JP5391400B2 - α−アクチニン−4遺伝子のコピー数または発現レベルを指標とした膵癌の検出を補助する方法および診断のためのキット - Google Patents
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Description
本発明は、癌の検出を補助する方法および診断のためのキットに関する。
「癌」は、種々の悪性新生物を表すのによく使われる用語である。癌のほとんどは周囲組織を侵襲し、数か所に転移し、除去しても再発しやすく、処置が不十分な場合には患者を死に至らしめる。よって、癌の治療には、癌を出来るだけ早期に発見し、患者に十分な処置を施すことが重要である。
サンプルとして、1990年1月から2003年10月までに国立がんセンター中央病院(日本国)において浸潤性膵管がんの切除手術を施行された、既往歴のない173名の患者からの、ホルマリン固定パラフィン包埋された切除検体を用いた。これらのサンプルについて、α−アクチニン−4タンパク質の発現を免疫組織化学分析によって検討した。免疫組織化学分析に用いた一次抗体は、国立がんセンター研究所(日本国)で作製された抗ヒトα−アクチニン−4ウサギポリクローナル抗体とした。免疫染色は、アビジン・ビオチン複合体(Avidin-Biotin Complex)を用いるABC法によって行った。
α−アクチニン−4(ACTN4)遺伝子のコピー数を調べるため、19番染色体の長椀上に存在するACTN4遺伝子に対する特異的プローブを作製し、膵癌切除標本のパラフィン切片に対してFISH(Fluorescence in Situ Hybridization)法による分析を行った。
膵癌細胞株であるBxPC−3細胞にACNT4遺伝子に対するshRNA(short hairpin RNA)を導入することにより、α−アクチニン−4タンパク質を恒常的に低下させた2種の膵癌細胞株(KD−1およびKD−2)を作製した。具体的には、ACNT4のmRNAを標的とする二本鎖オリゴヌクレオチド(5'-ggatggtcttgccttcaat-3';配列番号3)を合成し、これをpBAsi-hU6 Neoプラスミド(Takara Bio, Otsu, Japan)中にクローニングした。得られたプラスミドを、Lipofectamine 2000試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてBxPC−3細胞にトランスフェクトした。その24時間後に、トランスフェクション培地を、0.4mg/mlのG418(Geneticin, Invitrogen)を含有するRPMI1640培地に交換し、ネオマイシン耐性のクローンを選択した。こうして得られたクローンの中から2種を選択し、それぞれKD−1およびKD−2と命名した。
恒常的にα−アクチニン−4のタンパク質発現を抑制した細胞株(KD−1およびKD−2)とコントロール細胞株(Cont−1およびCont−2)のそれぞれを、SCIDマウスの膵部に1×106個注入した。これらのマウスを35日間飼育した後に解剖し、膵部に形成された腫瘍の最大径を実体顕微鏡下で計測した。その結果を図5に示す。
A.卵巣癌とα−アクチニン−4遺伝子の発現亢進との関連
サンプルとして、1987年1月から2005年12月までに防衛医科大学校病院産婦人科(日本国)において切除手術を施行された、進行期卵巣癌136症例のホルマリン固定パラフィン包埋検体を用いた。これらのサンプルについて、α−アクチニン−4タンパク質の発現を免疫組織化学分析によって検討した。免疫組織化学分析に用いた一次抗体は、国立がんセンター研究所(日本国)で作製された抗ヒトα−アクチニン−4ウサギポリクローナル抗体とした。免疫染色は、アビジン・ビオチン複合体(Avidin-Biotin Complex)を用いるABC法によって行った。
α−アクチニン−4(ACTN4)遺伝子のコピー数を調べるため、19番染色体の長椀上に存在するACTN4遺伝子に対する特異的プローブを作製し、卵巣癌切除標本のパラフィン切片に対してFISH(Fluorescence in Situ Hybridization)法による分析を行った。
上述のようにして分類されたα−アクチニン−4タンパク質発現の強陽性症例と弱陽性/陰性症例の2群、ならびにACTN4遺伝子コピー数増加症例(コピー数≧4)と非増加症例(コピー数<4)の2群について、Kaplan-Meier法によって生存曲線を作成した。得られた生存曲線を図7に示す。
進行期卵巣癌患者の生存期間に対する臨床病理学的因子ごとの危険率と、抗α−アクチニン−4抗体の染色性に対する危険率およびACTN4遺伝子コピー数増加に対する危険率とを、上述の患者136症例分のデータを用いて、Cox比例ハザードモデルの単変量解析および多変量解析によって分析した。その結果を以下の表3に示す。
ACTN4遺伝子のコピー数増加と卵巣癌における各種臨床病理学的因子との関連を、χ二乗検定を用いて判定した。その結果を以下の表4に示す。
Claims (9)
- 哺乳動物において膵癌の検出を補助する方法であって、
前記哺乳動物中の膵癌であると疑われる病巣部から得られた細胞におけるα−アクチニン−4遺伝子のコピー数を測定する工程、
を含んでなり、前記遺伝子のコピー数が4以上である場合に、前記哺乳動物に膵癌が存在することが示される、方法。 - 前記遺伝子のコピー数の測定が、ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブを用いるFISH法によって行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が、前記哺乳動物からの生検サンプルである、請求項1に記載の方法。
- 前記膵癌が浸潤性膵管癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記膵癌が予後不良の浸潤性膵管癌である、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物における膵癌の診断のためのキットであって、細胞におけるα−アクチニン−4遺伝子のコピー数を測定することのできる試薬を含んでなる、キット。
- ゲノム上の該遺伝子に特異的なプローブを含んでなる、請求項6に記載のキット。
- 前記膵癌が浸潤性膵管癌である、請求項6に記載のキット。
- 前記膵癌が予後不良の浸潤性膵管癌である、請求項6に記載のキット。
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