JP2000270900A

JP2000270900A - 癌検出のための方法およびプローブのセット

Info

Publication number: JP2000270900A
Application number: JP2000061230A
Authority: JP
Inventors: Kevin C Halling; ケビン，シー．ホーリング; Robert B Jenkins; ロバート，ビー．ジェンキンス; Walter King; ウォルター，キング; Irina A Sokolova; イリナ，エー．ソコロヴァ; Steven A Seelig; スティーブン，エイ．シーリグ
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Vysis Inc
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research; Abbott Molecular Inc
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-03-06
Publication date: 2000-10-03
Anticipated expiration: 2020-03-06
Also published as: US20150337391A1; JP5680502B2; JP4986316B2; JP2015015958A; US7998670B2; DE60029369T2; ES2528180T3; JP6170024B2; US6376188B1; US20080032302A1; US6174681B1; EP1035215B1; US7232655B2; US20020160409A1; EP1035215A2; DE60029369D1; DK1650313T3; US9045802B2; EP1650313A1; EP1035215A3

Abstract

(57)【要約】【課題】十分な感度を維持しつつ、迅速に癌を検出で
きる方法を提供する。【解決手段】(a) 染色体プローブのセットを被験者由来
の生物学的サンプルにハイブリダイズさせ、(b) 上記生
物学的サンプルから細胞を選択し、(c) 上記選択した細
胞における異数染色体性細胞の有無を判定し、(d) 上記
選択した細胞における異数染色体性細胞の存在を被験者
の癌と相関させる、ことを含んでなる被験者の癌をスク
リーニングする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌の検出に関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】米国
では、膀胱癌は五番目に多い新生物であり、癌による死
亡原因の第12位に位置する。米国では、毎年53,000人を
超える新たな患者が膀胱癌と診断されている。米国にお
いて、膀胱癌患者の95％以上が、移行上皮癌（TCC、ま
た、尿路上皮癌と呼ばれることもある）である。腫瘍の
病期によって、膀胱癌患者の予後が最もよく予測でき
る。膀胱癌は、腫瘍の侵襲深度に応じて、また、リンパ
節や遠隔転移があるかどうかによって、病期を決定す
る。非侵襲性の乳頭状腫瘍（最も一般的で、進行性が最
も低いタイプの膀胱癌）は、pTa期腫瘍と呼ばれる。
「偏平」TCC（より一般的には「上皮内癌」（CIS）と呼
ばれる）は、より進行性だが、一般的ではない腫瘍で、
侵襲性疾患の進行速度が速い。CISには、pTIS期が当て
られる。上皮の基底膜を通って、その下にある固有層に
侵入した腫瘍には、pT1期が当てられる。膀胱の筋肉に
侵入した腫瘍はpT2期腫瘍である。さらに、筋肉を通っ
て膀胱周囲の組織に侵入した腫瘍はpT3腫瘍である。ま
た、周囲の器官に侵入した腫瘍はpT4腫瘍である。「表
在性」膀胱癌という用語は、pTa、pTISおよびpT1腫瘍を
指す。筋肉侵襲性膀胱癌は、pT2、pT3およびpT4腫瘍を
指す。

【０００３】膀胱癌患者の約80％が、「表在性」膀胱癌
であり、残り20％が筋肉侵襲性膀胱癌である。「表在
性」膀胱癌患者には、膀胱切除術（すなわち、膀胱の除
去）は必要ないが、腫瘍再発の危険性が高いため、定期
的に（通常、初めの２年間は３ヵ月毎、次の２年間は６
ヵ月毎、その後は年１回）腫瘍の再発および／または進
行について監視する。表在性膀胱癌の治療は、一般に、
乳頭状腫瘍の外科切除と、カルメット・ゲラン菌（BC
G）によるCISの治療とから成る。筋肉侵襲性疾患患者
は、膀胱切除術により治療するが、「表在性」膀胱癌患
者と比べると予後が比較的悪い。残念なことには、筋肉
侵襲性膀胱癌患者の80〜90％が、初めから筋肉侵襲性疾
患を発病している。膀胱癌による毎年約10,000人の死亡
の大部分は、このグループの患者で占められる。膀胱癌
が進行した患者がこのように多く存在するという事実
は、早期段階で、膀胱癌を検出するスクリーニング・プ
ログラムが、この疾患による全体死亡率を減少させるの
に役立つのではないかということを示唆している。実際
に、少なくとも二つの大規模なスクリーニング研究か
ら、膀胱癌を早期段階で特定するのにスクリーニングが
役立つことが示されている。Messingら、Urology1995年
45号、387〜396頁、ならびに、MayfieldおよびWhelan、
Br.J.Urol.1998年82(6)号、825〜828頁。

【０００４】過去数年にわたり、膀胱鏡検査法と尿細胞
診断法が膀胱癌検出の主要な手段であった。しかし、い
くつかの研究によって、細胞診断法は膀胱癌検出の感度
が思いのほか低いことが明らかにされている。Maoら、S
cience1996年271号、656〜662頁、Ellisら、Urology199
7年50号、882〜887頁、ならびにLandmanら、Urology199
8年52号、398〜402頁。このために、膀胱癌検出の感度
を向上させた新しいアッセイの開発に大きな関心が寄せ
られている。膀胱癌検出のために開発されてきた新しい
アッセイの例として、例えば、BT試験（C.R.Bard社、Mu
rrayhill,NJ）、NMP-22、FDP等の膀胱癌腫瘍抗原を検出
する試験、テロメラーゼ活性の増加（通常、悪性腫瘍に
伴う）を検出する試験、または、尿細胞および膀胱洗浄
物の遺伝子変化を検出する試験（例えば、蛍光in situ
ハイブリダイゼーション（FISH）およびマイクロサテラ
イト分析）が挙げられる。FISH分析は、他の検出方法よ
り高感度であるが、多数の細胞を数えなければならない
ため、分析には時間と費用がかかる。このため、十分な
感度を維持しつつ、迅速に癌を検出できる方法が求めら
れている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、第一に、生物
学的サンプルから選択した細胞のサブセットにおける異
数染色体性(aneusomic)細胞の存在に基づいて、癌検出
のための迅速かつ高感度の方法が実現可能であるという
発見をもとにしている。染色体異常について評価すべき
細胞のサブセットを選択することによって、分析する細
胞数が減少するため、迅速に分析を実施し、しかも感度
を維持する、または向上させることができる。本発明は
また、FISH分析に最適の感度を達成するように選択され
た染色体プローブのセット、ならびに染色体プローブの
セットを含む検出キットを提供する。

【０００６】さらに、本発明は、被験者の癌スクリーニ
ング方法に関する。この方法は、染色体プローブのセッ
トを被験者由来の生物学的サンプルにハイブリダイズさ
せ、該生物学的サンプルから細胞を選択し、選択した細
胞における異数染色体性細胞の有無を判定し、選択した
細胞における異数染色体性細胞の存在を被験者の癌と相
関させる工程を含む。生物学的サンプルは、尿、血液、
脳脊髄液、胸膜液、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、口腔洗
浄物、組織サンプル、触診サンプル（touch preps）、
または細い針による吸引液でよく、使用前に濃縮しても
よい。尿は特に有用な生物学的サンプルである。細胞
は、核の大きさや形状等の核の形態学によって選択する
ことができる。核の形態学は、DAPI染色法によって評価
することができる。この方法は、膀胱癌、肺癌、乳癌、
卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、ならびに白血
病等の癌を検出するのに有用である。この方法は、特
に、膀胱癌の検出に適している。

【０００７】上記染色体プローブのセットは、少なくと
も三つの染色体プローブを含む。このセットは、少なく
とも一つの動原体プローブ、もしくは少なくとも一つの
遺伝子座特異的プローブを含む。適切な動原体染色体プ
ローブには、３番、７番、８番、11番、15番、17番、18
番染色体およびＹ染色体に対するプローブが含まれる。
適切な遺伝子座特異的プローブは、９番染色体の9p21領
域に対するプローブを含む。例えば、このセットは、動
原体染色体プローブ３、７、17と、さらに、遺伝子座特
異的プローブ9p21を含むことができる。染色体プローブ
は、蛍光標識することもできる。

【０００８】本発明はまた、染色体プローブのセット、
ならびにこれら染色体プローブのセットを含む癌検出キ
ットに関する。該染色体プローブのセットは、３番、７
番、および17番染色体に対する動原体プローブを含む
が、さらに、9p21のような遺伝子座特異的プローブを含
んでいてもよい。染色体プローブは、蛍光標識すること
もできる。

【０００９】別に定義しない限り、本明細書で用いる技
術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分
野の当業者が一般に理解する意味と同じである。これま
で述べたものと類似もしくは同等の方法および材料を使
用して、本発明を実施することもできるが、適した方法
および材料を以下に説明する。本明細書に述べる出版
物、特許出願、特許、ならびにその他の参考文献は、引
用により全内容を組み入れる。矛盾する場合には、定義
を含め本明細書によって調整する。さらに、材料、方
法、ならびに実施例は、説明のために示したに過ぎず、
これらに限定されるわけではない。本発明のその他の特
徴および利点は、以下に示す詳細な説明、ならびに特許
請求の範囲から明らかになるであろう。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、癌を検出するための迅
速で高感度の方法を好適に提供する。本発明は、充実性
腫瘍や白血病を含む癌の疑いのある被験者のスクリーニ
ング、または、癌と診断された患者の腫瘍再発の監視に
使用することができる。例えば、膀胱癌、肺癌、乳癌、
卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭部および頸部の癌、
腎臓癌、または白血病の疑いのある被験者のスクリーニ
ング、もしくはその再発の監視を行うことができる。一
般には、染色体プローブのセットをスライドガラス上の
細胞（尿由来、またはその他の生物学的サンプル）にハ
イブリダイズさせる。次に、スライドガラス上の細胞を
比較的低い拡大能（例えば、200〜400倍）で、視覚的に
走査することにより、悪性腫瘍を強く示す形態的特徴
（例えば、核の膨大や凹凸のある核形状）を見いだす。
細胞診断法的に異常な細胞の核を染色体異常について検
査するが、この検査は、対物レンズをさらに高い拡大能
のもの（例えば、600〜1,000倍）に切り換え、フィルタ
を「反転させる(flipping)」ことによって、細胞が異数
染色体性であるか否かを判定する。この方法を使用する
ことによって、新生物である確率が低い細胞を評価する
のに費やす時間を大幅に短縮し、検査者が、新生物であ
ると同時に、異数染色体性を示す確率がはるかに高い細
胞に焦点を絞ることが可能になる。

【００１１】in situハイブリダイゼーション異数染色体性細胞の有無は、in situハイブリダイゼー
ションによって判定する。「異数染色体性細胞(aneusom
ic cell)」とは、異常な数の染色体を有する細胞、また
は、特定の染色体領域の半接合体または同型接合体の損
失のような染色体の構造変化が生じた細胞を意味する。
典型的には、一つまたは複数の染色体増加、すなわち、
任意の所定の染色体の三つ以上のコピーを有する異数染
色体性細胞が、本明細書に記載した方法ではテスト陽性
と考えられるが、特定の状況下では、単染色体性や零染
色体性を表す細胞もテスト陽性と考えてよい場合もあ
る。一般的には、in situハイブリダイゼーションは、
生物学的サンプルを固定し、染色体プローブを、固定し
た該生物学的サンプルに含まれる標的ＤＮＡにハイブリ
ダイズさせ、洗浄によって非特異結合を除去し、ハイブ
リダイズしたプローブを検出する工程から成る。

【００１２】「生物学的サンプル」は、細胞または細胞
性物質を含むサンプルである。典型的には、生物学的サ
ンプルは、ハイブリダイゼーションの前に濃縮して、細
胞密度を高める。生物学的サンプルの非制限的例として
は、尿、血液、脳脊髄液（CSF）、胸膜液、喀痰、腹膜
液、膀胱洗浄物、分泌物（例えば、乳房分泌物）、口腔
洗浄物、組織サンプル、触診サンプル、または、細い吸
引針による吸引液等が挙げられる。本明細書に記載した
方法に使用される生物学的サンプルの種類は、検出した
い癌の種類によって異なる。例えば、尿や膀胱洗浄物
は、膀胱癌の検出、また、これより少ないが前立腺また
は腎臓癌の検出に有用な生物学的サンプルとなる。胸膜
液は、肺癌、中皮腫、または転移性腫瘍（例えば、乳
癌）の検出に有用であり、血液は、白血病の検出に有用
な生物学的サンプルである。組織サンプルについては、
組織をパラフィン中に固定・配置して薄切するか、もし
くは、凍結して、薄い切片に切断する。

【００１３】典型的には、標準的な技術を用いて生物学
的サンプルから細胞を回収する。例えば、尿等の生物学
的サンプルを遠心分離にかけ、ペレット状にした細胞を
再度懸濁させることによって、細胞を回収することがで
きる。典型的には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で
細胞を再懸濁させる。細胞懸濁液を遠心分離にかけて、
細胞ペレットを得た後、例えば、酸性アルコール溶液、
酸性アセトン溶液、または、ホルムアルデヒド、パラホ
ルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類
中で細胞を固定することができる。例えば、メタノール
と氷酢酸をそれぞれ３：１の比で含む固定液を固定剤と
して用いることができる。中性緩衝ホルマリン溶液も使
用することができるが、この溶液には、37〜40％のホル
ムアルデヒドのリン酸ナトリウム水溶液が約１〜10％含
まれる。細胞を載せたスライドガラスは、固定液の大部
分を除去し、わずかな溶液に懸濁した濃縮細胞を残すこ
とによって調製することができる。

【００１４】細胞がスライドガラス上で重なり合わない
ように、細胞懸濁液をスライドガラスに塗布する。細胞
密度は、光学顕微鏡または位相差顕微鏡によって測定す
ることができる。例えば、20〜100mlの尿サンプルから
回収した細胞は、典型的には、最終容量が約100〜200μ
lの固定液中に再懸濁させる。次に、この懸濁液を三種
類の容量（通常３、10、および30μl）ずつスライドガ
ラスの6mmウェルに滴下し、各ウェルの細胞充実度（す
なわち細胞の密度）を位相差顕微鏡で評価する。最大容
量の細胞懸濁液を入れたウェルが十分に細胞を含んでい
ない場合には、細胞懸濁液を濃縮し、別のウェルに滴下
する。

【００１５】in situハイブリダイゼーションの前に、
上記細胞の各々に含まれる染色体プローブおよび染色体
DNAをそれぞれ変性させる。典型的には、高いpH、熱
（例えば、約70℃〜95℃の温度）、ホルムアミドやハロ
ゲン化テトラアルキルアンモニウム等の有機溶剤の存在
下で、またはこれらを組み合わせて、インキュベートす
ることによって変性を実施する。例えば、染色体DNAの
変性は、70℃以上の温度（例えば、約73℃）と、70％ホ
ルムアミドおよび2×SSC（0.3M塩化ナトリウムと0.03M
クエン酸ナトリウム)を含む変性バッファーとを組み合
わせることによって実施することができる。典型的に
は、細胞形態が保存されるように、変性条件を設定す
る。染色体プローブは、熱によって変性させることがで
きる。例えば、約５分間、プローブを約73℃に加熱する
ことができる。

【００１６】変性のための化学薬品または条件を除去し
た後、ハイブリダイゼーション条件の下で、プローブを
染色体DNAへアニーリングさせる。「ハイブリダイゼー
ション条件」とは、プローブと標的染色体DNA間のアニ
ーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーショ
ン条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さおよび長
さ、ならびに、インキュベーションの塩濃度、温度およ
び時間に応じて異なる。プローブの濃度が高いほど、ハ
イブリッドを形成する確率も高くなる。例えば、in sit
uハイブリダイゼーションは、典型的には、1〜2×SSC、
50％ホルムアミド、ならびに、非特異的ハイブリダイゼ
ーションを抑制する遮断DNAを含むハイブリダイゼーシ
ョン・バッファー中で実施される。一般に、ハイブリダ
イゼーション条件には、前述のように、約25℃〜約55℃
の温度と、約0.5時間〜約96時間のインキュベーション
時間が含まれる。さらに詳細には、ハイブリダイゼーシ
ョンは、約32℃〜約40℃で、約２〜約16時間実施するこ
とができる。

【００１７】染色体プローブと、標的領域外のDNAとの
非特異結合は、洗浄を連続して繰り返すことによって除
去することができる。各回洗浄の温度および塩濃度は、
所望のストリンジェンシーに応じて異なる。例えば、ス
トリンジェンシー条件が高い場合には、0.2×〜約2×SS
C、ならびに、Nonidet P-40（NP40）等の非イオン性界
面活性剤を約0.1％〜約１％用いて、約65℃〜約80℃で
洗浄を実施することができる。また、洗浄の温度を下げ
るか、または、塩濃度を高めることによって、ストリン
ジェンシーを低くすることができる。

【００１８】染色体プローブ本発明に従うin situハイブリダイゼーションに適した
プローブは、染色体の動原体に対応する反復DNAとハイ
ブリダイズする（すなわち、二本鎖のDNAを形成す
る）。霊長動物の染色体の動原体は、約171塩基対のモ
ノマー反復長から構成される長い縦列反復DNAの複合体
ファミリーを含み、これは、α-サテライトDNAと呼ばれ
る。動原体染色体プローブの非制限的例としては、３
番、７番、８番、11番、15番、17番、18番染色体および
Ｙ染色体に対するプローブが挙げられる。また、９番染
色体の9p21領域のような重要な染色体領域にハイブリダ
イズする遺伝子座特異的プローブも適している。

【００１９】染色体プローブは、最大の感度と特異性を
達成すべく選択する。染色体プローブのセット（すなわ
ち、二つ以上のプローブ）を使用することによって、任
意の一つの染色体プローブの使用に比べて優れた感度お
よび特異性が得られる。従って、本明細書に記載する結
果に基づき、最もよく異数染色体性染色体を検出し、相
互に相補的な染色体プローブがこのセットに含まれる。
例えば、本発明で測定されるプローブの識別値によれ
ば、染色体プローブのセットは、３番、７番および17番
染色体に対する動原体プローブを含むことができる。さ
らに、このセットは、９番染色体の9p21領域のプロー
ブ、もしくは、８番染色体、９番染色体、11番染色体、
または18番染色体に対する動原体プローブも含むことが
できる。本明細書に記載するように、７番染色体に対す
るプローブは、単独で用いたときに高い感度を示し、膀
胱癌の約76％を検出することができた。３番および17番
染色体、ならびに９番染色体の9p21領域に対するプロー
ブは、７番染色体プローブ単独では異常を示さなかった
膀胱癌患者を新たに検出することができた。３番、７番
および17番染色体、ならびに9p21に対するプローブを組
み合わせることによって、本明細書に記載する患者コホ
ートの膀胱癌検出について、約95％の感度を達成した。

【００２０】染色体プローブは、典型的には、長さが約
50〜約１×10⁵ヌクレオチドである。これより長いプロ
ーブは、典型的に、長さが約100〜約500ヌクレオチドの
より小さい断片から構成される。動原体DNAおよび遺伝
子座特異的DNAとハイブリダイズするプローブは、例え
ば、Vysis社（Downers Grove, IL）、Molecular Probes
社（Eugene, OR）、またはCytocell社（Oxfordshire, U
K）から市販されている。また、標準的な技術を駆使し
て、染色体またはゲノムDNAから非工業的にプローブを
製造することも可能である。例えば、使用できるDNA源
として、ゲノムDNA配列、クローン化DNA配列、宿主の正
常染色体組と共に一つのヒトの染色体もしくはその一部
を含む体細胞ハイブリッド、ならびに、フローサイトメ
トリーまたは顕微手術によって精製された染色体が挙げ
られる。クローニング、または、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）を介した部位特異的増幅によって標的領域を単
離することができる。例えば、NathおよびJohnsonのBio
technic Histochem., 1998年、第73（１）号６〜22頁、
WheelessらのCytometry, 1994年、第17号319〜326頁、
ならびに米国特許第5,491,224号を参照のこと。

【００２１】染色体プローブは、典型的には、蛍光団、
すなわち、波長が短く／高エネルギーの光を吸収した後
に蛍光を発する有機分子で直接標識する。蛍光団によっ
て、プローブは、二次検出分子を用いずに視覚化するこ
とができる。蛍光団をヌクレオチドに共有結合させた
後、ニックトランスレーション、ランダムプライミン
グ、ならびにPCR標識等の標準的な技術を用いて、ヌク
レオチドをプローブに直接組み込むことができる。これ
以外にも、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチド
をリンカーによりアミノ基転移することもできる。次い
で、蛍光団をアミノ基転移したデオキシシチジンヌクレ
オチドに共有結合させる。米国特許第5,491,224号を参
照のこと。

【００２２】セットに含まれる染色体プローブの各々
が、明瞭に視覚化されるように、異なる色の蛍光団を選
択する。例えば、次の蛍光団を組合わせて使用すること
ができる：7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸（AMC
A）、Texas Red（商標）（Molecular Probes社、Eugen
e, OR）、5-(および-6)-カルボキシ-X-ローダミン、リ
サミン(lissamine)ローダミンB、5-(および-6)-カルボ
キシフルオレセイン、フルオレセイン-5-イソチオシア
ネート（FITC），7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボ
ン酸、テトラメチルローダミン-5-(および-6)-イソチオ
シアネート、5-(および-6)-カルボキシテトラメチルロ
ーダミン、7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸、6-[フ
ルオレセイン5-(および-6)-カルボキシアミド]ヘキサン
酸、N-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4aジ
アザ-3-インダセンプロピオン酸(indacenepropionic ac
id)、エオジン-5-イソチオシアネート、エリスロシン-5
-イソチオシアネート、ならびに、Cascade（商標）ブル
ーアセチルアジド（Molecular Probes社、Eugene, O
R）。プローブは、蛍光顕微鏡や各蛍光団に適したフィ
ルタによって、または、多数の蛍光団を観察するための
二重または三重バンドパスフィルタのセットを用いて、
観察することができる。例えば、米国特許第5,776,688
号を参照のこと。これ以外にも、フローサイトメトリー
等の方法を用いて、染色体プローブのハイブリダイゼー
ション・パターンを調べることもできる。

【００２３】プローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニ
ンで間接的に標識するか、または、 ³²Ｐおよび³Ｈなど
の放射性同位体で標識することができるが、二次検出分
子もしくは追加処理の場合には、プローブを視覚化する
必要がある。例えば、ビオチンで間接的に標識したプロ
ーブは、検出可能なマーカーにコンジュゲートしたアビ
ジンによって検出することができる。例えば、アビジン
は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ等の酵素マーカーにコンジュゲートすること
ができる。酵素マーカーは、酵素の基質および／または
触媒を用いて、標準的な比色法反応で検出することがで
きる。アルカリホスファターゼの触媒としては、5-ブロ
モ-4-クロロ-3-インドリルホスフェートならびにニトロ
・ブルー・テトラゾリウムが挙げられる。また、西洋ワ
サビ・ペルオキシダーゼの触媒としては、ジアミノベン
ゾエートを用いることができる。

【００２４】細胞の選択本発明によれば、異数染色体性細胞の有無を評価する前
に、スライドガラス上の生物学的サンプル（例えば、尿
等）の細胞から、顕微鏡を用いて細胞を選択する。「選
択」とは、核の膨大、核の凹凸、または、異常な核染色
（通常は斑状染色パターン）のような一つまたは複数の
細胞学的（主に核の）異常による新生物の疑いが高い細
胞の特定を意味する。これらの核の特徴は、ヨウ化プロ
ピジウムもしくは4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドー
ル・ジヒドロクロライド（DAPI）等の核酸染色または染
料を用いて評価することができる。ヨウ化プロピジウム
は、614nmの発光ピーク波長で観察できる赤い蛍光を発
するDNA特異的染料である。典型的には、ヨウ化プロピ
ジウムは、約0.4μg/ml〜約５μg/mlの濃度で使用す
る。DAPIは、青い蛍光を発するDNA特異的染料であり、4
52mnの発光ピーク波長で観察できるが、一般に、約125n
g/ml〜約1,000ng/mlまでの範囲の濃度で使用する。DAPI
またはヨウ化プロピジウムによる細胞の染色は、一般に
in situハイブリダイゼーションを実施した後に行う。

【００２５】異数染色体性細胞の存在の判定細胞を前記基準の一つまたは複数に従って選択した後、
選択した各細胞の染色体プローブのハイブリダイゼーシ
ョン・パターン（すなわち、各プローブのシグナル数）
を調べ、染色体シグナル数を記録することによって、異
数染色体性の有無を評価する。この工程は、４個の細胞
がすべて異数染色体性であれば、少なくとも４個の細胞
について、ハイブリダイゼーション・パターンを評価す
るまで繰り返す。典型的なアッセイでは、選択した約20
〜約25個の細胞について、ハイブリダイゼーション・パ
ターンを評価する。

【００２６】複合染色体の二つ以上のコピー（すなわ
ち、複合染色体の増加）を持つ細胞が、癌陽性と考えら
れる。約20個の選択細胞と少なくとも約４個のテスト陽
性細胞を含むサンプルは、典型的に癌陽性と考えられ
る。約４個以下のテスト陽性細胞がみつかった場合に
は、染色体の倍数性レベルを決定する。また、30％を超
える細胞が、膀胱癌における9p21の損失のように、特定
の染色体領域の半接合体もしくは同型接合体の損失（す
なわち、零染色体性）を示す場合にも、癌陽性の結果を
意味する。周囲の正常と思われる細胞を観察し、上記特
定染色体領域に二つのシグナルを持っているかどうかを
調べることによって、零染色体性を非人為構造として確
認することができる。

【００２７】患者の癌スクリーニングおよび監視本明細書に説明する方法は、癌患者のスクリーニング、
または、癌と診断された患者の監視に使用することがで
きる。例えば、スクリーニングでは、膀胱癌の早期検出
を目的として、年齢50歳以上で喫煙習慣のある患者、ま
たは、長期にわたって芳香族アミン類にさらされてきた
患者等、膀胱癌の疑いのある患者を選別する。本明細書
に記載する方法は、単独で用いても、ヘモグロビン試験
紙試験のようなその他の試験と組み合わせて用いてもよ
い。例えば、尿中のヘモグロビン、すなわち血尿を検出
することによって、膀胱癌の疑いが高い患者を選別する
ことができる。このようなスクリーニングの際に、血尿
のない患者は、それ以上の分析を必要としないが、適当
な時間をおいて（例えば、毎年の定期検診で）、血尿の
再検査を行う。血尿患者からのサンプルは、本明細書に
記載する方法を用いてさらに詳しく分析する。一般に、
染色体プローブのセットを生物学的サンプルにハイブリ
ダイズさせ、細胞のサブセットを選択した後、選択した
細胞について、異数染色体性細胞の存在を判定する。異
数染色体性細胞を持つ患者は、例えば、膀胱鏡検査法に
よってさらに検査し、必要であれば、適切な治療を受け
ることができる。治療後に、本明細書に記載する方法に
よって、患者の癌再発を監視する。

【００２８】本明細書に記載する方法は感度が優れてい
るため、この方法が、膀胱癌等の癌の検出および監視を
目的とする細胞診断法に取って代わることができること
は明らかである。大部分の膀胱癌患者には、検出可能な
異数染色体性細胞があり、治療の効力、ならびに腫瘍の
再発／進行を本明細書に記載した方法で監視することが
できる。膀胱鏡検査法または生検により膀胱癌（主に、
低段階の非侵襲性腫瘍）が明らかとなった患者の一部
は、その尿に検出可能な異数染色体性細胞がない場合も
ある。これらの患者（すなわち、低段階の乳頭状腫瘍を
有する患者）は、腫瘍の進行速度が非常に遅いため、本
明細書に記載した方法と膀胱鏡検査法を組み合わせて簡
便に監視することができる。これら患者の尿に異数染色
体性細胞が存在すれば、このサブグループに属する患者
にさらに進行性の腫瘍の発現が予測される場合もある。
進行性膀胱癌については、本明細書に記載したFISH試験
の感度および特異性が優れているため、膀胱鏡検査法の
使用頻度を少なくすることができる。

【００２９】以下に示す実施例に基づき、本発明をさら
に詳しく説明するが、これらの実施例は、特許請求の範
囲に記載した本発明の範囲を制限するものではない。

【００３０】

【実施例】実施例１−サンプルとサンプル調製：サンプ
ルは生検により証明された21人の膀胱癌患者からの排尿
を含み、これに対して陽性細胞診断法、または、細胞診
断法で陰性のサンプルの場合には組織学法のいずれかに
よって診断した。対照尿サンプルは、健康体のドナー
（年齢25〜80歳）からの九つのサンプルと、膀胱癌以外
の尿生殖器疾患患者からの三つのサンプルから成る。

【００３１】患者一人につき約50〜200mlの尿を採取し
た。尿サンプルは、48時間足らずの間、４℃で保存し、
1,200ｇで５分間遠心分離により処理した。上清を捨
て、ペレットを10mlの0.075 M KCl中に再懸濁し、室温
で15分間インキュベートした。サンプルを1,200gで５分
間回転させた後、KCl溶液を除去した。ペレットを10ml
の３：１のメタノール：氷酢酸固定液中に再懸濁し、1,
200ｇで８分間遠心分離にかけた。固定液を注意深く除
去することによって細胞ペレットを残し、この工程をさ
らに２回繰り返した。

【００３２】スライドガラス上の密度は、滴下するたび
に、20倍の対物レンズを用いた位相差顕微鏡により何度
も確認しながら監視した。全般に、スライドガラス上に
可能な限り多数の細胞を一切重なり合わないように載せ
るよう努めた。サンプルが少数の細胞しか含んでいない
場合には、出来るだけ多くのサンプルをスライドガラス
に載せた。細胞の数が非常に少ないサンプルは、サンプ
ルの全量を使用した。スライドガラスは、室温で一晩乾
燥させた。

【００３３】サンプルを含むスライドガラスを2×SSC中
で、37℃にて10〜30分間培養した後、0.2mg/mlペプシン
中で、37℃にて20分間インキュベートした。次に、スラ
イドガラスを室温にてPBSで１度の洗浄につき２分ずつ
２回洗浄した。細胞を室温にて2.5％中性緩衝化ホルマ
リン中に５分間固定した。スライドガラスを再びPBSで1
度の洗浄につき２分ずつ２回洗浄した。70％、85％、お
よび100％エタノールでそれぞれ１分間ずつ脱水した
後、スライドガラスを直ちに使用した、あるいは、室温
で暗所に保存した。

【００３４】三つの多色プローブセット：Ａ、Ｂおよび
Ｃを最初のハイブリダイゼーションに使用した。プロー
ブセットＡ〜Ｃは、表１に示す動原体／遺伝子座特異的
プローブを含んでいた。各プローブを標識するのに用い
た蛍光団の色も表１に示す。染色体プローブ（CEP(登録
商標)、染色体列挙プローブ）は、Vysis, Inc.（ダウナ
ーズ・グローヴ、IL）製のものを使用した。アクア色フ
ィルタを用いて、17および18番染色体を視覚化した。黄
色フィルタを用いて、9p21遺伝子座特異的プローブを視
覚化し、赤／緑の二色フィルタ、もしくは赤または緑色
のいずれか一色のフィルタを用いて、３番、７番、８
番、９番、11番染色体およびＹ染色体を視覚化した。

【００３５】

【表１】

【００３６】ハイブリダイゼーションは、HYBrite法も
しくは従来の方法によって実施した。HYBrite法では、V
ysis（ダウナーズ・グローヴ、IL）製のHYBrite^TMシス
テムを使用した。スライドガラスをHYBriteに設置し、
約10μlのプローブセットを添加し、覆い、密封した。H
YBriteは次のようにプログラムした：73℃で５分間の
後、37℃で16時間。次に、スライドガラスを0.4×SSC
（0.06M塩化ナトリウム／0.006Mクエン酸ナトリウム）
／0.3％NP-40中で、２分間、73℃で洗浄し、2×SSC／0.
1％NP-40中で室温にてすすぎ、通気乾燥させた。スライ
ドガラスを約10μlのDAPI II（125ng/mlの4,6-ジアミジ
ノ-2-フェニリンドール・ジヒドロクロライド）で対比
染色した。

【００３７】従来の方法（すなわち、コプリンびん法）
では、50％のホルムアルデヒドと、2×SSC、0.5μg/ml
Cot1 DNA、ならびに２μg/ml HP DNAを含むハイブリダ
イゼーション・バッファー中で、染色体プローブを含む
主配合物を製造した。プローブ配合物を73℃で５分間変
性させ、スライドガラスを73℃のコプリンびんに入れた
変性バッファー（70％ホルムアミド、2X SSC）中で５分
間変性させた（１びんにつきスライドガラス６〜８
枚）。スライドガラスを70％、85％および100％エタノ
ールでそれぞれ１分間ずつすすいだ。約10μlのハイブ
リダイゼーション配合物を各スライドガラスに塗布し、
カバーガラスで覆った後、ラバーセメントで密封した。
給湿したチャンバ内でハイブリダイゼーションを37℃で
一晩実施した。スライドガラスを0.4×SSC／0.3％NP-40
中で、２分間、73℃で洗浄し、次に、2×SSC／0.1％NP-
40中で、室温にて簡単にすすいだ。通気乾燥させた後、
スライドガラスをDAPI IIで対比染色した。100個の連続
した細胞中のFISHシグナルの数を記録することにより、
サンプルを列挙した。

【００３８】要約すると、この実施例は、生物学的サン
プルから細胞を単離し、染色体プローブセットを細胞に
ハイブリダイズする方法を提供する。

【００３９】実施例２−膀胱癌の検出：表２は、細胞診
断法によって分析したサンプルをまとめたものである。
全体として、尿細胞診断法では、21人の癌患者のうち13
人が陽性であり、これは62％の感度に等しい。この値
は、発表された文献とも一致する。細胞診断法により、
疾患が進行した段階にある11人（表２の初めの11人）の
膀胱癌患者のうち10人に腫瘍細胞を検出した。また、表
在性膀胱癌患者10人（表２の最後の10人）から、細胞診
断法では、３人を陽性、３人を疑い有り、４人を陰性と
診断した。NDは、未検出を意味する。疑い有り（Ｅ）
は、疑いがあるものの、移行上皮癌（TCC）とは診断さ
れないサンプルを意味する。pTisは上皮内癌を、pTaは
非侵襲性の乳頭状癌をそれぞれ指す。pT1は、腫瘍の上
皮下結合組織への侵入を、pT2は、腫瘍の筋肉への侵入
を、pT3は、腫瘍の膀胱周囲組織への侵入を、pT4は、前
立腺、子宮、膣、骨盤壁、あるいは、腹壁への侵入をそ
れぞれ示す。

【００４０】四つ以上の染色体シグナルを持つ異数染色
体性細胞のパーセンテージによって、癌グループと、正
常グループを極めて明瞭に識別することができた。対照
グループ内で単一コピー増加または損失は、はるかに高
い頻度（回数）で起き、同等の感度および特異性には達
しなかった。上記定義を用いて、各サンプルグループ
（癌および正常）について、また、各グループの一人一
人について、異数染色体性細胞のパーセンテージを決定
した。この定義を用いて、サンプルを下記のように分析
した。

【００４１】識別分析を実施した後、下記式を用いて、
各プローブが、正常な対照グループから癌患者をいかに
よく識別したかを評価する：識別値＝(Ｍ１−Ｍ２)²/ＳＤ１²＋ＳＤ２² 上記式において、M1とM2は、それぞれ、癌（ｎ＝21）お
よび正常（ｎ＝９）グループについて、四つ以上のシグ
ナルを持つ異数染色体性細胞の平均パーセンテージであ
り、SD1とSD2は、各サンプルグループの標準偏差であ
る。表３に、この分析を用いた染色体列挙プローブ（CE
P）の結果をまとめた。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】識別値＞1.0、すなわち二つの母集団を隔
てる95％信頼区間は、良と考えられた（正常分布および
ほぼ同等の標準偏差値を想定して）。この基準によれ
ば、最良のプローブは、７、３、および17であった。こ
の分析から、個々のプローブの感度および特性に関する
情報は得られるが、様々なプローブの組合わせの感度お
よび特性は明らかにされない。

【００４５】染色体増加を決定するFISH陽性基準とし
て、正常細胞中の異数染色体性細胞の平均％を超える標
準偏差の切捨てを用いた。他方で、膀胱癌における9p21
の変化は損失として表われることから、零染色体性とし
て評価した。零染色体性に用いた切捨て値は、正常サン
プルの平均値より大きい三つの標準偏差であった。プロ
ーブ毎の各患者の異数染色体性細胞のパーセンテージを
正常な人については表４Ａに、また癌患者については表
４Ｂにそれぞれ示す。表４Ｂでは、二重線から下のサン
プルは、細胞診断法による偽陰性の場合を示し、影を付
けた部分は、表３の切捨て値を用いた偽陰性のFISH結果
を示す。表４Ａに示すように、正常サンプル中の異数染
色体性細胞のパーセンテージ（染色体増加により定義し
た通り）は低く、約0.5％〜約4.5％であった。

【００４６】

【表４Ａ】

【００４７】

【表４Ｂ】

【００４８】

【表５】

【００４９】全体的にみて、表４Ｂに示すように、７番
染色体は、個々のプローブのうち最高の感度を示した
（76％、16／21）。３番染色体および9p21に対するプロ
ーブは、７番染色体を補足したため、７番染色体の結果
が正常であった患者の何人かについて陽性となった。３
番、７番染色体および9p21に対する三つのプローブを組
み合わせると、20／21膀胱癌患者を検出し、さらに重要
なことには、７／８細胞診断法偽陰性患者を検出した
（表４Ｂ）。このデータセットでは、これは総合感度の
95％に等しい。

【００５０】17番染色体プローブ（３番染色体プローブ
とともに）は、最大数の細胞診断法偽陰性サンプルを検
出した（４／８）。

【００５１】実施例３-標準スクリーニング法による比
較分析本試験には、Mayo診療所の190名の患者が参加する見込
みであった。患者の多くは、以前膀胱癌の診断を受けた
か、あるいは膀胱癌の可能性があるとの初期診断を受け
ていた（例えば微小血尿（microhematuria）のため）。
患者の一部は、膀胱癌以外に、尿生殖器疾患の診断を受
けていた。比較した検査法は、尿細胞診断法、膀胱鏡検
査法、BTA STAT法（C.R.Bard,Inc.、米国ニュージャー
ジー州ムレイヒル市）、蛍光in situハイブリダイゼー
ション法（FISH）、およびヘモグロビン試験紙（dipsti
ck）法（Bayer Corporation、診断部門、米国インディ
アナ州エルカート市）であった。

【００５２】FISHは、通常、実施例１に述べたように行
った。患者１名あたり約25〜200mlの尿を採取した。尿
サンプルは、採取後48時間まで4℃で保存し、遠心分離
機に600gで10分間かけた。上清を捨て、ペレットを25〜
50mlの1×リン酸緩衝生理食塩水（PBSと略す）に再懸濁
した。600gで5分間遠心後、再度上清を捨てた。ペレッ
トをゆっくりと1.5〜5mlの固定液（メタノール：氷酢
酸、3：1）に再懸濁し、600gで5分間遠心した。固定液
を注意深く除き、この過程を更に2回繰り返した。

【００５３】最後の遠心の後、12ウェル6mm Shandon Li
pshawスライドのようなスライドに滴下するのに適切な
量を残して、固定液を除いた。細胞ペレットが少ない場
合、ならびに肉眼で見にくい場合は、約100μlをペレッ
ト上に残した。細胞ペレットが容易に肉眼で確認できる
場合は、出来るだけカルノア固定液を除去し、0.5mlの
新鮮なカルノア固定液を加えた。ペレットが見えない場
合、しばしば試料全部をスライドに滴下した。約3、1
0、30μlの細胞懸濁液を12ウェルShandonスライドの直
径0.6mmの3つの異なるウェルに滴下した。これらのウェ
ルの細胞性（即ち細胞の密度）を位相差顕微鏡で調べ
た。最も容量の少ない細胞懸濁液を含むウェルの密度が
高すぎる場合、細胞懸濁液をさらに希釈し、希釈液の一
部を4番目のウェルに入れた。最も容量の多い細胞懸濁
液を含むウェルにおいて十分な細胞が得られない場合、
細胞懸濁液を濃縮し4番目のウェルに入れた。

【００５４】サンプルを加えたスライドを、2×SSCを用
いて37℃で10-30分間インキュベートした。次に、0.2mg
/mlペプシン溶液中で37℃で10分間インキュベートし
た。そして、スライドをPBSで、室温で１回につき2分間
ずつ2回洗浄した。室温で、2.5%中性緩衝ホルマリンを
用いて細胞を5分間固定した。再度、スライドを5分間PB
Sで洗浄した。それぞれ70％、85％、100％のエタノール
中で１分間脱水後、スライドを45-50℃のスライド・ウ
ォーマー（slide warmer）上で２分間乾燥した。スライ
ドは、使用時まで100％エタノール中で４℃にて保存、
あるいはFISHに使用した。

【００５５】ハイブリダイゼーションは、HYBrite法ま
たは従来の方法で行った。HYBrite法には、Vysis社（米
国イリノイ州ダウナーズ・グローブ市）のHYBriteシス
テム（商標名）を用いた。スライドをHYBrite上に置
き、標的あたり3μlのプローブを加え、スライドを覆い
密封した。HYBriteを次のようにプログラムした。73℃5
分間、37℃16時間。次にスライドを0.4SSC（0.06M塩化
ナトリウム／0.006Mクエン酸ナトリウム）／0.3%NP-40
中で73℃にて2分間洗浄し、2×SSC／0.1%NP40中で室温
にてすすぎ、風乾した。スライドを約3μlのDAPI II（1
25ng/mlの4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒド
ロクロライド）で対比染色した。

【００５６】従来の方法では、染色体プローブを含むマ
スターミックス（master mix）を、50％ホルムアミド、
2×SSC、0.5μg/mlのCot1 DNAおよび2μg/mlのHP DNAを
含有するハイブリダイゼーション・バッファー中で調製
した。このプローブミックスを73℃で5分間かけて変性
させ、スライドをコプリン・ジャー（Coplin jar）を用
い、変性バッファー（70％ホルムアミド、2X SSC）中で
73℃5分間（6-8スライド／ジャー）で変性した。スライ
ドを、それぞれ70％、85％、100％エタノールで１分間
洗浄した。サンプルをスライドウォーマー上で２分間以
下の時間乾燥した。各スライドの標的あたり約３μlの
ハイブリダイゼーション・ミックスを載せ、直ちにカバ
ーグラスでスライドを覆い、ゴムセメントで密封した。
ハイブリダイゼーションは、加湿したチャンバー内で37
℃で一晩行った。スライドを、0.4×SSC/0.3%NP-40中
で、73℃で2分間洗浄し、次に室温で2×SSC/0.1%NP-40
で短時間すすいだ。風乾後、スライドをDAPI IIで対比
染色した。各試料から、20個の細胞診断学上異常な細胞
を選択し、FISHパターンを分析した。

【００５７】生検（病期／段階）（n=49）および細胞学
的陽性TCC（n=34）により癌と診断された53例につい
て、細胞診断法の感度は57％（不明瞭な細胞診断は陽性
とした）、膀胱鏡検査法の感度は88％（不明瞭な膀胱鏡
結果は陽性とした）、BTA STAT法の感度は71％およびFI
SHの感度は86％であった。膀胱鏡検査陰性で膀胱癌歴が
無く、細胞診断法陰性を伴うまたは伴わず、癌陰性と診
断された63例について、BTA STAT法の感度は73％および
FISHの感度は90％であった（細胞診断法と膀胱鏡検査法
の感度は、これらの検査法を膀胱癌患者でないと定義す
るのに使用したため、調べられなかった）。

【００５８】FISHで偽陽性であった3名のうち2名は、テ
ロメラーゼ、ヘモグロビン試験紙法およびBTA-STATまた
はBTA-TRAKでも陽性であった。もし上述の2名の患者が
膀胱癌であると証明されれば、FISHの感度は100％に近
づくであろう。これは、以下に述べる、検査法の陽性予
測値に対し密接な関係が有る。表6に、各検査法の病期
および段階別の感度を示した。表６で、「E」は不明瞭
を示し、「＊」はFISH陽性で細胞診断法のみにより癌と
された3例を含んでいない事を示している。

【００５９】疾患発病率28％（53/190）、特異性93％、
感度77％に基づく陽性ならびに陰性予測値（PV）を表7
に示した。

【００６０】

【表６】

【００６１】

【表７】

【００６２】癌の症例53のうち51例については、試験紙
法を行った。ヘモグロビン試験紙法の感度は、病期pT1-
pT4に対して91％、癌腫in situ（Tis）に対しては100％
で、理想的なスクリーニング検査法である（表8）。し
かしながら、ヘモグロビン試験紙法の特異性は低かった
（52％）。ヘモグロビン試験紙法は、感度が高く費用が
安いので有用なスクリーニング検査法であるが、検査結
果が陽性の場合、さらに明確な検査で確認する必要があ
るのは明らかである。細胞診断法は選択できる検査法で
はあり得ない。なぜなら、pT2-pT4症例のうち33％だけ
を陽性とし、癌腫in situ12例の内2例を検出できなかっ
たからである（表6参照）。

【００６３】

【表８】

【００６４】FISHの臨床的有用性を標準細胞診断／膀胱
鏡検査法と比較した。癌53例の内、進行期（pT2-pT4ま
たはpTIS）が22例であった。これらの症例を検出できな
い事は、最も深刻な偽陰性と言える。細胞診断／膀胱鏡
検査法が13/22例で陽性で感度59％であったのに対し、F
ISHの感度は100％、すなわち22/22例を検出できた（こ
れらの症例の内5例を代表として表9に示した）。これ
は、FISHが、進行期疾患の検出感度の良い、改良された
細胞診断法である事を示唆する。

【００６５】

【表９】

【００６６】他の実施形態本発明はその詳細な説明と共に記載されたが、上述の記
載は例証するためであり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。本発明の範囲は、請求の範囲により定義され
る。他の態様、優位性、変更は以下の請求の範囲内にあ
る。

フロントページの続き (71)出願人 598091963 マヨファウンデーションフォーメディカルエデュケーションアンドリサーチアメリカ合衆国 55905 ミネソタ州，ロチェスター，ファーストストリートサウスウェスト 200 (72)発明者ケビン，シー．ホーリングアメリカ合衆国 55902 ミネソタ州，ロチェスター，ウェンディーレーンサウスウェスト 5233 (72)発明者ロバート，ビー．ジェンキンスアメリカ合衆国 55902 ミネソタ州，ロチェスター，フィフスストリートサウスウェスト 829 (72)発明者ウォルター，キングアメリカ合衆国 60187 イリノイ州，ウェアトン，サマセットレーン 1996 (72)発明者イリナ，エー．ソコロヴァアメリカ合衆国 60148 イリノイ州，ロンバード，エス．フィンレイロードナンバー２ディー 1312 (72)発明者スティーブン，エイ．シーリグアメリカ合衆国 60565 イリノイ州，ナパヴィィル，アパートメント 115，フォックスクロフト 19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (a) 染色体プローブのセットを被験者由
来の生物学的サンプルにハイブリダイズさせ、 (b) 上記生物学的サンプルから細胞を選択し、 (c) 上記選択した細胞における異数染色体性細胞の有無
を判定し、 (d) 上記選択した細胞における異数染色体性細胞の存在
を被験者の癌と相関させる、ことを含んでなる被験者の
癌をスクリーニングする方法。
【請求項２】上記生物学的サンプルが、尿、血液、脳
脊髄液、胸膜液、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、口腔洗浄
物、組織サンプル、触診サンプル、または細い吸引針に
よる吸引液から成る群より選択される、請求項１記載の
方法。
【請求項３】上記生物学的サンプルを濃縮する、請求
項１記載の方法。
【請求項４】上記生物学的サンプルが尿である、請求
項１記載の方法。
【請求項５】上記癌が、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣
癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、および白血病から
成る群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】上記癌が膀胱癌である、請求項１記載の
方法。
【請求項７】上記染色体プローブを蛍光標識する、請
求項１記載の方法。
【請求項８】上記プローブのセットが少なくとも三つ
の染色体プローブを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項９】上記セットが少なくとも一つの動原体プ
ローブを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】上記セットが少なくとも一つの遺伝子
座特異的プローブをさらに含んでなる、請求項９記載の
方法。
【請求項１１】上記動原体染色体プローブが、３番、
７番、８番、11番、15番、17番、18番染色体プローブお
よびＹ染色体プローブから成る群より選択される、請求
項９記載の方法。
【請求項１２】上記遺伝子座特異的プローブが9p21で
ある、請求項10記載の方法。
【請求項１３】上記セットが、３番、７番、および17
番染色体プローブを含んでなる、請求項８記載の方法。
【請求項１４】上記セットが、9p21遺伝子座特異的プ
ローブをさらに含んでなる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】核の形態学によって細胞を選択する、
請求項１記載の方法。
【請求項１６】核の大きさによって細胞を選択する、
請求項１記載の方法。
【請求項１７】核の形状によって細胞を選択する、請
求項１記載の方法。
【請求項１８】 DAPI染色法によって核の形態学を評価
する、請求項15記載の方法。
【請求項１９】３番、７番および17番染色体に対する
動原体プローブを含んでなる染色体プローブのセット。
【請求項２０】遺伝子座特異的プローブをさらに含ん
でなる、請求項19記載の染色体プローブのセット。
【請求項２１】上記遺伝子座特異的プローブが9p21で
ある、請求項20記載の染色体プローブのセット。
【請求項２２】染色体プローブのセットを含む癌検出
のためのキットであって、３番、７番、および17番染色
体に対する動原体プローブを含んでなる前記キット。
【請求項２３】遺伝子座特異的プローブをさらに含ん
でなる、請求項22記載のキット。
【請求項２４】上記遺伝子座特異的プローブが9p21で
ある、請求項23記載のキット。
【請求項２５】上記染色体プローブを蛍光標識する、
請求項22記載のキット。