を用いて全ＲＮＡを単離した。１×１０６細胞からの典型的なＲＮＡの収量は２０ｕｇの全ＲＮＡである。ＲＮＡの単離後、約１００ｎｇのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ分析）により一般法に記載されているようにして分析する。
ＰＡＩＧＢタンパク質発現およびその発現骨形成または骨同化活性を検出するための抗体の使用
図１７におけるウェスタンブロットは、ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのイムノブロッティングにより示されるようなＵ２ＯＳ骨芽細胞において標識された完全長（エクソン１、２、３）ＰＡＩＧＢ−ｖ５タンパク質の発現を表す。ＰＡＩＧＢポリクローナル抗体がＰＡＩＧＢタンパク質を検出する能力を図１８に示す。図１８は、ヒトＰＡＩＧＢ ＯＲＦ（指定されたエクソン１、２、３を含有する完全長、配列番号３）でトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞から得られる核および細胞質抽出物のウェスタンブロットを示す。レーン２、４、６および８はＰＡＩＧＢトランスフェクト細胞の抽出物であり、レーン１、３、５および７は対照プラスミド細胞からの抽出物である。レーン１、２、５および６は細胞質抽出物であり、レーン３、４、７および８は核抽出物であった。ＰＡＩＧＢポリクローナル抗体（配列番号１１に対して惹起）でイムノブロットされたレーン５〜８は、レーン６および８および矢印で示すようにＰＡＩＧＢに対して特異性を示す。負の対照として、レーン１〜４を免疫前血清でイムノブロットした。特に、図１７および１８において、Ｕ２ＯＳ細胞を１００ｍｍ皿中３．１×１０６細胞でシードし、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で希釈された１０μｇのヒトＰＡＩＧＢ ＯＲＦまたは対照ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−ｖ５標識、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２４時間後にトランスフェクトした。順化培地を集め、細胞質および核抽出物を既に記載されているようにして得た（Ｈｅｎｒｙ Ｂ．ＳａｄｏｗｓｋｉおよびＭｉｃｈａｅｌ Ｚ．Ｇｉｌｍａｎ．Ｎａｔｕｒｅ．３６２：７９−８３；１９９３）。簡単に言うと、冷低張性緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．９、２０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａカタログ番号８３４０））を０．２％ＮＰ４０と共に皿に添加して、細胞を溶解させた。サンプルを１６０００×ｇで２０秒間遠心分離して、核をペレット化した。サンプルをついで２０秒間１６０００×ｇで遠心分離して核をペレット化した。５Ｍ ＮａＣｌを上清に添加して１２０ｍＭの最終濃度のＮａＣｌを得た。サンプルを次いで１６０００×ｇで２０分間遠心分離し、グリセロール（最終濃度１０％ｖ／ｖ）を上清に添加した。サンプルの核ペレット部分を、０．２％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中低張緩衝液（４２０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％グリセロールを含有する低張緩衝液）中に再懸濁させた。ペレットを低張緩衝液中で３０分間４℃でインキュベートし、１６０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を集めた。ウェスタンブロット分析を行い、１レーンあたり１４μｇの全タンパク質を１２％Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にかけ、次いでタンパク質をニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。抗ウサギウェスタンブリーズキット（製造業者により記載されているとおり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｖ５モノクローナル抗体の１：１０００希釈または５μｇ／ｍｌ精製ＰＡＩＧＢウサギポリクローナル抗体を用いて、イムノブロッティングを行った。
免疫組織化学的方法、免疫蛍光顕微鏡検査およびフローサイトメトリーによるＰＡＩＧＢタンパク質発現の分析
ＰＡＩＧＢタンパク質発現の免疫組織化学的分析のために、（図１９）細胞を２×１０４〜５×１０４細胞でＬａｂｔｅｋ２またはＬａｂｔｅｋ８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ）にシードし、成長培地中で一夜成長させた。培地を吸引し、新鮮な培地を添加し、続いて実施例１７に記載するような商業的に入手可能な試薬とＰＡＩＧＢ ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。２４〜４８時間のインキュベーション後、細胞を３回冷ＴＢＳ（トリス緩衝塩溶液）で洗浄し、続いて冷メタノールで３０分間固定した。サンプルを５〜１０分間室温で空気乾燥し、次いで３回ＴＢＳでリンスした。サンプルをＴＢＳ中Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）ＡＢＣ−ＡＰブロッキング血清で、室温で２０分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ中でリンスした。サンプルを次いでＤＡＫＯ抗体希釈剤（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ。Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中に希釈した２．５μｇ／ｍｌの一次抗体と共に３０分間室温でインキュベートした。サンプルを続いて３回ＴＢＳ中で洗浄し、希釈されたビオチニル化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートし、次いでＴＢＳ中で洗浄した。サンプルを次いで３０分間Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）ＡＢＣ−ＡＰ試薬中で製造業者により記載されているようにしてインキュベートした。サンプルを次いでＴＢＳで洗浄し、サンプルをアルカリホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに製造業者により記載されているようにしてインキュベートすることにより、染色が観察された。
インビボ免疫組織化学法
ＰＡＩＧＢタンパク質発現の免疫組織化学的分析は、ヒト骨バイオプシーサンプル、マウス、ラット、またはイヌ骨サンプルなどの、潜在的な骨同化剤で処理された様々な動物種において評価することができる。例えば、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを２０μｇ／ｋｇ／日のＰＴＨ１−３４で皮下経路により頭蓋冠上に１８日間処理した。１８日後、頭蓋冠サンプルを収穫し、ＰＡＩＧＢタンパク質発現を、ＰＡＩＧＢポリクローナル抗体を用いて分析した（図２０、図２１および図２２）。２０×対物レンズを用いて、図２０は頭蓋冠内の骨髄腔の骨膜および骨内膜におけるＰＴＨ１−３４によるＰＡＩＧＢの誘発を示す。図２１は、１００×対物レンズを用いて、ＰＡＩＧＢタンパク質発現が主に頭蓋冠の骨膜内の骨表面に隣接する骨芽細胞において誘発されたことを示す。図２２は、１００×対物レンズで見られるように、ＰＴＨにより誘発されるＰＡＩＧＢタンパク質発現は、骨内膜の骨表面に隣接する骨芽細胞において見られ、骨髄腔の間質細胞においては見られないことを示す。
マウス頭蓋冠をやさしく解剖し、１０％リン酸塩緩衝ホルマリン中に固定した。固定後、頭蓋冠をＴＢＤ−２脱灰剤（ＳＨＡＮＤＯＮ、カタログ番号６７６４００３）中で７〜８時間脱灰し、次いで等級品アルコール中で脱水した。頭蓋冠を、ラムダ形縫合および冠状縫合に平行に頭頂骨の中心部分を通って矢状縫合に対して垂直に二分し、パラフィン中に埋め込んだ。４〜６の５μｍ厚さの代表的非連続工程断片をさらに分析するために切断した。様々な断片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色し、隣接する部分を免疫組織化学的分析に使用した。骨サンプルを次いでキシレン中で脱パラフィン化し、等級品エタノールおよびＰＢＳ中で再水和した。断片を０．３％Ｈ２Ｏ２／メタノールで３０分間室温で処理し、次いでプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３０分間３７℃で消化した。正常ウマ血清で３０分間ブロックした後、断片をウサギポリクローナル抗体（ヒト、ラットおよびマウスＰＡＩＧＢタンパク質を認識するアミノ酸配列ＲＡＤＡＩＥＰＲＹＹＥＳＷＴＲ（配列番号１１）に対して惹起）とともに一夜４℃でインキュベートした。断片を次いで３回、それぞれ１０分間ＰＢＳで洗浄した。抗体のエピトープとの結合を、ビオチニル化二次抗体（ウマ抗ウサギ）およびアビジン結合ペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、ＰＫ−６２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析した。対照は抗体−ペルオキシダーゼキットを有するが、ＰＡＩＧＢポリクローナル抗体を有さないサンプルを含んでいた。ペルオキシダーゼ基質キットＤＡＢ（ＳＫ−４１００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてペルオキシダーゼを検出した。
ＰＡＩＧＢのタンパク質レベルの定量化
競合性ベースのＥＬＩＳＡ検定について、９６ウェルプレートを、０．５ＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）中１０μｇ／ｍｌのＰＡＩＧＢに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の何れかで一夜４℃でコートした。ウェルを次いで２回０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、次いで１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴで１時間室温でブロックした。プレートを次いで３回ＴＢＳＴで洗浄した。未知のサンプルおよびＰＡＩＧＢタンパク質標準（ＴＢＳＴ中で希釈）を適当なウェルに添加し、続いて一定量のビオチニル化ＰＡＩＧＢタンパク質を添加した。２．５時間室温でインキュベートした後、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した。アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を次いで添加し、１時間室温でインキュベートした。３回ＴＢＳＴで洗浄した後、製造業者により記載されているようにして、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＢＳ）基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をそれぞれのウェルに添加した。１０〜２０分後、４Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、標準的プレートリーダーを用いて吸収を４５０ｎｍで読みとった。
この競合的ＥＬＩＳＡは、ビオチニル化の代わりにＰＡＩＧＢタンパク質をヨウ化（１２５Ｉ）することによりＲＩＡを生成するために修飾することができる。この場合において、前記のように、未知サンプルまたは未標識ＰＡＩＧＢタンパク質標準のどちらも適当なウェル中に入れ、続いて一定量の１２５Ｉ ＰＡＩＧＢタンパク質を添加する。２．５時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、残存する放射能を標準的ガンマカウンターを用いて計測する。
加えて、２つの異なるエピトープを認識するＰＡＩＧＢに対する２つの抗体を用いてサンドイッチベースのＥＬＩＳＡを開発することができる。この実施例において、手順は前記のＥＬＩＳＡ検定と類似しているが、次のような変更をする。９６ウェルプレートを適当なモノクローナルまたはポリクローナルＰＡＩＧＢ抗体でコートし、ＢＳＡ含有ブロッキング緩衝液中でブロックした後、未知のサンプルおよびＰＡＩＧＢ標準を適当なウェルに２．５時間室温で添加する。プレートを次いで洗浄し、続いて第二のＰＡＩＧＢ抗体（異なるエピトープおよび異なる種の抗体、次いでコートされた抗体を認識する）を１時間室温で添加する。プレートを次いで洗浄し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と結合した二次抗体（抗ウサギまたは抗マウス）を１時間室温で添加する。プレートを次いで洗浄し、ＴＭＢ基質を前記のようにして添加する。反応を停止させた後、標準的プレートリーダーを用いてプレートを４５０ｎｍで読みとる。
ＰＡＩＧＢ相互作用タンパク質−質量分析
ＰＡＩＧＢ機能に関与するか、またはＰＡＩＧＢポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定するため、またさらにこれらのパートナータンパク質がＰＡＩＧＢ活性をどのように調節するかを確かめるために、当該分野において公知の様々な方法、例えば２ハイブリッドおよび／または免疫沈降法を用いることができる。例えば、一組の免疫沈降プルダウン実験を行い、続いて複合体の質量分析を行うことができる。
これらの実験に関して、ＰＡＩＧＢを一時的に骨芽細胞系において過剰発現させた。簡単に言うと、１５０ｍｍ皿中で９５％融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）まで培養したＵ２ＯＳ骨芽細胞を、Ｖ５標識ＰＡＩＧＢ発現プラスミドとリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で製造業者により記載されているようにしてトランスフェクトした。トランスフェクトの４８時間後、細胞を２回冷ＰＢＳでリンスし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０および哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩおよびホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩからなる溶解緩衝液を用いて細胞タンパク質を収穫した。細胞溶解物（０．５ｍｌ）を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。溶解物１ｍＬあたり２５０μｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することにより、溶解物を次いで前清浄化した。サンプルを４℃でオービタルローテーター上で３０分間インキュベートし、次いで３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。
免疫沈降を行うために、上清を新しい試験管に移し、タンパク質抽出物１ｍｇあたり８０μｌの抗Ｖ５共役アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をサンプルに添加し、１．５時間４℃でａｎｏｒｂｉｔａｌローテーターでインキュベートした。サンプルを１０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離し、上清を除去した。アガロースペレットを、３５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する細胞溶解緩衝液（１ｍｌ／１００μｌ樹脂）で３回洗浄し、続いて１０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離した。サンプルを次いで免疫沈降（ＩＰ）緩衝液中で３回洗浄し（１ｍＬ／１００μｌの初期樹脂体積）、毎回１０００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心分離した。最後の洗浄後に上清を除去すると、約１０μｌを越えるビーズが残る。相互作用タンパク質を、最終濃度１ｍｇ／ｍｌでＶ５ペプチド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）（１％酢酸中で復元）を含有するＩＰ緩衝液（初期樹脂体積と等しい量）中溶出させた。サンプルを室温で６０分間オービタルローテーターでインキュベートし、続いて１０００ｒｐｍ、室温で１分間遠心分離した。ＰＡＩＧＢ相互作用タンパク質を含有する上清を集めた。
Ｖ５標識されたＰＡＩＧＢタンパク質複合体を抗Ｖ５親和性マトリックスから過剰のＶ５ペプチド（合計体積１．４ｍｌ）を用いて溶出させた。ＰＡＩＧＢを含有しない対照トランスフェクションを同じ方法で処理すると、１．４ｍｌのサンプルが得られた。ＤＴＴおよびＳＤＳ（どちらも複合体からタンパク質を遊離させ、その後の濃縮工程におけるタンパク質の沈降および膜との結合を防止する）の添加によりサンプルを還元し、変性させた。還元／変性について、溶液をＤＴＴ中２０ｍＭにし、ついで８μｌの１０％ＳＤＳを添加し、溶液を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ３遠心分離限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いてサンプルを次いで４０μｌに濃縮した。濃縮後、１０μｌの５×ＳＤＳ Ｌａｅｍｍｌｉローディング緩衝液と５０ｍＭ ＤＴＴおよび２０ｍＭチオグリコール酸ナトリウムを添加し、溶液を３７℃で２０分間インキュベートした。
タンパク質をＰＡＩＧＢ複合体から分離するために、濃縮されたサンプル（ＰＡＩＧＢおよび対照）を８〜１６％Ｌａｅｍｍｌｉ ＳＤＳゲル（Ｈｏｅｆｆｅｒ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｏｒｍａｔ、１４ｃｍ×１４ｃｍ、Ｊｕｌｅ Ｉｎｃ．から得られるゲル）上で分離した。質量スペクトル情報の回収のために最適化されたプロトコルを用いて固定されたゲルを銀染色した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９６ Ｍａｒ１；６８（５）：８５０−８）。ＰＡＩＧＢおよび対照サンプル両方についての全レーンを、１回の実験において、４０ゲルバンドに切断した。一般に、対照レーンから得られるバンドをＰＡＩＧＢサンプルレーンから得られるものと合わせて切除した。
タンパク質消化、質量分析およびタンパク質同定に関して、タンパク質バンドをゲルから切除し、還元し、アルキル化し、ゲル消化ロボット（Ａｂｉｍｅｄ，Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて無人操作で消化した。トリプシン消化性ペプチドを次いでゲルから溶出させ、濃縮した（ＳｐｅｅｄＶａｃ，Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。濃縮されたトリプシン消化物の２０〜３０％を微小毛細管Ｃ１８カラム（７５ｕｍ×１０ｃｍ）に注入し、直接Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＤＥＣＡ Ｘｐイオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に溶出させた。ＨＰＬＣ勾配を、スプリッターを有するＡＢＩ １４０Ｃシステムで送達して、カラムへの流速を２００ナノリットル／分に減少させた。ＦＡＭＯＳオートサンプラー（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）を用いてサンプルを自動的に注入する。イオントラップをデータに依存した方法で作動させ、フルスキャンで検出されたペプチドは自動的に該ペプチドに関するＣＩＤデータの収集のきっかけを与える。力学的排除として知られるさらなるソフトウェアを使用した。この様式において、ペプチドは一旦ＣＩＤに対して標的にされると、追加の２分間で拒絶されるリストに加えられ、同型スペクトルの再獲得を防止する。典型的には１回６０分のＬＣ−ＭＳ−ＭＳ実験において１０００の分解スペクトルを集めた。各ゲルバンドの結果、別のＬＣ−ＭＳ−ＭＳファイルが得られる。ＰＣクラスターで実行されるＳＥＱＵＥＳＴサーチアルゴリズムを用いてＬｃＱデータファイルをいくつかのＮＣＢＩタンパク質データベース（非重複タンパク質データベースおよび翻訳されたＵｎｉｇｅｎｅクラスターデータベース）に対して検索する。
これらの実験において用いられるデータベースは非重複ＮＣＢＩタンパク質データベース（ＮＲ）および翻訳されたＵｎｉｇｅｎｅクラスターデータベースを含んでいた。典型的な実験から得られるゲルバンドの全てについて、プロセスは様々な適合度でデータベースにおけるペプチドとマッチする数万のスペクトルを公表した。Ｓｅｑｕｅｓｔは相互相関係数（Ｘｃｏｒｒ）を割り当ての適合度の基準として使用する。データベースのペプチドとＸｃｏｒｒ＞２．０でマッチするスペクトルを、Ｏｒａｃｌｅベースのソフトウェアを用いて同定されたタンパク質を表すコンセンサス群に組み入れた。一般に、Ｘｃｏｒｒ＞２．０のいくつかのペプチドが同定されているタンパク質は割り当てが信頼できる。４０以上のペプチドが表されたいくつかの顕著なタンパク質が捕捉された。このような差次的実験について、全対照レーンにおいて検出される数百のタンパク質の全集団をＰＡＩＧＢサンプルにおいて見られるものから差し引いた。結果は、サンプルにおいて特異的に検出されるタンパク質のリストであり、これは推論の結果、ＰＡＩＧＢと直接相互作用する。
ＰＡＩＧＢトランスジェニックマウスの評価
骨組織特異的方法でＰＡＩＧＢを過剰発現させるためにＰＡＩＧＢトランスジェニックマウスを発育させた。これは、３．６ｋｂコラーゲンＩ型プロモーターを用いてラットＰＡＩＧＢトランス遺伝子の発現をおこなうことにより達成された。本発明者らは２つのＰＡＩＧＢトランス遺伝子構築物を開発し、一つはＰＡＩＧＢオープンリーディングフレームおよび１．６ｋｂ３’ＵＴＲを含有し、他のＰＡＩＧＢトランス遺伝子はオープンリーディングフレームを含有する。本発明者らは、２つのＰＡＩＧＢトランス遺伝子系のＣ５７／ＢＬ６株において、一方はライン２（完全長ｃＤＮＡトランス遺伝子から誘導される）と表され、第二のものはライン５４（オープンリーディングフレームから誘導される）と表されることを示した。マウスの組織学的キャラクタライゼーションは、ＰＡＩＧＢタンパク質の発現ならびに頭蓋冠の骨部分におけるアルカリホスファターゼ活性の分析を含んでいた。ＰＡＩＧＢトランスジェニックマウスにおけるＰＡＩＧＢタンパク質発現の免疫組織化学的分析は、実施例１９において既に記載されているようにして分析した。頭蓋冠部分におけるアルカリホスファターゼ活性（ＡＰ）の組織学的分析は、ＶｅｃｔｏｒＲｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）染色法を用いて決定した。簡単に言うと、７０％エタノール中に固定したマウス頭頂骨を６：ｍ部分に切断し、続いてＰＢＳ中で洗浄し、続いて０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．２緩衝液で洗浄した。部分を次いで３０分間３７℃で、Ｖｅｃｔｏｒｅ Ｒｅｄ基質で製造業者により記載されているようにして染色した。
マウス骨の全ＲＮＡからのＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現は、各マウスについて脛骨を収穫し、骨から残存する軟組織を洗浄することにより得られた。骨のほとんどの遠位および近位端を除去し、シリンジを使ってＰＢＳで骨髄腔を洗い流した。各マウスからの２つの脛骨を合わせ、サンプルを液体窒素中に入れ、次いで骨を粉砕器で粉砕することにより骨を微粉末にした。粉末を試験管に移し、０．３ｍｌの変性溶液（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）を添加し、氷上に置いた。サンプルを次いで３０秒間均質化し、１０分間、１２０００×ｇ、４℃で遠心分離し、上清を集めた。ペレットを変性溶液で再抽出し、次いで前に行ったように遠心分離した。２つの上清を合わせ、１．１体積のＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加し、室温で５分間インキュベートした。クロロホルム（０．２ｍｌ／１ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ）を各サンプルに添加し、１５秒間激しく振とうし、次いで２〜３分間室温でインキュベートした。サンプルを１５分間１２０００×ｇ、４℃で遠心分離し、上部水性相を新しい試験管に移し、１：ｇのグリコーゲン（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）をサンプルに添加した。１体積のイソプロパノールを添加し、−２０℃で２４時間インキュベートした。サンプルを最大速度、４℃で２０分間遠心分離し、ペレットを７０％冷エタノールで洗浄した。再び、サンプルを遠心分離し、上清を除去し、その後のＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）処理のためにサンプルを水中で復元した。適当なラットＰＡＩＧＢプライマー（配列番号４５、４６）およびプローブ（配列番号４７）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。
図２３は、リアルタイムＰＣＲにより示されるような非トランスジェニック対照と比較してＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡを過剰発現するライン２およびライン５４の両方のヘテロ接合マウスの例を表す。図２４に示されるように、ライン２（完全長トランス遺伝子）ＰＡＩＧＢヘテロ接合マウスは、同腹子非トランスジェニック対照マウスと比較して、ＰＡＩＧＢタンパク質を頭蓋冠の骨膜において過剰発現することが示される。ＰＡＩＧＢタンパク質過剰発現は、非トランスジェニック対照マウスと比較して、ヘテロ接合マウスにおける頭蓋冠の矢状縫合領域においても見られた（図２５）。ＰＡＩＧＢタンパク質における増大の結果、非トランスジェニック対照マウスと比較して、ヘテロ接合マウスの頭蓋冠の骨膜および骨内膜においてアルカリホスファターゼ活性が増大した（図２６）。さらに、アルカリホスファターゼの増大は、非トランスジェニック対照マウスと比較して、ヘテロ接合マウスにおける頭蓋冠の厚さの増大も伴った。ヘテロ接合ＰＡＩＧＢ過剰発現マウスにおいて示されるアルカリホスファターゼ活性および頭蓋冠厚さの増大は、骨同化作用表現型の指標である。アルカリホスファターゼ活性および頭蓋冠厚さにおける増大を包含するこの同化効果は、第二のＰＡＩＧＢトランスジェニックマウスライン５４（オープンリーディングフレームトランス遺伝子）においても示された（図２７）。
ＰＡＩＧＢ機能を評価するためのＰＡＩＧＢノックダウン法
小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用は、興味のある遺伝子の発現を転写後に封じるための配列特異的方法である（Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｈａｎｎｏｎ Ｎａｔｕｒｅ４１８：２４４−２５１，２００２により論評）。近年、この技術により遺伝子機能を分析するための哺乳動物システムが首尾よく開発された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．、Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｔｕｓｈｌ，Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９４−４９８ ２００１、Ｙｕ，Ｊ．Ｄｅｒｕｉｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．ＰＮＡＳ９９：６０４７−６０５２ ２００２）。従って、骨芽細胞機能に関するＰＡＩＧＢ発現および遺伝子発現をブロックする効果を評価するためにＰＡＩＧＢｓｉＲＮＡを使用する。例えば、ＰＡＩＧＢ ｓｉＲＮＡで、２４、４８、および２７時間トランスフェクトされた骨芽細胞を表示された時点で収穫し、アルカリホスファターゼ、オステオカルシンおよびＩ型コラーゲンなどの骨形成マーカーの発現を、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で測定した。加えて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップ技術を用いたその後の発現プロファイリングのためのＲＮＡ単離を含むように類似の実験を拡大することができる（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。結果として得られる発現特性は、ＰＡＩＧＢが調節できるＰＴＨ経路以外の様々なシグナル変換経路を同定する。同様の実験をＰＴＨ１−３４の存在下および不在下でも行うことができる。ＰＴＨ１−３４はＰＡＩＧＢの発現を誘発するので、ＰＴＨ処理の前の骨芽細胞のＰＡＩＧＢ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションはＰＡＩＧＢ発現の誘発をブロックするであろう。その結果、これらの遺伝子のＰＴＨにより誘発された調節がＰＡＩＧＢ発現に依存する場合、他の機能的に重複したＰＡＩＧＢ様遺伝子がないならば、ＰＡＩＧＢ ｓｉＲＮＡはＰＴＨのＰＴＨ標的遺伝子（例えば、ＭＭＰ１３、コネクシン４３、Ｉ型コラーゲンおよびアルカリホスファターゼ（Ｓｗａｒｔｈｏｕｔ，Ｊ．Ｔ．，Ｄ’Ａｌｏｎｚｏ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｅｌｖａｍｕｒｕｇａｎ，Ｎ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｃ．ＧＥＮＥ２８２：１−１７ ２００２））に対する効果をブロックする。
骨芽機能に関するＰＡＩＧＢの重要性を確認することに加えて、ＰＡＩＧＢの骨芽細胞増殖およびアポトーシスに対する影響を、ＰＡＩＧＢ ｓｉＲＮＡを用いて評価することができる。ＰＡＩＧＢはＰＴＨシグナル化の下流標的であり、ＰＴＨは骨芽細胞数およびアポトーシスに影響を及ぼすことが知られ、骨形成の促進において重要な態様である（Ｓｔａｖｒｏｓ Ｃ．Ｍａｎｏｌａｇａｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２１：１１５−１３７，２０００．Ｔａｓｈｊｉａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｃｈａｂｎｅｒ，Ｂ．Ａ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１７：１１５１−１１６１ ２００２）。これら実験は、既に記載したのと同様にして、ＰＴＨ１−３４の存在下および不在下、様々な骨芽細胞および間質細胞において行うことができる。骨芽細胞または間質細胞数ならびに細胞アポトーシスの分析は、本出願の前記部分において記載されるようにして行うことができる。ｐＰＡＩＧＢ ｓｉＲＮＡはＰＴＨにより誘発される骨同化シグナル化におけるその役割に基づいて骨芽細胞数およびアポトーシスに関してＰＴＨの影響をブロックすることができる。
ラットおよびヒトＰＡＩＧＢ双方の複数の２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ（配列番号４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３）は、骨細胞機能におけるＰＡＩＧＢの役割をさらに研究するための手段として開発された。ｓｉＲＮＡを既に記載されているのと同様にして（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ４１１：４９９−４９８ ２００１）、次の基準に基づいて選択した：１）Ｇ／Ｃ含量は３３〜５５％の間であった、２）４塩基以上の同じ塩基はなかった、３）配列はＢＬＡＳＴサーチに基づいて独自のものであった、４）配列は二次構造（ループおよびヘアピン）について最小の可能性を有していることが確認された。
ｓｉＲＮＡの一時的トランスフェクションのために、骨芽細胞を、トランスフェクションの前日に、成長培地中、約８０％コンフルエンスでプレートする。トランスフェクションの当日、６ウェルプレート中、例えば、ｓｉＲＮＡ（１０〜１００ｎＭ）を、１ｍｌの基礎無血清培地を含む試験管に添加し、続いて４：１〜７．５：１のＴｒａｎｓｆａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加するか、または製造業者により記載されているとおりにする。他のトランスフェクション試薬、例えばリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびリボジュース（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いることができる。Ｔｒａｎｓｆａｓｔの添加後、サンプルを３０分間室温でインキュベートした。同時に、成長培地を細胞から除去し、無血清基礎培地と置換した。３０分のインキュベーション後、基礎培地を細胞から除去し、次いでｓｉＲＮＡを含有する混合物を細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を次いで除去し、成長培地と置換し、一夜インキュベートする。翌日、ＰＴＨ１−３４（１〜１００ｎＭ）でまたはなしで、実験の終点が遺伝子発現であるか、または細胞数または前記のようなアポトーシス分析に応じて、様々な時点で細胞を処理する。
（原文に記載なし）
【配列表】
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Claims (87)

  1. （ａ）配列番号２、４、６、８および１０をコード化する単離された核酸フラグメント；
    （ｂ）配列番号２、４、６、８および１０と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列をコード化する単離された核酸フラグメント；
    （ｃ）（ａ）の単離された核酸フラグメントと、３７℃で、６ＸＳＳＣ（１Ｍ ＮａＣｌ）、４５〜５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、および０．５×〜１×ＳＳＣ中、５５〜６０℃での洗浄のハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する、単離された核酸分子；
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に対して相補性である単離された核酸フラグメント
    からなる群から選択されるＰＡＩＧＢポリペプチドをコード化する単離された核酸フラグメント。
  2. 配列番号１、３、５、７および９からなる群から選択される請求項１記載の単離された核酸フラグメント。
  3. 単離された核酸フラグメントがＤＮＡである請求項１記載の単離された核酸フラグメント。
  4. 単離された核酸フラグメントがＲＮＡである請求項１記載の単離された核酸フラグメント。
  5. 核酸フラグメントがＰＴＨシグナル化経路に関与するポリペプチドをコード化する請求項１記載の核酸フラグメント。
  6. 過剰発現されると骨組織において骨形成活性を誘発する請求項１記載の核酸フラグメント。
  7. 断続的なＰＴＨ投与に応答して過剰発現される請求項１記載の単離された核酸フラグメント。
  8. 請求項１の単離された核酸フラグメントによりコード化されるポリペプチド。
  9. 配列番号２、４、６、８および１０からなる群から選択される請求項８記載のポリペプチド。
  10. ＰＴＨシグナル化経路に関与する請求項８記載のポリペプチド。
  11. 過度に発現されると骨組織において骨形成活性を誘発する請求項８記載のポリペプチド。
  12. 断続的なＰＴＨ投与に応答して過剰発現される請求項８記載のポリペプチド。
  13. 適当な調節配列と操作可能に結合した請求項１記載の単離された核酸フラグメントを含むキメラ構造物。
  14. 請求項１３記載のキメラ構築物で形質転換された宿主細胞。
  15. 宿主細胞が真核細胞、原核細胞および多細胞生物からなる群から選択される請求項１４記載の宿主細胞。
  16. 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項１５記載の宿主細胞。
  17. 宿主細胞が哺乳動物骨芽細胞である請求項１６記載の宿主細胞。
  18. 宿主細胞が、ＣＯＳ−７（サル腎臓）、２９３（ヒト腎臓）、ＣＨＯ（ハムスター卵巣）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓）、ＨｅＬａ（ヒト頚部）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、一次骨芽細胞、ＴＥ−８５（ヒト骨芽細胞）、ＭＧ−６３（ヒト骨芽細胞）、ＳＡＯＳ−２（ヒト骨芽細胞）、ＵＭＲ１０６（ラット骨芽細胞）、ＲＯＳ１７／２．８（ラット骨芽細胞）、ＭＣ３Ｔ３（マウス骨芽細胞）およびＵ２ＯＳ（ヒト骨芽細胞）からなる群から選択される請求項１６記載の宿主細胞。
  19. 宿主細胞がヒト骨芽細胞である請求項１５記載の宿主細胞。
  20. 宿主細胞がイー・コリである請求項１５記載の宿主細胞。
  21. 宿主細胞がＤＨ５アルファ、ＢＬ２１およびＤＨ１０Ｂからなる群から選択される請求項２０記載の宿主細胞。
  22. 宿主細胞が酵母細胞である請求項１５記載の宿主細胞。
  23. 宿主細胞が、シザサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚａｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉｃｅ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピチア・メタノリック（Ｐｉｃｈｉａ Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ）からなる群から選択される請求項２２記載の宿主細胞。
  24. 宿主細胞が昆虫細胞である請求項１５記載の宿主細胞。
  25. 宿主細胞が、ＳＦ、ＳＦ２１−Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｓ２シュナイダー細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ卵から得られるハイファイブ細胞から選択される請求項２４記載の宿主細胞。
  26. 請求項１記載の核酸フラグメントを含むベクター。
  27. ベクターがプラスミドである請求項２６記載のベクター。
  28. 請求項２６記載のベクターを含む形質転換された細胞。
  29. 宿主微生物が、真核細胞、原核細胞、および多細胞生物からなる群から選択される請求項２８記載の形質転換された細胞。
  30. 宿主微生物が哺乳動物細胞である請求項２９記載の形質転換された細胞。
  31. 宿主細胞が哺乳動物骨芽細胞である請求項３０記載の宿主細胞。
  32. 宿主微生物がイー・コリである請求項２８記載の形質転換された細胞。
  33. 宿主微生物が酵母細胞である請求項２８記載の形質転換された細胞。
  34. （ａ）配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号９に記載された核酸フラグメントの全部または一部でゲノムライブラリーをプローブし；
    （ｂ）工程（ａ）の核酸フラグメントとハイブリッド形成するＤＮＡクローンを同定し；
    （ｃ）工程（ｂ）において同定されたＤＮＡクローンを含む核酸フラグメントの配列を決定する
    ことを含む、請求項８に記載のポリペプチドをコード化する核酸フラグメントを得る方法。
  35. （ａ）請求項２６に記載のベクターを適当な宿主細胞中に導入し；
    （ｂ）得られた細胞をポリペプチドを産生するために培養し；
    （ｃ）工程（ｂ）において産生されたポリペプチドを回収し；
    （ｄ）かくして回収されたポリペプチドを単離する
    ことを含む、請求項８に記載のポリペプチドを得る方法。
  36. （ａ）生物学的サンプルを請求項１に記載の核酸フラグメントと接触させ；（ｂ）核酸フラグメントが生物学的サンプル中の核酸分子と結合するかどうかを決定し、これによりサンプルにおける請求項１に記載の核酸フラグメントの存在を検出することを含む、生物学的サンプルにおける請求項１に記載の核酸フラグメントの存在を検出する方法。
  37. 請求項８〜１２に記載のＰＡＩＧＢポリペプチドの１以上のエピトープと特異的に結合する抗体。
  38. （ｉ）請求項１〜７に記載の核酸フラグメント、（ｉｉ）請求項８〜１２に記載のポリペプチド、（ｉｉｉ）かかるポリペプチドまたはその一部から形成される抗体のうちの少なくとも１つを含む哺乳動物における骨形成活性を調節する組成物。
  39. 該ＰＡＩＧＢがヒト骨芽細胞から由来するところの請求項３８記載の組成物。
  40. 骨形成活性が骨成長の調節である請求項３８記載の組成物。
  41. 骨形成活性が骨密度の調節である請求項３８記載の組成物。
  42. ＰＡＩＧＢが配列番号２、４、６、８および１０に記載するアミノ酸配列を有する請求項３８〜４１に記載の組成物。
  43. ＰＡＩＧＢ遺伝子またはポリペプチドの発現を変更する薬剤。
  44. ポリヌクレオチドである請求項４３記載の薬剤。
  45. ポリペプチドである請求項４３記載の薬剤。
  46. 化学小分子である請求項４３記載の薬剤。
  47. ペプチドである請求項４３記載の薬剤。
  48. 骨形成活性を誘発する請求項４３記載の薬剤。
  49. （ａ）骨形成活性の誘発、（ｂ）骨先祖細胞からの骨芽細胞の分化における増大、（ｃ）骨芽活性の増大、（ｄ） 骨芽細胞増殖における増大、または（ｅ）骨芽細胞アポトーシスの減少のうちの少なくとも１を示す請求項４３記載の薬剤。
  50. 請求項４３記載の薬剤を含む組成物。
  51. 薬剤がＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現を変更するかどうかを決定するための方法であって：ａ）該薬剤と接触していない試験サンプル中に存在しているＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルを測定すること；ｂ）該薬剤と接触している試験サンプル中に存在しているＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルを測定すること；およびｃ）工程ａ）において測定されたＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルが、工程ｂ）において測定されたＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡのレベルと異なる場合に、該薬剤がＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡの発現を改変することを測定すること、含む方法。
  52. 請求項１に記載の核酸フラグメントの発現の変更における有効性に関する薬剤のスクリーニング法であって、ａ）請求項１に記載の核酸フラグメントを含む試験サンプルを請求項１に記載の核酸フラグメントの発現に適した条件下で薬剤と接触させ、ｂ）請求項１に記載の核酸フラグメントの変更された発現を検出し、およびｃ）可変量の薬剤の存在下および該化合物の不在下での請求項１に記載の核酸フラグメントの発現を比較することを含む方法。
  53. 試験サンプルが骨組織バイオプシー、骨髄穿刺液、および滑液からなる群から選択される請求項５１または５２記載の方法。
  54. ａ）ＰＡＩＧＢ遺伝子を発現するために遺伝子操作された、培養された宿主細胞と薬剤を接触させ（ここで、ＰＡＩＢＧ遺伝子は請求項８に記載のポリペプチドをコード化する）、ｂ）ＰＡＩＧＢ遺伝子、ＰＡＩＧＢ ｍＲＮＡまたはＰＡＩＧＢポリペプチドレベルの発現における変化を検出することを含む、骨関連疾患の治療に有用な薬剤のスクリーニング法。
  55. 該薬剤が骨細胞の機能的活性を誘発する請求項５４記載の方法。
  56. 骨の機能的活性が、骨特異性細胞の発現を誘発することにより誘発される請求項５５記載の方法。
  57. 該薬剤が骨同化剤である請求項５４記載の方法。
  58. 対象における骨関連疾患の治療の有効性を評価するための方法であって：所定のプロトコルで治療される対象について、請求項１において定義されたＰＡＩＧＢ核酸分子または請求項８のＰＡＩＢＧポリペプチドの発現レベルを評価（ここで、治療前のレベルに対する治療後のＰＡＩＧＢ核酸またはＰＡＩＢＧポリペプチドの発現レベルにおける変化は骨疾患の治療の有効性の指標となる）することを含む方法。
  59. ＰＡＩＧＢと結合できるポリペプチドを同定する方法であって、該ＰＡＩＧＢをコード化する配列が１つのハイブリッドベクターによって運ばれ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリから由来の配列が第二のハイブリッドベクターによって運ばれ、該ベクターを次いで宿主細胞を形質転換するために使用し、明確な形質転換された細胞を単離し、続いて該第二のハイブリッドベクターを抽出して、該ＰＡＩＧＢと結合するポリペプチドをコード化する配列を得る、哺乳動物の２ハイブリッド法を適用することを含む方法。
  60. 対象の骨関連薬剤を用いる治療の有効性をモニターする方法であって、（ａ）薬剤の投与前に対象から投与前サンプルを得る工程；（ｂ）投与前サンプル中のＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｃ）１またはそれ以上の投与後サンプルを対象から得る工程；（ｄ）投与後サンプル中のＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出する工程；（ｅ）投与前サンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを、投与後サンプルまたは複数のサンプルにおけるＰＡＩＧＢタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルと比較する工程；および（ｆ）それに応じて対象に対する該薬剤の投与を変更する工程を含む方法。
  61. 請求項１に記載のＤＮＡを含むトランスジェニック動物。
  62. 該動物が齧歯類である請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  63. 該動物がマウスである請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  64. 該動物がラットである請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  65. 少なくとも１５の配列番号１、３、５、７または９の連続したヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む配列と操作可能に結合した動物および／またはヒト細胞においてタンパク質発現の指令能を有するプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞および／または胚細胞を有する請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  66. 核酸が動物および／またはヒト細胞におけるタンパク質発現の指令能を有する操作可能に結合したプロモーター領域をさらに含む、請求項６に記載のポリペプチドをコード化する配列を含む核酸からなる体細胞および／または胚細胞を有する請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  67. 骨量が１以上の骨パラメーターにおいて同じ種の非トランスジェニック動物に関連して調節される、配列番号１、３、５、７または９の少なくとも１５の連続したポリヌクレオチドを含む配列と操作可能に結合した動物および／またはヒト細胞においてタンパク質の発現を指令するプロモーター領域を含む核酸からなる体細胞および／または胚細胞を有する請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  68. ヒトＰＡＩＧＢポリペプチドを発現する請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  69. ヒトＰＡＩＧＢポリペプチドが骨組織において最高に発現される請求項６８記載のトランスジェニック動物。
  70. 骨表現型を示す請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  71. 骨量が、骨密度、骨強度、骨梁数、骨サイズ、および骨組織連結度から選択される１以上のパラメータにおいて同じ種の非トランスジェニック動物に関連して調節される請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  72. 請求項６１記載のトランスジェニック動物で構成される第一動物群および対照動物の第二群を含む骨密度調節の研究用動物モデル。
  73. ＰＡＩＧＢをコード化する遺伝子の変更を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、変更が、マウスＰＡＩＧＢ遺伝子とホモローガスな第一部分およびマウスＰＡＩＧＢ遺伝子の別の部分とホモローガスな第二部分を含み、第一および第二部分の間にＰＡＩＧＢ遺伝子の一部の操作された欠失、核酸配列変化、または核酸挿入を含む中間部分を含む胚肝細胞または多能性細胞中へのホモローガスな組換えにより遺伝子ターゲティングのための核酸の導入により引き起こされ、核酸が内因性遺伝子とのホモローガスな組換えを可能とするトランスジェニックマウス。
  74. 遺伝子ターゲティングのための核酸の中間部分が、ＡＴＧ開始コドンの操作された欠失、操作されたフレームシフト変異、操作された停止コドン、ネオマイシン耐性配列、ループ組換え部位、または合成転写停止配列を含む請求項７３記載のトランスジェニックマウス。
  75. 遺伝子ターゲティングのための核酸がさらに、マウスＰＡＩＧＢ遺伝子のイントロンおよびエクソン配列のどちらも含む請求項７３記載のトランスジェニックマウス。
  76. 内因性ＰＡＩＧＢの発現が、ホモローガスまたは非ホモローガスな組換えにより導入される、変更された遺伝子調節配列により調節されるトランスジェニック動物。
  77. ＰＡＩＧＢ遺伝子が誘発可能である請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  78. 前記動物が、動物のＰＡＩＧＢ遺伝子の一つの一方または両方のコピーがホモローガスな組換えまたは遺伝子ターゲティングにより部分的または完全に欠失しているか、または内因性配列のホモローガスな組み換えまたは遺伝子ターゲティングによる挿入または置換により不活化されている「ノックアウト」動物である請求項６１記載のトランスジェニック動物。
  79. （ａ）請求項１に記載のトランスジェニック動物の第一群を提供する工程；および（ｂ）該トランスジェニック動物における骨発生の少なくとも１つのパラメータを測定する工程を含む骨量決定因子を研究する方法。
  80. （ａ）請求項１に記載のトランスジェニック動物の第一群を提供する工程；（ｂ）試験化合物の投与または実験を行う工程；および（ｃ）試験化合物を投与されたトランスジェニック動物における骨発生の少なくとも１つのパラメータを測定する工程を含む、骨量の調節を研究する方法。
  81. ＰＡＩＧＢの骨障害に対する影響を研究する方法であって：（ａ）骨関連障害表現型を有する動物の胚を提供する工程；（ｂ）請求項１に記載の核酸を胚の第一群に導入する工程；（ｃ）胚を偽妊娠マウスに移す工程；および（ｄ）得られたマウスにおける発生の少なくとも１つのパラメータを測定する工程を含む方法。
  82. 骨関連障害の治療に有効な薬剤を同定する方法であって、請求項６１に記載のトランスジェニック動物に前記薬剤を投与し、前記動物の細胞におけるＰＡＩＧＢ発現を測定し、ＰＡＩＧＢ発現を未処置の対照動物におけるものと比較することを含む方法。
  83. 他の骨関連薬剤との組み合わせにおいて前記薬剤が投与される請求項８２記載の方法。
  84. 該薬剤が骨形成活性を有するかどうかを確認する方法であって、ａ）該薬剤を請求項６１に記載のトランスジェニック動物に投与する工程；およびｂ）該動物のＢＭＤが変化したかどうかを決定するために該トランスジェニック動物を該薬剤の投与後に検査する工程を含む方法。
  85. 前記薬剤が他の骨関連薬剤との組み合わせにおいて投与される請求項８４記載の方法。
  86. 組み合わせ投与が骨ミネラル密度の増大をもたらす請求項８５記載の方法。
  87. ２つの構築物を含む安定にトランスフェクトされた細胞系であって、第一の構築物は、その発現の全てが構成プロモーターにより行われる活性化ドメインと結合したＤＮＡ結合ドメインと結合したリガンド結合ドメインを含み、第二の構築物はＰＡＩＧＢ ｃＤＮＡと結合した最小プロモーターと結合したＤＮＡ結合エレメントの複数のコピーを含み、化学インデューサーの添加によりＰＡＩＧＢ遺伝子の転写が誘発される、安定にトランスフェクトされた細胞系。
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