DE10126472A1

DE10126472A1 - Verwendung des Nachweises der Expression von Splice-Varianten von Gen21 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen

Info

Publication number: DE10126472A1
Application number: DE2001126472
Authority: DE
Inventors: Dave Brett; Wolfgang Kemmner
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2002-12-05
Also published as: WO2002097119A2; AU2002317169A1; WO2002097119A3

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Splice-Varianten der Sequenz Gen21 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen. Die mRNA-Expression einer Splice-Variante der Sequenz Gen21 ist in kolorektalen Karzinomen später Stadien reduziert oder nicht vorhanden. Untersuchungen an 100 gut dokumentierten Fällen kolorektaler Karzinome zeigen, daß die Expression der Splice-Variante der Sequenz Gen21 einen prognostischen Faktor für das Überleben solcher Patienten darstellt. Die Aktivierung der Expression dieser Sequenz durch pharmazeutische Mittel ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Splice-Varianten der Sequenz Gen21 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.

In Arbeiten der Arbeitsgruppe von John D. Minna wurde durch somatisches genetisches Mapping von Tumorzelllinien, Tumorbiopsien und von prämalignen Läsionen aus humanen Lungen- und Brustgewebsproben ein Bereich auf Chromosom 3p21.3 entdeckt, der möglicherweise Tumor-Suppressorgene enthält (1). In diesem Bereich, der etwa 630 Kilobasen umfaßt, wurden 25 Gene gefunden. Vier dieser Gene zeigten eine verringerte mRNA-Expression in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen. In 6 dieser Gene, darunter in Gen21, wurden Mutationen gefunden, die zur Bildung einer veränderten Aminosäuresequenz führten. Allerdings trat keine dieser Mutationen in mehr als 10% der getesteten Lungenkarzinome auf, und es ist nichts über die prognostische Bedeutung dieser Gene bekannt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß das postulierte Tumorsuppressorgen bisher nicht nachgewiesen werden konnte, und daß vor allem die Sequenz Gen21 nicht als Tumorsuppressorgen identifiziert wurde. Darüber hinaus wurden bisher keine Daten über ein Vorkommen oder eine Funktion von Gen21 in kolorektalen oder anderen Karzinomen publiziert.

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, neue Tumorsuppressorgene auf Chromosom 3p21.3 zu finden, die für die Diagnose und die Therapie von Tumorerkrankungen geeignet sind.

Überraschend wurde gefunden, daß in kolorektalem Gewebe zumindest 2 Splicevarianten von Gen21 auftreten, die als als Gen217 und Gen215 bezeichnet werden. Dabei handelt es sich bei Gene215 um eine Splicevariante von Gen217, der zwei Sequenzabschnitte fehlen. Die mRNA-Sequenz von Gen215 ist daher kürzer als die von Gen217. Dies gilt allerdings nicht für die Proteinsequenz. Da die RNA-Sequenz von Gen217 ein Stop-Kodon enthält, ist die kodierte Peptidsequenz von Gen217 gegenüber der von Gen215 verkürzt.

Die Gensequenzen von Gen215 und Gen217 sind in den Abb. 2 und 3 dargestellt.

In Untersuchungen von kolorektalem Gewebe, die mit der Microarray-Technologie von Affymetrix (GeneChip) durchgeführt wurden, zeigte sich, daß die Expression von Gen215 in gesundem Kolongewebe 5-mal höher ist als in Karzinomgewebe. Untersuchungen von kolorektalen Karzinomen von 102 Patienten mit quantitativer RT-PCR (One-step multiplex Taqman-PCR) ergaben, daß Gen215 in etwa 40% der Fälle nicht exprimiert wurde. Statistische Auswertungen zeigten einen deutlichen Einfluß der Expression von Gen215 auf das Überleben der Patienten (log rank, p = 0.04).

Erfindungsgemäß wird deshalb mit Gen215 eine Substanz bereitgestellt, die zu prognostischen, diagnostischen und therapeutischen Zwecken bei Tumorerkrankungen verwendet werden kann. Die Expression von Gen215 stellt einen prognostischen Faktor zur Diagnose von Tumorerkrankungen dar. Gegenstand der Erfindung ist deshalb der Einsatz von Gen215 für die Prognose, wobei die Konzentration des Gen215 Proteins und/oder die Expression ihrer sie kodierenden Gene bestimmt wird, z. B. durch Bestimmung der mRNA Expression mittels RT-PCR oder Expressionsbestimmung mit Hilfe von Microarrays durch Immobilisierung einer entsprechenden Oligonukleotidsequenz.

Durch Messungen der Expression von Gen215 in Tumorgewebe aus Resektaten oder Biopsien von Patienten können Prognosen für das Überleben (die Lebenserwartung z. B. nach Operationen oder chemotherapeutischen Behandlungen) eines Patienten gemacht werden. Wird Gen215 normal exprimiert, leben nach 60 Monaten noch etwa 80% der Patienten. Wird Gen215 nicht exprimiert, leben nach 60 Monaten nur noch 40% der Patienten (unveröffentlicht).

Gegenstand der Erfindung sind ferner therapeutische Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, welche Substanzen enthalten, die die Expression von Genen, die Gen215 oder Gen217 kodieren, aktivieren. Diese therapeutischen Substanzen werden in die jeweiligen Tumorzellen appliziert. Bevorzugt liegen die therapeutischen Mittel in Formulierungen zur parenteralen Applikation oder zur gentherapeutischen Anwendung vor.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Nutzung des Expression von Gen215 als Prognosemarker

Es wird die Gen215 Expression in Biopsien durch RT-PCR Methoden oder durch Immobilisierung der entsprechenden Oligonukleotidsequenz auf einem Microarray (z. B. Genchip der Firma Affymetrix oder andere Microarrays) gemessen.

Die RT-PCR wird wie folgt durchgeführt. Karzinomgewebe wird in flüssigem Stickstoff mit Hilfe eines Gewebs-Homogenisators aufgelöst. RNA wird extrahiert mit Hilfe der GITC Methode. Zur Quantifizierung der Expression wird die Taqman-Methode RT-PCR von Applied Systems PE benutzt. Als Referenz dient die Expression des Housekeeping-Gens beta-Aktin. Dazu wird beta-Aktin im selben Reaktionsgefäß ko-amplifiziert. Beta-Aktin wird mit folgenden Primern amplifiziert und mit der Sonde nachgewiesen:
Vorwärtsprimer: TCA GCA AGC AGG AGT ATG ACG A
Rückwärtsprimer: CGC AAC TAA GTC ATA GTC CGC C
Sonde: TET-CCA TCG TCC ACC GCA AAT GCT TC-TAMRA
Die Länge des Reaktionsprodukts beträgt 80 Basenpaare.

Das Gen215 wird mit folgenden Primern amplifiziert und mit der Sonde nachgewiesen:
Vorwärtsprimer: AACGGAGGAAGCTGATCCA
Rückwärtsprimer: CTCATGCTGTCTTGCAGCA
Qgen215 IV Sonde: FAM-ATCCTGTGCGGGTGACTCGGGA-TAMRA
Die Länge des Reaktionsprodukts beträgt 156 Basenpaare.

Für die Reaktion wird der Applied Systems PE Universal Master Mix 430 4437 benutzt.

In Abb. 1 ist das Überleben von Patienten mit oder ohne Expression von Gen215 im Gewebe dargestellt. Die Überlebenskurve wurde nach Kaplan-Meier erhalten und die Signifikanz der Differenzen wurde mit dem log-rank Test berechnet. Die Expression von Gen215 war hoch assoziiert (log rank, p = 0,04) mit dem Überleben der Patienten (X-Achse: Überlebenszeit nach der Operation in Monaten; Y-Achse: Wahrscheinlichkeit des Überlebens).

Literatur

(1) Michael I. Lerman and John D. Minna: The 630-kb Lung Cancer Homozygous Deletion Region on Human Chromosome 3p21.3: Identification and Evaluation of the Resident Candidate Tumor Suppressor Genes. Cancer Res 60, 6116-6133, 2000;
(2) Brett D, Kemmner W, Koch G, Roefzaad C, Gross S, Schlag PM. A rapid bioinformatic method identifies novel genes with direct clinical relevance to colon cancer. Oncogene, 2001, in press.

Claims

1. Verwendung von Splice-Varianten von Gen21 für die Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Varianten Gen215 oder Gen217 benutzt werden.

3. Verwendung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Gen215 bzw. des Gen217 Proteins und/oder die Expressionrate der kodierenden Gene Gen215 und Gen217 in den Tumorzellen bestimmt wird.

4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die m-RNA Expression der Splice-Varianten von Gen21 bestimmt wird.

5. Verwendung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionsbestimmung mit Hilfe von RT-PCR erfolgt.

6. Verwendung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionsbestimmung mit Hilfe von Mikroarrays nach Immobilisierung der entsprechenden Oligonukleotidsequenz erfolgt.

7. Sequenz von Gen215 nach Abb. 2.

8. Sequenz von Gen217 nach Abb. 3.

9. Therapeutische Mittel zur Behandlung von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie Substanzen enthalten, die die Expression von Genen, die Splice-Varianten von Gen215 kodieren, aktivieren.

10. Therapeutische Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Expression der Gene Gen215 oder Gen217 aktiviert wird.

11. Therapeutische Mittel nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Formulierungen zur parenteralen Applikation oder zur gentherapeutischen Anwendung vorliegen.