-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zum Ermitteln
von Krebs.
-
Blasenkrebs
stellt das fünft
häufigste
Neoplasma und die zwölft
häufigste
Ursache von Tod durch Krebs in den Vereinigten Staaten dar, wo über 53.000
neue Fälle
jedes Jahr diagnostiziert werden. Über 95% der Blasenkrebsfälle in den
Vereinigten Staaten sind Übergangszellkarzinome
(TCC, wird manchmal auch als urotheliales Zellkarzinom bezeichnet).
Das Tumorstadium ist der beste Prädikator der Prognose für Patienten mit
Blasenkrebs. Blasenkrebs wird entsprechend der Tiefe der Invasion
des Tumors und ob es Lymphknoten oder entfernte Metastasen gibt
oder nicht in Stadien eingeteilt. Nicht invasive Papillentumore
(die häufigste
und am wenigstens aggressive Art von Blasentumor) werden als Stadium
pTa-Tumor bezeichnet. „Flache" TCC, häufiger als „Karzinom
in situ" (CIS) bezeichnet,
ist ein aggressiverer jedoch nicht so häufig auftretender Tumor, der
mit einer hohen Progressionsrate zu einer invasiven Krankheit in
Verbindung steht. CIS wird das Stadium pTIS zugeordnet. Tumore,
die durch die Basalmembran des Epitheliums in die darunterliegende
lamina propria eingedrungen sind, wird das Stadium pT1 zugeordnet.
Ein Tumor, der in den Muskel der Blase eingedrungen ist, ist ein
Stadium pT2 Tumor. Die Invasion durch den Muskel in das die Blase
umgebende Gewebe ist ein pT3 Tumor. Die Invasion in die umgebenden
Organe ist ein pT4 Tumor. Der Begriff „oberflächlicher" Blasenkrebs bezieht sich auf pTa, pTIS
und pT1 Tumore. Muskel invasiver Blasenkrebs bezieht sich auf pT2,
pT3 und pT4 Tumore.
-
Etwa
80% der Blasenkrebsfälle
liegen als „oberflächlicher" Blasenkrebs und
die restlichen 20% als muskelinvasiver Blasenkrebs vor. Patienten
mit „oberflächlichem" Blasenkrebs erforderen
keine Zystektomie (d.h. Entfernung der Blase), besitzen jedoch ein
hohes Tumor-Wiederkehr-Risiko, und werden auf die Tumor-Wiederkehr
und/oder Fortschritt auf einer regelmäßigen Basis (üblicherweise
alle drei Monate für
die ersten zwei Jahre, alle sechs Monate für die nächsten zwei Jahre, und danach
jedes Jahr) überwacht.
Die Behandlung von oberflächlichem
Blasenkrebs besteht im Allgemeinen aus der operativen Entfernung
von Papillentumoren und die Behandlung von CIS mit Bacillus-Calmette
Guerin (BCG). Patienten mit muskelinvasiver Krankheit werden durch
Zystektomie behandelt und weisen eine relativschlechte Prognose
im Vergleich zu Patienten mit „oberflächlichem" Blasenkrebs auf.
-
Unglücklicherweise
präsentieren
sich 80–90%
der Patienten mit muskelinvasiven Blasenkrebs ursprünglich mit
muskelinvasiver Krankheit. Ein großer Anteil der geschätzten 10.000
Todesfälle
pro Jahr von Blasenkrebs entfallen auf diese Gruppe von Patienten.
Die Tatsache, das viele Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs
sich auf diese Weise präsentieren,
weist darauf hin, dass Screening Programme, die Blasenkrebs zu einem
früheren
Stadium detektieren, dabei helfen können, die Gesamt-Mortalität von dieser
Krankheit zu reduzieren. Tatsächlich
weisen zumindest zwei große
Screening Studien darauf hin, dass Screening dabei hilft, Blasenkrebs
zu früheren
Stadien zu identifizieren. Messing et al., Urology, 45: 387–396, 1995;
und Mayfield und Whelan, Br. J. Urol. 82(6): 825–828, 1998.
-
Alcaraz
A. et al: "Aneuploidy
and aneusomy of chromosome 7 detected by fluorescence in situ hybridisation
are markers of poor prognosis in prostate cancer" Cancer Research, Band 54, – 1. August
1994 (1994-08-01) Seiten 3998-4002, XP002142798. Dieses Dokument
offenbart die Analyse von Prostatakrebs-Proben unter Verwendung
von FISH Einzel-Sonden-Hybridisationen,
die mit Sonden zu der mittig-distalen Yq Region von 11 Chromosomen
durchgeführt
werden.
-
Persons
D. et al: „Chromosome-specific
aneusomy in carcinoma of the breast" Clin. Cancer Research, Band 2, – Mai 1996
(1996-05) Seiten 883–888,
XP002142799. Dieses Dokument offenbart die Analyse von Gewebeproben
duktaler Karzinome der Brust auf chromosomale Anormalitäten. Einzel-
oder Doppel-Sonden-Hybridisationen wurden mit Sonden zu 11 Chromosomen
durchgeführt.
-
Zhang
FF, Arber DA, Wilson TG, Kawachi MH, Slovak ML. „Toward the validation of
aneusomy detection by fluorescence in situ hybridisation in bladder
cancer" Clin Cancer
Res 1997 Dezember; 3 (12 Pt 1): 2317–2328. Dieses Dokument offenbart
die Untersuchung von Tumor-Proben und Blasenspülungen unter Verwendung von
FISH. Einzel- oder Doppel-Hybridisationen
wurden durchgeführt.
Die Analyse wurde als erfolgreich erachtet, wenn 200 Zellkerne für jede der
sechs Sonden gezählt
wurden.
-
Sauter
G. Moch H, Carroll P, Kerschmann R, Mihatsch MJ, Waldman FM. „Chromosome-9
loss detected by fluorescence in situ hybridisation in bladder cancer" Int J Cancer. 1995
April 21: 64(2): 99–103.
Dieses Dokument offenbart die Analyse von Tumor-Proben auf Chromosom 9-Anormalitäten unter
Verwendung von FISH. Einzel- oder Doppel-Hybridisationen wurden mit einer Vielzahl
von Sonden durchgeführt.
-
Li
M, Zhang ZF, Reuter VE, Cordon-Cardo C. "Chromosome 3 allelic losses and microsatellite
alterations in transitional cell carcinoma of the urinary bladder" Am J. Pathol. 1996
Juli; 149(1): 229–35.
Dieses Dokument offenbart eine Deletions-Analyse von Chromosom 3 in
72 Fällen
von Übergangszellkarzinomen
der Harnblase unter Verwendung von Mikrosatelliten.
-
Das
Dokument
US 5759781 (02.06.1998)
offenbart ein Verfahren zum Screenen auf Krebs in einem Lebenswesen.
Die Diagnose von Krebs ist als die erste der „Verwendungen der vorliegenden
Erfindung" beschrieben,
welche erläutert,
dass „Unter
ihren primären
Anwendungen die zytogenetische Diagnose von Krankheit, komplexe
Tumor-Karyotypisierung [...] Krebse (insbesondere [...] Brustkrebs),
Leukämien)
...", und dass das
Verfahren dazu dient, die technischen Schwierigkeiten bei der Routine
Karyotypisierung für „Die Ermittlung
von wiederkehrenden genetischen Veränderungen in soliden Tumorgeweben" (siehe Spalte 26,
Zeilen 1–30)
dient. Das Verfahren weist auf: (i) das Hybridisieren eines Satzes
von 24 chromosomalen Sonden, die gegen alle menschlichen Chromosome
gerichtet sind (vergleiche Spalte 2, Zeilen 34–61) durch kombinatorische
multi-fluor FISH; (ii) das Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit
von aneusomen Zellen (vergleiche Spalte 2, Zeile 62 bis Spalte 3,
Zeile 56; Spalte 6, Zeile 42; Beispiel 1); und (iii) das Korrelieren
der Gegenwart besagter aneusomischer Zellen mit Krebs (siehe Spalte
26, Zeilen 1–30;
Spalte 1, Zeile 20, bis Spalte 2, Zeile 32).
-
Das
Dokument BIOSIS-PREV 198682045777 („2 DIMENSIONAL HISTOGRAMS
OF NUCLEAR AREA AND NUCLEAR SHAPE IN DAIGNOSIS OF ASTROCYTOMAS AND
GLIOBLASTOMAS";
MARTIN H; VOSS K; HUFNAGL P; Zentralblatt für Allgemeine Pathologie und
Pathologische Anatomie 1986 Band 131, NR 2, Seiten 137–142) offenbart
einen Schritt zum Selektieren von Zellen mit nuklearen Anomalitäten, und dass
die Korrelation zwischen der anomalen Kerngröße und der Form einer Zelle
und der Wahrscheinlichkeit, neoplastisch zu sein, in der Krebsforschung
verwendet wird.
-
Zytoskopie
und Urin-Zytologie waren die Hauptstützen der Blasenkrebs-Detektion über die
letzten mehreren Dekaden. Mehrere Studien haben jedoch gezeigt,
dass die Zytologie eine enttäuschend
geringe Sensitivität
für die
Blasenkrebs-Detektion hat. Mao et al., Science, 271: 659–662, 1996;
Ellis et al., Urology, 50: 882–887,
1997; und Landman et al., Urology 52: 398–402, 1998. Aus diesem Grund
gab es ein großes Interesse
in der Entwicklung von neuen Untersuchungen, die eine erhöhte Sensitivität für die Ermittlung
von Blasenkrebs aufweisen. Zu Beispielen. von neuen Untersuchungen,
die für
die Blasenkrebs-Ermittlung entwickelt wurden, zählen Tests, die Blasentumorantigene
ermitteln, z.B. BT-Test (C. R. Bard, Inc., Murrayhill, NJ), NMP-22,
FDP, etc., Teste, die erhöhte
telomerase Aktivität
ermitteln (üblicherweise
mit Malignität
in Verbindung stehend) oder Tests, die genetische Veränderungen
in Harnzellen und Blasenspülungen
ermitteln (z.B. Fluoreszenz in situ Hybridisation (FISH) und Mikrosatelliten Analyse).
Obwohl die FISH-Analyse sensitiver als andere Ermittlungsverfahren
sein kann, muss eine große
Anzahl von Zellen gezählt
werden, und als Folge davon wird die Analyse zeitaufwendig und teuer.
-
Die
vorliegende Erfindung bezweckt die oben genannten Nachteile des
Standes der Technik durch Bereitstellen von Mitteln und Verfahren
für die
schnelle, jedoch sensitive, Ermittlung von Krebs zu überkommen oder
zu verbessern.
-
Die
Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass ein schnelles,
sensitives Verfahren für
das Ermitteln von Krebs auf dem Vorhandensein von aneusomen Zellen
in einer ausgewählten
Teilmenge von Zellen einer biologischen Probe basieren kann. Die
Auswahl einer Teilmenge von Zellen, die für chromosomale Anomalien zu
evaluieren sind, reduziert die Anzahl von Zellen, die zu analysieren
sind, was eine Analyse ermöglicht,
die auf eine schnelle Art und Weise durchgeführt wird, während die Sensitivität beibehalten
oder sogar verbessert wird. Die Erfindung bietet ebenso einen Satz
von chromosomalen Sonden, die ausgewählt sind, um die optimale Sensitivität in der
FISH-Analyse bereitzustellen und Ausrüstungssätze für das Ermitteln von Krebs,
die Sätze
von chromosomalen Sonden beinhalten.
-
In
einem Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zum Screenen für Krebs
in einem Lebewesen, welches aufweist:
- (a) Hybridisieren
eines Satzes von chromosomalen Sonden, die aus einer zentromeren
Sonde für
jedes der Chromosome 3,7 und 17 und einer ortsspezifischen Sonde
für 9p21
besteht mit einer biologischen Probe von dem Lebewesen;
- (b) Auswählen
der Zellen aus der genannten biologischen Probe auf Basis einer
oder mehreren Kern-Anomalien;
- (c) Ermitteln der Anwesenheit oder Abwesenheit von aneusomischen
Zellen in den ausgewählten
Zellen durch Überprüfung des
Hybridisations-Musters des Satzes von chromosomalen Sonden in jeder
der ausgewählten
Zellen; und
- (d) Korrelieren der Anwesenheit der aneusomischen Zellen in
den ausgewählten
Zellen mit Krebs in dem Lebewesen.
-
Die
biologische Probe kann Urin, Blut, Cerebrospinalflüssigkeit,
Pleuralflüssigkeit,
Sputum, Peritonealflüssigkeit,
Blasenspülung,
Mundspülung,
Gewebeproben, Abtupfpräparate
oder Feinnadelabsaugung sein, und kann vor der Verwendung konzentriert
werden. Urin ist eine besonders nützliche biologische Probe.
Die Zellen können
durch jedes geeignete Mittel, wie z.B. Kernmorphologie, einschließlich Kerngröße und Form, ausgewählt werden.
Die Kernmorphologie kann durch DAPI Färbung beurteilt werden. Das
Verfahren ist für das
Ermitteln von Krebsen, wie Blasenkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs,
Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Kolorektalkrebs, Nierenkrebs und
Leukämie
nützlich.
Das Verfahren ist besonders für
das Ermitteln von Blasenkrebs geeignet.
-
Die
chromosomalen Sonden können
z.B. fluoreszierend markiert werden.
-
Die
Erfindung bietet auch einen Satz von chromosomalen Sonden, die aus
zentromeren Sonden für die
Chromosomen 3, 7 und 17, und aus der locus-spezifischen Sonde 9p21
besteht, sowie einen Ausrüstungssatz
für das
Ermitteln von Krebs, welcher einen solchen Satz aufweist. Die chromosomalen
Sonden können z.B.
fluoreszierend markiert werden.
-
Wenn
nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen
und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie für gewöhnlich durch
einen Fachmann auf dem Gebiet, zu welchem diese Erfindung gehört, verstanden
wird. Obwohl Verfahren und Materialen ähnlich oder äquivalent
zu den hierin beschriebenen verwendet werden können, um die Erfindung auszuführen, sind
geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Zusätzlich sind
die Materialien, Verfahren und Beispiele nur illustrativ und nicht
beabsichtigt, einschränkend
zu sein. Alle Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der
folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen offensichtlich.
-
Die
Erfindung bietet vorteilhafterweise ein schnelles, sensitives Verfahren
für das
Ermitteln von Krebs, und kann verwendet werden, um Lebewesen mit
einem Risiko für
Krebs einschließlich
soliden Tumoren und Leukämien
zu screenen, oder um Patienten, die mit Krebs diagnostiziert wurden,
auf Tumor-Wiederkehr zu überwachen.
Zum Beispiel können
Lebewesen, die für
Blasenkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs,
Kolorektalkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Nierenkrebs oder Leukämie gefährdet sind,
gescreent werden, oder für
Wiederkehr überwacht
werden. Im Allgemeinen wird ein Satz von chromosomalen Sonden an
Zellen (aus Urin oder einer biologischen Probe) auf einem Objektträger hybridisiert.
Die Zellen auf dem Objektträger
werden dann bei einer relativ geringen Leistung (z.B. 200–400 X)
auf morphologische Merkmale, die stark suggestiv für Malignität sind (z.B.
erhöhte
Kerngröße oder
unregelmäßige Kernform),
gescannt. Die Zellkerne der zytologisch anormalen Zellen werden
dann auf chromosomale Anomalien durch Umschalten des Objektivs auf
eine höhere
Leistung (z.B. 600–1000
X) und „umdrehen" der Filter untersucht,
um zu bestimmten, ob die Zelle aneusomisch ist oder nicht. Die Verwendung
dieses Verfahrens reduziert die aufgewendete Zeit, um Zellen zu
beurteilen, die eine niedrige Wahrscheinlichkeit aufweisen, neoplastisch
zu sein, und ermöglicht
dem Untersucher, dessen Anstrengung auf Zellen zu fokusieren, die
eine viel höhere
Wahrscheinlichkeit aufweisen, neoplastisch zu sein und eine Aneusomie
zeigen.
-
In Situ Hybridisation
-
Die
Anwesenheit oder Abwesenheit von aneusomischen Zellen kann durch
jedes geeignete Verfahren, einschließlich in situ Hybridisation,
bestimmt werden. „Aneusome
Zellen" sind Zellen
mit einer anomalen Anzahl von Chromosomen oder mit chromosomalen
Strukturveränderungen,
wie hemizygotischer oder homozygotischer Verlust einer spezifischen
chromosomalen Region. Typischerweise werden aneusome Zellen mit einem
oder mehreren chromosomalen Zuwächsen,
d.h. drei oder mehreren Kopien eines gegebenen Chromosoms, als Test
positiv in dem oben beschriebenen Verfahren betrachtet, obwohl Zellen,
die eine Monosomie und Nullisomie zeigen, ebenfalls Test positiv
unter bestimmten Umständen
betrachtet werden können.
Im Allgemeinen beinhaltet die in situ Hybridisation die Schritte
des Fixierens einer biologischen Probe, des Hybridisieres einer
chromosomalen Probe an eine Ziel-DNA,
die innerhalb der fixierten biologischen Probe enthalten ist, des
Waschens, um nicht spezifische Bindung zu entfernen, und des Detektierens
der hybridisierten Sonde.
-
Eine „biologische
Probe" ist eine
Probe, die Zellen oder zelluläres
Material enthält. Üblicherweise
wird die biologische Probe vor der Hybridisation konzentriert, um
die Zelldichte zu erhöhen.
Zu nicht limitierenden Beispielen von biologischen Proben zählen Urin,
Blut, Cerebrospinalflüssigkeit
(CSF), Pleuraflflüssigkeit,
Sputum und Peritonealflüssigkeit,
Blasenspülungen,
Sekretionen (z.B. Brustsekretion), Mundspülungen, Gewebeproben, Abtupfpräparate oder
Feinnadel-Absaugungen. Die Art der biologischen Probe, die in den
hierin beschriebenen Verfahren verwendet wird, hängt von der Art des Krebses,
der zu detektieren gewünscht
wird, ab. Zum Beispiel liefern Urin und Blasenspülungen nützliche biologische Proben
für die
Ermittlung von Blasenkrebs und zu einem geringeren Ausmaß Prostata-
oder Nierenkrebs. Pleuralflüssigkeit
ist für
das Detektieren von Lungenkrebs, Mesotheliom oder metastatischen
Tumoren (z.B. Brustkrebs) nützlich,
und Blut ist eine nützliche
biologische Probe für
das Detektieren von Leukämie.
Für Gewebeproben
kann das Gewebe fixiert und für
das Sektionieren in Paraffin platziert werden oder gefroren und
in dünne
Sektionen geschnitten werden.
-
Typischerweise
werden die Zellen aus einer biologischen Probe mittels Standardtechniken
geerntet. Zum Beispiel können
die Zellen durch Zentrifugieren einer biologischen Probe, wie Urin,
geerntet werden und die pelletierten Zellen resuspendiert werden. Üblicherweise
werden die Zellen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert. Nach
dem Zentrifugieren der Zell-Suspension, um das Zellpellet zu erhalten,
können
die Zellen zum Beispiel in Säurealkohollösungen,
sauren Acetonlösungen,
oder Aldehyden, wie Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd
fixiert werden. Zum Beispiel kann ein Fixiermittel, welches Methanol
bzw. Eisessig in einem Verhältnis
von 3:1 enthält,
als Fixiermittel verwendet werden. Eine neutrale gepufferte Formalinlösung kann
ebenfalls verwendet werden, und enthält etwa 1–10% von 37–40% Formaldehyd in einer wässrigen
Natriumphosphatlösung.
Objektträger,
die die Zellen enthalten, können
durch Entfernen eines Großteils
des Fixiermittels hergestellt werden, was die konzentrierten Zellen
in nur einem Teil der Lösung
suspendiert belässt.
-
Die
Zellsuspension wird auf die Objektträger aufgetragen, so dass sich
die Zellen auf dem Objektträger nicht überlappen.
Die Zelldichte kann durch Licht- oder Phasenkontrast-Mikroskop gemessen
werden. Zum Beispiel werden die Zellen, die von einer 20–100 ml
Urinprobe geerntet wurden, typischerweise in einem Endvolumen von
etwa 100 bis 200 μl
Fixiermittel resuspendiert. Drei Volumina dieser Suspension (üblicherweise 3,
10 und 30 μl)
werden dann in 6 mm Kammern eines Objektträgers getropft. Die Zellularität (d.h.
Zelldichte) in diesen Kammern wird dann mit einem Phasenkontrastmikroskop
beurteilt. Wenn die Kammer, die das größte Volumen der Zellsuspension
enthält,
nicht genügend
Zellen enthält,
wird die Zellsuspension konzentriert und in eine andere Kammer gegeben.
-
Vor
der in situ Hybridisation werden chromosomale Sonden und chromosomale
DNA, die innerhalb der Zelle enthalten sind, denaturiert. Die Denaturierung
wird typischerweise durch Inkubieren in der Gegenwart eines hohen
pH's, Hitze (z.B.
Temperaturen von etwa 70°C
bis etwa 95°C),
organischen Lösungsmittel,
wie Formamid und Tetraalkylammonium Halogenide, oder Kombinationen
davon durchgeführt.
Zum Beispiel kann chromosomale DNA durch eine Kombination von Temperaturen über 70°C (z.B. etwa
73°C) und
einem Denaturierungspuffer, der 70% Formamid und 2 × SSC (0,3
M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat) enthält, denaturiert werden. Die
Denaturierungs-Bedingungen werden üblicherweise so festgelegt,
dass die Zellmorphologie konserviert wird. Chromosomale Sonden können durch
Wärme denatoriert
werden. Zum Beispiel können Sonden
auf etwa 73°C
für etwa
5 Minuten erwärmt
werden.
-
Nach
dem Entfernen von Denaturierungs-Chemikalien oder Bedingungen, werden
die Sonden an die chromosomale DNA unter Hybridisierungs-Bedingungen
angelagert. „Hybridisierungs-Bedingungen" sind Bedingungen,
die das Anlagern zwischen einer Sonde und der Ziel-chromosomalen
DNA fördern.
Hybridisierungs-Bedingungen variieren in Abhängigkeit von den Konzentrationen,
der Basenzusammensetzungen, der Komplexitäten, und Längen der Sonden sowie der Salzkonzentrationen,
der Temperaturen, und der Inkubationslänge. Je höher die Sondenkonzentration,
desto höher
ist die Wahrscheinlichkeit der Bildung eines Hybrids. Zum Beispiel
werden in situ Hybridisationen üblicherweise
in Hybridisierungspuffer, die 1–2 × SSC, 50% Formamid
und Blockierungs-DNA, um die nicht spezifische Hybridisation zu
unterdrücken,
enthält,
durchgeführt.
In Allgemeinen weisen Hybridisations-Bedingungen, wie oben beschrieben,
Temperaturen von etwa 25°C
bis etwa 55°C,
und Inkubationsdauern von etwa 0,5 h bis etwa 96 h auf. Insbesondere
kann die Hybridisation bei etwa 32°C bis etwa 40°C für etwa 2
bis etwa 16 Stunden durchgeführt
werden.
-
Die
nicht spezifische Bindung der chromosomalen Sonden an DNA außerhalb
der Zielregion kann durch eine Reihe von Waschungen entfernt werden.
Temperatur und Konzentration des Salzes in jeder Waschung hängt von
der gewünschten
Stringenz ab. Zum Beispiel für
hohe Stringenzbedingungen können
die Waschungen bei etwa 65°C
bis etwa 80°C
unter Verwendung von 0,2 × bis
etwa 2 × SSC
und etwa 0,1% bis etwa 1% eines nicht ionischen Detergenzes, wie
etwa Nonidet P-40 (NP40) ausgeführt
werden. Die Stringenz kann durch verringern der Temperatur der Waschungen
oder durch erhöhen
der Salzkonzentration in den Waschungen gesenkt werden.
-
Chromosomale
Sonden
-
Geeignete
zentromere Sonden für
die in situ Hybridisation gemäß der Erfindung
hybridisieren (d.h. Bildung eines Duplex) mit sich wiederholender
DNA, die mit dem Zentromer eines Chromosoms in Verbindung steht.
Zentromere von Primaten-Chromosomen enthalten eine Komplexfamilie
von langen DNA Tandem Repeats, die aus einer Monomer Wiederholungslänge von
etwa 171 Basenpaare aufgebaut sind, die als Alpha-Satelliten DNA
bezeichnet wird.
-
Chromosomale
Sonden werden für
ihre maximale Sensitivität
und Spezifität
ausgewählt.
Die Verwendung eines Satzes von chromosomalen Sonden (d.h. zwei
oder mehr Sonden) bietet eine höhere
Sensitivität und
Spezifität,
als die Verwendung einer beliebigen chromosomalen Sonde. Somit sind,
basierend auf den Ergebnissen hierin, chromosomale Sonden, die die
häufigsten
aneusomen Chromosomen detektieren und die einander komplementieren,
in einem Satz enthalten. Basierend auf den hierin bestimmten Sondendiskriminierungswerten,
wird ein Satz von chromosomalen Sonden, der die zentromeren Sonden
für die
Chromosome 3, 7 und 17 und eine Sonde für die 9p21 Region des Chromosoms
9 enthält,
verwendet. Sowie hierin verwendet, zeigte eine Sonde für Chromosom
7, wenn allein verwendet, eine hohe Sensitivität, und konnte etwa 76% der Blasenkrebse
ermitteln. Sonden für
die Chromosome 3 und 17 und für
die 9p21 Region von Chromosom 9 waren in der Lage, zusätzliche
Blasenkrebsfälle,
die keine Anomalie mit der Chromosom 7 Sonde allein zeigten, zu
ermitteln. Die Kombination von Sonden für die Chromosome 3, 7, 17 und
für 9p21
lieferte eine Sensitivität von
etwa 95% für
das Ermitteln von Blasenkrebs in der hierin beschriebene Gruppe
von Patienten.
-
Chromosomale
Sonden sind üblicherweise
etwa 50 bis etwa 1 × 105 Nukleotide lang. Längere Sonden weisen üblicherweise
kleinere Fragmente mit einer Länge
von etwa 100 bis etwa 500 Nukleotide auf. Sonden, die mit zentromerer
DNA und locus-spezifischer DNA hybridisieren, sind kommerziell erhältlich,
z.B. von Vysis, Inc. (Downers Grove, IL), Molecular Probes, Inc.
(Eugene, OR), oder von Cytocell (Oxfordshire, UK). Alternative können Sonden
nicht kommerziell von chromosomaler oder genomischer DNA durch Standardtechniken hergestellt
werden. Zum Beispiel zählen
zu DNA-Quellen, die verwendet werden können, genomische DNA, klonierte
DNA-Sequenzen, somatische Zellhybride, die ein oder ein Teil eines
menschlichen Chromosoms zusammen mit dem normalen Chromosom-Komplement
der Wirtszelle enthalten, und Chromosome, die durch Flusszytometrie
oder Mikrodissektion gereinigt wurden. Die interessierende Region
kann durch Klonierung oder durch ortsspezifische Amplifikation mittels
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) isoliert werden. Siehe zum Beispiel
Nath and Johnson, Biotechnic Histochem., 1998, 73(1): 6–22, Wheeless
at al., Cytometry, 1994, 17: 319–326, und U.S. Patent No. 5.491.224.
-
Chromosomale
Sonden werden typischerweise direkt mit einem Flurophor, einem organischen
Molekül,
das nach dem Absorbieren von Licht niederer Wellenlänge/höherer Energie
fluoresziert, markiert. Das Fluorophor ermöglicht das Visualisieren der
Sonde ohne ein zweites Detektionsmolekül. Nach dem kovalenten Anheften
eines Flurophors an ein Nukleotid, kann das Nukleotid direkt in
die Sonde unter Verwendung von Standarttechniken, wie Nick-Translation, random
priming, und PCR-Markierung, eingebaut werden. Alternativ können die
Deoxycitidin-Nukleotide innerhalb der Sonde mit einem Linker transaminiert
werden. Das Fluorophor wird dann kovalent an die transaminierten
Deoxycytidin-Nukleotide angelagert. Siehe U.S. Patent No. 5.491.224.
-
Flurophore
unterschiedlicher Farben werden ausgewählt, so dass jede chormosomale
Sonde in dem Satz unterschiedlich visualisiert werden kann. Z.B.
kann eine Kombination der folgenden Fluorophore verwendet werden:
7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure
(AMCA), Texas RedTM (Molecular Probes, Inc.,
Eugene, OR), 5-(und-6)-Carboxy-X-rhodamin, Lissamine rhodamine B,
5-(und-6)-Carboxyfluorescein, Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC),
7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure, tetramethylrhodamine-5(und-6)-isothioncyanat,
5-(and-6)-carboxytetramethylrhodamin,
7-hydroxycoumarin-3-carbonsäure,
6-[Fluorescein 5-(and-6)-carboxamido]hexansäure, N-(4,4-Difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenpropionsäure, Eosin-5-isothiocyanat,
Erythrosin-5-isothiocyanat, and CascadeTM blue acetylazide
(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Die Sonden werden mit einem
Fluoreszenzmikroskop und einem geeigneten Filter für jedes
Fluorophor, oder unter Verwendung von Dual- oder Tripple-Band-Pass
Filtersätzen,
um mehrere Fluorophore zu beobachten, betrachtet. Siehe z.B. U.S.
Patent No. 5,776,688. Alternativ können Techniken, wie Flusszytometrie,
verwendet werden, um das Hybridisationsmuster der chromosomalen
Sonden zu untersuchen. Die Sonden können durch jedes andere Mittel
markiert werden, einschließlich
jenen, die Fachleuten bekannt sind und schließen die indirekte Markierung
mit Biotin oder Digoxygenin, der die Markierung mit radioaktiven
Isotopen, wie 32P und 3H
ein, obwohl dann sekundäre
Detektionsmoleküle
oder eine weitere Bearbeitung erforderlich ist, um die Proben zu
visualisieren. Zum Beispiel kann eine mit Biotin indirekt markierte
Sonde durch Avidin, welches an einen nachweisbaren Marker konjugiert
ist, detektiert werden. Z.B. kann Avidin an einen enzymatischen
Marker, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase konjugiert
werden. Enzymatische Marker können
den Standard-Kolorimetrischen Reaktionen unter Verwendung eines
Substrats und/oder eines Katalysators für das Enzym ermittelt werden.
Zu Katalysatoren für
die alkalische Phosphatase zählen 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat
und Nitro-Blau-Tetrazolium. Diaminobenzoat kann als ein Katalysator
für die
Meerrettich-Peroxidase
verwendet werden.
-
Auswahl von Zellen
-
Gemäß der Erfindung
werden die Zellen aus einer Probe unter Verwendung der Kernmorphologie
ausgewählt.
Die Zellen können
aus den Zellen einer biologischen Probe (z.B. Urin, etc.) auf einem
Objektträger vor
der Beurteilung, ob aneusome Zellen vorhanden oder abwesend sind,
mikroskopisch ausgewählt
werden. „Auswählen" bezieht sich auf
die Identifikation von Zellen, die auf Grund einer oder mehrerer
cytologischer (hauptsächlich
nuklearer) Anomalie, wie Kernvergrößerung, Kernunregelmäßigkeiten
oder anormaler Kernfärbung
(üblicherweise
ein geflecktes Färbungsmuster)
eher neoplastisch sind. Diese Kernmerkmale können mit Nukleinsäurefärbemittel
oder Farbstoffen, wie Propidiumiodid oder 4,6-Diamidiono-2-phenylindoldihydrochlorid
(DAPI) beurteilt werden. Propidiumiodid ist ein rot fluoreszierender
DNA-spezifischer Farbstoff, der bei einer Emissions-Peak-Wellenlänge von
614 nm beobachtet werden kann. Typischerweise wird Propidiumiodid
bei einer Konzentration von etwa 0,4 μg/ml bis etwa 5 μg/ml eingesetzt.
DAPI, ein blau fluoreszierendes DNA-spezifisches Färbemittel, das bei einer Emissions-Peak-Wellenlänge von
452 nm beobachtet werden kann, wird im Allgemeinen bei einer Konzentration
im Bereich von etwa 125 ng/ml bis etwa 1000 ng/ml eingesetzt. Das Färben von
Zellen mit DAPI oder Propidiumiodid wird im Allgemeinen, nach dem
die in-situ-Hybridization durchgeführt ist, ausgeführt.
-
Das Bestimmen der Anwesenheit
von Aneusomen Zellen
-
Nachdem
eine Zelle basierend auf einem oder mehreren der festgelegten Kriterien
ausgewählt
ist, wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Aneusomie üblicherweise
durch Untersuchen des Hybridisationsmusters von chromosomalen Sonden
(d.h. die Anzahl von Signalen für
jede Sonde) in jeder ausgewählten
Zelle, und Aufzeichnen der Anzahl von Chromosomensignalen, beurteilt.
Dieser Schritt wird wiederholt bis das Hybridisationsmuster in zumindest
vier Zellen beurteilt wurde, wenn alle vier Zellen aneusomisch sind.
In einer typischen Untersuchung wird das Hybridisationsmuster in
etwa 20 bis etwa 25 ausgewählten
Zellen beurteilt.
-
Zellen
mit mehr als zwei Kopien von mehreren Chromosomen (d.h. Zuwächse von
mehreren Chromosomen) werden als Krebs-positiv betrachtet. Proben,
die etwa 20 ausgewählte
Zellen und zumindest etwa vier Test-positive-Zellen enthalten, werden üblicherweise
als Krebs-positiv
erachtet. Wenn weniger als vier Test-positive-Zellen gefunden werden,
wird der Grad der Chromosomploidie bestimmt. Ein Krebs-positives
Ergebnis wird ebenfalls angezeigt, wenn mehr als 30% der Zellen
einen hemizygoten oder homozygoten Verlust (d.h., Nullisomie) einer
spezifischen Chromosomenregion wie etwa ein Verlust von 9p21 in
Blasenkrebs, zeigen. Nullisomie kann als kein Artefakt durch Beobachten
der umgebenden normal erscheinenden Zellen bestätigt werden, um zu sehen, ob
sie zwei Signale für
die spezifische chromosomale Region aufweisen.
-
Screening und Überwachen
von Patienten für
Krebs
-
Die
hierin beschriebenen Verfahren können
verwendet werden, um Patienten auf Krebs zu screenen, oder können verwendet
werden, um mit Krebs-diagnostizierte Patienten zu überwachen.
Zum Beispiel werden in einer Screening-Art Patienten mit dem Risiko
für Blasenkrebs,
wie Patienten die älter
als 50 sind und rauchen, oder Patienten die chronischaromatischen
Arminen ausgesetzt sind, mit dem Ziel einer früheren Detektion von Blasenkrebs
gescreent. Die hierin beschriebenen Verfahren können allein oder in Verbindung
mit anderen Tests, wie der Hämoglobin-Messtab-Test
verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Patient mit einem erhöhten Blasenkrebsrisko
auf Blasenkrebs durch Ermitteln des Hämoglobins im Urin, d.h. Hämaturie,
gescreent werden. Während
eines solchen Screeningvorganges brauchen Patienten ohne Hämaturie
keine weitere Analyse, und werden stattdessen nach einer geeigneten
Zeitdauer erneut auf Hämaturie
untersucht, z.B., bei ihren jährlichen
Kontrolluntersuchungen. Proben von Patienten mit Hämaturie
werden unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren weiter
analysiert. Im Allgemeinen wird ein Satz von chromosomalen Sonden
mit der biologischen Probe hydidisiert, eine Teilmenge von Zellen
wird ausgewählt,
und die Anwesenheit von aneusomen Zellen in den ausgewählten Zellen
wird bestimmt. Patienten, die aneusome Zellen aufweisen, werden
weiter untersucht, z.B., durch Zytoskopie, und können, falls notwendig, eine
geeignete Behandlung empfangen. Nach der Behandlung werden Patienten
auf Krebswiederkehr unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren überwacht.
-
Die
höhere
Sensitivität
der hierin beschriebenen Verfahren weist darauf hin, dass diese
Technik Zytologie für
das Detektieren und Überwachen
von Krebsen, wie Blasenkrebs, ersetzen könnte. Die Mehrheit der Patienten
mit Blasenkrebs wird detektierbare aneusome Zellen aufweisen und
können
für die
Behandlungswirksamkeit und Tumorwiederkehr/Progression mit den hierin
beschriebenen Verfahren überwacht
werden. Ein kleiner Teil von Patienten mit zytoskopischem oder Biopsie-Beweis
von Blasenkrebs (hauptsächlich
jene mit nicht-invasiven Tumoren niedrigen Grades) kann keine nachweisbaren
aneusomen Zellen in ihrem Urin aufweisen. Diese Patienten (d.h.
jene mit Papillentumoren niedrigen Grades) werden eine sehr geringe
Rate an Tumorprogression auf und können bequem durch eine Kombination
der hierin beschriebenen Verfahren von Zytoskopie überwacht
werden. Das Auftreten von aneusomen Zellen im Urin von diesen Patienten
kann die Entwicklung eines aggressiveren Tumors in dieser Teilmenge
von Patienten ankündigen.
Die hohe Sensitivität und
Spezifität
des hierin beschriebenen für
aggressive Blasenkrebse FISH-Tests kann bei der Reduktion der Zytoskopiehäufigkeit
helfen.
-
Ausrüstungssätze
-
Die
vorliegende Erfindung bietet auch Ausrüstungssätze für die Ermittlung von Krebs.
Besagte Ausrüstungssätze weisen
einen Satz von chromosomalen Sonden auf, die aus zentromeren Sonden
für Chromosome
3, 7 und 17 und eine locus-spezifische Sonde 9p21 enthalten. Die
Ausrüstungssätze der
Erfindung können
zusätzlich
Mittel für
das Selektieren von Zellen aus einer Probe, wie oben beschrieben,
z.B. Nucleinsäure-Färbemittel
oder Farbstoffe; und/oder eine Karte aufweisen, die die Korrelation
von aneusomer Zellen mit Krebs andeuten.
-
Die
Erfindung wird in den folgenden Beispiele, die den Umfang der Erfindung,
wie in den Ansprüchen beschrieben,
nicht beschränken,
weiter beschrieben.
-
Beispiele
-
Beispiel
1 – Proben
und Probenvorbereitung: Die Proben beinhalteten Spontanurin von
21 Biopsie-bestätigten
Blasenkrebsfällen,
in welchen eine Diagnose entweder durch positive Zytologie oder
durch Histologie, in Fall von Zytologie-negativen Proben, gemacht.
Kontrollurinproben beinhalteten 9 Proben von normalen gesunden Donatoren
(Alter 25–80),
und drei Proben von Patienten mit Urogenitalkrankheiten außer Blasenkrebs.
-
Etwa
50 bis 200 ml Urin wurden pro Patient gesammelt. Urinproben wurden
bei 4°C
für weniger
als 48 Stunden gelagert, und durch Zentrifugation bei 1200 g für 5 Minuten
verarbeitet. Der Überstand
wurde verworfen, und das Pellet in 10 ml 0,075 M KCl resuspendiert,
und bei Raumtemperatur für
15 Minuten inkubiert. Die Proben wurden für 5 Minuten bei 1200 g zentrifugiert
und die KCl-Lösung
wurde entfernt. Die Pellets wurden in 10 ml eines 3:1 Methanol:Eisessig-Fixiermittels
resuspendiert, und für
8 Minuten bei 1200 g zentrifugiert. Das Fixiermittel wurde unter
Hinterlassen des Zellpellets vorsichtig entfernt, dieser Schritt
wurde zwei weitere Male wiederholt.
-
Die
Dichte der Objektträger
wurde durch häufiges Überprüfen unter
einem Phasenkontrastmikroskop mittels eines 20 × Objektives, zwischen den
Tropfen überwacht.
Im Allgemeinen wurde versucht, so viele Zellen wie möglich auf
dem Objektträger
zu erhalten, ohne eine Zellüberlappung
zu bekommen. Wenn eine Probe eine geringe Anzahl von Zellen enthielt,
wurde so viel Probe wie möglich
auf dem Objektträger
platziert. Bei Proben mit einer sehr geringen Anzahl von Zellen
wurde die gesamte Probe verwendet. Die Objektträger wurden über Nacht bei Raumtemperatur
getrocknet.
-
Die
Proben-enthaltenden Objektträger
wurden in 2 × SSC
bei 37°C
für 10
bis 30 Minuten inkubiert, dann in 0,2 mg/ml Pepsin für 20 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Die Objektträger
wurden dann zweimal in PBS, für
2 Minuten pro Waschung bei Raumtemperatur gewaschen. Die Zellen
wurden in 2,5% neutralem gepuffertem Formalin für 5 Minuten bei Raumtemperatur
fixiert. Die Objektträger
wurden erneut zweimal in PBS, für
2 Minuten pro Waschung, gewaschen. Nach der Dehydrierung für 1 Minute
in jeweils 70%, 85%, und 100% Ethanol wurden die Objektträger unmittelbar
verwendet oder in der Dunkelheit bei Raumtemperatur gelagert.
-
Drei
Mehrfarben-Sondensätze:
A, B, und C wurden in den anfänglichen
Hybridisationen verwendet. Die Sondensätze A–C enthielten die in Tabelle
1 gezeigten die Zentromeren/Locusspezifischen Sonden. Die Farbe
des für
das Markieren jeder Sonde verwendeten Flourophors ist ebenfalls
in Tabelle 1 gezeigt. Die chromosomalen Sonden (CEP®, chromosomal
enumeration probe: chromosomale Aufzählungssonde) wurden von Vysis,
Inc. (Downers Grove, IL) erhalten. Ein Aquafilter wurde verwendet,
um die Chromosome 17 und 18 zu visualisieren. Ein gelber Filter
wurde verwendet um die 9p21 Locusspezifische Sonde zu visualisieren,
und ein Dual-Rot/Grünfilter
oder individuelle Rot- oder Grünfilter
wurden verwendet, um die Chromosome 3, 7, 8, 9, 11 und Y zu visualisieren.
-
Tabelle
1 FISH Sondensätze
-
Die
Hybridisierungen wurden durch ein HYBrite-Verfahren oder einem konventionellen
Verfahren durchgeführt.
Bei dem HYBrite-Verfahren, wird ein HYBriteTM-System
von Vysis, Downers Grove, IL verwendet. Die Objektträger werden
auf dem HYBrite platziert, und etwa 10 μl Sondensatz wurde hinzugefügt, abgedeckt
und versiegelt. Das HYBrite wurde wie folgt programmiert: 73°C für 5 min,
dann 37°C
für 16
Stunden. Die Objektträger
wurden dann in 0,4 × SSC
(0,06 M Natriumchlorid/0,006 M Natriumzitrat)/0,3% NP-40 für 2 Minuten
bei 73°C
gewaschen, in 2 × SSC/0,1%
NP40 bei Raumtemperatur gespült
und luftgetrocknet. Die Objektträger
wurden mit ungefähr
10 μl DAPI
II (125 ng/ml 4,6-Diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid) gegengefärbt.
-
Bei
dem herkömmlichen
Verfahren (d.h. Coplin jar Verfahren), wird ein Mastermix, der die
chromosomalen Sonden enthält,
in Hybridisierungspuffer, der 50% Formamid, 2 × SSC, 0,5 μl/ml Cot1 DNA, und 2 μg/ml HP DNA
enthält,
hergestellt. Die Sondenmischung wurde bei 73°C für 5 Minuten denaturiert, und
die Objektträger
wurden im Denaturierungspuffer (70% Formamid, 2 × SSC) in einem Coplin-Jar
bei 73°C
für 5 Minuten (6–8 Objektträger/Gefäß) denaturiert.
Die Objektträger
wurden in jeweils 70%, 85% und 100% Ethanol für 1 Minute gespült. Ungefähr 10 μl Hybridizationsmischung
wurden auf jeden Objektträger
aufgetragen, mit einem Deckglas abgedeckt, und mit Gummizement versiegelt.
Die Hybridisation wurde in einer befeuchteten Kammer über Nacht
bei 37°C
durchgeführt.
Die Objektträger
wurden in 0,4 × SSC/0,3%
NP-40 bei 73°C
für 2 Minuten gewaschen,
dann in 2 × 0,4 × SSC/0,1%
NP-40 kurz bei Raumtemperatur gespült. Nach der Lufttrocknung wurden
die Objektträger
mit DAPI II gegengefärbt.
Die Proben wurden durch Aufzeichnen der Anzahl von FISH-Signalen
in 100 aufeinander folgenden Zellen gezählt.
-
Zusammengefasst
bietet dieses Beispiel, Verfahren zum Isolieren von Zellen aus einer
biologischen Probe und zum Hybridisieren eines Satzes von chromosomalen
Sonden an die Zellen.
-
Beispiel
2 – Ermittlung
von Blasenkrebs: Tabelle 2 bietet eine Zusammenfassung von mittels
Zytologie analysierten Proben. Insgesamt war die Urinzytologie in
13 von 21 Krebsfällen
positiv, was einer Sensitivität von
62% gleicht. Dieser Wert ist mit der publizierten Literatur übereinstimmend.
Die Zytologie detektierte Tumorzellen in 10 von 11 Blasenkrebspatienten
mit fortgeschrittenem Stadium der Krankheit (ersten 11 Einträge in Tabelle
2). Unter den 10 Patienten mit oberflächlichem Blasenkrebs (die letzten
10 Einträge
in Tabelle 2) waren 3 Patienten Zytologie positiv, 3 waren zweifelhaft
und 4 Patienten waren negativ. ND bezieht sich auf nicht bestimmt.
Zweifelhaft (E) bezieht sich auf Proben die verdächtig waren, jedoch nicht für Übergangszellkarzinom
(TCC) diagnostiziert sind. pTis bezieht sich auf Karzinom in situ,
und pTa bezieht sich auf nicht-invasive Papillar Karzinom. pT1 bezieht
sich auf die Invasion von Subepithelialem Bindegewebe durch den
Tumor; pT2 bezieht sich auf die Invasion von Muskel durch den Tumor;
pT3 bezieht sich auf die Invasion von perivesikalem Gewebe durch
den Tumor; pT4 bezieht sich auf die Invasion der Prostata, Gebärmutter,
Vagina, Beckenwand, oder Bauchdecke.
-
Der
Prozentsatz an aneusomen Zellen mit vier oder mehreren chromosomalen
Signalen gestattete die beste Unterscheidung zwischen der Krebsgruppe
und den normalen Fällen.
Einzel-Kopien Zuwächse oder Verluste
unter der Kontrollgruppe zeigte viel höhere Häufigkeiten und führte nicht
zu vergleichbaren Sensitivitäten
und Spezifitäten.
Der Prozentsatz an aneusomen Zellen, unter Verwendung dieser Definition,
wurden für jede
Probengruppe (Krebs und normal) und in jede Gruppe individuell bestimmt.
Unter Verwendung dieser Definition wurden die Proben auf folgende
Art analysiert.
-
Die
Unterscheidungsanalyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, wie gut
jede Probe, Krebsfälle von
den normalen Kontrollen differenzierte, unter Verwendung der Formel
-
-
In
dieser Formel sind M1 und M2 die mittleren Prozentsätze an aneusomen
Zellen mit vier oder mehr Signalen für Krebs (n = 21) bzw. normale
(n = 9) Gruppen und SD1 und SD2 sind die Standardabweichungen für jede Gruppe
von Proben. Tabelle 3 bietet eine Zusammenfassung der Ergebnisse
für die
Chromosom-Aufzählungs-Sonden
(CEP) unter Verwendung dieser Analyse.
-
Tabelle
2 Detektion
von Blasenkrebs mittels Zytologie
-
Tabelle
3 Sonden-Diskriminationswerte
-
Ein
Diskriminationswert von > 1,0,
das 95% Vertrauensintervall um welches zwei Populationen getrennt
sind, wurde als gut erachtet (unter Annahme einer Normalverteilung
und annähernd äquivalenten
Standardabweichungswerten). Bei diesen Kriterien waren 7, 3 und
17 waren die besten Sonden. Diese Analyse bietet Informationen in
Bezug auf die Sensitivität
und Spezifität von
individuellen Sonden, offenbart jedoch nicht die Sensitivität/Spezifität von unterschiedlichen
Sondenkombinationen.
-
Eine
Ausschlussgrenze von zwei Standardabweichungen über dem mittleren Prozentsatz
an aneusomen Zellen in normalen Zellen wurde als das Kriterium für die FISH
Positivität
für chromosomale
Zuwächse verwendet.
Andererseits sind 9p21 Veränderungen
bei Blasenkrebs als ein Verlust erklärt und werden somit als Nullisomie
evaluiert. Der für
die Nullisomie verwendete Ausschlusswert war drei Standardabweichungen größer als
der Mittelwert der normalen Proben. Der Prozentsatz an aneusomen
Zellen für
jeden Fall sind in Tabelle 4A für
normale Individuen und in Tabelle 4B für Krebspatienten nach der Probe
gezeigt. In Tabelle 4B sind die Proben unterhalb der Doppellinie
Zytologie falsch-negative Fälle
und ein schattierter Text weist auf falsch-negative FISH Ergebnisse
unter Verwendung der Ausschlusswerte von Tabelle 3 hin. Wie in Tabelle
4A gezeigt ist, ist der Prozentsatz an aneusomen Zellen (wie durch
chromosomalen Zuwachs definiert ist) in normalen Proben gering,
im Bereich von etwa 0,5% bis etwa 4,5%.
-
Tabelle
4A Prozentsatz
an aneusomen Zellen: normale Fälle
-
Tabelle
4B Prozentsatz
an aneusomen Zellen: Krebsfälle
-
Tabelle
5 FISH
und Zytologie-Ergebnisse für
normale und Blasenkrebs-Patienten
-
Insgesamt,
wie in Tabelle 4B gezeigt ist, zeigte Chromosom 7 die beste Sensitivität einer
beliebigen individuellen Sonde (76%, 16/21). Sonden für die Chromosome
3 und 9p21 komplimentierten Chromosom 7 auf diese Weise, dass sie
für einige
der Fälle
mit normal Chromosom 7 Ergebnissen positiv waren. In Kombination
ermittelten, die drei Sonden für
die Chromosome 3,7, und 9p21 20/21 Blasenkrebsfälle und wichtiger 7 von 8 Zytologie
falsch-negative
Fälle (Tabelle
4B). In diesem Datensatz gleicht dies einer Gesamtsensitivität von 95%.
-
Die
Chromosom-17-Sonde (zusammen mit der Chromosom-3-Sonde) ermittelte
die höchste
Anzahl von Zytologie falsch-negativen Proben (4/8).
-
Beispiel 3 – Vergleichsanalyse
mit Standardscreening-Verfahren:
-
190
Patienten von der Mayo Klinik wurden prospektive in diese Studie
eingeschrieben. Eine Mehrheit von den Patienten hatte entweder eine
frühere
Diagnose von Blasenkrebs oder wurden für eine mögliche Blasenkrebsanfangs-Diagnose
evaluiert (z.B. Mikrohämaturie).
Ein kleiner Anteil von Patienten wurde auf Urogenitalkrankheiten
außer
Blasenkrebs evaluiert. Zu den verglichenen Testmethodologien zählt Urinzytologie,
Zytoskopie, BTA STAT (C. R. Bard, Inc., Murray Hill, NJ), FISH,
und Hämoglobin-Messstab
(Bayer Corporation, Diagnostic Division, Elkhart, IN.).
-
Die
FISH wurde im Allgemeinen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Etwa
25 bis 200 ml Urin wurde pro Patient gesammelt. Urinproben wurden
bei 4°C
für bis
zu 48 Stunden gelagert, und durch Zentrifugation bei 600 g für 10 Minuten
verearbeitet. Der Überstand
wurde verworfen, und das Pellet in 25–50 ml 1 × Phoshat-gepufferter Salzlösung (PBS)
resuspendiert. Nach der Zentrifugation für 5 Minuten bei 600 g wurde der Überstand
erneut verworfen. Die Pellets wurden langsam in 1,5–5 ml Fixiermittel
(Methanol:Eisessig, 3:1) resuspendiert, und für 5 Minuten bei 600 g zentrifugiert.
Das Fixiermittel wurde vorsichtig entfernt und dieser Schritt wurde
zwei weiter Male wiederholt.
-
Nach
der letzten Zentrifugation wurde das Fixiermittel entfernt, was
die entsprechende Menge an Lösung
für das
Tropfen auf die Objektträger,
wie die 12-Circle 6 mm Shandon Lipshaw Objektträger übrig ließ. Wenn das Zellpellet sehr
klein und für
das Auge kaum sichtbar war, war ungefähr 100 μl über dem Pellet übrig. Wenn
der Zellpellet durch das Auge leicht sichtbar war, wurde so viel
Carnoys Fixiermittel wie möglich
entfernt, und 0,5 ml frisches Carnoys Fixiermittel wurde hinzugefügt. Wenn
kein Zellpellet sichtbar war, wurde häufig die gesamte Probe auf
den Objektträger
getropft. Ungefähr
3, 10, und 30 μl
Zellsuspension wurden dann in drei getrennte 0,6 ml Kammern eines
Shandon 12 Kammer Objektträgers
getropft. Die Zellularität
(d.h. Dichte von Zellen) in diesen Kammern wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop
beurteilt. Wenn die Kammer, die das geringste Zellsuspension-Volumen enthielt,
zu dicht ist, wurde die Zellsuspension weiters verdünnt und
ein Teil dieser Verdünnung
wird in eine vierte Kammer platziert. Wenn die Kammer, die das größte Zellsuspensionsvolumen
enthielt, nicht genug Zellen aufweist, wird die Zellsuspension konzentriert
und in eine vierte Kammer gegeben.
-
Proben
enthaltene Objektträger
wurden in 2 × SSC
bei 37°C
für 10
bis 30 Minuten inkubiert, dann in 0,2 mg/ml Pepsin für 10 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Die Objektträger
wurden dann in PBS zweimal, für
2 min pro Waschung, bei Raumtemperatur gewaschen. Die Zellen wurden
in 2,5% neutralem gepufferten Formalin für 5 Minuten bei Raumtemperatur
fixiert. Die Objektträger
wurden dann erneut in PBS für
5 Minuten gewaschen. Nach der Dehydrierung für 1 Minuten in jeweils 70%,
85%, und 100% Ethanol, wurden die Objektträger auf einem Objektträgerwärmer bei
45–50°C für 2 Minuten
getrocknet. Die Objektträger
wurden entweder in 100% Ethanol bei 4°C bis zur weiteren Verwendung
belassen oder wurden für
die FISH verwendet.
-
Hybridisation
wurde durch ein HYBrite-Verfahren oder einem herkömmlichen
Verfahren durchgeführt. Bei
dem HYBrite-Verfahren, wurde ein HYBriteTM System
von Vysis, Downers Grove, IL, verwendet. Die Objektträger wurden
auf dem HYBrite platziert, und etwa 3 μl Sonde wurden pro Ziel hinzugefügt, dann
wurden die Objektträger
abgedeckt und versiegelt. Das HYBrite wurde wie folgt programmiert:
73°C für 5 min,
dann 37°C
für 16
Stunden. Die Objektträger
wurden dann in 0,4 SSC (0,06 M Natriumchlorid/0,006 M Natriumcitrat)/0,3%
NP-40 für 2 Minuten
bei 73°C
gewaschen, in 2 × SSC/0,1%
NP40 bei Raumtemperatur gespült,
und luftgetrocknet. Die Objektträger
wurden mit etwa 3 μl
DAPI II (125 ng/ml 4, 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) gegengefärbt.
-
Bei
dem konventionellen Verfahren wurde ein Mastermix, der die Chromosomsonden
enthält,
in Hybridisations-Puffer, der 50% Formamid, 2 × SSC, 0,5 μg/ml Cot1 DNA und 2 μg/ml HP DNA
enthält,
hergestellt. Die Sondenmischung wurde bei 73°C für 5 Minuten denaturiert, und
die Objektträger
wurden in den Denaturierungspuffer (70% Formamid, 2 × SSC) in
einem Coplin jar bei 73°C
für 5 Minuten
(6–8 Objektträger Gefäß) denaturiert.
Die Objektträger
wurden in jeweils 70%, 85% und 100% Ethanol für 1 Minute gespült. Die
Proben wurden auf einem Objektträgerwärmer für 2 Minuten
oder weniger getrocknet. Etwa 3 μl
Hybridisationsmischung wurde dann pro Ziel auf jedem Objektträger aufgetragen,
und die Objektträger
unmittelbar mit einem Deckglas abgedeckt, welches dann mit Gummizement
versiegelt wurde. Die Hybridisation wurde in einer befeuchteten
Kammer über
Nacht bei 37°C
durchgeführt.
Die Objektträger
wurden in 0,4 × SSC/0,3%
NP-40 bei 73°C
für 2 Minuten
gewaschen, dann in 2 × SSC/0,1%
NP-40 kurz bei Raumtemperatur gespült. Nach der Lufttrocknung
wurden die Objektträger
mit DAPI II gegengefärbt.
Zwanzig zytologisch anormale Zellen wurden in jeder Probe ausgewählt und
auf ihr FISH-Muster analysiert.
-
Für 53 Krebsfälle, wie
durch Biopsie (Stadium/Einteilung) (n = 49) und diagnostiziert,
und Zytologie positive TCC (n = 34), hatte die Zytologie eines Sensitivität von 57%
(eine zweifelhafte Zytologiediagnose zählte als positiv), die Zystoskopie
hatte eine Sensitivität
von 88% (zweifelhafte Zystoskopieergebnisse zählten als positiv), BTA STAT
hatte eine Sensitivität
von 71%, und FISH hatte eine Sensitivität von 86%. In 63 Krebs negativen
Fällen,
wie durch eine negative Zystoskopie mit oder ohne negative Zytologie
und keiner Blasenkrebs-Historie angezeigt ist, hatte BTA STAT eine
Spezifität
von 73% und FISH hatte eine Spezifität von 90% (Spezifität von Zystoskopie
und Zytologie können
nicht bestimmt werden, da sie verwendet wurden, um zu definieren,
welche Patienten keinen Blasenkrebs hatten).
-
Zwei
von drei Patienten mit „falsch-positiven" FISH-Ergebnissen
hatten auch eine positive Telomerase, einen positiven Hämoglobin-Messstab
und positive BTA-STAT oder BTA-TRAK
Ergebnisse. Sollte sich erweisen, dass diese zwei Patienten Blasenkrebs
haben, wird die Spezifität
von FISH 100% erreichen. Dies hat Auswirkungen für den positiven Prädiktivwert
des Tests, wie unten diskutiert ist. Tabelle 6 zeigt die Sensitivität von verschiedenen
Tests nach Stadium und Einteilung. In Tabelle 6 bezieht sich „E" auf zweifelhaft,
und „–„ „weist
auf 3 FISH+-Proben hin, die nur auf Grund
von Zytologie Krebs waren und wurden nicht eingeschlossen.
-
Die
positiven und negativen Prädiktivwerte
(PV), basierend auf einer Krankheits-Prävalenz
von 28% (53/190), Spezifität
von 93% und Sensitivität
von 77%, sind in Tabelle 7 angegeben.
-
-
Tabelle
7 Prädikativ-Wert
-
Einundfünfzig von
53 Krebsfällen
hatten ein Messstab Ergebnis. Die Sensitivität des Hämoglobin-Messstab-Tests war
91% für
die Stadien pT1–pT4
und 100% für
Karzinom in situ (Tis), was es zu einem idealen Screeningtest (Tabelle
8) macht. Die Spezifität
(52%) des Hämoglobin-Messstab-Tests
war jedoch schlecht. Während
die hohe Sensitivität
und die niederen Kosten des Hämoglobin-Messstab-Tests
es zu einem nützlichen
Screening-Test machen, ist es verständlich, dass positive Ergebnisse
durch einen spezifischeren Test bestätigt werden müssen. Zytologie
kann nicht der Test der Wahl sein, da es nur 33% der pT2–pT4 Fälle als
positiv ermittelte, und 2 von 12 Karzinom in situ (siehe Tabelle
6) nicht ermittelte.
-
-
Der
klinische Nutzen von FISH wurde zu dem Standardzytologie/Zystoskopie
Untersuchungsplan verglichen. Von den 53 Krebsfällen gab es 22 Fälle von
Krankheiten mit fortgeschrittenem Stadium (pT2–pT4 oder pTIS). Das Versagen,
diese Fälle
zu ermitteln, stellt gravierenste falsch-negativ Situation dar.
Während
Zytologie/Zystoskopie in 13/22 Fällen
bei einer Sensitivität
von 59% positiv war, hatte FISH eine Sensitivität von 100%, d.h. war in der
Lage 22/22 Fälle
zu ermitteln (siehe Tabelle 9 für
eine Darstellung von 5 dieser Fälle). Dies
deutet darauf hin, dass FISH ein verbesserter zytologischer Test
ist der eine hohe Sensitivität
für das
Ermitteln von Krankheiten mit fortgeschrittenem Stadium aufweist.
-
