WO2018155631A1 - 新たな染色体領域をターゲットにした腫瘍検出用マーカー - Google Patents

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WO2018155631A1
WO2018155631A1 PCT/JP2018/006709 JP2018006709W WO2018155631A1 WO 2018155631 A1 WO2018155631 A1 WO 2018155631A1 JP 2018006709 W JP2018006709 W JP 2018006709W WO 2018155631 A1 WO2018155631 A1 WO 2018155631A1
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chromosome
chromosome region
chromosomal
tumor detection
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PCT/JP2018/006709
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滋克 前川
之夫 本間
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国立大学法人東京大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a tumor detection method, a tumor detection marker, and a tumor detection kit.
  • Cancer diagnosis is roughly classified into invasive detection methods and non-invasive detection methods. Among them, a noninvasive detection method is desired in order to reduce the burden on the target patient.
  • cytodiagnosis urinary cytodiagnosis
  • cytodiagnosis urinary cytodiagnosis
  • CT / MRI imaging diagnosis a means for invasive examination.
  • urine cytology which is a non-invasive means, can provide a certain degree of specificity in tumor detection, but sensitivity is not sufficient (about 40-60%). In non-invasive cancers and low-grade cancers, the sensitivity is even lower.
  • the present inventors conducted genome analysis narrowed down to renal pelvic and ureteral cancer, elucidated genomic abnormality of renal pelvic and ureteral cancer, compared with bladder cancer, and as a result of aiming for discovery of a new detection target, 1, 3 , 8, 10, 11, 15, 17, 19, and 20 by using a tumor detection marker comprising one or more selected from the group consisting of specific probes for specific regions of chromosomes It was found that both specificity and sensitivity were excellent.
  • the present inventors have found 1, 3, 8, 10 as probes that can be used for tumor detection markers that are excellent in both specificity and sensitivity. , 11, 15, 17, 19 and 20 specific probes for specific regions of chromosomes were found, and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows. [1] Any of 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region, 19q12 chromosome region, and 20q13 chromosome region.
  • a tumor detection method for detecting an aneuploid chromosomal region [2] Detecting an aneuploid chromosomal region by any of fluorescence in situ hybridization method, DNA microarray method, and PCR method, The tumor detection method according to [1].
  • [5] In the hybridizing step cells are selected according to nuclear morphology.
  • [6] In the hybridizing step, cells are selected according to the size of the nucleus.
  • [7] Select cells according to the shape of the nucleus, [4] The tumor detection method according to any one of [6].
  • the tumor detection marker according to any one of [11] to [11].
  • the specific probe is a 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region, 19q12 chromosome region, And used to detect a tumor by detecting any aneuploid chromosomal region of any of the 20q13 chromosomal regions, The marker for tumor detection according to [12].
  • Samples derived from the subject such as urine, blood, cerebrospinal fluid, pleural fluid, sputum, peritoneal fluid, bladder lavage, secretions, oral lavage, tissue sample, palpation sample, and aspirate fluid from a thin aspiration needle
  • the marker for tumor detection according to any one of [14].
  • [17] Including two or more specific probes for the 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region, [9] The tumor detection marker according to any one of [16] to [16].
  • [18] Including 3 or more specific probes for the 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region, [17] The tumor detection marker according to [17].
  • [19] Including 4 or more specific probes for 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region, [18] The tumor detection marker according to [18].
  • the chromosomal probes are fluorescently labeled with different colors, [9] The tumor detection marker according to any one of [19] to [19].
  • [21] Including the tumor detection marker according to any one of [9] to [19], Tumor detection kit.
  • [23] Further comprising a DNA polymerase and a primer, The tumor detection kit according to [21] or [22].
  • a part of the results of chromosome copy number analysis of 109 cases of renal pelvic and ureteral cancer cases are shown.
  • the remainder of the results of chromosome copy number analysis of 109 cases of renal pelvic and ureteral cancer cases are shown.
  • the schematic which arranged the result of the copy number analysis of the chromosomal region of 1q, 3p, 8q, and 20q is shown.
  • the schematic which arranged the result of the copy number analysis of the chromosome region of 9p, chr3, chr7, and chr17 is shown. Shows the ratio of copy number changes in 2 or more chromosome regions, 3 or more chromosome regions, and 4 or more chromosome regions.
  • [Tumor detection marker] Markers for tumor detection according to the present invention 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region, It includes one or more selected from the group consisting of specific probes for the 19q12 chromosomal region and the 20q13 chromosomal region.
  • this specific probe more specifically, the 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome
  • the effects of the present invention can be exhibited more reliably.
  • the specific probe according to the present invention hybridizes with repetitive DNA corresponding to a predetermined chromosomal region.
  • “hybridize” means forming a double-stranded DNA.
  • the specific probe according to the present invention is a 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region , 19q12 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region.
  • a specific probe that hybridizes to the 9p chromosomal region may be further used, and specific probes for the 9p chromosomal region include specific probes for the 9p21 chromosomal region.
  • the tumor detection marker when the tumor detection marker includes a plurality of specific probes, they may be directed to different chromosomal regions, or may be directed to the same chromosomal region.
  • the specific probe may contain one species, preferably two or more species, more preferably three or more species, and even more preferably four or more species, but to different chromosomal regions. Is preferably 2 or more, more preferably 3 or more, and still more preferably 4 or more.
  • two or more kinds of tumor detection markers can be used, with the same or different specific probes for the 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region.
  • it contains 3 or more, more preferably 4 or more.
  • the tumor detection marker preferably contains specific probes for the 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region, respectively.
  • an optimal probe can be selected as appropriate using the specificity and sensitivity of tumor detection as an index.
  • the tumor detection marker according to the present invention can include specific probes for the 1q23 region of chromosome 1, the 3p25 region of chromosome 3, the 8q22 region of chromosome 8, and the 20q13 region of chromosome 20.
  • a specific probe of the 9p21 region of chromosome 9 can further be included.
  • specific probes for the 1q23 chromosomal region, 3p25 chromosomal region, 8q22 chromosomal region, and 20q13 chromosomal region include specific probes for the 2, 3, and 4 regions. , Tend to be more specific and sensitive.
  • the length of the specific probe is not particularly limited, but is preferably 50 to 100 ⁇ 10 6 nucleotides, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 30 ⁇ 10 6 nucleotides, and even more preferably 30 ⁇ 10 6 nucleotides. ⁇ 15 ⁇ 10 6 nucleotides.
  • Specific probes that hybridize to the chromosomal regions described above are commercially available from, for example, Vysis (Downers Grove, IL), Molecular Probes (Eugene, OR), or Cytocell (Oxfordshire, UK).
  • a specific probe can be produced non-industrially from chromosomal or genomic DNA using standard techniques.
  • DNA sources that can be used include genomic DNA sequences, cloned DNA sequences, somatic cell hybrids that contain a normal chromosome set of the host and one human chromosome or part thereof, and purified by flow cytometry or microsurgery A chromosome is mentioned.
  • the target region can be isolated by cloning or site-specific amplification via polymerase chain reaction (PCR).
  • the specific probes are preferably fluorescently labeled with different colors so that they can be distinguished from each other.
  • the tumor detection kit according to the present invention includes the tumor detection marker according to the present invention.
  • the tumor detection kit may further include a fluorescent dye capable of fluorescently labeling a specific probe included in the tumor detection marker, and may further include a DNA polymerase and a primer.
  • “Dye” means an organic molecule that emits fluorescence after absorbing high-energy light with a short wavelength. Specific probes that are fluorescently labeled with fluorescent dyes can be visualized without the use of secondary detection molecules. Fluorescent dyes can be directly incorporated into specific probes using standard techniques such as nick translation, random priming, and various labels used in PCR methods after covalent binding to a given nucleotide. In addition, the deoxycytidine nucleotide in the specific probe may be amino-transferred by a linker, and then the fluorescent dye may be covalently bound to the deoxycytidine nucleotide having been amino-transferred.
  • DNA polymerase means an enzyme that synthesizes a DNA strand having a base sequence complementary to a single-stranded nucleic acid as a template.
  • a commercially available reagent used for PCR can be used.
  • the “primer” means an oligonucleotide that serves as a starting point for DNA replication.
  • a commercially available reagent used in the PCR method can be used.
  • fluorescent dyes of different colors are selected so that each of them is clearly visualized.
  • the following fluorescent dyes can be used in combination: 7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (AMCA), Texas® Red® (Molecular® Probes, Eugene, OR), 5- ( -6) -carboxy-X-rhodamine, lissamine rhodamine B, 5-(-6) -carboxyfluorescein, fluorescein-5-isothiocyanate (FITC), 7-diethylaminocoumarin-3-carboxylic acid (DEAC), Tetramethylrhodamine-5-(-6) -isothiocyanate, 5- (and -6) -carboxytetramethylrhodamine, 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid, 6- [fluorescein 5- (and -6) -carboxyl Amido] hexanoic acid, N- (4,4
  • the specific probe can be labeled indirectly with biotin or digoxigenin, or with a radioactive isotope such as 32 P or 3 H.
  • the marker for tumor detection according to the present invention is used for detection of tumors, particularly cancer. It is also used for detection of urothelial cancer among cancers. By being used for detection of urothelial cancer, specificity and sensitivity in tumor detection are superior.
  • “urinary tract epithelial cancer” means cancer that occurs in the urinary tract (eg, renal pelvis, ureter, bladder, urethra). Urinary tract epithelial cancer is classified into renal pelvic cancer, ureteral cancer, bladder cancer, urethral cancer, and the like, depending on the location of the urinary tract. Of the urinary tract, the renal pelvis and ureter are also referred to as the upper urinary tract.
  • Renal ureteral cancer and bladder cancer are both of the same tissue type as urothelial cancer (TCC, UC).
  • TCC urothelial cancer
  • the bladder may enter cystitis retrogradely from the urethra, and may be relatively susceptible to external stimuli, such as stretching and contracting due to urine collection and urination. Therefore, inflammatory findings may accumulate in gene analysis such as copy number analysis.
  • the present inventors have found that gene analysis narrowed down to renal pelvic and ureteral cancer reflects a state in which pelvic and ureteral cancer corresponds purely to urothelial cancer.
  • tumor detection markers are not limited to urothelial cancer, but also for detection of tumors such as lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, etc. Can be used.
  • the tumor detection marker according to the present invention is preferably used for detecting a tumor by detecting an aneuploid chromosomal region or an aneuploid chromosomal cell having an aneuploid chromosome region.
  • Probes are 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region, 19q12 chromosome region, and 20q13 chromosome It is preferably used to detect a tumor by detecting any aneuploid chromosomal region of the region.
  • the specific probe according to the present invention is designed to detect an aneuploid chromosome region.
  • ⁇ aneuploid chromosome region '' means 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, Chromosomes that have an abnormal number in the chromosomal region of the 17q25 chromosomal region, 19q12 chromosomal region, or 20q13 chromosomal region, or have undergone chromosomal structural changes such as loss of hemizygote or homozygote Means an area.
  • An “aneusomic cell” means a cell having an aneuploid region.
  • the tumor detection method comprises 1q23 chromosome region, 3p25 chromosome region, 8p12 chromosome region, 8q22 chromosome region, 10p14 chromosome region, 11q13 chromosome region, 15q11 chromosome region, 17q11 chromosome region, 17p12 chromosome region, 17q25 chromosome region, 19q12 An aneuploid chromosomal region in either the chromosomal region or the 20q13 chromosomal region is detected.
  • a detection method it can be detected by any one of a fluorescence in situ hybridization method (Fluorescence in situ Hybridization: FISH method), a DNA microarray method, and a PCR method. It can also be detected by analysis using a next-generation sequencer, an analysis DNA chip for observing gene expression, or an RNA sequence.
  • the tumor detection method according to the present invention comprises a sample derived from a subject, a 1q23 chromosome region, a 3p25 chromosome region, an 8p12 chromosome region, an 8q22 chromosome region, a 10p14 chromosome region, an 11q13 chromosome region, a 15q11 chromosome region, a 17q11 chromosome.
  • the determination step further comprising a hybridization step of hybridizing the tumor detection marker according to the present invention to a sample derived from a subject, and a selection step of selecting cells from the hybridized sample using a microscope.
  • the tumor detection method according to the present invention is more excellent in specificity and sensitivity.
  • the tumor detection marker according to the present invention to a fluorescent in situ hybridization method using a urine sample, the tumor can be detected with specificity and sensitivity significantly superior to those of conventional tumor detection methods. Can be detected.
  • the contents of the tumor detection method according to the present invention will be described by detailing the fluorescence in situ hybridization method.
  • the tumor detection method according to the present invention is a rapid, high-specificity and high-sensitivity method for detecting a tumor.
  • This method can be used, for example, to screen for subjects suspected of having cancer, including urothelial cancer, and to monitor tumor recurrence in patients diagnosed with cancer. More specifically, screening for subjects suspected of having renal pelvic and ureteral cancer, bladder cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, and Relapse can be monitored.
  • the method for hybridizing the tumor detection marker to the sample derived from the subject is not particularly limited, and examples thereof include the following methods.
  • Specific probes are hybridized to cells (from urine, other biological samples) on glass slides.
  • the cells on the glass slide are selected by the morphology, size, and shape of the nucleus by visually scanning the cells with a relatively low magnification (eg, 200 to 400 times) (for example, , Finds an enormous number of nuclei and uneven nuclei as a feature that strongly indicates malignant tumors.)
  • the abnormal cell nuclei are examined by cytodiagnosis, which switches the objective lens to one with a higher magnification (for example, 600 to 1,000 times) and “flipping” the filter.
  • the cell is aneuploid.
  • the time spent evaluating cells with a low probability of being neoplastic is greatly reduced, and the tester is much more likely to be neoplastic and at the same time exhibit aneuploidy. It is possible to focus on high cells.
  • aneuploid chromosomal cells can be determined by in situ hybridization.
  • an aneuploid cell having one or more chromosomal gains i.e., three or more copies of any given chromosome
  • cells that are monochromic or zero-chromosomal (Deletion) may be considered positive.
  • in situ hybridization involves immobilizing a biological sample, hybridizing a chromosomal probe to target DNA contained in the immobilized biological sample, removing non-specific binding by washing, and hybridizing. Detecting the soy probe.
  • sample derived from a subject means a sample containing cells or cellular substances. Samples from the subject may be concentrated prior to hybridization to increase cell density. Specific examples of the sample derived from the subject include urine, blood, cerebrospinal fluid (CSF), pleural fluid, sputum, peritoneal fluid, bladder lavage, secretion (eg, mammary secretion), oral lavage, tissue sample , Palpation samples, and aspirate with a fine aspiration needle.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • sample derived from the subject varies depending on the type of tumor to be detected.
  • urine and bladder washings can be useful samples for detection of urothelial cancers such as renal pelvic and ureteral cancer and bladder cancer, and to a lesser extent, detection of prostate and kidney cancer.
  • Pleural fluid is useful for detecting lung cancer, mesothelioma, metastatic tumors (eg, breast cancer), and blood is useful for detecting leukemia.
  • tissue samples the tissue may be fixed and placed in paraffin and sliced or frozen and cut into thin sections.
  • cells can be collected using a conventionally known technique.
  • the cells can be collected by centrifuging a sample such as urine and suspending the pelleted cells again.
  • the cells are also resuspended in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the cells can be fixed in aldehydes such as acidic alcohol solution, acidic acetone solution, formaldehyde, paraformaldehyde, and glutaraldehyde.
  • aldehydes such as acidic alcohol solution, acidic acetone solution, formaldehyde, paraformaldehyde, and glutaraldehyde.
  • aldehydes such as acidic alcohol solution, acidic acetone solution, formaldehyde, paraformaldehyde, and glutaraldehyde.
  • a fixing solution containing methanol and glacial acetic acid in a ratio of 3: 1 can be used as a fixing agent.
  • the cell suspension can be measured by an optical microscope or a phase contrast microscope. For example, cells collected from a 20-100 mL urine sample are resuspended in a fixative with a final volume of about 100 ⁇ L to about 200 ⁇ L. Next, this suspension is dropped into 6 mm wells of a glass slide in three different volumes (usually 3, 10, and 30 ⁇ L), and the cell quality (ie, cell density) of each well is evaluated with a phase contrast microscope. . If the well containing the maximum volume of cell suspension does not contain enough cells, concentrate the cell suspension and drop it into another well.
  • the specific probe and chromosomal DNA contained in each of the cells are denatured.
  • denaturation is performed by incubation at high pH, heat (eg, temperatures from about 70 ° C. to about 95 ° C.), in the presence of organic solvents such as formamide and tetraalkylammonium halides, or a combination thereof.
  • chromosomal DNA denaturation is achieved by combining a temperature above 70 ° C. (eg, about 73 ° C.) with a denaturation buffer containing 70% formamide and 2 ⁇ SSC (0.3 M sodium chloride and 0.03 M sodium citrate).
  • denaturing conditions are set so that the cell morphology is preserved.
  • Specific probes can be denatured by heat.
  • the specific probe can be heated to about 73 ° C. for about 5 minutes.
  • hybridization conditions are conditions that promote annealing between a specific probe and a target chromosomal DNA.
  • Hybridization conditions vary with probe concentration, base composition, complexity and length, and incubation salt concentration, temperature and time. The higher the concentration of the specific probe, the higher the probability of forming a hybrid.
  • in situ hybridization is typically performed in a hybridization buffer containing 1-2 ⁇ SSC, 50% formamide, and blocking DNA that suppresses non-specific hybridization.
  • hybridization conditions include a temperature of about 25 ° C. to about 55 ° C. and an incubation time of about 0.5 hours to about 96 hours, as described above. More particularly, hybridization can be performed at about 32 ° C. to about 40 ° C. for about 2 hours to about 16 hours.
  • Non-specific binding between the specific probe and DNA outside the target region can be removed by repeated washing.
  • the temperature and salt concentration of each wash varies depending on the desired stringency. For example, when stringency conditions are high, 0.2 ⁇ to about 2 ⁇ SSC and about 65 ° C. using about 0.1% to about 1% nonionic surfactant such as NonidetideP-40 (NP40) Washing can be performed at ⁇ 80 ° C. Moreover, stringency can be lowered by lowering the washing temperature or increasing the salt concentration.
  • cells can be selected from a sample-derived sample (eg, urine) on a slide glass using a microscope.
  • “Selection” is a high suspicion of a neoplasm due to one or more cytological (mainly nuclear) abnormalities, such as a large number of nuclei, irregularities in the nuclei, or abnormal nuclear staining (usually a patchy staining pattern) Means cell identification.
  • the characteristics of these nuclei can be evaluated using nucleic acid stains or dyes such as propidium iodide or 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI).
  • DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
  • Propidium iodide is a DNA-specific dye that emits red fluorescence that can be observed at an emission peak wavelength of 614 nm. Typically, propidium iodide is used at a concentration of about 0.4 ⁇ g / mL to about 5 ⁇ g / mL.
  • DAPI is a blue-fluorescent DNA-specific dye that can be observed at an emission peak wavelength of 452 mn, but is generally used at concentrations ranging from about 125 ng / mL to about 1,000 ng / mL. Staining of cells with DAPI or propidium iodide is generally performed after in situ hybridization.
  • ⁇ Judgment process> After selecting the cells in the selection process, the hybridization pattern of the specific probe of each selected cell (ie, the number of signals of each probe) is examined, and the number of chromosomal signals is recorded. Can be determined. If all four cells are aneuploid, this process is repeated until the hybridization pattern is evaluated for at least four cells. In a typical assay, a hybridization pattern is evaluated for about 20 to about 25 selected cells.
  • Cells with two or more copies of complex chromosomes are considered cancer positive.
  • a sample containing about 20 selected cells and at least about 4 test positive cells is considered cancer positive. If less than about 4 test positive cells are found, determine the level of chromosome ploidy.
  • more than 30% of the cells are lost in a half-zygote or homozygote of a specific chromosomal region (eg, loss of 9p21, q15q11, 17q25 in urothelial cancer such as renal pelvic and bladder cancer, bladder cancer, etc.) That is, even when showing zero-chromosome nature, it means a cancer positive result.
  • the zero-chromosome nature can be confirmed as a non-artificial structure.
  • the correlation step can be used to screen cancer patients or monitor patients diagnosed with cancer and correlates with the subject's cancer.
  • suspected renal pelvic and ureteral cancer such as patients who are over 50 years old and who are smoking habits or who have been exposed to aromatic amines for a long time.
  • Select a patient for the purpose of early detection of renal pelvic and ureteral cancer, suspected renal pelvic and ureteral cancer, such as patients who are over 50 years old and who are smoking habits or who have been exposed to aromatic amines for a long time.
  • Select a patient for the purpose of early detection of renal pelvic and ureteral cancer, such as patients who are over 50 years old and who are smoking habits or who have been exposed to aromatic amines for a long time.
  • Select a patient for the purpose of early detection of renal pelvic and ureteral cancer.
  • the methods described herein may be used alone or in combination with other tests such as the hemoglobin test strip test. For example, by detecting hemoglobin in urine, that is, hematuri
  • samples from hematuria patients are analyzed in more detail using the methods described herein.
  • a set of chromosomal probes is hybridized to a biological sample and a subset of cells is selected, the presence of aneuploid cells is determined for the selected cells.
  • Patients with aneuploid cells can be further examined, for example, by cystoscopy, and receive appropriate treatment if necessary. After treatment, the patient's cancer recurrence is monitored by the tumor detection method according to the present invention.
  • renal pelvic and ureteral cancer accounts for about 10% of pre-urinary tract tumors and is often diagnosed as advanced cancer.
  • metastasis tends to occur and the prognosis is poor, and the effect of chemotherapy is still unsatisfactory.
  • bladder cancer among urothelial cancers has the same problem.
  • the tumor detection method according to the present invention is not limited to the fluorescence in situ hybridization method using the urine specimen described above, and any method can be used as long as it can detect an aneuploid chromosome region, and the fluorescence in situ hybridization method and the DNA microarray method.
  • the presence or absence of the aneuploid chromosome region may be determined using a known quantitative PCR method, for example, PCR using a specific probe by a fluorescent probe method in the quantitative PCR method
  • the fluorescence amplification may be measured in real time, and the presence or absence of the aneuploid chromosome region may be determined by the fluorescence amplification rate.
  • the presence or absence of an aneuploid chromosome region may be determined by known labeling or detection by performing PCR without using a specific probe using the electrophoresis method or SYBR green method in the quantitative PCR method.
  • DNA was extracted from the cancerous part and normal part of 109 specimens that had been cryopreserved after undergoing surgery to remove cancer after diagnosis of renal pelvic cancer or ureteral cancer at the Department of Urology at the University of Tokyo .
  • Affymetrix GeneChip Mapping 250K arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA, trade name)
  • copy number analysis was performed according to the protocol (FIGS. 1 and 2). A specific procedure will be described below.
  • genomic DNA For each of 109 extracted specimens, genomic DNA (gDNA) was treated with restriction enzyme using Nspl, and adapter ligated to the 3 ′ and 5 ′ ends of all gDNA fragments. Thereafter, a generic primer for recognizing the adapter was added, the DNA fragment was PCR amplified, and the PCR amplified products were combined and purified using polystyrene beads. The amplified gDNA was further fragmented for hybridization, labeled, and then hybridized. As a result, the genomic DNA was hybridized to the probes on the array and the signal was read to determine the genotype ⁇ ⁇ of hundreds to millions of SNPs on the genome at once (SNP). Microarray).
  • CGH Compparative Genomic Hybridization
  • a plurality of genes are encoded in these regions, and it was not possible to narrow down the gene in which the copy number change occurred to one (FIGS. 1 and 2). 1 and 2, the left side shows a region where the copy number change is amplified, and the right side shows a region where the copy number change is missing.
  • each chromosomal region for example, “1q23.3” in FIG. 3, the line portion shown on the right indicates each sample in which the copy number change occurred in the chromosomal region, and the white portion shown on the right is shown. The part shows each specimen in which the copy number change has not occurred in the chromosomal region. Furthermore, in the lower part of FIG. 3, the genes contained in the four regions are summarized.
  • the diagnostic kit modeled on the 4 regions of the 1q23.3 chromosomal region, 3p25.2 chromosomal region, 8q22.3 chromosomal region, and 20q13.2 chromosomal region is more suitable for UroVysion. It was expected to be superior to the diagnostic kit modeled on the four areas targeted by (trade name).
  • Target patients were 4 preoperative patients with bladder cancer and 2 patients who were denied urothelial cancer by urine cytology and diagnostic imaging.
  • a probe set including four color probes was produced.
  • the fluorophore used to label each probe is labeled with 1q23.1: Red, 3p25.2: Green, 8q22.3: Cy5, 20q13.13: DEAC (Aqua), and using an aqua color filter Visualize chromosome 20.
  • Chromosome 8 was visualized using a yellow filter, and chromosomes 1 and 3 were visualized using a red / green dichroic filter or a filter of either red or green.
  • Table 1 below shows the details of the prepared probe and the BAC (cell artificial chromosome clone) used.
  • hybridization The four-color probe set prepared above was used for hybridization. Specifically, hybridization was performed according to the following steps 1 to 4. 1. Cell specimens were hardened on a 70 ° C. hotplate for over 2 hours. 2. Each probe prepared above was applied to a cell specimen and covered with a cover glass (22 ⁇ 22 mm). 3. Denaturation treatment was performed for 5 minutes on a 70 ° C hot plate. 4. Hybridized overnight (in a wet box) at 37 ° C.
  • washing and detection were performed according to the following steps 1 to 5.
  • 1. Immerse in 2 ⁇ SSC for 5 minutes and gently remove the cover glass.
  • 2. Dipped in 50% formamide / 2 ⁇ SSC (mixed with formamide and 4 ⁇ SSC 1: 1) at 37 ° C. for 20 minutes.
  • 3. After rinsing with 1 ⁇ SSC, it was immersed in 1 ⁇ SSC for 15 minutes. 4). Mounted after DAPI staining. 5). The fluorescence was observed.

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Abstract

本発明は、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される１種又は２種以上を含む、腫瘍検出用マーカーを提供する。

Description

新たな染色体領域をターゲットにした腫瘍検出用マーカー
　本発明は、腫瘍検出方法、腫瘍検出用マーカー、及び腫瘍検出用キットに関する。
　がんの診断は、大きく分けて、侵襲的な検出法及び非侵襲的な検出法により行われている。その中でも、対象である患者の負担を軽減するためには、非侵襲的な検出法が望まれている。
　中でも、尿路上皮癌（Urothelial carcinoma:UC）を非侵襲的に検出するためには、尿を検体とした細胞診断法（尿細胞診）及びCT/MRI画像診断があり、診断確定のための侵襲的な検査として膀胱鏡や尿管鏡による肉眼所見が主要な手段である。しかしながら、非侵襲的な手段である尿細胞診では、腫瘍検出において、特異度は一定程度得られるものの、感度が十分ではない（40-60%程度）。また、非浸潤癌やlow-gradeの癌においては、さらに感度が低くなる。
　また、尿路上皮癌を非侵襲的に検出するためには、BTA試験（Bladder Tumor Antigen test、C.R.Bard社、Murrayhill,NJ）や、NMP-22（Nuclear Matrix Protein 22）の尿中分子マーカーを用いた方法もあるが、これらの方法は、腫瘍検出における感度（32-92%程度、53-89%程度）や特異度（51-94%程度、53-89%程度）が未だ不十分であり、広く普及するには至っていない。
　よって、昨今ニュースで問題となるような偽陰性の症例を見過ごし進行癌になるまで放置してしまう問題が起こるだけでなく、非侵襲的に検出した段階では陽性と判定され、確定的に腫瘍を検出すべく生検等の侵襲的な検査や手術がなされた上、結果的に陰性と判定されることも数多い。このように偽陽性であったにも関わらず、侵襲的な検査や手術がなされてしまうことは、患者に対して身体的負担が大きく、また、金銭的負担も大きい。なお、わが国で尿潜血から腫瘍を疑われたものの約９割が、偽陽性であるとの知見もある。
　一方、２００１年にアメリカ食品医薬品局（Food and Drug Administration: FDA）で、腫瘍を検出するための非侵襲的な診断法として、尿検体を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（Fluorescence in situ Hybridization: FISH）法が認可された。この診断法については、例えば特許文献１にも開示されている。
特許第５６８０５０２号
　しかしながら、特許文献１に開示されるような、従来の染色体マーカーを用いる場合、検出標的とする染色体領域に未だ改善の余地があるため、腫瘍検出における充分な特異度及び感度が得られない。
　本発明は、腫瘍検出において特異度及び感度が共に充分優れる腫瘍用検出マーカーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、腎盂尿管癌に絞り込んだゲノム解析を行い、腎盂尿管癌のゲノム異常の解明及び膀胱癌との比較を行い、新たな検出標的の発見を目指した結果、1、3、8、10、11、15、17、19、及び20番染色体の特定領域に対する特異的プローブからなる群より選択される1種又は2種以上を含む腫瘍検出用マーカーを用いることにより、腫瘍検出において特異度及び感度が共に優れることを見出した。
　また、本発明者らは、新たな検出標的の発見を目指してゲノム解析を行った結果、特異度及び感度が共に優れる腫瘍検出用マーカーに用いることのできるプローブとして、1、3、8、10、11、15、17、19、及び20番染色体の特定領域に対する特異的プローブを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下に示す通りである。
［１］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域のいずれかにおける異数染色体領域を検出する腫瘍検出方法。
［２］
　蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ法、及びＰＣＲ法のいずれかで異数染色体領域を検出する、
　［１］に記載の腫瘍検出方法。
［３］
　被検体由来のサンプルから、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域のいずれかにおける異数染色体領域の有無を判定する判定工程、及び
　異数染色体性領域の存在を被験者の癌と相関させる相関工程、を含む、
　［１］又は［２］に記載の腫瘍検出方法。
［４］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される１種又は２種以上を含む、腫瘍検出用マーカーを、被験者由来のサンプルにハイブリダイズさせるハイブリダイジング工程、及び
　ハイブリダイズされたサンプルから顕微鏡を用いて細胞を選択する選択工程、をさらに含み、
　判定工程において、選択された細胞における異数染色体性細胞の有無を確認することにより、異数染色体領域の有無を判定する、
　［３］に記載の腫瘍検出方法。
［５］
　前記ハイブリダイジング工程において、核の形態学によって細胞を選択する、
　［４］に記載の腫瘍検出方法。
［６］
　前記ハイブリダイジング工程において、核の大きさによって細胞を選択する、
　［４］又は［５］に記載の腫瘍検出方法。
［７］
　核の形状によって細胞を選択する、
　［４］～［６］のいずれかに記載の腫瘍検出方法。
［８］
　ＤＡＰＩ染色法によって核の形態学を評価して細胞を選択する、
　［４］～［７］のいずれかに記載の腫瘍検出方法。
［９］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される１種又は２種以上を含む、
　腫瘍検出用マーカー。
［１０］
　尿路上皮癌の検出に用いられる、
　［９］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［１１］
　前記尿路上皮癌が、腎盂尿管癌又は膀胱癌である、
　［１０］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［１２］
　異数染色体領域を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
　［９］～［１１］のいずれかに記載の腫瘍検出用マーカー。
［１３］
　前記特異的プローブが、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域のいずれかの異数染色体領域を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
　［１２］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［１４］
　異数染色体領域を有する異数染色体性細胞を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
　［１２］又は［１３］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［１５］
　尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、分泌物、口腔洗浄物、組織サンプル、触診サンプル、及び細い吸引針による吸引液の少なくともいずれかを被検体由来のサンプルとする、
　［９］～［１４］のいずれかに記載の腫瘍検出用マーカー。
［１６］
　９ｐ２１染色体領域に対する特異的プローブをさらに含む、
　［９］～［１５］のいずれかに記載の腫瘍検出用マーカー。
［１７］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ２種以上を含む、
　［９］～［１６］のいずれかに記載の腫瘍検出用マーカー。
［１８］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ３種以上を含む、
　［１７］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［１９］
　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ４種以上を含む、
　［１８］に記載の腫瘍検出用マーカー。
［２０］
　前記染色体プローブが、互いに異なる色で蛍光標識されている、
　［９］～［１９］のいずれかに記載の腫瘍検出用マーカー。
［２１］
　［９］～［１９］のいずれかに記載される腫瘍検出用マーカーを含む、
　腫瘍検出用キット。
［２２］
　染色体プローブを蛍光標識できる蛍光色素をさらに含む、
　［２１］に記載の腫瘍検出用キット。
［２３］
　ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーをさらに含む、
　［２１］又は［２２］に記載の腫瘍検出用キット。
腎盂尿管癌症例109例を対象に染色体コピー数解析を行った結果の一部を示す。 腎盂尿管癌症例109例を対象に染色体コピー数解析を行った結果の残りを示す。 1q、3p、8q、及び20qの染色体領域のコピー数解析の結果を整理した概略図を示す。 9p、chr3、chr7、及びchr17の染色体領域のコピー数解析の結果を整理した概略図を示す。 2以上の染色体領域、3以上の染色体領域、4以上の染色体領域でコピー数が変化していた割合を示す。
［腫瘍検出用マーカー］
　本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される1種又は2種以上を含む。また、この特異的プローブは、より具体的に1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される1種又は2種以上であることにより、より確実に本発明の作用効果を奏することができる。
＜特異的プローブ＞
　本発明に係る特異的プローブは、所定の染色体領域に対応する反復DNAとハイブリダイズする。ここで、「ハイブリダイズする」とは、二本鎖のDNAを形成することを意味する。また、本発明に係る特異的プローブは、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域の一つに、少なくとも対応する。また、9p染色体領域にハイブリダイズする特異的プローブをさらに用いてもよく、9p染色体領域に対する特異的プローブとしては、9p21染色体領域に対する特異的プローブが挙げられる。
　ここで、腫瘍検出用マーカーが複数の特異的プローブを含む場合には、互いに異なる染色体領域に対するものであってもよく、同一の染色体領域に対するものであってもよい。
　特異的プローブは、1種を含んでいてもよく、2種以上を含むことが好ましく、3種以上を含むことがより好ましく、4種以上を含むことがさらに好ましいが、互いに異なる染色体領域に対するものを、2種以上を含むことが好ましく、3種以上を含むことがより好ましく、4種以上を含むことがさらに好ましい。
　また、腫瘍検出用マーカーは、より優れた特異度及び感度を得るために、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8q22染色体領域、及び20q13染色体領域に対する特異的プローブを同一または異なって、2種以上を含むことが好ましく、3種以上を含むことがより好ましく、4種以上を含むことがさらに好ましい。
　腫瘍検出用マーカーは、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8q22染色体領域、及び20q13染色体領域に対する特異的プローブをそれぞれ含むことが好ましい。
　特異的プローブは、腫瘍検出の特異度及び感度を指標として、適宜最適なものを選択することができる。例えば、本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、1番染色体の1q23領域、3番染色体の3p25領域、8番染色体の8q22領域、及び20番染色体の20q13領域に対する特異的プローブを含むことができる。さらに、9番染色体の9p21領域の特異的プローブもさらに含むことができる。後述する実施例に記載するように、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8q22染色体領域、及び20q13染色体領域に対する特異的プローブは、その2領域、3領域、及び4領域に対する特異的プローブを含むことにより、特異度及び感度が優れていく傾向にある。
　特異的プローブの長さは、特に限定されないが、好ましくは50～100×106のヌクレオチドであり、より好ましくは1.0×106～30×106のヌクレオチドであり、さらに好ましくは30×106～15×106のヌクレオチドである。上述した染色体領域とハイブリダイズする特異的プローブは、例えば、Vysis社（Downers Grove, IL）、Molecular Probes社（Eugene, OR）、またはCytocell社（Oxfordshire, UK）から市販されている。また、標準的な技術を駆使して、染色体又はゲノムDNAから非工業的に特異的プローブを製造することもできる。例えば、使用できるDNA源として、ゲノムDNA配列、クローン化DNA配列、宿主の正常染色体組と共に一つのヒトの染色体若しくはその一部を含む体細胞ハイブリッド、ならびに、フローサイトメトリー又は顕微手術によって精製された染色体が挙げられる。ここで、クローニング、又は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介した部位特異的増幅によって標的領域を単離することができる。
　特異的プローブは、互いに区別して視認することができるよう、互いに異なる色で蛍光標識されていることが好ましい。
［腫瘍検出用キット］
　本発明に係る腫瘍検出用キットは、本発明に係る腫瘍検出用マーカーを含む。腫瘍検出用キットは、腫瘍検出用マーカーに含まれる特異的プローブを蛍光標識できる蛍光色素をさらに含んでいてもよく、DNAポリメラーゼ及びプライマーをさらに含んでいてもよい。
　「色素」とは、波長が短い高エネルギーの光を吸収した後に、蛍光を発する有機分子を意味する。蛍光色素によって蛍光標識された特異的プローブは、二次検出分子を用いずに視覚化することができる。蛍光色素は、所定のヌクレオチドに共有結合させた後、ニックトランスレーション、ランダムプライミング、PCR法に用いる各種標識等の標準的な技術を用いて、特異的プローブに直接組み込むことができる。これ以外にも、特異的プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドをリンカーによりアミノ基転移し、次いで、蛍光色素をアミノ基転移したデオキシシチジンヌクレオチドに共有結合させてもよい。
　「DNA ポリメラーゼ」とは、1本鎖の核酸を鋳型として、それに相補的な塩基配列を持つ DNA 鎖を合成する酵素を意味し、例えばPCR法に用いる市販の試薬を用いることができる。
　「プライマー」とは、DNA複製時の起点となるオリゴヌクレオチドを意味し、例えばPCR法に用いる市販の試薬を用いることができる。
　プライマーは、特異的プローブが対応する所定の染色体領域に対応する反復DNAを複製するよう設計されたものを用いることにより、特異的プローブと対応する所定の染色体領域が増大し、感度が優れていく傾向にある。
　腫瘍検出用マーカーが複数の特異的プローブを含む場合には、その各々が、明瞭に視覚化されるように、互いに異なる色の蛍光色素を選択する。例えば、次の蛍光色素を組み合わせて使用することができる：7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸（AMCA）、Texas Red（登録商標）（Molecular Probes社、Eugene, OR）、5-(-6)-カルボキシ-X-ローダミン、リサミン(lissamine)ローダミンB、5-(-6)-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン-5-イソチオシアネート（FITC），7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボン酸（DEAC）、テトラメチルローダミン-5-(-6)-イソチオシアネート、5-(および-6)-カルボキシテトラメチルローダミン、7-ヒドロキシクマリン-3-カルボン酸、6-[フルオレセイン5-(および-6)-カルボキシアミド]ヘキサン酸、N-(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4aジアザ-3-インダセンプロピオン酸(indacenepropionic acid)、エオジン-5-イソチオシアネート、エリスロシン-5-イソチオシアネート、Cascade（登録商標）ブルーアセチルアジド（Molecular Probes社、Eugene, OR）、SpectrumRed（登録商標）、SpectrumGreen（登録商標）、Cy-3（登録商標）、Cy-5（登録商標）。特異的プローブは、蛍光顕微鏡や各蛍光色素に適したフィルタによって、或いは、多数の蛍光色素を観察するための二重又は三重バンドパスフィルタのセットを用いて、観察することができる。これ以外にも、フローサイトメトリー等の方法を用いて、特異的プローブのハイブリダイゼーション・パターンを調べてもよい。
　特異的プローブは、蛍光色素以外に、ビオチン又はジゴキシゲニンで間接的に標識するか、或いは、32Ｐ、3Ｈ等の放射性同位体で標識することができる。
［用途］
　本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、腫瘍、特に癌の検出に用いられる。また、癌の中でも特に尿路上皮癌の検出に用いられる。尿路上皮癌の検出に用いられることにより、腫瘍検出における特異度及び感度により優れる。ここで、「尿路上皮癌」とは、尿路（例えば、腎盂、尿管、膀胱、尿道）に発生する癌を意味する。尿路上皮癌は、尿路の部位よって、腎盂癌、尿管癌、膀胱癌、尿道癌等に分類される。また、尿路のうち、腎盂及び尿管は上部尿路ともいい、この尿路に発生する癌をまとめて腎盂尿管癌ともいう。
　腎盂尿管癌と膀胱癌とは、共に尿路上皮癌（TCC、UC）と同じ組織型である。しかし、膀胱は、尿道から逆行性に細菌が入り膀胱炎になる場合があり、また、蓄尿や排尿による伸展収縮をするなど、外部からの刺激を比較的受けやすい。よって、コピー数解析等の遺伝子解析では、炎症所見が蓄積される場合がある。本発明者らは、腎盂尿管癌に絞り込んだ遺伝子解析では、腎盂尿管癌が尿路上皮癌に純粋に対応する状態を反映していることを見出している。
　また、腫瘍検出用マーカーは、尿路上皮癌に限定されず、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部の癌、腎臓癌、白血病等の腫瘍の検出にも用いることができる。
　本発明に係る腫瘍検出用マーカーは、後述するように、異数染色体領域乃至異数染色体領域を有する異数染色体性細胞を検出することにより腫瘍を検出するために用いられることが好ましく、特異的プローブが、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域のいずれかの異数染色体領域を検出することにより腫瘍を検出するために用いられることが好ましい。本発明に係る特異的プローブは、異数染色体領域を検出するよう設計されている。本明細書において、「異数染色体領域」とは、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域のいずれかの染色体領域において、異常な数を有するもの、又は、半接合体若しくは同型接合体の損失のような染色体の構造変化が生じている染色体領域を意味する。「異数染色体性細胞(aneusomic cell)」とは、異数染色体領域を有する細胞を意味する。
［腫瘍検出方法］
　本発明に係る腫瘍検出方法は、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域のいずれかにおける異数染色体領域を検出する。検出方法としては、蛍光in situハイブリダイゼーション法（Fluorescence in situ Hybridization: FISH法）、DNAマイクロアレイ法、及びPCR法のいずれかで検出することができる。また、次世代シークエンサーを用いた解析、遺伝子発現をみる解析用DNAチップやRNAシークエンスによって検出することもできる。
　本発明に係る腫瘍検出方法は、具体的に、被検体由来のサンプルから、1q23染色体領域、3p25染色体領域、8p12染色体領域、8q22染色体領域、10p14染色体領域、11q13染色体領域、15q11染色体領域、17q11染色体領域、17p12染色体領域、17q25染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13染色体領域のいずれかにおける異数染色体領域の有無を判定する判定工程、及び異数染色体性領域の存在を被験者の癌と相関させる相関工程、を含むものであってよい。さらに、本発明に係る腫瘍検出用マーカーを、被験者由来のサンプルにハイブリダイズさせるハイブリダイジング工程、及びハイブリダイズされたサンプルから顕微鏡を用いて細胞を選択する選択工程、をさらに含み、判定工程において、選択された細胞における異数染色体性細胞の有無を確認することにより、染色体領域の有無を判定するものであれば、本発明に係る腫瘍検出方法はより特異度及び感度に優れる。例えば、尿検体を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション法に対して、本発明に係る腫瘍検出用マーカーを適用することにより、従来の腫瘍検出方法よりも有意に、優れた特異度及び感度で腫瘍を検出することができる。以下、蛍光in situハイブリダイゼーション法を詳述することにより、本発明に係る腫瘍検出方法の内容を説明する。
　本発明に係る腫瘍検出方法は、腫瘍を検出するための迅速で、高特異度及び高感度の方法である。この方法は、例えば、尿路上皮癌を含む癌の疑いのある被験者のスクリーニング、及び、癌と診断された患者の腫瘍再発の監視に使用することができる。より具体的には、腎盂尿管癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭部及び頸部の癌、腎臓癌、白血病の疑いのある被験者のスクリーニング、並びにその再発の監視を行うことができる。
＜ハイブリダイジング工程＞
　腫瘍検出用マーカーを被験者由来のサンプルにハイブリダイズする方法は、特に限定されないが、例えば、次のような方法が挙げられる。特異的プローブをスライドガラス上の細胞（尿由来、その他の生物学的サンプル）にハイブリダイズさせる。次に、スライドガラス上の細胞を比較的低い拡大能（例えば、200～400倍）で、視覚的に走査することにより、核の形態学、核の大きさ、形状によって細胞を選択する（例えば、悪性腫瘍を強く示す特徴として核の膨大や凹凸のある核形状を見いだす。）。次に、細胞診断法で異常な細胞の核を検査するが、この検査は、対物レンズをさらに高い拡大能のもの（例えば、600～1,000倍）に切り換え、フィルタを「反転させる(flipping)」ことによって、細胞が異数染色体性であるか否かを判定する。この方法を使用することによって、新生物である確率が低い細胞を評価するのに費やす時間を大幅に短縮し、検査者が、新生物であると同時に、異数染色体性を示す確率がはるかに高い細胞に焦点を絞ることが可能になる。
　異数染色体性細胞の有無は、in situハイブリダイゼーションによって判定することができる。例えば、一つ又は複数の染色体増加、すなわち、任意の所定の染色体の三つ以上のコピーを有する異数染色体性細胞が、本明細書に記載した方法ではテスト陽性と考えられるが、特定の状況下では、単染色体性や零染色体性(Deletion)を表す細胞もテスト陽性と考えてよい。一般的には、in situハイブリダイゼーションは、生物学的サンプルを固定し、染色体プローブを、固定した該生物学的サンプルに含まれる標的DNAにハイブリダイズさせ、洗浄によって非特異結合を除去し、ハイブリダイズしたプローブを検出する工程を含む。
　本明細書において「被検体由来のサンプル」とは、細胞又は細胞性物質を含むサンプルを意味する。被検体由来のサンプルは、ハイブリダイゼーションの前に濃縮して、細胞密度を高めてもよい。被検体由来のサンプルの具体例としては、尿、血液、脳脊髄液（CSF）、胸膜液、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、分泌物（例えば、乳房分泌物）、口腔洗浄物、組織サンプル、触診サンプル、及び細い吸引針による吸引液が挙げられる。
　被検体由来のサンプルの種類は、検出したい腫瘍の種類によって異なる。例えば、尿や膀胱洗浄物は、腎盂尿管癌や膀胱癌等の尿路上皮癌の検出、また、これより少ないが前立腺や腎臓癌の検出に有用なサンプルとなり得る。胸膜液は、肺癌、中皮腫、転移性腫瘍（例えば、乳癌）の検出に有用であり、血液は、白血病の検出に有用である。組織サンプルについては、組織をパラフィン中に固定・配置して薄切するか、凍結して、薄い切片に切断すればよい。
　被検体由来のサンプルからは、従来公知の技術を用いて細胞を回収することができる。例えば、尿等のサンプルを遠心分離にかけ、ペレット状にした細胞を再度懸濁させることによって、細胞を回収することができる。また、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で細胞を再懸濁させる。細胞懸濁液を遠心分離にかけて、細胞ペレットを得た後、例えば、酸性アルコール溶液、酸性アセトン溶液、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類中で細胞を固定することができる。固定には、例えば、メタノールと氷酢酸とをそれぞれ3：1の割合で含む固定液を固定剤として用いることができる。中性緩衝ホルマリン溶液も使用することができるが、この溶液には、37～40％のホルムアルデヒドのリン酸ナトリウム水溶液が1～10％含まれる。細胞を載せたスライドガラスは、固定液の大部分を除去し、わずかな溶液に懸濁した濃縮細胞を残すことによって調製することができる。
　細胞がスライドガラス上で重なり合わないように、細胞懸濁液をスライドガラスに塗布する。細胞密度は、光学顕微鏡又は位相差顕微鏡によって測定することができる。例えば、20～100mLの尿サンプルから回収した細胞は、最終容量が約100μL～約200μLの固定液中に再懸濁させる。次に、この懸濁液を三種類の容量（通常3、10、及び30μL）ずつスライドガラスの6mmウェルに滴下し、各ウェルの細胞充実度（すなわち細胞の密度）を位相差顕微鏡で評価する。最大容量の細胞懸濁液を入れたウェルが十分に細胞を含んでいない場合には、細胞懸濁液を濃縮し、別のウェルに滴下する。
　in situハイブリダイゼーションの前に、上記細胞の各々に含まれる特異的プローブ及び染色体DNAをそれぞれ変性させる。例えば、高いpH、熱（例えば、約70℃～約95℃の温度）、ホルムアミドやハロゲン化テトラアルキルアンモニウム等の有機溶剤の存在下で、またはこれらを組み合わせて、インキュベートすることによって変性を実施する。例えば、染色体DNAの変性は、70℃以上の温度（例えば、約73℃）と、70％ホルムアミドおよび2×SSC（0.3M塩化ナトリウムと0.03Mクエン酸ナトリウム)を含む変性バッファーとを組み合わせることによって実施することができる。例えば、細胞形態が保存されるように、変性条件を設定する。特異的プローブは、熱によって変性させることができる。例えば、約５分間、特異的プローブを約73℃に加熱することができる。
　変性のための化学薬品又は条件を除去した後、ハイブリダイゼーション条件の下で、特異的プローブを染色体DNAへアニーリングさせる。この「ハイブリダイゼーション条件」とは、特異的プローブと標的とする染色体DNAとの間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さ及び長さ、並びに、インキュベーションの塩濃度、温度及び時間に応じて異なる。特異的プローブの濃度が高いほど、ハイブリッドを形成する確率も高くなる。例えば、in situハイブリダイゼーションは、典型的には、1～2×SSC、50％ホルムアミド、並びに、非特異的ハイブリダイゼーションを抑制する遮断DNAを含むハイブリダイゼーション・バッファー中で実施される。一般に、ハイブリダイゼーション条件には、上述のように、約25℃～約55℃の温度と、約0.5時間～約96時間のインキュベーション時間が含まれる。さらに詳細には、ハイブリダイゼーションは、約32℃～約40℃で、約2時間～約16時間実施することができる。
　特異的プローブと、標的領域外のDNAとの非特異結合は、洗浄を連続して繰り返すことによって除去することができる。各回洗浄の温度及び塩濃度は、所望のストリンジェンシーに応じて異なる。例えば、ストリンジェンシー条件が高い場合には、0.2×～約2×SSC、ならびに、Nonidet P-40（NP40）等の非イオン性界面活性剤を約0.1％～約１％用いて、約65℃～約80℃で洗浄を実施することができる。また、洗浄の温度を下げるか、塩濃度を高めることによって、ストリンジェンシーを低くすることができる。
＜選択工程＞
　異数染色体性細胞の有無を評価する前に、スライドガラス上の被検体由来のサンプル（例えば、尿等）の細胞から、顕微鏡を用いて細胞を選択することができる。「選択」とは、核の膨大、核の凹凸、異常な核染色（通常は斑状染色パターン）のような一つ又は複数の細胞学的（主に核の）異常による新生物の疑いが高い細胞の特定を意味する。これらの核の特徴は、ヨウ化プロピジウムもしくは4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール・ジヒドロクロライド（DAPI）等の核酸染色又は染料を用いて評価することができる。ヨウ化プロピジウムは、614nmの発光ピーク波長で観察できる赤い蛍光を発するDNA特異的染料である。典型的には、ヨウ化プロピジウムは、約0.4μg/mL～約５μg/mLの濃度で使用する。DAPIは、青い蛍光を発するDNA特異的染料であり、452mnの発光ピーク波長で観察できるが、一般に、約125ng/mL～約1,000ng/mLまでの範囲の濃度で使用する。DAPI又はヨウ化プロピジウムによる細胞の染色は、一般にin situハイブリダイゼーションを実施した後に行う。
＜判定工程＞
　細胞を選択工程において選択した後、選択した各細胞の特異的プローブのハイブリダイゼーション・パターン（すなわち、各プローブのシグナル数）を調べ、染色体シグナル数を記録することによって、異数染色体性の有無を判定することができる。この工程は、４個の細胞がすべて異数染色体性であれば、少なくとも４個の細胞について、ハイブリダイゼーション・パターンを評価するまで繰り返す。典型的なアッセイでは、選択した約20個～約25個の細胞について、ハイブリダイゼーション・パターンを評価する。
　複合染色体の二つ以上のコピー（すなわち、複合染色体の増加）を持つ細胞が、癌陽性と考えられる。約20個の選択細胞と少なくとも約４個のテスト陽性細胞を含むサンプルは、癌陽性と考えられる。約４個以下のテスト陽性細胞がみつかった場合には、染色体の倍数性レベルを決定する。また、30％を超える細胞が、腎盂尿管癌、膀胱癌等の尿路上皮癌における例えば9p21, 15q11, 17q25の損失のように、特定の染色体領域の半接合体もしくは同型接合体の損失（すなわち、零染色体性）を示す場合にも、癌陽性の結果を意味する。周囲の正常と思われる細胞を観察し、上記特定染色体領域に二つのシグナルを持っているかどうかを調べることによって、零染色体性を非人為構造として確認することができる。
＜相関工程＞
　相関工程は、癌患者のスクリーニング、又は、癌と診断された患者の監視に使用することができ、被験者の癌と相関させる。例えば、スクリーニングでは、腎盂尿管癌の早期検出を目的として、年齢50歳以上で喫煙習慣のある患者、または、長期にわたって芳香族アミン類にさらされてきた患者等、腎盂尿管癌の疑いのある患者を選別する。本明細書に記載する方法は、単独で用いても、ヘモグロビン試験紙試験のようなその他の試験と組み合わせて用いてもよい。例えば、尿中のヘモグロビン、すなわち血尿を検出することによって、膀胱癌の疑いが高い患者を選別することができる。このようなスクリーニングの際に、血尿のない患者は、それ以上の分析を必要としないが、適当な時間をおいて（例えば、毎年の定期検診で）、血尿の再検査を行う。血尿患者からのサンプルは、本明細書に記載する方法を用いてさらに詳しく分析する。一般に、染色体プローブのセットを生物学的サンプルにハイブリダイズさせ、細胞のサブセットを選択した後、選択した細胞について、異数染色体性細胞の存在を判定する。異数染色体性細胞を持つ患者は、例えば、膀胱鏡検査法によってさらに検査し、必要であれば、適切な治療を受けることができる。治療後に、本発明に係る腫瘍検出方法によって、患者の癌再発を監視する。
　特に尿路上皮癌のうちで腎盂尿管癌は、前尿路腫瘍の約10％を占め、しばしば進行癌として診断される。特に浸潤癌の場合には、転移を起こしやすく予後不良であり、化学療法の効果は未だ満足できない。また、尿路上皮癌のうちで膀胱癌も、同様の問題を有する。
　尿路上皮癌が進行した患者が多く存在するという事実は、早期段階で、尿路上皮癌を検出するスクリーニング・プログラムが、この疾患による全体死亡率を減少させるのに役立つことを示唆している。
　本発明に係る腫瘍検出方法は、上述した尿検体を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション法に限定されず、異数染色体領域を検出するものであればよく、蛍光in situハイブリダイゼーション法及びDNAマイクロアレイ法により異数染色体領域の有無を判定する場合には、例えば後述する実施例に記載の方法のように検出すればよい。
　PCR法により異数染色体領域を検出する場合には、公知の定量PCR法を用いて異数染色体領域の有無を判定すればよく、例えば定量PCR法における蛍光プローブ法により特異的プローブを用いてPCRを行い、リアルタイムで蛍光の増幅を測定し、蛍光の増幅率で異数染色体領域の有無を判定してもよい。また、定量PCR法における電気泳動法やSYBRグリーン法を用いて、特異的プローブを用いずにPCRを行って、公知の標識や検出によって異数染色体領域の有無を判定してもよい。
　以下に示す実施例に基づき、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を制限するものではない。
＜コピー数解析＞
　東京大学泌尿器科において腎盂癌ないし尿管癌と診断された後、癌の摘出手術を施行した、109例の凍結保存していた摘出検体について、その癌部と正常部とからそれぞれDNAを抽出した。それらをAffymetrix GeneChip Mapping 250K arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA、商品名)を用いて、そのプロトコール通りにコピー数解析を行った（図１及び２）。以下、具体的な手順を説明する。
　109例の摘出検体のそれぞれについて、ゲノムDNA（gDNA）をNsplを用いてそれぞれ制限酵素で処理し、全てのgDNA断片の3', 5'末端にアダプターライゲーションした。その後、アダプターを認識するジェネリックプライマーを加え、DNA断片をPCR増幅させ、PCR増幅させた各産物を合わせ、ポリスチレンビーズを用いて精製した。増幅したgDNAは、ハイブリダイズのために、さらに断片化され、標識化した後、ハイブリダイズされた。これにより、ゲノムDNAをアレイ上のプローブにハイブリダイズさせて信号を読み取ることにより、ゲノム上の数十万から百万のSNPを一度に遺伝子型(ジェノタイプ) を決定することができた（SNPマイクロアレイ）。また、各々のプローブの信号強度と対照ゲノムの信号強度との比を取ることによって、仮想的に競合ゲノムハイブリダイゼーション（Comparative genomic hybridization: CGH）を行うことができた。ここで、SNPマイクロアレイを用いたCGH の利点は、単純にコピー数の異常を検知するだけではなく、ジェノタイプのデータを用いたLOH （loss of heterozygosity;ヘテロ接合性消失）解析も行えることにあった。
　これらから得られた結果をBroad Instituteが提供するソフトウェアGISTIC（Genomic Identification of Significant Targets in Cancer；商品名）2.0を用いて解析し、各々の患者において癌部と正常部とで比較し癌特異的な変化を検索した。ここで、これらの有意差がq-value ≦ 1×10-10となる領域を検索したところ、1q23.3染色体領域、3p25.2染色体領域、8p12染色体領域、8q22.3染色体領域、9p21.3染色体領域、10p14染色体領域、11q13.3染色体領域、15q11.2染色体領域、17q11.2染色体領域、17p12染色体領域、17q25.2染色体領域、19q12染色体領域、及び20q13.2染色体領域が絞り込まれたすなわち、これらの領域がより癌特異的に起こっている変化領域と考えられた。これらの領域には複数の遺伝子がコードされており、コピー数変化の起きている遺伝子を1つに絞り込むことはできなかった（図１及び２）。なお、図１及び２において、それぞれ左側はコピー数変化が増幅している領域を示し、右側はコピー数変化が欠損している領域を示す。
　コピー数変化の起きている遺伝子のなかでも、より多い複数の症例で認められた1q23.3染色体領域、3p25.2染色体領域、8q22.3染色体領域、及び20q13.2染色体領域で整理してみてみると、それぞれ45.8％、45.8％、54.1％及び54.1％の症例でコピー数変化が起きていた（図３）。この4領域で任意の2領域がコピー数変化を起こしていたのは59.6％、3領域がコピー数変化を起こしていたのは42.2％、そして4領域すべてがコピー数変化を起こしていたのは26.6％であった。なお、他に検討した17q25.2染色体領域、及び9p21.3染色体領域の結果についても、上記4領域の結果と併記する。また、図３の各染色体領域（例えば、「1q23.3」）の文字において、その右に示すライン部はその染色体領域でコピー数変化を起こした各検体を示し、その右に示す白抜きの部分はその染色体領域でコピー数変化を起こしていない各検体を示す。さらに、図３の下部において、上記4領域に含まれる遺伝子をまとめた。
　上記4領域の結果と比較するため、コピー数解析の結果からAbbott社が提供するUroVysion（商品名）と同様4領域（9pLOH, chr3, chr7, chr17）についても、上記4領域と同様にコピー数変化を整理した（図４）。この4領域で任意の2領域がコピー数変化を起こしているのは48.6％、3領域がコピー数変化を起こしていたのは29.4％、そして4領域すべてがコピー数変化を起こしていたのは7.3％であった。この結果も併せて整理すると（図５）、1q23.3染色体領域、3p25.2染色体領域、8q22.3染色体領域、及び20q13.2染色体領域の4領域をモデルにした診断キットの方が、UroVysion（商品名）で対象とする4領域をモデルにした診断キットよりも優れていると予想された。
＜FISH診断＞
　実際に、1q23.3染色体領域、3p25.2染色体領域、8q22.3染色体領域、及び20q13.2染色体領域の4領域を標的としたプローブを作製し、FISH診断モデルを検討した。以下、具体的な手順を説明する。
　対象患者は、膀胱癌の術前患者4例と、尿細胞診及び画像診断で尿路上皮癌が否定された患者2例とで行った。
〔細胞標本の作製〕
　まず、患者一人につき約50mLの尿を採取した。その後、下記1～9のステップに従って、細胞標本を作製した。
１．必要量の細胞を遠心しチューブに集めた（15mLチューブ）。
２．0.075M KCl を1.5mL加えて、20分間室温で低張処理した。
３．固定液（メタノール：酢酸=3：1、用時調製）を1.5mL滴加えて、4℃で5分保持した。
４．10mLの固定液をさらに加えて、転倒混和し遠心した。
５．再度固定液を少量加え、良く懸濁した後10mLの固定液を加えて混合し遠心した。
６．良好な結果を得るために、上記５．の操作をさらに2回繰り返す場合もあった。
７．少量の固定液で懸濁した後、適当量の固定液（メタノール：酢酸=3：1、用時調製）で細胞を希釈した。
８．スライドグラス上にパスツールピペットで1滴落として細胞を広げた。
９．37℃でovernight（一晩）乾燥し、細胞標本を作製した。
〔プローブの作製〕
　次に、4色のプローブを含むプローブセットを作製した。各プローブを標識するのに用いた蛍光団の色は1q23.1：Red、3p25.2：Green、8q22.3：Cy5、 20q13.13：DEAC(Aqua)で標識し、アクア色フィルタを用いて、20番染色体を視覚化した。黄色フィルタを用いて、8番染色体を視覚化し、赤／緑の二色フィルタ、もしくは赤または緑色のいずれか一色のフィルタを用いて、1番染色体および3番染色体を視覚化した。下記表１に、作製したプローブ及び用いたBAC（細胞人工染色体クローン）の詳細を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔ハイブリダイゼーション〕
　上記で作製した4色のプローブセットをハイブリダイゼーションに使用した。具体的には、下記1～4のステップに従って、ハイブリダイゼーションを行った。
１．細胞標本を70℃ホットプレート上で2時間以上ハードニングした。
２．細胞標本に上記で作製した各プローブをアプライしカバーグラス（22×22mm）をかけた。
３．70℃ホットプレート上で5分間変性処理した。
４．37℃でovernight（一晩）ハイブリダイゼ-ションした（湿潤箱中）。
〔洗浄・検出〕
　さらに、下記1～5のステップに従って、洗浄及び検出を行った。
１．2×SSC中5分浸漬し、カバーグラスを静かにはずした。
２．37℃の50％ホルムアミド／２×SSC（ホルムアミドと4×SSC を1：1で混合）中20分浸漬した。
３．1×SSCですすいだ後、１×SSC中15分浸漬した。
４．DAPI染色後マウントした。
５．蛍光観察した。
　膀胱癌の術前患者4例と、尿細胞診及び画像診断で尿路上皮癌が否定された患者2例との6例について、FISH診断モデルで検討して得られたシグナルカウントの結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２の結果を参照すれば、30％以上の細胞で4つのプローブいずれかで3シグナル以上もしくは4シグナル以上検出したのは、癌患者のみであり、正常患者ではいなかったことが確認された。また、この結果からは、偽陰性も擬陽性も認められなかった。
　本発明者らの見出した、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される１種又は２種以上は、腫瘍検出において特異度及び感度が共に充分優れる腫瘍検出用マーカーとして有用であると考えらえた。
 

Claims (15)

  1. 　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブからなる群より選択される１種又は２種以上を含む、
    　腫瘍検出用マーカー。
  2. 　尿路上皮癌の検出に用いられる、
    　請求項１に記載の腫瘍検出用マーカー。
  3. 　前記尿路上皮癌が、腎盂尿管癌又は膀胱癌である、
    　請求項２に記載の腫瘍検出用マーカー。
  4. 　異数染色体領域を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の腫瘍検出用マーカー。
  5. 　前記特異的プローブが、１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｐ１２染色体領域、８ｑ２２染色体領域、１０ｐ１４染色体領域、１１ｑ１３染色体領域、１５ｑ１１染色体領域、１７ｑ１１染色体領域、１７ｐ１２染色体領域、１７ｑ２５染色体領域、１９ｑ１２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域のいずれかの異数染色体領域を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
    　請求項４に記載の腫瘍検出用マーカー。
  6. 　異数染色体領域を有する異数染色体性細胞を検出することにより腫瘍を検出するために用いられる、
    　請求項４又は５に記載の腫瘍検出用マーカー。
  7. 　尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、喀痰、腹膜液、膀胱洗浄物、分泌物、口腔洗浄物、組織サンプル、触診サンプル、及び細い吸引針による吸引液の少なくともいずれかを被検体由来のサンプルとする、
    　請求項１～６のいずれか一項に記載の腫瘍検出用マーカー。
  8. 　９ｐ２１染色体領域に対する特異的プローブをさらに含む、
    　請求項１～７のいずれか一項に記載の腫瘍検出用マーカー。
  9. 　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ２種以上を含む、
    　請求項１～８のいずれか一項に記載の腫瘍検出用マーカー。
  10. 　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ３種以上を含む、
    　請求項９に記載の腫瘍検出用マーカー。
  11. 　１ｑ２３染色体領域、３ｐ２５染色体領域、８ｑ２２染色体領域、及び２０ｑ１３染色体領域に対する特異的プローブ４種以上を含む、
    　請求項１０に記載の腫瘍検出用マーカー。
  12. 　前記染色体プローブが、互いに異なる色で蛍光標識されている、
    　請求項１～１１のいずれか一項に記載の腫瘍検出用マーカー。
  13. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載される腫瘍検出用マーカーを含む、
    　腫瘍検出用キット。
  14. 　染色体プローブを蛍光標識できる蛍光色素をさらに含む、
    　請求項１３に記載の腫瘍検出用キット。
  15. 　ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーをさらに含む、
    　請求項１３又は１４に記載の腫瘍検出用キット。
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