DE60219652T2

DE60219652T2 - Chromogene in-situ-hybridisierungsverfahren, kits und zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60219652T2
Application number: DE60219652T
Authority: DE
Inventors: Zuo-Rong Redwood City SHI; Rina San Francisco WU
Original assignee: Zymed Laboratories Inc
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2001-09-14
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2022-09-14
Also published as: US20060035246A1; US20090137412A1; AU2002326899B2; WO2003025127A3; US20030017491A1; EP1434877B1; CA2460456A1; EP1434877A2; EP1434877A4; JP2005503158A; US20090233803A1; WO2003025127A2; ATE360099T1; DE60219652D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine chromogene (kolorimetrische) in situ Hybridisierung (CISH, chromogenic in situ-hybridization) und für die mit dieser in situ-Hybridisierung verwendbaren Nukleinsäuresonden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für das Durchführen von Hellfeld-Krebsdiagnostik unter Verwendung von chromogener in situ-Hybridisierung (z. B. für das Detektieren von Genamplifikationen, Gentranslokationen, Deletion und chromosomaler Aneuploidie) bereit. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung CISH-Verfahren für das Detektieren des Gen-Status von HER2(erbB-2) bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Charakterisierung von Chromosomaberrationen wurde bei einer Vielzahl von Tumoren untersucht. Spezifische Onkogen- und Tumorsupressorgen-Ziele, die von diesen Chromosomen-Abweichungen betroffen sind, wurden in vielen Tumoren charakterisiert. Ein derartiges Ziel ist das HER2-Gen. HER2-Genamplifikation oder HER2-Proteinüberexpression wurden in 10-34% der invasiven Brustkrebsfälle laut einer Serie von 52 veröffentlichten und unter Verwendung verschiedener Methoden durchgeführten Studien mit mehr als 16.000 Patienten (Siehe Ross et al., Am. J. Clin. Pathol., 1999; 112:S53-67, hierin durch Bezugnahme inkorporiert)..
Identifizierung des HER2-Status ist wichtig für das Feststellen der Prognose von Patienten mit invasivem Brustkrebs, sowie für das Auswählen einer Untergruppe mit metastatischer HER2-Überexpression für eine Therapie mit Trastuzumab (HERCEPTIN^®), einem humanisierten, monoklonalen anti-HER2-Antikörper (Siehe Shak et al., Cancer Res. 199; 6:71-7; und Cobleigh et al., J. Clin. Oncol., 1999; 17:2639-48).
Es wurde gezeigt, dass HERCEPTIN^® nur bei Patienten wirksam ist, deren Tumore eine HER2-Genamplifikation und/oder eine Überexpression des HER-Proteins aufweisen. Somit werden genaue, zuverlässige und unkomplizierte Verfahren für die Auswertung des HER2-Status zunehmend wichtiger.
Immunhistochemisches Färben (IHC, immunohistochemical staining) war das für das Bestimmen des HER2-Status in Proben von Brustkrebs am meisten angewendete Verfahren. Es ist mit schneller Ergebnisfindung unter relativ geringen Kosten relativ einfach durchzuführen (Siehe Ross et al. oben, und Hanna et al., Mod. Pathol., 1999, 12:827-34, hierin durch Bezugnahme inkorporiert). Jedoch haben viele handelsübliche Antikörper eine große Bandbreite bezüglich ihrer Sensitivität und Spezifität für FFPE-Gewebeproben gezeigt (FFPE: formalen fixed paraffin embedded, mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet), und die Wirkung der Gewebefixierung und der Vorbehandlung haben einen wesentlichen Einfluss auf die HER2-IHC-Färbung (Siehe Ross et al. oben; Jacobs et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17:1974-1987; Espinoza et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17:2293B; und Penault-LIorca et al., J. Pathol. 1994, 173:65-75). Außerdem sind das Fehlen eines allgemeingültigen Bewertungssystems und Interbeobachter-Unterschiede in der Interpretation von HER2-IHC-Ergebnissen ebenfalls eine Quelle für unerwünschte Abweichungen.
Überexpression des HER2-Proteins resultiert im Allgemeinen (> 95%) aus der HER2-Genamplifikation (Siehe Slamon et al., Science 1989; 244:707-12, hierin durch Bezugnahme inkorporiert). Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) scheint für viele die Technik mit der höchsten Sensitivität für die quantitative Auswertung des HER2-Gen-Status bei Brustkrebszellen zu sein, und man glaubt auch, dass es eine sinnvolle Alternative zu IHC in FFPE-Gewebeschnitten darstellt (Siehe Pauletti et al., J. Clin. Oncology, 2000, 18:3651-64). Patienten, die laut FISH positiv, nach IHC jedoch negativ getestet wurden, hatten eine schlechtere Überlebensrate als diejenigen mit einer HER2-Überexpression und ohne Genamplifikation (Siehe Pauletti et al. oben).
Somit könnte für Brustkrebspatienten mit einer HER2-Amplifikation eine zutreffendere Prognose abgegeben werden als für solche mit HER2-Überexpression. Zusätzlich quantifiziert FISH die Anzahl der Genkopien in der Krebszelle, was objektiv den HER2-Gen-Status von Tumoren wiedergibt, während IHC ein in höherem Maße subjektiver Test ist. Somit kann FISH leichter interpretiert werden als IHC.
Jedoch weist auch das FISH-Verfahren viele Nachteile auf.
Die Auswertung von FISH erfordert ein modernes und teures Fluoreszenz-Mikroskop, das mit 60X- oder 100X-Ölimmersionsobjektiven von hoher Qualität und Multibandpass-Fluorereszenzfiltern ausgestattet sein muss, wie es in den meisten herkömmlichen Diagnostiklaboren nicht verwendet wird. Die Fluoreszenzsignale können innerhalb einiger Wochen verblassen und die Hybridisierungsergebnisse werden üblicherweise mit einer teuren CCD-Kamera aufgezeichnet. Somit sind die Analyse und das Aufzeichnen von FISH-Daten teuer und zeitaufwendig. Insbesondere ist die Morphologie der Gewebeschnitte bei FISH mit FFPE nicht optimal, was ein besonderes Problem für das Unterscheiden zwischen invasivem Brustkrebs und Brustkarzinom in situ darstellt, wo HER2-Genamplifikation oder Protein-Überexpression eine unterschiedliche klinische Bedeutung haben können. Sämtliche dieser Einschränkungen bewirken, dass FFPE-FISH bei routinemäßigen Tests eher umständlich ist (Siehe Jacobs et al. oben und Tanner et al., Am. J. Pathol. 2000, 157:1467-72).
Aus diesem Grund werden Verfahren benötigt, die mit hoher Genauigkeit den Status des Krebsmarker-Gens, wie etwa den HER2-Gen-Status, identifizieren für die teure Fluoreszenz-Detektionsausrüstung nicht benötigt wird, die es ermöglichen, dass die Zellmorphologie und das ISH-Signal gleichzeitig angezeigt werden, und die genaue Ergebnisse unter Verwendung von Standard-Gerätschaften, wie etwa Hellfeld-Mikroskopen, liefern.
Verfahren für das Bestimmen des HER-2/neu-Onkogen-Status bei Brustkrebspatienten unter Verwendung von chromogener in situ-Hybridisierung werden in Tanner et al, 2000 (American Journal of Pathology, Bd. 57(5): 1467-1472) und in Kumamoto et al, 2001 (Pathology International, 51:579-584) offenbart, wodurch das Auswählen von Patienten, die für eine Therapie mit Trastuzumab (HERCEPTION^®) geeignet sind, ermöglicht wird. Ein Verfahren für die Fluoreszenz-Hybridisierung für zwei Ziele gleichzeitig (HER-2/neu und Topo-II-alpha), wird in Tanner et al., 2001, beschrieben (Cancer Research 61:5345-5348). Ein Vergleich der Wirksamkeit von CISH und der von FISH bei der Bestimmung des HER2-Status bei menschlichem Brustkrebs wird in Zhao et al, 2002 (Mod. Pathol. 15(6):657-665) beschrieben. WO 0026415 offenbart Verfahren für das Herstellen einer genomischen Subtraktionsbibliothek. WO 01/29265 offenbart Verfahren für Detektieren von einzelnen Genkopien in situ.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine chromogene (kolorimetrische) in situ-Hybridisierung (CISH) und auf für die in situ-Hybridisierung nützliche Nukleinsäuresonden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für das Durchführen von Hellfeld-Krebsdiagnose unter Verwendung von chromogener in situ-Hybridisierung (z. B. für das Detektieren von Genamplifikationen, Gentranslokationen und chromosomalen Polysomien) bereit. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung CISH-Verfahren für das Detektieren des HER2-Gen-Status bereit.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für das Durchführen von chromogener in situ-Hybridisierung bereit, die folgendes umfassen: a) Vorerwärmen einer biologischen Probe (z. B. Tumorbiopsie) in einem Vorbehandlungspuffer bei einer Temperatur von wenigstens 96 Grad Celsius; b) Aussetzen der biologischen Probe an eine Enzymverdaulösung; c) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Subtraktions-Sondenbibliothek unter Bedingungen, sie bewirken, dass Subtraktions-Sondenbibliothek mit einem Zielbereich in der biologischen Probe hybridisiert, d) Hinzugeben eines mit einem Enzym verbundenen Detektionsmoleküls zu der biologischen Probe unter Bedingungen, die bewirken, dass das Detektionsmolekül mit folgendem bindet: i) der markierten Subtraktions-Sondenbibliothek, oder ii) einem mit der Subtraktions-Sondenbibliothek verbundenen Zwischenmolekül; und e) das Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats zu der biologischen Probe. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner den Schritt f) Detektieren des Vorliegens oder des Nicht-Vorliegens des Zielbereichs in der biologischen Probe. In zusätzlichen Ausführungsformen umfasst das Detektieren das Visualisieren des kolorimetrischen Substrats mit einem Mikroskop (z. B. Hellfeld-Mikroskop).
In einigen Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek derart konfiguriert, dass sie eine HER2-Genamplifikation detektiert. In besonderen Ausführungsformen umfasst der Zielbereich das HER2-Gen. In einigen Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek derart konfiguriert, dass sie eine TopoIIα-Genamplifikation detektiert. In besonderen Ausführungsformen umfasst der Zielbereich das TopoIIα-Gen (z. B. und schließt nicht die HER2-Gensequenz ein). In einigen Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek derart konfiguriert, dass sie eine EGFR-Genamplifikation (EGFR, epidermal growth factor receptor, Rezeptor für Epidermalen Wachstumsfaktor) detektiert. In besonderen Ausführungsformen umfasst der Zielbereich das EGFR-Gen. In einigen Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek derart konfiguriert, dass sie eine N-MYC-Genamplifikation detektiert. In zusätzlichen Ausführungsformen umfasst der Zielbereich das N-MYC-Gen.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Subtraktions-Sondenbibliothek eine Sondenpaarbibliothek.
In weiteren Ausführungsformen umfasst das Sondenpaar ein getrenntes Sondenpaar. In besonderen Ausführungsformen umfasst die Sondenpaarbibliothek folgendes: i) eine erste Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem ersten Bereich auf Chromosom neun hybridisiert, das zentromerisch in Bezug auf das ABL-Gen ist, und ii) eine zweite Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem zweiten Bereich auf Chromosom neun hybridisiert, der telomerisch in Bezug auf das ABL-Gen ist. In weiteren Ausführungsformen umfasst die Sondenpaarbibliothek folgendes: i) eine erste Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem ersten Bereich auf Chromosom achtzehn hybridisiert, der zentromerisch zum SYT-Gen ist, und ii) eine zweite Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem zweiten Bereich auf Chromosom achtzehn hybridisiert, der telomerisch zum SYT-Gen ist.
In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Vorerwärmungstemperatur wenigstens 98 Grad Celsius (98,99 oder 100 Grad Celsius). In weiteren Ausführungsformen liegt die Vorerwärmungstemperatur zwischen 96 bis 100 Grad Celsius (z. B. 98-100 Grad Celsius). In einigen Ausführungsformen wird das Vorerwärmen mit einem Dampfdrucktopf (pressure cooker), einer Heizplatte oder einem Mikrowellenofen durchgeführt. In weiteren Ausführungsformen befindet sich die biologische Probe während des Schritts des Vorerwärmens in einem geschlossenen Behälter.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Enzymverdaulösung Pepsin (z. B. eine Lösung mit ungefähr 0,0625% Pepsin bei einem pH-Wert von 2,3). In weiteren Ausführungsformen umfasst der Vorbehandlungspuffer TRIS-EDTA (z. B. 0,1 M Tris/0,05 EDTA, pH 7,0). In weiteren Ausführungsformen ist der Vorbehandlungpuffer TRIS.
In bestimmten Ausführungsformen ist das Detektionsmolekül Avidin, Streptavidin oder Biotin. In einigen Ausführungsformen ist das Detektionsmolekül ein Antikörper. In bestimmten Ausführungsformen ist das Detektionsmolekül über ein Polymer mit einer Vielzahl von Enzymen verbunden. In zusätzlichen Ausführungsformen ist das Zwischenprodukt-Molekül ein primärer Antikörper und das Detektionsmolekül ein sekundärer Antikörper, der an den primären Antikörper bindet.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Enzym eine Peroxidase (z. B. eine Meerrettich-Peroxidase). In weiteren Ausführungsformen ist das Enzym HRP oder AP. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner das Durchführen von immunhistomchemischen Verfahren an der biologischen Probe mit Antikörpern, die für von dem Zielbereich exprimierte Proteine spezifisch sind. In einigen Ausführungsformen umfasst die Subtraktions-Sondenbibliothek Digoxigenin, FITC, Avidin, Streptavidin oder Biotin. In zusätzlichen Ausführungsformen umfasst das kolorimetrische Substrat Diaminobenzidin oder FASTRED.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Subtraktions-Sondenbibliothek eine heterogene Mischung von markierten Nukleinsäuresonden mit einer Länge von ungefähr 0,1 kb bis 8 kb (z. B. ungefähr einer Länge von 0,5 bis 4 kb). In einigen Ausführungsformen umfasst der Zielbereich eine Länge von ungefähr 50 kb bis ungefähr 500 kb oder 1,5 bis 5,0 Megabasen. In weiteren Ausführungsformen ist der Zielbereich mit Aberrationen des humanen Krebsgens assoziiert. In bestimmten Ausführungsformen ist die biologische Probe eine Tumorprobe (z. B. eine Gewebeprobe aus einer Brustkrebsbiopsie). In einigen Ausführungsformen wird die biologische Probe auf einer Oberfläche (z. B. einem Objektträger eines Mikroskops) befestigt.
In einigen Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek ungefähr zu 90 Prozent frei von repetitiven Sequenzen. In weiteren Ausführungsformen ist die Subtraktions-Sondenbibliothek ungefähr zu 95 Prozent frei von repetitiven Sequenzen. In bestimmten Ausführungsformen ist die biologische Probe eine in Paraffin eingebettete Gewebeprobe (z.B. eine mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeprobe).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für das Stellen einer Diagnose sowie für das Behandeln eines Subjekts bereit, die folgendes umfassen: a) Vorerwärmen einer biologischen Probe von einem Subjekt in einem Vorbehandlungspuffer bei einer Temperatur von wenigstens 96 °C, b) Aussetzen der biologischen Probe an eine Enzymverdaulösung; c) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Subtraktions-Sondenbibliothek unter Bedingungen, sie bewirken, dass die Subtraktions-Sondenband mit einem Zielbereich in der biologischen Probe hybridisiert, wobei der Zielbereich die HER2-Gensequenz umfasst, d) Hinzugeben eines mit einem Enzym verbundenen Detektionsmoleküls zu der biologischen Probe unter Bedingungen, die bewirken, dass das Detektionsmolekül an folgendes bindet: i) an die markierte Subtraktions-Sondenbibliothek, oder ii) ein Molekül eines Zwischenprodukts, das mit der Subtraktions-Sondenbibliothek verbunden ist, e) Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats zu der biologischen Probe, f) Detektieren des Zielbereichs durch Visualisieren des kolorimetrischen Substrats mit einem Hellfeldmikroskop, wodurch bestimmt wird, dass die biologische Probe eine Amplifikation der HER2-Gensequenz aufweist und g) Identifizieren des Subjekts als geeignet für eine Behandlung mit anti-HER2-Antikörpern. In besonderen Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner Schritt h) Verabreichen der anti-HER2-Antikörper (z. B. HERCEPTIN^® kann dem Subjekt verabreicht werden).
In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das mögliche Subjekt ein Mensch. In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das mögliche Subjekt ein nicht-menschliches Lebewesen. In einigen Ausführungsformen ist das Lebewesen ein Säugetier (z. B. Mensch, Katze, Hund, Schwein oder Kuh). In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen hat das mögliche Subjekt Brustkrebszellen (z. B. wurde es vorher als Brustkrebszellen aufweisend diagnostiziert). In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Brustkrebszellen metastatisch.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt das 3'-Ende der exemplarischen TopoIIα-Sonde (SEQ ID NO: 9) und das 5'-Ende der exemplarischen TopoIIα-Sonde (SEQ ID NO: 10).
2 zeigt ein Diagramm, das geeignet für das Interpretieren der ISH-Ergebnisse bei Verwendung der Sonden von TopoIIα und Chromosom 17 ist.
3 zeigt die in Beispiel 6 verwendeten BAC-Klone, die das ABC-Gen flankieren.
4 zeigt ABL-Tanslokationen, beteiligte Partnergene und Leukämien mit ABL-Translokationen.
5A zeigt ein schematisches Diagramm von ABL-DNA, und 5B zeigt verschiedene Bruchstellen in dem ABC-Gen.
6 zeigt BCR-ABL-Translokationen.
7 zeigt ein vereinfachtes Schema der BCR- und ABL-Gene und zeigt die Bruchstellen darauf an, zusammen mit exemplarischen BCR/ABL-Transkripten und Proteinen, die von einzelnen Brüchen entlang der BCR- und ABL-Gene stammen.
8 zeigt klinikopathologische Korrelationen der häufigsten BCR-ABL-Fusionen.
9 zeigt den UCSC-Genom-Browser für das ABL-Gen.
10 zeigt eine schematische Illustration der Detektion der ABL-Translokation durch zweifarbige in situ-Hybridisierung (z. B. CISH oder FISH). Schwarze Punkte stellen ABL.c dar und weiße Punkte stellen ABL.t dar. Partielle Karyotypen und die entsprechenden Interphase-Zellkerne werden in der Figur gezeigt. Normale Zellen ohne ABL-Translokationen zeigen schwarze und weiße Punkte nebeneinander, während Zellen mit ABL-Translokation ein getrenntes Paar von schwarzen und weißen Punkten zeigen. Zellen mit ABL-Translokation und Deletion von chromosomalem Material, das zentromerisch in Bezug auf die Bruchstelle des ABL-Gens liegt, zeigen ein Paar von schwarzen und weißen Punkten nebeneinander, und der schwarze Punkt bei einem weiteren Paar ist verschwunden (gelöscht).
DEFINITIONEN
Zur Vereinfachung des Verständnisses der vorliegenden Erfindung werden eine Reihe von Begriffen und Ausdrücken untenstehend definiert:
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „mögliches Subjekt", „Subjekt" oder „Patient" auf ein Tier wie etwa einen Hund, eine Katze, einen Vogel, Vieh und bevorzugt auf einen Menschen. In einigen Ausführungsformen wird vermutet, dass das Subjekt Krebs hat, der auf die Eignung für eine Behandlung mit Topoisomerase-I-Inhibitor oder anti-HER2-Immuntherapie hin untersucht wird. Beispiele für Subjekte und mögliche Subjekte schließen folgende ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Frauen mit Verdacht auf Brustkrebs und Männer mit Verdacht auf Brustkrebs.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Kopienanzahl", wie er in Bezug auf spezifische Nukleinsäuresequenzen verwendet wird (z. B. HER-2/neu, TopoIIα und Kontrolle) auf die genau Anzahl dieser Sequenzen pro einzelne Zelle. Die Kopienanzahl kann für eine einzelne Zelle festgestellt werden oder als die durchschnittliche Anzahl in einer Gruppe von Zellen festgestellt werden (z. B. Gewebeprobe). Beim Vergleich der „Kopienanzahl" von Zellen (z. B. experimentelle und Kontrollzellen) ist es nicht notwendig, die genaue Anzahl der Kopien der Zelle zu bestimmen, sondern eine Annäherung reicht aus, die es ermöglicht, dass bestimmt wird ob eine gegebene Zelle im Vergleich mit einer anderen Zelle weniger oder mehr die Nukleinsäuresequenz enthält. Somit kann jedes Verfahren, das geeignet ist, zuverlässig direkt oder indirekt die Menge der Nukleinsäure zu bestimmen als ein Maß für die Anzahl der Kopien verwendet werden, auch wenn die eigentliche Kopienzahl dabei nicht bestimmt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "HER-2/neu" auf eine Nukleinsäuresequenz, die für das HER2-Protein codiert und schließt sowohl die Wildtypsequenz als auch natürlich vorkommende Variationen, Trunkierungen und Mutationen ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "TopoIIα" auf eine Nukleinsäuresequenz, die für das TopoIIα-Protein codiert oder Abschnitte davon und schließt sowohl die Wildtypsequenz als auch natürlich vorkommende Variationen, Abbrüche und Mutationen ein.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „geeignet für die Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren", wenn er unter Bezugnahme auf ein mögliches Subjekt verwendet wird, auf Subjekte, die wahrscheinlicher von einer Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren profitieren als ein willkürlich aus der Bevölkerung ausgewähltes Subjekt. Zum Beispiel sprachen 79% der ausgewählten Subjekte bei einer Verwendung der Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in Bespiel 6 beschrieben auf die Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitor an (im Vergleich zu 10% oder weniger, wenn die Subjekte willkürlich aus der Bevölkerung ausgewählt worden waren, oder im Vergleich zu ungefähr 30-40% der Patienten mit metastatischem Brustkrebs.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Amplifikation" in Bezug auf die Kopienzahl auf einen Fall, wo die Anzahl der Kopien einer Nukleinsäuresequenz (z. B. HER2/neu) höher ist als die Kopienanzahl einer Kontrollsequenz (z. B. Chromosom 17). Anders erklärt zeigt die Amplifikation an, dass das Verhältnis einer speziellen Nukleinsäuresequenz (z. B. HER-2/neu) im Vergleich mit einer Kontrollsequenz (z. B. 1,1:1, 1,2:1, oder 1,3:1) über 1:1 liegt. In bevorzugten Ausführungsformen liegt das Verhältnis einer speziellen Nukleinsäuresequenz wenigstens 1,5 mal höher als bei der Kontrollsequenz (d.h., 1,5:1).
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe „Nukleinsäuremolekül" und Nukleinsäuresequenz" auf jedes beliebige Molekül, das eine Nukleinsäure, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, DNA oder RNA enthält. Der Begriff umfasst Sequenzen, die jede beliebige bekannten Basenanaloga von DNA und RNA einschließen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die folgenden: 4-Acetylcytosin, 8-Hydroxy-N6-Methyladenosin, Aziridinylcytosin, Pseudoisocytosin, 5- (Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarbonylmethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin, Uracil-5-Oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Oxybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, N-Uracil-5-Oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oOxyessigsäure, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, und 2,6-Diaminopurin.
Wie hierin verwendet wird der Begriff „Hybridisierung" im Zusammenhang mit der Paarung komplementärer Nukleinsäuren verwendet. Hybridisierung und die Stärke der Hybridisierung (d. h., die Stärke der Assoziation zwischen den Nukleinsäuren) wird durch Faktoren wie den Komplementaritätsgrad der Nukleinsäuren, die Stringenz der Bedingungen, die T_m des gebildeten Hybrids und das Verhältnis G:C innerhalb der Nukleinsäuren beeinflusst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Sonde" auf ein Oligonukleotid (d.h., eine Sequenz von Nukleotiden) oder eine Nukleotidfragmentbibliothek, die entweder natürlich vorliegt wie bei einem gereinigten Restriktionsverdau oder die synthetisch, rekombinant oder durch Amplifikation (z. B. PCR) hergestellt wird, das/die geeignet ist, mit einem Oligonukleotid von Interesse zu hybridisieren. Sonden, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sonden sind geeignet für die Detektion, die Identifikation und die Isolierung von bestimmten Gensequenzen (z. B. HER-2/neu, TopoIIα, und Chromosom 17). Es wird vorgeschlagen, dass jede in der vorliegenden Erfindung verwendete Sonde mit jedem beliebigen „Reportermolekül" markiert werden kann, so dass sie in jedem Detektionssystem detektiert werden kann, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Enzym-Systeme (z. B. ELISA; sowie enzymbasierte immunhistochemische Assays), Fluoreszenz-Systeme (z. B. FISH), radioaktive Massenspektroskopie-Systeme und Lumineszenz-Systeme. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung auf ein bestimmtes Detektionssystem oder einen bestimmten Marker beschränkt ist.
Wie hierin verwendet kann sich der Begriff „Marker" auf jedes beliebige detektierbare Molekül beziehen. Marker schließen zum Beispiel ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, ³⁵S, Biotin, Digoxigenin, Avidin, Fluoreszenz- oder Enzymmoleküle.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „repetitive Nukleinsäuresequenzen" auf eine Nukleinsäuresequenz innerhalb eines Genoms, das eine Reihe von Nukleotiden umfasst, die viele Male wiederholt werden, oftmals in Tandem-Arrays. Die repetitiven Sequenzen können in dem Genom in Mehrfachkopien im Bereich von zwei Kopien bis Hunderttausenden von Kopien auftreten und können auf einem oder mehr Chromosomen innerhalb eines Genoms in Clustern auftreten oder verteilt sein. Obwohl repetitive Nukleinsäuresequenzen in dem gesamten Genom vorliegen können, ist dennoch eine große Anzahl der repetitiven Nukleinsäuresequenzen typischerweise am Zentromer jedes Chromosoms gelagert. Beispiele für repetitive Nukleinsäuresequenzen schließen ALU und LINE-Elemente ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe „in situ-Hybridisierung" und „ISH" auf Verfahren für das Detektieren und Lokalisieren von Nukleinsäuren innerhalb eines Zell- oder Gewebepräparats. Diese Verfahren stellen sowohl quantitative als auch räumliche Information bezüglich der Nukleinsäuresequenzen innerhalb einer einzelnen Zelle oder eines Chromosoms bereit. ISH wurde in vielen Bereichen standardmäßig eingesetzt, einschließlich der pränatalen Diagnostik von genetischen Krankheiten, der molekularen Zytogenetik, für das Detektieren von Expression und Überexpression von Genen, für das Identifizieren von Orten der Genexpression, für das Erstellen von Genkarten, für das Lokalisieren von Zielgenen und für das Identifizieren von verschiedenen Virus- und Mikrobeninfektionen, für die Tumordiagnostik, für die in vitro Fertilisationsanalyse, für die Analyse von Knochenmarkstransplantationen und für die Chromosomenanalyse. Die Technik beinhaltet im Allgemeinen die Verwendung von markierten Nukleinsonden, die mit einem Chromosom oder mRNA in Zellen, die auf einer Oberfläche angebracht sind (z. B. Objektträger oder anderen Materialien), hybridisieren. Die Sonden können mit Fluoreszenzmolekülen oder weiteren Markern markiert werden. Ein Beispiel für Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) wird in Kuo et al. Am. J Hum. Genet., 49: 112-119, 1991 bereitgestellt. Weitere ISH und FISH-Detektionsverfahren werden im US-Pat. 5,750, 340 von Kim et al. bereitgestellt, hierbei durch Bezugnahme inkorporiert. Weitere Beispiele für Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung wie auch chromogene in-situ-Hybridisierung werden in den untenstehenden Beispielen 1-10 aufgeführt. Zusätzliche Protokolle sind Fachleuten gut bekannt.
Der Ausdruck „unter in situ-Hybridisierungsbedingungen" wie hierin verwendet bezieht sich auf jede beliebige Gruppe von Bedingungen, die für das Durchführen von in-situ-Hybridisierung (ISH) verwendet werden, durch welche die erfolgreiche Detektion von markierten Oligonukleotidsonden ermöglicht wird. Im Allgemeinen beinhalten die für die in situ-Hybridisierung angewendeten Bedingungen das Fixieren von Gewebe oder einer anderen biologischen Probe auf einer Oberfläche, eine Hybridisierungsvorbehandlung, um die Verfügbarkeit von Nukleinsäure-Zielsequenzen in der Probe zu erhöhen (und um nicht-spezifisches Binden zu verringern), Hybridisierung der markierten Nukleinsäuresonden an der Ziel-Nukleinsäure, Waschen nach der Hybridisierung, um ungebundene Sonden zu entfernen und die Detektion der hybridisierten Sonden. Jeder dieser Schritte ist im Stand der Technik gut bekannt und wurde bereits unter vielen verschiedenen experimentellen Bedingungen durchgeführt. Beispiele für derartige in situ-Hybridisierungsbedingungen werden wiederum in Kuo et al., U.S. Pat. 5,750,340, und den Beispielen 1-10 (unten) bereitgestellt. Weitere Beispiele für Bedingungen und Reagenzien, die für das Durchführen einer in situ-Hybridisierung nützlich sind, werden untenstehend bereitgestellt.
Das Gewebe oder die biologische Probe können unter Verwendung von Fixierungsmittel auf einer Oberfläche fixiert werden. Bevorzugte Fixierungsmittel verursachen eine Fixierung der zellulären Konstituenten über eine Fällungsreaktion, die reversibel ist, die eine zelluläre Morphologie mit der Nukleinsäure an dem geeigneten Ort in der Zelle aufrechterhält und die Nukleinsäurehybridisierung nicht stört. Beispiele für Fixierungsmittel schließen folgende ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Formaldehyd, Alkohole, Salzlösungen, Quecksilberchlorid, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumdichromat, Kaliumphosphat, Ammoniumbromid, Calciumchlorid, Natriumacetat, Lithiumchlorid, Cäsiumacetat, Calcium- oder Magnesiumacetat, Kaliumnitrat, Kaliumdichromat, Natriumchromat, Kaliumiodid, Natriumiodat, Natriumthiosulfat, Picrinsäure, Essigsäure, Natriumhydroxid, Aceton, Chloroformglycerin und Thymol.
Nach Fixieren auf einer Oberfläche werden Proteine und weiteres zelluläre Material, die eine unspezifische Hintergrundbindung (background binding) verursachen können, von den Proben entfernt. Mittel, die Proteine entfernen, schließen folgende ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Enzyme wie etwa Pronase und Proteinkinase K oder schwache Säuren wie etwa 0,02–0,2 HCl, sowie RNase (für das Entfernen von RNA).
DNA auf der Oberfläche kann dann denaturiert werden, so dass die Oligonukleotidsonden binden und ein Signal abgeben können. Eine Denaturierung kann zum Beispiel durchgeführt werden, indem der pH-Wert verändert wird, die Temperatur erhöht wird oder mit organischen Lösungsmitteln wie etwa Formamid. Die markierte Sonde kann dann unter normalen Hybridisierungsbedingungen mit der denaturierten DNA hybridisieren. Das Gewebe oder die biologische Probe können auf einer festen Oberfläche unter Verwendung von Standardtechniken wie etwa das Herstellen von Gewebeschnitten oder von Abstrichen oder die Zytozentrifugation von einzelnen Zellsuspensionen. Beispiele für feste Oberflächen schließen folgende ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Glas, Nitrozellulose, Klebeband, Nylon oder GENE SCREEN PLUS.
Der Ausdruck "Polymerase-Kettenreaktion" („PCR") wie hierin verwendet bezieht sich auf das in den US-Patenten Nr. 4,683,195; 4,683,202, and 4,965,188, beschriebene Verfahren, wobei ein Verfahren für das Erhöhen der Konzentration eines Segments einer Zielsequenz in einer Mischung einer genomischen DNA ohne Klonen oder Reinigung beschrieben wird. Das Verfahren für das Amplifizieren der Zielsequenz besteht darin, zwei Oligonukleotidprimer im Übermaß zu der die gewünschte Zielsequenz enthaltenden DNA-Mischung hinzuzufügen, gefolgt von einer genauen Abfolge von thermischen Zyklen in Anwesenheit einer DNA-Polymerase. Die beiden Primer sind komplementär zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Zielsequenz. Um die Amplifikation durchzuführen, wird die Mischung denaturiert und die Primer werden dann innerhalb des Zielmoleküls mit ihren komplementären Sequenzen hybridisiert. Nach dem Hybridisieren (annealing) werden die Primer mit einer Polymerase verlängert, so dass sich ein neues Paar von komplementären Strängen bildet. Die Schritte der Denaturierung, der Primer-Hybridisierung (primer annealing) und der Verlängerung durch Polymerase können viele Male wiederholt werden (d.h. Denaturierung, Annealing und Verlängerung stellen einen „Zyklus" dar, es kann eine Vielzahl von „Zyklen" geben), um eine hohe Konzentration eines amplifizierten Segments der gewünschten Zielsequenz zu erhalten. Die Länge der amplifizierten Segmente der gewünschten Zielsequenz wird bestimmt durch die relativen Positionen der Primer zueinander, und aus diesem Grund stellt diese Länge einen steuerbaren Parameter dar. Aufgrund des Wiederholungsaspekts des Prozesses wird das Verfahren als "Polymerase-Kettenreaktion" (im Folgenden „PCR", polymerase chain reaction) bezeichnet. Da die gewünschten amplifizierten Segmente der Zielsequenz die in der Mischung vorherrschend vorhandenen Sequenzen werden (in Bezug auf die Konzentration), werden sie als „PCR-amplifiziert" bezeichnet.
Mit PCR ist es möglich, eine einzelne Kopie einer spezifischen Zielsequenz in genomischer DNA auf ein Niveau zu amplifizieren, das durch mehrere verschiedene Verfahren detektierbar ist (z. B. Hybridisierung mit einer markierten Probe; Inkorporierung mit biotinylierten Primern gefolgt von Avidin-Enzym-Konjugat-Detektion, Inkorporierung von ³²P-markierten Desoxynukleotidtriphosphaten, wie etwa dCTP oder ATP in das amplifizierende Segment). Zusätzlich zu der genomischen DNA kann jede Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenz mit dem geeigneten Set von Primer-Molekülen amplifiziert werden. Insbesondere sind die in dem PCR-Prozess an sich erstellten amplifizierten Segmente wirksame Templates für nachfolgende PCR-Amplifikationen.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „PCR-Produkt", „PCR-Fragment" und „Amplifikationsprodukt" auf die resultierende Mischung von Verbindungen nachdem zwei oder mehr Zyklen der PCR-Schritte des Denaturierens, des Hybridisierens und der Extension abgeschlossen sind. Diese Begriffe umfassen den Fall, in dem eine Amplifikation von einem oder mehr Segmenten von einer oder mehr Zielsequenzen vorliegt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „anti-HER2 antikörperfreie Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitor" auf ein Behandlungsregimen für ein Subjekt, die das Verabreichen eines Topoisomerase-II-Inhibitors (z. B. Anthracycline), jedoch keine anti-HER2-Antikörper-Gabe in diesem Zeitraum, einschließt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Topoisomerase-II-Inhibitor-freie Behandlung mit anti-HER2-Antikörpern" auf ein Behandlungsregimen für ein Subjekt, die das Verabreichen von anti-HER2-Antikörpern (z. B. HERCEPTIN^®), jedoch keine Gabe von Topoisomerase-II-Inhibitoren (z. B. Anthracycline) in diesem Zeitraum einschließt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Subtraktions-Sondenbibliothek" auf eine Mischung von Nukleinsäurefragmenten, die derart konfiguriert sind, dass sie mit einem Zielbereich hybridisieren (z.B. ein ausgewählter Abschnitt eines Chromosoms, der ein Gen von Interesse enthält), die wenigstens ungefähr 90 Prozent wiederholungsfreie Segmente umfasst.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine chromogene (kolorimetrische) in situ Hybridisierung (CISH, chromogenic in situ hybridization) und auf für die in situ Hybridisierung nützliche Nukleinsäuresonden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren, Kits und Zusammensetzungen für das Durchführen von Hellfeld-Krebsdiagnostik unter Verwendung von chromogener in situ-Hybridisierung (z. B. für das Detektieren von Genamplifikationen, Gentranslokationen und chromosomalen Polysomien) bereit. In bevorzugten Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung CISH-Verfahren, Kits und Zusammensetzungen für das Detektieren des HER2-Gen-Status bereit.
Die Beschreibung der Erfindung erfolgt unten in den folgenden Abschnitten: I. Chromogene in situ-Hybridisierung; II. Detektion von HER-2/neu durch CISH und Anti-HER2-Antikörpertherapie; III. Kombinierte HER2/HER-2/neu und TopoIIα-Detektion; IV. Kombinierte CISH und IHC;V. Subtraktions-Sonden; und VI. ABL-Sondenpaare und Detektion von BCR-ABL-Translokationen.
I. Chromogene in situ-Hybridisierung
Chromogene in situ-Hybridisierung (CISH) ist eine Technik, die es ermöglicht, dass die Durchführung und Detektion von in situ-Hybridisierungsverfahren mit einem Hellfeld-Mikroskop statt mit einem Fluoreszenzmikroskop, wie dies für FISH erforderlich ist, erfolgt. Während für FISH ein moderne und teure Fluoreszenz-Mikroskope benötigt werden, die mit 60X oder 100X Ölimmersionsobjektiven von hoher Qualität und Multibandpass-Fluoreszenzfilter ausgerüstet sind (nicht verwendet in den meisten herkömmlichen Diagnostiklaboren), ermöglicht CISH eine Detektion mit Standardlicht-Mikroskopen (Hellfeld-Mikroskopen) (die im Allgemeinen in Diagnostiklaboratorien verwendet werden). Auch können bei FISH die Fluoreszenzsignale innerhalb weniger Wochen verblassen und die Hybridisierungsergebnisse werden üblicherweise mit einer teuren CCD-Kamera aufgezeichnet, während die Ergebnisse von CISH im allgemeinen nicht verblassen, was es ermöglicht, dass die Gewebeproben archiviert und später erneut untersucht werden können. Somit sind die Analyse und das Aufzeichnen von FISH-Daten teuer und zeitaufwendig. Insbesondere ist die Gewebeschnittmorphologie bei FISH mit FFPE nicht optimal. Im Allgemeinen werden histologische Details eher mit Hellfeld-Detektion untersucht, was bei der CISH-Detektion möglich ist. Ein weiterer Vorteil von CISH ist, dass große Bereiche von Gewebeschnitten nach dem CISH-Gegenfärben schnell geprüft werden können, da morphologische Details schnell unter Verwendung von Objektiven mit geringer Leistung (z. B. 10X und 20X) sichtbar sind, während FISH-Detektion im Allgemeinen eine wesentlich höhere Vergrößerung erfordert (was das Sichtfeld verringert). Diese Vorteile bewirken im Allgemeinen, dass CISH im Vergleich eine bessere in situ-Hybridisierungstechnik als FISH ist.
Allgemeine chromogen/kolorimetrische in situ-Hybridisierungsverfahren werden in WO0026415 von Fletcher et al. beschrieben. Spezielle Reagenzien und Schritte für das Durchführen von CISH auf mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben, sowie Zellproben/Proben mit Chromosomen in der Metaphase werden in WO0026415 und dem untenstehenden Abschnitt beschrieben. Es ist wichtig zu beachten, dass die unten detailliert aufgeführte Beschreibung exemplarische CISH-Verfahren, Verfahrensabläufe und Reagenzien bereitstellt und nicht als die vorliegende Erfindung einschränkend betrachtet werden soll.
A. Mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeproben (FFPE)
Im Allgemeinen haben FFPE-Gewebeproben (z. B. Gewebeproben aus einer Krebsbiopsie) ungefähr einen Durchmesser von 1-2 cm, sie können jedoch jeden beliebigen Durchmesser aufweisen. Diese Gewebeschnitte (z.B. 4-5 μm) können auf behandelten Mikroskop-Objektträgern (z.B. mit HISTOGRIP behandelt) oder weiteren festen Trägeroberflächen (z. B. Superfrost/Plus Mikroskop-Objektträgern) befestigt werden.
i. VORBEHANDLUNG
In bevorzugten Ausführungsformen durchlaufen die FFPE-Gewebeproben zunächst einen Entparaffinierungsschritt. Dies kann zum Beispiel dadurch geschehen, dass die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Xylol versetzt wird. Dies kann gegebenenfalls wiederholt werden. Die Probe kann dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit EtOH (z.B. 100% EtOH) versetzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird dies drei Mal durchgeführt. Die Gewebeproben werden dann getrocknet (z. B. Lufttrocknen).
Anschließend werden die Gewebeproben einer Wärmevorbehandlung unterzogen. Insbesondere wird den Gewebeproben ein Vorbehandlungspuffer hinzugefügt und die Proben werden ungefähr 15 Minuten lang auf ungefähr 96-100 Grad Celsius erwärmt (es können auch unterschiedliche Inkubationszeiten in Abhängigkeit von der Gewebefixierung angewendet werden). Beispiel für Vorbehandlungspuffer schließen folgende ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: Citratpuffer, EDTA-TRIS-Puffer (z.B. 0,1M Tris/0,05 M EDTA, pH 7,0) und TRIS-Puffer. In bestimmten Ausführungsformen wird die Vorerhitzungstemperatur mit einer Mikrowelle, einem Dampfdrucktopf, einer Heizplatte oder einer anderen Art von Vorrichtung für das Erwärmen erreicht. Auch ist in bevorzugten Ausführungsformen die Vorerhitzungstemperatur so, dass der Vorbehandlungspuffer kocht. Zum Beispiel liegt ein bevorzugter Temperaturbereich bei 96-100 Grad Celsius. Ein besonders bevorzugter Temperaturbereich liegt bei 98-100 Grad Celsius. Es wurde bestimmt, dass der Temperaturbereich von 98-100 zu verbesserten CISH-Detektionsergebnissen führt (z. B. im Vergleich zu 92 Grad Celsius). Die Gewebeproben werden dann im Allgemeinen zwei oder drei Mal (z.B. für 2-4 Minuten pro Wäsche) gewaschen (z.B. mit Wasser oder PBS).
Im Allgemeinen ist der nächste Schritt ein Enzymverdauschritt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Gewebeproben etwa einige Minuten lang (z.B. können 1-20 Minuten erforderlich sein, je nach Gewebefixierung) einer Verdauung durch Pepsin ausgesetzt (z. B. bei Raumtemperatur oder bei ungefähr 37 °C). Es ist wichtig zu beachten, dass eine übermäßige Verdauung einen Verlust von Zellkern- und Chromosomenstruktur verursachen kann, während eine inadäquate Verdauung zu einem Signalverlust führen kann. Die Gewebeproben werden dann zwei oder drei Mal (z. B. für 2-4 Minuten pro Wäsche) erneut gewaschen (z. B. mit Wasser oder PBS).
Nach dem Waschen werden die Gewebeproben mit einer abgestuften Alkoholreihe dehydriert. Zum Beispiel können die Gewebeproben 2 Minuten lang mit 70-, 85-, 95- und 100-%igem Ethanol versetzt und anschließend an der Luft getrocknet werden.
ii. Denaturierung und Hybridisierung
Denaturierung und Hybridisierung können entweder in einem Schritt durchgeführt werden (Co-Denaturierung und Hybridisierung, in diesem Paragraphen beschrieben), oder in zwei Schritten (separate Denaturierung und Hybridisierung, untenstehend beschrieben). Ein allgemeiner Verfahrensablauf für die Co-Denaturierung und Hybridisierung ist wie folgt. Zunächst wird die Sonde (z.B. 12-20 μl einer Subtraktions-Sondenbibliothek) auf die Mitte eines Deckglases gegeben (z. B. Deckglas mit 22 × 22 mm, oder Deckglas mit 24 × 32 mm, oder Deckgläser, wie sie in WO0138848 von Ventana Medical Systems Inc. beschrieben sind). In weiteren Ausführungsformen wird die Sonde direkt zu der Gewebeprobe gegeben. In weiteren Ausführungsformen wird das Liquid COVERSLIP von Ventana Medical Systems, Inc. an der Gewebeprobe angewendet (z.B. um eine feuchte Reaktionskammer auf dem Objektträger herzustellen). In weiteren Ausführungsformen werden Zymed CISH UNDERCOVER Slips-Objektträger verwendet (erhältlich bei Zymed Labs.). In einigen Ausführungsformen wird das Deckglas dann mit der Sondenseite nach unten auf der Gewebeprobe platziert. Die Kanten des Deckglases können dann versiegelt werden, zum Beispiel mit einer dünnen Schicht Gummilösung, um ein Verdampfen während der Inkubation zu vermeiden. Der Objektträger mit der Gewebeprobe wird dann auf einem Objektträgerblock einer PCR-Anlage oder einem Heizblock mit einer Temperaturanzeige (oder einer anderen Heizvorrichtung) platziert. Denaturierung wird ungefähr 5-10 Minuten lang bei ungefähr 94-95 Grad Celsius durchgeführt. Die Gewebeprobe (z.B. auf dem Objektträger) wird dann ungefähr 16-24 Stunden lang bei ungefähr 37 Grad Celsius inkubiert. Eine Inkubation kann zum Beispiel in einer dunklen Feuchtigkeitskammer (oder einer anderen feuchten Kammer) oder in dem Objektträgerständer eines PCR-Thermocyclers erfolgen.
Ein allgemeiner Verfahrensablauf für die getrennte Denaturierung und die Hybridisierung ist die folgende.
Diese Verfahrensabläufe sind nützlich, wenn zum Beispiel eine PCR-Anlage oder ein Heizblock nicht schnell verfügbar sind. Zunächst wird die Gewebeprobe ungefähr 5 Minuten lang in Denaturierungspuffer (z.B. 4 ml 20 × SSC [20 × SSC Puffer = 0,3M Natriumzitrat, mit 3M NaCl, pH 7,0], 8 ml ddH₂O, 28 ml Formamid) bei ungefähr 75 Grad Celsius denaturiert. Temperaturerhöhungen können für das gleichzeitige Denaturieren von zusätzlichen Proben verwendet werden (z.B. Erhöhung von ungefähr 1 Grad Celsius für jede zusätzliche zu denaturierende Probe). Danach werden die Objektträger mit abgestuften Alkoholen denaturiert (z.B. 70-%iger EtOH, 85-%iger EtOH und 95-%iger EtOH für jeweils 2 Minuten bei minus 20 Grad Celsius und dann zweimal ungefähr 2 Minuten lang mit 100-%igem EtOH).
Dann werden die Gewebeproben luftgetrocknet, während die markierte Sonde (z.B. die Subtraktionssonde) ungefähr 5 Minuten lang bei ungefähr 75 Grad Celsius denaturiert wird. Die denaturierte Sonde wird dann auf Eis gegeben. Ungefähr 12-15 μl der denaturierten Sonde werden auf den Mittelpunkt eines Deckglases (z.B. eines 22 × 22 mm Deckglases oder einer anderen Abdeckung) gegeben. Das Deckglas wird dann zu dem geeigneten Gewebeprobenbereich gegeben, und die Gewebeprobe wird dann wenigstens 14 Stunden lang in einer dunklen, feuchten Box (oder einer anderen feuchten Kammer) bei ungefähr 37 °C platziert. Der nächste Schritt wäre zum Beispiel die unten beschriebene Stringenzwäsche.
B. Zellprobe oder Probe mit Metaphasechromosomen
i. Vorbehandlung
Zunächst werden Objektträger bei ungefähr 37 Grad Celsius ungefähr 60 Minuten lang in einen Vorbehandlungspuffer wie etwa 2 × SSC-Puffer (20 × SSC-Puffer = 0,3 M Natriumzitrat, mit 3 M NaCl, pH 7,0), oder Tris-EDTA oder Tris getaucht. In einigen Ausführungsformen werden die Zellproben ungefähr 5 Minuten lang bei ungefähr 37 Grad Celsius mit Pepsin-Zusammensetzungen (z. B. SPOT LIGHT Cell Pretreatment Reagent von Zymed) behandelt. Die Inkubationszeit kann je nach Zelltyp und Bedingungen der Herstellung der Objektträger zum Beispiel ungefähr ab 1-10 Minuten betragen. Ein übermäßiger Pepsinverdau kann einen Verlust der Zellkerne und der Chromosomenstruktur verursachen. Ein unangemessener Verdau kann zu einem Signalverlust führen. Die Objektträger können dann zwei oder drei Mal für jeweils zwei oder drei Minuten bei Raumtemperatur gewaschen werden (z. B. in dH₂O oder PBS). In einigen Ausführungsformen können die Objektträger etwa eine Minute lang bei Raumtemperatur in gepuffertes Formalin (z.B. 10-%ig) getaucht werden. Die Objektträger können dann zwei oder drei Mal für jeweils 1-3 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen werden (z. B. in dH₂O oder PBS). Die Objektträger können dann dehydriert werden. Die Objektträger können zum Beispiel für jeweils 2 Minuten in 70-%igem, 85%-%igem, 95%-%igem, und 100-%igem Ethanol dehydriert und daraufhin luftgetrocknet werden. Objektträger können mit oben beschriebenen ISH-Verfahren bearbeitet oder aufbewahrt werden (z. B. in 70-%igem Ethanol bei –20 Grad Celsius).
ii. Denaturierung und Hybridisierung
Zunächst wird die Sonde (z.B. 12-20 μl einer Subtraktions-Sondenbibliothek, siehe den Abschnitt über Subtraktionssonden unten) auf den Mittelpunkt eines Deckglases gegeben (z. B. 22 × 22 mm Deckglas, oder 24 × 32 mm oder Deckgläser, die in WO0138848 von Ventana Medical Systems Inc. beschrieben sind). In weiteren Ausführungsformen wird die Sonde direkt zu der Gewebeprobe hinzugefügt. In einigen Ausführungsformen wird das Liquid COVERSLIP von Ventana Medical Systems, Inc. für die Gewebeprobe angewendet (z.B. um eine feuchte Reaktionskammer auf dem Objektträger zu erzielen).
In weiteren Ausführungsformen werden Zymed CISH UNDERCOVER Slips-Deckgläser verwendet (erhältlich von Zymed Labs.). In einigen Ausführungsformen wird das Deckglas dann mit der Sondenseite nach unten auf die Gewebeprobe gegeben. Die Kanten des Deckglases können dann versiegelt werden, zum Beispiel mit einer dünnen Schicht Gummilösung, um ein Verdampfen während der Inkubation zu vermeiden. Für die Denaturierung wird dann der Objektträger mit der Gewebeprobe auf einem Objektträgergestell einer PCR-Anlage oder auf einem Heizblock mit einer Temperaturanzeige (oder einer anderen Heizvorrichtung) platziert. Die Denaturierung wird bei ungefähr 80 Grad Celsius während ungefähr 2-5 Minuten durchgeführt. Die Objektträger können dann 16-24 Stunden lang zum Beispiel in einer dunklen Feuchtigkeitsbox (oder einer anderen feuchten Kammer) oder in dem Objektträgerständer eines PCR-Thermocyclers bei ungefähr 37 Grad Celsius platziert werden.
iii. Stringenzwäsche
Die verbleibenden Schritte (z.B. Stringenzwäsche, Immundetektion, Gegenfärben/mit Deckglas bedecken) sind im Allgemeinen für Zellprobe und FFPE gleich. Nach der Hybridisierung werden die Gummilösung (oder das andere Abdichtungsmittel, falls ein Abdichtungsmittel verwendet wird) und das Deckglas (oder eine andere Abdeckung) vorsichtig entfernt. Die Objektträger mit den Gewebeproben werden dann gewaschen (z. B. in einer Coplin-Küvettte), um die nicht hybridisierten Sonden zu entfernen. Zum Beispiel können die Objektträger ungefähr 5 Minuten lang bei 72 °C mit den Gewebeproben in 0,5 × SSC gewaschen werden. Die Temperatur kann aufwärts geregelt werden, wenn mehr als ein Objektträger gewaschen wird (z.B. Erhöhung um 1 C pro Objektträger bei mehr als 2 Objektträgern, jedoch bevorzugt nicht höher als 80 °C). Die Objektträger werden dann erneut ungefähr 2-3 Minuten lang zum Beispiel in dH₂O oder PBS/Tween 20 Puffer gewaschen. Dies kann zwei oder drei Mal wiederholt werden.
iv. Immundetektion
Im Allgemeinen besteht je nach verwendeten Detektionsreagenzien der erste Schritt bei der Vorbereitung der Immundetektion in der Inaktivierung der Peroxidase und dem Blocken von endogenem Biotin. Für das Inaktivieren (quenching) der Peroxidase können Objektträger etwa 10 Minuten lang in 3%-iger H₂O₂ in absolutem Methanol eingeweicht werden (z. B. wird ein Teil 30%iges Wasserstoffperoxid zu 9 Teilen absolutem Methanol hinzugefügt). Der Objektträger wird dann 2-3 Minuten lang mit PBS (z.B. 1 × PBS (10mM)/Tween 20 (0,025%)) gewaschen. Dies kann zwei oder drei Mal wiederholt werden. Die Gewebeproben sind dann geblockt. Das Blocken kann durchgeführt werden, indem 2 Tropfen CAS-BLOCK (bestehend aus 0,25% Casein, 0,2% Gelatine und 10 mM PBS, pH-Wert 7,4) pro Objektträger (bei Raumtemperatur) hinzugegeben werden. Nach ungefähr 10 Minuten lässt man das blockende Reagens abtropfen.
Danach wird die markierte Sondenbibliothek detektiert. Die Sonde kann dann detektiert werden, indem zunächst ein primärer Anti-Marker Antikörper (z. B. ein Mausantikörper oder ein Antikörper mit einem Marker wie etwa FITC) hinzugegeben werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Sonde mit Digoxigenin markiert, und der primäre Antikörper ist ein FITC-anti-dig-Antikörper. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist der primäre Antikörper ummarkiert, stammt jedoch von einer besonderen Spezies, wie etwa Ratte, Maus oder Ziege.
In weiteren Ausführungsformen ist der primäre Antikörper mit einem Enzym verbunden (z. B. mit diesem konjugiert) (z.B. Meerrettich-Peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) oder alkalische Phosphatase (AP)), die geeignet ist, auf ein chromogenes Substrat einzuwirken, und der unten beschrieben sekundäre Antikörper ist nicht erforderlich. Im Allgemeinen werden bei Raumtemperatur zwei Tropfen der Lösung mit primärem Antikörper ungefähr 30-60 Minuten lang zu dem Gewebe gegeben. Die Gewebeprobe wird dann 2-3 Minuten lang gespült, zum Beispiel mit PBS (z.B. 1 × PBS/Tween 20 (0,025%). Dies kann zwei bis drei Mal wiederholt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen wird ein sekundärer Antikörper zu der Gewebeprobe gegeben, der in der Lage ist, mit dem primären Antikörper zu binden. Zum Beispiel ist der sekundäre Antikörper ein anti-FIC-Antikörper, wenn der primäre Antikörper mit FITC markiert ist. Auch kann der sekundäre Antikörper ein Anti-Maus-Antikörper sein (z. B. Ziege-anti-Maus-Antikörper), falls zum Beispiel der primäre Antikörper ein unmarkierter Mausantikörper ist. Im Allgemeinen wird der sekundäre Antikörper mit einem Enzym (z. B. HRP oder AP) verbunden (z. B. mit diesem konjugiert), das geeignet ist, auf ein chromogenes Substrat (oder ein chemilumineszentes Substrat) einzuwirken. Im Allgemeinen werden bei Raumtemperatur 30-60 Minuten lang ungefähr 2 Tropfen des sekundären Antikörpers zu der Gewebeprobe gegeben. Die Gewebeprobe wird dann etwa 2-3 Minuten lang zum Beispiel mit PBS (z. B. 1 × PBS/Tween 20 (0,025%) gespült. Dies kann zwei oder drei Mal wiederholt werden. Gegebenenfalls können zusätzliche Antikörper (z. B. tertiäre, quaternäre Antikörper) verwendet werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird der sekundäre Antikörper mit einem Polymer verbunden, das wiederum mit vielen Enzymmolekülen verbunden ist (z. B. HRP oder polymerisiertes AP). Dies ermöglicht es, dass jeder einzelne Antikörper sich mit vielen Enzymmolekülen verbindet (über das Polymer), um die Signalstärke zu erhöhen. Derartige polymerisierte Enzyme sind in der Technik bekannt und können käuflich zum Beispiel bei Nichirei Inc. (Tokio, Japan) und ImmunoVision erworben werden.
Sobald der mit einem Enzym (z. B. einem sekundären oder tertiären Antikörper, der mit AP oder HRP konjugiert ist) verbundene Antikörper (oder ein weiteres Detektionsmolekül) zu der biologischen Probe hinzugegeben wird, wird ein Substrat für das Enzym hinzugefügt. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Substrat ein Chromogen. Beispiele für geeignete Chromogene schließen folgende ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: DAB, FASTRED, AEC, BCIP/NBT, BCIP/INT, TMB, APPurple, ULTRABLUE, TMBlue, und VEGARED. In weiteren Ausführungsformen ist das Substrat ein chemilumineszentes Molekül (z.B. chemilumineszentes Substrat BOLD APS 540, chemilumineszentes Substrat BOLD APS 450 oder chemilumineszentes Substrat BOLD APB, sämtlich erhältlich bei INTERGEN Co). Somit besteht der nächste Schritt darin, zum Beispiel beim Entwickeln des Objektträgers, DAB (oder ein anderes Substrat); Puffer und Wasserstoffperoxid (z.B. 0,6-%ig) in einem Rohr zu vermischen und dann 30 Minuten lang 3 Tropfen pro Objektträger zu der Gewebeprobe hinzuzufügen. In bestimmten Ausführungsformen werden chromogene Verstärker hinzugefügt, um die Signalstärke zu erhöhen (z. B. AEC-Verstärker, FAST RED-Verstärker und DAB-Verstärker, die bei INNOVEX Biosciences, ZYMED Labs, etc. erhältlich sind). Die Gewebeprobe kann dann ungefähr zwei Minuten lang gewaschen werden (z. B. unter dem laufenden Wasserhahn). In bestimmten Ausführungsformen werden die immunhistochemischen Schritte automatisiert oder teilweise automatisiert. Zum Beispiel kann der ZYMED ST 5050 Automated Immunostainer verwendet werden, um dieses Verfahren zu automatisieren.
v. Gegenfärben und Abdecken mit Deckgläsern
In einigen Ausführungsformen ist der nächste Schritt ein Schritt des Gegenfärbens und des Abdeckens mit Deckgläsern. Dieser Schritt kann durchgeführt werden, indem die Gewebeprobe gegengefärbt wird. Zum Beispiel kann die Gewebeprobe mit Hämatoxylin oder einer anderen Gegenfärbung gegengefärbt werden. Dieser Vorgang kann etwa 6 Sekunden bis ungefähr 1 Minute lang durchgeführt werden, je nach zu färbendem Gewebe. Bevorzugt wird eine übermäßig dunkle Gegenfärbung vermieden, damit das positive Signal nicht verdunkelt wird. Die Objektträger können dann einige Minuten lang gewaschen werden (z.B. unter laufenden Wasser) und wird dann in einigen Ausführungsformen mit abgestuftem EtOH dehydriert (z.B. 70%, 85%, 95%, 100%, 100% für ungefähr jeweils 2 Minuten, zwei Mal wiederholt). In einigen Ausführungsformen wird die Dehydrierung nicht mit EtOH durchgeführt, wenn zum Beispiel FAST RED das Substrat ist (z. B. ein wasserlösliches Substrat). Die Objektträger können dann ungefähr zwei Minuten lang Xylol ausgesetzt werden (dies kann wenigstens einmal wiederholt werden). Die Gewebeprobe kann dann mit einem Deckglas abgedeckt werden (z.B. mit HISTOMOUNT, Cytoseal 6.0, Kat. # 8310-16, Stephen Scientific).
In einigen Ausführungsformen wird stattdessen CLEARMOUNT verwendet (z. B. wenn FAST RED eines der Substrate ist).
vi. Mikroskopie und Interpretation der Ergebnisse
Hauptsächlich können die Objektträger unter Verwendung von Standard-Hellfeldmikroskopie mit einem Hellfeldmikroskop visualisiert werden (z.B. OLYMPUS NIKOLA, LEITZ, etc.). Im Allgemeinen sind die Sonden mit ungefähr 20-facher Vergrößerung (z. B. 15x-25x) sichtbar. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Sonden mit ungefähr 30-facher oder 40-facher Vergrößerung (z. B. 28x-43x) visualisiert. Höhere Stärken (z. B. 60x, 80x und 100x) können verwendet werden, sind jedoch im Allgemeinen nicht notwendig (und können das Sichtfeld verkleinern). In einigen Ausführungsformen wird für die Auswertung von Translokationsergebnissen eine 100x-Öllinse verwendet. In weiteren Ausführungsformen wird für das Auswerten der Amplifikation und der Zentromersonden eine 40x-Linse verwendet. Untenstehend finden sich Beispiele für Arten, wie CISH-Ergebnisse für Genamplifikation/Zentromerdetektion sowie Gentranslokationen interpretiert werden können.
Wie oben erwähnt, kann die CISH-Detektion der Genamplifikation, Translokation und Zentromerdetektion mit einem Hellfeldmikroskop oder einem anderen Mikroskoptyp durchgeführt werden. Zum Beispiel sind CISH-Färbeergebnisse im Allgemeinen bei Verwendung eines 40x-Objektivs in gegengefärbten Gebeweschnitten (z. B. Hämatoxylin) gut sichtbar. Ein einzelnes Gensignal oder ein Chromosomenzentromersignal erscheint normalerweise als ein kleiner, einzelner Punkt. Die Ziel-Genamplifikation ist üblicherweise sichtbar als große, chromogen gefärbte (z. B. DAB-gefärbte) Cluster oder viele Punkte im Zellkern oder gemischte Cluster und mehrere Punkte (z. B. >6 Punkte pro Zellkern). Tumore mit gezielter Genamplifikation zeigen üblicherweise 1 bis 5 Punkte pro Zellkern.
Normalerweise sind 3-5 Punkte pro Zellkern in mehr als 50% der Tumorzellen auf chromosomale Polysomie zurückzuführen. Tabelle 1 zeigt ein exemplarisches Diagramm, das geeignet für eine Visualisierung von individuellen Genen mittels CISH für chromosomale Polysomien ist.
Tabelle 1 Exemplarische Visualisierung des CISH-Signals für ein einzelnes Gen oder ein Chromosomenzentromer
Beispiele für Detektion mittels CISH und Interpretation von Genamplifikation bei CISH für HER2 und TopoIIα werden unten in Tabellen 2 und 3 dargestellt.
Tabelle 2 Exemplarische Bestimmung von HER2-Gen-Status durch CISH
Tabelle 3 Verwendung der exemplarischen TopoIIα-Sonde und der Chromosom 17-Zentromersonde
Auch kann in einigen normalen Zeilen aufgrund eines Verlustes von Kernmaterial während des Herstellens des Schnitts eine Genkopie fehlen. Deshalb sollte im Allgemeinen die Analyse auf den Resultaten der Mehrzahl der untersuchten Krebszellen (>50%) basieren. 2 stellt ein Interpretationsdiagramm für das Interpretieren von TopoIIα-Amplifikation unter Verwendung von TopoIIα- und Chromosome 17–Zentromersonden dar. Es gilt zu beachten, dass dies lediglich repräsentative Beispiele sind. Die Kopienanzahl aus den tatsächlichen Proben kann für Aneuploidie, Deletion und Amplifikation variieren.
vii. Qualitätskontrollverfahren
In einigen Ausführungsformen werden Verfahrensabläufe zur Qualitätskontrolle verwendet. Qualitätskontrolle bezüglich der Genauigkeit der obigen Verfahren kann in einigen Ausführungsformen durch einige oder sämtliche der unten beschriebenen Kontrollen gewährleistet werden.
Positive Gewebekontrolle:
Externe positive Kontrollmaterialien für die klinische Forschung sollten im Allgemeinen frische Proben aus einer Autopsie/Biopsie/einem chirurgischen Eingriff sein, die so schnell wie möglich auf die gleiche Weise wie die Probe/n von Patienten fixiert, verarbeitet und eingebettet werden sollten. Anders als die Probe(n) bearbeitete Proben validieren die Leistung des Reagens und dienen nicht der Überprüfung von Gewebeproben.
Positive Gewebekontrollen sind indikativ für korrekt präpariertes Gewebe und richtige Färbetechniken. Eine Kontrolle mit positivem Gewebe kann in jeden Durchlauf für jede Gruppe von Testbedingungen eingeschlossen werden. Zum Beispiel sollten für die TopoIIα-Gendetektion als positive Kontrollmaterialien verwendete Gewebe mit gut charakterisierten Niveaus an TopoIIα-Gen ausgewählt werden.
Ungefähr 5-10% des Brustkrebsgewebes weist eine TopoIIα-Genamplifikation auf und kann eine nützliche Quelle für positives Kontrollgewebe sein.
Bekannte positive Kontrollen können für das Überwachen der richtigen Funktionsweise der verarbeiteten Gewebe und Testreagenzien verwendet werden und nicht als Unterstützung für das Interpretieren von Ergebnissen von Proben. Wenn die Kontrollen mit positivem Gewebe keine positive Färbung zeigen, sollten Ergebnisse mit den Testproben im Allgemeinen als ungültig betrachtet werden.
Negative oder normale (diploide) Gewebekontrolle:
Normales Gewebe kann als eine negative Kontrolle für die Genamplifikation oder Deletion verwendet werden.
Eine negative Gewebekontrolle (die bekannterweise diploid ist), die in gleicher Weise wie die Probe(n) fixiert, verarbeitet und eingebettet ist, wird bei jedem Färbedurchlauf verwendet. Dies beweist die Spezifität der ISH-Sonde und weist auf ein unspezifisches Hintergrundfärben (falsch-positives Färben) hin.
Eine negative, von der Probe separate, Gewebekontrolle ist als „externe" negative Kontrolle bekannt. Wenn eine externe negative Gewebekontrolle nicht verfügbar ist, dann dient ein normaler Schnitt der Probe als eine „interne" negative Gewebekontrolle.
In bestimmten Ausführungsformen wird die negative Gewebekontrolle nach der positiven Gewebekontrolle untersucht, um die Spezifität der Hybridisierung zu überprüfen. Im Allgemeinen bestätigt das Vorhandensein von weniger als zwei Genkopien in den meisten Zellen in der negativen Gewebekontrolle, dass die Probe und die Detektionsreagenzien nicht mit den Zell- oder Gewebekomponenten kreuzreagieren.
Manchmal sind 0, 1, 3, oder 4 Genkopien im Zellkern sichtbar. Normale Gewebe-Gegenstücke in einer anormalen Probe können auch als negative Gewebekontrollen verwendet werden. Wenn in den negativen Gewebeproben unspezifisches Färben auftritt, dann sollten für die Testprobe(n) erhaltene Ergebnisse im Allgemeinen als ungültig betrachtet werden. Auch unspezifisches Färben ergibt normalerweise ein diffuses Färbemuster. Sporadisches Färben von Bindegewebe kann auch in Schnitten von übermäßig mit Formalin fixierten Geweben beobachtet werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden normale Zellen für die Interpretation von Färbeergebnissen verwendet werden, da nekrotische oder degenerierte Zellen oftmals unspezifisch färben.
Reagenskontrolle (NO-Sonde):
Eine Reagenskontrolle kann auf einem Schnitt einer Testprobe ohne die Sonde durchgeführt werden.
Die Reagenskontrolle ist nützlich für eine Einschätzung der Möglichkeit des unspezifischen Färbens, insbesondere wenn ISH in Gewebeschnitten durchgeführt wird. Die Reagenskontrolle kann auf dieselbe Weise gefärbt werden wie die Testproben, außer dass der die Sonde nicht enthaltende Hybridisierungspuffer im Allgemeinen nicht während dem Hybridisierungsschritt verwendet werden sollte. Objektträger-Vorbehandlung, Denaturierung und Immundetektion sollten im Allgemeinen unter den gleichen Bedingungen wie Testproben durchgeführt werden.
viii. Automatisierung
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind alle oder ein Teil der oben beschriebenen Verfahrensabläufe für das Durchführen von CISH automatisiert. Eine Automatisierung ist nützlich für eine Verarbeitung vieler Proben mit hohem Durchsatz (z.B. im klinischen Labor). Beispiele von Verfahren und Vorrichtungen, die für eine derartige Automatisierung nützlich sind, können in WO9943434 und WO9944030 von Ventana Medical Systems Inc. (Tucson, AZ) gefunden werden. Zusätzliche Beispiele sind automatisierte in situ-Hybridisierung und in der Immunhistochemie verwendete Vorrichtungen, die bei Ventana Medical Systems Inc. erhältlich sind, wie etwa das BENCHMARK in situ-Hybridisierungsmodul. In weiteren Ausführungsformen wird die Ausrüstung von Cytologix Corp. (Cambridge Mass.) verwendet (z. B. wie in WO0063670, WO0062064, WO9944032, WO9944031, und WO9901770 gezeigt).
II. CISH HER-2/neu Detektion und Anti-HER2 Antikörpertherapie
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren, Kits und Zusammensetzungen für das Detektieren der HER2-Genamplifikation (z. B. bei einem Patienten) an einer Probe unter Verwendung von CISH bereit (siehe, z.B. Beispiele 1 und 2). Sobald die HER2-Genamplifikation durch CISH detektiert wurde, kann der Patient, von dem die Probe stammt als ein geeigneter Kandidat für eine anti-HER2-Antikörper-Immuntherapie identifiziert werden. In einigen Ausführungsformen werden dem Patienten anti-HER2-Antikörper verschrieben. In weiteren Ausführungsformen wird dem Patienten eine therapeutisch wirksame Dosis oder Dosen von anti-HER2-Antikörpern (z. B. chimärische, humanisierte oder vollständig humane anti-HER2-Antikörper) verabreicht.
Beispiele für Antikörper, die an HER2 binden, schließen folgende ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: MAbs 4D5 (ATCC CRL 10463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216), und 7C2 (ATCCHB12215) (siehe, US-Patent Nr. 5,772,997; PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 98/77797; und US-Patent Nr. 5,840,525).
Beispiele für humanisierte anit-HER2-Antikörper schließen folgende ein, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, und huMAb4D5-8 (HERCEPTIN^®) wie in Tabelle 3 von US-Patent 5,821,337 beschrieben, und humanisiertes 520C9 (PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 93/21319). Beispiele für humane anti-HER2-Antikörper schließen die in US-Patent Nr. 5,772,997 und PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 97/00271 beschriebenen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt:
III. Kombinierte HER2/HER-2/neu und TopoIIα-Detektion
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die Diagnose und die Behandlung Krebs und insbesondere Verfahren für das Bestimmen der Empfindlichkeit von Subjekten mit Verdacht auf Brustkrebs (oder bei denen Brustkrebs diagnostiziert wurde) auf einen Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren und eine Behandlung mit anti-HER2-Antikörpertherapie bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für das Detektieren einer Kopienzahl sowohl von TopoIIα als auch HER2/neu bereit oder für das Detektieren der HER2-Genexpression (z. B. Überexpression) und der Kopienanzahl von TopoIIα (z. B. Amplifikation) bereit, die zu einer verbesserten diagnostische Behandlung (z. B. für die erfolgreiche Behandlung von Brustkrebspatienten) führen. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung angesichts der Gefahren, die bei einer kombinierten Verabreichung von Topoisomerase-II-Inhibitoren (wie etwa Anthracyclinen) und anti-HER2-Antikörpern (z. B. HERCEPTIN^®) auftreten, auch Verfahren für das Auswählen des für einen Patienten am besten geeigneten Verfahrens bereit. Dies wird in einigen Ausführungsformen dadurch erreicht, dass eine Kopienanzahl sowohl von TopoIIα als auch von HER2/neu in einer Gewebeprobe eines Patienten (z. B. eines Brustkrebspatienten) bestimmt wird oder aber durch das Detektieren einer Kopienanzahl von TopoIIα und der Expressionsniveaus von HER2.
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, um zu bestimmen, ob ein Subjekt mit Verdacht auf Brustkrebs von einer Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren (z. B. Anthracyclinen) profitieren würde. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung diagnostische Assays für das Detektieren einer amplifizierten Kopienanzahl von HER-2/neu und TopoIIα in Brustkrebszellen eines möglichen Subjekts sowie für das Identifizieren, ob das Kandidatensubjekt für eine Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren (z.B. ohne gleichzeitige anti-HER2-Antikörpertherapie) oder für eine Behandlung mit anti-HER-2-Antikörpertherapie (z. B. ohne gleichzeitige Therapie mit Topoisomerase-II-Inhibitoren wie etwa eine Therapie mit Anthracyclinen) geeignet ist, bereit. In weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Behandlung von Brustkrebs durch das Verabreichen von Topoisomerase-II-Inhibitoren (z. B. Anthracycline) an Subjekte, die Brustkrebszellen mit einer amplifizierten Kopienanzahl von HER-2/neu und TopoIIα aufweisen, bereit. Zur besseren Übersicht ist dieser Abschnitt in die folgenden Abschnitte unterteilt: A. Brustkrebs; B. Behandlung des metastatischem Brustkrebses; C. TopoIIα und TopoIIα; D. Detektion von TopoIIα; E. HER-2 and HER2/neu; F. Detektion von HER2 und HER-2/neu;
G. Zusammenhang zwischen HER-2/neu und TopoIIα; und H.HER-2/neu-TopoIIα-Status als Diagnosemarker.
A. Brustkrebs
Trotz der Tatsache, dass Brustkrebs heutzutage früher diagnostiziert wird, haben ungefähr 1-5% der Frauen zum Zeitpunkt der Diagnose des Brustkrebses eine entfernte Metastase. Außerdem erleiden ungefähr 50% der Patienten mit einer primär diagnostizierten lokal beschränkten Erkrankung ein Rezidiv mit einer Metastase.
Fünfundachtzig Prozent dieser Rückfälle treten innerhalb der ersten fünf Jahre nach der ersten Feststellung der Krankheit auf.
Bei der ersten Untersuchung ist(sind) bei den meisten Patienten mit metastatischem Brustkrebs lediglich eines bis zwei Organsystem(e) betroffen. Bei einer Progression der Krankheit im Laufe der Zeit folgt für gewöhnlich ein Auftreten an mehreren Orten. Tatsächlich können bei der Autopsie Metastasen in fast jedem Körperorgan gefunden werden.
Metastasen treten am häufigsten lokoregional in der Haut und im weichen Gewebe der Brustwand sowie in der Achselhöhle und im supraklavikulären Bereich auf. Knochenmetastasen (30-40% der entfernten Metastasen), gefolgt von Lungen- und Lebermetastasten sind die häufigsten Orte entfernter Metastasen. Metastatischer Brustkrebs wird im Allgemeinen als unheilbare Krankheit betrachtet. Jedoch verlängern die derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten oftmals die krankheitsfreie Zeit und die Gesamtüberlebensrate und erhöhen die Lebensqualität. Die mediane Überlebenszeit ab der Feststellung von entfernten Metastasen liegt bei etwa drei Jahren.
Bei einigen Patienten kann eine Krankheit im fortgeschrittenen Stadium viele Jahre lang bei guter Lebensqualität mit einer Therapie kontrolliert werden. Dies gilt insbesondere für Patienten mit hormonrezeptorpositiven Krankheiten und nichtviszeralen Metastasen. Es wird angenommen, dass mit besserem Verständnis der am Ansprechen auf Chemotherapie und an einer erhöhten Wirksamkeit der Chemotherapie beteiligten molekularen Faktoren die Behandlungen das Überleben dieser Patienten signifikant erhöhen und bei bestimmten Patienten möglicherweise sogar dazu führen, dass sie eine normale Lebenszeit haben. Jedoch stellt trotz dieser positiven Tendenzen derzeit eine Behandlung bei den meisten Patienten mit metastatischem Brustkrebs lediglich eine Möglichkeit einer zeitlich beschränkten Kontrolle des Wachstums des Krebses dar.
B. Behandlung des metastatischen Brustkrebses
Die systemische Behandlung mit Medikamenten bei fortgeschrittenem Brustkrebs wird aufgrund der geringeren Toxizität im Vergleich zu den zytotoxischen Chemotherapien normalerweise mit hormonaler Therapie begonnen. Die auf Grundlage der klinischen Merkmale geeignetesten Kandidaten für hormonale Therapie sind Patienten mit einem hormonrezeptorpositiven Tumor (insbesondere wenn beide Hormonrezeptoren positiv sind), mit langer krankheitsfreier Überlebenszeit, vorangegangem Ansprechen auf Hormontherapie und nichtviszeraler Krankheit. Trotz kurzem Ansprechen in der Zweit- oder Drittlinienbehandlung auf alternative hormonelle Therapien (z. b. sekundäres Anti-Östrogen oder Aromatasehemmer) werden fast alle Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium des Brustkrebses refraktär gegenüber einer hormonellen Therapie und die Krankheit schreitet weiter fort.
Aufgrund der höheren Toxizität werden Patienten mit einer gegenüber der hormonellen Therapie refraktären Erkrankung mit zytotoxischer Chemotherapie behandelt. Zusätzlich wird diese häufig als Erstlinientherapie für Patienten mit viszeraler metastatischer Erkrankung eingesetzt (z. B. Lungen oder Lebermetastasen), sowie für Patienten mit hormonrezeptornegativem Primärtumor, mit Knochenmarksbefall oder mit einem Tumor, der so schnell wächst, dass das Ansprechen auf die hormonelle Therapie nicht nachgewiesen werden kann. Kombinations-Chemotherapie für fortgeschrittenen Brustkrebs wird im Allgemeinen als wirksamer als die Behandlung mit nur einem Wirkstoff betrachtet. Jedoch haben randomisierte Studien gezeigt, dass ähnliche Ansprechraten bei Therapien mit nur einem Wirkstoff erreicht werden können.
Fortgeschrittener Brustkrebs wird derzeit als unheilbar betrachtet und fast alle verfügbaren Chemotherapeutika sind hinsichtlich einer Verwendung für die Behandlung dieser Erkrankung getestet worden. Von den vielen zytotoxischen Medikamenten scheinen Anthracycline (die TopoII-Inhibitoren sind), insbesondere Doxorubicin und sein Derivat Epirubicin sowie Taxane am wirksamsten zu sein. Die optimalen Behandlungspläne für die Behandlung mit en neueren Medikamenten Paclitaxel und Docetaxel (Taxane) müssen noch aufgestellt werden.
Neben den Anthracyclinen schließen weitere TopoII-Inhibitoren zytotoxische Wirkstoffe wie etwa Etoposid, Amsacrin und Mitoxantron ein. All diese Wirkstoffe sind auf das Topoisomerase-IIα-Enzym (TopoIIα) gerichtet und werden nun routinemäßig in der systemischen Behandlung von hämatologischen Krebserkrankungen und soliden Tumoren verwendet. Im Allgemeinen basieren die chemotherapeutischen Behandlungsarten für die meisten heilbaren bösartigen Erkrankungen wie etwa Lymphome und Leukämien sowie für Brustkrebs auf Wirkstoffen, die auf TopoIIα gerichtet sind.
Bei der Behandlung von Brustkrebs werden diese Verbindungen nicht nur Patienten mit metastatischer Erkrankung verabreicht, sondern auch zunehmend als Basis-Behandlung zu einer adjuvanten Chemotherapie verwendet. Die objektive Ansprechrate auf Anthracycline liegt bei metastatischem Brustkrebs bei Verabreichung allein oder in Kombination mit anderen zytotoxischen Medikamenten im Bereich von 40% bis 80%. Jedoch beträgt die vollständige Ansprechrate ungefähr 5-15% und bleibt bei diesen Patienten für gewöhnlich ein oder zwei Jahre lang bestehen. Der Anteil der Patienten mit vollständiger, Langzeit-Remission (d. h. mehrere Jahre) liegt unter 1%. Das Ansprechen erfolgt meistens nur teilweise (50-%ige Reduzierung der Tumormasse) und die Dauer liegt im Bereich von 6 bis 12 Monaten. Somit ist die Zahl der Patienten, die klinisch nicht objektive auf diese zytotoxischen Medikamente ansprechen, nach wie vor sehr groß. Bei diesen Patienten kann das Fortschreiten der Krankheit lediglich verzögert werden oder die Krankheit schreitet trotz der Behandlung fort. Ungefähr 40-60% der Brustkrebspatienten, die Anthracycline erhalten, erfahren im Verlauf der Therapie entweder eine Stabilisierung der Erkrankung oder entwickeln eine fortschreitende Erkrankung. Aus diesem Grund ist es notwendig, dass eine zuverlässige Unterscheidung zwischen Patienten getroffen werden kann, die wahrscheinlich auf die Therapie ansprechen und solchen, die wahrscheinlich eine primäre Resistenz gegenüber Anthracyclinen aufzuweisen.
Es ist einerseits wichtig, die Patienten, die wahrscheinlich auf die Therapie ansprechen werden zu identifizieren, es könnte aber sein, dass es noch weitaus wichtiger ist, die Patienten zu identifizieren, die wahrscheinlich nicht objektiv auf Anthracycline ansprechen werden, denn Tumore die resistent gegenüber Anthracyclinen sind, erwerben im Laufe einer Anthracyclintherapie auch eine Resistenz gegenüber weiteren Gruppen von zytotoxischen Medikamenten (d.h. die Tumoren werden kreuzresistent (multidrug resistant, MDR). Der MDR-Phänotyp bewirkt, dass Krebszellen resistent gegenüber praktisch jeder Art von zytotoxischer Chemotherapie (ausschließlich der Taxane) werden. Tatsächlich sind MDR-Tumorzellen sogar resistent gegenüber Wirkstoffen, die keine funktionale oder mechanistische Wechselwirkung mit TopoII-Inhibitoren aufweisen.
Der neueste Durchbruch in der Behandlung von bösartigen Erkrankungen des Menschen war die Einführung monoklonaler Antikörper, die spezifisch auf an der Pathogenese von Krebs beteiligte Gene abzielen. Der erste derartige Antikörper, der auf ein humanes Onkogen abzielt, ist Trastuzumab (HERCEPTIN^®, Gentech BioOncology, Roche) und wurde 1997 für die Behandlung von Brustkrebspatienten eingeführt. HERCEPTIN^® bindet spezifisch an die extrazelluläre Domäne auf HER-2 und unterdrückt die Wachstumfaktor-Signalübertragung über HER-2 und weitere Wachstumsfaktorrezeptoren, die mit HER-2 in Verbindung stehen.
In klinischen Studien wurde gezeigt, dass HERCEPTIN^® im Allgemeinen gut vertragen wird, wobei die häufigsten Nebenwirkungen bei ungefähr 40% der Patienten Schüttelfrost und Fieber waren (hauptsächlich bei der ersten Infusion). Jedoch führte HERCEPTIN^® bei Verabreichung zusammen mit Anthracyclinen bei den Patienten zu einem erhöhten Risiko für das Auftreten von kardiologischen Problemen. Insbesondere wurde berichtet, dass bei 27% der Patienten, die eine kombinierte Therapie mit HERCEPTIN^® und Anthracyclinen erhielten, kardiologische Nebenwirkungen auftraten, während bei lediglich 6% der Patienten, die ausschließlich mit Anthracyclinen behandelt wurden, kardiologische Probleme auftraten. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die nützlich für das Identifizieren von geeigneten Subjekten sind, die von einer Behandlung mit Anthracyclinen profitieren würden, auch wenn sie anfänglich als geeignet für eine Therapie mit HERCEPTIN^® eingestuft wurden. Die vorliegende Erfindung stellte auch Verfahren bereit (z.B. duale Tests für TopoIIα und HER-2/neu, die geeignet sind, um Patienten zu identifizieren, die HERCEPTIN^® ohne Anthracycline (oder andere TopoIIα-Inhibitoren) erhalten sollten.
C. TopoIIα und TopoIIα
Topoisomerasen sind Enzyme, die an der Lösung topologischer Probleme beteiligt sind, die während der verschiedenen Prozesse des DNA-Metabolismus auftreten, einschließlich der Transkription, der Replikation und der Chromosomensegregation während der Zellteilung. Aufgrund der Tatsache, dass sie diese vitalen Funktionen ausführen, sind Topoisomerasen notwendig für die Lebensfähigkeit jedes lebenden Organismus.
Topoisomerasen werden basierend auf ihrer katalytischen Aktivität in „Typ I" und „Typ II" unterteilt. Enzyme des Typs I bringen transiente einzelsträngige Bruchstellen in die DNA ein, führen einen intakten DNA-Strang durch den gebrochenen Strang hindurch und verkleben die Bruchstelle wieder. Enzyme des Typs II hingegen verursachen transiente doppelsträngige Brüche in einem Segment replizierter DNA und führen einen intakte Doppelstrang durch die gebrochene doppelsträngige DNA hindurch.
Von den verschiedenen Topoisomerase-Enzymen sind DNA-Topoisomerasen (TopoII) des Typs II von entscheidender Bedeutung für die Segregation neu replizierter Chromosomenpaare, bei der Verkürzung der Chromosomen, beim Ausbilden der Chromosomengerüsten sowie bei der Veränderung der DNA-Superhelizität. Die Reaktion des Hindurchführens der ineinander verflochtenen doppelsträngigen DNA durch einen doppelsträngigen Bruch spricht für ein „Zwei-Tore-Modell" („two-gate-model"). In diesem Modell bildet TopoII eine mit ATP modulierte Klammer, durch die das erste Segment der DNA bindet, und das dann das hindurch zu führende DNA-Segment fängt. Sobald das transportierte Segment durch den Bruch in der gebundenen DNA hindurchgeführt wurde, kann das Enzym durch ein weiteres Tor auf der anderen Seite des Moleküls passieren, während gleichzeitig der doppelsträngige Bruch in der gebundenen DNA durch das Enzym wieder verschlossen wird. Gemäß diesem biochemischen Modell, in dem man sich das Enzym als eine mit ATP modulierte Zange mit zwei Zangen an gegenüberliegenden Enden, die mit einem Drehgelenk verbunden sind, vorstellt, ist die Kristallstruktur von TopoII ein herzförmiges dimerisches Protein mit einem großen Loch in der Mitte.
Das eukaryotische TopoII ist ein homodimerisches Enzym, das in zwei Isoformen in menschlichen Zellen existiert, der Großteil davon TopoIIα mit 170 kd und dem TopoIIα mit einer Länge von 180 kd. Diese beiden Enzyme sind weitestgehend homolog (72%), sind aber Produkte von verschiedenen, jeweils in den Chromosomen 17q21-q22 und 3p lokalisierten Genen. Die Funktionsweise sowie die Expression dieser beiden Gene sind unterschiedlich. Während die TopoIIα-Expression Zellzyklus-abhängig ist, zeigt die β-Isoform keine Abhängigkeit vom Zellzyklus. Die übermäßige Expression von TopoIIα findet in der G2/M-Phase des Zellzyklus statt und fällt am Ende der Mitose auf ein Minimum ab. Die genaue Funktionsweise von TopoIIα ist noch immer weitgehend unbekannt.
TopoIIα hat beträchtliches klinisches Interesse geweckt, da es es ein molekulares Ziel für viele antineoplastische und antimikrobielle Medikamente darstellt. Unter den zytotoxischen Medikamenten, die hemmend auf TopoII wirken, sind einige der wichtigsten Krebsmedikamente wie etwa Anthracycline (z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Idarubicin), Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid), Actinomycin und Mitoxantron. Obwohl diese Krebsmedikamente keine strukturelle Homologie aufweisen, wirken sie alle derart, dass sie topoIIα kovalent gebundenen in einem reversiblen Komplex mit der DNA halten, der als der "spaltbare Komplex" bezeichnet wird. Die Stabilisierung von spaltbaren Komplexen verhindert die Religation der doppelsträngigen Brüche. Dies wandelt TopoIIα in ein physiologisches Toxin um und führt zu hohen Niveaus von dauerhaft bestehenden doppelsträngigen Brüchen, die letztlich von Prüfpunkten (checkpoints) im Zellzyklus detektiert werden und schließlich zum Zelltod durch Apoptose führen.
Es wurde in vitro gezeigt, dass eine Korrelation zwischen der Sensitivität gegenüber TopoII-Inhibitoren und dem Expressionsniveau von TopoIIα in Krebszellen besteht. Zellen mit niedrigen Konzentrationen von TopoIIα-Protein im Zellkern bilden weniger TopoII-vermittelte DNA-Strangbrüche und sprechen weniger auf auf topoII gerichtete Medikamente an als Zellen, die hohe Mengen von TopoIIα enthalten. Dieser Zusammenhang wurde als erstes durch das Vergleichen der Chemosensitivität bestimmter Zelllinie bezüglich der Expression von TopoIIα erstellt, in jüngster Zeit wurde dieser Zusammenhang auch durch spezifischere Verfahren bestätigt. Diese Studien haben gezeigt, dass sensitive Zelllinien durch Transfektion entweder mit antisense-Topo IIα-mRNA oder mutanter TopoIIα-cDNA resistent gemacht werden können. Die Transfektion von exogener Wildtyp-Topo IIα-mRNA widerum kehrt die primäre Resistenz gegenüber topoII-Inhibitoren in eine Sensitivität um.
D. Detektion von TopoIIα
Detektion der Amplifikation des Topoisomerase-IIa-(topoIIα)-Gens kann durch Anwenden einer in situ-Hybridisierung der Erfindung durchgeführt werden. Sonden für TopoIIα können zum Beispiel durch das Screenen einer PI-Bibliothek und das Bestätigen der Art der Sonde durch das Durchführen einer PCR mit TopoIIα-spezifischen Primern (siehe Beispiele 1 und 3) erhalten werden. BAC oder PAC-Klone können ebenfalls für die Herstellung von TopoIIα-Sonden verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine TopoIIα-Sonde, die geeignet ist, die TopoIIα-Gensequenz spezifisch zu detektieren (ohne fälschliches Detektieren von HER2/neu) verwendet. Es gilt zu beachten, dass die TopoIIα-Sonden die eine kurze Zeit lang von Vysis (Downers Grove, IL) vertrieben wurden, nicht geeignet waren, genau zwischen TopoIIα und HER1/neu zu unterscheiden. Jedoch stellt die vorliegende Erfindung derartige spezifische Sonden (z.B. die exemplarische, in Beispiel 10 beschriebene Sonde, die bei Zymed Laborstories erhältlich ist), bereit.
E.HER und HER-2/neu
Das HER-2/neu Onkogen (auch bekannt als erbB-2) codiert für ein transmembranes Glycoprotein (HER2) mit 185-kDA, das zur Familie der Rezeptortyrosinkinasen (RTK, receptor tyrosine kinase) der Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF, epidermal growth factor) gehört. Die HER-2-Familie der RTKs besteht aus vier Mitgliedern: HER-1, HER-2, HER-3, und HER-4. Die RTKs sind Zelloberflächenenzyme, die aus einer einzelnen transmembranen Domäne bestehen, die eine intrazelluläre Kinasedomäne von einer extrazellulären, Liganden-bindenden Domäne trennt. Ligandenbindung an die extrazelluläre Domäne induziert die Bildung von Rezeptordimeren (Homodimer oder bevorzugt Heterodimer), die wesentlich für die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinaseaktivität sind. Dies führt anschließend zu einer Aktivierung von Zielproteinen, die eine komplexe Signalkaskade initiieren.
Obwohl eine große Anzahl von möglichen Kandidatenliganden (EGF, Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor, Transforming Growth Factor-α, Amphiregulin, Betacellulin, Epiregulin und eine große Familie unterschiedlicher Neureguline, unter anderem) HER-2 binden, bindet keines dieser Peptide mit hoher Affinität an HER-2. Jedoch sind EGF-ähnliche Liganden bivalent. Obwohl HER-2 kein Rezeptor mit hoher Affinität zu einem der gezeigten Liganden für das Binden an ErbBs ist, ist er der bevorzugte Co-Rezeptor mit niedriger Affinität für EGF-ähnliche Liganden. Dadurch ist er das bevorzugte Partner-Dimer für die drei anderen ErbBs, sobald diese primären Rezeptoren von ihren Liganden besetzt sind. Somit können wenigstens 20 Wachstumsfaktoren HER-2-bezogene Signalverarbeitungswege nutzen.
HER-2 ist bei der Induktion des Wachstumsignals durch den mit dem Liganden besetzten ErbBs essentiell, da er 1) der bevorzugte Heterodimerisierungspartner für sämtliche Liganden-bindenden ErbB-RTKs ist und 2) HER-2-enthaltende Heterodimere auch durch extrem hohe, durch Wachstumsfaktoren induzierte Signalverarbeitungsfähigkeit und Mitogenese charakterisiert sind. Die hohe Signalübertragungspotenz von Heterodimeren, die HER-2 enthalten, wird wiederum auf mehrere spezifische Merkmale zurückgeführt: 1) HER-2 reduziert die Liganden-Dissoziation von seinem Hochaffinitätsrezeptor; 2) HER-2 induziert seitliche Signalverarbeitung durch Rekrutieren und Aktivieren weiterer (unbesetzter) ErbB-Rezeptoren; und 3) HER-2 verarbeitet wirksam Signale durch Proteinkinasen (wie etwa MAP und Jun N-terminal), die besonders wirksame Mitoseaktivatoren sind. Zusätzlich werden HER2-enthaltende Rezeptordimere von den Endosomen zurück an die Zelloberfläche rezykliert, anstatt von Lysosomen abgebaut zu werden. Somit können diese Dimere an der Zelloberfläche überrepräsentiert sein.
Aufgrund dieser Merkmale haben die HER-2 Rezeptoren ein onkogenes Potential das durch mehrere genetische Mechanismen aktiviert werden kann, einschließlich Punktmutationen, Trunkierung des Proteins und der Amplifikation des nicht mutierten Proto-Onkogens. Jedoch ist die Genamplifikation bei weitem der häufigste Mechanismus für die Aktivierung des onkogenen Potentials von HER-2. Die Amplifikation von HER-2/neu geschieht bei ungefähr 20 bis 35% der Fälle von invasivem Brustkrebs und führt zu einer Überexpression des Proteins. Somit erhöht die Amplifikation von HER-2/neu die Wahrscheinlichkeit, dass HER-2 heterodimere Komplexe mit den anderen ErBs bildet. Dies ist wiederum ein Zeichen dafür, dass mehrere Dutzend wirksamer Liganden von HER-2 abhängige Signalverarbeitungswege nützen können, was zu der onkogenen Aktivierung der Zellen führt.
Der Zusammenhang zwischen HER-2/neu und der Prognose für Brustkrebspatienten wurde auf breiter Basis erforscht (z. B. Ravdin und Chamness, Gene, 159: 19-27, [1995]). Leider wurde gefunden, dass eine Amplifikation von HER-2/neu eine schlechte klinische Prognose nach sich zieht.
Jedoch ist nach wie vor umstritten ob HER-2/neu ein unabhängiger prognostischer Faktor ist, weil sowohl diese These unterstützende Ergebnisse als auch solche, die dagegen sprechen veröffentlicht wurden (z. B. Ravdin und Chamness, oben).
Der bekannteste Aktivierungsmechanismus für HER-2/neu liegt in der Amplifikation des Gens bei 17ql2-q21. Die zusätzliche Kopien des HER-2/neu-Onkogens liegen in Krebszellen als extrachromosomale, winzige doppelte Chromosomen oder innerhalb der Chromosomen in homogen färbenden Bereichen.
Der Vorhersagewert des HER-2/neu ist ebenfalls erforscht worden, wenn auch nicht so breit wie der Prognosewert, sowohl im Zusammenhang mit adjuvanter Chemotherapie als auch bei Chemotherapie für Brustkrebs im fortgeschrittenen Stadium (z.B. McNeil, C.,J: Natl. Cancer Inst., 91: 100, [1999]). HER-2/neu scheint ein Prädiktor für eine ungünstige klinische Prognose bei der adjuvanten Chemotherapie mit einer herkömmlichen Cyclosphosphamid-Methotrextat-Fluorouracil-Kombination zu sein.
Der Zusammenhang zwischen amplifiziertem HER-2/neu und Chemotherapie mit TopoII-Inhibitoren bei Brustkrebs ist umstritten. Die meisten Studien haben amplifiziertes HER-2/neu mit der chemischen Beständigkeit gegenüber TopoII-Inhibitoren in Verbindung gebracht (Siehe, z.B. Tetu et al., Mod. Pathol., 11:823 [1998]), es gibt jedoch auch klinische Studien, die berichten, dass es entweder keinen Zusammenhang gibt (siehe, z.B. Clahsen et al., J; Clin. Oncol., 16: 470 [1998]), oder sogar eine Tendenz für höhere Ansprechraten bei HER-2/neu-amplifizierten Brusttumoren (Siehe z.B. Thor et al, J. Natl. Cancer Inst. 90: 1346[1998]).
Die in Beispiel 5 von WO 03/025127 gezeigten Ergebnisse unterstützen die Schlussfolgerung, dass HER-2/neu-Amplifikation nicht mit dem klinischen Ansprechen auf Topoisomerase II-Inhibitoren im Zusammenhang steht.
F. Detektion von HER-2 und HER-2/neu
Wie oben erläutert, werden die Amplifikation des HER-2/neu-Onkogens und die damit einhergehende Überexpression derzeit als wichtiger prognostischer Biomarker beim Brustkarzinom in Verbindung gebracht und können auch nützliche determinierende Faktoren für das Ansprechen auf hormonelle oder zytotoxische Chemotherapie sein. Die klinische Bedeutung von HER-2/neu-Diagnostik ist mit der zunehmenden Verwendung des neuen Krebsmedikaments Trastuzumab (HERCEPTIN, ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen den extrazellulären Teil des HER-2/neu-Proteinprodukts) noch bedeutsamer geworden. Jedoch ist Therapie mit Trastuzumab lediglich bei Patienten wirksam, in deren Tumoren eine Amplifikation und/oder Überexpression von HER-2 vorliegt (Shak. S., Semis. Oncol., 6: 71 [1999]).
Somit werden HER-2-Assays nun, zusammen mit den Assays für Hormonrezeptoren und Tumorproliferationsraten, zunehmend ein wichtiger Teil der Brustkrebsdiagnostik.
Die frühesten Studien über HER-2 verwendeten Southern Blotting und Western Blotting für die Detektion einer HER-2/neu Genamplifikation und einer Überexpression des HER-2-Proteins. Zusätzlich wurden viele HER-2-Studien unter Verwendung der Immunhistochemie (IHC) durchgeführt, mit der die HER-2-Proteinüberexpression auf der Zellmembran detektiert wird. Ohne Amplifikation des HER-2/neu-Onkogens ist die Proteinexpression im Allgemeinen niedrig und wird durch IHC nicht detektiert.
Jedoch treten bei IHC einige technischen Artefakte sowie Sensitivitätsunterschieden zwischen verschiedenen Antikörpern und Gewebe-Vorbehandlungen auf. Standardisierte Reaktionskits sind kürzlich vorgestellt worden (z. B. HERCEP-TEST, DAKO Corp.), es wurden jedoch unterschiedliche Ergebnisse aus dem methodologischen Vergleich derselben berichtet (Jiminez et al., Mod. Pathol., 13: 37 [2000]). Weitere handelsübliche HER-2 Antikörper schließen zwei monoklonale Antikörper von Novocastra Laborstories ein, Klon CB-11 und NCLB12 und die oben in Abschnitt II beschriebenen Antikörper. Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) quantifiziert die Anzahl der Genkopien im Zellkern von Krebszellen. Seit den anfänglichen Experimenten für das Detektieren von HER-2/neu Amplifizierung durch FISH wurde die Genauigkeit dieser Methode sowohl in frisch eingefrorenem als auch in in Paraffin eingebettetem Tumormaterial in einer Anzahl von Berichten bestätigt (Mitchell, M. S., Serin. Oncol., 26:108 [1999]). FISH wird im Allgemeinen entweder unter Verwendung von einfarbiger (nur HER-2/neu-Sonde) oder zweifarbiger Hybridisierung durchgeführt (unter Verwendung von HER-2/neu und Kontrollsonden (z. B. gleichzeitig Chromosom 17-Zentromersonden), wobei das letztere Verfahren eine Unterscheidung zwischen wirklicher HER-2/neu-Amplifikation von der chromosomalen Aneuploidie einfacher macht. FISH unter Verwendung von ganzen Zellen (z. B. kultivierten Zellen, gemahlenem Gewebe oder Kontaktimprint-Proben (imprint touch specimen) von Tumoren) wird als zuverlässig betrachtet, die Verwendung von Gewebeschnitten verkompliziert jedoch die quantitative Eigenschaft von FISH aufgrund der nuklearen Trunkierung, d.h. aufgrund der Tatsache, dass die Gewebe, wenn sie für das Färben vorbereitet werden, in Scheiben geschnitten werden). Käuflich erwerbbare FISH-Sonden schließen Zymeds SPOT-LIGHT HER-2/neu-Sonde (Zymed Laborstories, San Francisco, CA), und Vysis's LSI HER-2/neu SpectrumOrange-Sonde (Vysis, Downer's Grove, IL) ein.
Die Hauptschwierigkeit bei der Verwendung von FISH für die Verwendung in der klinischen Diagnostik ist die Tatsache, dass Fluoreszenzmikroskopie erforderlich ist. Auswertung von FISH erfordert im Allgemeinen ein modernes Fluoreszenz-Mikroskop, das mit 60X- oder 100X- Ölimmersionsobjektiven von hoher Qualität und Multibandpass-Fluorereszenzfiltern ausgerüstet ist. Zudem müssen die Hybridisierungsergebnisse für gewöhnlich mit teuren CCD-Kameras aufgenommen werden, weil die Fluoreszenzsignale innerhalb weniger Wochen verblassen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umgeht viele dieser Probleme durch das Bereitstellen von schnellen Verfahren und Zusammensetzungen für das Detektieren von HER-2/neu, die keine Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie erforderlich machen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung HER-2/neu-Detektionssonden für die Chromogene In situ-Hybridisierung (CISH) sowie entsprechende Verfahren bereit (Siehe Beispiele 1, 2 und 3), die eine enzymatische Detektion von HER-2/neu ermöglichen, bereit. Wie in diesen Beispielen beschrieben stellt die vorliegende Erfindung HER-2/neu Sondenbibliotheken bereit, die geeignet für eine Detektion durch Hellfeldmikroskopie sind, bereit. Derartig Sonden und Detektionsreagenzien können bei Zymed Inc. (South San Francisco, CA) erworben werden. Ein weiterer Vorteil der HER-2/neu-Sonde ist die Fähigkeit, CISH und Histopathologie gleichzeitig mit derselben Gewebeprobe durchzuführen (Siehe Beispiel 3). Ein weiterer Vorteil des Verwendens von CISH ist die Möglichkeit, CISH-Signale und Zellmorphologie gleichzeitig anzuzeigen.
G. Beziehung HER-2/neu – TopoIIα
Der Zusammenhang zwischen HER-2/neu- und TopoIIα-Amplifikation wurde in jüngster Zeit erforscht. Es wurde nämlich gefunden, dass TopoIIα in Brusttumoren mit HER-2/neu-Amplifikation verstärkt auftritt [z.B., Smith et al., Oncogene, 8 : 933 (1993)]. Dadurch, dass TopoIIα und HER-2/neu auf Chromosom 17 so nahe aneinander liegen, beinhaltet ein im Voraus hypothetisch vermuteter, einfacher molekularer Mechanismus die Amplifikation des Chrosomomenabschnitts, auf dem die beiden Gene liegen [Murphy et al., Int.J. Cancer, 64: 18-26 (1996), Hoare et al., Br.J. Cancer, 75: 275 (1997)]. Dies sollte zu vergleichbaren Anzahlen von Genkopien für HER2/neu und topo IIα führen. Jedoch wurden während der Arbeiten des Anmelders der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Fiber-FISH-Analyse ungleiche Kopienanzahlen für HER2/neu und topo IIα gefunden. Das Vorliegen zweier separater Amplicons für nahe aneinander liegende Gene wie etwa HER-2/neu und TopoIIα war unerwartet.
Der Zusammenhang zwischen der Amplifikation von HER-2/neu und TopoIIα sowie das Ansprechen von Brustkrebszelllinien auf Topoisomerase-Inhibitoren wurde ebenfalls in jüngster Zeit erforscht.
Zum Beispiel berichtete eine Gruppe, dass eine Brustkrebszelllinie mit Amplifikation sowohl von HER-2/neu als auch von TopoIIα am meisten auf m-AMSA und Mitoxantron ansprach [Smith et al., siehe oben]. Im Anschluss an die Arbeiten mit Brustkrebszelllinien wurde die Wirkung von Topoisomerase-Inhibitoren auf primäre Brustkrebszellen in primären Brustkrebszellen, in denen eine Amplifikation von HER-2/neu und TopoIIα festgestellt wurde, hin untersucht [Jarvinen, et al., British Journal of Cancer, 77 (12): 2267 (1998)]. Jedoch bestätigten die primären Brustkrebszelllinien mit Amplifikation sowohl von HER-2/neu als auch TopoIIα nicht die vorher berichteten Ergebnisse der Brustkrebszelllinien, sondern zeigten kein positives Ansprechen auf Topoisomerase-Inhibitoren.
H. HER-2/neu-TopoIIα-Status als Diagnosemarker
Hierin werden durch das Detektieren einer Amplifikation der Kopienanzahl sowohl von HER-2/neu als auch von TopoIIα Verfahren für das Bestimmen, ob ein Kandidatensubjekt geeignet für eine Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren oder anti-HER2-Immuntherapie ist, bereitgestellt. Durch das Bereitstellen eines Kandidatensubjekts mit Verdacht auf Brustkrebs und das Detektieren eine Kopienzahl sowohl für HER-2/neu als auch TopoIIα in den Brustkrebszellen werden Verfahren für das Identifizieren eines Kandidaten für eine Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren bereitgestellt. In dieser Hinsicht erlaubt das Verfahren durch das Feststellen der Amplifikation der Kopienanzahl sowohl von HER-2/neu als auch TopoIIα eine Identifizierung des Kandidatensubjekts als geeignet für die Behandlung mit einem Topoisomerase-II-Inhibitor. In einigen Ausführungsformen weist das Kandidatensubjekt Brustkrebszellen auf, bei eine amplifizierte Kopienanzahl für HER-2/neu festgestellt werden kann. (z. B. wurde bereits eine HER-2/neu-Amplifikation festgestellt). In weiteren Ausführungsformen wurde festgestellt, dass das Kandidatensubjekt eine HER2-Genamplifikation aufweist, jedoch keine TopoIIα-Genamplifikation. Diese Subjekte werden in einigen Ausführungsformen mit anti-HER2-Immuntherapie behandelt (z.B. HERCEPTIN) ohne gleichzeitige Topoisomerase-II-Inhibitoren (z.B. so, dass das aus einer kombinierten Behandlung mit HER2-Immuntherapie und Anthracyclinen erwachsende erhöhte Risiko kardiovaskulärer Nebenwirkungen verhindert wird). Anders gesagt werden Subjekte, bei denen gefunden wurde, dass sie über eine amplifizierte Anzahl von HER2-Genkopien verfügen, jedoch keine amplifizierte TopoIIα-Genkopienzahl, als geeignet für Topoisomerase-II-Inhibitor-freie (z.B. Anthracyclin-freie) anti-HER2-Antikörpertherapie (d.h. dem Subjekt werden keine Topoisomerase-II-Inhibitoren und anti-HER2-Antikörper im gleichen Zeitraum verabreicht, um zum Beispiel kardiologische Komplikationen, die bei mit Kombinationstherapie behandelten Patienten auftraten, zu verhindern).
In bestimmten Ausführungsformen wird das Detektieren mit für HER-2/neu und TopoIIα spezifischen Sonden durchgeführt. Man glaubt, dass es durch das Detektieren der Nukleinsäure von TopoIIα statt des exprimierten Proteinprodukts (z. B. durch Immunhistochemie) ermöglicht wird, eine Amplifikation sowohl von HER-2/neu als auch von TopoIIα als Diagnosemarker für Brustkrebszellen, die auf eine Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren ansprechen, zu nutzen. Insbesondere besteht eine mangelnde Korrelation zwischen dem TopoIIα-Genstatus und der immunhistochemischen Detektion (IHC).
Infolgedessen ist es durch das Feststellen der TopoIIα-Genexpression unter Verwendung von IHC-Detektion nicht möglich, einen Zusammenhang zwischen der Amplifikation sowohl von TopoIIα als auch von HER-2/neu für eine Vorhersage des Ansprechverhaltens von primären Brustkrebszellen auf Topoisomerase-II-Inhibitoren zu treffen. Somit wird ein Brustkrebsmarker offenbart, mit dessen Hilfe durch das Detektieren einer Kopienanzahl sowohl für HER-2/neu (z.B. unter Verwendung von IHC oder Nukleinsäuresoden) als auch TopoIIα (z.B. unter Verwendung von Nukleinsäure-Sonden) eine Aussage über das Ansprechen auf eine Anthracyclin-basierte Therapie getroffen werden kann. Somit werden verbesserte Verfahren für das Identifizieren von Brustkrebspatienten, die geeignet für eine Behandlung mit Topoisomerase-II-Inhibitoren sind sowie von Patienten, die keine Topoisomerase-II-Inhibitoren (z.B. Anthracycline) erhalten sollten, offenbart. Somit kann bei Patienten, die Kandidaten für eine anti-HER2-Immuntherapie wären (die z.B. eine erhöhte HER2-Expression aufweisen und/oder eine erhöhte HER2-Genamplifikation) die jedoch keine Amplifikation des TopoIIα-Gens aufweisen (bei denen es z.B. unwahrscheinlich ist, dass sie von einer Behandlung mit Anthracyclinen profitieren), eine Gabe von anti-HER2-Antikörpern erfolgen, ohne dass die Nebenwirkungen von Anthracyclinen sowie das erhöhte Risiko von kardiovaskulären Problemen in Kauf genommen werden müssen, indem diesen Patienten keine Anthracycline verabreicht werden.
Insbesondere erlaubt die offenbarte Verfahrensweise eine Einordnung der Patienten, bei denen eine HER-2/neu-Amplifikation (d.h. ein Indikator für eine Behandlung mit HERCEPTIN^®) gefunden wurde. Konkret geht es darum, Tests durchzuführen, um zu bestimmen, ob eine Behandlung mit Anthracyclinen geeignet ist (sowohl Amplifikation von HER-2/neu als auch TopoIIα) oder ob eine Behandlung mit HERCEPTIN^® angezeigt ist (nur HER-2/neu-Amplifikation). Diese Eigenschaft ist von besonderer Wichtigkeit in Hinblick auf die Studien am Menschen, in denen schwerwiegende, mit der gemeinsamen Gabe von Anthracyclinen und HERCEPTIN^® in Verbindung stehende Risiken festgestellt wurden.
IV. Kombinierte CISH und IHC
Des Weiteren werden hierin Verfahren, Zusammensetzungen und Kits für eine kombinierte chromogene in situ-Hybridisierung (CISH) und Immunhistochemie (IHC) offenbart. Die kombinierten CISH- und IHC-Verfahren ermöglichen das Bestimmen einer umfangreichen und verwertbaren Information bezüglich einer Gewebeprobe (und eines Patientenstatus). In bestimmten Ausführungsformen werden CISH und IHC mit denselben Gewebeproben durchgeführt (z.B. auf demselben Teil der Gewebeprobe oder auf nebeneinander liegenden Abschnitten). In weiteren Ausführungsformen werden CISH und IHC mit verschiedenen Gewebeproben durchgeführt, jedoch stammen die Gewebeproben aus derselben biologischen Probe (z.B. aus derselben Probe aus einer Brustkrebsbiopsie). In besonderen Ausführungsformen werden CISH und IHC gleichzeitig oder fast gleichzeitig durchgeführt (z.B. mit derselben Gewebeprobe oder mit separaten Gewebeproben aus derselben biologischen Probe). In bevorzugten Ausführungsformen wird CISH zuerst und anschließend IHC durchgeführt.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird eine biologische Probe sowohl mit CISH als auch mit IHC getestet (z.B. um das Vorliegen oder das Nicht-Vorhandensein einer HER2-Genamplifikation und HER2-Überexpression zu bestätigen). In bestimmten Ausführungsformen wird eine Gewebeprobe (z.B. eine Probe aus einer Brustkrebsbiopsie) vor der Anwendung (oder der Empfehlung) einer anti-HER2-Antikörpertherapie (z.B. einer Therapie mit HERCEPTIN) auf eine HER2-Genampflikation durch CISH und einer HER2-Überexpression durch IHC hin untersucht.
In bestimmten Ausführungsformen werden CISH und IHC mit demselben Gewebeschnitt durchgeführt.
Zum Beispiel können die ersten Schritte von CISH (z.B. Vorbehandlung, Hybridisierung und Waschen) zunächst auf dem Gewebeschnitt durchgeführt werden. Dann können der zweite Teil von CISH und IHC ungefähr oder genau gleichzeitig erfolgen. Zum Beispiel können unterschiedliche Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel können die CISH-Antikörper aus einer ersten Art (z.B. Maus) gewonnen werden und die IHC-Antikörper können aus einer zweiten Art (z.B. Hase) gewonnen werden. Auch können die für CISH und IHC verwendeten Detektionsenzyme unterschiedlich sein, so dass die Signale einzeln ausgewertet werden können. Zum Beispiel können die CISH-Antikörper HRP-konjugiert sein, während die IHC-Antikörper AP-konjugiert sein können. In dieser Hinsicht können bei CISH-Verfahren Substrate wie etwa DAB verwendet werden, während bei CISH-Verfahren andere Substrate wie etwa FAST RED verwendet werden können.
V. Subtraktions-Sonden
Die vorliegende Erfindung schließt Subtraktions-Sonden (z.B. Subtraktions-Sondenbibliotheken) ein, die für CISH geeignet sind. In bestimmten Ausführungsformen sind die Sondenbibliotheken im wesentlichen frei von repetitiven Sequenzen (z. B. ALU und LINE-Elementen). Zum Beispiel sind in einigen Ausführungsformen wenigstens 90% der repetitiven Sequenzen aus den Sondenbibliotheken entfernt (z.B. umfassen die Sondenbibliotheken zu 10% oder weniger repetitive Sequenzen). In weiteren Ausführungsformen sind wenigstens 95% der repetitiven Sequenzen aus den Sondenbibliotheken entfernt (z.B. umfassen die Sondenbibliotheken zu 5% oder weniger repetitive Sequenzen). Die CISH-Verfahren der vorliegenden Erfindung werden mit Subtraktions-Sondenbibliotheken durchgeführt. Insbesondere ermöglicht es in bestimmten Ausführungsformen die Verwendung von Subtraktions-Sonden, ein klares Signal beim Durchführen von CISH-Verfahren (z. B. bei Proben aus einer Krebsbiopsie) zu erhalten.
In einigen Ausführungsformen werden die Subtraktions-Sondenbibliotheken im Wesentlichen wie in WO 0026415 von Fletcher et al. beschrieben. In bestimmten Ausführungsformen werden die Subtraktions-Sondenbibliotheken gemäß des folgenden Ablaufs durchgeführt. Zunächst werden Klone (z.B. YACs, BACs, oder PACs) ausgewählt, die ein Gen von Interesse einfassen oder die sich in Sondenpaarbibliotheken auf jeder Seite eines Gens von Interesse befinden.
Danach wird der Klon in kleinere Stücke (z. B. Fragmente von 0,1-8 kb) fragmentiert (z.B. durch Ultraschallbehandlung), um die Sondenbibliothek zu bilden. Dann werden in bestimmten Ausführungsformen Adapter an die Enden der Fragmente gebunden (in einigen Ausführungsformen werden keine Adapter verwendet). Danach wird PCR mit den Fragmenten durchgeführt (z.B. unter Verwendung von Primern, die für die Adapter oder die Random-Primer spezifisch sind). Daraufhin wird Gelelektrophorese und Reinigung durchgeführt, um eine Fragmentbibliothek in einem vorgegebenen Bereich (z. B. 0,5-4 kb) auszuwählen. Danach wird ein Subtraktionsschritt mit der markierten Repeat-Nukleinsäure (Driver-Nukleinsäure) (z. B. Biotin-markierte COT-1-DNA) durchgeführt. Die markierte Driver-Nukleinsäure kann dann mit der Fragmentbibliothek hybridisieren (Tracer-Nukleinsäure). Die Driver-Nukleinsäure hybridisiert mit den Fragmenten, die komplementäre repetitive Sequenzen enthalten (und hybridisiert im Allgemeinen nicht mit Fragmenten die diese repetitiven Fragmente nicht enthalten). Die Mischung wird dann einem festen Träger (z.B. Kugeln) ausgesetzt, der mit einem zweiten, für den Marker der Driver-Nukleinsäure spezifischen Marker konjugiert ist. Somit werden die Nukleinsäure und die die repetitiven Sequenzen enthaltenden Fragmente mit der Driver-Nukleinsäure hybridisiert und aus der Reaktionslösung entfernt. Infolgedessen die meisten repetitiven Sequenzen aus der verbleibenden Fragmentbibliothek physikalisch subtrahiert. Die verbleibende Subtraktionsbibliothek kann weitere PCR-Durchgänge (z.B. 3 zusätzliche PCR-Durchgänge) durchlaufen und dann mit einem gewünschten Marker versehen werden (z.B. Digoxigenin). Die Subtraktions-Sondenbibliothek kann in in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden und benötigt für gewöhnlich keinen Schritt des Blockens (z.B. müssen die Sonden nicht mit repetitiven Sequenzen geblockt werden, und die Gewebeprobe darf auch nicht mit repetitiven Sequenzen geblockt werden).
In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine HER2-Gensondenbibliothek bereit (siehe, z.B. Beispiel 1). In bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Sondenbibliothek 90%, bevorzugt 95% repetitive Sequenzen). In einigen Ausführungsformen ist die HER1-Genbibliothek spezifisch für das HER2-Gen und ist geeignet, eine HER2-Genamplifikation zu detektieren. In besonderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine TopoIIα-Gensondenbibliothek (siehe z.B. Beispiel 3) bereit. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Sondenbibliothek 90%, bevorzugt 95% nicht-repetitive Segmente. In weiteren Ausführungsformen ist die TopoIIα-Genbibliothek spezifisch für das TopoIIα-Gen (z. B. detektiert nicht fälschlicherweise eine HER2-Genamplifikation) und ist geeignet, eine TopoIIα-Genamplifikation zu detektieren. In zusätzlichen Ausführungsformen verwendet die vorliegende Erfindung eine EGFR-Gensondenbibliothek (siehe z.B. Beispiel 5). In bevorzugten Ausführungsformen umfasst diese Sondenbibliothek 90%, bevorzugt 95% nicht-repetitive Segmente. In einigen Ausführungsformen ist die EGFR-Sondenbibliothek spezifisch für das EGFR-Gen und ist geeignet, eine EGFR-Genamplifikation (durch CISH) durchzuführen. In weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine N-MYC-Sondenbibliothek (siehe z.B. Beispiel 7) bereit. In bestimmten Ausführungsformen umfasst die N-MYC-Sondenbibliothek 90%, bevorzugt 95% nicht-repetitive Segmente. In einigen Ausführungsformen ist die N-MYC-Sondenbibliothek spezifisch für das N-MYC-Gen und ist geeignet, eine N-MYC-Genamplifikation zu detektieren.
In einigen Ausführungsformen verwendet die vorliegende Erfindung Sondenpaare für Subtraktionsbibliotheken für das Detektieren von Gentranslokationen. In bestimmten Ausführungsformen sind die Sondenpaare „getrennte" Sondenpaare und sind derart ausgestaltet, dass sie mit den zentromerischen und telomerischen Bereichen außerhalb der Bruchstellen von Ziel-Genen (z. B. ABL- und SYT-Gene) hybridisieren. Zusätzliche Details zu getrennten ABL-Sondenpaaren und Detektion von Krankheiten werden untenstehend im Abschnitt VI bereitgestellt. Die Bruchstellen befinden sich zwischen der Lücke der zentromerischen und der telomerischen Sonden, so dass alle (oder die meisten) Translokationen detektiert werden. Getrennte Sondenpaare weisen in einer normalen Zelle ohne Translokation zwei Paare von Punkten auf (z. B. ein Punkt hat zwei nebeneinander liegende Punkte). Die beiden Punkte zeigen in CISH für jedes Paar zum Beispiel zwei verschiedene Farben. Auch mit getrennten Sonden zeigt eine Zelle mit Translokation 2 Punktpaare. Ein Paar weist zwei nebeneinander liegende Punkte auf, die das normale Chromosom in der Zelle darstellen, das andere Punktpaar ist getrennt und stellt das translokalisierte Chromosom in der Zelle dar.
VI. ABL-Sondenpaare und Detektieren von BCR-ABL-Translokationen
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung ABL-Sondenpaare bereit, die zum Beispiel für das Detektieren von BCR-ABL-Translokationen verwendet werden können. Ein Beispiel dafür, wie getrennte ABL-Sondenpaare hergestellt werden, wird mit Beispiel 6 bereitgestellt. Das markierte ABL-Sondenpaar kann eine BCR-ABL-Translokation mittels ISH (z.B. CISH oder FISH) detektieren, zum Beispiel Chronische Myeloische Leukämie (CML). Das Färbungsmuster bei diesen Tumorzellen unterscheidet sich deutlich von dem in normalen Zellen. Im ABL-Gen auftretende Translokationen (4) werden zum Beispiel bei CML, akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), akuter nicht-lymphozytischer Leukämie (ANLL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) gefunden. Bruchstellen in dem ABL-Gen sind über einen Bereich von 200 kb (6) variabel. Die ABL-Translokations-Sondenpaare sind in einigen Ausführungsformen in der Lage, sämtliche bisher berichtete ABL-Translokationsarten zu detektieren. Beispiele für ABL-Translokationen, die mittels ABL-Sondenpaaren detektiert werden können, werden untenstehend beschrieben.
i. ABL-Gen (Abelson murine leukemia oncogene) und Protein
Das ABL-Protoonkogen erstreckt sich über 230 kb genomischer DNA, weist 12 Exons auf (5) und ist entweder als mRNA-Transkript von 6 oder 7 kb exprimiert, mit alternativ gespleißten ersten Exons, Exon 1b und 1a jeweils mit den herkömmlichen Exons 2-11 gespleißt. Exon 1b ist ein 5-Prime von ungefähr 200 kb von Exon 1a (5). Das sehr lange Intron ist ein Ziel für die Translokation bei Leukämie (siehe Bernards et al., 1987, Molec. Cell. Biol. 7: 3231-6, hierin durch die Bezugnahme darauf inkorporiert). Bruchstellen in dem ABL-Gen sind über einen Bereich von ungefähr 200 kb hinweg (5) variabel und treten oft zwischen den beiden alternativen Exons 1b und 1a auf, manchmal am 5'-Ende von 1b oder am 3'-Ende von 1a. Eine Bruchstelle in dem Intron zwischen Exons a2 und a3 des ABL-Gens ist selten.
Das ABL-Gen befindet sich auf Chromosomenband 9q34.1. Sowohl ABL als auch BCR-Genbereiche haben eine extrem hohe Dichte, jeweils 39,4% und 38,83% von homologen Alu-Bereichen (Siehe, Chissoe et. al, 1995, Genomics, 27: 67-82). Das ABL-Protein mit 145 kD ist homolog zu der Tyrosinkinase (SH1) und Bereichen 2 und 3 (SH2, SH3) von SRC (das Rous-Sarkoma-Virus des Huhns). ABL-Protein ist, wie SRC, eine Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase und weist eine schwache enzymatische Aktivität auf. ABL-Protein ist ubiquitär exprimiert und die Expression findet hauptsächlich im Zellkern statt, um DNA zu binden, kann jedoch auch in das Zytoplasma wandern. Sowohl ABL als auch transformierende ABL-Proteine hemmen den Eintritt der Zelle in die S-Phase durch einen Mechanismus, der eine Translokation in den Zellkern erfordert und der p53- und pRb-abhängig ist (Siehe Welch und Wang, 1993, Cell, 75: 779-790). Wechselwirkungen von ABL-Protein mit pRB können E2F1-gesteuerte Transkription fördern, zum Beispiel von Myc. Veränderungen von ABL durch chromosomale Rearrangements oder virale Transduktion führen zu einer malignen Transformation, wie bei CML. Die Aktivität des ABL-Proteins wird durch seine SH3-Domäne negativ reguliert und die Deletion der SH3-Domäne macht ABL zu einem Onkogen.
ii. BCR-Gen (breakpoint cluster region) und Protein
Das BCR-Gen erstreckt sich über ungefähr 130 kb genomischer DNA, weist 23 Exons auf und befindet sich auf Chromosomenband 22q11.2. Es liegt in der Nähe der Gene EWS und NF2, die sich beide auf 22q12 befinden. Bisher wurden drei Breakpoint Cluster Regions beschrieben: major (M-bcr), minor (m-bcr) und micro (m-bcr). Die Bruchstelle bei M-bcr, einem Cluster von 5,8 kb liegt zwischen den Exons 12 und 16, auch b1 bis b5 von M-bcr genannt. Die Bruchstelle auf m-bcr liegt in einem Bereich von 35 kb zwischen den Exons 1 und 2. Die Bruchstelle in m-bcr liegt auf Intron 19. Das BCR-Protein von 160 kD weist eine Serin/Threonin-Proteinkinaseaktivität auf. Das BCR-Protein ist in vielen Arten von menschlichen hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen und Zelllinien exprimiert.
III. CML
CML ist eine maligne klonale Erkrankung der pluripotententen hämatopoetischen Stammzellen, die zu einem Anstieg der myeloiden, der erythroiden Zellen und der Blutplättchen im peripheralen Blut und der myeloiden Hyperplasie im Knochenmark führt. CML ist eine heimtückische Krebserkrankung. Ihr Anfang liegt in einem genetischen Fehler, der zu einer Überproduktion von Blutplättchen und weißen Blutkörperchen führt. Die frühen Symptome sind überraschend gering und schwach, wie etwa Schüttelfrost und Unwohlsein. Die typischen Symptome der Erkrankung sind Splenomegalie, Müdigkeit, Appetitlosigkeit und Gewichtsverlust. Innerhalb weniger Jahre treten an den genetisch defekten Zellen langsam immer mehr Mutationen auf. Ab einem gewissen Zeitpunkt unterdrücken die sich stark vermehrenden malignen Zellen die guten Zellen und der Körper ist nicht mehr in der Lage, Infektionen zu bekämpfen. Das mediane Alter von CML-Patienten liegt zwar bei 53 Jahren liegt, jedoch tritt die Krankheit auch bei Kindern auf. Die jährliche Inzidenz beträgt 10/106 (von 1/106 in der Kindheit bis 30/106 bei Personen älter als 60 Jahren). Die Krankheit erfährt ausgehend von der benignen chronischen Phase innerhalb von 3-4 Jahren eine Progression, durchläuft dabei für gewöhnlich eine Akzelerationsphase und endet schließlich mit der tödlichen Blasenkrise. Im Unterschied zu der chronischen Phase reifen Leukozyten während der Blastenkrise nicht und ähneln Myeoblasten oder Lymphoblasten bei Patienten mit akuten Leukämien.
Diese Progression steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit der durch BCR-ABL induzierten genetischen Instabilität und steht im Allgemeinen mit dem Auftreten von zusätzlichen und häufig charakteristischen genetischen Veränderungen im Zusammenhang. Das Ph-Chromosom und die BCR-ABL-Fuison jedoch bleiben während aller Phasen bestehen.
Jedes Jahr treten in den Vereinigten Staaten ungefähr 4500 neue Fälle von CML auf. Die einzige Heilungschance bei CML, von der 25000 Erwachsene in den USA betroffen sind, besteht in einer Knochenmarkstransplantation.
Jedoch können 80% der Patienten keinen geeigneten Spender finden oder sind zu alt für eine Transplantation. Die Behandlung kostet ungefähr $150.000 und hat eine Mortalitätsrate von bis zu 25%. Medikamentöse Therapie mit Alpha-Interferon verlangsamt die Erkrankung lediglich, und die Nebenwirkungen sind so schwer, dass viele das Medikament nicht einnehmen können. Glücklicherweise wurde ein neues Medikament namens GLEEVECA (STI571) von Novartis entwickelt. GLEEVECA ist ein kleiner molekularer Inhibitor von ABL, dem ersten Medikament gegen Leukämie, das derart ausgestaltet wurde, dass es die die Krankheit steuernden molekularen Mechanismen angreift. In einem Experiment mit STI571 erfuhren 56% von 290 Patienten, bei denen andere Therapien nicht mehr halfen, eine partielle oder komplette Eliminierung der Krebszellen aus dem Knochenmark. Bei einigen Patienten können selbst mit besonders sensitiven DNA-Sonden keine Spuren des Krebses mehr festgestellt werden. Auch wenn STI571 bei CML zu Fällen mit vollständigen Ansprechen geführt hat, besteht aufgrund der Resistenz einiger Patienten ein Bedarf an weiteren Medikamenten. Laut den Forschungen am Memorial Sloan-Kettering Cancer Center und an der Rockefeller University zeigte ein neues Medikament namens PD17 gegen BCR-ABL-enthaltende Zelllinien und CML-Patientenzellen eine größere Wirksamkeit als STI571. PD17 ist ein Mitglied einer Gruppe von Tyrosinkinaseinhibitoren, die ursprünglich von Parke Davis hergestellt wurden und von denen gezeigt wurde, dass sie wirksame Inhibitoren der Kinasen der src-Familie sind. Außerdem zeigte ein weiteres Experiment, dass eine Kombination von STI571 mit Adaphostin eine höhere Zytotoxität in vitro induzierte als jeder der beiden Wirkstoffe allein (Siehe MowBMF, et al., Blood, 99: 664-71, 2001, hierin durch Bezugnahme inkorporiert).
iv. BCR-ABL-Translokation
CML war die erste maligne Erkrankung, von der gezeigt wurde, dass sie auf einen erworbene und spezifische genetische Abweichung zurückzuführen ist, mit der Identifizierung des Philadelphia-Chromosoms (Ph) im Jahr 1960, einem abnormal verkürzten Chromosom 22. Später (1973) wurde gezeigt, dass das Ph-Chromosoms von einer reziproken t-(9,22)-Translokation stammt (6). Die molekularen Korrelate dieser Translokation wurden zuerst im Jahr 1983 identifiziert, mit der anschließenden Erkennung der Fusion zweier unterschiedlicher Gene, nämlich BCR und ABL (Siehe De Klein et al., Nature, 330:765-767, 1982, hierin durch Bezugnahme darauf inkorporiert), was zu einer Fusion Kopf-Schwanz der Gene BCR und ABL führte (Siehe Chissoe et. al, Genomics, 27: 67-82, 1995, hierin durch Bezugnahme inkorporiert) (6).
Das BCR/ABL-Fusionsprotein erhöht in hohen Maße die Tyrosinkinaseaktivität von ABL. Seine Fähigkeit, CML zu verursachen wurde im Jahr 1990 durch retrovirale Transfektion von BCR-ABL in Mäuse bewiesen, was zu der Induktion eines CML-ähnlichen Syndroms führte (Siehe, Scott et al., PNAS, 88: 6506-6510, 1991, hierin durch Bezugnahme darauf inkorporiert) Während die genauen subzellularen Signalverarbeitungswege, über die diese letztlich biologischen Konsequenzen erreicht werden, noch genau analysiert werden müssen, scheint die Tatsache, dass BCR-ABL tatsächlich die Ursache von CML ist nun aufgrund des klinischen Ansprechens auf gezielte Tyrosinkinase (TK)-Inhibition mit dem Medikament Imatinibmesylat (ehemals als STI571 bekannt), unter dem Handelsnahmen GLEEVACA vertrieben, festzustehen.
Das BCR-ABL-Hybridgen, das Hauptprodukt der t(9;22)(q34;ql1)-Translokation, wird in > 95% der CML-Patienten gefunden. Die BCR-ABL-Translokation liegt nicht ausschließlich bei CML vor und liegt auch in einem geringen Teil anderer onkohämatologischer Krankheiten vor, z.B. in etwa 25% der ALL-Fälle bei Erwachsenen und 5% der ALL-Fälle bei Kindern, 1% der AML-Fälle und sehr selten bei Lymphomen, Myelomen oder myelodysplastischen Syndromen. Das Vorliegen des BCR/ABL-Gens weist bei diesen Krankheiten im Allgemeinen keine diagnostische Signifikanz auf, hat jedoch zumindest bei ALL eine prognostische Bedeutung, d. h. es ist ein negativer prognostischer Faktor. Das von BCR-ABL kodierte Fusionsprotein ist in seiner Größe je nach Bruchstelle in dem BCR-Gen variabel. Bisher wurden drei Breakpoint Cluster Regions (7) beschrieben: major (M-bcr), minor (m-bcr) und micro (m-bcr) (Melo JV, Baillieres, Clin. Haematol. 10: 203-222, 1997, hierin durch Bezugnahme inkorporiert).
Die überwiegende Mehrheit der CML-Patienten weisen ein p210-BCR-ABL-Gen auf (M-bcr), dessen mRNA-Transkripte eine b3a2-Junktion und/oder eine b2a2-Junktion aufweisen (8). Das kleinste Fusionsprotein, p190BCR-ABL (m-bcr-Bruchstelle) wird für gewöhnlich mit Ph-positiver ALL assoziiert (Fainstein et al., Nature, 330: 386-388, 1987, hierin durch Bezugnahme inkorporiert). Auch CML, die auf ein p230-BCR-ABL-Gen zurückzuführen ist (m-bcr-Bruchstelle), tritt selten auf. Es wurden außergewöhnliche CML-Fälle mit BCR-Bruchstellen außerhalb der drei definierten Clusterbereiche oder mit ungewöhnlichen Bruchstellen im ABL-Gen, die zu einem BCR-ABL-Transkript mit b2a3- oder b3a3-Junktionen führen oder mit aberranten Fusionstranskripten, die verschiedene Längen von intronischen Sequenz-Inserts enthalten (Melo, oben), beschrieben.
Ungefähr 5-10% der Patienten mit CML weisen eine Deletion des 5'-Bereichs von ABL und des 3'-Bereichs des BCR-Gens auf dem 9q+-Chromosom auf. Die Deletionen auf dem 5'-Bereich des ABL-Gens können sich in vielen Fällen über mehrere Megabasen erstrecken. Erfahrungsgemäß sind diese weitläufigen Deletionen mit einer schlechten Prognose bei CML assoziiert. ETV6-ABL-Translokation, t (9;12)(q34;q13) werden in 6 Fällen von ALL, ANLL und CML berichtet (Andreasson P, et al., Genes Chromosome Cancer, 20: 299-304, 1997; Hannemann JR, et al., Genes Chromosomes Cancer, 21: 256-259, 1998, beide hierin durch die Bezugnahme darauf inkorporiert). Die bei der EWS-Translokation beteiligten Bruchstellen in Chromosom 22 sind distal zu dem Translokation (8;22)-positiven Burkitt-Lymphom und der Translokation (9;22)-positiven Chronischen Myeloischen Leukämie.
iv. Getrennte ABL-Sonden
In einigen Ausführungsformen verwendet die vorliegende Erfindung getrennte ABL-Sondenpaare, die geeignet sind, sowohl mit den zentromerischen als auch den telomerischen Bereichen außerhalb des ABL-Gens zu hybridisieren.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das ABL-Sondenpaar ein Sondenset, das derart konfiguriert ist, dass er mit einem Bereich der zentromerisch auf dem ABL-Gen liegt, hybridisiert sowie ein Sondenset, das derart konfiguriert ist, dass er mit einem Bereich, der telomerisch auf dem ABL-Gen liegt, hybridisiert. Die Sondensets umfassen Subtraktions-Nukleinsäurefragmente (z.B. weniger als 90 oder 95% oder es liegen repetitive Sequenzen vor) und sind detektierbar markiert. Die ABL-Sondenpaare können verwendet werden, um ABL-Translokationen (siehe oben und 4) zu detektieren, um bei einem Patient mit Verdacht auf diese Krankheit eine Diagnose zu stellen. Beispiel 6 stellt ein Beispiel für die Herstellung von getrennten ABL-Sondenpaaren bereit. In bevorzugten Ausführungsformen ist das ABL-Sondenpaar derart konfiguriert, dass sich sämtliche Bruchstellen in dem ABL-Gen zwischen der Lücke der zentromerischen und der telomerischen Sonden befinden. Das ABL-Sondenpaar kann zum Beispiel in dem CISH-Verfahren der Erfindung verwendet werden, um Proben von Patienten auf ABL-Rearrangements hin zu untersuchen (z. B. siehe 1). Die ABL-Sonden sollten auch eine Lokalisierung der vorher nicht charakterisierten Translokationspartner ermöglichen.
Die ABL-Sondenpaare können zum Beispiel wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt werden.
Auch können zusätzliche Startklone (z. B. BACs, YACs) verwendet werden, die unter Zuhilfenahme von Computerdatenbanken (z. B. im Internet verfügbare Information über die Sequenz des humanen Genoms) ausgewählt werden, um Sequenzen an den telomerischen und zentromerischen Seiten des ABL-Gens auszuwählen. Zum Beispiel stellt 9 einen Ausdruck des UCSC-Genombrowsers für das ABL-Gen dar, der verwendet werden kann, um geeignete Klonsequenzen für die Herstellung des getrennten ABL-Sondenpaares zu identifizieren. Bevorzugt werden repetitive Sequenzen aus beiden Sondensets entfernt (Siehe z.B. Beispiel 6), sodass die Zellproben nicht vor der in situ-Hybridisierung geblockt werden müssen. Auch haben die zentromerischen und/oder telomerischen Sondensets (z. B. umfassend Fragmente von einer Länge von 0,1 bis 8 kb) in bevorzugen Ausführungsformen eine gemeinsame Hybridisierungslänge von wenigstens 50 kb, bevorzugt 100 kb, bevorzugter 200 kb, und am meisten bevorzugt wenigstens 250 kb. In bestimmten Ausführungsformen hat das ABL.c (zentromerisches Sondenset) ungefähr eine Länge von 250 kb (z. B. 200-300 kb) und das ABL.t (telomerisches Sondenset) ungefähr eine Länge von 250 kb (z.B. 175-325 kb Länge).
Das ABL-Sondenpaar kann in einem Kit bereitgestellt werden. Zum Beispiel umfasst in einigen Ausführungsformen das Kit ein telomerisches ABL-Sondenset, ein zentromerisches ABL-Sondenset, eine Anweisung für das Verwenden des Sondenpaares (z. B. um eine mit einem ABL-Rearrangement einhergehende Krankheit festzustellen, wie etwa die in 4 angeführten). Die Kits können Reagenzien umfassen, die für FISH oder CISH benötigt werden.
Das Interpretieren der Ergebnisse der in situ-Hybridisierung an einer Zellprobe (z.B. einer Probe aus einem Patienten) kann wie oben beschrieben für die getrennten Sonden der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Zum Beispiel zeigt 10 grafisch, wie die Ergebnisse für „normale" Fälle (Sondenpaare nebeneinander) und eine Translokation (eine getrenntes Sondenpaar) aussehen. 10 zeigt auch die Ergebnisse, die in ungefähr 5-10% der CML-Fälle vorliegen können, die eine Deletion aufweisen, die wenigstens in einigen Fällen zu einem Verlust des chromosomalen Materials zentromerisch von der Bruchstelle auf Chromosom 9 führen kann. ABL.c kann in bis zu 5-10% der CML-Fälle deletiert sein. Die Zymed-Sonde stellt einen Vorteil im Vergleich zu den herkömmlichen komplementären Sonden (bring-together grobes) für das Detektieren von Fusionsgenen, z. B. BCR/ABL-Sonden von Vysis dar, weil der getrennte Assay sowohl die Translokation als auch die damit in Verbindung stehende Deletion zeigt.
In einigen Ausführungsformen wird die Patientenprobe (z.B. eine Probe aus einer Zellbiopsie) mit den ABL-Sondenpaaren der vorliegenden Erfindung behandelt, eine ABL-Translokation wird detektiert, und dann wird der Patient als geeignet für die Behandlung mit GLEEVACA, PD17 oder einer anderen geeigneten Behandlung identifiziert. In weiteren Ausführungsformen wird die Patientenprobe mit den ABL-Sondenpaaren der vorliegenden Erfindung behandelt, die ABL-Translokation wird detektiert und dann wird dem Patienten GLEEVACA, PD17 oder eine andere geeignete Behandlung verabreicht.
EXPERIMENTELLER TEIL
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu beschreiben und weiter zu veranschaulichen und sollen nicht verstanden werden als deren Schutzumfang einschränkend.
In dem folgenden experimentellen Teil der Offenbarung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: N (Normal); M (Molar); mM (Millimolar); μM (Mikromolar); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); pmol (Picomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); l or L (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); DS (Dextransulfat); and C (Grad Celsius).
BEISPIEL 1
Herstellen der HER2/neu-Subtraktions-Sondenbibliothek
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer exemplarischen HER2/neu-Subtraktions-Sondenbibliothek. Diese exemplarische Sonde ist nützlich bei in situ Hybridisierungstechniken wie etwa CISH und FISH.
1. Selektion des BAC-Klons für die Detektion der HER2-Genamplifikation.
Zwei BAC-Klone (312L7 and 359J8) wurden mit Hilfe von PCR-Screening einer Bibliothek für menschliches BAC identifiziert (erhältlich bei Research Genetics). Diese beiden BAC-Klone enthalten sowohl die 5'-Enden als auch die 3'-Enden des HER-2-Gens. Die 5'- und 3'-Enden der beiden BAC-Klone wurde sequenziert und es wurde eine BLAT-Suche unter Verwendung dieser Sequenzen durchgeführt. In dem UCSC-Genom-Browser vom 22. Dezember 2001 wurde bestimmt, dass BAC-Klon 3127L an der Stelle 39829991-39946716 (117kb) liegt und dass BAC-Klon 359JB an der Stelle 39890898-40010140 (119kb) liegt. Das HER2-Gen ist an der Stelle 39915101-39943629 lokalisiert. Somit enthalten beide BAC-Klone das HER2-Gen. FISH unter Verwendung jedes Klons zeigte, dass beide spezifisch an den HER-2-Gen-Lokus auf Chromosomenband 17q21 binden sowie das Fehlen eines Chimärismus. Das FISH-Signal, das unter Verwendung der beiden Klone zusammen generiert wurde, war höher als das unter Verwendung von jedem Klon einzeln generierte.
2. Herstellung der Tracer-DNA.
Die Tracer-DNA, die verwendet wird, um eine Bibliothek von HER2-Sonden für ISH herzustellen, wurde durch Ultraschallbehandlung (sonication) von 10 μg der gereingten BAC-Klon-DNA in 0,1-8 kb vorbereitet und auf 1% Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. Die Fraktionen mit 0,5-4 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung des QlAquick Gel Extraction Kit (QUIAGEN, Santa Clarita, CA) gereinigt, und mit glatten Enden versehen und mit dem Adapter verbunden. Der T1/T2-Adapter wurde durch das Hybridisieren von mit Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigten Oligos T1 5'-CTG AGC GGA ATT CGT GAG ACC-3' (SEQ ID NO: 18) ("Sense"-Oligo) und T2 5'-P04 GGT CTC ACG AAT TCC GCT CAGTT-3' (SEQ ID NO: 19) ("Antisense"-Oligo) hergestellt. An den Adapter gebundene Fragmente (100 ng) wurden dann in mehreren Reaktionen mit 25 ml unter Verwendung der T1-Sequenz als Primer PCR-amplifiziert. Die Bedingungen des PCR-Zyklisierens waren 94 °C während 30 Sekunden und 72 °C während 3 Minuten für 30 Zyklen, gefolgt von 72 °C während 10 Minuten.
Amplifizierte Fragmente wurden der Größe nach auf 1-%igen Agarosegel aufgetrennt und dann unter Verwendung von QlAquick Gel Extraction Kit gereinigt.
3. Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Humanes hochmolekulares Cot-1 (3 mg) wurde mit glatten Enden versehen und an den D40/D41-Adapter gebunden, der durch Hybridisieren von mit PAGE gereinigten Oligos hergestellt wurde (jeweils SEQ ID NOS: 15 und 16). An den Adapter gebundene Fragmente (100 ng) wurden dann in mehreren Reaktionen von 25 μl unter Verwendung der Biotin-markierten 5'-Sequenz D40 (D40B, SEQ ID NO: 17) als Primer PCR-amplifiziert.
Die Bedingungen des PCR-Zyklierens waren 94 °C während 30 Sekunden, 60 C während 30 Sekunden und 72 °C während 3 Minuten für 30 Zyklen, gefolgt von 72 °C während 10 Minuten. Das Produkt der PCR wurde mit Phenol:Chloroform:Isoamyl gereinigt. Das Pellet wurde getrocknet und die Driver-DNA sorgfältig erneut bei 1,5-2,5 mg/ml in EE-Puffer aufgelöst (10 mmol/L 2-[Hydroxyethyl]-piperazin-N'-3-Propansulfonsäure (NaEPPS), 1 mmol/L EDTA, pH 8,0).
4. Subtraktions-Hybridisierung
Sequenzen wurden aus einer Tracer-DNA-Population mittels genomischer Subtraktions-Hybridisierung durch Hybridisieren mit einem molaren Übermaß an Driver-DNA entfernt. Die Driver-DNA ist chemisch mit einem Biotin modifiziert, so dass sie zusammen mit den Driver-Tracer-Hybridmolekülen selektiv aus der Lösung entfernt werden kann. Kurz gesagt wurde die HER2-Tracer-DNA wiederholt mit 40-fachem Überschuss der Biotin-markierten Driver-DNA, welche die repetitive Sequenzen (Alu und LINE-Elemente) enthielt, hybridisiert. Anschließend wurden repetitive Sequenzen, die den HER2-Bereich präsentieren, quantitativ entfernt. Die Verfahren werden unten im Detail dargelegt.
Die Subtraktion wurde durchgeführt durch Vermischen von 250 ng Tracer-DNA mit 10 mg Biotin-markierter Driver-DNA, 2 mg T1, 5 mg Hefe-tRNA als Träger. Die Mischung wurde bei 100 °C 2 Minuten lang denaturiert, erneut in 5 ml EE-Puffer/l 1 mol/L NaCl gelöst und dann bei 65 °C 24 bis 48 Stunden lang inkubiert. Biotinylierte Moleküle (einschließlich Tracer-Driver-Hybride) wurden unter Verwendung von Avidin-Polystyrol-Perlen entfernt. Verbleibende, nicht biotinylierte Tracer-Fragmente wurden in Ethanol gefällt, bevor mit dem nächsten Subtraktionsdurchgang fortgefahren wurde.
Jede der drei Subtraktionsrunden wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Nach der dritten Runde wurden verbleibende Tracer-Fragmente durch PCR unter Verwendung der T1-Sequenz als Primer amplifiziert.
5. Herstellen der Sondenbibliothek
Nach drei Subtraktionsrunden und 3 Runden PCR wurde die HER2-DNA-Sondenbibliothek mit Digoxigenin (DIG) unter Verwendung des Random Octamer Primer Kit (Gibco BRL/Life Technologies) markiert. Die End-Nukleotid-Konzentrationen für das Markieren mit DIG waren 0,2 mmol/L dCTP dGTP, dATP, 0,13mmol/L dTTP, and 0,07 mmol/L Dig-11-dUTP (Boehringer Mannheim/Roche). Verbleibende Primer und nicht inkorporierte Nukleotide wurden mit S-200 HR-spin Säulenchromatographie (Amersham Pharmacia Biotech Inc.) entfernt.
Die gereinigten Produkte wurden in Ethanol gefällt und in einer Lösung gelöst, die 50% Formamid, 10% Dextransulfat, und 2 × SSC (0,3 mol/L Natriumchlorid, 0,03 mol/L Natriumzitrat, pH 7,0) enthielt.
BEISPIEL 2
Detektion von HER2/neu durch chromogene in situ-Hybridisierung
Dieses Beispiel beschreibt das Durchführen der chromogenen in situ-Hybridisierung mit der in Beispiel 1 hergestellten HER2/neu-Sondenbibliothek, sowie allgemeine Verfahrensabläufe für das Auswerten der CISH-Ergebnisse. CISH wurde auf 4 μm dicken Gewebeschnitten durchgeführt, die auf Superfrost/Plus Microscope Slides Objektträgern (Fisher Pittsburgh, PA) aufgebracht wurden. Die Objektträger wurden 2-4 Stunden lang bei 65 °C erhitzt und dann 10 Minuten lang in Xylol (2 mal) sowie 5 Minuten lang in Ethanol (3 mal) entparaffiniert. Luftgetrocknete Gewebeschnitte wurden in eine Coplin-Küvette, die den CISH-Vorbehandlungspuffer enthielt (0,1 M Tris/0,05 M EDTA, pH 7,0; SPOT-Light Tissue Pretreatment Kit, Zymed), gegeben und lose abgedeckt. Sie wurden 15 min lang bei 199 °F mit einem Temperaturfühler (GE Profile Sensor Convection) in der Mikrowelle erwärmt. Der Temperaturfühler wurde in eine separaten Coplin-Küvette aus Plastik ohne Deckel gegeben. Nach dem Aufbringen eines Deckels auf der Coplin-Küvette erreichten die Gewebeschnitte eine Siedetemperatur (100 Grad Celsius), die an der in der Küvette kochenende Lösung nach Ausschalten der Mikrowelle und Untersuchen der Küvette festgestellt wurde.
Die Objektträger wurden sofort nach der Hitze-Vorbehandlung mit entionisiertem Wasser gewaschen.
Nach dem Enzymverdau folgte das Abdecken des Schnittes mit vorgewärmten 37 °C Pepsin (0,0625-%iges Pepsin, pH 2,3, SPOT-Light Tissue Pretreatment Kit, Zymed) sowie das Inkubieren bei 37 °C während 3±1 Minuten. Die Objektträger wurden dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, mit abgestuftem Ethanol dehydriert und luftgetrocknet. Die gebrauchsfertige, mit DIG-markierte HER2-Sonde (Siehe Beispiel 1) oder Biotin-markierte zentromerische Chromosom17-Sonde (SPOT-LIGHT Chromosom 17 Centromeric Probe, Zymed Laborstories, Inc.) wurde auf den Mittelpunkt des Deckglases gegeben. Das Deckglas wurde mit der Sondenseite nach unten auf der Gewebeprobe platziert. 15 μl or 20 μl der Sonde wurden für Deckgläser mit den Maßen 22 × 22 mm or 24 × 32 mm entsprechend der Größe der abzudeckenden Gewebeabschnitte verwendet. Nach dem Versiegeln der Kanten der Deckgläser mit Gummilösung wurden die Gewebeschnitte und die Sonden bei 94 °C 5 Minuten lang durch Ablegen der Objektträger in dem Objektträgerständer der PCR-Anlage (MJ research, Watertown, MA) denaturiert.
Die Hybridisierung wurde bei 37 °C in demselben Objektträgerständer über Nacht durchgeführt. Die Stringenzwäsche erfolgte 5 Minuten lang mit 0,5 × Standard-Kochsalzzitrat bei 75-80 °C.
Danach wurde die Aktivität der endogenen Peroxidase in 3% mit Methanol gelöstem H₂O₂ 10 Minuten lang geblockt. Das unspezifische Färben wurde durch Verwendung des CasBlock^TM (0,25% Casein, 0,2% Gelatine und 10 mM PBS, pH 7,4) geblockt. Nach dem Abtropfen des CasBlock^TM wurde FITC-konjugierter Maus-anti-DIG-Antikörper auf den Gewebeschnitt aufgebracht und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen jeweils 2 Minuten lang mit PBS und Tween 20 wurde HRP-konjugierter Schaf-anti-FITC-Antikörper auf dem Gewebeschnitt aufgebracht und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit anschließender DAB-Entwicklung während 30 Minuten inkubiert. Die Biotin-markierte Chromosom 17-Zentromer-Sonde wurde durch sequentielle Inkubation mit HRP-konjugiertem Streptavidin 45 Minuten lang bei Raumtemperatur detektiert, und die DAB-Entwicklung wurde 30 Minuten lang durchgeführt (CISH Centromere Detection Kit, Zymed). Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und mit einem Deckglas bedeckt. Positive Kontrollen wurden in jedem Färbedurchlauf eingeschlossen.
Auswertung der CISH-Ergebnisse. CISH-Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Hellfeld-Mikroskops (Nikon, E400) ausgewertet, die mit 10x-, 20x- und 40x-Trockenobjektiven mit 10x-Okularen ausgerüstet waren (siehe Tabelle 4).
Zur Auswertung der HER2-CISH-Ergebnisse siehe Tabelle 5. Ein einzelnes HER2-Gen oder ein Chromosom17-Zentromersignal erscheint normalerweise als ein kleiner, einzelner Punkt. Gezielte HER2-Genamplifikation ist üblicherweise als große DAB-gefärbte Cluster oder in Form von vielen Punkten im Zellkern erkennbar.
TABELLE 4: Signalvisualisierung
TABELLE 5: Exemplarische Bestimmung von HER2-Genstatus durch CISH
Die CISH-Färbeergebnisse sind bei Verwendung eines 40x-Objektivs in z.B. mit Hämatoxylin gegengefärbten Gebeweabschnitten gut sichtbar. Ein Signal für ein einzelnes Gen oder ein Zentromer eines Chromosoms erscheint normalerweise als ein kleiner, einzelner Punkt. Gezielte Genamplifikation ist üblicherweise in Form großer DAB-gefärbte Cluster oder in Form vieler Punkte im Zellkern oder gemischter Cluster und mehrerer Punkte (>6 Punkte pro Zellkern) sichtbar. Tumore mit keiner gezielten Genamplifikation zeigen üblicherweise 1 bis 5 Punkte pro Zellkern. 3-5 Punkte pro Zellkern in mehr als 50% der Tumorzellen sind auf chromosomale Polysomie zurückzuführen.
BEISPIEL 3
Exemplarische TopoIIα-Sonde und weitere TopoIIα-Sonden
Dieses Beispiel beschreibt eine exemplarische TopoIIα-Sonde für das Detektieren der TopoIIα-Kopienanzahl zum Beispiel in FFPE-Gewebeschnitten, frischen Gewebeschnitte, Zellpräparaten und Metaphasechromosomen unter Verwendung von Detektionsverfahren der in situ-Hybridisierung, wie etwa FISH und CISH. Dieses Beispiel beschreibt Verfahrensabläufe für das Herstellen von ähnlichen Sonden.
Die exemplarische, in diesem Beispiel beschriebene TopoIIα-Sonde ist bei Zymed Laborstories als eine Fragmentbibliothek mit Größen in einem Bereich von ungefähr 0,5 to 4 kb erhältlich (South San Francisco, CA, Kat. Nr. 84-0600). Die Nukleinsäuresequenz der exemplarischen TopoIIα-Sonde ist eine Sequenz von ungefähr 170 kb aus dem menschlichen Chromosom siebzehn (17), die das TopoIIα-Gen umgibt, das HER2/neu-Gen jedoch nicht enthält. FISH-Experimente zeigten, dass die Sonden spezifisch an den TopoIIα-Gen-Locus auf Chromosomenband 17q11-21 binden sowie das Fehlen eines Chimärismus. PCR mit HER2/neu-spezifischen Primern zeigte, dass die Sequenz der exemplarischen TopoIIα-Sonde das HER2/neu Gen nicht enthält.
i) Selektion des PAC-Klons für die Detektion einer TopoIIα-Genamplifikation
Um den PAC-Klon für TopoIIα zu isolieren, wurden PAC-Klon-Sonden für TopoIIα durch PCR-basiertes Screenen einer PAC-Bibliothek gewonnen. Eine perizentromerische Sonde von Chromosom 17 (p17H8) wurde als Bezugssonde verwendet, um die Gesamtkopienzahl des Chromosoms 17 zu bestimmen. Die Spezifität der TopoIIα-Sonde wurde durch PCR mit TopoIIα-spezifischen Primern bestätigt. Diese TopoIIα-Sonde enthält keine HER-2-DNA-Sequenz, da es keine Amplifikation unter Verwendung von 3 Paaren von HER-2 spezifischen Primern gibt, die das 5'-Ende, die Mitte und das 3'-Ende von HER-2 abdecken. Die PCR-Analyse zeigte, dass die TopoIIα-Sonde keine Sequenzen von HER-2/neu erkannte.
Das Sequenzieren der Enden der exemplarischen Sonde zeigte, dass diese Sequenz mit der in 1A gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: 9) an das 3'-Ende sowie mit der in 2B gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: 10) an das 5'-Ende gebunden ist. Vergleich mit der veröffentlichten Humangenomsequenz in dem Chromosom 17q11-21-Bereich in Gene Bank zeigte, dass die Sequenz der exemplarischen Sonde sich ungefähr 500 kb stromabwärts von dem HER2/neu-Gen befindet.
Die Sequenz der exemplarischen Sonde kann zum Beispiel unter Verwendung der 3'- und/oder 5'-Enden der exemplarischen Sondensequenz (d.h. SEQ ID NOS 9 und 10) hergestellt werden. Zum Beispiel können diese Sequenzen verwendet werden, um eine Bibliothek mit menschlichen Sequenzen, derart zu durchsuchen, dass diese Sequenz gefunden und isoliert werden kann. Dieser Klon kann ferner mittels herkömmlichen molekularbiologischen Techniken verändert werden, so dass Sequenzen, die ähnlich zu oder identisch mit den exemplarischen Sondensequenzen sind, hergestellt werden. SEQ ID NOs: 9 und 10 können ebenfalls verwendet werden, um humane Gensequenz-Datenbanken (z. B. bei Chromosom 17) zu durchsuchen, so dass die Sequenzen zwischen SEQ ID NOs 9 und 10 und nahe SEQ ID NOs 9 und 10 bestimmt werden können (und dann verwendet werden können, um Sequenzen herzustellen, die gleich oder ähnlich den exemplarischen Sondensequenzen bei Verwendung von herkömmlichen molekularbiologischen Techniken sind). Bevorzugt wird die Länge der resultierenden Sequenz, falls Sequenzen ähnlich den exemplarischen Sondensequenzen hergestellt werden, so gewählt, dass sie zwischen 100 kb und 1 Megabase liegt (Gesamtlänge der Bibliothek aus den Fragmenten, aus denen die Sonde besteht) und dass sie geeignet ist, mit dem humanen Chromosom 17 zu hybridisieren (z. B. in einem Bereich, der das TopoIIα-Gen und nicht das HER2/neu-Gen enthält).
Um zu bestätigen, dass die exemplarische Sonde die TopoIIα-Gensequenz enthält, wurde ein PCR-Test durchgeführt. Insbesondere wird die exemplarische Sondensequenz als ein Template verwendet, und zwei TopoIIα-Primer wurden verwendet (TopoIIα A: 5-'GCC TCC CTA ACC TGA TTG GTTA-3', SEQ ID NO: 11; and TopoIIα B: 5'-CTC AAG AAC CCT GAA AGC GACT-3', SEQ ID NO:12). Die PCR-Reaktion wurde in einem Volumen von 25μl enthaltend 100 ng Tracer-DNA, 20 pmol jedes Primers, 1 × KlenTaq DNA-Polymerase (Clonetech) und 200μM jedes dNTPs (Roche), durchgeführt. Die PCR wurde 30 Zyklen lang mit 94 Grad Celsius 1 Minute lang durchgeführt. Das resultierende Gel zeigte deutlich ein topoIIα-PCR-Produkt (259 Basen). Die gleiche Art von PCR-Test kann für andere TopoIIα-Sondensequenzen verwendet werden, die hergestellt werden, um zu zeigen, dass das TopoIIα-Gen von der Sonde eingeschlossen wird.
ii) Herstellung der Tracer-DNA.
Die exemplarische TopoIIα-Sonde (oder "Tracer-DNS") kann verwendet werden, um eine Fragmentbibliothek mit Fragmenten einer Gesamtlänge von 100 kb bis 1 Megabase (z.B. 170 kb Gesamtlänge) herzustellen, wobei die repetitiven Sequenzen wie oben beschrieben aus dieser Bibliothek entfernt wurden. In diesem Beispiel wurde die Tracer-DNA durch Ultraschallbehandlung von 30 μg gereinigter PAC-Klon-DNA in 0,1-8 kb hergestellt und auf 1%igem Agarosegel der Größe nach aufgetrennt. Die Fraktionen mit 0,5-4 kb wurden aus dem Gel ausgeschnitten, unter Verwendung des QlAquick Gel Extraction Kit (QUIAGEN, Santa Clarita, CA) gereinigt, mit glatten Enden versehen und mit dem TopoIIα1/TopoIIα2-Adapter verbunden. Der TopoIIα1/TopoIIα2-Adapter wurde durch das Hybridisieren von über Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigten Oligos hergestellt TopoIIα 1 5'-(PO4) GCT ACG GTC TGC TCA GGA CAG TT-3' ("Antisense"-Oligo, SEQ ID NO: 13), und TopoIIα 2 3'-CGA TGC CAT ACG AGT CCT GTC-5' ("Sense"-Oligo, SEQ ID NO: 14). An den Adapter gebundene Fragmente (100 ng) wurden dann in mehreren 25 ml Reaktionen unter Verwendung der TopoIIα 2-Sequenz als Primer PCR-amplifiziert. Die Bedingungen des PCR-Zyklierens waren 94 °C während 30 Sekunden, 60 °C während 30 Sekunden und 72 °C während 3 Minuten für 30 Zyklen, gefolgt von 72 °C während 10 Minuten. Amplifizierte Fragmente wurden der Größe nach auf 1%igen Agarosegel aufgetrennt (0,5-4kb Fraktionen) und dann unter Verwendung von QlAquick Gel Extraction Kit gereinigt.
iii) Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Fragmente von hochmolekularem Cot-1 (3 mg) mit einer Größe im Bereich von 0,4 bis 2kb wurden Gel-gereinigt, mit glatten Enden versehen und an den D-40/D-41-Adapter gebunden, der durch Hybridisieren von mit PAGE gereinigten Oligos 5'AATTCTTGCGCCTTAAACCAAC (D-40) SEQ ID. NO: 15 und 5'GTTGGTTTAAGGCGCAAG (D-41) SEQ. ID. NO: 16 hergestellt wurde. An den Adapter gebundene Fragemente (100 ng) wurden dann PCR-amplifiziert, in mehreren 25 ml Reaktionen unter Verwendung der Biotin-markierten 5'-Ende Sequenz D40 (5' (Biotin) AATTCTTGCGCCTTAAACCAAC (D-40B) SEQ. ID. NO:17) als Primer. Die Bedingungen des PCR-Zyklierens waren 94 °C während 30 Sekunden, 60 °C während 30 Sekunden und 72 °C während 3 Minuten für 30 Zyklen, gefolgt von 72 °C während 10 Minuten. Das PCR-Produkt wurde mit Phenol:Chloroform:Isoamyl gereinigt. Das Pellet wurde getrocknet und die Driver-DNA sorgfältig erneut bei 1,5-2,5 mg/ml in EE-Puffer aufgelöst (10 mmol/L 2-[Hydroxyethyl]-piperazin-N'-3-Propansulfonsäure (NaEPPS), 1 mmol/L EDTA, pH 8,0).
iv) Subtraktions-Hybridisierung
Sequenzen wurden aus einer Tracer-DNA-Population mittels genomischer Subtraktions-Hybridisierung durch Hybridisieren mit einem molaren Übermaß an Driver-DNA entfernt. Die Driver-DNA ist chemisch z.B. mit einem Biotin modifiziert, so dass sie zusammen mit den Driver-Tracer-Hybridmolekülen selektiv aus der Lösung entfernt werden kann. Zusammengefasst wurde die TopoIIα-Tracer-DNA wiederholt mit 40-fachem Überschuss der Biotin-markierten Driver-DNA, welche die wiederholten Sequenzen enthält (Alu und LINE-Elemente), hybridisiert. Infolgedessen wurden repetitive Sequenzen, die in dem TopoIIα-Bereich vorliegen, quantitativ entfernt. Die Verfahren werden unten im Detail dargelegt.
Die Subtraktion wurde durchgeführt durch Vermischen von 250 ng Tracer-DNA mit 10 mg Biotin-markierter Driver-DNA, 2 mg TopoIIα 2, 5 mg Hefe-tRNA als Träger. Die Mischung wurde bei 100 °C 2 Minuten lang denaturiert, gefriergetrocknet, erneut in 5 ml EE-Puffer/1 mol/L NaCl gelöst und dann bei 65 °C für 24 bis 48 Stunden inkubiert. Biotinylierte Moleküle (einschließlich Tracer-Driver-Hybride) wurden unter Verwendung von Avidin-Polystyrol-Kugeln (beads) wie beschrieben entfernt. Verbleibende, nicht biotinylierte Tracer-Fragmente wurden in Ethanol gefällt, bevor mit dem nächsten Subtraktionsdurchgang fortgefahren wurde. Jede der drei Subtraktionsrunden wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Der Subtraktionsprozess führte dazu, dass wenigstens 95% der repetitiven Sequenzen aus der Sondenbibliothek entfernt wurden. Nach der dritten Runde wurden verbleibende Tracer-Fragmente unter Verwendung der TopoIIα 2-Sequenz mittels PCR als Primer amplifiziert.
v) abschließende Herstellung der Nukleinsäuren für die Subtraktions-Sondenbibliothek
Nach drei Subtraktionsdurchgängen und 3 PCR-Durchgängen wurde die TopoIIα-Subtraktionnukleinsäure-Sondenbibliothek unter Verwendung von Random Octamer Primer Kit (Gibco BRL/Life Technologies) mit Digoxigenin (DIG) markiert. Die End-Nukleotid-Konzentrationen für das Markieren mit DIG waren 0,2 mmol/L dCTP, dGTP, dATP, 0,13 mmol/L dTTP, and 0,07 mmol/L Dig11-dUTP (Boehringer Mannheim/Roche). Die verbleibenden Primer und nicht inkorporierten Nukleotide wurden mittels S-200HR Spin Säulenchromotographie (Amersham Pharmacia BiotechInc.) entfernt. Die gereinigten Produkte wurden in Ethanol gefällt und in einer Lösung gelöst, die 50% Formamid, 10% Dextransulfat, und 2 × SSC (0,3 mol/L Natriumchlorid, 0,03 mol/L Natriumzitrat, pH 7,0) enthielt.
Währenddessen wird die exemplarische TopoIIα-Sondenbibliothek mit Digoxigenin (DIG) markiert. Die exemplarische Sondensequenz, oder andere Sonden mit derselben oder ähnlichen Sequenzen, kann mit einem beliebigen Typ von detektierbarem Marker markiert werden (z. B. dergestalt, dass die Sonde während in situ-Hybridisierungsverfahren wie etwa FISH oder CISH detektiert werden kann). Auch wurde die Spezifität der exemplarischen Sonde durch CISH-Detektionsverfahren (Daten nicht angegeben) auf dem Adenokarzinom der Milchdrüsen MCF-7 (ATCC# HTB-22), das keine TopoIIα-Genamplifikation oder – Deletion aufweist sowie Zellen des Adenokarzinom der Milchdrüsen MDA-MB-361-Zellen (ATCC# HTB-27), bei denen das TopoIIα-Gen deletiert ist, bewiesen.
BEISPIEL 4
In situ-Hybridisierungsverfahren mit der exemplarischen TopoIIα-Sonde
Dieses Beispiel beschreibt in situ-Hybridisierungsverfahren (CISH und FISH), die mit TopoIIα-Sonden verwendet werden können, wie etwa die exemplarische, in Beispiel 2 beschriebene TopoIIα-Sonde.
Insbesondere beschreibt dieses Beispiel in situ-Hybridisierungsverfahren mit der exemplarischen Sonde an mit Formalin fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben sowie Zellproben/Proben von Chromosomen in der Metaphase. Schließlich beschreibt das Beispiel ein Verfahren zur Qualitätskontrolle, das mit jedem dieser Verfahren verwendet werden kann.
A. Einfarbiges CISH-Verfahren für die Detektion von DIG-markierter exemplarischer TopoIIα-Sonde mit FFPE-Gewebeschnitten
1. VORBEHANDLUNG

1. Entparaffinisierung Xylol : 10 Min × 2
100 % EtOH : 5 Min × 3
luftgetrocknete Objektträger

2. Wärmebehandlung

Objektträger unter Verwendung einer Mikrowelle mit Temperaturfühler oder mit einem Dampfdrucktopf oder einer Heizplatte kochen)
Tris-EDTA buffer, pH 7;0 : 15 Min, 96-100 C
(SPOT-Light Tissue Heat Pretreatment Buffer, Kat.# 00-8401)
dH₂O : 2 Min × 3

3. Pepsinverdau:

Pepsin bei 37 °C : 3 Min.
Wichtig: unterschiedliche Pepsin-Konzentrationen und Inkubationszeiten (1-10 min) können in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und der Art des Gewebes erforderlich sein. Übermäßige Verdauung verursacht einen Verlust von Zellkern- und Chromosomenstruktur, während eine inadäquate Verdauung zu einem Signalverlust führen kann.
dH₂O : 2 min × 3

4. Dehydrierung mit abgestuftem Alkohol

70% EtOH : 2 min
85% EtOH : 2 min
95% EtOH : 2 min
100% EtOH : 2 min
100% EtOH : 2 min

5. Lufttrocknen der Objektträger
6. Objektträger mit Stift markieren
II. Möglichkeit 1: CO-DENATURIERUNG UND HYBRIDISIERUNG:

(es soll eine PCR-Anlage mit einem Objektträgerständer oder einem Heizblock mit einer digitalen Temperaturanzeige und einer Feuchtigkeitskammer für Objektträger sowie einem 37 °C-Inkubator verwendet werden)

1. es werden 12-15 μl der Sonde auf die Mitte des 22 × 22mm Deckglases oder 20 μl auf die Mitte des 24 × 32 mm Deckglases gegeben.
2. Abdecken mit einem Deckglas: Der Objektträger wird mit einem Deckglas über dem Bereich, wo sich die Gewebeprobe befindet, abgedeckt.
3. Versiegeln mit Gummilösung: Versiegeln der Kanten des Deckglases mit einer dünnen Schicht Gummilösung, um Verdampfen während der Inkubation zu vermeiden.
4. Denaturierung bei 94 °C während 5 min: Die Objektträger werden in enen Objektträgerständer einer PCR-Anlage oder auf einen Heizblock mit einer digitalen Temperaturanzeige gegeben.
5. Inkubation bei 37 °C über Nacht: Die Objektträger werden in dem Objektträgerständer der PCR-Anlage oder in einem dunklen, feuchten Behältnis in einem Inkubator gelassen.

Möglichkeit 2: SEPARATE DENATURIERUNG

(z. B. wenn die PCR-Anlage oder der Heizblock nicht zur Verfügung steht)

1. Das Gewebe wird in frisch hergestelltem Denaturierungspuffer 5 min lang bei 75 °C denaturiert.

Denaturierungspuffer: 4 ml 20 × SSC (20 × SSC-Puffer = 0,3 M Natriumzitrat mit 3 M NaCl, pH 7,0), 8 ml ddH₂O, 28 ml Formamid.
(Für mehr als eine Objektträgerprobe wird die Temperatur um 1 °C pro Objektträger erhöht. Zum Beispiel wird die Temperatur auf 76 °C erhöht, wenn 2 Objektträger verwendet werden).

2. Dehydrierung mit abgestuftem Alkohol

70% EtOH : 2 min, bei –20 C
85% EtOH : 2 min, bei –20 °C
95% EtOH : 2 min, bei –20 °C
100% EtOH : 2 min, bei RT
100% EtOH : 2 min, bei RT

3. Lufttrocknen der Objektträger

Gleichzeitig wird Schritt 4 ausgeführt.

4. Denaturieren der markierten Sonde 75°C, 5 min.
5. Die denaturierte Sonde wird sofort in Eis gegeben.
6. Hinzufügen der Sonde: 12-15 μl der denaturierten Sonde werden in die Mitte des 22 × 22 mm Deckglases gegeben.
7. Abdecken der Objektträger über dem Bereich der Gewebeprobe mit einem Deckglas.
8. Inkubation: Objektträger werden bei 37 °C über Nacht in einen dunklen, feuchten Behälter gegeben (mehr als 14 Stunden).

III. STRINGENZWÄSCHE

1. Nach der Hybridisierung werden Gummilösung und Deckglas vorsichtig entfernt.
2. Stringenzwäsche Die Objektträger werden 5 min lang in 0,5 × SSC bei 75 °C gewaschen. (Die Temperatur wird bei mehr als 2 Objektträgern um 1 °C erhöht, soll jedoch 80 °C nicht überschreiten).
3. dH₂O Wäsche : 2 min × 3

IV. IMMUNDETEKTION

1. 3% H₂O₂ in absolutem Methanol: (für die Peroxidase-Inaktivierung) 10 min
2. Wäsche mit 1 × PBS (10mM)/Tween 20 (0,025%): 2 min × 3
3. Hinzufügen von blockendem Reagenz 2 Tropfen/Objektträger bei RT (CAS-Block; 0,25 % Casein, 0,2 % Gelatine und 10 mM PBS, pH 7,4) 10 min Wichtig: Es sollte genug Reagenz verwendet werden, um den gesamten Gewebebereich zu bedecken.
4. Abtropfen von blockendem Reagens; NICHT SPÜLEN.
5. Hinzufügen von FITC-anti-DIG-Antikörper 2 Tropfen/Objektträge bei RT 45 (30-60) min Wichtig: Es sollte genug Reagenz verwendet werden, um den gesamten Gewebebereich zu bedecken.
6. Wäsche mit 1 × PBS/Tween 20 (0,025%) 2 min × 3 Wenn FISH gewünscht ist, dann wird 1 Tropfen VECTASHIELD Mounting Medium mit DAPI (Vector, Kat. Nr. H-1200) auf den Schnitt gegeben, dann mit einem Deckglas abgedeckt. Vor dem Durchführen der Fluoreszenz-Mikroskopie wird 10 Minuten lang bei RT in einer dunklen Kammer inkubiert. Nachdem die Analyse durchgeführt wurde, wird das Deckglas entfernt und der Objektträger 3mal für jeweils 2 min in 1 × PBS/Tween 20 (0,025 %) gewaschen. Es wird mit dem nächsten Schritt fortgefahren.
7. Füge HRP-anti-FITC 2 Tropfen/Objektträger bei RT hinzu 45 (30-60min) Wichtig: Es sollte genug Reagenz verwendet werden, um den gesamten Gewebebereich zu bedecken.
8. Wäsche mit PBS/Tween (0,025%) 2 min × 39. Hinzufügen von DAB, 3 Tropfen/Objektträger, 30 min Wichtig: Es sollte genug Reagenz verwendet werden, um den gesamten Gewebebereich zu bedecken. Erzeugen des DAB-Signals durch Hinzufügen von 1 Tropfen jedes Reagens A (CAS-BLOCK), B (FITC-Schaf-anti-Digoxigenin) und C (HRP-Ziege anti-FITC) zu 1 ml dH₂O, dann gut vermischen) 10. Waschen unter laufendem Wasserhahn: 2 min.

V. GEGENFÄRBEN UND ABDECKEN MIT DECKGLÄSERN

1. Gegenfärben mit Hämatoxylin 6 sec – 1 min. Die für das Gegenfärben benötigte Zeit hängt von den verwendeten Geweben ab. Dunkles Gegenfärben wird nicht empfohlen, da es das positive Signal verdunkeln kann.
2. Waschen unter laufendem Wasserhahn : 2 min
3. Es wird mit abgestuftem EtOH dehydriert (70%, 85%, 95%, 100%, 100%) jeweils 2 min
4. Xylol : 2 min × 2
5. Abdecken mit Histomount (Cytoseal 6.0, Kat. # 8310-16, Stephen Scientific).

V. MIKROSKOPIE
Visualisieren der Sonden in Zellen mit einem Hellfeldmikroskop.
B. Zellprobe oder Probe mit Chromosomen in der Metaphase
Zellprobe wird auf beschichtetem Glasobjektträger von HISTOGRIP oder Supefrost (oder einem anderen) fixiert.
Vorbehandlung

1. Objektträger 60 Minuten lang bei 37 °C in 2 × SSC-Puffer eintauchen (20 × SSC-Puffer = 0,3 M Natriumzitrat mit 3 M NaCl, pH 7,0).
2. (Optional) Vorbehandeln der Zellen mit SPOT LIGHT Cell Preatreatment Reagent (oder einer anderen Pepsinverbindung in saurem Puffer) 5 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Die Inkubationszeit kann zum Beispiel je nach Zelltyp und Herstellungsbedingungen der Objektträger 1-10 Minuten betragen. Übermäßiger Pepsinverdau verursacht einen Verlust der Zellkerne und der Chromosomenstruktur. Ein ungeeigneter Verdau kann zu einem Signalverlust führen.
3. 3 × 2 Minuten lang Waschen in dH₂O bei Raumtemperatur (RT).
4. (Optional) 1 Minute lang Eintauchen der Objektträger in 10% gepuffertes Formalin bei RT.
5. 3 × 2 Minuten lang bei RT in dH₂O waschen.
6. Die Objektträger werden dann für jeweils 2 Minuten in 70-, 85-, 95-, und 100-%igem Ethanol dehydriert und daraufhin luftgetrocknet.

Objektträger sind nun bereit für das ISH-Verfahren (alternativ können die Objektträger in 70-%igem Ethanol bei –20 Grad Celsius aufbewahrt werden).
Denaturierung und Hybridisierung

1. Es werden 15 μl der exemplarischen TopoIIα-Sonde (Sonde) auf die Mitte der Probe gegeben und mit einem 22 × 22 mm Deckglas abgedeckt (für eine größere Probe wird eine größere Menge der Sonde und ein größeres Deckglas verwendet).
2. Versiegeln der Kanten des Deckglases mit einer dünnen Schicht Gummilösung, um Verdampfen der Sondenlösung während der Inkubation zu vermeiden.
3. 3 Minuten lang Denaturieren der Objektträger auf einer Heizplatte oder einem Objektträgerwärmer bei 80 Grad Celsius (Intervall von 2-5 min) oder in dem Objektträgerblock eines PCR-Thermocyclers.
4. Objektträger wird 16-24 Stunden lang in einem dunklen, feuchten Behälter oder in dem Objektträgerblock eines PCR-Thermocyclers bei 37 Grad Celsius gelagert.

Stringenzwäsche

1. Entfernen von Gummilösung und Deckglas.
2. 5 Minuten lang Eintauchen der Objektträger in 0,5 × SSC-Puffer unter Verwendung einer Coplin-Küvette bei 72 Grad Celsius (Wichtig: dies ist die Temperatur für einen Objektträger, jedoch verursacht jeder Objektträger einen Temperaturabfall von 1 Grad Celsius der Temperatur der Lösung. Aus diesem Grund muss die Temperatur des Wasserbades entsprechend angepasst werden, wenn mehr als ein Objektträger vorhanden ist. Zum Beispiel wird beim Waschen von 4 Objektträgern die Temperatur des Wasserbades auf 75 Grad Celsius eingestellt. 80 Grad Celsius sollten nicht überschritten werden).
3. Die Objektträger werden in PBS/Tween 20-Puffer (1 Teil Tween-20, 3900 Teile 0,1 M PBS) 3 × 2 Minuten bei RT gewaschen.

Die Immundetektion und das Gegenfärben-Abdecken mit Abdeckglas wie oben in Teil A beschrieben.
C. Qualitätskontrollverfahren
Qualitätskontrolle über die Genauigkeit der obigen Verfahren kann durch einige oder sämtliche unten beschriebene Kontrollen geleistet werden.
Positive Gewebekontrolle (Amplifikation): Externe positive Kontrollmaterialien für klinische Forschung sollten im Allgemeinen frische Proben aus einer Autopsie/Biopsie/einem chirurgischen Eingriff sein, die so schnell wie möglich fixiert, verarbeitet und eingebettet werden sollten, so wie eine Probe oder Proben von Patienten. Anders als die Probe(n) verarbeitete Proben validieren die Leistung des Reagens und dienen nicht der Überprüfung von Gewebepräparaten. Positive Gewebekontrollen sind indikativ für korrekt präpariertes Gewebe und richtige Färbetechniken. Eine Kontrolle mit positivem Gewebe sollte in jedem Durchlauf für jeden Satz von Testbedingungen eingeschlossen sein.
Für die TopoIIα-Gendetektion für die positiven Kontrollmaterialien verwendete Gewebe sollten mit gut charakterisierten Niveaus des TopoIIα-Gens ausgewählt werden. Ungefähr 5-10% des Brustkrebsgewebes weist eine topoIIa-Genamplifikation auf und kann eine nützliche Quelle für positives Kontrollgewebe sein.
Bekannte positive Kontrollen sollten für das Überwachen der richtigen Betriebsbedingungen der verarbeiteten Gewebe und Testreagenzien verwendet werden anstatt als Hilfe bei der Interpretation von Testergebnissen. Wenn die Kontrollen mit positivem Gewebe keine positive Färbung zeigen, sollten Ergebnisse mit den Testproben als ungültig betrachtet werden.
Negative oder normale (diploide) Gewebekontrolle: Humane diploide Gewebeproben weisen normalerweise zwei TopoIIα-Genkopien in jeder Zelle auf. Aus diesem Grund ist eine echte negative Gewebeprobe nicht verfügbar. Normales Gewebe kann jedoch als eine negative Kontrolle für Genamplifikation oder Deletion verwendet werden. Eine negative Gewebekontrolle (von der bekannt ist, dass sei diploid ist), die in gleicher Weise wie die Probe(n) fixiert, verarbeitet und eingebettet ist, wird bei jedem Färbedurchlauf verwendet. Dies beweist die Spezifität der ISH-Sonde und weist auf ein nicht-spezifisches Hintergrundfärben (falsch positives Färben) hin.
Eine negative, von der Probe separate, Gewebekontrolle wird als „externe" negative Kontrolle bezeichnet. Wenn eine externe negative Gewebekontrolle nicht verfügbar ist, dann dient ein normaler Schnitt der Probe als eine „interne" negative Gewebekontrolle.
Reagens (NO-Sonde) Kontrolle: Das Reagens wird auf einem Schnitt einer Testprobe ohne die Sonde kontrolliert. Die Überprüfung des Reagens ist nützlich für eine Einschätzung der Möglichkeit des nichtspezifischen Färbens, insbesondere wenn ISH in Gewebeschnitten ausgeführt wird. Die Reagenskontrolle kann auf dieselbe Weise gefärbt werden wie die Testproben, außer dass der Hybridisierungspuffer, der die Sonde nicht enthält, während des Hybridisierungsschritts verwendet werden sollte. Objektträger-Vorbehandlung, Denaturierung und Immundetektion sollten unter den gleichen Bedingungen wie bei den Testproben durchgeführt werden.
BEISPIEL 5
Herstellen der EGFR-Subtraktions-Sondenbibliothek
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer EGFR-Subtraktions-Sondenbibliothek. Diese Sondenbibliothek wurde, soweit nicht anders beschrieben, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
1) Selektion des BAC-Klons und des PAC-Klons für die Detektion der EGFR-Genamplifikation.
Zwei BAC-Klone (343B1 und 339F13), ein PAC-Klon (1091E12) wurden durch das Humangenomprojekt (von Research Genetics) identifiziert. Bei diesen drei Klonen wurde durch PCR bestätigt, dass sie das EGFR-Gen enthalten und FISH unter Verwendung jedes Klons zeigte, dass beide spezifisch an den EGR-Gen-Lokus auf Chromosomenband 7p12 binden, sowie das Fehlen eines Chimärismus. Eine BLAT-Suche des UCSC-Genombrowsers vom 6. August 2001 zeigte, dass die drei Klone sich überlappten und über eine Strecke von 303 kb von 5971102160014071 zusammengefügt waren, welche das EGFR-Gen einschließt.
2). Vorbereitung der Tracer-DNA.
Die PAC und BAC Klone wurden auf dieselbe Weise verändert wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Die für Adapter verwendeten Primer für die EGFR-Sondenbibliothek sind die folgenden:
EGFR.A 5'-(PO4) ACC GTA GGA CTC TGC TGG CGA TT-3' (SEQ ID NO: 20) ("Antisense"-Oligo), und
EGFR.B 5'-TCG CCA GCA GAG TCC TAC GGT-3' (SEQ ID NO:21) ("Sense"-Oligo)
3). Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Wie in Beispiel 1.
4). Subtraktions-Hybridisierung
Wie in HER2-Sonde (Beispiel 1), außer dass statt T1-Primer EGFR-B-Primer verwendet wurde.
5) Sondenherstellung
Wie in HER2-Sonde (Siehe, Beispiel 1).
BEISPIEL 6
Getrenntes ABL-Subtraktions-Sondenpaar
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer Bibliothek eines getrennten ABL-Subtraktions-Sondenpaars. Diese Sondenbibliothek wurde, soweit nicht anders beschrieben, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 hergestellt. Insbesondere ist dieses Sondenpaar derart ausgestaltet, dass es Chromosomentranslokationen in einer einzigartigen „getrennten" Art und Weise detektiert. Herkömmliche BCR/ABL-Sondenpaare befinden sich im „normalen" Zustand (d. h. nicht kanzerös) auf verschiedenen Chromosomen und sind nebeneinander angeordnet, wenn eine Translokation auftritt. Die getrennten ABL-Sonden des vorliegenden Beispiels sind derart ausgestaltet, dass dieses Paar sich im „normalen" Zustand (z. B. nicht kanzerös) auf demselben Chromosom befindet und lediglich dann auf getrennten Chromosomen vorliegen, wenn eine Translokation in der getesteten Probe aufgetreten ist.
1) Selektion des BAC-Klons für die Detektion der BCR/ABL-Gentranslokation.
Zwei BAC-KLone, RP11-618A20 (Zugangsnummer AL354898.10) and RP11-17L7 (Zugangsnummer AL353695.7) wurden verwendet, um die ABL.c-Sonde (zentromerische Seite) (ungefähr 258 kb Größe) herzustellen. 9 zeigt den UCSC-Genbrowser für das ABL-Gen, der für ausgewählte zusätzliche oder veränderte Klone verwendet werden kann, um die ABL.c- und ABL.t-Sonden der vorliegenden Erfindung herzustellen. Auch wurden zwei BAC-Klone, RqP11143H20 (Zugangsnummer AL355872.13) und RP11-544A12 (Zugangsnummer AL157938.22) verwendet, um die ABL.t-Sonde (telomerische Seite) (ungefähr 250 kb Größe) herzustellen. FISH unter Verwendung dieses Klons zeigte, dass sie allesamt spezifisch an das Chromosomenband 9q34 binden, das Fehlen eines Chimärismus.
2). Herstellung der Tracer-DNA
Die PAC und BAC Klone wurden auf dieselbe Weise verändert wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Die Primer für den Adapter:
3). Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Wie in Bespiel 1.
4). Subtraktions-Hybridisierung
Wie in HER2-Sonde (Beispiel 1), lediglich wurden, statt T1-Primer, jeweils ABL.cS and ABL.tS-Primer für ABL.c und ABL.t-Sonden verwendet
5). Sondenherstellung
Wie für HER2-Sonde (Siehe Beispiel 1). Das Sondenpaar (zentromerische und telomerische Sonden ergibt eine Lücke von ungefähr 109 kb auf der zentromerischen Seite und eine Lücke von 104 kb auf der telomerischen Seite des ABL-Gens (Siehe 3 und 4). Dieses markierte Sondenpaar kann zum Beispiel verwendet werden, um ABL-Translokationen (z. B. BCR-ABL-Translokationen) durch in situ-Hybridisierungstechniken zu detektieren (z. B. FISH und CISH). Zum Beispiel werden Translokationen in dem ABL-Gen bei CML, akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL), akuter nicht-lymphozytischer Leukämie (ANLL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) (siehe Abschnitt VI oben) gefunden. Außerdem können diese Sonden verschiedene ABL-Translokationen detektieren, wie etwa TEL-ABL, die bei anderen Leukämie-Arten gefunden werden.
BEISPIEL 7
Herstellen der N-MYC-Subtraktions-Sondenbibliothek
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer N-MYC-Subtraktions-Sondenbibliothek. Diese Sondenbibliothek wurde, soweit nicht anders beschrieben, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 hergestellt.
1) Selektion des BAC-Klons für die Detektion der N-Myc-Genamplifikation.
Zwei BAC-Klone (2014F22 und 2121A13339F13) wurden durch Durchsuchen von Caltech OncoBAC und mittels des Humangenomprojekts (erhältlich bei Research Genetics) identifiziert.
Es wurde mittels PCR bestätigt, dass diese beiden Klone das N-Myc-Gen enthalten. FISH unter Verwendung jedes Klons zeigte, dass beide spezifisch an den N-MYC-Gen-Locus auf Chromosomenband 2p24.3 binden sowie das Fehlen eines Chimärismus. Das FISH-Signal, das unter Verwendung der beiden Klone zusammen generiert wurde, war höher als das bei Verwendung von jedem Klon einzeln generierte.
2) Herstellung der Tracer-DNA.
Die PAC und BAC Klone wurden auf dieselbe Weise verändert wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Die Primer für den Adapter:
AF3S 5'-TCT TCA CGA CAC GAC AGC CAG-3' (SEQ ID NO:26) ("Sense"-Oligo)
AF3a 3'-TT AGA AGT GCT GTG CTG TCG TCG GTC (PO₄)-5' (SEQ ID NO:27) ("Antisense"-Oligo)
3). Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Wie in Bespiel 1.
4) Subtraktions-Hybridisierung
Wie HER2-Sonde (Beispiel 1), außer dass statt T1-Primer AF3S-Primer verwendet wurde.
5) Sondenherstellung
Wie in HER2-Sonde (Siehe Beispiel 1).
BEISPIEL 8
Herstellen der SYT-Subtraktions-Sondenpaarbibliothek
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer Subtraktions-Sondenpaarbibliothek für SYT (Synovialsarkom). Diese Sondenbibliothek wurde, soweit nicht anders beschrieben, im Wesentlichen wie in Beispiel 1 hergestellt. Es gilt zu beachten, dass dieses Sondenpaar derart ausgestaltet ist, dass es Chromosomtranslokationen in einer einzigartigen „getrennten" Art und Weise detektiert. Herkömmliche SYT-Sondenpaare befinden sich im „normalen" Zustand (d. h. nicht kanzerös) auf verschiedenen Chromosomen und sind nebeneinander angeordnet, wenn eine Translokation auftritt. Die getrennten SYT-Sonden des vorliegenden Beispiels sind derart ausgestaltet, dass dieses Paar sich auf demselben Chromosom im „normalen" Zustand (z. B. nicht kanzerös) befindet und lediglich dann auf getrennten Chromosomen vorliegt, wenn eine Translokation in der getesteten Probe aufgetreten ist.
1. Selektion der BAC-Klone für die Detektion der SYT-Translokation.
Klone von beiden Seiten des SYT (SS18) Gens werden verwendet, um eine getrennte Subtraktions-Sondenpaarbibliothek herzustellen. Zum Beispiel können ein Klon oder mehrere Klone aus den folgenden verwendet werden, um die SYT.c-Sonde (Sonde für Zentromerseite) herzustellen: RP11-885J19 (Siehe, Zugangsnummer AP001326); RP11-689N18 (Siehe Zugangsnummer AP001121); RP11-5F22 (Siehe Zugangsnummer AC011268); RP11-326M20 (Siehe Zugangsnummer AC019306); RP11-540M4 (Siehe Zugangsnummer AC007768). Bevorzugt werden die ersten vier aufgelisteten Klone verwendet, und optional wird der fünfte Klon hinzugefügt. Um die SYT.t-Sonde (Sonde für die Telomerseite) herzustellen, können einer oder mehrere aus den folgenden Klonen verwendet werden: RP11-802C10 (Zugangsnummer AP002752), und RP11-774F2 (Zugangsnummer AP001451).
2. Vorbereitung der Tracer-DNA.
Die Klone wurden auf dieselbe Weise verändert wie oben in Beispiel 1 beschrieben. Die Primer für den Adapter:
3. Herstellung von Biotin-markierter Driver-DNA
Wie in Bespiel 1.
4. Subtraktions-Hybridisierung
Wie in HER2-Sonde (Beispiel 1), es wurde lediglich T1-Primer durch SYT.c1 and SYT.tS-Primer für SYT.c und SYT.t-Sonden ausgetauscht.
5. Sondenherstellung
Wie bei HER2-Sonde (Beispiel 1).
Verschiedene Modifikationen und Variationen des beschriebenen Verfahrens und Systems der vorliegenden Erfindung, die erfolgen können, ohne dass vom Schutzumfang der Erfindung abgewichen wird, sind dem Fachmann ersichtlich. Auch wenn die Erfindung in Verbindung mit den spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist offensichtlich, dass die Erfindung wie sie beansprucht wird, nicht unrechtmäßig auf derartige spezifische Ausführungsformen beschränkt werden sollte. Verschiedene Modifikationen der beschriebenen Arten für das Ausführen der Erfindung, die für den Fachmann im Bereich der Medizin, Immunologie, Chemie und molekularen Biologie oder ähnlichen Gebieten offensichtlich sind, sollen in den Schutzumfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren für das Durchführen einer chromogenen in situ-Hybridisierung, das folgendes umfasst: a) Vorerwärmen einer biologischen Probe in einem Vorbehandlungspuffer bei einer Temperatur von wenigstens 96 Grad Celsius, b) Aussetzen der biologischen Probe gegenüber einer Enzymverdaulösung, c) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Subtraktions-Sondenbibliothek unter Bedingungen, die bewirken, dass die Subtraktions-Sondenbibliothek mit einem Zielbereich in der biologischen Probe hybridisiert, d) Hinzufügen eines an ein Enzym gebundenen Detektionsmoleküls zu der biologischen Probe unter Bedingungen, die bewirken, dass das Detektionsmolekül mit Folgendem bindet: i) der markierten Subtraktions-Sondenbibliothek, oder ii) einem mit der Subtraktions-Sondenbibliothek verbundenen Zwischenmolekül; und e) Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats zu der biologischen Probe.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das ferner den Schritt f) Detektieren des Zielbereichs umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Detektieren das Visualisieren des kolorimetrischen Substrats mit einem Mikroskop umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Mikroskop ein Hellfeldmikroskop ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek derart ausgestaltet ist, dass sie eine HER2-Genamplifikation detektiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek derart ausgestaltet ist, dass sie eine TopoIIα-Genamplifikation detektiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek derart ausgestaltet ist, dass sie eine EGFR-Genamplifikation detektiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek derart ausgestaltet ist, dass sie eine N-MYC-Genamplifikation detektiert.
Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek eine Sondenpaarbibliothek umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Sondenpaar ein getrenntes Sondenpaar umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Sondenpaarbibliothek folgendes umfasst: i) eine erste Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem ersten Bereich auf Chromosom neun hybridisiert, der zentromerisch zu dem ABL-Gen liegt, und ii) eine zweite Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem zweiten Bereich von Chromosom neun hybridisiert, der telomerisch zu dem ABL-Gen liegt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Sondenpaarbibliothek folgendes umfasst: i) eine erste Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem ersten Bereich auf Chromosom achtzehn hybridisiert, der zentromerisch zum SYT-Gen ist, und ii) eine zweite Sondenbibliothek, die derart ausgestaltet ist, dass sie mit einem zweiten Bereich von Chromosom achtzehn hybridisiert, der telomerisch zum SYT-Gen ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Temperatur wenigstens 98 Grad Celsius beträgt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Temperatur zwischen 96 Grad Celsius und 100 Grad Celsius liegt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek zu etwa 90 Prozent frei von repetitiven Sequenzen ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Subtraktions-Sondenbibliothek zu etwa 95 Prozent frei von repetitiven Sequenzen ist.
Ein Verfahren, um zu bestimmen, ob ein Subjekt geeignet für eine Behandlung mit anti-HER2-Antikörpern ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a) Vorerwärmen einer biologischen Probe aus einem Subjekt in einem Vorbehandlungspuffer bei einer Temperatur von wenigstens 96 °C, b) Aussetzen der biologischen Probe gegenüber einer Enzymverdaulösung, c) Kontaktieren der biologischen Probe mit einer Subtraktions-Sondenbibliothek unter Bedingungen, die bewirken, dass die Subtraktions-Sondenbibliothek mit einem Zielbereich in der biologischen Probe hybridisiert, wobei der Zielbereich die HER2-Gensequenz umfasst, d) Hinzufügen eines an ein Enzym gebundenen Detektionsmoleküls zu der biologischen Probe unter Bedingungen, die bewirken, dass das Detektionsmolekül mit folgendem bindet: i) der markierten Subtraktions-Sondenbibliothek, oder ii) einem mit der Subtraktions-Sondenbibliothek verbundenen Zwischenmolekül; e) Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats zu der biologischen Probe, f) Detektieren des Zielbereichs durch Visualisieren des kolorimetrischen Substrats mit einem Hellfeldmikroskop, wodurch bestimmt wird, dass die biologische Probe eine Amplifikation der HER2-Gensequenz aufweist, und g) Identifizieren des Subjekts als geeignet für eine Behandlung mit anti-HER2-Antikörpern.
Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die anti-HER2-Antikörper HERCEPTIN^® umfassen.