EP0360822A1 - Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen flüssigkeit auf zellulare onkogen-transkripte bzw. deren fragmente - Google Patents

Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen flüssigkeit auf zellulare onkogen-transkripte bzw. deren fragmente

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EP0360822A1
EP0360822A1 EP88904461A EP88904461A EP0360822A1 EP 0360822 A1 EP0360822 A1 EP 0360822A1 EP 88904461 A EP88904461 A EP 88904461A EP 88904461 A EP88904461 A EP 88904461A EP 0360822 A1 EP0360822 A1 EP 0360822A1
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EP
European Patent Office
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rna
labeled
oncogene
dna
product
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EP88904461A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Viktor Dr. Dr. Med. Balazs
Margit BALAZS-FRÖHLICH
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BALAZS, VIKTOR, DR. DR. MED.
BALAZS-FROEHLICH, MARGIT
Original Assignee
Individual
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of cellular oncogene transcripts, or their fragments, according to the preamble of claim 1, it relates to a malignancy test.
  • RNA transcripts Methods for detecting cellular oncogene (RNA) transcripts, including separation of RNA, mRNA, denaturation and hybridization, and the like are known in the field of molecular biological research. Reproducibility, reliability, specificity and extreme sensitivity of the in vitro hybridization between DNA and DNA, as well as between RNA and DNA are known from the literature, which has found application as a standard method for specific problem solutions.
  • RNA oncogene
  • RNA hybridization with DNA using a solid substrate for immobilization has been known since 1965 (J. Mol. Biol. 12: 829-842; 1965). Since then, several improvements to this method and the methods of separating RNA from cells and tissues have been published.
  • RNA or poly (A) RNA (iriRNA) by the living malignant cells, as the experiments with in vitro grown malignant cell cultures have already proven.
  • RNA in particular the ⁇ lRNA from the cell nucleus
  • cancer-specific products such as "cancer-associated protein etc.
  • RNA form (ds for double-stranded RNA).
  • the causes and circumstances mentioned above are responsible for the changed RNA content in the blood plasma in different combinations and different dimensions in the different types and stages of malignant states.
  • the increased transcription of cellular oncogenes is the basic requirement, but not enough.
  • precancerous conditions such as polyposis of the colon, for example, the transcription of one of the cellular oncogenes can even be increased 90-fold, but no RNA transcript of the highly activated oncogene appears in the blood plasma.
  • Others and several of the circumstances noted above that are characteristic of the malignant states must be present and cooperative at the same time.
  • RNA hybridization in vitro is not only extremely specific, but also highly sensitive. 1 pg of RNA can already be detected in a complex of RNA molecules.
  • the normal values showed a large spread and so there can be a significant overlap of the normal and pathological values.
  • studies with monoclonal antibodies against an oncogene polypeptide showed positive values in 25-29% of the malignant and in 6-9% of the non-malignant cases.
  • a very significant disadvantage of this like any other method, which is based on the immunological detection of the proteins or polypeptides of cancer cell origin, is that the presence of specific antibodies which are formed by the host or are introduced for therapeutic purposes has unrealistic results cause and can be a significant disruptive factor at all.
  • the invention is based on the object of specifying a method for the detection of the RNA transcripts, or their fragments, of cellular oncogenes in an acellular biological fluid, such as blood plasma, as a malignancy test. Since it is necessary for this to first separate the RNA from the blood plasma, it is a further object of the invention to provide a reliable method for separating the RNA from the acellular body fluid, e.g. B. to indicate the blood plasma.
  • This object is achieved by a method according to claim 1.
  • reliable, effective, potent RNase inhibitors by avoiding the mixing of the ubiquitous, highly resistant RNase enzyme from exogenous sources throughout the process, by treating the blood plasma to separate the RNA Content, by immobilizing the RNA in denatured form on a solid substrate and by contacting the solid substrate with the labeled denatured oncogene DNA around them when the plasma RNA and oncogene DNA have complementary sequence (s) bind (to hybridize), a reliable detection method is achieved. The fact of hybridization is determined by the detection of the labeling substance, or in the case of radioisotopic labeling by autoradiography.
  • the total plasma RNA such as the RNA, mRNA, or fragments thereof which have entered the bloodstream, are isolated from the blood plasma of patients with malignant and non-malignant diseases and the presence of the RNA transcripts of cellular oncogenes with in vitro mole ⁇ molecular hybridization examined.
  • RNA transcripts, or their fragments, of cellular oncogenes from human blood plasma is a universal malignancy test for the detection of malignant processes, (as a confirmation test), for early detection of malignancy ( as an addiction test) and for early detection of recurrences and metastases after therapeutic measures (as a follow-up test).
  • RNA RNA that can differentiate between malignancy and non-malignancy origin.
  • Messencjer activity of the RNA, tested in the cell-free protein-synthesizing system has proven to be unsuitable for this, because this activity could be observed in both malignant and non-malignant states.
  • this differentiation could be achieved by the presence of the oncogene transcripts or their fragments in the plasma RNA.
  • plasma RNAs from malignant cases were found to contain oncogene transcripts or their fragments, while practically none of them were detectable from plasma RNAs from non-malignant states. Further research confirmed this tendency and indicated that this method is capable of smaller amounts of
  • the most important advantage of this invention is that it specifies a method that can serve as a universal malignancy test: This test is based on the basic principles of the malignant transformation by activating cellular oncogenes and the special features of the malignant cells and tumors.
  • the second significant advantage of this method is the high sensitivity (1-5 pg / ml).
  • Another major advantage of the invention in contrast to II tests, is that the specific antibodies which have been formed by the host or which have been introduced into the bloodstream for therapeutic purposes cannot influence the results.
  • the method according to the invention has the advantage that there is no interference with the result or specific antibodies.
  • the basic character of malignant processes and their behavior in the host is largely determined by which oncogenes have been activated (genetic scripture, cell oncogene profile). Up to now, this could only be determined histologically in tumor tissues by in vitro nucleic acid hybridization.
  • the malignancy test according to the invention can provide this information at least partially from the blood plasma (plasma oncogene profile) long before the relatively small tumor cell mass can be visualized and reached for histological examinations.
  • New oncogenes can be activated during the malignant processes in vitro as well as during the existence of the malignant disease in patients, which can lead to a significant progression of the malignancy. This risk can be detected early with the malignancy test during the follow-up by identifying a new oncogene transcript from the blood plasma that was not previously present in the plasma.
  • an amplification amplification the activated oncogenes occur, which can cause a substantially increased aggressiveness and progression of the malignant cells.
  • the occurrence of such an enhancement can be observed early on during the follow-up with the quantitative maglignity test.
  • This subclone can be recognized at an early stage before it has been able to spread and could worsen the prognosis.
  • This subclone can be influenced in the early stage by specific immunotherapy, immunochemotherapy, or by preventing the activity of the oncogene RNA transcripts, etc. and possibly destroyed.
  • a - amplification of the cellular oncogenes occurs either in the primary tumor or during the progression and diversification of the malignant cells and in approximately 30% to 50% of the malignant diseases.
  • Gene products of the activated cellular oncogenes play an important, even vital function in the transformed malignant cells, many of which act as protein kinase enzymes in the cell membrane.
  • the change or impairment of this function by attacking the malignant cells in an immunospecific manner, targeting their oncogene products with monoclonal antibodies alone or in conjunction with substances having a radioactive or chemotherapeutic effect, can lead to a healing effect before the tumor cell mass has been able to spread.
  • a plasma oncogene profile with early detection shows the specific therapy options.
  • the monitoring of the course with new oncogene samples makes it possible to recognize newly occurring oncogene transcripts.
  • a quantitative malignancy test during the course of the disease offers an early detection of a possible amplification of a cellular oncogene and gives specific information on how to suppress or destroy this new subclone of malignant cells before a larger progression or aggressiveness is caused.
  • the freshly obtained blood is immediately mixed with an RNase enzyme-inhibiting substance and the plasma quickly separated.
  • the blood plasma is mixed in the presence of the RNase inhibitor with a detergent such as sodium duodecyl sulfate (SDS) and a proteolytic enzyme such as Proteinase K (Boehringer, Mannheim) with an aqueous medium and is then at 37 degrees C for 1 to 3 h in one Buffer solution (pH 7.5) incubated. It is then mixed with 4 M guanidinium isothiocyanate to effect protein denaturation and the cleavage of the proteins from the RNA. The mixture is then extracted with organic solvents such as phenol and chloroform at 60 ° C.
  • RNA is precipitated by mixing with two vol ethanol at -20 degrees C.
  • the RNA is dissolved in Tris.Cl buffer (pH 7.4) with EDTA and SDS and treated with proteinase K at 37 degrees C for one hour in the presence of RNase heaters .
  • the RNA precipitated with ethanol washed and stored in 70% ethanol at -70 degrees C.
  • Either the poly (A) RNA is selected from the RNA by affinity adsorption and elution methods with oligo (dT) cellulose, or the RNA is subjected to a DNase enzyme treatment in order to degrade and remove the DN that may be present.
  • the denatured RNA or the poly (A) RNA is applied to pure nitrocellulose paper as a solid substrate and is treated for 2 hours at 80 ° C. in a vacuum oven in order to cause the RNA to bind on the solid substrate.
  • the baked solid substrate is then treated to prevent further binding of nucleic acids to the solid substrate.
  • An amount of purified molecularly cloned DNA containing the sequence as a code for oncogene is labeled either radioisotopically or non-radioisotopically.
  • the radioisotopic labeling is carried out by nick translation according to Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) performed to achieve high specific activity. For this
  • Radioisotopes that can be used in procedures are, for example,
  • Oncogene DNA samples labeled or unlabeled, are commercially available (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).
  • the labeled oncogene DNA sample is denatured and contacted in a solution with the solid substrate on which the plasma RNA is immobilized to hybridize therewith. This causes the labeled oncogene DNA sample to be linked (hybridized) by hydrogen compounds to the complementary sequence (s) of the plasma RNA which is immobilized on the solid substrate.
  • the solid substrate is washed to remove non-specifically bound labeled oncogene DNA sample.
  • the solid substrate is then subjected to analysis to detect the hybridization between the plasma RNA and the labeled oncogene DNA sample.
  • this is assaulted by autoradiography, in the case of biotin labeling by biotin detection using an enzyme affinity test by color reaction.
  • a mixture of 0.2 M Tris.Cl (pH.7.5); 25 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 0.3 M NaCl; 2% (wt / full sodium duodecyl sulfate (SDS) and proteinase K (final concentration 200 micrograms / ml) were added and incubated for 1 to 3 h in the presence of RNase inhibitors at 37 ° C. Then mixed with 4 M guanidinium isothiocyanate. The slimy mixture is drawn into a syringe equipped with an 18 gr. Needle and expelled vigorously until the viscosity is significantly reduced at 60 degrees C.
  • RNA is dissolved in Tris.Cl buffer (0.1 M, pH 7.4) buffer solution which still contains 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS and RNase inhibitor and with Proteinase K (final concentration 200 micrograms) / ml) incubated at 37 degrees C for 1 h. Then it is extracted twice with phenol and chloroform at 60 degrees C and with chloroform at room temperature. The RNA is precipitated from the aqueous phase with ethanol, washed with 70% ethanol and each dissolved in the necessary solution. The extraction of the RNA is essential and significantly facilitated by the use of the "Nucleic Acid Extractor" instrument (Applied Biosystem, Foster City, Ca. USA). The procedure written above is easily adaptable for this instrument.
  • Either the poly (A) RNA is selected from the isolated plasma RNA with oligo (dT) cellulose by "batch" absorption and elution, or we subject the plasma RNA to a DNase enzyme treatment in order to degrade the DNA which may be present.
  • the plasma RNA is dissolved in sterile water, incubated at 65 degrees C for 10 min and mixed with 2 x loading buffer and cooled to temperature (loading buffer: 20 mM Tris. Cl, pH 7.6; 0.5 M NaCl; 1 mM EDTA;. 0.1% SDS) then is mixed with 0.3 g (Trok- kensolv) "of oligo (dT) -cellulose for each 0.5 mg of RNA, at 1500 g for 4 Centrifuged min at 15 degrees C and the oligo (dT) cellulose washed 4-5 times with 5 ml loading buffer (at room temperature). The poly (A) + RNA is washed with 1 ml of sterile 10 mM Tris. Cl (pH 7.5; 1mM EDTA; 0.05% SDS. Eluted.
  • Na acetate (3 M pH 5.2) is mixed to 0.3 M and the RNA precipitated with 2.2 vol ethanol at -20 ° C. and the precipitate washed with 70% ethanol.
  • the plasma RNA is subjected to a DNase enzyme treatment.
  • RNase-free DNase enzyme and MgCl_ are mixed to the plasma RNA solution (50 mM Tris. Cl, pH 7.5 in 1 mM EDTA) and in the presence of RNase inhibitors at 37 degrees C for 30 min incubated, then extracted with phenol / chloroform and in the presence of Na acetate (pH 5.2, 0.3 M) the RNA is precipitated with 70% ethanol at -20 degrees C.
  • Biotin-labeled DNA can be isolated with 2-butanol extraction with ethanol precipitation and can be stored as a stable labeled sample for half a year in 0.1 M EDTA at -15 degrees C.
  • the plasma RNA or the poly (A) RNA is subjected to a treatment, the so-called prehybridization, before the hybridization.
  • the RNA solution or the RNA dilutions are denatured first by incubating the 65 degrees C for 15 min and then by rapid cooling.
  • the RNA is then applied to the solid substrate, such as nitrocellulose paper, which was previously equilibrated with 20 x NaCl / Cit and then dried.
  • a corresponding volume of the denatured RNA solution i is a well of the microfilter plate (Bio-Dot Microfiltration Apparatus, Bio-Rad Richmond, ca. 94804 USA; Minifold Filtration & Incubation Plate, Schleicher & Schuel, Keene, New Hampshire 03431, USA and filtered under gentle vacuum to form a spot of 3.0 mm in diameter, quantity of RNA applied: 10 micrograms, the poly (A) RNA: 2 micrograms
  • nitrocellulose paper is then dried in a vacuum oven at 80 ° C. for 2 hours. After baking, in a solution (prehybridization buffer): formamides (50% vol / vol); 5 x NaCl / Cit; 50 M sodium phosphate pH 6.5; sonicated, denatured Salmon sperm DNA (250 micrograms / ml) and 0.02% per bovine serum albumin (BSA), Ficoll and polyvinylpyrrolidone, incubated for 8-20 h at 42 ° C.
  • prehybridization buffer formamides (50% vol / vol); 5 x NaCl / Cit; 50 M sodium phosphate pH 6.5; sonicated, denatured Salmon sperm DNA (250 micrograms / ml) and 0.02% per bovine serum albumin (BSA), Ficoll and polyvinylpyrrolidone
  • the radioisotopically labeled human oncogene DNA sample (2 x 10 cpm / ml) is only denatured at 100 degrees C for 5-10 min, cooled rapidly and becomes the solution (prehybridization buffer) which immobilized the nitrocellulose paper with the immobilized product Contains mixed plasma RNA.
  • the hybridization is effected at 42 degrees C for 20 hours.
  • the nitrocellulose paper is inserted between clear acetate foils and brought close to a film sensitive to the X-rays.
  • An intensifying screen is attached to the opposite side and packed light-tight. After a certain time, the film is developed. The presence of the RNA transcripts or their fragments that hybridized with the oncogene DNA sample is determined by the presence of a spot on the film.
  • the DNA samples are applied in 0.1 M EDTA, otherwise the prehybridization is carried out as with radioisotopically labeled DNA samples, but the The duration of the pre-hybridization is shorter: 4-8 h.
  • the hybridization is carried out as with radioactive samples, but at a higher temperature (55 degrees C) for 20 h in a solution: 4 vol.
  • Prehybridization buffer 1 volume of about 0.5 g / ml sodium dextran sulfate and 20 ng / ml biotin-labeled DNA sample (oncogene DNA sample).
  • the dried nitrocellulose papers are at 42 degrees C for 30 min in STMT buffer (1 M NaCl; 0.1 M Tris. Cl. PH 7.5; 2 mM MgCl 2 0.05% v / v Triton X-100) with 30 mg of Bovine serum albumin incubated. After the nitrocellose paper has dried, it is incubated at room temperature for 10 min in SIMT buffer with 1 microgram / ml Sigma Avidin-alkaline phosphatase complex, then it is shaken frequently in STMT buffer (3 x 10 min) STM buffer (1 M NaCl, Tris. Cl pH 9.5, 5 mM MgCl incubated for 2 x 5 min
  • the nitrocellulose paper is darkened at room temperature with substrate solution (STM buffer but only with 0.1 M NaCl) with 0. mg / ml nitro-blue-tetrazolium, 0.17 mg / ml 5-br ⁇ no-4-chloro-3-indolyl Phophate and 0.33% v / v N, N-dimethylformamide mixed.
  • substrate solution STM buffer but only with 0.1 M NaCl
  • the reaction is carried out by washing the nitrocellulose paper with 10 mM Tris.Cl pH 7.5; -1 mM EDTA terminated.
  • the detection of the presence of oncogene RNA transcripts or fragments is positive if the plasma RNA or the poly (A) RNA has a positive signal at least with one of the oncogene DNA samples (above the background or above negative control).
  • the radioactive sample a dark spot appears on the film according to autoradiography in the case of biotin-labeled samples as a spot with a color reaction.
  • D Malignancy test is negative if no RNA is isolated from the blood plasma or if the blood plasma RNA does not give a positive signal with any of the oncogene samples.
  • the hybridized DNA sample can be washed at 65 degrees C for 1 - 2 h with 0.1 - 0.05 x wash buffer (1 x wash buffer: 50 mM Tris.Cl. pH 8.0; 0.2 mM EDTA; 0.5% sodium pyrophosphate and 0.02% per BSA, Ficoll , Polyvinyl pyrrolidone) can be removed.
  • the treatment of the nitrocellulose paper, that is to say the prehybridization and the re-hybridization is carried out as above (original).
  • RNA transcripts, or their fragments, of cellular oncogenes in human blood plasma comprises several favorable reaction methods and steps in order to result in a high reliability and reproducibility.
  • the use of reliable RNase-inhibiting substances already prevents the possible degradation of RNA when the blood is drawn.
  • the risk of mixing (admixing) the ubiquitous, highly resistant RNase from exogenous sources is mitigated throughout the entire process by using baked glassware, autoclaved solutions, baked spatulas, tools, dry chemical preparations, and glass distilled Autoclave-sterilized water and wearing gloves reduced during all phases and stages of the preparation and examination process.
  • Proteinase K facilitates the removal of the proteins, the guanidinite-isothiocyanate treatment, the denaturation of the proteins and the cleavage of the RNA-protein complexes.
  • the rest of the proteins are removed by organic extraction.
  • the degradation and removal of the DNA is achieved by DNase treatment, because otherwise the DNA could interfere with the hybridization.
  • Baking ensures the reliability of the tight binding of the RNA to the nitrocellulose filter. Treating the nitrocellulose filter after baking prevents unspecific binding and also ensures reliability. Washing the nitrocellulose filter after hybridization removes unnecessary, or non-specifically bound, labeled oncogene DNA samples and also contributes to reliability.
  • a semi-quantitative evaluation can also be carried out.
  • the intensity of the black spot on the X-ray film is measured by densitometry and quantitative comparisons can be made. (Reflectance Densitcmeter, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA). Quantitative test:
  • the relative amount can be determined by the dilution method.
  • a 1: 2 serial dilution is made from the blood plasma RNA and each dilution is tested by hybridization.
  • the highest dilution from which a positive signal is still emitted is the titer.
  • quantitative comparisons can be made during the observation period. In this way you can e.g. B. observe the amplification of one of the activated oncogenes: If the titer of an oncogene is increased disproportionately compared to other oncogenes during the follow-up, this means the amplification of this oncogene.
  • Radioactive ogenogen samples with higher activity or according to Leary et al . (Proc . Natl Acad. Sci. USA 80: 4045 4049, 1983) use oncogene samples and enzyme affinity tests labeled with biotin and use them - if possible - with from the plasma RNA selek
  • Hybridized poly (A) RNA In this way a sensitivity of pg / ml RNA can be achieved. Otherwise the use for hybridization is
  • a positive test in the case of a malignant disease is usually obtained if the plasma RNA hybridizes only with oncogene group A (see above), because these oncogenes are activated in all or almost all types of malignancy. It is less common to extend hybridization to Group B.
  • oncogenes are particularly often activated in this cancer. New oncogenes are still being discovered. This can also be used as a sample if necessary use, as well as oligonucleotide samples for the detection of oncogenes activated by point mutation.
  • RNA in denatured form, free in solution is mixed with the labeled oncogene DNA sample, incubated for 1-2 hours at 70 ° C. in the presence of the nuclease inhibitors. Then hydroxyapatite is added for 5 min. incubated at 70 degrees C to adsorb the product of the hybridization (RNA-labeled oncogene-DNA complexes).
  • the hydroapatite fraction thus formed is separated as sediment by centrifugation.
  • the sediment is washed (for 5 min, at 70 degrees C) and the product in the hydroxyapatite fraction is determined based on the label.

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Description

Verfahren zur Untersuchung einer azellularen biologischen Flüssigkeit auf zellulare Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente .
B e s c h r e i b u n g
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularen Onko- gen-Transkripten, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruch 1, sie bezieht sich auf einen Malignitätstest.
Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen- (-RNA) -Transkipten einschließlich Trennung von RNA, mRNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl . sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung be¬ kannt. Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Spezifizität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA, sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardme¬ thode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.
Die RNA Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol . 12: 829-842; 1965) . Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der RNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.
Die Aktivierung von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch er¬ höhte Transkription oder durch Mutation wird allgemein als ein sehr wichtiger Schritt in der Verursachung, Aufrechterhaltung und in der Progression der bösartigen Transformationen betrachtet. Diese Erhöhung der Transkription kann mehrfach, sogar das 100-fach der normalen Werte erreichen.
Die folgenden wichtigsten Hauptursachen bzw. Umstände kann man als maßgebend betrachten, die für den veränderten RNA-Inhalt des Blutplas¬ mas in bösartigen Zuständen u. a. verantwortlich sein können:
1. Erhöhte Transkription von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen (siehe oben)
2. Gesteigerter Zellumsatz in bösartigen Zuständen
3. Sekretion von RNA bzw. Poly(A) RNA (iriRNA) durch die lebenden bösar¬ tigen Zellen, wie das Experimente mit in vitro gezüchteten malignen Zellkulturen schon bewiesen haben.
4. Erhöhte Mobilisierung der RNA, insbesondere der πlRNA aus dem Zell¬ kern durch krebsspezifische Produkte wie "Cancer-Associated Protein etc.
5. Erhöhte RNA-Densität in peripheralen Zonen dermalignen Zellen.
6. Erhöhte Leckage der lebendigen bösartigen Zellen, aber besonders sterbenden und nekrotischen bösartigen Zellen.
7. Gesteigerte Sterberate der bösartigen Zellen.
8. Erhöhte Vaskularisation der malignen Tumore.
9. Erhöhte Permeabilität der Kapillaren und der Gefäße in den bösarti¬ gen Tumoren für Makromoleküle und Zellekαnponenten wegen der unge¬ eigneten und unvollständigen Entwicklung der sonst reichlich vorhan denen Gefäße.
10. Akkumulation der bösartigen Zellen, hauptsächlich sterbenden Zellen in den Kapillaren und Arteriolen maligner Tu»,ore, so können Zellel mente leichter direkt in die Blutbahn gelangen.
11. Erhöhte Resistenz der RNA, mRNA, und deren Fragmente gegen degra¬ dierende Enzyme wie RNase wegen u. a.
a) der Bindung an Proteine, Mukoproteine, Lipoproteine bzw., Schutz durch eine Lipoproteinhülle, und b) Anwesenheit der RNA bzw. deren Fragmente in ds.RNA Form (ds für Doppeltstrang-RNA) .
12. Möglicher längerer Aufenthalt der RNA bzw. deren Fragmente in der Blutbahn wegen Ausschöpfung der Aufräumungsmechanismen (Clearance- mechanismen) , die für die Entfernung der RNA bzw. deren Fragmente verantwortlich wären, möglich wegen der ständigen "Überflutung" der Blutbahn mit diesen Substanzen, in der bösartigen Zuständen, oder wegen anderer, noch nicht bekannter Ursachen.
Die oben erwähnten Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombina¬ tionen und verschiedenen Maßen in den verschiedenen Sorten und Stadien von bösartigen Zuständen für den veränderten RNA Inhalt im Blutplasma verantwortlich. Die erhöhte Transkription von zellularen Onko genen ist die grundlegende Voraussetzung, aber allein nicht genügend. In präkanzerosen Zuständen, wie in Polypose des Kolons kann zum Beispiel di Transkription einer der zellularen Onkogene sogar 90-fach erhöht sein, trotzdem erscheint kein RNA-Transkript des so hoch aktivierten Onkogens im Blutplasma. Andere und mehrere von den oben angegebenen, für die bösartigen Zustände charakteristischen umständen müssen gleichzeitig anwesend und mitwirkend sein.
Die molekulare Hybridisierung in vitro ist nicht nur äußerst spezifisch, sondern auch hochgradig sensitiv. Es kann bereits 1 pg RNA in einer K nplex-Population von RNA Molekülen nachgewiesen werden.
Da die Früherkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universa1-Malig- nitätstest notwendig, der im breiten Spektrum bösartiger Krankheiten schon kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann, die durch die üblichen heutigen diagnostischen Maßnahmen noch nicht entdeckt werden können.
Einen derartigen universalen Suchtest gibt es noch nicht. Nur zwei Ver¬ fahren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Feto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzincm und das carcinoe bryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems, die CEA produzieren.
In 1985 wurde ein Flotationsverfahren nach 16 stündigem Ultrazentrifu- gieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische Lipopro- tein-Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A) RNA Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber in präkanzerosen Zuständen, in benignen monoklonalen Ga mopathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfahren ist relativ gering, 0.2 mikrograπm/ml, im Vergleich zu dem hochgradig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipopro- tein Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma-RNA ist, die aus den bösar¬ tigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind. (Gesamt-Plasma-RNA bösartigen Ursprungs) . Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flotationsverfahrens.
Jüngstens wurden auch zwei Eπmuntests als diagnostischer Krebs-Tests vorgeschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten "Cancer Associated Protein" (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Ver¬ wendung als ein Krebstest (Imtiuntest) .
In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels ürmunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchunge haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und pathologischen Werten nicht sehr groß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produ- ziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurteilung m jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, wa ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist.
Ferner zeigten die normalen Werte eine große Streuung und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorko men. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nu ein Onkogen-Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nicht-bösartigen Fälle.
Ein sehr wesentlicher Nachteil dieses wie jeder anderen Methode, die au dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebs¬ zellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Anti¬ körpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführ werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeu¬ tender Störfaktor sein können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis de RNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azellularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma als Maligni- tätstest anzugeben. Da es hierfür notwendig ist, erst die RNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der RNA aus der azellularen Körper flüssigkeit, z. B. dem Blutplasma anzugeben.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1. Durch di weitere Verwendung zuverlässiger, wirkungsvoller, potenter RNase-Hemmer durch Vermeidung der Vermischung des ubiquitären, hochgradig resistente RNase Enzyms aus exogenen Quellen während des ganzen Verfahrens, durch Behandlung des Blutplasmas zur Trennung des RNA-Inhaltes, durch Immobi¬ lisierung der RNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-RNA und Onkogen-DNA komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybridisieren) , wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Die Tatsache der Hybridisie¬ rung wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestimmt. Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma RNA wie die in die Blutbahn gelangte RNA, mRNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patien¬ ten mit bösartigen und nicht bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwesenheit der RNA-Transkripte zellularer Onkogene mit in vitro mole¬ kularer Hybridisierung untersucht.
Die praktische Verwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der RNA- Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen aus mensch¬ lichem Blutplasma ist ein Universal-Malignitatstest für den Nachweis bös¬ artiger Prozesse, (als Bestätigungstest) , für Früherkennung der Bösar¬ tigkeit (als Suchtest) und für Früherfassung der Rezidiven und Metastasen nach Therapiemaßnahmen (als Verlaufskontrolltest) .
Erfindungsgemäß wurde ein Merkmal oder eine Komponente für Blutplasma- RNA gefunden, das zwischen Bosartigkeits- und Nichtbδsartigkeitsursprung differenzieren kann. Messencjer-Äktivität der RNA, getestet im zell¬ freien protein-synthetisierenden System hat sich dafür als nicht geeig¬ net erwiesen, weil diese Aktivität in bösartigen sowie in nicht-bösarti¬ gen Zuständen beobachtet werden konnte. Durch die Anwesenheit der Onko- gen-Transkripte bzw. deren Fragmente in der Plasma-RNA konnte aber diese Differenzierung erreicht werden. Schon bei den ersten blind-ausgeführten Versuchsreihen wurde praktisch in allen Plasma-RNAs aus bösartigen Fäl¬ len Onkogen-Transkripten bzw. deren Fragmente entdeckt, während sie praktisch in keinen aus Plasma-RNAs aus nicht-bösartigen Zuständen nach¬ weisbar waren. Weitere Untersuchungen bestätigten diese Tendenz und wiesen darauf hin, daß dieses Verfahren fähig ist, kleinere Mengen von
* bösartigen Zellen, die durch heute übliche diagnostische Maßnahmen noch nicht erfaßbar sind, zu erkennen.
Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren angibt, das als Universal-Malignitatstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivie¬ rung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore. Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfind¬ lichkeit (1-5 pg/ml) .
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Ii iuntests, daß die spezifischen Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder die für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.
Gegenüber Nachweisverfahren, die auf immunologischem Nachweis der Pro¬ teine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfin¬ dungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses du spezifische Antikörper entfällt.
Der Nachweis zellularer Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente aus d Blutplasma bietet über den eigentlichen Malignitätstest hinaus weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:
1. a. Der Grundcharakter maligner Prozesse und ihr Verhalten im Wirt is wesentlich dadurch bestimmt, welche Onkogene aktiviert wurden (Ge netic Scripture, Zell-Onkogenprofil) . Dies konnte bisher nur hin- stologisch in Tumorgeweben durch in vitro Nukleinsäure-Hybridisie rung bestimmt werden. Der erfindungsgemäße Malignitätstest kann diese Auskunft zumindest teilweise aus dem Blutplasma liefern (Plasma-Onkogen-Profil) , lange bevor die relativ kleine Tumorzell masse Visualisierbar und für histologische Untersuchungen erreich bar ist.
b. Während der malignen Prozesse in vitro sowie während des Bestehen der bösartigen Krankheit in Patienten können neue Onkogene zusätz lich aktiviert werden, was zu einer bedeutenden Progression der Bösartigkeit führen kann. Diese Gefahr kann mit dem Malignitätste während der Verlaufskontrolle frühzeitig dadurch erkannt werden, daß ein neues Onkogen-Transkript aus dem Blutplasma identifiziert wird, welches bisher im Plasma nicht vorhanden war.
c. Während des Krankheitsablaufs kann eine Verstärkung (Amplifikatio der aktivierten Onkogene auftreten, wodurch eine wesentlich erhöh¬ te Aggressivität und Progression der bösartigen Zellen verursacht werden kann. Das Auftreten einer solchen Verstärkung kann mit dem quantitativ ausgeführten Maglignitätstest schon frühzeitig während der Verlaufskontrolle beobachtet werden. Das bedeutet, daß ein Subklon der Tumorzellen, der das amplifizierte Onkogen hat, früh¬ zeitig, bevor er sich ausbreiten konnte und die Prognose sehr verschlechtern könnte, erkannt werden kann. Dieser Subklon kann im Frühstadium durch spezifische Immuntherapie, Immonochemotherapie, oder durch die Verhinderung der Aktivität der Onkogen-RNA-Trans- kripte etc. beeinflußt und gegebenenfalls vernichtet werden. A - plifikation der zellularen Onkogene (auf das Zwei- bis Hundertfa¬ che) tritt entweder im Primärtumor oder während der Progression und Diversifikation der bösartigen Zellen und in ungefähr 30 % bis 50 % der bösartigen Krankheiten auf.
2. Genprodukte der aktivierten zellularen Onkogene spielen eine wichtige, sogar vitale Funktion in den transformierten bösartigen Zellen, viele von ihnen fungieren als Protein-Kinase-Enzyme in der Zellmembran.
Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogen- produkte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radio¬ aktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Thera- piemδglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben er¬ möglicht es, neu aufgetretene Onkogen-Transkripte zu erkennen. Ein quantitativ durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krank¬ heitsverlaufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zellularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man die¬ sen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.
Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert. Das frischgewonnene Blut wird sofort mit einer RNase Enzym-hemmenden Substanz gemischt und das Plasma schnell separiert. Dann wird das Blutplasma in Anwesenheit d RNase Hemmers mit einem Detergens, wie Natriumduodecylsulfat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer, Mannheim) mi einem wässrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 1 bis 3 h in einer Pufferlösung (pH 7.5) inkubiert. Danach wird mit 4 M Guanidinium-isothiocyanat vermischt, um die Proteindenaturierung sowie die Abspaltung der Proteine von der RNA zu bewirken. Danach wird mit organischem Lösungsmittel wie Phenol und Chloroform bei 60 Grad C extra hiert um der organischen Phase den größten Anteil der Proteine zu ent¬ ziehen, was zu einer wässrigen Phase führt, die im wesentlichen die gesamte RNA enthält. Diese wässrige Phase wird mit Phenol/Chloroform reextrahiert. Dann wird mit Chloroform noch zweimal extrahiert. Die RNA wird durch Vermischung mit zwei vol Äthanol bei -20 Grad C precipitiert Die RNA wird in Tris.Cl Puffer (pH 7.4) mit EDTA und SDS aufgelöst und mit Proteinase K bei 37 Grad C für eine h in Anwesenheit von RNase- Heirmern behandelt. Dann wird mit Phenol und Chloroform zweimal extra- . hiert, bei 60 Grad C. Bei-Zimmertemperatur wird zweimal mit Chloroform extrahiert, mit Äthanol die RNA precipitiert, gewaschen und in 70% Äthanol bei -70 Grad C aufbewahrt.
Entweder wird die PoIy(A) RNA aus der RNA durch Affinitätsadsorptions-u Elutionsverfahren mit oligo(dT) Cellulose selektiert, oder wird die RNA einer DNase Enzym Behandlung unterzogen, um die eventuell vorhandene DN abzubauen und zu entfernen.
Die denaturierte RNA oder die Poly(A) RNA wird auf reines Nitrocellu- lose-Papier als festes Substrat aufgetragen und um eine Im oblisierung der RNA auf dem festen Substrat zu bewirken, wird für 2 h bei 80 Grad C im Vakuumofen behandelt. Das gebackene feste Substrat wird anschließend behandelt, um ein weiteres Binden von Nukleinsäuren an das feste Substra zu verhindern.
Eine Menge von gereinigten molekularisch klonierten DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht- radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113:237-251, 1977) durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese
Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise beson-
__P . . τ125 _131 , „3 ders 32 aber auch I , I und H .
Für die nicht-radioisotopische Markierung der Onkogen-DNA Proben wurde beispielsweise Biotin (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:6633-6637, 1981) un jüngstens Photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985) verwen¬ det. Die Markierung mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kcπmerziell angeboten (BRESA, Adelaide, South Australia) .
Onkogen-DNA Proben, markiert oder unmarkiert, sind kcπmerziell erhältlic (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA) .
Die markierte Onkogen-DNA Probe wird denaturiert und in einer Lösung mi dem festen Substrat, auf dem die Plasma-RNA immobilisiert ist, in Kontak gebracht, um damit zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen-DNA Probe durch Wasserstoffverbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der Plasma-RNA, die auf dem festen Substrat immobilisiert ist, verbunden (hybridisiert) wird.
Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um nicht spezifisch gebundene markierte Onkogen-DNA Probe zu entfernen.
Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, um das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-RNA und der markierte Onkogen-DNA Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der Biotin-Markierung durch Biotin-Nachweis mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestürmt.
Das folgende Beispiel dient zur.weiteren Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken. Beispiel
Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen und sofort mit einer Lösung von RNase Enzym-hemmender Subtanz wie RNasin (Prc ega Biotec. Maidison, Wi. USA) (Endkonzentration: 2000 E/ml) oder eines Vanadyl- ribonucleosid Komplexes (Bethesda Research Lab. Gaithersburgh, MD. USA) (Endkonzentration: 10 mM) vermischt. Das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg-Plastik-Zentrifugen-Röhrchen 5 ml Blutplasma pipettiert, eines wird tiefgekühlt für eventuelle Wiede holung, oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.
Es wird ein Gemisch aus 0.2 M Tris.Cl (pH.7.5) ; 25 mM Äthylendiamino- tetraessigsäure (EDTA) ; 0.3 M NaCl; 2% (Gew/Voll_Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 200 mikrogramm/ml) hinzugefügt und in der Anwesenheit von RNase-Hemmern bei 37 Grad C für 1 bis 3 h in kubiert. Dann wird mit 4 M Guanidinium-isöthiocyanat gemischt. Bei 60 Grad C wird die schleimige Mixtur in eine Spritze, die mit einer 18 Gr. Nadel versehen ist, aufgezogen und kräftig zurück ausgestoßen, bis die Viskosität wesentlich vermindert ist. Anschließend wird ein gleiches Volumen Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) eingemischt und bei 60 Grad C für 10 bis 15 min durch kräftiges Schütteln extrahiert. Nach Zentrifugieren wird die wassrige Phase noch zweimal mit Phenol-Chlorofo und dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die wassrige Phase wird mit Vol Äthanol vermischt und bei -20 Grad C für 1 bis 5 h wird die RNA precipitiert.
Nach Zentrifugieren wird die RNA in Tris.Cl Puffer (0.1 M, pH 7.4) Pufferlösung, die noch 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS und RNase-Hem er enthält, aufgelöst und mit Proteinase K (Endkonzentration 200 mikro¬ gramm/ml) bei 37 Grad C für 1 h inkubiert. Danach wird mit Phenol und Chloroform bei 60 Grad C und mit Chloroform bei Zimmertemperatur je zweimal extrahiert. Aus der wässrigen Phase wird die RNA mit Äthanol precipitiert, mit 70% Äthanol gewaschen und jeweils in der notwendigen Lösung aufgelöst. Die Extrahierung der RNA ist wesentlich und bedeutend erleichtert durch die Anwendung des Instruments "Nucleic Acid Extractor" (Applied Bio¬ system, Foster City, Ca. USA) . Das oben geschriebene Verfahren ist leich adaptierbar für dieses Instrument.
Entweder wird die Poly(A) RNA aus der isolierten Plasma -RNA mit Oligo (dT)-Cellulose durch "Batch" Absorption und Elution selektiert, oder wir die Plasma-RNA einer DNase Enzym Behandlung unterzogen, um die eventuell vorhandene DNA abzubauen.
Für"die Selektion der Poly(A) RNA wird die Plasma-RNA in Steril-Wasser gelöst, bei 65 Grad C für 10 min inkubiert und mit 2 x Loading-Puffer vermischt und auf Ziπrnertemperatur gekühlt (Loading-Puffer: 20 mM Tris. Cl, pH 7,6; 0.5 M NaCl; 1 mM EDTA; 0.1% SDS) . Dann wird mit 0.3 g (Trok- kengewicht)" von Oligo(dT)-Cellulose für je 0.5 mg RNA gemischt, bei 1500 g für 4 min bei 15 Grad C zentrifugiert und die Oligo (dT)-Celluose 4-5 mal mit 5 ml Loading-Puffer gewaschen (bei Zimmertemperatur) . Die Poly (A)+RNA wird mit 1 ml wasche von sterilen 10 mM Tris. Cl (pH 7.5; 1 mM EDTA; 0.05% SDS .einer Elution unterzogen.
Es wird Na-azetat (3 M pH 5.2)- zu 0.3 M vermischt und die RNA mit 2.2 Vo Äthanol bei -20 Grad C precipitiert und das Precipitat mit 70% Äthanol gewaschen.
Wenn die Selektion der Poly(A) RNA nicht durchgeführt wird, wird die Plasma-RNA einer DNase Enzym Behandlung unterzogen. In diesem Falle wird RNase-freie DNase Enzym und MgCl_ (zu 2 mM) zu der Plasma-RNA Lösung (50 mM Tris. Cl, pH 7.5 in 1 mM EDTA) vermischt und in Anwesenheit von RNase Hemmer bei 37 Grad C für 30 min inkubiert, dann wird mit Phenol/Chloro¬ form extrahiert und in Anwesenheit von Na-azetat (pH 5.2, 0.3 M) wird di RNA mit 70% Äthanol bei -20 Grad C precipitiert.
Das folgende, gut bekannte, käufliche 18 molekularisch klonierte mensch¬ liche Onkogeri wurde als Onkogen-DNA Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind: In allen bzw. praktisch in seltenen, nur in in sehr seltenen allen Bösartigkeiten: gewissen Formen von Bös- Formen von Bösar- artigkeiten: tigkeiten:
A. B.
fos fes raf Erb" alu myc myb ErbB mos bcr Ha-ras fms N-myc sis N-ras Ki-ras src abl
32
Die Proben wurden entweder radioisotopisch mit P markiert (Spezifische g
Aktivität: 10 cpm/mikrogramm) durch Nick-Translation nach Rigby et al (J. Mol. Biol. 133:237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmar¬ kierten DNA Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, siehe Seite 21) oder mit Photobiotin nach Vorschrift des Herstellers (BRESA, Adel¬ aide, South Australia) markiert: Nach kurzer Bestrahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mit Nukleinsäuren ein. Die s mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol- Precipitation isoliert werden und kann als stabile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0.1 M EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.
Die Plasma RNA oder die Poly(A) RNA wird vor der Hybridisierung einer Behandlung, die sogenannte Prehybridisierung, unterzogen. Die RNA Lösung bzw. die RNA-Verdünnungen werden erst durch Inkubierung der 65 Grad C fü 15 min und dann durch rasche Abkühlung denaturiert. Dann wird die RNA au dem festen Substrat, wie Nitrocellulose-Papier, das zuvor mit 20 x NaCl/Cit equilibriert und dann getrocknet wurde, aufgetragen.
Dabei wird ein entsprechendes Volumen von der denaturierten RNA Lösung i eine Vertiefung der Mikrofilter-Platte (Bio-Dot Microfiltration Appa- ratus, Bio-Rad Richmond, Ca. 94804 USA; Minifold Filtration & Incubation Plate, Schleicher & Schuel, Keene, New Hampshire. 03431, USA hineinge¬ bracht und unter gelindem Vakuum unter Bildung eines Flecks von 3.0 mm Durchmesser filtriert. Quantität der aufgetragenen RNA: 10 mikrogramm, der Poly(A) RNA : 2 mikrogramm
Das Nitrocellulose-Papier wird dann für 2 h bei 80 Grad C im Vakuumofen getrocknet. Nach dem Backen wird in einer Lösung (Prehybridisierungsbuf- fer) : Formamide (50% Vol/Vol) ; 5 x NaCl/Cit; 50 M Natriumphosphat pH 6.5; sonizierte, denaturierte Salmon Sperma DNA (250 mikrogramm/ml) und 0.02 % je Bovine Serum Albumin (BSA), Ficoll und Polyvinylpyrrolidon, fü 8-20 h bei 42 Grad C inkubiert.
Die radioisotopisch markierte menschliche Onkogen-DNA Probe (2 x 10 cpm/ml) wird erst bei 100 Grad C für 5-10 min denaturiert, rasch gekühlt und wird zu der Lösung (Prehybridisierungspuffer) , die das Nitrocellulo¬ se-Papier mit der immobilisierten Plasma-RNA enthält, gemischt. Die Hy¬ bridisierung wird bei 42 Grad C für 20 h bewirkt. Danach wird das Nitrc^- cellulose-Papier mit einer Lösung von 2 x NaCl/Cit. 0.1% SDS gewaschen, erst bei Zimmertemperatur, dann bei 50 Grad C viermal mit der Lösung von 0.1 x NaCl/Cit, 0.1% SDS.
Das Nitrocellulose-Papier wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes ge¬ bracht. Ein Verstärkerschirm wird an der entgegengesetzten Seite ange¬ bracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der RNA-Transkripten bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA Probe hybridisierten, wird durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.
Im Falle nicht-radioisotopisch markierter Onkogen-DNA Proben, wie im Falle der mit Photo-Biotin-markierten Onkogen-DNA Proben werden die DNA Proben in 0.1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchge führt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol. Prehybridisierungspuffer; 1 Vol. von etwa 0.5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-markierte DNA Probe (Onkogen-DNA Probe) . Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C für 30 min in STMT Puffer (1 M NaCl; 0,1 M Tris. Cl. pH 7.5; 2 mM MgCl2 0.05% v/v Triton X-100) mit 30 mg von Bovine Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitro- cellose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in SIMT-Puffer mit 1 mikrogramm/ml Sigma Avidin-alkalische Phosphatase-Komple inkubiert, dann wird mit häufigem Schütteln in STMT Puffer (3 x 10 min) un STM Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl pH 9.5, 5 mM MgCl für 2 x 5 min inkubiert
Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose Papier bei Zimmertemperatur Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM Puffer aber nur mit 0.1 M NaCl) mit 0. mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0.17 mg/ml 5-Brαno-4-Chloro-3-Indolyl Pho phat und 0.33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose Papiers mit 10 mM Tris.Cl pH 7.5; -1 mM EDTA beendet.
Der Nachweis für die Anwesenheit von Onkogen-RNA-Transkripten, bzw. der Fragmente ist positiv, wenn die Plasma-RNA oder die Poly (A) RNA minde¬ stens mit einer der Onkogen-DNA Proben ein positives Signal (über dem Hintergrund oder über der negativen Kontrolle) gibt. Im Falle der radio aktiven Probe zeigt sich ein dunkler Fleck am Film nach Autoradiographi im Falle mit Biotin-markierter Proben als ein Fleck mit Farbreaktion. D Malignitätstest ist negativ, wenn aus dem Blutplasma keine RNA isolierb ist, oder die Blutplasma-RNA mit keinen der Onkogen-Proben ein positive Signal gibt.
Die Wiederverwendung der Blutplasma-RNA, die auf dem Nitrocellulose Pa¬ pier immobilisiert ist, ist möglich nach der Hybridisierung und Autora¬ diographie (für Rehybridisierung) . Die hybridisierte DNA Probe kann dur Wäsche bei 65 Grad C für 1 - 2 h mit 0.1 - 0.05 x Waschpuffer (lx Wasch puffer: 50 mM Tris.Cl. pH 8.0; 0.2 mM EDTA; 0.5 % Natriumpyrophosphat u 0.02% je BSA, Ficoll, Polyvinyl Pyrrolidon) entfernt werden. Die Behand¬ lung des Nitrocellulose-Papiers, also die Prehybridisierung sowie die Rehybridisierung wird, so wie oben (originell) .durchgeführt. Auf diese Weise kann die Rehybridisierung mit neuen Onkogen-DNA Proben noch durchgeführt werden. Dies ist sehr wichtig, weil die Menge der Blutplas¬ ma-RNA sehr limitiert ist. Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der RNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt mehrere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuver¬ lässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.
So erlaubt die Verwendung von zuverlässigen RNase-heπmenden Substanzen schon bei der Blutentnahme die Verhinderung des eventuellen Abbau von RNA. Die Gefahr einer Vermischung (Zumischung) der ubiquitären, hochgra¬ dig resistenten RNase aus exogenen Quellen wird während des ganzen Ver¬ fahrensablaufs durch Gebrauch von gebackenen Glaswaren, autoklavierten Lösungen, gebackenen Spatulas, Werkzeugen, trockenen chemischen Präpara¬ ten, von Glas destillierten, mit Autoklavsterilisiertem Wasser, sowie Tragen von Handschuhen während aller Phasen und Etappen des Präparations¬ und Untersuchungsablaufs verringert.
Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinitm-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der RNA-Protein Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der DNA wird durch DNase-Behandlung erreicht, weil die DNA sonst bei der Hybredi- sierung interferieren könnte. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit de festen Bindung der RNA an das Nitrocellulose-Filter. Die Behandlung des Nitrocellulose-Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindunge und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Nitrocellulose-Filters nach Hybridisierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.
Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.
Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.
Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In diese Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densi tαnetrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden. (Reflectance Densitcmeter, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA) . Quantitativer Test:
Wenn ein Blutplasma-RNA mit einer Onkogen Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren be¬ stimmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-RNA eine 1:2 Se- rialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patie ten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportioneil erhöht wird, im Vergleich zu ander Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.
Wenn man große Empfindlichkeit braucht, wie bei Screening von Personen, die durch familiäre, genetische oder wegen, beruflicher Exposition beson ders krebsgefährdet sind, oder bei screening von Patienten, die wegen Che o- oder Immunosuppressiv-Therapie beeinträchtigtes Immunsystem ha¬ ben, kann man radioaktive όnkogen-Proben mit höherer Aktivität verwen¬ den oder nach Leary und Mitarbeiter (Proc.. Natl Acad. Sei. USA 80:4045 4049, 1983) mit Biotin markierte Onkogen-Proben und Enzym-Affinitätstes benutzen und diese - wenn es möglich ist - mit aus der Plasma-RNA selek
+ tierten Poly(A) RNA hybridisieren. So kann man eine Empfindlichkeit von pg/ml RNA erreichen. Sonst ist die Verwendung für Hybridisierung die
Plasma-RNA für differential diagnostische Zwecke (als Bestätigungstest) für Verlaufskontrolle, Monitoring, und Staging ausreichend.
Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartige Krankheit meistens, wenn die Plasma-RNA erst nur mit der Onkogen-Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auszuweitern.
Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht ha auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die i dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man gegebenenfalls auch als Probe benutzen, sowie 0ligonukleotid-Proben für den Nachweis von durch Punktmutation aktivierten Onkogenen.
Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbah anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil) , muß man die Blutplasma-RNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisie¬ ren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen i der Blutbahn während der'Krankheitsablauf erfassen möchte, was aufgrund der:prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.
Verfahrensführung Frei-In-Lösung
Die RNA in denaturierter Form frei in Lösung wird mit der markierten Onkogen-DNA-Probe gemischt, inkubiert für 1 - 2 h bei 70 Grad C in Anwesenheit vom Nuklease-Inhibitoren. Dann wird Hydroxyapatit zugefügt, für 5 min. bei 70 Grad C inkubiert, um das Produkt der Hybridisierung (RNA-^narkierte Onkogen-DNA Komplexe) zu adsorbieren.
Die so entstehende Hydroyapatit-Fraktion wird als Sediment durch Zentri¬ fugieren separiert. Das Sediment wird einer Wäsche (für 5 min, bei 70 Grad C) unterzogen und das Produkt in der Hydroxyapatit-Fraktion aufgrund der Markierung bestimmt.

Claims

Pa te n tan s p rü c he
1. Verfahren.zur Untersuchung einer azellularen biologischen Flüssig¬ keit auf die Anwesenheit von zellularen Qnkogen-Transkripten bzw. deren Fragmente als Malignitätstest, bei dem man a) aus der gesamten azellularen biologischen Flüssigkeit die RNA in ständiger Anwesenheit eines wirksamen RNase-Hem ers konzentriert bzw. trennt, die RNA denaturiert und in dieser Form entweder auf einem festen Träger immobilisiert oder frei in Lösung beläßt, b) die RNA mit markierten Onkogen-DNA Proben in Kontakt bringt, um diese mit der RNA zu hybridisieren, wenn komplementäre Sequenz vorliegt, die überflüssige und nicht spezifisch gebundene, mar¬ kierte Onkogen-DNA entfernt und c) das Produkt auf die Anwesenheit markierter DNA bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die azellular biologische Flüssigkeit menschliches Blutplasma ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe radioisotopisch markierte Onkogen-DNA ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nicht radioisotopisch markierte, vorzugsweise mit Biotin markierte Onkogen-DNA ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Blutplasma vor der Trennung der RNA mit einem organischen Lösungs¬ mittel behandelt wird, um Eiweißmaterial in einer organischen Phase zu entfernen und um die RNA in der wässrigen Phase zu erhalten.
6. Verfahren nach Anspruch 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestirrmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels autoradiographi¬ scher Technik durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Substrat reine Nitrocellulose verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Immo¬ bilisierung ein Vakuum eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man a) das Blut mit einer Lösimg einer wirkungsvollen
RNase-Enzym hemmenden Substanz vermischt, und das Plasma von den Zellen separiert; b) das Produkt der Stufe a) (das Plasma) mit einem Detergens und proteolytischen Enzym in Kontakt bringt; c) das Produkt der Stufe b) mit einer proteindenaturierenden Lösung, wie Guanidinium-isothiocyanat vermischt und behandelt; d) das Produkt der Stufe c) mit einem organischen Lösungsmittel (bei 60 Grad C) extrahiert unter Bildung einer im wesentlichen protein¬ freien wässrigen Phase, die die RNA enthält; e) das Produkt der Stufe d) mit einem Detergens und einem proteoly- tischen Enzym in Kontakt bringt, inkubiert, und dann die Extrak tion der Stufe d) wiederholt; f) das Produkt der Stufe e) mit (2 vol) Äthanol präzipitiert, wäsc und in sterilem Wasser löst; g) das Produkt der Stufe f) einer DNase Enzym Behandlung unterzieh um die vorhandene DNA abzubauen und zu entfernen und dann die Extraktion der Stufe d) wiederholt; oder h) das Produkt der Stufe f) einem Affinitätsadsorptions- und Elu- tionsverfahren mit Oligo(dT)-Cellulose unterzieht um die poly(A) RNA (mRNA) zu isolieren.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) das Produkt der Stufe g) oder h) behandelt und dann denaturiert; b) das Produkt der Stufe a) auf ein festes Substrat aufträgt durch Backen im Vakuum immobilisiert; und behandelt c) das feste Substrat der Stufe b) mit einer Lösung von markierter Onkogen-DNA Probe in Kontakt bringt, um sie mit der auf dem fes Substrat immobilisierten RNA zu hybridisieren; d) das Produkt der Stufe c) im Fall radioisotopisch markierter Onk gen-DNA Probe, durch Autoradiographie bestimmt; e) das Produkt der Stufe c) im Fall nicht-isotopisch markierter Onkogen-DNA Probe mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktio bestimmt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das fes Substrat der Stufe b) behandelt, um eine weitere Bindung von Nuklei säure daran zu hindern.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das fes Substrat der Stufe c) wäscht, um nicht spezifisch gebundene markie Onkogen-DNA zu entfernen.
14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene, mit der Plasma-RNA verbundene Radioaktivität durch Autoradiographie bestimmt.
15. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene nicht-radioaktive Markierungssubstanz der festen Substrat, die durch die Hybridisierung zwischen RNA und der markier¬ ten Onkogen-DNA gebunden ist, mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.
16. Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Onkogen-DNA, die mit der auf dem festen Substrat gebunde nen RNA hybridisierte, entfernt um das feste Substrat mit der daran verbliebenen RNA mit einer neuen Onkogen-DNA Probe wiederzuhybridi- sieren (Rehybridisierung) .
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Onkogen-DNA-Probe eine individuelle Onkogen-DNA oder eine Mischung individueller Onkogen-DNAs (pooled probe) nimmt. -
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