JP6703824B2 - 細胞選択方法、細胞検出方法、細胞選択装置、および細胞検出装置 - Google Patents

細胞選択方法、細胞検出方法、細胞選択装置、および細胞検出装置 Download PDF

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Description

本発明は、細胞選択方法、細胞検出方法、細胞選択装置、および細胞検出装置に関する。
特許文献１には、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ法）の検出にフローサイトメータ等を適用する際の細胞の処理方法が記載されている。ＦＩＳＨ法によれば、細胞中の検出対象のＤＮＡ配列領域に標識プローブを結合させることにより細胞を染色し、標識プローブに起因して生じた蛍光を検出することにより、異常細胞の検出を行うことができる。
特表２００５−５１５４０８号公報
インサイチュハイブリダイゼーション法を行う場合、標識プローブによる染色性の悪い細胞や、非特異反応を起こした細胞が出現することがある。このように解析対象の細胞に染色不良の細胞が混ざってしまうと、結果として異常細胞を精度良く検出できなくなる。このため、異常細胞を精度良く検出できることが求められていた。
本発明の第１の態様は、細胞選択方法に関する。本態様に係る細胞選択方法は、第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、試料に光を照射して、第１蛍光色素からの蛍光と第２蛍光色素からの蛍光とを受光する受光工程と、第１蛍光色素からの蛍光の強度と第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、を含む。第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素が、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である。
本発明の第２の態様は、細胞選択方法に関する。本態様に係る細胞選択方法は、第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、試料に光を照射して、試料中の細胞を撮像する撮像工程と、撮像工程で撮像された細胞の画像に基づいて、第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とを取得する輝度取得工程と、第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、を含む。第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素が、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である。
本発明の第３の態様は、細胞検出方法に関する。本態様に係る細胞検出方法は、第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションと、第３蛍光色素を含む検出用プローブによる細胞中のＤＮＡの検出対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、試料に光を照射して、第１蛍光色素からの蛍光と、第２蛍光色素からの蛍光と、第３蛍光色素からの蛍光とを受光する受光工程と、第１蛍光色素からの蛍光の強度と第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、第３蛍光色素からの蛍光に基づいて、解析対象の細胞から異常細胞を検出する検出工程と、を含む。第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素が、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、第３蛍光色素が、第１および第２波長とは異なる第３波長の蛍光を発する色素である。
本発明の第４の態様は、細胞選択装置に関する。本態様に係る細胞選択装置は、細胞と、細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、試料が流れるフローセルと、フローセルを流れる試料に光を照射する光源と、第１蛍光色素からの蛍光と第２蛍光色素からの蛍光とを受光する受光部と、処理部と、を備える。第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素は、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である。処理部は、第１蛍光色素からの蛍光の強度と第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する。
本発明の第５の態様は、細胞選択装置に関する。本態様に係る細胞選択装置は、細胞と、細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、試料が流れるフローセルと、フローセルを流れる試料に光を照射する光源と、試料中の細胞を撮像する撮像部と、処理部と、を備える。第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素は、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である。処理部は、撮像部により撮像された細胞の画像に基づいて、第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とを取得し、第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する。
本発明の第６の態様は、細胞検出装置に関する。本態様に係る細胞検出装置は、細胞と、細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬と、細胞中のＤＮＡの検出対象領域にハイブリダイズする、第３蛍光色素を含む検出用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、試料が流れるフローセルと、フローセルを流れる試料に光を照射する光源と、第１蛍光色素からの蛍光と、第２蛍光色素からの蛍光と、第３蛍光色素からの蛍光とを受光する受光部と、処理部と、を備える。第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、第２蛍光色素は、第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、第３蛍光色素は、第１および第２波長とは異なる第３波長の蛍光を発する色素である。処理部は、第１蛍光色素からの蛍光の強度と第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択し、第３蛍光色素からの蛍光に基づいて、解析対象の細胞から異常細胞を検出する。
本発明によれば、異常細胞を精度良く検出できる。
図１は、実施形態１に係る細胞検出方法を示すフローチャートである。 図２（ａ）は、実施形態１に係る検出対象領域に検出用プローブが結合している状態を示す図である。図２（ｂ）は、実施形態１に係る評価対象領域に評価用プローブが結合している状態を示す図である。 図３（ａ）は、実施形態１の変更例に係る画像の各ピクセルから輝度値を取得することを説明する図である。図３（ｂ）は、実施形態１の変更例に係る輝度値から画像の輝度を取得することを説明する図である。 図４（ａ）は、実施形態１に係る解析対象の細胞を選択するためのスキャッタグラムおよび領域を示す図である。図４（ｂ）は、実施形態１に係る中央値を算出するために用いるヒストグラムである。 図５（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る解析対象の細胞を選択するための領域の変更例である。 図６は、実施形態１に係る解析対象の細胞を選択するためのスキャッタグラムの異なる３つの領域にある細胞から取得された明視野画像と蛍光画像を示す例示図である。 図７（ａ）〜（ｆ）は、実施形態１に係る検証において不要な粒子を除去するために作成されたスキャッタグラムおよび領域を示す図である。 図８（ａ）〜（ｆ）は、実施形態１に係る検証において作成されたスキャッタグラムと、スキャッタグラムに設定された解析対象の細胞を絞り込むための領域とを示す図である。 図９（ａ）、（ｂ）は、実施形態１に係る検証において解析対象の細胞を選択するためのスキャッタグラムおよび領域を示す図である。 図１０は、実施形態１と比較例に係る検証結果を示す図である。 図１１（ａ）、（ｂ）は、実施形態２に係るデュアルフュージョンに基づいて転座の判定を行う場合の蛍光標識の一例を示す模式図である。図１１（ｃ）、（ｄ）は、実施形態２に係るデュアルフュージョンに基づいて転座の判定を行う場合のマージされた蛍光画像の一例を示す模式図である。 図１２（ａ）、（ｂ）は、実施形態２に係るブレイクアパートに基づいて転座の判定を行う場合の蛍光標識の一例を示す模式図である。図１２（ｃ）、（ｄ）は、実施形態２に係るブレイクアパートに基づいて転座の判定を行う場合のマージされた蛍光画像の一例を示す模式図である。 図１３は、実施形態１〜４に係る種々のゲノム異常を判定して異常細胞を検出できることを説明する図である。 図１４は、実施形態５に係る細胞検出装置の構成を示すブロック図である。 図１５は、実施形態５に係る光学検出部の構成を示す模式図である。 図１６は、実施形態５に係る細胞分析装置による異常細胞の検出処理を示すフローチャートである。 図１７は、実施形態５に係る画像を目視により分類した結果を受け付けるための目視結果入力画面の構成を示す図である。 図１８は、実施形態６に係る細胞選択装置の構成を示すブロック図である。 図１９は、実施形態６に係る粒子選別部、貯留部およびフローセルの構成を示す模式図である。 図２０は、実施形態６に係る細胞選択装置による解析対象細胞の選択処理を示すフローチャートである。
本発明は、標識プローブによる染色性の悪い細胞、および、標識プローブの非特異的な結合が生じている細胞を解析対象から除外し、検出対象のＤＮＡ配列領域への標識プローブのハイブリダイゼーションが適正に行われている細胞を解析対象として選択する選択方法を提供する。また、選択された細胞からゲノムの異常が生じている異常細胞を検出する検出方法も提供する。
ここで、本明細書中において、「ゲノムの異常」は、野生型のＤＮＡ配列とは異なる配列が生じることであり、たとえば、遺伝子増幅、欠失、逆位、転座等を含む。
「遺伝子増幅」は、ゲノムのなかで特定の遺伝子が増幅することであり、「欠失」は、染色体の一部、たとえば長腕や短腕などが失われることであり、「転座」は、染色体の一部が分断され他の染色体に付着・融合することであり、「逆位」は、染色体上のＤＮＡの塩基配列の順序が部分的に逆転することである。
「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、たとえば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含む。したがって、「遺伝子」という用語は、コード領域の他に、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル等の制御配列を含む。遺伝子の制御配列は、コード領域の近位に、同領域内に、または同領域の遠位に位置してもよい。
「異常細胞」は、遺伝子増幅、欠失、逆位、および転座の少なくとも一つのゲノムの異常が生じている細胞であり、「正常細胞」は、遺伝子増幅、欠失、逆位、および転座のいずれもが生じていない細胞である。
「検出用プローブ」は、細胞中のＤＮＡにおける検出対象領域の塩基配列に相補的なポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドを標識する蛍光物質とを含む。蛍光物質は、ポリヌクレオチドに直接的に結合してもよいし、間接的に結合していてもよい。ここで、間接的に結合するとは、ポリヌクレオチドに抗体など別の物質（以下、介在物質）を介して蛍光物質が結合することを意味する。介在物質としては、ハプテン、抗ハプテン抗体等を用いることができ、たとえば、ポリヌクレオチドに結合するハプテン、抗ハプテン一次抗体、一次抗体に結合する標識二次抗体を用いることができる。二次抗体を用いず、標識された抗ハプテン一次抗体を用いてもよい。介在物質を用いる場合、本明細書では、ポリヌクレオチド、介在物質、蛍光物質の複合体をまとめて「検出用プローブ」という。ハプテンとしては、ビオチン、デス-ビオチンおよびその他の誘導体、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）等が挙げられる。抗ハプテン一次抗体は、たとえば抗ＤＮＰ抗体、抗ＤＩＧ抗体を利用できる。ビオチンに結合する捕捉剤は、アビジン、ストレプトアビジン、または抗体であり得る。抗体はその他のハプテンのための捕捉剤として利用できる。二次抗体は、一次抗体に結合可能であればよく、たとえばヤギ由来の抗ウサギ抗体、ヤギ由来の抗マウス抗体である。
「評価用プローブ」は、細胞中のＤＮＡにおける評価対象領域の塩基配列に相補的なポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチドを標識する蛍光物質とを含む。蛍光物質は、ポリヌクレオチドに直接的に結合してもよいし、間接的に結合していてもよい。ここで、間接的に結合するとは前述の通りである。介在物質を用いる場合、本明細書では、ポリヌクレオチド、介在物質、蛍光物質の複合体をまとめて「評価用プローブ」という。ハプテン、抗ハプテン一次抗体、二次抗体は、前述の通りである。
なお、検出用プローブが介在物質を含む場合、介在物質は、検出用プローブのポリヌクレオチドに特異的に結合し、実質的に評価用プローブのポリヌクレオチドに結合しない物質である必要がある。同様に、評価用プローブが介在物質を含む場合、この介在物質は、評価用プローブのポリヌクレオチドに特異的に結合し、実質的に検出用プローブのポリヌクレオチドに結合しない物質である必要がある。
また、検出用プローブおよび評価用プローブのそれぞれが、ハプテンに特異的に結合する標識抗体を含む場合、検出用プローブと評価用プローブとの間で、ポリヌクレオチドに結合するハプテンを異なる物質にする必要があり、たとえば、ＤＮＰを検出用プローブのポリヌクレオチドに結合するハプテンとして用いる場合には、ＤＩＧを評価用プローブのポリヌクレオチドに結合するハプテンとして用いる必要がある。
また、検出用プローブおよび評価用プローブのそれぞれが、一次抗体に結合する標識二次抗体を含む場合、検出用プローブに含まれる標識二次抗体は、検出用プローブ用の一次抗体に特異的に結合し、実質的に評価用プローブ用の一次抗体に結合しない物質である必要がある。同様に、評価用プローブに含まれる標識二次抗体は、評価用プローブ用の一次抗体に特異的に結合し、実質的に検出用プローブ用の一次抗体に結合しない物質である必要がある。たとえば、検出用プローブ用の一次抗体と、評価用プローブ用の一次抗体を異なる動物種で作り、その特定の動物種の抗体に対する抗体を二次抗体として用いることができる。たとえば、検出用プローブ用の一次抗体をマウス抗体、二次抗体を抗マウス抗体とし、評価用プローブ用の一次抗体をウサギ抗体、二次抗体を抗ウサギ抗体とすることができる。標識二次抗体を用いる場合、さらに、検出用プローブと評価用プローブとの間で、ポリヌクレオチドに結合したハプテンと一次抗体の結合様式が異なることが好ましい。
検出用プローブおよび評価用プローブに含まれる蛍光物質としては、それぞれ異なる波長の蛍光を発する蛍光物質が用いられる。蛍光物質としては、たとえば、フルオレセイン、またはそれらの誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（登録商標）（ＴＲ）、Ｃｙ Ｄｙｅ、ローダミン、アレクサ色素（Alexa Fluor（登録商標））等が挙げられる。
「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、および抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含むがこれらに限定せず、任意のアイソタイプの抗体またはイムノグロブリン、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片が含まれる。「抗体」はさらに、たとえばビオチン（ビオチン-アビジン特異的結合対のメンバー）などの特定の結合対のメンバーといった他の部分に結合してよい。また、「抗体」には、Ｆａｂ'、Ｆｖ、Ｆ(ａｂ')２、および抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片も包含される。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられ、ＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（たとえばペプチド核酸および非天然存在ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることも可能である。
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズ」とは、相補的ヌクレオシド塩基間または相補的ヌクレオチド塩基間で水素結合（これは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る）を形成することを意味する。たとえば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を介して対合する、相補的核酸塩基である。「相補的」とは、本明細書中で使用される場合、２つのヌクレオチド間で正確に対合する能力をいう。たとえば、ポリヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドは、ＤＮＡ分子の同じ位置でヌクレオチドと水素結合し得る場合、このポリヌクレオチドとＤＮＡとは、その位置で互いに相補的であると考えられる。このポリヌクレオチドとこのＤＮＡとは、各分子における充分な数の対応する位置が、互いに水素結合し得るヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズする」および「相補的」という用語は、安定かつ特異的な結合がこのポリヌクレオチドとこのＤＮＡ標的との間で生じるような充分な程度の相補性または正確な対合を示すために用いられる。
ポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で、検出対象領域または評価対象領域の塩基配列にハイブリダイズ可能であるならば、「相補的」である。
「ストリンジェントな条件」は、ポリヌクレオチドが特定の核酸配列に選択的にハイブリダイズし、他の配列にはほとんどあるいはまったくハイブリダイズしない条件を指し、当業者であれば、適宜選択することができる。「ストリンジェントな条件」は、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ 第２版〔Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年発行〕に記載されている短鎖のヌクレオチドのハイブリダイゼーションに関する条件等を参照して設定することができる。かかる「ストリンジェントな条件」としては、たとえば、３０〜７０質量％ホルムアミドを含むｐＨ７．４の溶液中、４４℃の環境下でハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて６０℃以上の条件下での洗浄を行う条件などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
「検出対象領域」は、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、遺伝子増幅、欠失、転座、および逆位のいずれかの異常の有無を検出する対象となるＤＮＡ配列領域である。
「評価対象領域」は、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡの複製とともに増加し、ゲノムの異常に起因した増幅、配列の変化が生じないＤＮＡ配列領域である。遺伝子増幅が生じている異常細胞を検出する場合には、評価対象領域としては、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、増幅が生じるＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部であれば良い。たとえばＨｅｒ２遺伝子増幅が生じている異常細胞を検出する場合には、Ｈｅｒ２遺伝子を除くＤＮＡ配列領域の一部を評価対象領域とすればよく、たとえば１７番染色体のセントロメア領域を評価対象領域としてもよい。欠失が生じている異常細胞を検出する場合には、評価対象領域としては、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、欠失が生じるＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部であれば良い。転座が生じている異常細胞を検出する場合には、評価対象領域はゲノム上の何れの領域であっても良い。転座によって別の染色体に移動するＤＮＡ配列領域を評価対象領域としてもよいし、転座による切断点を含むＤＮＡ配列領域を評価対象領域としてもよい。たとえば、９番染色体にあるＡＢＬ遺伝子が転座により２２番染色体に移動し、２２番染色体にあるＢＣＲ遺伝子と融合してＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が生じている異常細胞を検出する場合には、ＢＣＲ遺伝子またはＡＢＬ遺伝子を評価対象領域としてもよい。逆位が生じている異常細胞を検出する場合には、評価対象領域はゲノム上の何れの領域であっても良い。逆位によって移動するＤＮＡ配列領域を評価対象領域としてもよいし、逆位による切断点を含むＤＮＡ配列領域を評価対象領域としてもよい。
「核酸染色用色素」は、細胞中の核酸全体を染色する物質であり、ＤＮＡの特定の領域にハイブリダイズして蛍光標識する検出用プローブの蛍光物質および評価用プローブの蛍光物質のそれぞれとは異なる波長の蛍光を発する。核酸染色用色素は、核酸を特異的に染色するためのインターカレータや副溝(minor groove)に結合する蛍光色素を含む。前記インターカレータとしては、シアニン系、アクリジン系、phenanthridium系の公知の色素が挙げられる。たとえば、シアニン系のインターカレータとしては、SYBR（登録商標） Green I、Thiazole orangeが挙げられる。アクリジン系のインターカレータとしては、Acridin orangeが挙げられる。phenanthridium系のインターカレータとしては、propidium Iodide、Ethidium bromideが挙げられる。副溝に結合する色素としては、DAPI、Hoechst等の公知の色素が挙げられる。たとえば、Hoechstとしては、Hoechst33342、Hoechst33258等が挙げられる。
「細胞」は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（たとえば、融合細胞、ｉＰＳ細胞）であってもよい。細胞は、体細胞であっても胚細胞であってもよい。そのような細胞としては、たとえば、胚性幹細胞、体性幹細胞、分化細胞（たとえば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞など）などが挙げられるがそれらに限定されない。動物種の細胞としては、好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。フローサイトメータにおいて細胞の検出を行う場合は、細胞塊をばらばらの細胞にした状態で検出する方が好ましい。また、検出用プローブおよび評価用プローブをＤＮＡの特定の領域にハイブリダイズする前に、メタノール、エタノールなどの極性有機溶媒で細胞を固定する方が好ましい。
「試料」は、細胞を含み、細胞中のＤＮＡに検出用プローブおよび評価用プローブがハイブリダイズされ、細胞中の核酸全体が染色された検体を指す。
試料調製工程において、核酸染色用色素によって核酸を染色し、評価用プローブとゲノムとをハイブリダイズさせることにより、試料が調製される。
核酸染色および評価用プローブのハイブリダイゼーションの前に、核酸分解の抑制等のために細胞を固定することが好ましい。細胞の固定には、エタノール、メタノール、ホルムアルデヒドなど、公知の固定液を用いることができる。
評価用プローブをゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせる前に、加熱や界面活性剤による化学的処理など公知の方法でゲノムＤＮＡを変性させて一本鎖の状態にすることが好ましい。評価用プローブおよび検出用プローブの両方（以下、これらをあわせて単に「プローブ」ということもある）を用いる場合も同様である。
プローブのハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡと非特異的にハイブリダイズした検出用プローブおよび評価用プローブを洗浄により除去してもよい。塩濃度の低い溶液を用いてプローブを洗浄することができる。
プローブが標識抗体を含む場合、抗体を反応させる前に、バックグラウンド低減のためブロッキング処理を行ってもよい。ブロッキング剤としては、ＢＳＡ、スキムミルク等を用いることができる。標識抗体の反応を行った後、ターゲットの物質に結合した標識抗体と、ターゲットの物質に結合せずに遊離している標識抗体とを分離するＢ／Ｆ分離処理を行い、遊離していた標識抗体を除去してもよい。Ｂ／Ｆ分離処理は、たとえば遠心処理を用いて行うことができる。
プローブが、一次抗体および標識二次抗体を含む場合は、一次抗体とプローブのポリヌクレオチドとの反応において、上述のブロッキング処理および／またはB/F分離処理を行うことができる。さらに、標識二次抗体を反応させるに際しても、上述のブロッキング処理および／またはB/F分離処理を行うことができる。
核酸の染色および評価用プローブのハイブリダイゼーションは同時に行ってもよいし、別々に行っても良い。同時に行う場合は、核酸染色用色素および評価用プローブを含む染色試薬と細胞とを混合することによって行うことができる。評価用プローブがポリヌクレオチドと抗体とを含む場合は、核酸染色はポリヌクレオチドとゲノムDNAのハイブリダイゼーションと同時に行ってもよいし、抗体反応と同時に行ってもよい。核酸の染色および評価用プローブのハイブリダイゼーションを別々に行う場合、これらの順序は特に限定されない。
受光工程において、調製された試料に励起光を照射し、生じた蛍光の情報が取得される。細胞中の核酸を染色する核酸染色色素に励起光を照射することによって生じた蛍光、および、評価用プローブの蛍光色素に励起光を照射することによって生じた蛍光の情報が取得される。
選択工程において、核酸染色用色素および評価用プローブの蛍光色素からの蛍光情報に基づいて、解析対象の細胞が選択される。
ゲノムの異常を有する細胞を検出する目的における解析対象の細胞としては、核酸染色用色素からの蛍光強度と評価用プローブの蛍光色素からの蛍光強度との比率が一定範囲内にある細胞が選択され得る。たとえば、核酸染色用色素からの蛍光強度と評価用プローブの蛍光色素からの蛍光強度との比率が所定の数値範囲内にある細胞を解析対象の細胞として選択することができる。他にも、試料中の各細胞から得られた上記比率を軸にしたヒストグラムデータにおいて、その中央値の比率を特定し、特定した中央値の比率に対して所定の幅を持たせた範囲内の細胞を解析対象の細胞として選択することもできる。
解析対象の細胞を選択する場合、たとえば、試料中の各細胞を測定して得られた測定データの中から、解析対象の細胞の測定データのみを抽出してもよいし、試料中の全細胞の中から、解析対象の細胞のみを物理的手段により他の細胞と分離して回収してもよい。物理的手段としては、たとえば熱によりバブルを生じさせ、流路を流れる細胞にバブルを衝突させることで、他の細胞と分離させる構成でもよいし、二股の流路のうち一方を開閉することにより、流路を流れる液体の方向を変え、所望の細胞のみを一方の流路に流して集める構成であってもよい。
選択された細胞中のＤＮＡに結合した検出用プローブの蛍光物質から得られた蛍光強度に基づいて、ゲノム異常が検出され得る。たとえば、検出用プローブの蛍光物質からの蛍光強度と評価用プローブの蛍光物質からの蛍光強度との比を算出することにより、ゲノム異常を検出してもよい。たとえば、検出用プローブの蛍光物質からの蛍光強度を評価用プローブの蛍光物質からの蛍光強度で除した値が閾値を超えている細胞を、ゲノム異常が生じている細胞として検出してもよい。また、検出用プローブの蛍光物質からの蛍光強度と評価用プローブの蛍光物質からの蛍光強度との差分を算出し、差分が閾値を超えている細胞を、ゲノム異常が生じている細胞として検出してもよい。
＜実施形態１＞
実施形態１は、ＦＩＳＨ法に基づいて細胞中の特定のＤＮＡ配列領域のみが増幅している細胞を異常細胞として検出するための方法に、本発明を適用したものである。実施形態１では、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅して癌化した細胞を異常細胞として検出する。
図１に示すように、異常細胞を検出するための細胞検出方法は、試料調製工程と、受光工程と、選択工程と、検出工程と、を含む。以下では、オペレータが、フローサイトメータと、フローサイトメータにより取得された蛍光の強度を解析可能な処理装置を用いて、図１の細胞検出方法を実行する場合について説明する。
ステップＳ１１の試料調製工程において、オペレータは、核中のＤＮＡの検出対象領域に対する検出用プローブのハイブリダイゼーションと、核中のＤＮＡの評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイゼーションと、細胞中の核酸の染色とを行うことにより、試料を調製する。試料は、被検者から採取された細胞を含む。
実施形態１において、検出対象領域は、Ｈｅｒ２遺伝子であり、評価対象領域は、１７番染色体のうちＨｅｒ２遺伝子を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列である。以下、１７番染色体のうちＨｅｒ２遺伝子を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列を「Ｃｈ１７」と称する。評価対象領域は、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡの複製とともに増加し、ゲノムの異常に起因した増幅、配列の変化が生じないＤＮＡ配列領域であれば良い。たとえば、評価対象領域は、核中のＤＮＡ配列領域のうち、増幅が生じるＤＮＡ配列領域を除く領域であれば良い。このような観点から、評価対象領域として、たとえば１７番染色体のセントロメア領域が挙げられる。
図２（ａ）に示すように、検出用プローブは、検出対象領域であるＨｅｒ２遺伝子と特異的に結合するポリヌクレオチド（Her2 DNA Probe）、一次抗体（Rabbit anti-DNP Antibody）、二次抗体（Goat anti-Rabbit Antibody）および蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標） 647）を含む。ポリヌクレオチドは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）により標識されている。ステップＳ１１の試料調製工程により、検出対象領域にポリヌクレオチドが結合され、一次抗体および二次抗体を介してポリヌクレオチドに蛍光色素が結合される。図２（ｂ）に示すように、評価用プローブは、評価対象領域であるＣｈ１７と特異的に結合するポリヌクレオチド（Ch17 DNA Probe）、一次抗体（Mouse anti-DIG Antibody）、二次抗体（Goat anti-Mouth Antibody）および蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標） 488）を含む。ポリヌクレオチドは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）により標識されている。ステップＳ１１の試料調製工程により、評価対象領域にポリヌクレオチドが結合され、一次抗体および二次抗体を介してポリヌクレオチドに蛍光色素が結合される。また、ステップＳ１１の試料調製工程により、核は、核酸を特異的に染色するための核酸染色用色素、具体的には、ＤＮＡのＡＴ配列の副溝に結合する蛍光色素（HOECHST33342）によって染色される。この色素により、核中の核酸全体が染色される。
検出用プローブに含まれる蛍光色素と、評価用プローブに含まれる蛍光色素と、核中の核酸全体を染色するための蛍光色素として、それぞれ所定波長の光が照射された場合に互いに異なる波長の蛍光を生じるような異なる種類の蛍光色素が用いられている。
図１に戻り、ステップＳ１２の受光工程において、オペレータは、フローサイトメータを用いて、ステップＳ１１で調製した試料をフローセルに流し、フローセルを流れる試料に光を照射して、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光と、核酸染色用色素からの蛍光と、を受光部により受光する。ステップＳ１２において、フローサイトメータに代えて、蛍光顕微鏡が用いられても良い。蛍光顕微鏡としては、たとえばZeiss社製 Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒを用いることができる。この場合、オペレータは、基材（たとえば、スライドガラス）上に試料を配置し、顕微鏡を操作して基材上の試料に光を照射する。なお、基材としては、スライドガラスに限られず、金属または他の任意の適当な固体の支持体であってもよく、たとえばシリコンウェハーで作られた基板であってもよい。
ステップＳ１２において、受光部が蛍光を受光することにより各細胞について、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度とが生成される。ここでいう「蛍光の強度」とは、受光部から出力された蛍光信号波形（横軸を時間、縦軸を強度）におけるピーク値である。なお、蛍光の強度としては、蛍光信号波形のピーク値に限らず、蛍光信号波形の面積であってもよい。上述したように、検出対象領域に結合した検出用プローブに含まれる蛍光色素と、評価対象領域に結合した評価用プローブに含まれる蛍光色素と、核中の核酸を染色している蛍光色素は、光の照射により互いに異なる波長の蛍光を生じる。したがって、たとえば波長が異なる３種類の蛍光をそれぞれ異なる受光部で受光すれば、検出対象領域と、評価対象領域と、核全体とが識別可能となる。
ステップＳ１２の受光工程代えて、撮像工程と輝度取得工程が行われても良い。撮像工程において、オペレータは、粒子画像を撮像可能なフローサイトメータを用いて、ステップＳ１１で調製した試料をフローセルに流し、フローセルを流れる試料に光を照射して、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光と、核酸染色用色素からの蛍光と、を撮像部により撮像する。これにより、各細胞について、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像と、核酸染色用色素からの蛍光の画像とが取得される。そして、輝度取得工程において、オペレータは、処理装置を用いて、各画像における輝度を算出する。
図３（ａ）、（ｂ）を参照して、画像における輝度の算出について説明する。図３（ａ）に示すように、蛍光の画像において、ピクセルごとに明暗を示す輝度値が取得される。撮像された画像がモノクロの場合は、たとえば階調に基づく値が輝度値とされる。撮像された画像がカラーの場合は、たとえばモノクロに変換した上で輝度値が取得される。輝度値の取得は、画像上の全てのピクセルについて行われる。
続いて、たとえば、図３（ｂ）に示すように、画像上の全ピクセルの輝度値に基づいて、横軸が輝度値、縦軸がピクセル数のヒストグラムが作成される。このヒストグラムにおいて、ピクセル数に応じて破線で示す曲線が生成され、この曲線によって囲まれる範囲の面積が、画像の輝度として算出される。なお、画像の輝度は、全ピクセルの輝度値の合計であっても良い。オペレータは、処理装置を用いて上記のような演算を行い、各画像において輝度を算出する。こうして算出された画像の輝度は、受光部が蛍光を受光することにより生成される蛍光の強度に対応するものとなる。したがって、以下の処理で用いる蛍光の強度を、蛍光の画像における輝度に置き換えても良い。
次に、ステップＳ１３の選択工程において、処理装置は、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する。より詳細には、ステップＳ１３において、処理装置は、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度とが、評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイズの状態が適正であると評価される関係にある細胞を、解析対象の細胞とする。そして、処理装置は、試料中の各細胞を測定して得られた測定データの中から、解析対象の細胞から得られた、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度のデータと、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度のデータとを抽出する。
図４（ａ）に示すように、ステップＳ１３では、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度を縦軸とし、核酸染色用色素からの蛍光の強度を横軸とするスキャッタグラム１００が作成される。スキャッタグラム１００には、試料に含まれる各細胞に応じて点がプロットされる。スキャッタグラム１００には、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度との比率が所定の範囲にあると評価される領域１０１が設定されている。
領域１０１は、たとえば、以下のように設定される。各細胞について、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度との比率が算出される。全ての細胞についてそれぞれ算出された比率に基づいて、図４（ｂ）に示すように、比率を横軸、粒子数を縦軸にしたヒストグラムが作成される。作成されたヒストグラムにおいて、その中央値の比率が特定される。そして、領域１０１は、特定された中央値の比率に対して所定の幅を持たせた範囲内の粒子を囲む領域とされる。
スキャッタグラム１００に設定される領域１０１は、図４（ａ）に示す形状に限られず、図５（ａ）、（ｂ）に示す形状であっても良い。図５（ａ）の領域１０１は、直線１０１ａを中心に所定の幅を持たせた領域である。直線１０１ａの傾きは、上記のように算出した中央値の比率であり、直線１０１ａは原点を通る。すなわち、直線１０１ａは、縦軸と横軸の値が比例関係にあると見なすことができる直線である。図５（ｂ）の領域１０１は、曲線によって囲まれ、直線１０１ａを中心に所定の幅を持たせた領域である。図５（ａ）、（ｂ）に示すような直線１０１ａを中心とする領域１０１の幅は、ハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞を精度良く選択できるよう設定されれば良く、たとえば、直線１０１ａを中心に３〜５％程度のばらつきの範囲にある細胞を含むよう設定される。
ここで、核全体の染色は、検出対象領域と評価対象領域のようにハイブリダイゼーションによって蛍光標識プローブが結合することにより行われるのではなく、核酸染色用色素により行われる。核酸染色用色素によって核中の核酸全体に対して染色が行われるのに対して、Ｈｅｒ２遺伝子のように局所的に増幅する遺伝子は核酸全体に対してわずかであるため、核酸染色用色素全体から得られる蛍光の強度は、概ね細胞周期のＳ期におけるＤＮＡ複製に伴う核中の核酸量の増加に対応して変化することになる。
一方、評価対象領域は、上述したように、細胞の核中に存在するＤＮＡ配列領域のうち、ゲノムの異常に起因した増幅、配列の変化が生じないＤＮＡ配列領域である。評価対象領域は、細胞周期のＳ期におけるＤＮＡの複製とともに増加するため、ステップＳ１１の試料調製工程において評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイゼーションが適正に行われているとすれば、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度は、核酸染色用色素全体からの蛍光の強度に対応して変化することになる。よって、ハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞は、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度との比率が所定の範囲にあると見なすことができる領域１０１に含まれることになる。
しかしながら、実際には全ての細胞においてハイブリダイゼーションが適正に行われるとは限らない。ハイブリダイゼーションが適正に行われなかった細胞の場合、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度は、核酸染色用色素からの蛍光の強度のみに対応して変化するのではなく、ハイブリダイゼーションの状態によっても変化することになる。すなわち、ハイブリダイゼーションが適正に行われなかった細胞は、領域１０１の上下に外れた領域１０２、１０３に含まれることになる。
領域１０１よりも上にある領域１０２と、領域１０１よりも下にある領域１０３は、いずれも評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイゼーションが適正に行われなかったと見なすことができる細胞を含む。領域１０２は評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光が大きい領域であるから、領域１０２には、評価用プローブの非特異的な結合が生じたと考えられる細胞が含まれる。評価用プローブの非特異的な結合は、たとえば、評価対象領域以外のＤＮＡ配列領域に対する評価用プローブの結合により生じる。領域１０３は評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光が小さい領域であるから、領域１０３には、評価用プローブによる染色効率の低下が生じたと考えられる細胞が含まれる。評価用プローブによる染色効率の低下は、たとえば、評価用プローブのハイブリダイゼーション不良により生じる。
ステップＳ１３の選択工程では、スキャッタグラム１００にプロットされた試料中の全細胞に基づいて、すなわち今回の試料に含まれる全細胞に基づいて、領域１０１が設定される。そして、領域１０１にある細胞が解析対象の細胞として選択される。あるいは、領域１０１は、以前の試料に基づいて予め設定され、処理装置に記憶されている領域であっても良い。領域１０１が予め設定される場合、１つの細胞について蛍光の強度を取得した時点でスキャッタグラム上にプロットし、この細胞が領域１０１に含まれれば、当該細胞を解析対象の細胞として選択しても良い。
上述したステップＳ１３の選択工程では、説明の便宜上、処理装置においてスキャッタグラム１００が作成された。しかしながら、実際に細胞の選択が行われる場合にはスキャッタグラム１００が用いられることはなく、処理装置は、核酸染色用色素からの蛍光の強度と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度とを軸とした仮想の座標空間上で処理を行い、解析対象の細胞を選択する。以下の説明においても、スキャッタグラムが用いられることなく、蛍光の強度を２軸とする仮想の座標空間上で処理が行われることにより、細胞の選択が行われる。なお、上述したように、処理装置が、スキャッタグラムを作成して細胞を選択してもよい。
ステップＳ１３の選択工程により、評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞のみが選択されることになる。評価対象領域に対する評価用プローブのハイブリダイゼーションが適正に行われている場合、検出対象領域に対する検出用プローブのハイブリダイゼーションも適正に行われていると考えられる。したがって、ステップＳ１３の選択工程により、評価用プローブと検出用プローブのハイブリダイゼーションが共に適正に行われた細胞が選択される。
図６に示す細胞の例示図を参照して、図４（ａ）に示したスキャッタグラム１００の領域１０１〜１０３にある細胞からの蛍光の強度について説明する。
「明視野」は、細胞の明視野画像を示す。「Ｃｈ１７」は、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光、すなわちＣｈ１７に対応する蛍光を撮像した画像である。「核」は、核酸染色用色素からの蛍光を撮像した画像である。「Ｈｅｒ２」は、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光、すなわちＨｅｒ２遺伝子に対応する蛍光を撮像した画像である。横方向に並ぶ４つの画像は、１つの細胞から取得された画像である。図６に示す５つの細胞は、いずれも正常細胞であるためＨｅｒ２遺伝子が増幅しておらず、かつ二本鎖のＤＮＡが存在する細胞である。したがって、いずれの細胞においても、ハイブリダイゼーションが適正に行われていれば、Ｃｈ１７に対応する２つの輝点とＨｅｒ２遺伝子に対応する２つの輝点とを判別できると想定される。
領域１０１の細胞の画像を参照すると、Ｃｈ１７の輝点とＨｅｒ２遺伝子の輝点は、いずれも明瞭に２つ存在していることが分かる。領域１０２の細胞の画像を参照すると、Ｃｈ１７の輝点とＨｅｒ２遺伝子の輝点は、細胞全体から蛍光が生じているため判別が困難である。領域１０３の細胞の画像を参照すると、Ｃｈ１７の輝点とＨｅｒ２遺伝子の輝点は、蛍光の強度が十分でないため判別が困難である。
このように領域１０２、１０３の細胞の場合、適正に輝点を評価できないため、後述する検出工程において異常細胞を精度良く検出できない。すなわち、領域１０２、１０３の細胞の場合、偽陽性や偽陰性が生じるおそれがある。しかしながら、実施形態１によれば、ステップＳ１３の選択工程において、スキャッタグラム１００の領域１０１に含まれる細胞、すなわちハイブリダイゼーションが適正に行われたと見なされる細胞のみを解析対象の細胞として選択できる。したがって、選択された解析対象の細胞に染色不良の細胞が混ざりにくいため、検出工程において異常細胞を精度良く検出できる。
図１に戻り、ステップＳ１４の検出工程において、オペレータは、処理装置を用いて、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に基づいて、解析対象の細胞から異常細胞を検出する。より詳細には、ステップＳ１４において、処理装置は、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度との比に基づいて、解析対象の細胞から異常細胞を検出する。具体的には、各細胞において、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度を評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度で除算し、除算結果が所定の閾値を上回っている場合に、当該細胞において検出対象領域が増幅していると判定する。そして、検出対象領域が増幅している細胞を異常細胞として検出する。検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度が所定の閾値を上回っていることのみに基づいて、検出対象領域が増幅していると判定しても良い。
なお、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光と評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光とを撮像部により撮像して画像を取得する場合には、画像における検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布とに基づいて、異常細胞を検出しても良い。たとえば、検出用プローブの輝点の数を評価用プローブの輝点の数で除算し、除算結果が所定の閾値を上回っている場合に、当該細胞を異常細胞として検出しても良い。検出用プローブの輝点の数と評価用プローブの輝点の数との差が、所定の閾値を上回っている場合に、当該細胞を異常細胞として検出しても良い。検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像上における総面積を、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像上における総面積で除算し、除算結果が所定の閾値を上回っている場合に、当該細胞を異常細胞として検出しても良い。
ステップＳ１３の選択工程では、ハイブリダイゼーションが適正に行われたと見なされる細胞が解析対象の細胞として選択され、ステップＳ１４の検出工程では、選択された各細胞に対して、異常細胞であるか否かの判定が行われる。このように、選択工程を経て検出工程を行えば、ハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞に対してのみ、異常細胞であるか否かの判定が行われることになるため、検出工程における異常細胞の検出精度を高めることができる。
以上のように、実施形態１では、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅して癌化した細胞を異常細胞として精度良く検出できる。したがって、Ｈｅｒ２遺伝子が病状の進行に従って増幅する乳癌の場合等に、医師等が、検出した異常細胞に基づいて病状の判定を精度良く行うことができる。また、Ｈｅｒ２遺伝子は乳癌の予後因子の１つであるため、検出した異常細胞に基づいて、医師等は、患者に対する治療方針を適正に判断できる。実施形態１では、治療方針の判断指標となる検出対象領域をＨｅｒ２遺伝子としたが、これに限らず、他の疾病を治療対象とし、治療方針の判断指標となる検出対象領域を、対象となる疾病に合わせて他の遺伝子としても良い。
＜実施形態１の検証＞
次に、発明者らが行った実施形態１の検証について説明する。
１．試料の調製
対照細胞として、Ｈｅｒ２遺伝子増幅陰性のＭＣＦ７を用いた。異常細胞として、Ｈｅｒ２遺伝子増幅陽性のＳＫ−ＢＲ−３を用いた。
（１）固定
ＭＣＦ７を、１．５ｍＬのチューブに２×１０６個収容させ、ＳＫ−ＢＲ−３を、１．５ｍＬのチューブに２×１０６個収容させた。２４℃の室温環境下で各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブにＰＢＳを７００μＬ入れて、内容物を再懸濁させた。軽く攪拌しながら、Carnoy's solutionを各チューブに３００μＬ添加し、終濃度を３０％のCarnoy's solutionとした。Carnoy's solutionは、メタノールと酢酸の比が３：１の溶液である。４℃の環境下で、各チューブを攪拌することにより内容物の沈降を防ぎながら、２０分経過させた。
２４℃の室温環境下で各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブにＰＢＳを３００μＬ入れて、内容物を再懸濁させた。軽く攪拌しながら、Carnoy's solutionを各チューブに７００μＬ添加し、終濃度を７０％のCarnoy's solutionとした。４℃の環境下で、各チューブを攪拌することにより内容物の沈降を防ぎながら、２０分経過させた。
（２）ハイブリダイズ
２８８μＬのHybReady（Ventana社製 #780-4409）と、１２μＬのHer2 DNAカクテルプローブ（Ventana社製 #109509）とを混合して、ハイブリダイズ用の試薬を調製した。Her2 DNAカクテルプローブは、ジニトロフェノール（DNP）標識されたＨｅｒ２ＤＮＡプローブと、ジゴキシゲニン（DIG）標識されたＣｈ１７ＤＮＡプローブとを含んでいる。なお、Ventana社製のDIG標識されたＣｈ１７ＤＮＡプローブは、１７番染色体のうちＨｅｒ２遺伝子を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列とハイブリダイズする。
２４℃の室温環境下で（１）の各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブにReaction Buffer（Ventana社製 #950-300）を１ｍＬ入れて洗浄を行った。この洗浄を２回行った。各チューブにハイブリダイズ用の試薬を１２０μＬ添加して、内容物をよく懸濁させた。各チューブの内容物を、０．２ｍＬのチューブ２本に分注した。すなわち、ＭＣＦ７が含まれるチューブを２本作成し、ＳＫ−ＢＲ−３が含まれるチューブを２本作成した。サーマルサイクラーを用いて、９５℃の環境下で、各チューブを５分間加熱し、ＤＮＡを１本鎖に解離させた。４４℃の環境下で、オーバーナイト（約１６時間）でハイブリダイゼーションを行った。
（３）プローブ洗浄
2xSSC（Ventana社製 #650-012）を、予めヒートブロックを用いて６５℃に温めた。（２）の各チューブに2xSSCを１００μＬ添加した。２４℃の室温環境下で各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離後、各チューブの上清を除去した。各チューブに2xSSCを１００μＬ添加し、サーマルサイクラーを用いて６５℃の環境下で各チューブを３分間加熱し、２４℃の室温環境下で各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去する手順を、合計３回行った。各チューブにReaction Bufferを１００μＬ入れ、内容物を再懸濁させた。
（４）ブロッキング
ブロッキング試薬として、１％ BSA/Reaction bufferを３ｍＬ調製した。２４℃の室温環境下で（３）の各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブにブロッキング試薬１００μＬを添加し、内容物を懸濁させた。３７℃の環境下で２０分間ブロッキングを行った。
（５）一次抗体反応
２４μＬのRabbit Anti DNP Abと、２１６μＬのMouse Anti DIG Abとを混合して、一次抗体反応試薬を調製した。２４℃の室温環境下で（４）の各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。全チューブうち２本のチューブに、検出のための試料を調製するために、一次抗体反応試薬８０μＬを添加し、内容物を懸濁させた。残りの２本のチューブに、後述する領域設定のための試料を調製するために、一次抗体反応試薬ではなくReaction bufferを添加し、内容物を懸濁させた。３７℃の環境下で、２０分間一次抗体反応を行った。
（６）二次抗体・核染色反応
蛍光標識抗体である１μＬのAnti-Mouse IgG-Alexa 488（Cell Signaling Technology社製 #4408S）と、蛍光標識抗体である１μＬのAnti-Rabbit IgG-Alexa 647（Cell Signaling Technology社製 #4414S）と、１μＬのHOECHST33342（同仁化学研究所製 #346-07951）と、１０００μＬのブロッキング試薬とを混合して、二次抗体・核染色反応試薬を調製した。２４℃の室温環境下で（５）の各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブに、二次抗体・核染色反応試薬１００μＬを添加し、内容物を懸濁させた。３７℃の環境下で、遮光状態にして２０分間二次抗体・核染色反応を行った。
（７）測定サンプル調製
２４℃の室温環境下で（６）の各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。各チューブにTBSTを１００μＬ添加し、２４℃の室温環境下で各チューブを１５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去する手順を、合計３回行った。各チューブに、ブロッキング試薬１００μＬ添加して、内容物を再懸濁させた。
２．フローサイトメータによる測定
（１）〜（７）の手順を行った４つのチューブ内の試料を、アムニス社製の画像化フローサイトメータ（ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer）を用いて測定した。フローサイトメータのフローセルを流れる試料に対して、波長が４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４２ｎｍ、７８５ｎｍであるレーザ光を照射した。そして、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光と、核酸染色用色素からの蛍光に対応する光と、明視野に対応する光と、を受光して、各蛍光の強度および画像を取得した。
３．不要な粒子を除去するための領域設定
上記（５）の手順において一次抗体反応試薬に代えてReaction bufferが添加された２本のチューブを用いて、不要な粒子を除去するための領域を設定した。この２本のチューブには、それぞれ、一次抗体反応が行われていない対照細胞を含む試料と、一次抗体反応が行われていない異常細胞を含む試料とが収容された。
一次抗体反応が行われていない試料をフローセルに流し、試料に含まれる粒子ごとに、明視野画像と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度と、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光に対応する光の強度とを取得した。対照細胞を含む試料と異常細胞を含む試料とに基づいて、図７（ａ）、（ｂ）に示すように、明視野画像における粒子の真球度を縦軸とし、明視野画像における粒子の面積を横軸とするスキャッタグラム１１０を作成した。真球度が１に近くなると、粒子の形状は真球に近くなる。解析対象となり得る細胞は、真球度が１に近く、所定の面積を有する。したがって、スキャッタグラム１１０の領域１１１を、解析対象となり得る細胞が分布する領域として設定した。
続いて、スキャッタグラム１１０の領域１１１に含まれる粒子に基づいて、図７（ｃ）、（ｄ）に示すように、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度を縦軸とし、核酸染色用色素からの蛍光に対応する光の強度を横軸とするスキャッタグラム１２０を作成した。微小な粒子の大部分からは微弱な蛍光しか生じないため、所定の強度以上の蛍光を持つ集団を解析対象とした。したがって、スキャッタグラム１２０の領域１２１を、解析対象となり得る細胞が分布する領域として設定し、スキャッタグラム１２０の領域１２２を、解析対象となり得ない微小な粒子が分布する領域として設定した。
続いて、スキャッタグラム１２０の領域１２１に含まれる粒子に基づいて、図７（ｅ）、（ｆ）に示すように、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度を縦軸とし、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度を横軸とするスキャッタグラム１３０を作成した。一次抗体反応が行われていない試料中の細胞からは、自家蛍光が僅かに生じるものの、所定の強度よりも大きい蛍光は生じない。したがって、スキャッタグラム１３０において、この試料中の略全ての細胞を含む領域１３２を、一次抗体反応が行われていない細胞が分布する領域として設定した。そして、スキャッタグラム１３０において、領域１３２よりも縦軸と横軸の値がともに大きい領域１３１を、解析対象となり得る細胞が分布する領域として設定した。
４．解析対象となる細胞の選択
上記（５）の手順において一次抗体反応試薬が添加された２本のチューブを用いて、解析対象となる細胞の選択を行った。この２本のチューブには、それぞれ、対照細胞を含む試料と異常細胞を含む試料とが収容された。試料をフローセルに流し、試料に含まれる粒子ごとに、明視野画像と、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度と、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に対応する光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光に対応する光の強度とを取得した。
続いて、対照細胞を含む試料と異常細胞を含む試料とに基づいて、図８（ａ）、（ｂ）に示すように、図７（ａ）、（ｂ）と同様のスキャッタグラム１１０を作成した。この場合のスキャッタグラム１１０には、図７（ａ）、（ｂ）と同様の領域１１１を設定した。続いて、図８（ａ）、（ｂ）の領域１１１に含まれる粒子に基づいて、図８（ｃ）、（ｄ）に示すように、図７（ｃ）、（ｄ）と同様のスキャッタグラム１２０を作成した。この場合のスキャッタグラム１２０には、図７（ｃ）、（ｄ）と同様の領域１２１を設定した。続いて、図８（ｃ）、（ｄ）の領域１２１に含まれる粒子に基づいて、図８（ｅ）、（ｆ）に示すように、図７（ｅ）、（ｆ）と同様のスキャッタグラム１３０を作成した。この場合のスキャッタグラム１３０には、図７（ｅ）、（ｆ）と同様の領域１３１を設定した。
続いて、図８（ｅ）、（ｆ）の領域１３１に含まれる粒子に基づいて、図９（ａ）、（ｂ）に示すように、図４（ａ）と同様のスキャッタグラム１００を作成した。この場合のスキャッタグラム１００には、図４（ａ）を参照して説明したように、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と、核酸染色用色素からの蛍光の強度との比率が所定の範囲にあると見なすことができる領域１０１を設定した。そして、図９（ａ）、（ｂ）の領域１０１に含まれる粒子を、解析対象の細胞として選択した。
このように、図８（ａ）〜（ｆ）に示すような解析対象の細胞の絞り込みが行われることにより、不要な粒子が除去された。この結果、図９（ａ）、（ｂ）の領域１０１によりハイブリダイゼーションが適正に行われたと見なされる細胞を精度良く選択できた。
５．解析対象の細胞に基づく感度と特異度
上記４において最終的に選択された解析対象の各細胞について、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度を評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度で除算した値を取得した。図１０に示すように、実施形態１として取得した除算値を、対照細胞と異常細胞に分けてプロットした。
また、図１０には、比較例により選択された解析対象の各細胞について取得した除算値を、対照細胞と異常細胞に分けてプロットした。比較例では、上記４において、図９（ａ）、（ｂ）に示したスキャッタグラム１００を用いずに、図８（ｅ）、（ｆ）の領域１３１に含まれる粒子を解析対象とした。すなわち、比較例の場合は、実施形態１と比較して、ハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞を選択するという工程を省略した。
実施形態１と比較例において、図１０に破線で示すように、それぞれ、感度と特異度が最大となるように除算値に対する閾値を設定した。感度は、閾値の上側にあるために異常と判定された細胞の数を、試料中の実際の異常細胞の数で除算したものである。特異度は、閾値の下側にあるために正常と判定された細胞の数を、試料中の対照細胞の数で除算した値である。比較例の場合、感度と特異度は、いずれも９４．５％となった。実施形態１の場合、感度と特異度は、いずれも９９．１％となり、比較例に比べて良好な結果となった。なお、閾値として別の値を用いてもよい。たとえば、実施形態１において各対照細胞から得られた除算値の最大値を閾値として用いてもよいし、実施形態１において各異常細胞から得られた除算値の最小値を閾値として用いてもよい。
以上のように、本検証によれば、実施形態１のようにスキャッタグラム１００の領域１０１を用いてハイブリダイゼーションが適正に行われた細胞を選択することにより、感度と特異度を向上できることが分かる。したがって、実施形態１によれば、異常細胞と正常細胞を精度良く検出できるため、薬剤治療の効果を精度良くモニタリングできる。
＜実施形態２＞
実施形態２は、ＦＩＳＨ法に基づいて転座が生じている細胞を異常細胞として検出するための方法に、本発明を適用したものである。転座が生じている異常細胞を検出する方法について、慢性骨髄性白血病に見られる９番染色体と２２番染色との間で生じる転座を例に説明する。
正常細胞、すなわち転座陰性の細胞の場合、図１１（ａ）に示すように、ＡＢＬ遺伝子の配列は９番染色体にあり、ＢＣＲ遺伝子の配列は２２番染色体にある。以下、ＢＣＲ遺伝子の配列を「ＢＣＲ領域部」と称し、ＡＢＬ遺伝子の配列を「ＡＢＬ領域部」と称する。転座が生じると、ＡＢＬ領域部は２２番染色体に移動する。これにより、異常細胞、すなわち転座陽性の細胞の場合、図１１（ｂ）に示すように、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が生じる。
このように転座が生じることから、図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、たとえば、ＡＢＬ領域部を赤色の蛍光が生じるように蛍光標識し、ＢＣＲ領域部を、緑色の蛍光が生じるように蛍光標識する。こうすると、正常細胞の画像は、図１１（ｃ）に示す状態となり、異常細胞の画像は、図１１（ｄ）に示す状態となる。図１１（ｃ）、（ｄ）に示す細胞画像は、細胞から生じた赤色の蛍光に基づく画像と、細胞から生じた緑色の蛍光に基づく画像を合成したものである。図１１（ｃ）の場合、赤色の輝点と緑色の輝点が離れているため、正常細胞であることが分かる。他方、図１１（ｄ）の場合、いわゆるデュアルフュージョン（Dual Fusion）により、赤色の輝点と緑色の輝点とが重って黄色の輝点が生じている。これにより、図１１（ｄ）の場合、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が生じた異常細胞であることが分かり、医師等が、慢性骨髄性白血病の可能性について診断できる。
また、２２番染色体へのＡＢＬ領域部の転座を検出するために、図１２（ａ）、（ｂ）に示すように、たとえば、ＢＣＲ領域部と、ＢＣＲ領域部に隣接する核酸配列とが、それぞれ、緑色の蛍光を生じるように蛍光標識されても良い。以下、ＢＣＲ領域部に隣接する核酸配列を「ＢＣＲ隣接領域部」と称する。こうすると、正常細胞の画像は、図１２（ｃ）に示す状態となり、異常細胞の画像は、図１２（ｄ）に示す状態となる。
図１２（ｃ）に示すように、正常細胞の場合には、核中のＤＮＡは二本鎖であるため、緑色の輝点は、図１２（ａ）の状態に対応して２つになる。他方、図１２（ｄ）に示すように、異常細胞の場合、染色体の分離、いわゆるブレイクアパート（Break Apart）により、ＢＣＲ隣接領域部が２２番染色体から分断されて９番染色体に移動し、緑色の輝点が増えている。なお、この場合、９番染色体にあったＡＢＬ領域部が２２番染色体上のＢＣＲ隣接領域部があった場所に移動する。これにより、図１２（ｄ）の場合、異常細胞であることが分かる。なお、ＡＢＬ領域部と、ＡＢＬ領域部の隣接の核酸配列とが、緑色の蛍光を生じるように蛍光標識されても良い。この場合も、図１２（ｃ）、（ｄ）と同様に、ブレイクアパートによる異常細胞を検出できる。
上記のようなデュアルフュージョンとブレイクアパートの判定を行う場合においても、図１のステップＳ１１〜Ｓ１４の処理工程が行われ、異常細胞の検出が行われる。
デュアルフュージョンに基づく判定の場合、図１１（ａ）に示すように、遺伝子配列が蛍光標識される。この場合、評価対象領域は、ＢＣＲ領域部またはＡＢＬ領域部である。評価対象領域がＢＣＲ領域部である場合、検出対象領域はＡＢＬ領域部とされ、評価対象領域がＡＢＬ領域部である場合、検出対象領域はＢＣＲ領域部とされる。すなわち、検出対象領域と評価対象領域の組合せは、ＢＣＲ領域部とＡＢＬ領域部であれば良い。
この場合も、実施形態１と同様、ステップＳ１１の試料調製工程において、ハイブリダイゼーションにより、評価対象領域には、評価用プローブが結合され、検出対象領域には、検出用プローブが結合される。したがって、実施形態１と同様、ステップＳ１１〜Ｓ１３により、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と核酸染色用色素からの蛍光の強度とに基づいて、ハイブリダイゼーションが適正な細胞を選択できる。
ステップＳ１４の検出工程では、ＡＢＬ領域部およびＢＣＲ領域部の分布を判定するために、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像と評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の画像が用いられる。したがって、実施形態２では、ステップＳ１２の受光工程において、これらの画像が取得される。
ステップＳ１４では、ステップＳ１２で取得された画像における、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布と評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布とに基づいて、処理装置により、解析対象の細胞から異常細胞が検出される。具体的には、検出用プローブに基づく輝点の位置と評価用プローブに基づく輝点の位置とが重なることにより、図１１（ｄ）に示すように、合成画像において所定の色の輝点が生じている場合に、処理装置により、転座が生じていると判定される。そして、処理装置により、転座が生じている細胞が異常細胞として検出される。なお、細胞の画像を表示部に表示させ、オペレータの目視により、検出用プローブに基づく輝点の位置と評価用プローブに基づく輝点の位置とが近付いている、または重なっている細胞を、転座が生じている異常細胞と判定しても良い。
ブレイクアパートに基づく判定の場合、図１２（ａ）に示すように、ＢＣＲ領域部と、ＢＣＲ領域部に隣接する核酸配列とがそれぞれ蛍光標識される。この場合、評価対象領域は、ＢＣＲ領域部またはＢＣＲ隣接領域部である。評価対象領域がＢＣＲ領域部である場合、検出対象領域はＢＣＲ隣接領域部とされ、評価対象領域がＢＣＲ隣接領域部である場合、検出対象領域はＢＣＲ領域部とされる。すなわち、検出対象領域と評価対象領域の組合せは、ＢＣＲ領域部とＢＣＲ隣接領域部であれば良い。なお、検出対象領域と評価対象領域の組合せは、ＡＢＬ領域部と、ＡＢＬ領域部に隣接する核酸配列であっても良い。
この場合も、ステップＳ１１の試料調製工程において、ハイブリダイゼーションにより、評価対象領域には、評価用プローブが結合され、検出対象領域には、検出用プローブが結合される。ただし、この場合の評価用プローブと検出用プローブは、ＢＣＲ領域部とＢＣＲ隣接領域部にハイブリダイズ可能となるよう構成されるため、実質的に同一の構成となる。そして、上記デュアルフュージョンの場合と同様、ステップＳ１１〜Ｓ１３により、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と核酸染色用色素からの蛍光の強度とに基づいて、ハイブリダイゼーションが適正な細胞が選択される。
ステップＳ１４では、取得された画像における、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布と評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の分布とに基づいて、処理装置により、解析対象の細胞から異常細胞が検出される。図１２（ｂ）に示すように、検出対象領域または評価対象領域が他の染色体上に移動している場合に、転座が生じていると考えられる。したがって、図１２（ｄ）に示すように、検出用プローブと評価用プローブに基づく輝点が増えている場合に、転座が生じていると判定される。そして、転座が生じている細胞が異常細胞として検出される。なお、細胞の画像を表示部に表示させ、オペレータが目視で観察することによって、転座が生じている細胞を検出してもよい。
実施形態２においても、ハイブリダイゼーションが適正に行われたと見なされる細胞に対して、異常細胞であるか否かの判定が行われる。よって、実施形態１と同様、異常細胞の検出精度を高めることができる。また、実施形態２では、９番染色体と２２番染色との間で転座が生じている異常細胞が精度良く検出されるため、医師等が、骨髄性白血病の病状の判定を精度良く行うことができる。
＜実施形態３＞
実施形態３は、ＦＩＳＨ法に基づいて欠失が生じている細胞を異常細胞として検出するための方法に、本発明を適用したものである。
正常細胞、すなわち欠失陰性の細胞の場合、所定のＤＮＡ配列領域が所定の染色体にあるが、異常細胞、すなわち欠失陽性の細胞の場合、所定のＤＮＡ配列領域が染色体上から消失する。欠失を検出する場合には、検出対象領域は、欠失するＤＮＡ配列領域の少なくとも一部の配列とされ、評価対象領域は、欠失するＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列とされる。これにより、実施形態１と同様、ハイブリダイゼーションが適正に行われたと見なされる細胞を選択できる。また、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光強度が所定の閾値以下と処理装置により判定された場合に、欠失が生じている異常細胞を処理装置により検出できる。画像を表示部に表示させ、オペレータの目視により、欠失が生じている異常細胞を検出してもよい。
＜実施形態４＞
実施形態４は、ＦＩＳＨ法に基づいて染色体上で逆位が生じている細胞を異常細胞として検出するための方法に、本発明を適用したものである。
逆位では染色体上のＤＮＡの塩基配列の順序が部分的に逆転する。そのため、たとえば、特定の遺伝子とそれに隣接するＤＮＡ配列領域の両方の領域に結合するプローブを試料に混ぜ、当該プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光を検出できた場合には、逆位が生じていない正常細胞と判断できる。当該プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光を検出できなかった場合には、遺伝子が染色体から切断され、逆転したことによりプローブが結合しなかったと考えられるため、逆位が生じている異常細胞であると判断できる。逆位を検出する場合には、検出対象領域は、特定の遺伝子とそれに隣接するＤＮＡ配列領域の両方にまたがる領域とされ、評価対象領域は、逆位が生じる当該特定の遺伝子とされる。
なお、図１３に示すように、種々のゲノム異常（遺伝子増幅、転座、欠失、逆位等）を判定して異常細胞を検出する場合に本発明を適用できる。
＜実施形態５＞
実施形態５は、実施形態１の細胞検出方法に基づいて異常細胞を検出する細胞検出装置に、本発明を適用したものである。
図１４に示すように、細胞検出装置１０は、処理部１１と、試料調製部１２と、光学検出部１３と、信号処理部１４と、表示部１５と、入力部１６と、を備える。
処理部１１は、マイクロコンピュータおよびＣＰＵ等と、記憶部１１ａとにより構成される。記憶部１１ａは、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。記憶部１１ａは、処理部１１によって実行される処理プログラムを記憶する。処理部１１は、細胞検出装置１０の各部との間で信号の送受信を行い、各部を制御する。試料調製部１２は、細胞と試薬を混合することにより、試料を調製する。
図１５に示すように、光学検出部１３は、フローセル２００と、光源２１１〜２１４と、受光部２２１〜２２３と、撮像部２２４と、集光レンズ２３１〜２３９と、ダイクロイックミラー２４１〜２４４と、ハーフミラー２５１と、フィルタ２５２と、光学ユニット２５３と、を備える。
光源２１１〜２１４は、半導体レーザ光源により構成される。光源２１１〜２１４から出射される光は、それぞれ、波長λ１１〜λ１４のレーザ光である。波長λ１１〜λ１４は、それぞれ、たとえば４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４２ｎｍ、７８５ｎｍである。集光レンズ２３１〜２３４は、それぞれ、光源２１１〜２１４から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー２４１は、波長λ１２の光を反射し、波長λ１３の光を透過させる。ダイクロイックミラー２４２は、波長λ１１の光を反射し、波長λ１２、λ１３の光を透過させる。こうして、光源２１１〜２１４から出射された波長λ１１〜λ１４の光は、フローセル２００の流路２０１を流れる試料に照射される。
フローセル２００を流れる試料に波長λ１１〜λ１３の光が照射されると、細胞を染色している蛍光色素から蛍光が生じる。波長λ１１の光が核染色用色素に照射されると、波長λ２１の蛍光が生じ、波長λ１２の光が評価用プローブの蛍光色素に照射されると、波長λ２２の蛍光が生じ、波長λ１３の光が検出用プローブの蛍光色素に照射されると、波長λ２３の蛍光が生じる。フローセル２００を流れる試料に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の光は、明視野画像の生成に用いられる。
集光レンズ２３５は、フローセル２００を流れる試料から生じた波長λ２１〜λ２３の蛍光と、フローセル２００を流れる試料を透過した波長λ１４の光とを集光する。ハーフミラー２５１は、集光レンズ２３５を透過した光の略半分を透過させ、略半分をフィルタ２５２へと反射させる。
フィルタ２５２は、波長λ２１〜λ２３の蛍光を透過し、不要な光を遮断する。ダイクロイックミラー２４３は、波長λ２１の蛍光を反射し、波長λ２２、λ２３の蛍光を透過させる。ダイクロイックミラー２４４は、波長λ２２の蛍光を反射し、波長λ２３の蛍光を透過させる。集光レンズ２３６〜２３８は、それぞれ、波長λ２１〜λ２３の蛍光を集光する。受光部２２１〜２２３は、それぞれ、波長λ２１〜λ２３の蛍光を受光して、受光した蛍光の強度に応じた信号を出力する。受光部２２１〜２２３は、フォトマルチプライヤにより構成される。受光部２２１〜２２３は、フォトマルチプライヤにより構成されることにより、高感度に蛍光の強度に応じた信号を生成できる。
光学ユニット２５３は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット２５３の４枚のダイクロイックミラーは、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部２２４の受光面上において分離させる。集光レンズ２３９は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを集光する。撮像部２２４は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部２２４は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを受光して、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光にそれぞれ対応した粒子の画像情報を、撮像信号として出力する。
図１４に戻り、信号処理部１４は、信号を処理するための複数の回路と記憶部とにより構成される。信号処理部１４は、受光部２２１〜２２３から出力された信号に基づいて、粒子ごとに蛍光の強度を算出する。処理部１１は、粒子ごとに算出された蛍光の強度を記憶部１１ａに記憶する。また、処理部１１は、撮像部２２４から出力された撮像信号に基づいて粒子の画像を生成し、生成した画像を粒子ごとに記憶部１１ａに記憶する。表示部１５は、ディスプレイにより構成され、異常細胞の検出結果等を表示する。入力部１６は、マウスおよびキーボードにより構成される。オペレータは、入力部１６を介して細胞検出装置１０に対して指示を入力する。
次に、図１６を参照して、細胞検出装置１０による異常細胞の検出処理について説明する。異常細胞の検出処理は、処理部１１が細胞検出装置１０の各部を制御することにより実行される。
ステップＳ１０１において、処理部１１は、試料調製部１２を駆動して、細胞と、細胞中の検出対象領域にハイブリダイズする検出用プローブを含む試薬と、細胞中の評価対象領域にハイブリダイズする評価用プローブを含む試薬と、核染色用色素を含む試薬とを混合することにより、試料を調製する。これにより、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、検出対象領域に蛍光色素を含む検出用プローブが結合し、評価対象領域に蛍光色素を含む評価用プローブが結合する。ステップＳ１０２において、処理部１１は、ステップＳ１０１で調製した試料をフローセル２００に流す。ステップＳ１０３において、処理部１１は、光源２１１〜２１４を駆動して、フローセル２００に流れる試料に光を照射する。ステップＳ１０４において、処理部１１は、試料中の粒子から生じた波長λ２１〜λ２３の蛍光を受光部２２１〜２２３により受光して、波長λ２１〜λ２３の蛍光の強度を取得する。
ステップＳ１０５において、処理部１１は、実施形態１のステップＳ１３と同様、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と核酸染色用色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する。具体的には、処理部１１は、信号処理部１４により算出された波長λ２１、λ２２の蛍光の強度に基づいて、スキャッタグラム１００の領域１０１にある細胞を、解析対象の細胞として選択する。この場合も、処理部１１は、実際にスキャッタグラム１００を用いるのではなく、波長λ２１、λ２２の蛍光の強度を２軸とする仮想の座標空間上で処理を行い、解析対象の細胞を選択する。なお、この場合も、実施形態１の検証で示したように、不要な粒子の除去が行われるのが望ましい。
ステップＳ１０６において、処理部１１は、実施形態１のステップＳ１４と同様、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光に基づいて、解析対象の細胞から異常細胞を検出する。具体的には、処理部１１は、信号処理部１４により算出された波長λ２２、λ２３の蛍光の強度を用いる。処理部１１は、解析対象の各細胞について波長λ２３の蛍光の強度を波長λ２２の蛍光の強度で除算し、除算結果が所定の閾値を上回っている細胞を、検出対象領域が増幅している異常細胞として検出する。ステップＳ１０６において、処理部１１は、撮像部２２４の撮像信号から生成した画像において輝点を取得し、輝点に基づいて異常細胞を検出しても良い。
実施形態５においても、実施形態２〜４で説明したような転座、欠失、逆位が生じている細胞を異常細胞として検出しても良い。転座の場合、処理部１１は、撮像部２２４の撮像信号から生成した画像に基づいて蛍光の分布を取得し、蛍光の分布に基づいて、転座が生じている異常細胞を検出する。欠失または逆位の場合、処理部１１は、検出用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度が所定の閾値以下である細胞を、欠失または逆位が生じている異常細胞として検出する。あるいは、処理部１１は、撮像部２２４の撮像信号から生成した画像において輝点を取得し、輝点数が正常細胞に比べて少ない細胞を、欠失または逆位が生じている異常細胞として検出しても良い。
処理部１１は、画像を目視により分類した結果を受け付けるための目視結果入力画面３００を、表示部１５に表示しても良い。
図１７に示すように、目視結果入力画面３００は、画像表示領域３１０と、ボタン３２１〜３２４と、結果表示領域３３０と、保存ボタン３４０と、を備える。処理部１１は、目視入力を開始する指示を受け付けると、対象となる試料に関する目視結果入力画面３００を表示部１５に表示する。
画像表示領域３１０は、対象となる試料に基づいて取得され、ステップＳ１０５により選択された細胞画像を表示する。画像表示領域３１０内の画像は、選択可能に構成されており、画像が選択されると、画像表示領域３１０内の左上にある画像のように、画像が２重線により囲まれる。ボタン３２１〜３２４は、画像表示領域３１０内の選択された画像の目視結果を受け付ける。オペレータは、選択した画像を目視して、画像が示す細胞において、遺伝子増幅、転座による遺伝子の融合、転座による分断、および欠失が生じていると判定した場合に、それぞれ、入力部１６を介してボタン３２１〜３２４を押す。これにより、結果表示領域３３０内の該当する項目の値が増やされる。
結果表示領域３３０は、試料に含まれる全細胞のうち、遺伝子増幅、融合、分断、および欠失が生じている細胞の個数をそれぞれ表示する。すなわち、結果表示領域３３０は、オペレータによりボタン３２１〜３２４を介して入力された個数を表示する。保存ボタン３４０が押されると、処理部１１は、結果表示領域３３０に表示されている結果値を記憶部１１ａに記憶する。このように、オペレータは、画像を目視して細胞ごとの状態を入力し、入力した結果を記憶部１１ａに記憶させることができる。目視結果入力画面３００には、染色状態の良い細胞のみが選択されて表示されるため、オペレータは良好な画像を観察して細胞の状態を効率的に判断できる。
＜実施形態６＞
実施形態６は、細胞の選択を行う細胞選択装置に、本発明を適用したものである。
図１８に示すように、実施形態６の細胞選択装置２０は、実施形態５の細胞検出装置１０と比較して、粒子選別部２１と貯留部２２が追加されている。この他、図１９に示すように、実施形態６では、実施形態５と比較して、光学検出部１３のフローセル２００の構成が異なっている。実施形態６の他の構成については、実施形態５と同様である。
図１９に示すように、実施形態６のフローセル２００は、流路２０１に加えて、流路２０２、２０３が形成されている。流路２０２は、流路２０１の延長上に形成されており、流路２０３は、流路２０１、２０２の間において、流路２０１から分岐している。流路２０２は、図示しない廃棄部に接続されており、流路２０３は、貯留部２２に接続されている。粒子選別部２１は、流路２０２に設置されている。粒子選別部２１は、部材２１ａと、部材２１ａを流路２０２に突出させるための駆動部とを備える。部材２１ａが流路２０２を開放する位置に位置付けられると、流路２０１を流れる試料は、流路２０３には送られず、流路２０２を経由して廃棄部へと送られる。他方、部材２１ａが流路２０２を塞ぐ位置に位置付けられると、流路２０１を流れる試料は、流路２０２には送られず、流路２０３を経由して貯留部２２へと送られる。
次に、図２０を参照して、細胞選択装置２０による解析対象細胞の選択処理について説明する。図２０のフローチャートは、図１６と比較して、ステップＳ１０５、Ｓ１０６に代えて、ステップＳ１１１〜Ｓ１１３が追加されている。
ステップＳ１０１において、処理部１１は、実施形態５と同様、試料を調製する。ステップＳ１０２において、処理部１１は、粒子選別部２１を駆動して、予め流路２０２を開放させ、試料を試料調製部１２からフローセル２００の流路２０１に流す。ステップＳ１０３において、処理部１１は、実施形態５と同様、試料に光を照射する。このとき、図１９に示すように、光源２１１〜２１４から出射された光は、流路２０１の位置２０１ａに位置する粒子に照射され、粒子から生じた光は、受光部２２１〜２２３および撮像部２２４によって受光される。ステップＳ１０４において、処理部１１は、実施形態５と同様、粒子から生じた蛍光の強度を取得する。
ステップＳ１１１において、処理部１１は、位置２０１ａの粒子から生じた波長λ２１、λ２２の蛍光の強度に基づいて、この粒子が図４（ａ）に示すスキャッタグラム１００の領域１０１にあるか否かを判定する。すなわち、処理部１１は、位置２０１ａの細胞について、評価用プローブに含まれる蛍光色素からの蛍光の強度と核酸染色用色素からの蛍光の強度に基づいて、ハイブリダイゼーションが適正に行われたか否かを判定する。
処理部１１は、位置２０１ａの細胞についてハイブリダイゼーションが適正に行われたと判定すると、ステップＳ１１２において、この細胞が流路２０１の位置２０１ｂに位置付けられたときに粒子選別部２１を駆動して流路２０２を塞ぎ、この細胞を貯留部２２へ送る。他方、処理部１１は、位置２０１ａの細胞についてハイブリダイゼーションが適正に行われていないと判定すると、ステップＳ１１３において、この細胞が位置２０１ｂに位置付けられたときに粒子選別部２１を駆動して流路２０２を開放し、この細胞を廃棄部へ送る。
実施形態６によれば、ハイブリダイゼーションが適正な細胞が解析対象として選択され、貯留部２２に送られる。したがって、貯留部２２に貯留している細胞を用いて、たとえば他の検出装置や細胞検出装置１０において異常細胞の検出を行えば、精度良く異常細胞の検出を行うことができる。
実施形態６では、ステップＳ１０１において、実施形態５と同様、検出対象領域をＨｅｒ２遺伝子とし評価対象領域をＣｈ１７として試料の調製が行われた。しかしながら、これに限らず、実施形態２〜４と同様、検出対象領域と評価対象領域の組合せ決められ、試料の調製が行われても良い。この場合も、ハイブリダイゼーションが適正な細胞を解析対象として選択できる。
１０ 細胞検出装置
１１ 処理部
１２ 試料調製部
２０ 細胞選択装置
２００ フローセル
２１１〜２１４ 光源
２２１〜２２３ 受光部
２２４ 撮像部

Claims (19)

  1. 第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、
    前記試料に光を照射して、前記第１蛍光色素からの蛍光と前記第２蛍光色素からの蛍光とを受光する受光工程と、
    前記第１蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、を含み、
    前記第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素が、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である、細胞選択方法。
  2. 前記受光工程において、フローセルを流れる前記試料に光を照射して、前記第１蛍光色素からの蛍光と前記第２蛍光色素からの蛍光とを受光する、請求項１に記載の細胞選択方法。
  3. 前記受光工程において、基材上に配置された前記試料に光を照射して、顕微鏡を用いて、前記第１蛍光色素からの蛍光と前記第２蛍光色素からの蛍光とを受光する、請求項１に記載の細胞選択方法。
  4. 前記選択工程において、前記第１蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度との比率が所定の範囲にあると評価される細胞を、解析対象の細胞として選択する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の細胞選択方法。
  5. 前記解析対象の細胞は、前記細胞中のゲノムの異常を検出するために選択され、
    前記ゲノムの異常は、遺伝子増幅、欠失、転座および逆位のいずれかである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の細胞選択方法。
  6. 前記ゲノムの異常が遺伝子増幅の場合、前記評価対象領域は、前記細胞の核中のＤＮＡ配列領域のうち、増幅が生じるＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列であり、
    前記ゲノムの異常が欠失の場合、前記評価対象領域は、前記細胞の核中のＤＮＡ配列領域のうち、欠失が生じるＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列である、請求項５に記載の細胞選択方法。
  7. 前記評価用プローブは、前記評価対象領域に相補的で、前記第２蛍光色素が結合されるポリヌクレオチドを有する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の細胞選択方法。
  8. 第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、
    前記試料に光を照射して、前記試料中の前記細胞を撮像する撮像工程と、
    前記撮像工程で撮像された前記細胞の画像に基づいて、前記第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、前記第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とを取得する輝度取得工程と、
    前記第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、前記第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、を含み、
    前記第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素が、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素である、細胞選択方法。
  9. 第１蛍光色素による細胞中の核酸の染色と、第２蛍光色素を含む評価用プローブによる前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域に対するハイブリダイゼーションと、第３蛍光色素を含む検出用プローブによる前記細胞中のＤＮＡの検出対象領域に対するハイブリダイゼーションとを行うことにより、試料を調製する試料調製工程と、
    前記試料に光を照射して、前記第１蛍光色素からの蛍光と、前記第２蛍光色素からの蛍光と、前記第３蛍光色素からの蛍光とを受光する受光工程と、
    前記第１蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する選択工程と、
    前記第３蛍光色素からの蛍光に基づいて、前記解析対象の細胞から異常細胞を検出する検出工程と、を含み、
    前記第１蛍光色素が第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素が、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第３蛍光色素が、前記第１および第２波長とは異なる第３波長の蛍光を発する色素である、細胞検出方法。
  10. 前記受光工程において、フローセルを流れる前記試料に光を照射して、前記第１蛍光色素からの蛍光と、前記第２蛍光色素からの蛍光と、前記第３蛍光色素からの蛍光とを受光する、請求項９に記載の細胞検出方法。
  11. 前記検出工程において、前記第３蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度との比を閾値と比較することにより、前記解析対象の細胞から異常細胞を検出する、請求項９または１０の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  12. 前記検出工程において、前記第３蛍光色素からの蛍光の強度を前記第２蛍光色素からの蛍光の強度で除した値が閾値を超えている細胞を、異常細胞として検出する、請求項１１に記載の細胞検出方法。
  13. 前記検出対象領域は、前記細胞の核中のＤＮＡ配列領域のうち、増幅の有無を検出するためのＤＮＡ配列領域であり、
    前記評価対象領域は、前記細胞の核中のＤＮＡ配列領域のうち、増幅が生じるＤＮＡ配列領域を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列であり、
    前記検出工程において、特定のＤＮＡ配列領域の増幅が生じている細胞を異常細胞として検出する、請求項９ないし１２の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  14. 前記検出対象領域は、Ｈｅｒ２遺伝子であり、
    前記評価対象領域は、１７番染色体のうちＨｅｒ２遺伝子を除くＤＮＡ配列領域の一部の配列であり、
    前記検出工程において、前記Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している細胞を異常細胞として検出する、請求項１３に記載の細胞検出方法。
  15. 前記検出対象領域は、前記細胞の核中のＤＮＡ配列領域のうち、転座の有無を検出するためのＤＮＡ配列領域であり、
    前記検出工程において、転座が生じている細胞を異常細胞として検出する、請求項９ないし１２の何れか一項に記載の細胞検出方法。
  16. 前記検出対象領域と前記評価対象領域の組合せは、ＢＣＲ遺伝子と、ＡＢＬ遺伝子であり、
    前記検出工程において、前記ＢＣＲ遺伝子または前記ＡＢＬ遺伝子が転座してＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子を生成している細胞を異常細胞として検出する、請求項１５に記載の細胞検出方法。
  17. 細胞と、前記細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、
    前記試料が流れるフローセルと、
    前記フローセルを流れる前記試料に光を照射する光源と、
    前記第１蛍光色素からの蛍光と前記第２蛍光色素からの蛍光とを受光する受光部と、
    処理部と、を備え、
    前記第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素は、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、
    前記処理部は、前記第１蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する、細胞選択装置。
  18. 細胞と、前記細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、
    前記試料が流れるフローセルと、
    前記フローセルを流れる前記試料に光を照射する光源と、
    前記試料中の前記細胞を撮像する撮像部と、
    処理部と、を備え、
    前記第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素は、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、
    前記処理部は、
    前記撮像部により撮像された前記細胞の画像に基づいて、前記第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、前記第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とを取得し、
    前記第１蛍光色素からの蛍光の画像の輝度と、前記第２蛍光色素からの蛍光の画像の輝度とに基づいて、解析対象の細胞を選択する、細胞選択装置。
  19. 細胞と、前記細胞中の核酸を染色するための第１蛍光色素を含む核酸染色用試薬と、前記細胞中のＤＮＡの評価対象領域にハイブリダイズする、第２蛍光色素を含む評価用プローブを含む試薬と、前記細胞中のＤＮＡの検出対象領域にハイブリダイズする、第３蛍光色素を含む検出用プローブを含む試薬とを混合することにより、試料を調製する試料調製部と、
    前記試料が流れるフローセルと、
    前記フローセルを流れる前記試料に光を照射する光源と、
    前記第１蛍光色素からの蛍光と、前記第２蛍光色素からの蛍光と、前記第３蛍光色素からの蛍光とを受光する受光部と、
    処理部と、を備え、
    前記第１蛍光色素は、第１波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第２蛍光色素は、前記第１波長とは異なる第２波長の蛍光を発する色素であり、
    前記第３蛍光色素は、前記第１および第２波長とは異なる第３波長の蛍光を発する色素であり、
    前記処理部は、
    前記第１蛍光色素からの蛍光の強度と前記第２蛍光色素からの蛍光の強度とに基づいて、解析対象の細胞を選択し、
    前記第３蛍光色素からの蛍光に基づいて、前記解析対象の細胞から異常細胞を検出する、細胞検出装置。
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