DE112008001164T5

DE112008001164T5 - Gensignatur der frühen Hypoxie zur Vorhersage des Patientenüberlebens

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Publication number: DE112008001164T5
Application number: DE112008001164T
Authority: DE
Inventors: Renaud G. Seigneuric; Maud H. W. Starmans; Glenn Madison Fung; Balaji Krishnapuram; Dimitry S. A. Branford Nuyten; Arie Vanerk; Michael Gaston Magagnin; Kasper M. Rouschop; Sriram Krishnan; R. Bharat Rao; Christoffel Theodorus Anthonius Evelo; Adrian Campbell Begg; Bradly G. Ontario Wouters; Philippe Lambin
Original assignee: Stichting Maastricht Radiation Oncology Maastro Clinic; Siemens Medical Solutions USA Inc
Current assignee: Stichting Maastricht Radiation Oncology Maastro Clinic; Siemens Medical Solutions USA Inc
Priority date: 2007-05-02
Filing date: 2008-05-02
Publication date: 2010-06-24
Also published as: US20090130096A1; US7960114B2; WO2008137089A3; WO2008137089A2

Abstract

Verfahren zum Vorhersagen des Patientenansprechens auf eine Krebsbehandlung, umfassend:
Messen der Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C, in einer biologischen Probe von einem Patienten:
a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217;
b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078,...

Description

VERWEIS AUF EINE VERWANDTE ANMELDUNG
Das vorliegende Patentdokument beansprucht das Anmeldedatum nach 35 U.S.C. §119(e) der provisional U.S.-Patentanmeldung Nr. 60/915,531, angemeldet am 2. Mai 2007, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
HINTERGRUND
Gebiet der Erfindung
Die Aufrechterhaltung von physiologischen Sauerstoffkonzentrationen ist ein hochdynamischer Vorgang, der für viele Bereiche der Zellbiologie lebenswichtig ist. Sauerstoffmangel (Hypoxie) ist eine Situation, die in soliden Tumoren häufig angetroffen wird und mit erhöhter Resistenz gegen Strahlentherapie und Chemotherapie, erhöhter Malignität und einer ungünstigen Prognose verbunden ist (2, 8, 18, 19, 22 und 23). Es ist bekannt, dass Hypoxie in Tumoren bezüglich ihrer räumlichen Verteilung, Schwere und Kinetik sehr heterogen ist. Hypoxie entsteht durch verschiedene Mechanismen, die hauptsächlich mit Beschränkungen der Sauerstoffdiffusion (chronische Hypoxie) und der Durchblutung (akute Hypoxie) verbunden sind. Außerdem reguliert die Hypoxie mehrere zelluläre Signalwege, die eine spezielle Aktivierungskinetik und Empfindlichkeit gegenüber der Sauerstoffkonzentration aufweisen. Als Folge ist die hypoxieregulierte Genexpression komplex und zeigt ausgeprägt zeitabhängige Eigenschaften.
Unter Verwendung von DNA-Mikroarrays kann mittlerweile die Expression mehrerer Zehntausend Gene zugleich überwacht werden. In der Onkologie wird diese Möglichkeit zum Extrahieren von Genlisten (oder Gensignaturen) genutzt, anstatt sich auf wenige klinische Variablen für die Diagnose (5, 14) oder Prognose zu stützen. Für die Prognose umfassen diese Sätze von Genen solche, die aus klinischen Daten erhalten sind, wobei klinische Gruppen mit einer besseren oder schlechteren Prognose durch Korrelation mit einem kontrollierten Klassierer identifiziert werden (13, 20, 21). Erst kürzlich wurden in vitro erhaltene Sätze von Genen beschrieben, die Gene enthalten, die mit einem besonderen Phänotyp, von dem eine klinische Bedeutung vermutet wird, verbunden sind (1, 3, 4, 9). Dies ermöglicht eine unverzerrte Prüfung einer solchen Hypothese, indem die in vitro erhaltene Signatur einer getrennten Mikroarray-Untersuchung von Patienten gegenüber gestellt wird. Durch eine derartige Untersuchung wurde kürzlich gezeigt, dass eine Gensignatur für Hypoxie für einen ganzen Bereich von Tumortypen als prognostische Größe dienen könnte. Bei dieser Untersuchung haben Chi et al. (4) auch die zeitabhängigen Genexpressionsprogramme einiger primärer Zelllinien unter Hypoxie in vitro gemessen. Der Datensatz von Chi et al. könnte zum Extrahieren von hypoxischen Gensignaturen, die Unterschiede zwischen langsamen und schnellen kinetischen Antworten auf Hypoxie aufzeigen, und zum Ermitteln ihres prognostischen Beitrags durch die starke Zeitabhängigkeit der hypoxischen Genexpression verwendet werden. Unter diesen Gesichtspunkten ist ein Bedarf an verbesserten hypoxischen Gensignaturen zur Identifikation, Diagnose und Behandlung von Krebs offensichtlich.
ZUSAMMENFASSUNG
Bei einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Vorhersagen des Patientenansprechens auf eine Krebsbehandlung bereit, umfassend das Messen der Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C, in einer biologischen Probe von einem Patienten: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; und c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575; und Erzeugen eines Score-Werts der Signatur aus den Genexpressionsniveaus; und Korrelieren des Score-Werts der Signatur mit einem vorhergesagten Ansprechen auf die Krebsbehandlung.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Genexpressionsniveaus durch Bestimmen der Expressionsniveaus einer Gruppe von Polynucleotidsequenzen gemessen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: d. den Sequenzen SEQ ID NOS: 1–80; e. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 81, 82, 2, 83, 84, 43, 33, 85, 36, 86, 12, 24, 68, 74, 87, 32, 88, 46, 89, 90, 91, 58, 92, 59, 93, 94, 95, 26, 44, 96, 97, 98, 99, 100 und 101; und f. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 2, 43, 33, 36, 12, 24, 68, 74, 32, 46, 58, 59, 26 und 44. Bei besonderen Ausführungsformen ist der Krebs Brustkrebs, Nierenkrebs oder Lungenkrebs. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Messung der Genexpressionsniveaus an RNA aus der biologischen Probe durchgeführt. Die biologische Probe stammt bei besonderen Ausführungsformen aus einem Tumor, einem kanzerösen Gewebe, einem präkanzerösen Gewebe, einem Biopsat, einem Gewebe, einem Lymphknoten, einem chirurgischen Exzidat, Blut, Serum, Urin, einem Organ oder Speichel. Die Behandlung des Krebses kann bei besonderen Ausführungsformen Strahlentherapie, fraktionierte Strahlentherapie, Chemotherapie oder Radiochemotherapie umfassen.
Bei einer zweiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Mikroarrays bereit, umfassend ein festes Substrat und eine Vielzahl von Nucleinsäuresonden, die die Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen nachweisen können, die ausgewählt sind aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; und c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575. Bei besonderen Ausführungsformen enthält das Mikroarray eine Vielzahl von Nucleinsäuresonden, die die Expression einer Gruppe von Sequenzen nachweisen können, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: d. den Sequenzen SEQ ID NOS: 1–80; e. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 81, 82, 2, 83, 84, 43, 33, 85, 36, 86, 12, 24, 68, 74, 87, 32, 88, 46, 89, 90, 91, 58, 92, 59, 93, 94, 95, 26, 44, 96, 97, 98, 99, 100 und 101; und f. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 2, 43, 33, 36, 12, 24, 68, 74, 32, 46, 58, 59, 26 und 44. Bei besonderen Ausführungsformen umfasst die Vielzahl von Sonden DNA-Sequenzen. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Vielzahl von Sonden unter den Hybridisierungsbedingungen von 6X SSC bei 65°C an die Sequenzen von wenigstens einem aus den Gruppen (d)–(f) hybridisieren. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst die Vielzahl von Sonden etwa 15 bis 50 Basenpaare DNA.
Bei einer dritten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Kits bereit, umfassend ein Mikroarray, umfassend eine Vielzahl von Nucleinsäuresonden, die die Expression einer Gruppe von Sequenzen nachweisen können, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den vorstehend beschriebenen Gruppen (d)–(f); sowie Gebrauchsanweisungen für das Kit.
Bei einer vierten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von Krebs bereit, umfassend das Messen der Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C, in einer biologischen Probe von einem Patienten: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; und c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: gegenüber dem Miller-Datensatz Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575; und Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einem oder mehreren Mitteln zur Krebsbehandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus chemotherapeutischen Krebsmitteln und Strahlung; oder Durchführen eines chirurgischen Eingriffs an dem Patienten; oder eine Kombination davon. Bei weiteren Ausführungsformen werden die Genexpressionsniveaus durch Bestimmen der Expressionsniveaus einer Gruppe von Polynucleotidsequenzen bestimmt, die aus der Gruppe, bestehend aus den vorstehend beschriebenen Gruppen (d)–(f), ausgewählt sind.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist das eine oder mehrere Mittel zur Krebsbehandlung ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Paclitaxel, Docetaxel, Imatinibmesylat, Sunitinibmalat, Cisplatin, Etoposid, Vinblastin, Methotrexat, Adriamycin, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Daunomycin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Endostatin, Angiostatin, Bevacizumab und Rituximab. Bei einer anderen Ausführungsform ist das eine oder mehrere Mittel zur Krebsbehandlung Strahlung. Bei besonderen Ausführungsformen ist der behandelte Krebs Brustkrebs, Nierenkrebs oder Lungenkrebs. Bei bestimmten Ausführungsformen umfassen die Behandlungsverfahren chirurgische Eingriffe.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann nach dem Studium der nachstehenden Beschreibung mit Bezug auf die anhängenden Zeichnungen und Ansprüche, die Teil dieser Beschreibung bilden, leicht ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt Kaplan-Meier-Überlebenskurven für krankheitsspezifisches Überleben (bei 12 Jahren Nachsorge) und p-Werte für verschiedene Gensignaturen. Bei den Gruppen in A, B und C (Felder links oben und unten) entspricht die obere Kurve der Gruppe mit der niedrigen Expression, während die untere Kurve der Gruppe mit der hohen Expression entspricht. Bei den Gruppen in C (Felder rechts oben und rechts unten) entspricht die obere Kurve der Gruppe mit der hohen Expression, während die untere Kurve der Gruppe mit der niedrigen Expression entspricht. Feld A zeigt die (A) Chi-Signatur (8). Feld B zeigt die frühen Signaturen der Hypoxie (unter 0 oder 2%). Feld (C) zeigt die späten Signaturen. Für jeden Patienten der verschiedenen Datengruppen wurde ein Score-Wert der Signatur berechnet. Diese Score-Werte wurden verwendet, um die Patienten in zwei Gruppen einzuteilen, eine mit niedriger Expression und eine mit hoher Expression der Signatur. Die Kaplan-Meier-Überlebenskurven der beiden Gruppen wurden verglichen. Patienten mit Tumoren mit einem hohen Score-Wert der Proliferationssignatur wiesen einen ungünstigeren Ausgang also solche mit Tumoren mit einem niedrigen Score-Wert der Proliferationssignatur auf.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Hypoxie ist ein häufiges Merkmal von soliden Tumoren, das mit Therapieresistenz, erhöhter Malignität und ungünstiger Prognose verbunden ist. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um Patienten mit hypoxischen Tumoren zu identifizieren, einschließlich die Verwendung von Gensignaturen auf der Grundlage von Mikroarrays. Allerdings wurde bei den bisherigen Untersuchungen die starke Zeitabhängigkeit der hypoxieregulierten Genexpression weitgehend außer Acht gelassen. Es wird vermutet, dass die Verwendung zeitabhängiger Muster der Genexpression während einer Hypoxie die Entwicklung besserer prognostischer Expressionssignaturen ermöglichen würde.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Vorhersagen des Patientenansprechens auf eine Krebsbehandlung unter Verwendung von Gensignaturen bereit. Die Verfahren umfassen typischerweise das Messen der Genexpressionsniveaus einer Gruppe von Genen, die Transkripten entsprechen, die mit einer bestimmten Gruppe von Unigene-ID-Nummern verbunden sind, in einer biologischen Probe von einem Patienten. Bei besonderen Ausführungsformen sind die Unigene-ID-Nummern aus den vorstehend beschriebenen Gruppen (a)–(c) ausgewählt. Mit einer Unigene-ID-Nummer können mehrere Transkripte verbunden sein. Beispiele einer DNA-Sequenz, die mit jeder Unigene-ID-Nr. der Gruppen (a) verbunden ist, sind in Tabelle 2A als SEQ ID NOS. 1–80 zu finden.
Zur Untersuchung der Genexpressionsniveaus von einer oder mehreren Sequenzen oder Unigene-ID-Nrn. wird typischerweise eine biologische Probe von einem Patienten untersucht, der an einem Krebs leidet oder der noch auf Krebs zu diagnostizieren ist. Eine ”biologische Probe” umfasst eine Tumorprobe, kanzeröses Gewebe, präkanzeröses Gewebe, ein Biopsat, Gewebe, Lymphknoten, ein chirurgisches Exzidat, Blut, Serum, Urin, Organe, Speichel usw., erhalten von einem Patienten, der an einem Krebs leidet oder der noch auf Krebs zu diagnostizieren ist.
Anschließend wird die biologische Probe typischerweise auf das Vorhandensein von einem oder mehreren Genexpressionsprodukten untersucht, wie z. B. RNA, cDNA, cRNA, Proteine und so weiter.
Bei einer Ausführungsform wird die mRNA aus einer biologischen Probe direkt zur Bestimmung der Expressionsniveaus einer Gruppe von Genen verwendet. Bei einer besonderen Ausführungsform wird RNA aus einer biologischen Probe erhalten. Anschließend wird die RNA unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, in eine cDNA-Kopie (komplementäre DNA) transformiert. Bei besonderen Ausführungsformen wird die cDNA mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einer anderen nachweisbaren Markierung versehen. Anschließend wird die cDNA an ein Substrat hybridisiert, das eine Vielzahl von Sonden von Interesse enthält. Eine Sonde von Interesse hybridisiert typischerweise unter strengen Hybridisierungsbedingungen an wenigstens eine DNA-Sequenz einer Gensignatur. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Vielzahl von Sonden unter den Hybridisierungsbedingungen von 6X SSC (0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat, pH-Wert = 7,4) bei 65°C an die Sequenz von wenigstens einem aus der Gruppe von DNA-Sequenzen der Gruppen (d)–(f) hybridisieren. Die Sonden können Nucleinsäuren umfassen. Ein Beispiel einer Nucleinsäure ist DNA. Der Begriff ”Nucleinsäure” bezeichnet Desoxyribonucleotide und Ribonucleotide sowie Polymere davon. Der Begriff umfasst Nucleinsäuren, die bekannte Nucleotidanaloga, modifizierte Reste im Rückgrat oder Verknüpfungen, die synthetisch, natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend sind, enthalten und ähnliche Bindungseigenschaften wie die Bezugsnucleinsäure aufweisen, und die auf ähnliche Weise wie die Bezugsnucleotide metabolisiert werden. Beispiele derartiger Analoga umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Phosphorothioate, Phosphoramidate, Methylphosphonate, chirale Methylphosphonate und Peptidnucleinsäuren (PNAs).
In bestimmten Fällen werden die Sonden eine Länge von etwa 15 bis etwa 50 Basenpaaren aufweisen. Der Umfang der cDNA-Hybridisierung kann durch Untersuchung des Vorhandenseins der nachweisbaren Markierung, wie z. B. eines Fluorophors, gemessen werden. Die Quantifizierung des Hybridisierungssignals kann verwendet werden, um einen Score-Wert für eine bestimmte Sequenz oder einen bestimmten Satz von Sequenzen in der Gensignatur für einen bestimmten Patienten oder eine Vielzahl von Patienten zu erzeugen.
Der Begriff ”nachweisbare Markierung” bezeichnet eine Einheit, die durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel an eine zu vermessene Einheit oder eine Sonde befestigt ist. Eine ”nachweisbare Markierung” kann eine radioaktive Einheit, eine fluoreszierende Einheit, eine chemilumineszierende Einheit usw. sein. Der Begriff ”Fluoreszenzmarkierung” bezeichnet eine Markierung, die Strahlungsenergie einer Wellenlänge aufnimmt und Strahlungsenergie einer anderen Energie aussendet. Das Vorhandensein einer nachweisbaren Markierung kann unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren geprüft werden, die zum Nachweisen einer bestimmten Markierung geeignet sind, wie z. B. spektrophotometrische Mittel (beispielsweise ein Spektrophotometer), radiometrische Mittel (beispielsweise ein Szintillationszähler), Fluorometer, Luminometer und so weiter.
Der Umfang der Erfindung umfasst DNA-Mikroarrays, die eine Vielzahl von Sequenzen enthalten, die unter strengen Hybridisierungsbedingungen an eine oder mehrere der Gensequenzen in einer Gensignatur hybridisieren. Ein Beispiel eines Substrats, das eine oder mehrere Sonden von Interesse enthält, ist eine Vielzahl von DNA-Sonden, die an einem Substrat befestigt sind. Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Substrat ein oder mehrere Materialien wie ein Gel, Nitrocellulose, Nylon, Quarz, Glas, Metall, Materialien auf Siliciumoxidbasis, Siliciumoxid, Harze, Polymere usw. oder Kombinationen davon umfassen. Typischerweise umfassen die DNA-Sonden etwa 10–50 bp zusammenhängender DNA. Bei bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei den DNA-Sonden um etwa 20 bis etwa 50 bp kontinuierlicher DNA. Bei bestimmten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Kits, die ein Mikroarray und Bedienungsanleitungen dafür umfassen. Das Kit kann einen Behälter umfassen, der ein oder mehrere Mikroarrays umfasst, sowie Bedienungsanleitungen dafür.
Die biologische Probe kann auch unter Verwendung von Verfahren, die Nucleinsäuren nachweisen können, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, PCR (Polymerase-Kettenreaktion); RT-PCT (reverse-Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion); quantitative PCR und so weiter, auf Genexpression von einem oder mehreren Genen in einer Signatur analysiert werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Genexpressionsniveaus durch Nachweisen der Proteinexpressionsprodukte der Gene oder DNA-Sequenzen gemessen. Die Mengen der Proteinprodukte können unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, gemessen werden, einschließlich durch Verwendung von Antikörpern, die spezifisch an ein bestimmtes Protein binden. Diese Antikörper, einschließlich polyklonale und monoklonale Antikörper, können unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Diese Antikörper können auch an ein festes Substrat gekuppelt werden, um einen Antikörper-Chip oder ein Antikörper-Mikroarray zu bilden. Antikörper- oder Protein-Mikroarrays können unter Verwendung von Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden.
Nachdem die Genexpressionsniveaus gemessen sind, wird ein Score-Wert der Signatur erzeugt. Beispiele, wie ein Score-Wert einer Signatur erzeugt wird, werden hier beschrieben. Anschließend wird der Score-Wert der Signatur mit einem vorhergesagten Ansprechen auf eine Krebsbehandlung korreliert. Typischerweise kann eine Kaplan-Meier-Kurve erzeugt werden, um zu bestimmen, ob der Score-Wert der Signatur mit einer höheren oder niedrigeren Überlebensrate verbunden ist. Bei besonderen Ausführungsformen kann einer Sequenz oder einer Unigene-ID-Nummer bei der Erzeugung eines Score-Werts des Signatur ein positives oder negatives zahlenmäßiges Gewicht zugeordnet werden. Wenn der Score-Wert der Signatur mit einer geringeren Überlebensrate verbunden ist, kann eine aggressive Krebsbehandlung angezeigt sein. Wenn der Score-Wert der Signatur mit einer höheren Überlebensrate verbunden ist, kann eine weniger aggressive Krebsbehandlung angezeigt sein.
Die Behandlung von Krebs umfasst bei bestimmten Ausführungsformen das Messen der Genexpressionsniveaus einer Gruppe von Unigene-ID-Nummern, die aus der aus Gruppe, die aus den Gruppen (a)–(c) besteht, ausgewählt sind. Ferner umfasst das Behandlungsverfahren typischerweise das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines oder mehrerer Mittel zur Krebsbehandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus chemotherapeutischen Krebsmitteln und Strahlung. Die Krebsbehandlung kann auch chirurgische Eingriffe oder chirurgische Verfahren umfassen. Die Krebsbehandlung kann ferner chirurgische Eingriffe und das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einem oder mehreren Mitteln zur Krebsbehandlung umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus chemotherapeutischen Krebsmitteln und Strahlung. Der Begriff ”Verabreichung” bezeichnet das Verfahren des Kontaktierens einer Verbindung mit einem Subjekt. Wege der ”Verabreichung” können Verfahren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die das intravenöse, intraperitoneale, intranasale, transdermale und topische Kontaktieren, das Kontaktieren über Implantation, das subkutane, parenterale, intramuskuläre, orale und systemische Kontaktieren und das Kontaktieren über Adsorption der chemotherapeutischen Krebsmittel umfassen. Der Begriff ”Behandlung” umfasst die akute oder prophylaktische Verringerung oder Linderung wenigstens eines Symptoms oder Merkmals, das mit dem behandelten Krebs verbunden oder ist oder davon verursacht wird. Beispielsweise kann eine Behandlung die Verringerung mehrerer Symptome eines Krebses oder die vollständige Beseitigung eines Krebses umfassen. Der Begriff ”therapeutisch wirksame Menge” bezeichnet eine Menge eines chemotherapeutischen Krebsmittels oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, die ausreicht, um bei Verabreichung allein oder in Verbindung mit einem anderen pharmazeutischen Mittel oder einer anderen Behandlung bei einem bestimmten Subjekt oder einer bestimmten Population von Subjekten den behandelten Krebs zu hemmen, aufzuhalten oder eine Verbesserung davon zu ermöglichen. Beispielsweise kann bei einem Menschen eine therapeutisch wirksame Menge für die bestimmte Erkrankung und das bestimmte Subjekt, das behandelt wird, in einem klinischen Rahmen experimentell bestimmt werden. Es ist zu beachten, dass die Bestimmung geeigneter Dosierungsformen, Dosierungsmengen und Verabreichungswegen zum normalen Fachkönnen auf den Fachgebieten der Pharmazie und der Medizin gehört.
Die Auswahl eines geeigneten therapeutischen Behandlungsplans gehört zum Fachkönnen eines praktizierenden Arztes. Therapeutische Behandlungspläne können die Verwendung von chemotherapeutischen Krebsmitteln und/oder Strahlung umfassen. Ein chemotherapeutisches Krebsmittel ist ein chemisches oder biologisches Mittel (beispielsweise ein Antikörper, Protein, RNA, DNA usw.), das das Wachstum von Krebs verzögert, verlangsamt oder beendet oder von der U.S. Food and Drug Administration zur Behandlung von Krebs zugelassen ist. Beispiele von chemotherapeutischen Krebsmitteln umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Paclitaxel, Docetaxel, Imatinibmesylat, Sunitinibmalat, Cisplatin, Etoposid, Vinblastin, Methotrexat, Adriamycin, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Daunomycin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Endostatin, Angiostatin, Bevacizumab und Rituximab. Ein weiteres Beispiel eines Mittels zur Krebsbehandlung ist Strahlung. Somit kann die Krebsbehandlung Strahlentherapie, fraktionierte Strahlentherapie, Chemotherapie und Radiochemotherapie (eine Kombination von einem oder mehreren chemotherapeutischen Mitteln und Strahlung) umfassen. Der Krebs kann jede Art von Krebs sein. Bei bestimmten Ausführungsformen ist der Krebs Brustkrebs, Nierenkrebs oder Lungenkrebs. Beispiele von Krebs umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, kleinzelligen Lungenkrebs, Plattenepithel-Lungenkarzinom, Gliom, Brustkrebs, Prostatakrebs, Ovarialkrebs, Zervixkrebs, Glioblastom, Endometriumkarzinom, heptozelluläres Karzinom, Darmkrebs, Lungenkrebs, Melanom, Nierenzellkarzinom, Nierenkrebs, Schilddrüsenkarzinom, Plattenepithel-Lungenkarzinom, Leukämie, Zelllymphom und lymphoproliferative Störungen.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Unter Verwendung von veröffentlichten Daten aus der Mikroarray-Untersuchung von Chi et al. (4) wurden Gensignaturen extrahiert, die mit einer Induktion während einer frühen oder späten hypoxischen Exposition korrelieren. Die Gensignaturen wurden aus einer in-vitro-exponierten menschlichen Mammaepithel- Zelllinie (HMEC) unter 0% oder 2% Sauerstoff erhalten. Gensignaturen, die mit einer frühen oder späten Hochregulierung korrelieren, wurden mit Hilfe von Kaplan-Meier-Überleben, univariaten und multivariaten Analysen eines Patienten-Datensatzes mit herkömmlich behandeltem primärem Brustkrebs (chirurgischer Eingriff plus, falls indiziert, Strahlentherapie und systemische Therapie) geprüft.
Ergebnisse
Zwei frühe Gensignaturen der Hypoxie, die bei 0% bzw. 2% Hypoxie extrahiert wurden, zeigten eine wesentliche prognostische Kraft (log-Rangtest: p = 0,004 bei 0% und p = 0,034 bei 2%), im Gegensatz zu den Signaturen der späten Hypoxie. Beide frühen Gensignaturen stehen mit dem Insulin-Signalweg in Verbindung. Bei einer multivariaten Cox-Regressionsanalyse wurde gefunden, dass die Signatur der frühen Hypoxie (p = 0,254) der viertbeste prognostische Faktor nach dem Lymphknotenstatus (p = 0,002), der Tumorgröße (p = 0,016) und den Elston-Graden (p = 0,111) ist. Aus diesem Datensatz wird mehr Information erhalten, als aus dem ER(Estrogenrezeptor)-Status oder dem p53-Status.
Schlussfolgerung
Der hypoxische Stress löst einen breiten Bereich von zeitabhängigen Antworten aus, die verschiedenen biologischen Signalwegen entsprechen. Es wurde gezeigt, dass frühe Signaturen der Hypoxie eine wesentliche prognostische Kraft aufweisen. Diese Daten legen nahe, dass aus in-vitro-Experimenten identifizierte Gensignaturen zur individualisierten Medizin beitragen können.
Materialien und Verfahren
Daten
Das Ausgangsmaterial war der Datensatz aus der Studie von Chi et al., der mit 2,4 Millionen Messungen der Genexpression einen der umfangreichsten Sätze von zeitabhängigen Reihen unter Hypoxie darstellt. Es wurden vier normale Zelllinien, nämlich menschliche Endothelzellen von Koronararterien (ECs), glatte Muskelzellen (SMCs), menschliche Mamma-Epithelzellen (HMECs) und Epithelzellen von proximalen Nierentubuli (RPTECs 1 und 2), unter 2 Sauerstoffkonzentrationen (weniger als 0,02% (hier als ”0%” bezeichnet) und 2%) verwendet. Die Genexpression unter Hypoxie wurde unter Verwendung von cDNA-Mikroarrays mit 42.000 Reportern überwacht, mit dem Ergebnis von 10 zeitabhängigen Reihen mit jeweils höchstens 6 Zeitpunkten. Nach Filterung auf Rauschen und Intensität haben Chi et al. die zeitabhängigen Reihen der verbleibenden 4.333 Reporter aufgetragen (Daten nicht gezeigt). Dieser Datensatz wurde von http//microarraypubs.stanford.edu/hypoxia/index.htm herunter geladen. SM und HMEC verfügten über die längsten zeitabhängigen Reihen, d. h. über sechs Zeitpunkte bei 0, 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden Hypoxie, jeweils bei zwei Sauerstoffkonzentrationen (weniger als 0,02% (hier als ”0%” bezeichnet) und 2%). Die anderen Zelllinien konnten wegen fehlender früher Zeitpunkte hier nicht eingeschlossen werden. Wie auch von Chi et al. gefunden wurde, konnte für die SM-Zelllinie wegen eines schmalen Bereichs der Expression zwischen Hoch- und Abregulierung eine differenzielle Expression nicht klar definiert werden. Die nachstehende Analyse konzentriert sich daher auf die beiden zeitabhängigen Reihen, die für die HMEC-Zelllinie zur Verfügung stehen, eine mit einer Sauerstoffkonzentration von weniger als 0,02% (HMEC0) und die andere unter 2% (HMEC2).
Mithilfe von SOURCE (http://smd.stanford.edu/cgibin/source/sourceSearch) wurde eine Batch-Recherche durchgeführt, um die 4.333 CLONEIDs in UniGenes (letzter Zugang: Februar 2007, Build 199) zu übertragen. Ein Reporter (eine Sonde) wurde entfernt, wenn eines der folgenden Kriterien erfüllt war: keine UniGene-Kennung gefunden (328 Reporter); ein Reporter entspricht mehreren UniGene-Kennungen (257 Reporter); das Gen-Symbol entspricht Mitochondrien (28 Reporter); oder das UniGene ist nicht vom Menschen (1 Reporter).
Die verbleibenden 3.719 Reporter wurden für jede zeitabhängigen Reihe unabhängig weiter ausgefiltert, wenn 1 Zeitpunkt oder mehr fehlte. Für HMEC0 ergab dies eine zeitabhängige Reihe von 1.196 Reportern, die durch 1.082 verschiedene Gene dargestellt waren. Für die HMEC2-Reihe bestand sie aus 1.047 Reportern, die durch 955 verschiedene Gene dargestellt waren.
Genexpressions-Profiling
Die Extraktion von Genen mit Hochregulierung zu frühen Zeitpunkten wurde auf kontrollierte Weise beurteilt. Als Ähnlichkeitsmaß wurde eine Pearson-Korrelation verwendet, um Profile auf der Grundlage ihrer zeitabhängigen Form, aber unabhängig von den Änderungen des Ausmaßes auszuwählen (unter diesen Bedingungen werden also eine schwache frühe und eine starke frühe Hochregulierung als gleichwertig angesehen). Eine Bezugskurve, die das Muster der Genexpression als Funktion der Zeit darstellt, wurde vom Benutzer als Abfolge von Ziffern Null und Eins definiert. Die Zeitpunkte 1, 3 und 6 Stunden wurden bei der Antwort auf Hypoxie als frühe Zeitpunkte angesehen, während 12 und 24 Stunden als späte Zeitpunkte betrachtet wurden. Die Bezugskurve zum Auswählen von Genen mit einer frühen Hochregulierung, die bei späteren Zeitpunkten wieder zu dem Grundwert zurückkehren, wurde somit als 0-111-00 angesetzt. Dieses Templat wurde verwendet, um die Gene auszuwählen, deren zeitabhängiges Profil diesem a priori bestimmten Expressionsmuster ähnlich war. Es wurde ein Filterschritt eingeführt, der eine wenigstens 2fache Induktion forderte (bezogen auf die Expression unter Kontrollbedingungen). Dieser Vorgang wurde für jede Zelllinie unabhängig durchgeführt. Um Genlisten mit handhabbarem Umfang zu erhalten, wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,6 gewählt.
Die frühe Signatur der Hypoxie (Bezugskurve: 0-111-00 für die Zeitpunkte Kontrolle-früh-spät) wurde mit einem Muster der späten Hypoxie verglichen, deren Bezugskurve 0-000-11 ist, bei der also die Genexpression während der 3 frühen Zeitpunkte konstant und gleich dem Kontrollwert bleibt und nach 12 und 24 Stunden Hypoxie hochreguliert sein muss. Für jede zeitabhängige Reihe wurden drei Arten von Gensignaturen abgeleitet: frühe Hypoxie; späte Hypoxie gemäß dem Korrelationskoeffizienten (lange Version); und späte Hypoxie gemäß der Anzahl der Reporter (kurze Version).
Statistische Analyse
Die in vitro extrahierten Signaturen auf der Grundlage von Genexpression wurden gegenüber einer umfangreichen Krebsstudie in vivo ausgewertet, für die Mikroarray-Daten zur Verfügung stehen (von http://www.ncbi.nim.nih.gov/projects/geo/, Zugangsnummer GSE3494, herunter geladen). Für die 251 Patienten (eine Teilgruppe der Uppsala-Gruppe) mit primärem Brustkrebs, die mit chirurgischen Eingriffen plus, falls indiziert, begleitender Strahlentherapie und systemischer Therapie behandelt wurden, sind klinische Informationen verfügbar (Tabelle 1) (13, 16). Die Expressionsdaten wurden log-transformiert, mehrfache Reporter für das gleiche Gensymbol wurden gemittelt. Abhängig von der Gesamtexpression der für die Signatur gewählten Gene wurde ein Patient entweder einer Gruppe mit hoher Expression oder einer Gruppe mit niedriger Expression zugeordnet. das Ergebnis in beiden Gruppen wurde analysiert und mit dem Kaplan-Meier-Verfahren verglichen. Zur Beurteilung der Unterschiede im Überleben zwischen den beiden Gruppen wurden log-Rangtests durchgeführt. Mithilfe von SPSS (SPSS, Chicago, IL) wurden univariate und multivariate Cox-Regressionsanalysen durchgeführt, die alle klinischen Variablen und die frühe Singnatur bei 0% umfassten. Es wurde auch ein Ansatz mit maschinellem Lernen verwendet, um den Einfluss der frühen Signatur zu beurteilen. Dieser bestand aus (1) dem Auswählen von Merkmalen (durch Vergleichsprüfung durch Weglassen von Einem), gefolgt von (2) einem Validierungsschritt, der aus einem Bootstrap-Verfahren bestand (Resampling mit Austausch), bei dem zufällig gewählte 70% der Daten zum Trainieren und die verbleibenden 30% der Daten zum Prüfen verwendet wurden. Dieses Verfahren wurde 100 Mal wiederholt, wobei die Mittelwerte und Standardabweichungen der Ergebnisse aufgezeichnet wurden. Ferner wurden multivariate Modelle geprüft, die alle möglichen Variablenkombinationen (2^8-1 = 255) darstellten, wobei die 5 besten Modelle behalten wurden.
Ergebnisse
Zur Ableitung von frühen Gensignaturen der Hypoxie aus den HMEC-Zelllinien unter 0% bzw. 2% Sauerstoff wurden die Gene mit einem vorbestimmten Bezugsmuster korreliert. Dabei wurden Gene ausgewählt, die eine Korrelation mit dem geforderten Zeitprofil von besser als 0,6 und eine mindestens 2fache Induktion aufwiesen (Tabelle 2). Ergebnisse von log-Rangtests an dem Miller-Datensatz sind in Tabelle 3 gezeigt.
HMEC0%
Die Anzahl der Reporter, die mit einer frühen Induktion (frühe Gensignatur der Hypoxie) nach Exposition an 0% Sauerstoff korrelieren, betrug 80 (79 verschiedene UniGenes) (siehe Tabelle 2A) (Signatur (a)). Auf dem gleichen Korrelationsniveau wurden 241 Reporter (210 verschiedene UniGene) für die späte Signatur der Hypoxie gefunden (lange, späte hypoxische Signatur). Zu Vergleichszwecken wurde die geforderte Korrelation erhöht, um die Anzahl der Reporter auf eine ähnliche Größe wie jene der frühen Signatur zu verringern. Diese kurze, späte hypoxische Signatur umfasste 74 Reporter (70 verschiedene UniGenes) (siehe Tabelle 2B). Von diesen drei Signaturen war nur die frühe Signatur der Hypoxie gegenüber dem Brustkrebs-Datensatz signifikant (p = 0,004 für einen Unterschied im Überleben). Überraschenderweise waren die späten Signaturen nicht signifikant und zeigten keinen Hinweis auf eine Aufteilung der Patienten in verschiedene prognostische Gruppen (p = 0,118 und p = 0,110 für die kurze bzw. die lange Version).
HMEC2%
Unter 2% Sauerstoff war die Zahl der ausgewählten Reporter kleiner als unter 0% Sauerstoff. Die frühe Gensignatur enthielt 36 Reporter (36 verschiedene UniGenes) (siehe Tabelle 2C) (Signatur (b)), die eine Hochregulierung innerhalb der ersten Stunden (Stunden 1-3-6) nach einer Exposition an Hypoxie zeigten. Die lange, späte Hypoxiesignatur wurde aus 169 Reportern (147 verschiedene UniGenes) mit einer Korrelation von 0,6 abgeleitet. Für die kurze Version wurde die Korrelation erhöht, um eine Größe zu erhalten, die mit jener der frühen vergleichbar war. Sie bestand aus 34 Reportern (32 UniGenes) (siehe Tabelle 2D). Ähnlich wie bei den Ergebnissen unter 0% war die frühe Signatur der Hypoxie die einzige signifikante Signatur (p = 0,034), während die kurze und die lange Version der späten Signatur der Hypoxie beide nicht signifikant waren (p-Werte von 0,919 bzw. 0,842).
Kombination von Signaturen (0% Sauerstoff und 2% Sauerstoff)
Die zeitabhängigen Reihen ohne Weglassen von HMEC-Daten unter 0% Sauerstoff (1.082 UniGenes) bzw. 2% Sauerstoff (955 UniGenes) zeigten eine starke Überlappung: 793 UniGenes. Die Gegenüberstellung der beiden frühen Signaturen zeigte eine kleine Überlappung (15 UniGenes) (siehe Tabelle 2E) (Signatur (c)). Dieser Kern des Ansprechens von HMEC wurde ebenfalls geprüft und zeigte einen p-Wert von 0,005 (log-Rangtest). Die Überlappung der beiden langen, späten Signaturen zeigte eine Überlappung von 93 UniGenes. Diese Kernsignatur des späten Ansprechens wurde geprüft und zeigte keine Signifikanz (p = 0,240) gegenüber dem Brustkrebs-Datensatz.
Um die Gene aus den frühen Signaturen mit biologischen Funktionen zu verbinden, wurden Gen-ontologische Analysen unter Verwendung von ”Ingenuity Pathways Analysis” (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) durchgeführt. Die Ergebnisse für die wichtigsten Funktionen sind in Tabelle 4 gezeigt. Für beide frühen Signaturen wurden nur zwei wichtige Funktionen gefunden. Die zur Anreicherung ausgewählten Gene (”Fokusgene”) werden aufgeführt und sind hauptsächlich bei der Proliferation, dem Zellzyklus und Krebs beteiligt. Für den Kern des frühen Ansprechens (Schnittmenge von 0% und 2% Sauerstoff) betraf die wichtigste Funktion den Aminosäuremetabolismus.
Prognostische Kraft der frühen Signatur (HMEC0)
An der frühen Signatur (HMEC0) wurde eine univariate Cox-Regressionsanalyse gegenüber dem Miller-Datensatz mit allen verfügbaren Variablen und dem Score-Wert der frühen Hypoxie durchgeführt. Dabei wurde gefunden, dass der Score-Wert der Signatur signifikant ist (p-Wert < 0,05), während der Progesteronrezeptor(”PgR”)-Status und der Estrogenrezeptor(”ER”)-Status sowie das Alter nicht signifikant waren.
Bei der multivariaten Analyse (mit einem Auswahlverfahren mit Rückwärtsschritten) wurde gefunden, dass die frühe Signatur der Hypoxie (p = 0,254) der viertbeste prognostische Faktor nach dem Lymphknotenstatus (p = 0,002), der Tumorgröße (p = 0,016) und den Elston-Graden (p = 0,111) ist. Aus diesem Datensatz wird mehr Information erhalten, als beispielsweise aus dem ER-Status oder dem p53-Status (beide einzeln oder mit anderen Variablen kombiniert).
Es wurde auch eine multivariate Analyse mit einem Ansatz der Auswahl unter Verwendung von maschinellem Lernen durchgeführt. Die Verwendung aller Variablen in dem Algorithmus (Alter und der Score-Wert der frühen Signatur) ergab eine Fläche unter der Kurve (”AUC”) von 62,3 mit einer Standardabweichung (std) von 0,07. Die Wiederholung der Analyse mit nur dem Alter ergab eine AUC von 62,2 mit einer std von 0,07. Als das Alter und der Score-Wert der Signatur verwendet wurden, betrug die AUC 62,5 (std 0,07). Mit nur dem Score-Wert der Signatur betrug die AUC 66,1 (std 0,06). Aus einhundert Computerläufen für jede Analyse wurde ein t-Test zwischen den sechs Variablen und dem Score-Wert der Signatur gegenüber den sechs Variablen und dem Alter durchgeführt. Der erhaltene p-Wert von 4.8e-6 deutete darauf hin, dass bei diesem Datensatz das Alter eine kleinere Rolle spielt als der Score-Wert der Signatur.
Es ist auch wichtig, dass bei Berücksichtigung aller möglichen Variablenkombinationen zum Trainieren eines multivariaten Modells vier der fünf am besten arbeitenden Kombinationen den Score-Wert der Signatur enthielten.
Diskussion
Frühe Hypoxie
Die Auswirkungen des frühen Ansprechens auf Hypoxie werden mit der Ausnahme einiger weniger Untersuchungen (beispielsweise (12)) nur selten unter Verwendung von Mikroarrays untersucht. Wegen möglicher Unterschiede, die aus unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen entstehen, wurden die beiden zeitabhängigen Reihen unabhängig voneinander behandelt. Beide frühen Signaturen der Hypoxie waren signifikant (p < 0,01 bei 0% Sauerstoff; p < 0,05 bei 2% Sauerstoff), während die späten Signaturen alle nicht signifikant waren. Die Signatur der 15 gemeinsamen UniGenes (13 Symbole), die in beiden frühen Signaturen gefunden wurden, wurde ebenfalls geprüft und als signifikant gefunden (p = 0,005) (siehe Tabelle 2E).
Durch Ingenuity-Pathways-Analyse wurden Gene in dieser Liste identifiziert, umfassend ACACA; AMH; BACH1; CCT2 (betrifft Wachstum und Apoptose) und IFI6 bei Krebs, Tumormorphologie und Aminosäuremetabolismus (Tabelle 4). Die Verwendung der frühen Signatur bei 0% Sauerstoff (p = 0,004) ergab bei der Ingenuity-Pathways-Analyse einen wesentlichen Beitrag von IGF1R (aus dem kanonischen Insulin-Signalweg); TERT(Telomerase-reverse-Transkriptase); AMH; COL6A3; und ACACA bei der Apoptose, dem Wachstum und der Proliferation. Ferner wurden CCNH (aus dem Estrogenrezeptor-Signalweg) und die Transkriptionsfaktoren ATF3 und BACH1 identifiziert. Die frühe Signatur könnte die Aktivierung der Unfolded-Protein-Antwort (beispielsweise ATF3) anzeigen, von der bekannt ist, dass sie schnell in Antwort auf Hypoxie aktiviert wird. Es wurde ein Austausch zwischen dem Sauerstoff- und dem Glucosemetablismus über HIF1 beschrieben (11, 15), sowie eine schützende Rolle von IGF1 gegen Zelldegeneration nach Schlaganfall, wie z. B. Hypoxie-Ischämie, in Tiermodellen (17).
Späte Hypoxie
Es wurde gefunden, dass die späten Signaturen (0% Sauerstoff und 2% Sauerstoff) der Chi-Signatur sehr ähnlich sind, wobei die Überlappung für beide größer als 40% ist (und bis zu 70% bei den kurzen Versionen). Die biologische Rolle der späten Signaturen ist ebenfalls für eine hypoxische Antwort typisch (6), wobei Gene Proteine codieren, die bei dem Hypoxie-Signalweg und der Angiogenese beteiligt sind (ANGPTL4, CA9, DDIT4, EGLN3, EGFR, HK2, HIG2, LOX); bei der Zellproliferation und der Apoptose (BNIP3L, NDRG1, MXI1); beim Glucosetransport (viele Mitglieder der Familie der gelösten Träger, einschließlich GLUT1); beim Metabolismus (ENO1, PGK1), sowie Adrenomedullin (ADM). Ähnlich wie bei den vier abgeleiteten späten Signaturen der Hypoxie wurde von der Chi-Signatur keine Signifikanz gegenüber diesem Datensatz gefunden. Dies legt nahe, dass späte Signaturen der Chi-Signatur nicht nur in ihrem Gen-Gehalt, sondern auch hinsichtlich ihrer prognostischen Kraft sehr ähnlich sind.
Nicht-kontrollierte und kontrollierte Signaturen der Hypoxie
Die Clusteranalyse (7) ist ein häufig verwendetes Verfahren (3, 10) zur unverzerrten Beurteilung von geteilten Funktionen und gemeinsamer Regulation, da der Algorithmus keine benutzerdefinierten (d. h. kontrollierten) Annahmen über die Anzahl oder die Art der aufzufindenden Cluster benötigt. Die zugrunde liegende Idee ist, dass Gene mit einem ähnlichen Expressionsmuster wahrscheinlich auch bei dem gleichen regulatorischen Vorgang beteiligt sind (als ”Schuld durch Gemeinschaft” bezeichnet). Dieser Ansatz wurde von Chi et al. verwendet, um die zeitabhängige Genexpression unter Hypoxie zu klassieren. Aus HMECs und RPTECs wurde nach einer visuellen Begutachtung ein Cluster von global hochregulierten Genen als so genannte ”Epithelzellenhypoxie-Gene” oder so genannte Chi-Signatur ausgewählt. Der genetische Inhalt der frühen Signaturen der Hypoxie zeigt beinahe keine Überlappung mit der Chi-Signatur, nämlich 2 UniGene bei 0% Sauerstoff (Hs.149032, PIK3R4 und Hs.283749, RNASE4) und nur eines bei 2% Sauerstoff (Hs.94542, ALKBH1). Dies deutet darauf hin, dass die frühen Signaturen von der Chi-Signatur sehr verschieden sind.
Obwohl externe Änderungen des Milieus (beispielsweise Hypoxie) von der Zelle sehr schnell wahrgenommen werden, treten große Änderungen auf der Transkriptionsebene meist erst nach mehreren Stunden auf. Es wurde ein kontrolliertes Verfahren entwickelt, um einige Gene zu extrahieren, die bei der frühen hypoxischen Antwort beteiligt sind (beispielsweise nach 1–6 Stunden Hypoxie). Zwischen den frühen und den späten Signaturen wurde nur wenig Überlappung gefunden, nämlich nur ein UniGen bei 0% Sauerstoff (Hs.106861, NSD1) und keines unter 2% Sauerstoff. Dies zeigt, dass sich frühe Signaturen sowohl in ihrem genetischen Inhalt als auch bei Patienten, die sie auswählen, von späten Signaturen (einschließlich die Chi-Signatur) unterscheiden.
Alle frühen Signaturen der Hypoxie, unabhängig ob unter 0% Sauerstoff oder unter 2% Sauerstoff extrahiert, und auch ihre Überlappung, waren gegenüber dem Miller-Datensatz signifikant. Die prognostische Kraft der erstgenannten Signatur wurde durch eine multivariate Analyse bestätigt. Derzeit ist noch unklar, warum die frühen hypoxische Signaturen bei diesem Datensatz bessere prognostische Informationen liefern. Sie könnten eine differenzielle Aktivierung von Antwort-Signalwegen auf Hypoxie anzeigen, könnten aber auch Patienten mit aggressiveren Tumoren (mehr Metastasen), mit Behandlungsresistenz oder mit beidem auswählen. Derzeit werden weitere Verfahren untersucht, um unsere frühen Gensignaturen zu validieren, wie z. B. in-vitro-Experimente mit RNAi zum selektiven Abregulieren von Genprodukten (beispielsweise TERT oder IGF1R) oder durch weiteres Prüfen der Gensignatur an unabhängigen klinischen Datensätzen mit klaren klinischen Merkmalen. Diese retrospektive Untersuchung könnte auf dem Gebiet der Strahlentherapie und der Onkologie von Nutzen sein, indem sie den Bedarf an einer prospektiven klinischen Untersuchung aufzeigt, um klinische Daten zusammen mit Mikroarray-Daten und einer unabhängigen Messung der Hypoxie (beispielsweise durch Eppendorf-Elektroden oder immunchemische Färbung) zu gewinnen.
Schlussfolgerung

Die vorliegende Analyse zeigt in Übereinstimmung mit unserer Hypothese, dass die frühe und die späte Antwort auf Hypoxie auf der Transkriptionsebene sehr verschieden sind. Für eine vergleichsweise alte Gruppe von Patienten mit primärem Brustkrebs, der durch lokoregionale Therapie und begleitende systemische Therapie behandelt wurde, wurde gezeigt, dass frühe Signaturen der Hypoxie, nicht aber späte Antworten auf Hypoxie, mit Unterschieden im Überleben korrelieren. Dies legt nahe, dass Gensignaturen ein Mittel zum Auswählen von Patienten für eine individualisierte Therapie liefern können. Tabelle 1 Klinische Informationen über die 251 Patienten des Validierungsdatensatzes.

Merkmal
Anzahl der Patienten	251
Alter – Jahre	62,1 ± 13,9
Tumorstadium – Anzahl der Patienten (%)
Stadium I	67 (26,7)
Stadium II	128 (51,0)
Stadium III	54 (21,5)
Tumorgröße – mm	22,4 ± 12,5
ER(Estrogenrezeptor)-Status – Anzahl der Patienten (%)
positiv	213 (84,9)
negativ	34 (13,5)
Lymphknotenstatus – Anzahl der Patienten (%)
positiv	84 (33,5)
negativ	158 (62,9)
Progesteronrezeptorstatus – Anzahl der Patienten (%)
positiv	190 (75,7)
negativ	61 (24,3)
p53-Status – Anzahl der Patienten (%)
positiv	58 (23,1)
negativ	193 (76,9)

Tabelle 2A früh, 0%

Nr.	UniGene	Symbol	korr.	max.
1	Hs.592692		0,95	1,59
2	Hs.633514	TIMP2	0,92	3,49
3	Hs.127126	CPEB4	0,91	1,80
4	Hs.334587	RBPMS	0,90	1,35
5	Hs.648626		0,89	1,09
6	Hs.646346	GAS6	0,87	1,65
7	Hs.584803	ST3GAL1	0,87	1,45
8	Hs.567495	TRNT1	0,85	1,80
9	Hs.651126	DUSP3	0,85	1,50
10	Hs.478746	CENTB2	0,84	2,60
11	Hs.72550	HMMR	0,83	1,81
12	Hs.154276	BACH1	0,83	1,18
13	Hs.233568	HIST1H2AL	0,82	2,15
14	Hs.106861	NSD1	0,81	1,51
15	Hs.414418	BET1L	0,80	3,41
16	Hs.593565		0,80	4,08
17	Hs.235116	GRK6	0,79	1,94
18	Hs.554791	TP53I11	0,79	1,65
19	Hs.226780	OSTM1	0,79	1,86
20	Hs.525549	BTBD7	0,79	2,68
21	Hs.536158	PARG	0,79	2,83
22	Hs.438489	ATP5S	0,79	1,12
23	Hs.643279	EIF4EBP2	0,79	2,96
24	Hs.189772	CCT2	0,77	3,24
25	Hs.78977	PCSK1	0,76	2,18
26	Hs.155983	JMJD2A	0,76	2,03
27	Hs.612872	TTLL5	0,76	2,23
28	Hs.435933	PHF10	0,76	1,55
29	Hs.489603	ATXN7L1	0,76	3,60
30	Hs.128959	PCF11	0,75	3,40
31	Hs.335205	SSH2	0,74	2,84
32	Hs.146406	NIT1	0,74	1,81
33	Hs.596783		0,73	1,14
34	Hs.512973	PTPLAD1	0,73	1,71
35	Hs.461030	GFOD2	0,73	1,99
36	Hs.149983	PEX14	0,73	4,49
37	Hs.464137	ACOX1	0,73	2,21
38	Hs.292524	CCNH	0,72	3,27
39	Hs.283749	RNASE4	0,71	1,74
40	Hs.287362	TLE3	0,71	4,38
41	Hs.492203	TERT	0,71	1,20
42	Hs.250693	ZNF117	0,71	1,04
43	Hs.593232		0,70	3,15
44	Hs.590575	GRM3	0,70	3,26
45	Hs.428214	MAML2	0,70	3,13
46	Hs.523847	IFI6	0,70	4,68
47	Hs.533712	RBM4	0,70	2,29
48	Hs.44067	C12orf53	0,69	1,69
49	Hs.647072	PRKAG2	0,68	1,59
50	Hs.606472		0,68	3,93
51	Hs.149032	PIK3R4	0,68	1,21
52	Hs.436705	KIAA1219	0,68	2,10
53	Hs.631539	RAB4B	0,67	2,42
54	Hs.529353	ACSS1	0,67	2,55
55	Hs.592020	IGF1R	0,67	4,02
56	Hs.642938	IGFBP1	0,67	1,63
57	Hs.631930	LOC646450	0,67	2,42
58	Hs.148907	SLC5A12	0,66	5,14
59	Hs.160556	ACACA	0,65	1,63
60	Hs.126891	IL22RA2	0,64	1,63
61	Hs.124011		0,64	1,70
62	Hs.524828	ZNF664	0,64	3,12
63	Hs.4779	GATAD2B	0,64	2,28
64	Hs.612872	TTLL5	0,63	1,63
65	Hs.233240	COL6A3	0,63	1,19
66	Hs.445030	RHOBTB3	0,63	3,76
67	Hs.460	ATF3	0,63	1,79
68	Hs.112432	AMH	0,63	2,24
69	Hs.544738	LY86	0,63	3,32
70	Hs.530941	C12orf30	0,63	3,66
71	Hs.180903	NCAPH2	0,63	1,81
72	Hs.76364	AIF1	0,62	3,06
73	Hs.43627	SOX12	0,62	6,59
74	Hs.643599	PAPPA	0,62	1,96
75	Hs.125038	FAM92A1	0,61	1,82
76	Hs.131342	CCL26	0,61	2,59
77	Hs.512767	DKFZP761H 17	0,61	2,67
78	Hs.631974	LOC728488	0,60	1,31
79	Hs.112873	IGSF11	0,60	1,65
80	Hs.6217		0,60	1,93

Tabelle 2B spät, 0%, kurz

SEQ ID NO:	UniGene	Symbol	korr.	max.
102	Hs.102267	LOX	1,00	1,26
103	Hs.435051	CDKN2D	1,00	1,16
104	Hs.520819	INSIG1	0,99	2,18
105	Hs.380906	MYADM	0,98	1,56
106	Hs.102267	LOX	0,98	2,38
107	Hs.523012	DDIT4	0,98	1,69
108	Hs.465870	KEAP1	0,97	1,42
109	Hs.649390		0,97	1,20
110	Hs.173381	DPYSL2	0,97	2,70
111	Hs.287659	STRBP	0,97	2,70
112	Hs.131433	ADAMTS13	0,97	3,65
113	Hs.443976	CEP250	0,97	1,52
114	Hs.235782	SLCO4A1	0,96	2,24
115	Hs.405662	CRABP2	0,96	1,33
116	Hs.34871	ZFHX1B	0,96	2,58
117	Hs.269722	TCBA1	0,96	1,65
118	Hs.540696	SLC6A8	0,96	3,26
119	Hs.644065	TSC22D2	0,96	1,43
120	Hs.129003		0,95	2,49
121	Hs.502116	NAV2	0,95	2,02
122	Hs.511915	ENO2	0,95	4,10
123	Hs.530381	PIM3	0,95	2,03
124	Hs.497822	DUSP10	0,95	2,26
125	Hs.379821	FAM83A	0,95	1,36
126	Hs.96996	HNRPA0	0,95	2,50
127	Hs.26010	PFKP	0,94	1,56
128	Hs.75093	PLOD1	0,94	2,01
129	Hs.525704	JUN	0,93	2,15
130	Hs.446240	PRKCBP1	0,93	1,44
131	Hs.89387	CASC2	0,93	1,96
132	Hs.288232	SERINC5	0,93	1,03
133	Hs.533887	SMEK1	0,93	1,39
134	Hs.78771	PGK1	0,93	2,41
135	Hs.108106	UHRF1	0,93	1,46
136	Hs.644649		0,93	3,49
137	Hs.445402	PCTK3	0,93	3,23
138	Hs.535297	ARID5B	0,93	2,73
139	Hs.515032	MKNK2	0,92	2,76
140	Hs.422113	ZNF511	0,92	1,80
141	Hs.133350	CNOT2	0,92	2,65
142	Hs.146688	PTGES	0,92	1,15
143	Hs.460355	PRKCB1	0,92	2,79
144	Hs.369520	SYTL2	0,92	4,32
145	Hs.647120	MLL3	0,92	4,44
146	Hs.517145	ENO1	0,92	1,62
147	Hs.533782	KRT8	0,91	1,83
148	Hs.21691	GPR75	0,91	1,55
149	Hs.458513	PPP1R3B	0,91	2,57
150	Hs.643452	DGCR8	0,91	2,82
151	Hs.591443	RAVER2	0,91	1,14
152	Hs.433146	SLC6A10P	0,91	3,62
153	Hs.429879	EHHADH	0,91	4,21
154	Hs.9613	ANGPTL4	0,91	4,95
155	Hs.494529	FANCC	0,91	1,94
156	Hs.523012	DDIT4	0,91	2,14
157	Hs.97858	KIF1B	0,90	2,55
158	Hs.581355	EIF4E3	0,90	3,84
159	Hs.530904	CSRP2	0,90	1,32
160	Hs.159430	FNDC3B	0,90	1,73
161	Hs.435667	USP34	0,90	1,93
162	Hs.505172	LOC645619	0,90	1,93
163	Hs.446017	WSB1	0,90	2,09
164	Hs.470633	PDK1	0,89	2,22
165	Hs.501023	MXI1	0,89	4,06
166	Hs.501023	MXI1	0,89	1,92
167	Hs.46423	HIST1H4C	0,89	1,75
168	Hs.433146	SLC6A10P	0,89	3,61
169	Hs.591849	C8orf4	0,89	2,18
170	Hs.159195	DOCK1	0,89	3,02
171	Hs.372914	NDRG1	0,89	5,68
172	Hs.8004	KALRN	0,89	2,67
173	Hs.523789	TncRNA	0,89	2,14
174	Hs.634882	ARL6IP1	0,88	2,39
175	Hs.585433	KIRREL	0,88	2,60

Tabelle 2C früh, 2

SEQ ID NO:	UniGene	Symbol	korr.	max.
11	Hs.72550	HMMR	0,90	2,39
81	Hs.528299	HTATIP	0,90	1,84
82	Hs.510078	SGK	0,86	1,58
2	Hs.633514	TIMP2	0,86	3,83
83	Hs.602706	LOC645591	0,86	1,63
84	Hs.642877	MALAT1	0,85	2,46
43	Hs.593232		0,84	3,25
33	Hs.596783		0,82	1,59
85	Hs.441113	MAGEA6	0,80	1,06
36	Hs.149983	PEX14	0,79	4,42
86	Hs.94542	ALKBH1	0,79	1,18
12	Hs.154276	BACH1	0,77	2,12
24	Hs.189772	CCT2	0,77	4,09
68	Hs.112432	AMH	0,76	2,54
74	Hs.643599	PAPPA	0,74	1,51
87	Hs.126774	DTL	0,74	1,76
32	Hs.146406	NIT1	0,73	2,04
88	Hs.463838	LOC440459	0,73	1,25
46	Hs.523847	IFI6	0,72	4,45
89	Hs.46700	ING1	0,72	1,08
90	Hs.55131	C3orf23	0,71	1,21
91	Hs.558396	SCD	0,70	1,64
58	Hs.148907	SLC5A12	0,70	4,49
92	Hs.643920	CIGALT1C1	0,69	2,17
59	Hs.160556	ACACA	0,67	1,78
93	Hs.562083	ICMT	0,66	2,27
94	Hs.515383	LOC644242	0,66	4,93
95	Hs.513430	CDR2	0,65	2,10
26	Hs.155983	JMJD2A	0,63	2,71
44	Hs.590575	GRM3	0,62	3,65
96	Hs.632226	ITGB4	0,62	1,49
97	Hs.165607	FLJ25416	0,62	1,02
98	Hs.514033	SPAG5	0,61	1,92
99	Hs.632447	WDR42A	0,61	1,87
100	Hs.89603	MUC1	0,60	2,11
101	Hs.434961	ATXN1	0,60	2,34

Tabelle 2D spät, 2%, kurz

SEQ ID NO:	UniGene	Symbol	korr.	max.
176	Hs.446017	WSB1	1,00	1,77
177	Hs.370365	HK1	1,00	1,13
178	Hs.520819	INSIG1	0,97	1,51
179	Hs.405662	CRABP2	0,96	2,02
180	Hs.173705	LOC401152	0,94	2,24
181	Hs.644649		0,94	2,91
182	Hs.446017	WSB1	0,94	1,32
183	Hs.511915	ENO2	0,94	3,18
184	Hs.474935	SEMA4B	0,94	2,40
185	Hs.497822	DUSP10	0,94	2,06
186	Hs.335614	SEC14L2	0,93	2,59
187	Hs.102267	LOX	0,93	2,47
188	Hs.287659	STRBP	0,93	1,78
189	Hs.502116	NAV2	0,91	1,82
190	Hs.581021	SIRPA	0,91	1,08
191	Hs.403933	FBXO32	0,91	2,85
192	Hs.500047	P4HA1	0,91	2,97
193	Hs.540696	SLC6A8	0,90	2,43
194	Hs.2795	LDHA	0,89	1,38
195	Hs.9613	ANGPTL4	0,89	3,64
196	Hs.535297	ARID5B	0,89	2,28
197	Hs.173381	DPYSL2	0,89	2,19
198	Hs.429879	EHHADH	0,89	2,88
199	Hs.425144	MTMR11	0,89	1,74
200	Hs.98643	RAP2B	0,89	1,44
201	Hs.34871	ZFHX1B	0,88	2,08
202	Hs.591140	FOXK2	0,88	2,09
203	Hs.581355	EIF4E3	0,87	2,15
204	Hs.155247	ALDOC	0,87	1,38
205	Hs.501023	MXI1	0,87	2,77
206	Hs.536075		0,87	1,41
207	Hs.102267	LOX	0,86	1,79
208	Hs.132513	HSD17B12	0,86	3,51
209	Hs.132342	LPIN2	0,86	1,87

Tabelle 2E

SEQ ID NO:	UniGene	Symbol	korr.	max.
11	Hs.72550	HMMR	0,90	2,39
2	Hs.633514	TIMP2	0,86	3,83
43	Hs.593232		0,84	3,25
33	Hs.596783		0,82	1,59
36	Hs.149983	PEX14	0,79	4,42
12	Hs.154276	BACH1	0,77	2,12
24	Hs.189772	CCT2	0,77	4,09
68	Hs.112432	AMH	0,76	2,54
74	Hs.643599	PAPPA	0,74	1,51
32	Hs.146406	NIT1	0,73	2,04
46	Hs.523847	IFI6	0,72	4,45
58	Hs.148907	SLC5A12	0,70	4,49
59	Hs.160556	ACACA	0,67	1,78
26	Hs.155983	JMJD2A	0,63	2,71
44	Hs.590575	GRM3	0,62	3,65

Tabelle 3

Validierung der frühen Gensignaturen der Hypoxie: statistische Unterschiede zwischen Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurden durch berechnete mittlere p-Werte aus log-Rangtests bei 5 und 10 Jahren beurteilt. Für jede Signatur werden Art, Korrelationskoeffizient (nicht auf die Studie von Chi anwendbar), die Anzahl der Reporter und die Anzahl der einzelnen UniGene-Cluster-IDs angegeben.

Sauerstoff-Konzentration (%)	Hypoxietyp	Korr. koeff.	Anzahl der Reporter	Anzahl der einzelnen Unigene	p-Wert
0	früh	0,6	80	79	0,004
0	spät	0,6	241	210	0,118
0	spät	0,88	74	70	0,110
2	früh	0,6	36	36	0,034
2	spät	0,6	169	147	0,919
2	spät	0,86	34	32	0,842
0, 2	Chi et al.	n. a.	253	171	0,300
0, 2	früh	0,6	15	15	0,005
0, 2	spät	0,6	93	93	0,240

Tabelle 4

Gen-Ontologie der frühen Signaturen, erhalten durch Ingenuity. Für jeden Fall werden die wichtigsten beiden Funktionen gezeigt, die den höchsten Score-Werten entsprechen, sowie die Gene, die zu dem Score-Wert beitragen. Es werden auch die wichtigsten Funktionen der frühen Gene, die zwischen 0% und 2% überlappen, angegeben.

Sauerstoffkonz.	Wichtigste Funktionen	Score-Wert	Fokus-Gene	Gensymbole
0%	Zellwachstum und Zellproliferation, Zellentwicklung, Bindegewebsentwicklung und -funktion	27	14	AIF1, ATF3, BACH1, CCL26, COL6A3, GATAD2B, GRK6, IL22RA2, PARG, PCSK1, PEX14, PIK3R4, TERT,TP53I11
0%	Zellfunktion und Zellerhaltung, Krebs, Zellzyklus	25	13	ACACA, ACOX1, ACSS1, AMH, CCNH, CCT2, GRM3, HMMR, IFI6, IGF1R, LY86, PTPLAD1, TLE3
2%	Zellfunktion und Zellerhaltung, Krebs, Zellzyklus	27	12	ACACA, AMH, BACH1, CDR2, HTATIP, IFI6, ING1, ITGB4, PEX14, SCD, SGK, SPAG5
2%	Zellbewegung, Bindegewebsentwicklung und -funktion, Krebs	9	5	CCT2, GRM3, HMMR, ICMT, MUC1
0% und 2%	Krebs, Tumormorphologie, Aminosäuremetabolismus	11	5	ACACA, AMH, BACH1, CCT2, IFI6

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Wie ein Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennen wird, ist die vorstehende Beschreibung als Erläuterung der Umsetzung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung gedacht. Die vorliegende Beschreibung soll den Umfang oder die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht beschränken, wobei die Erfindung modifiziert, variiert und geändert werden kann, ohne vom Geist der Erfindung, wie er in den nachstehenden Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Vorhersagen des Patientenansprechens auf Krebsbehandlung unter Verwendung von Hypoxie-Gensignaturen bereit. Diese Verfahren können das Messen der Genexpressionsniveaus einer Gruppe von hier aufgeführten Genen in einer biologischen Probe von einem Patienten umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Mikroarrays bereit, die die Expression von einer Gruppe von Genen nachweisen können.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zum Vorhersagen des Patientenansprechens auf eine Krebsbehandlung, umfassend: Messen der Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C, in einer biologischen Probe von einem Patienten: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575; und Erzeugen eines Score-Werts der Signatur aus den Genexpressionsniveaus; und Korrelieren des Score-Werts der Signatur mit einem vorhergesagten Ansprechen auf die Krebsbehandlung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Genexpressionsniveaus durch Bestimmen der Expressionsniveaus einer Gruppe von Polynucleotidsequenzen gemessen werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: d. den Sequenzen SEQ ID NOS: 1–80; e. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 81, 82, 2, 83, 84, 43, 33, 85, 36, 86, 12, 24, 68, 74, 87, 32, 88, 46, 89, 90, 91, 58, 92, 59, 93, 94, 95, 26, 44, 96, 97, 98, 99, 100 und 101; und f. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 2, 43, 33, 36, 12, 24, 68, 74, 32, 46, 58, 59, 26 und 44.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs Brustkrebs, Nierenkrebs oder Lungenkrebs ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Messung an RNA aus der biologischen Probe durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die biologische Probe von einem Tumor, einem kanzerösen Gewebe, einem präkanzerösen Gewebe, einem Biopsat, einem Gewebe, einem Lymphknoten, einem chirurgischen Exzidat, Blut, Serum, Urin, einem Organ oder Speichel stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Krebsbehandlung Strahlentherapie, fraktionierte Strahlentherapie, Chemotherapie oder Radiochemotherapie umfasst.
Mikroarray, umfassend: ein festes Substrat und eine Vielzahl von Nucleinsäuresonden, die die Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen nachweisen können, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B, C, D, E, F, G, H, I, J und K: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; und c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575.
Mikroarray gemäß Anspruch 7, wobei die Vielzahl von Nucleinsäuresonden die Expression einer Gruppe von Sequenzen nachweisen können, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: d. den Sequenzen SEQ ID NOS: 1–80; e. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 81, 82, 2, 83, 84, 43, 33, 85, 36, 86, 12, 24, 68, 74, 87, 32, 88, 46, 89, 90, 91, 58, 92, 59, 93, 94, 95, 26, 44, 96, 97, 98, 99, 100 und 101; und f. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 2, 43, 33, 36, 12, 24, 68, 74, 32, 46, 58, 59, 26 und 44.
Mikroarray gemäß Anspruch 8, wobei die Vielzahl von Sonden DNA-Sequenzen umfasst.
Mikroarray gemäß Anspruch 9, wobei die Vielzahl von Sonden unter den Hybridisierungsbedingungen von 6X SSC bei 65°C an die Sequenzen von wenigstens einem von den Gruppen l–v gemäß Anspruch 5 hybridisieren kann.
Mikroarray gemäß Anspruch 10, wobei die Vielzahl von Sonden von etwa 15 bis etwa 50 Basenpaare DNA umfasst.
Kit, umfassend das Mikroarray gemäß Anspruch 8 und Bedienungsanleitungen dafür.
Verfahren zum Behandeln von Krebs, umfassend: Messen der Genexpressionsniveaus einer Vielzahl von Genen, ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus den nachstehend definierten Gruppen A, B und C, in einer biologischen Probe von einem Patienten: a. Gruppe A: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.592692, Hs.633514, Hs.127126, Hs.334587, Hs.648626, Hs.646346, Hs.584803, Hs.567495, Hs.651126, Hs.478746, Hs.72550, Hs.154276, Hs.233568, Hs.106861, Hs.414418, Hs.593565, Hs.235116, Hs.554791, Hs.226780, Hs.525549, Hs.536158, Hs.438489, Hs.643279, Hs.189772, Hs.78977, Hs.155983, Hs.612872, Hs.435933, Hs.489603, Hs.128959, Hs.335205, Hs.146406, Hs.596783, Hs.512973, Hs.461030, Hs.149983, Hs.464137, Hs.292524, Hs.283749, Hs.287362, Hs.492203, Hs.250693, Hs.593232, Hs.590575, Hs.428214, Hs.523847, Hs.533712, Hs.44067, Hs.647072, Hs.606472, Hs.149032, Hs.436705, Hs.631539, Hs.529353, Hs.592020, Hs.642938, Hs.631930, Hs.148907, Hs.160556, Hs.126891, Hs.124011, Hs.524828, Hs.4779, Hs.612872, Hs.233240, Hs.445030, Hs.460, Hs.112432, Hs.544738, Hs.530941, Hs.180903, Hs.76364, Hs.43627, Hs.643599, Hs.125038, Hs.131342, Hs.512767, Hs.631974, Hs.112873 und Hs.6217; b. Gruppe B: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.528299, Hs.510078, Hs.633514, Hs.602706, Hs.642877, Hs.593232, Hs.596783, Hs.441113, Hs.149983, Hs.94542, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.126774, Hs.146406, Hs.463838, Hs.523847, Hs.46700, Hs.55131, Hs.558396, Hs.148907, Hs.643920, Hs.160556, Hs.562083, Hs.515383, Hs.513430, Hs.155983, Hs.590575, Hs.632226, Hs.165607, Hs.514033, Hs.632447, Hs.89603 und Hs.434961; c. Gruppe C: Gene, die Transkripten entsprechen, die mit folgenden Unigene-ID-Nrn. verbunden sind: Hs.72550, Hs.633514, Hs.593232, Hs.596783, Hs.149983, Hs.154276, Hs.189772, Hs.112432, Hs.643599, Hs.146406, Hs.523847, Hs.148907, Hs.160556, Hs.155983 und Hs.590575; und Verabreichen einer wirksamen Menge von einem oder mehreren Mitteln zur Krebsbehandlung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus chemotherapeutischen Krebsmitteln und Strahlung, oder Durchführen eines chirurgischen Eingriffs an dem Patienten; oder eine Kombination davon.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Genexpressionsniveaus durch Bestimmen der Expressionsniveaus einer Gruppe von Polynucleotidsequenzen gemessen werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: d. den Sequenzen SEQ ID NOS: 1–80; e. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 81, 82, 2, 83, 84, 43, 33, 85, 36, 86, 12, 24, 68, 74, 87, 32, 88, 46, 89, 90, 91, 58, 92, 59, 93, 94, 95, 26, 44, 96, 97, 98, 99, 100 und 101; und f. den Sequenzen SEQ ID NOS: 11, 2, 43, 33, 36, 12, 24, 68, 74, 32, 46, 58, 59, 26 und 44.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zu Krebsbehandlung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Paclitaxel, Docetaxel, Imatinibmesylat, Sunitinibmalat, Cisplatin, Etoposid, Vinblastin, Methotrexat, Adriamycin, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Daunomycin, 5-Fluoruracil, Vincristin, Endostatin, Angiostatin, Bevacizumab und Rituximab.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das eine oder die mehreren Mittel zu Krebsbehandlung Strahlung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der Krebs Brustkrebs, Nierenkrebs oder Lungenkrebs ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, umfassend das Durchführen eines chirurgischen Eingriffs an dem Patienten.