JP5336174B2 - トラスツズマブによる治療の候補患者を確認するための診断方法 - Google Patents
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Description
本発明で使用されるイン・サイツハイブリダイゼーション方法に好適なプローブは、染色体計数プローブ、すなわち染色体領域、通常は反復配列領域にハイブリダイズし、染色体全体の有無を示すプローブ;および座特異的プローブ、すなわちある染色体上の特定遺伝子座にハイブリダイズし、特定遺伝子座の有無を検出するプローブという2つの広いグループに分けられる。染色体腕プローブ、すなわちある染色体領域にハイブリダイズして、特異的染色体の腕の有無を示すプローブも有用である可能性がある。本発明の方法で使用される場合、染色体プローブおよびそれらの組み合わせは、療法に対する応答に関して患者を分類する能力に関して選択する。療法に対する応答は一般に、進行性疾患(PD)、安定疾患(SD)、部分応答(PR)および完全応答(CR)に分類される。良好な応答は代表的には、PR+CR(本明細書においては、総称して客観的応答と称する)を含むものと考えられるが、特に疾患が重度のものである場合、SDを含むように拡大することもできる(本明細書においては、臨床的利益と称する)。プローブセットは、あらゆる数のプローブ、例えば2、3、4またはそれ以上のプローブを含むことができる。本発明で有用なプローブ数は、個別にそのプローブを検出する使用者の能力によってのみ限定される。
各種の方法により、そして各種基準を用いて、細胞試料を事前に評価することができる。本明細書に記載のプローブおよび方法は、定のスクリーニング方法を用いる用途に限定されるものではない。一つの例は、例えばDAPIフィルターで見るように細胞学的異常に関して数百ないし数千の細胞を走査する「走査方法」である。評価する細胞の数は、検体の細胞性によって決まり、それは患者ごとに異なる。一般的であっても常時とは限らないが形成異常細胞および新生物細胞に関連する細胞学的異常には、核肥大、核異常性および異常DAPI染色(非常に多くの場合、色むらがあり、色がより明るい)などがある。走査段階では、観察者は好ましくは、染色体異常(FISHによって示されるもの)についての細胞の評価を、やはり細胞学的異常を示す細胞に集中させる。さらに、染色体異常は細胞学的異常がない場合でも起こることから、明らかな細胞学的異常を持たない細胞の割合を評価することができる。この走査方法については、ハイリング(Hailing)らに対する米国特許第6174681号(参照によって本明細書に組み込まれる)にさらに詳細に記載されている。乳癌細胞は、アボット・モレキュラー社が市販しているパスビジョン(PathVysion(登録商標))FISHパネルに記載の方法を用いる評価用に選択することができる。パスビジョンFISHパネルの製品添付文書は、参照によって本明細書に組み込まれる。この手順は、FISH用のスライドと同じ腫瘍ブロックからのH&E染色スライドを用いるものである。対象領域は、好ましくは病理担当者がH&E染色スライドを見ることで選択し、相当する領域をFISHスライド上でマークする。悪性腫瘍と一致する形態(すなわち、相対的に大きい核)を有する細胞を、マークを施した対象領域内で計数する。
HER−2受容体タンパク質のシグナル伝達能力を阻害するか、他の形態でトラスツズマブに匹敵すると考えられている医薬での治療の候補患者(例:乳癌患者)の識別は、その患者から得た適切な生体試料における染色体異常を識別することで確認することができる。これは、イン・サイツハイブリダイゼーションによって行うことができる。概して、イン・サイツハイブリダイゼーションには、生体試料を固定する段階、固定試料内に含まれる標的DNAに染色体プローブをハイブリダイズする段階、洗浄を行って非特異的に結合したプローブを除去する段階、ならびにハイブリダイズしたプローブを検出する段階などがある。そのイン・サイツハイブリダイゼーションは、検体細胞を懸濁させ、次にフローサイトメトリーによって検出することでも行うことができる。あるいは、遺伝子コピー数および増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの他の方法によって評価することができる。PCRによるHER2遺伝子の測定についての記述が論文にある(例として、Willmore, et al., (2005) Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology 13(4):333-341;Lyon et al. (2001) Clinical Chemistry 47(5): 844-851;Li et al. (1994) 73(ll):2771-2778およびO′Malley et al. (2001) American Journal of Clinical Pathology 115(4):504-511)。
細胞中の染色体プローブまたは染色体プローブセットのハイブリダイゼーションパターン(例えば、各プローブについてのシグナル数)を調べ、シグナル数を記録することで、細胞内での染色体または染色体領域の増加または消失を評価する。試験試料は、臨床診断を行う上で十分な数の細胞を含むことができ、代表的には少なくとも約100個の細胞を含む。代表的なアッセイでは、ハイブリダイゼーションパターンを約20〜200個の細胞で評価する。試験試料は代表的には、異常(例:座の増加または消失)を含む細胞を複数含むことが認められた場合、特定の遺伝子座の異常について「試験陽性」と見なされる。「試験陽性」の基準には、異常座と療法に対する患者応答の間の臨床的相関に応じて、1、2、3、4個またはそれ以上のプローブでの試験陽性を含むことができる。さらに、複数のプローブを用いる場合、試験陽性には、小セットのプローブを用いた異常ハイブリダイゼーションパターンの検出が含まれ得る。例えば、小セットのプローブ、例えば全体が4個のプローブセットのうちの2個もしくは3個のプローブの増加または消失の組み合わせで、陽性試験結果となり得る。ハイブリダイゼーションパターンは、小セットのプローブについての配列で評価することもできる。例えば、初回小セットのプローブ(例:HER−2およびTOP2A座に対するプローブ)のパターンを評価することができ、その小セットのプローブから陽性結果が示された場合は、その試験は全体的に陽性と見なし得る。しかしながら、その最初の結果が陽性でない場合、追加小セットのプローブ(例:Iq25座に対するプローブ)についてのパターンを評価して、試験を完了することができる。全てのプローブについて合わせた結果が陽性の試験結果を示した場合、その試験は全体で陽性と見なすことができる。
ハイブリダイゼーションプローブ
291U(ロズウェルパーク癌研究所(Rosewell Park Cancer Institute:RPCI)のBACまたはPACライブラリから。名称:RPCI−11−283123)、291P(RPCI−5−1152A16)、291F(カリフォルニア技術研究所(California Institute of Technology)(CIT)のBACライブラリから。名称:CITC−428H21)、LSI(R)TOP2A(291Z.2;アボット・モレキュラー社)、291Z.7(RPCI−11−89A22)および291Z.8(RPC−I1−1028K7)というクローンをFISHマッピングプローブとして用いた。それらのマッピングクローンは、ビシス(Vysis)LSI HER−2プローブの約114kbテロメアから始まって、17qテロメアの方に約650kb延長する連続した領域内にある。マッピングプローブによる各イン・サイツハイブリダイゼーションには、異なるフルオロフォアで直接標識された3種類のFISHプローブ、すなわち、第17染色体についての動原体周囲プローブ(スペクトラム・アクア(SpectrumAqua;商標名)CEP(登録商標)17;アボット・モレキュラー社)、スペクトラム・グリーン(Spectrum Green;商標名)LSI HER−2(アボット・モレキュラー社)およびスペクトラム・オレンジ(Spectrum Orange;商標名)で標識された6個のマッピングプローブのうちの一つが含まれていた。
ラッシュ・プレスビテリアン聖ルカ医療センター(Rush Presbyterian St. Luke′s Medical Center, Chicago, IL)で1997〜2004年の間にトラスツズマブ治療を受けたことがある転移乳癌患者70名について試験を行うことを考えた。これは、治療前腫瘍組織記録が病理記録保管所で入手可能な全てのトラスツズマブ治療転移乳癌患者を含むものであった。この試験は、ラッシュ治験審査委員会による承認を受けた。患者は、トラスツズマブ単独または従来の化学療法(ほとんど全ての場合でタキサン)との併用のいずれかによる治療を受けたことがあった。実質的に全ての患者が、過去において、各種の化学療法による治療をかなりの程度で行ったことがあった。これらの患者について入念なカルテ検討を行った後、これら患者のうちの35名が、RECIST基準に従って、トラスツズマブ(PD)治療中に進行があったか、少なくとも6ヶ月間安定疾患(SD)であったか、部分応答(PR)であったか、または完全応答(CR)であったことが確認された。これら35名の患者は、本試験に選択するのに好適であると思われた。他の患者の場合、入手可能な医療記録が、トラスツズマブに応答したか否かを明瞭に示していなかったか、参考となる医療記録が入手できなかった。
イン・サイツハイブリダイゼーションのための準備で、検体スライドを、Hemo−De(商標名)溶媒および清浄剤(Clearing Agent)(Scientific Safety Solvents, Keller, TX)を各5分間3回交換で浸漬し、次に純粋エタノールで1分間洗うことでパラフィン除去した。乾燥後、スライドガラスを80℃のビシス前処理溶液(チオシアン酸ナトリウム系カオトロピック剤溶液)に10分間浸漬し、水で5分間洗うことで、イン・サイツハイブリダイゼーション用に検体をさらに準備した。次に、スライドガラスを、37℃のペプシン4mg(2500〜3000U/mg)/mL0.2N HCl溶液に15分間浸漬し、水で3分間洗い、70%、85%および100%エタノールでそれぞれ1分間脱水し、乾燥させた。前処理溶液、0.2N HClおよびペプシンは、キット形態(パラフィン・プレトリートメント(Paraffin Pretreatment)2、カタログ番号32−191095、アボット・モレキュラー社)で市販されている。
FISHスライドガラスを、ツァイス・アキシオスコープ(Zeiss Axioscope)エピ蛍光顕微鏡(Carl Zeiss, Thornwood, NY)下に評価した。シグナルを肉眼観察できるようにし、核を視覚化するためのDAPI単帯域通過フィルターセット(スペクトラム・オレンジ(SpectrumOrange)標識プローブを視覚化するための橙赤色単帯域通過フィルターセット、スペクトラム・グリーンプローブを視覚化するための緑色単帯域通過フィルターセット、スペクトラム・アクアプローブを視覚化するための水色単帯域通過フィルターセット、スペクトラム・レッドプローブを視覚化するための赤色単帯域通過フィルターセット、スペクトラム・ゴールドプローブを視覚化するための金色単帯域通過フィルターセット(いずれもアボット・モレキュラー社からのフィルターセット))を用いてカウンティングを行った。悪性形態を有する最低30個の核をカウントした。各プローブおよび各検体について、計数した全細胞にわたって相当するプローブシグナル数を合計し、計数細胞の総数で割ることで、細胞当たりの平均シグナル数を計算した。細胞当たりの平均HER−2およびマッピングプローブシグナルを、細胞当たりの平均CEP17シグナルによって割ることで、第17染色体当たりの各標的の平均数を得た。同様にして、一つの座についての細胞当たり平均シグナルを他方の座の細胞当たりの平均シグナルで割ることで他の座間の比率を計算した。スライドガラスを複数回カウントした場合は、各評価からの細胞当たりの平均プローブシグナルの平均を求め、それを比率の再計算に用いた。
計数結果
試験で検討された70名の患者のうち、35名が療法に対する説明可能な応答とマッピングプローブについて計数可能なFISHシグナルを生じる検体の両方を有していた。34個の検体で、シグナル伝達経路プローブについての計数可能なFISHシグナルが生じた。35名の患者のうちの一つの検体が、2つの特有の腫瘍クローンを含んでいた。そのクローンのより異常なものを選択して解析した。35の腫瘍全てが、マッピングおよびシグナル伝達プローブセットの試験を完了できるだけの材料を含んでいた。
療法に対する応答は、他覚的応答(CR+PR)および臨床的効果(SD+CR+PR)の両方と見なした。他覚的応答は35名の患者中14名(40%)で認められたのに対して、臨床的効果を示したのは35名の患者中20名(57%)であった(表1)。
HER−2プローブ領域を超えて延長していない単位複製配列を有する患者の場合、57%が他覚的応答を有していた。HER−2からテロメアの6個のマッピングプローブのそれぞれまで延長している単位複製配列の場合、他覚的応答が、それぞれ50%、100%、67%、0%、0%および12.5%で認められた(表2)。HER−2を超えて延長していない単位複製配列を有する患者の57%が、臨床的効果を示した。HER−2からテロメアの6個のマッピングプローブのそれぞれまで延長している単位複製配列の場合、臨床効果はそれぞれ67%、100%、100%、25%、50%および50%で認められた。これらのデータは、単位複製配列がTOP2A座を含まない場合に応答が最も良好であることを示している。単位複製配列がTOP2A座まで延長していない患者および単位複製配列がTOP2A座を含む患者に患者を群分けすると、他覚的応答は前者の群で62%(13/21)に、後者の群で7.1%(1/14)に認められた(p=0.0015)。臨床的効果は、前者の群で67%(14/21)に、後者の群で43%(6/14)に認められた(p=0.19)。これらのデータは、TOP2Aの遺伝子状態が他覚的応答の強力な予測因子であり、全体の(未選択)応答率より1.5倍良好に応答する患者(HER−2増幅および非増幅TOP2A)の群を識別し、トラスツズマブ療法の効果がほとんどない第2の群(HER−2およびTOP2A増幅)を識別するものであることを示している。臨床的効果に関しては、TOP2A状態によって提供される患者分類における改善がごく小さい。一般的に言えば、SDが治療の結果であるか否かを知るのが困難な可能性があることから、他覚的応答の方が臨床的効果より情報として有用であると考えられる。
ERBB増殖因子シグナル伝達経路の成分に関する特異的座を、乳癌患者でのトラスツズマブに対する応答との相関に関するFISHによって評価した。データは、比率ならびに細胞当たりのシグナルとして解析し、カットオフ値は療法に対する応答に基づいて求めた。本明細書で示したデータは、細胞当たりのシグナルに基づいたものである。
他の患者では64%(14/26)に応答があった(p=0.0109)。臨床的効果に基づいた比較では、有意な相関は得られなかった。
LSI TOP2A/HER−2/CEP17
ビシス社(Vysis,Inc.)から市販されている3色カラープローブセットLSI TOP2A/HER−2/CEP17多色プローブを用いて、トラスツズマブ治療について乳癌患者を階層化することができる。乳房生検試料をFISHハイブリダイゼーション用に準備し、上記のようにプローブセットでハイブリダイゼーションすることができる。各サンプルからの細胞を、上記の方法に従って、20〜200個の順次細胞を計数することで評価することができる。HER−2について増幅され、TOP2A/動原体17座のシグナル比が2.0のカットオフより小さい試料は、トラスツズマブ治療について陽性と見なすことができるが、他の患者はトラスツズマブ治療には好適性の低い候補者と見なすことができる。2名の患者(患者1および2)についての例は下記の通りである。
患者1および2からのホルマリン固定パラフィン包埋乳房腫瘍組織を、FISH用に処理し、ビシスLSI TOP2Aスペクトラム・オレンジ/LSI HER2スペクトラム・グリーン/CEP17スペクトラム・アクア多色プローブセット(アボット・モレキュラー社)を用いて、上記の方法に従ってFISHを行った。スライドガラスを上記の方法に従って蛍光顕微鏡で評価し、TOP2A、HER2およびCEP17プローブに相当するシグナルの数を、30個の細胞について求めた。結果を表5Aおよび5Bにまとめてある。
これらのシグナルカウントから、平均TOP2A/細胞、HER2/細胞およびCEP17/細胞はそれぞれ1.07、11.1および1.17と計算され、この検体についてTOP2A/CEP17値0.91およびHER2/CEP17値9.5が得られた。HER2は増幅され(HER2/CEP17>2.0)、TOP2Aは増幅されない(TOP2A/CEP17<2.0)ことから、患者は、トラスツズマブ療法に対して良好な非常に良好な候補者と見なされる。患者1をトラスツズマブで治療したところ、RECIST基準によりその薬剤に対して完全応答を示した。
これらのシグナルカウントから、平均TOP2A/細胞、HER2/細胞およびCEP17/細胞はそれぞれ6.20、8.73および1.67と計算され、この検体についてTOP2A/CEP17値3.7およびHER2/CEP17値5.2が得られた。HER2が増幅されることから(HER2/CEP17>2.0)、患者はトラスツズマブ療法の候補者の可能性があるが、TOP2Aも増幅されることから(TOP2A/CEP17>2.0)、この患者は、TOP2Aが増幅されない患者より治療に対して応答する可能性が低く、別の治療を考慮すべきである。患者2をトラスツズマブで治療したところ、RECIST基準によって進行性疾患が示された。
4つのプローブLSI Her−2、LSI TOP2A、CEP17およびLSIIq25を用いて、トラスツズマブ治療について乳癌患者を階層化することができる。ビシス・スペクトラム・オレンジLSI TOP2A/スペクトラム・グリーンLSI HER2/スペクトラム・アクアCEP17多色プローブセットを、これらプローブ源として用いることができる。上記のスペクトラム・グリーンLSI Iq25プローブを第2のハイブリダイゼーションでハイブリダイズすることができるか、標識を変えて4種類全てのプローブのハイブリダイゼーションおよび解析を同時にできるようにすることが可能である(例えば、スペクトラム・アクア、スペクトラム・グリーン、スペクトラム・ゴールドおよびスペクトラム・レッド標識を使用)。FISHハイブリダイゼーション用に乳房生検試料を準備し、上記の方法に従ってハイブリダイゼーションを行った。上記の方法に従って20〜200個の順次細胞を計数することで、各試料からの細胞を評価した。HER−2について増幅され、カットオフが2.0未満であるTOP2A/動原体17座のシグナル比を示し、カットオフが3.0より大きいか、カットオフが1.5未満である細胞当たりのIq25シグナルを示す試料はトラスツズマブ治療に関して陽性と見なされるが、他の患者はトラスツズマブ治療の候補者としては好適性が低いと見なされる。2名の患者(患者3および4)についての例は下記の通りである。
患者3および4からのホルマリン固定パラフィン包埋乳房腫瘍組織を、FISH用に処理し、1組のスライドガラス上でビシスLSI TOP2Aスペクトラム・オレンジ/LSI HER2スペクトラム・グリーン/CEP17スペクトラム・アクア多色プローブセット(アボット・モレキュラー社)を用い、ビシス・スペクトラム・グリーンLSI Iq25/スペクトラム・ゴールドPTGS2/スペクトラム・レッドAKT3プローブセットを別の1組のスライドガラス上でのIq25プローブ源として用いて、上記の方法に従ってFISHを行った。スライドガラスを上記の方法に従って蛍光顕微鏡で評価し、TOP2A、HER2、CEP17およびIq25プローブに相当するシグナルの数を、30個の細胞について求めた。結果を表6および7にまとめてある。
これらのシグナルカウントから、平均TOP2A/細胞、HER2/細胞、CEP17/細胞およびIq25/細胞はそれぞれ3.2、16.2、3.9および4.1と計算され、この検体についてTOP2A/CEP17値0.82およびHER2/CEP17値4.1が得られた。HER2は増幅され(HER2/CEP17>2.0)、TOP2Aは増幅されず(TOP2A/CEP17<2.0)、Iq25は異常である(Iq25/細胞>3.0または<1.5)ことから、患者は、トラスツズマブ療法に対して良好な非常に良好な候補者と見なされる。患者3をトラスツズマブで治療したところ、RECIST基準によりその薬剤に対して完全応答を示した。
これらのシグナルカウントから、平均TOP2A/細胞、HER2/細胞、CEP17/細胞およびIq25/細胞はそれぞれ11.8、13.8、1.9および2.6と計算され、この検体についてTOP2A/CEP17値6.3およびHER2/CEP17値7.4が得られた。HER2が増幅されることから(HER2/CEP17>2.0)、患者はトラスツズマブ療法の候補者の可能性があるが、TOP2Aも増幅され(TOP2A/CEP17>2.0)、Iq25が正常である(Iq25/細胞<3.0および>1.5)ことから、この患者は、TOP2Aが増幅されず、Iq25が異常である患者より治療に対して応答する可能性が低く、別の治療を考慮すべきである。患者4をトラスツズマブで治療したところ、RECIST基準によって進行性疾患が示された。
Claims (9)
- HER−2受容体タンパク質のシグナル伝達能力を阻害する医薬による治療の候補患者の識別を補助する方法において、(a)1以上の染色体プローブセットを、1以上の乳房細胞を含む試料中の染色体に、そのプローブのハイブリダイゼーションを可能とする上で十分な条件下で接触させる段階であって、前記プローブが、細胞における、HER−2/neuおよびTOP2Aを含み、1q25、PTGS2およびCEP10の1以上、および1以上の相当する基準プローブについてのコピー数を検出することができる段階;ならびに(b)前記候補者がHER−2受容体タンパク質のシグナル伝達能力を阻害する医薬による治療に好適である可能性を示す段階を有することを特徴とする方法。
- 前記プローブセットが、HER−2/neu、TOP2Aおよび前記1q領域内の1以上の座のコピー数を検出することができるプローブを含む請求項1に記載の方法。
- 前記プローブセットが、HER−2/neu、TOP2Aおよび1q25のコピー数を検出することができるプローブを含む請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が生検試料を含む請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料が細胞学試料を含む請求項1に記載の方法。
- 前記染色体プローブが蛍光標識されている請求項1に記載の方法。
- 前記候補患者が乳癌と診断されている請求項1に記載の方法。
- トラスツズマブ治療の候補患者の識別を補助する方法において、(a)1以上の染色体プローブセットを、1以上の乳房細胞を含む試料中の染色体に、そのプローブのハイブリダイゼーションを可能とする上で十分な条件下で接触させる段階であって、前記プローブが、細胞における、HER−2/neuおよびTOP2Aを含み、1q25、PTGS2およびCEP10の1以上、および1以上の相当する基準プローブについてのコピー数を検出することができる段階;ならびに(b)前記候補者がトラスツズマブ治療に好適である可能性を示す段階を有することを特徴とする方法。
- 前記プローブセットが、HER−2/neuおよびTOP2Aのコピー数を検出可能なプローブおよび第17染色体のコピー数を検出可能な基準プローブを含む請求項8に記載の方法。
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