JPS6091999A - ポリヌクレオチドの測定方法 - Google Patents
ポリヌクレオチドの測定方法Info
- Publication number
- JPS6091999A JPS6091999A JP58199702A JP19970283A JPS6091999A JP S6091999 A JPS6091999 A JP S6091999A JP 58199702 A JP58199702 A JP 58199702A JP 19970283 A JP19970283 A JP 19970283A JP S6091999 A JPS6091999 A JP S6091999A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- measured
- dna
- solid phase
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
及びリポ核酸（ＲＮＡ’）を測定する方法に関Ｊ一るも
のである。
のである。
人ｉｔｔ ？Ｉｌｉ中のＤＮＡを測定することは臨床．
１−、例えばウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の
発見などに極めて有意義である。従来、このＤＮＡＯ測
定方法としては、試料を変性処理して得た一本鎖ＤＮＡ
（ Ｓ − ＤＮＡ ）を固相に結合させ、との固相
にラジオアイソＩ・一ノ０を標識したＳ − ＤＮＡを
作用さすて１６１相のＳ−ＤＮＡと・・イブリッドを形
成させてから未反応の標７ＨＨ２ Ｓ Ｉ）ＮＡを除去
し、固４１−１の放射１腺を測定する方θ、が行なわれ
ていた。この方法は測定の際に固定化，洗浄等数多くの
上程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要すると
ころから操作の労力及び時間の両方に問題があった。
１−、例えばウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の
発見などに極めて有意義である。従来、このＤＮＡＯ測
定方法としては、試料を変性処理して得た一本鎖ＤＮＡ
（ Ｓ − ＤＮＡ ）を固相に結合させ、との固相
にラジオアイソＩ・一ノ０を標識したＳ − ＤＮＡを
作用さすて１６１相のＳ−ＤＮＡと・・イブリッドを形
成させてから未反応の標７ＨＨ２ Ｓ Ｉ）ＮＡを除去
し、固４１−１の放射１腺を測定する方θ、が行なわれ
ていた。この方法は測定の際に固定化，洗浄等数多くの
上程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要すると
ころから操作の労力及び時間の両方に問題があった。
木発明者らに仁のような問題のない方法を開発すべく種
々検問の結果、予め標識された 本鎖・ｊ？リヌクレメ
チドを・固相に結合させておき、この固７ｌ「１に試料
を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレオヂドを作用さ
せてノ・イブリッドを形成させ、・・イブリッドし／ξ
，ｌ？リヌクレオチドを制限醇累で切断する方法を案出
し、この方法を用いれば前記の目的を達成しうろことを
見出して本発明を完成するに至った。
々検問の結果、予め標識された 本鎖・ｊ？リヌクレメ
チドを・固相に結合させておき、この固７ｌ「１に試料
を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレオヂドを作用さ
せてノ・イブリッドを形成させ、・・イブリッドし／ξ
，ｌ？リヌクレオチドを制限醇累で切断する方法を案出
し、この方法を用いれば前記の目的を達成しうろことを
見出して本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、測定対象である一本鎖７１９リヌク
レオチドを、標識物が結合されかつ該測定対象−・木鎖
醪すヌクレオヂドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しう
る一本鎖ｉｊ？リヌクレオチじを結合した同相と６液中
で接触させて二本鎖２１？リヌクレオチドを形成さぜ、
該二本鎖ポリヌクレ珂チドに二本鎖目？リヌクレオチド
制限酵素を作用させてこの二本９ｆ） ；＋９リヌクレ
オチドを切断し、溶液叉は固相の標１熾物を４１１１定
することを特徴とする７１？リヌクレオヂドの４１１１
定力法に関するものである。
レオチドを、標識物が結合されかつ該測定対象−・木鎖
醪すヌクレオヂドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しう
る一本鎖ｉｊ？リヌクレオチじを結合した同相と６液中
で接触させて二本鎖２１？リヌクレオチドを形成さぜ、
該二本鎖ポリヌクレ珂チドに二本鎖目？リヌクレオチド
制限酵素を作用させてこの二本９ｆ） ；＋９リヌクレ
オチドを切断し、溶液叉は固相の標１熾物を４１１１定
することを特徴とする７１？リヌクレオヂドの４１１１
定力法に関するものである。
４１（１定対象（よ−Ａ＜鎖醪すヌクレオチド（以［・
、１＋１１定ン３■象ポリヌクレオチドという。）てあ
る。ｄ１１１定対象ぼりヌクレオチドゝはＤＮＡ及びＲ
ＮＡを含む。試料中に含まれるン１？リヌクレオヂドが
一本：梢である場合には水酸化すｌ−１）ラム溶液の添
加などのアルノノリ処即あるい（は熱処理などにより一
本鎖にしておく必要がある。試ｔｉｔのｌｉＩ ＃’、
ｑは問わないが、例えば人血（ｒｌ’ ＋尿２組織抽出
物などである。六ｎｉ１． ’（＋ＴなどのようにンＪ
？リヌクレオチドが蛋白と結合しているおそれがある場
合には試料をプロプアーゼ智″で処理して蛋白を分離し
ておくのがよい。
、１＋１１定ン３■象ポリヌクレオチドという。）てあ
る。ｄ１１１定対象ぼりヌクレオチドゝはＤＮＡ及びＲ
ＮＡを含む。試料中に含まれるン１？リヌクレオヂドが
一本：梢である場合には水酸化すｌ−１）ラム溶液の添
加などのアルノノリ処即あるい（は熱処理などにより一
本鎖にしておく必要がある。試ｔｉｔのｌｉＩ ＃’、
ｑは問わないが、例えば人血（ｒｌ’ ＋尿２組織抽出
物などである。六ｎｉ１． ’（＋ＴなどのようにンＪ
？リヌクレオチドが蛋白と結合しているおそれがある場
合には試料をプロプアーゼ智″で処理して蛋白を分離し
ておくのがよい。
同相に結合されている一本鎖、Ｉ？リヌクレメチド物が
結合されか−）ｉｌｊｌｌ定対象７ｆリヌクレオチ１゛
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるものである。
結合されか−）ｉｌｊｌｌ定対象７ｆリヌクレオチ１゛
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるものである。
従って、とのけ識、＋９リヌクレオチドは測定対象ポリ
ヌクレオチドにλ・ｊするノ０ロープである。との１票
識、＋９リヌクレオブドは測定対象、＋９リヌクレオヂ
ドを含む二本鎖、＋９リヌクレオチドをアルノノリ処理
。
ヌクレオチドにλ・ｊするノ０ロープである。との１票
識、＋９リヌクレオブドは測定対象、＋９リヌクレオヂ
ドを含む二本鎖、＋９リヌクレオチドをアルノノリ処理
。
熱処理などで変性させてイｑてもよく、あるいｆｄ １
ｌｌｌｌ定対象列？リヌクレオチじ、 ＤＮａｓｅ ｌ
及びＤＮＡ月９リメラーゼ１の存（１（で各種ヌクレオ
チドを中台させて得てもよい。
ｌｌｌｌ定対象列？リヌクレオチじ、 ＤＮａｓｅ ｌ
及びＤＮＡ月９リメラーゼ１の存（１（で各種ヌクレオ
チドを中台させて得てもよい。
標識物は放射ｉ（ｌ； ｌ：ｉｌ １１ン：体、螢光物
質１発光体、磁性体、酵素、その］°ロスティックグル
ーフ’ 、 袖ｆＱγ素、ｌ′ｌＩ！′累阻害′吻質な
どを使用することができる。
質１発光体、磁性体、酵素、その］°ロスティックグル
ーフ’ 、 袖ｆＱγ素、ｌ′ｌＩ！′累阻害′吻質な
どを使用することができる。
Ｌｄ ｄ −タミン、ンルオレセイン、メチルクマリン
。
。
グンノルクロシイド等の一股の螢光試薬でよく、発ｉ
体はイソルミノール、ルミノール等の化学発）’ｅ 体
及びルノフェリンールンフ、ラーゼ等の生物発光体のい
ずれであってもよい。酵素は活性測定の容易なものがよ
く、例えばグルコースオキ／グーゼアパーオキ／ダーゼ
、アルカリフλスフｒダーゼなどが適当である。ポリヌ
クレオチドの測定の際に力１）次へが行なわれるところ
からとノＬらは１１］ｊｊ熱性のものがよい。通′）１
号のｌ′ｌｉＹ素の１ふ′Ｊ合に１ｒよ；３５〜４０℃
稈邸でノ・イブリッドさせることもできる。
体はイソルミノール、ルミノール等の化学発）’ｅ 体
及びルノフェリンールンフ、ラーゼ等の生物発光体のい
ずれであってもよい。酵素は活性測定の容易なものがよ
く、例えばグルコースオキ／グーゼアパーオキ／ダーゼ
、アルカリフλスフｒダーゼなどが適当である。ポリヌ
クレオチドの測定の際に力１）次へが行なわれるところ
からとノＬらは１１］ｊｊ熱性のものがよい。通′）１
号のｌ′ｌｉＹ素の１ふ′Ｊ合に１ｒよ；３５〜４０℃
稈邸でノ・イブリッドさせることもできる。
７０ロスティンクグルーノ０は例えばグルー７−スオキ
シグーゼにおける活性中心であるフラビノアデニンジヌ
クレオチ１゛などでちり、ア・１？１・・１ケリ・、と
反応後そのホロ１１埜素の（′占・ビ十を曵１川定する
ことによ０て（２漕識物を定ｍすることができる。補酵
素の１＋１１としてはＮＡＩ）Ｈ、ＮＡＤＰＨ２，アミ
ンビロリン酸、）？リ ｌ゛キサールリン酸 ＡＤＰ
、 ＡＴｌ）などを挙げるととができる０ 一本鎖＋Ｊ？リヌクレオチドを１１１、合さぜる担体１
ｒ、、’ｉ ’ｌＩｉに：ｌｔ’ｌ限されるものではな
いが、例えば七ソ７ Ｔ−，１・−ス、セフアゾ、クス
、セルロース等のケ゛ル、イオ７ 交換１ａｌ ＢＷ
、０５紙、ニトロセルロース、ナイロン４？リスチレン
、ΣＦリアクリル°アミドなとは好適である。
シグーゼにおける活性中心であるフラビノアデニンジヌ
クレオチ１゛などでちり、ア・１？１・・１ケリ・、と
反応後そのホロ１１埜素の（′占・ビ十を曵１川定する
ことによ０て（２漕識物を定ｍすることができる。補酵
素の１＋１１としてはＮＡＩ）Ｈ、ＮＡＤＰＨ２，アミ
ンビロリン酸、）？リ ｌ゛キサールリン酸 ＡＤＰ
、 ＡＴｌ）などを挙げるととができる０ 一本鎖＋Ｊ？リヌクレオチドを１１１、合さぜる担体１
ｒ、、’ｉ ’ｌＩｉに：ｌｔ’ｌ限されるものではな
いが、例えば七ソ７ Ｔ−，１・−ス、セフアゾ、クス
、セルロース等のケ゛ル、イオ７ 交換１ａｌ ＢＷ
、０５紙、ニトロセルロース、ナイロン４？リスチレン
、ΣＦリアクリル°アミドなとは好適である。
一本鎖ポリヌク１７オチドを４１１体に結合させる方法
は化学結合法でもよく、物耶吸ス９法でもよ１７）。
は化学結合法でもよく、物耶吸ス９法でもよ１７）。
化学結合法（ｔ：’ｉ １ｉｉ！常の同相化法あるい乞
ｉ 、ｌ＝ ｌ）ヌクレオチド合成法に」、って行なっ
てもよ＜ 、ｔ ／＋−、数残基の１ゑ１１１安を丁・
めｊ’１．ｊ体にＡ’ｊ’ｉ介させ−Ｃ７１，・きこｊ
＋、、 ＩｊｒＩ本ｔＪ’、ｔ 、ｌ？リヌクレ珂チビ
を３′ンクレ珂チ々゛−、，１，＝ ヲ用いてＡ宿合さ
せてもよい。そのほか、不ツ・１“ｊ ：ｌ’： ’）
ヌクレオチドにアミノ基又はカル＋１？キンルノ４！ｉ
を・、「）人し、ノノルボキンル基又はアミン基を何す
る用ｆ本ｔこグｊして啄ゾチド６成試薬例えばジ／りＩ
Ｄへへ″ノ／Ｌカルボジイミドあるい（ｄノノルポンイ
ミダゾ ル′５を用いて糸占合さぜることもできる。ま
だ、４１１１本及び一本Ｇｉｉ 、１９リヌクレオチド
がいずれもアミノ」−をイ）シ て い る 」混合
にな−１，１番化 ／ −ア ヌ ル 、 グ ル タ
ノし ノ゛ ルブ゛ヒトなどてイ占合させることもて
きる。８１１占１：をイｊする場ａには１′へｌ ７ｉ
’、 ｉ’ｉりあるいはマレイミｌ゛ノ、１−をイｒ−
Ｊる試薬を利用することができる。とれらの方法υこお
いて担体が心尽な官能Ａ％を有してｔ／）ないＹ１易合
には予め公知の方法によって導入してお・ンナに１：よ
い。
ｉ 、ｌ＝ ｌ）ヌクレオチド合成法に」、って行なっ
てもよ＜ 、ｔ ／＋−、数残基の１ゑ１１１安を丁・
めｊ’１．ｊ体にＡ’ｊ’ｉ介させ−Ｃ７１，・きこｊ
＋、、 ＩｊｒＩ本ｔＪ’、ｔ 、ｌ？リヌクレ珂チビ
を３′ンクレ珂チ々゛−、，１，＝ ヲ用いてＡ宿合さ
せてもよい。そのほか、不ツ・１“ｊ ：ｌ’： ’）
ヌクレオチドにアミノ基又はカル＋１？キンルノ４！ｉ
を・、「）人し、ノノルボキンル基又はアミン基を何す
る用ｆ本ｔこグｊして啄ゾチド６成試薬例えばジ／りＩ
Ｄへへ″ノ／Ｌカルボジイミドあるい（ｄノノルポンイ
ミダゾ ル′５を用いて糸占合さぜることもできる。ま
だ、４１１１本及び一本Ｇｉｉ 、１９リヌクレオチド
がいずれもアミノ」−をイ）シ て い る 」混合
にな−１，１番化 ／ −ア ヌ ル 、 グ ル タ
ノし ノ゛ ルブ゛ヒトなどてイ占合させることもて
きる。８１１占１：をイｊする場ａには１′へｌ ７ｉ
’、 ｉ’ｉりあるいはマレイミｌ゛ノ、１−をイｒ−
Ｊる試薬を利用することができる。とれらの方法υこお
いて担体が心尽な官能Ａ％を有してｔ／）ないＹ１易合
には予め公知の方法によって導入してお・ンナに１：よ
い。
一方、物理吸着法の場合には、世５体の秤頓に応して行
なえばよく、例えば−・本領ｙｌ＠ ＩＪヌクレオチド
の溶ｌ仮にニトロセルロースを一定時間浸しその後洗浄
すればよい。そのほか、公知の固相合成法を用いて担体
上でヌクレオチドを次々と結合させて製造するとともで
きる。
なえばよく、例えば−・本領ｙｌ＠ ＩＪヌクレオチド
の溶ｌ仮にニトロセルロースを一定時間浸しその後洗浄
すればよい。そのほか、公知の固相合成法を用いて担体
上でヌクレオチドを次々と結合させて製造するとともで
きる。
標識物の一木鎖７Ｊ？リヌクレオチドへのＭ’ｆ人も公
知の方法によればよい。との導入は−木鎖）１？リヌク
レオチドに相体に結合させる前に行な７つてもよく、４
１１体に結合さぜた後であってもｊ：い。Ｊ］ｎ常は結
合前に行なうのがよいが、酵素などの高分子物質の１易
合に（・′よ結合後にイ”ｉなうことが灯４しい。
知の方法によればよい。との導入は−木鎖）１？リヌク
レオチドに相体に結合させる前に行な７つてもよく、４
１１体に結合さぜた後であってもｊ：い。Ｊ］ｎ常は結
合前に行なうのがよいが、酵素などの高分子物質の１易
合に（・′よ結合後にイ”ｉなうことが灯４しい。
このような１・５Ｙ相に？１ｉ１１定りＪ ｗ ｉｌ？
リヌクレＡチドを溶液中で接ｆ（，１ｊＨさぜる。接触
時間は１ｔ常に一測定対象、ｊ９リヌクレオチドがＩ肖
１相の・；票Ｉｌ岐、＋？リヌクレオグドと充分に反し
して〕・イブリッドを形成しつるイ゛一度がよく例えば
０５〜＝１０時間）ｌヤ度が３１：；’：ｒ当である。
リヌクレＡチドを溶液中で接ｆ（，１ｊＨさぜる。接触
時間は１ｔ常に一測定対象、ｊ９リヌクレオチドがＩ肖
１相の・；票Ｉｌ岐、＋？リヌクレオグドと充分に反し
して〕・イブリッドを形成しつるイ゛一度がよく例えば
０５〜＝１０時間）ｌヤ度が３１：；’：ｒ当である。
温度の、２０〜７０℃程度１．．ＩＩ（ｄ、５〜９程度
がよい。
がよい。
二本鎖ぽリヌクレオチ（゛制限酵素（以干、１ｌｉｌｌ
限ｒｎ％素という。）の種類は問わない。この制御奴酵
素は二本鎖７（？リヌクレメチドにのみ特異的にｆ′１
川するものがよ（，７４：メこ、認識ポリヌクレオチド
’ｉｎｌのあま９長くないもののほうがりｒましい。制
限ｌ’１４”宋は１１重のみでなく、２７重以上をｉＢ
ｊ刊してもよい。
限ｒｎ％素という。）の種類は問わない。この制御奴酵
素は二本鎖７（？リヌクレメチドにのみ特異的にｆ′１
川するものがよ（，７４：メこ、認識ポリヌクレオチド
’ｉｎｌのあま９長くないもののほうがりｒましい。制
限ｌ’１４”宋は１１重のみでなく、２７重以上をｉＢ
ｊ刊してもよい。
固相へ作用さぜる］１，１．期は通常（ｄ、測定利象、
Ｈ９リヌクレオチドと標−識月？リヌクレオグ・ドとの
反応終了後であるが、測定幻象月？リヌクレオヂドト１
１７１１１＋ｉ： 、ｒ）るいはその前に溶〆イｋに添
加しておいて」：い場合もある。
Ｈ９リヌクレオチドと標−識月？リヌクレオグ・ドとの
反応終了後であるが、測定幻象月？リヌクレオヂドト１
１７１１１＋ｉ： 、ｒ）るいはその前に溶〆イｋに添
加しておいて」：い場合もある。
１ｉｔｌ限酵素作用後は・１ろ要により固（ｆｋ分削し
、同相又は溶液の標識物−、ｌ！？１ｌｌｌｊ定する。
、同相又は溶液の標識物−、ｌ！？１ｌｌｌｊ定する。
６）１１定力θ、は碇識物に尾、して公知の方法にＲっ
て行なえばよく、１りりえば放射性同位体のＩ場合にけ
ンンチレー／１ンツＪウンタ、ガイガーノノウンタなど
でｉｔ！Ｉｆ ’ｊ、′ｌｌずれはよい。
て行なえばよく、１りりえば放射性同位体のＩ場合にけ
ンンチレー／１ンツＪウンタ、ガイガーノノウンタなど
でｉｔ！Ｉｆ ’ｊ、′ｌｌずれはよい。
本発明の方θｅ ＆、ｌ 測定対象ポリヌクレオチドを
固（１］に結合させる・１ζ、′、！ンがなく、Ｊ・■
作か容易である。
固（１］に結合させる・１ζ、′、！ンがなく、Ｊ・■
作か容易である。
本発明の方法に用いる試薬、器具類はキット化が容易で
あり、この八−ノトを使用することによってＤＮＡ等の
ポリヌクレオチドを実用的かつ簡便に測定することがで
きる。
あり、この八−ノトを使用することによってＤＮＡ等の
ポリヌクレオチドを実用的かつ簡便に測定することがで
きる。
以下、実施例を示す。
実施例工
（１） ＩＩＢＶ 、−ＤＮＡフ０ローブのｉｌ・５裂
５ （ｌ ｆ） ｍ（の慢性１３型肝炎患者のプール面
清を９００Ｏｒｐｍで１５分間遠心し、得られた一ｌ−
、’６Ｔを４℃１０００００Ｘ’７で５時間超遠心して
ＩＩｌ＋Ｖおシア・を４し、トとして集めた。この４し
、Ｉ−を０１ＭＮａＣ１，］ ｍＭ ＥＤＴＡ 、、０
．．１ ％ ２−ノルカフ０１エタノール及び０．１％
ＢＳＡを含む０．０．１ Ｍ ＋・リスー塩酸緩歯液（
ｐＨ７，５） ｌ （ｌ ｍｅに溶かし、このウィルス
溶７ｊ’ｉ （７Ｊ）うち５ ｎｒ／’を保存し、残５
ｒｎｌを＋ ０００００ Ｘ 、７で（１１度５１ｔ、
’ｉ間超超遠心てベレ、１・を得た。
５ （ｌ ｆ） ｍ（の慢性１３型肝炎患者のプール面
清を９００Ｏｒｐｍで１５分間遠心し、得られた一ｌ−
、’６Ｔを４℃１０００００Ｘ’７で５時間超遠心して
ＩＩｌ＋Ｖおシア・を４し、トとして集めた。この４し
、Ｉ−を０１ＭＮａＣ１，］ ｍＭ ＥＤＴＡ 、、０
．．１ ％ ２−ノルカフ０１エタノール及び０．１％
ＢＳＡを含む０．０．１ Ｍ ＋・リスー塩酸緩歯液（
ｐＨ７，５） ｌ （ｌ ｍｅに溶かし、このウィルス
溶７ｊ’ｉ （７Ｊ）うち５ ｎｒ／’を保存し、残５
ｒｎｌを＋ ０００００ Ｘ 、７で（１１度５１ｔ、
’ｉ間超超遠心てベレ、１・を得た。
このベレットを０．５ ％ ＮＰ−４（） ｆ含むｌ
ＯｒｎＭ ｌ□リ ス − 塩酸、１）、ｌ Ｍ Ｎａ
ＣｔｐＨ７，５７容７１’１２ ０ ＋） μ、ｌ−で
処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。この溶液に
１ ｍＭ ｄＡＴＰ 、１ ｍＭ ｄＴＴＰ、２５μＭ
Ｉ）ｄＧＴＰ、２．５７１Ｍ ３２ＰｄｃＴＰを含む
（１，０８Ｍ ＭｇＣｌ２０．２ Ｍ ＋・リス緩雨教
（ｐｉｆ ７．５ ） ５０ ／１１を加えて：Ｉ Ｉ
Ｉ；’ｉ間加謂Ｉした。この溶、夜を３０％シェークロ
ース溶液の入った遠心チ＝−ブに重層し、５Ｗ６５０−
ター（ベックマン社製）を用い”、） ００００ ｒ
ｐｍで３１侍間゛市心しテ啄しッｌ’ ”ｆｉｌＴ ’
（１’ｉ ）ニー。とのぐし）ｌ−ヲソ０ロリーセ゛で
処（里し、得らＩジノ；−、的醒をフェノールで２１ｉ
１ｉｊ ｌｌｌ＋ｌｌ押出た。４’ｌｌｌ ｉ、ｔ、！
液イし５〜２０係／ユ−−−クロースグンジエントで５
（１０ｔｌ Ｏｒ ｐｍにて３Ｂｌｊ間遠心して１５Ｓ
３２ＰＤＮＡ分画を集めこれを７°−ルした。この分画
から１５３３２１’１）ＮＡ をエクノーノしを用いて
沈ａ・１．Ｗさぜ、乾燥して目的の川（Ｖ −ＤＮＡを
１１） フζ。
ＯｒｎＭ ｌ□リ ス − 塩酸、１）、ｌ Ｍ Ｎａ
ＣｔｐＨ７，５７容７１’１２ ０ ＋） μ、ｌ−で
処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。この溶液に
１ ｍＭ ｄＡＴＰ 、１ ｍＭ ｄＴＴＰ、２５μＭ
Ｉ）ｄＧＴＰ、２．５７１Ｍ ３２ＰｄｃＴＰを含む
（１，０８Ｍ ＭｇＣｌ２０．２ Ｍ ＋・リス緩雨教
（ｐｉｆ ７．５ ） ５０ ／１１を加えて：Ｉ Ｉ
Ｉ；’ｉ間加謂Ｉした。この溶、夜を３０％シェークロ
ース溶液の入った遠心チ＝−ブに重層し、５Ｗ６５０−
ター（ベックマン社製）を用い”、） ００００ ｒ
ｐｍで３１侍間゛市心しテ啄しッｌ’ ”ｆｉｌＴ ’
（１’ｉ ）ニー。とのぐし）ｌ−ヲソ０ロリーセ゛で
処（里し、得らＩジノ；−、的醒をフェノールで２１ｉ
１ｉｊ ｌｌｌ＋ｌｌ押出た。４’ｌｌｌ ｉ、ｔ、！
液イし５〜２０係／ユ−−−クロースグンジエントで５
（１０ｔｌ Ｏｒ ｐｍにて３Ｂｌｊ間遠心して１５Ｓ
３２ＰＤＮＡ分画を集めこれを７°−ルした。この分画
から１５３３２１’１）ＮＡ をエクノーノしを用いて
沈ａ・１．Ｗさぜ、乾燥して目的の川（Ｖ −ＤＮＡを
１１） フζ。
（２１＝／りｌ・ランスレー／・ヨンによるＩ−）ＮＡ
ジノ ｕ−ブの調・梗 ５ｍＭ ＭｇＣ／、 、ｌ （ｌ ｍＭ ２−メルノノ
ゾトエクノーノし、５７１Ｍ ｄＴＴｌ〕、 ５ ／１
ｔＶｌ ｄＧＴＰ 、 ５ ／ＬＭ α ３２Ｐ −ｔ
ｌｃＴｌ’ （Ｊｉ ｊｊ（ｒ’４４活性１０ ｆ）〜
７０１） Ｃｉ／ｎ＋ｍｏ ｌ ）及び５／”Ｍ’Ｌｉ
−３２ｐ、−＋ｌΔＴｌ１（比放ｆｉＪ’ ｆａｒ −
１シアｇ Ｉ ［） （１〜７００ Ｃｉ／ｉｎ ｍｏ
ｌ ）を含む５０ｍＭトリス−■ｌｃｔλ麦ｆ巾Ｊ液（
Ｐｌ＋ ７．５ ） ｉ （１０μｌに１記の１［１３
Ｖ −１）ＮＡ １．７１．’７を加え、さらにＤＮａ
ｓｃ ｌ Ｉ Ｏ（ｌ ｐ、ツ及びＤＮＡ 、ｌ？リメ
シーー−ビＩ Ｉ Ｏ＋ｌ ｐ、９を）川えて１５Ｃで
９０分間イ／キュベ−１・し／こ。この溶）・′Ｉ′１
．をノアノールテ抽出し、５ｃｐｈａｄｅｘ Ｇ −５
０カジノ、でＡＩ７＋ Ｕ□ｊ＋して放射活性化１１Ｔ
３Ｖ −ＤＮＡを７■た。
ジノ ｕ−ブの調・梗 ５ｍＭ ＭｇＣ／、 、ｌ （ｌ ｍＭ ２−メルノノ
ゾトエクノーノし、５７１Ｍ ｄＴＴｌ〕、 ５ ／１
ｔＶｌ ｄＧＴＰ 、 ５ ／ＬＭ α ３２Ｐ −ｔ
ｌｃＴｌ’ （Ｊｉ ｊｊ（ｒ’４４活性１０ ｆ）〜
７０１） Ｃｉ／ｎ＋ｍｏ ｌ ）及び５／”Ｍ’Ｌｉ
−３２ｐ、−＋ｌΔＴｌ１（比放ｆｉＪ’ ｆａｒ −
１シアｇ Ｉ ［） （１〜７００ Ｃｉ／ｉｎ ｍｏ
ｌ ）を含む５０ｍＭトリス−■ｌｃｔλ麦ｆ巾Ｊ液（
Ｐｌ＋ ７．５ ） ｉ （１０μｌに１記の１［１３
Ｖ −１）ＮＡ １．７１．’７を加え、さらにＤＮａ
ｓｃ ｌ Ｉ Ｏ（ｌ ｐ、ツ及びＤＮＡ 、ｌ？リメ
シーー−ビＩ Ｉ Ｏ＋ｌ ｐ、９を）川えて１５Ｃで
９０分間イ／キュベ−１・し／こ。この溶）・′Ｉ′１
．をノアノールテ抽出し、５ｃｐｈａｄｅｘ Ｇ −５
０カジノ、でＡＩ７＋ Ｕ□ｊ＋して放射活性化１１Ｔ
３Ｖ −ＤＮＡを７■た。
次 に、５ ｍＭ Ｍｇ Ｃ／−２、］ ＯｍＭ ２
− メ ／ｌ／ ツノ フ０ ト エタノール、５ ／
（Ｍ ｄＴＴＰ 、５ ／ＩＭ ｄＧＴＰ 、５μＭ
ｄＣＴＰ。
− メ ／ｌ／ ツノ フ０ ト エタノール、５ ／
（Ｍ ｄＴＴＰ 、５ ／ＩＭ ｄＧＴＰ 、５μＭ
ｄＣＴＰ。
５ ／（Ｍ ｄＡＴＰ、１． ＋１ ／Ａ４アミノヘキ
フルｄＡＴＰ及び１０ ／（Ｍ ７ミノヘキシルｄＣＴ
Ｐを含む！’ｉ （ｌ ｎ＋Ｍ ｌ・リス〜ＨＣ１緩衝
液（ｐＨ７，”、） ） １００μＬにやはυＩＩＴ３
Ｖ −１）ＮＡ １ ／Ｌｊｌ、ＤＮａｓｅ Ｉ １０
０ ｐ、り 及びＩ）ＮＡポリメラーゼ１Ｉ００ｐ、７
を加えて１５℃で９０分間インキコベートシた。この溶
７１Ｅをやはりフ、ノールで抽出し、５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ −５０ツノラムで石ｖ’ＩＨ４してイ冬飾型１１
ＢＶ−ＤＮＡをイ１１プこ。
フルｄＡＴＰ及び１０ ／（Ｍ ７ミノヘキシルｄＣＴ
Ｐを含む！’ｉ （ｌ ｎ＋Ｍ ｌ・リス〜ＨＣ１緩衝
液（ｐＨ７，”、） ） １００μＬにやはυＩＩＴ３
Ｖ −１）ＮＡ １ ／Ｌｊｌ、ＤＮａｓｅ Ｉ １０
０ ｐ、り 及びＩ）ＮＡポリメラーゼ１Ｉ００ｐ、７
を加えて１５℃で９０分間インキコベートシた。この溶
７１Ｅをやはりフ、ノールで抽出し、５ｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ −５０ツノラムで石ｖ’ＩＨ４してイ冬飾型１１
ＢＶ−ＤＮＡをイ１１プこ。
（３） 固相の調・捜
（２） 、ｌ」’ｉで調製した）Ｊ（射活性化ＨＢＶ
−ＤＮＡ化用いた。
−ＤＮＡ化用いた。
ＣＮ１３ ｒ ７１ 惰ｇ 化セフ１０−スケ゛ルビー
ズに、＋９す・ンランルヌクレオチドを結合させ、これ
に放射活性化１１１３Ｖ −ＤＮＡを加えさらにＲＮＡ
リガーゼを加えて、１？リウシ／ルの３′ｌｌ！！、ｉ
と放射活ｔに化ＨＩ３Ｖ −１）ＮＡの５′端とを結合
させた。このケ゛ルビーズｆ ０．２ ＭＮａＣｔＫ
含ＩＪ５１） ％ジメチルポルノ・アミドで十分に洗っ
て［・１的の同相を得た。
ズに、＋９す・ンランルヌクレオチドを結合させ、これ
に放射活性化１１１３Ｖ −ＤＮＡを加えさらにＲＮＡ
リガーゼを加えて、１？リウシ／ルの３′ｌｌ！！、ｉ
と放射活ｔに化ＨＩ３Ｖ −１）ＮＡの５′端とを結合
させた。このケ゛ルビーズｆ ０．２ ＭＮａＣｔＫ
含ＩＪ５１） ％ジメチルポルノ・アミドで十分に洗っ
て［・１的の同相を得た。
（４） 検体の測定
）ｉＢウィルス性引炎恵者ｎｔ＋清１００μｌに０．５
ＮＮａ０）Ｉ Ｉ （ｌ Ｉ） μｌを加えて室温で
１０分間（ｉ？ ４′ｌ’ Ｌ １ｒ−０次に、０．５
Ｎ ｌＩｃ７１ （１０１ｔｌを加えさらに２ （ｌ
ｌ） ／ｌ 、ソ／ｍｅのプロディナーゼ１（溶（１
２００／１１を加えて７０℃で１ ｌｌｇｊ ｌ用１叉
１．己さぜ／ζ。これに（３）１百でへ周東“１し／こ
固（目を１ ｍｅ Ｋ懸濁して加え、３７℃で−戊放高
″した。
ＮＮａ０）Ｉ Ｉ （ｌ Ｉ） μｌを加えて室温で
１０分間（ｉ？ ４′ｌ’ Ｌ １ｒ−０次に、０．５
Ｎ ｌＩｃ７１ （１０１ｔｌを加えさらに２ （ｌ
ｌ） ／ｌ 、ソ／ｍｅのプロディナーゼ１（溶（１
２００／１１を加えて７０℃で１ ｌｌｇｊ ｌ用１叉
１．己さぜ／ζ。これに（３）１百でへ周東“１し／こ
固（目を１ ｍｅ Ｋ懸濁して加え、３７℃で−戊放高
″した。
これを遠心して」情を除き、ｄ −ＤＮＡ！ｔｉｌｌ限
１１ＩＹ素溶ｉｉ’ｊ、 （ＢｇｔＩＩ 、 Ａｖ＋ｉ
Ｉｔ 、 １ｌａｅ ＩＩ 、 ＋Ｉａｃ Ｉｌｌ
、 ｌ１ａｐ Ｉｆ 。
１１ＩＹ素溶ｉｉ’ｊ、 （ＢｇｔＩＩ 、 Ａｖ＋ｉ
Ｉｔ 、 １ｌａｅ ＩＩ 、 ＋Ｉａｃ Ｉｌｌ
、 ｌ１ａｐ Ｉｆ 。
１１ｉｎｃ Ｉｔ各Ｉ Ｕ／ｒｎｔ’、ｌ （ｌ ｍＭ
ｔ・リス−１−ＩＣＡ 、 ７１１１ＭＭｇＣｔ２．
７０ ｍＭ ＮａＣ１１７ｍＭ ２−メルカゾトエタノ
ール、ｐＨ７，５）を１． （ｌ ｍ（加えて３７℃で
Ｉ ＩＲｊｌｉ１１反応させた。反応後゛＋’Ｍ心し、
４−清５００μＬの放射ＡＸ足ヲｌ夜休体ンーｆｌ／−
ンヨンソノウンクで６川ンＰした。
ｔ・リス−１−ＩＣＡ 、 ７１１１ＭＭｇＣｔ２．
７０ ｍＭ ＮａＣ１１７ｍＭ ２−メルカゾトエタノ
ール、ｐＨ７，５）を１． （ｌ ｍ（加えて３７℃で
Ｉ ＩＲｊｌｉ１１反応させた。反応後゛＋’Ｍ心し、
４−清５００μＬの放射ＡＸ足ヲｌ夜休体ンーｆｌ／−
ンヨンソノウンクで６川ンＰした。
第１図は得られた結果を示すものであり、１ｔｉｒ軸は
放射線の割数率をそして横軸は［（Ｉシ苗の希釈度を衣
わしている。
放射線の割数率をそして横軸は［（Ｉシ苗の希釈度を衣
わしている。
実施例２
（１）同相のパ周製
二ｌ−ロセ）ｌｙ ｒＪ −７，７４ルター（５×５Ｌ
：Ｔｌ１）にｒ′め合成したアミノヘキ・／ル化ＨＢＶ
−ＤＮＡノジノルストランド５００ ｔｈｇを含イエ
する溶液を全体に侵透するように滴「し、加熱減圧下で
乾燥させた。次に、これを０．２ Ｍ ＮａＣｔ溶液で
十分にθＣ浄してから、１１８．０のＯ，１Ｍ炭酸溶液
に浸した。
：Ｔｌ１）にｒ′め合成したアミノヘキ・／ル化ＨＢＶ
−ＤＮＡノジノルストランド５００ ｔｈｇを含イエ
する溶液を全体に侵透するように滴「し、加熱減圧下で
乾燥させた。次に、これを０．２ Ｍ ＮａＣｔ溶液で
十分にθＣ浄してから、１１８．０のＯ，１Ｍ炭酸溶液
に浸した。
Ｎ６−（６−カルボキンヘキシル）−アデニンフラビン
ジヌクレオチド１ ’００ ｍ９をジメチルホルムアミ
ドＪＯ〃１ｒＫ溶カシ、コレＫ ５０ｍｑノＮ−ヒｌＳ
ロキンサクシンイミド及び７０ ｍｙの水溶１″Ｉカル
ボジイミドを加えて室温で１時間反応させた。反１．己
後この溶液を前述のフィルター全体にｔン透妬せ、Ｖｉ
＜温で２ Ｅ１間放置した。次に、このソイルターを０
１Ｍ炭酸溶液で十分に洗浄して未成ｊ心のアミンヘキシ
ルつ′デニンフラビンジヌクレ測チ１゛を除去した。
ジヌクレオチド１ ’００ ｍ９をジメチルホルムアミ
ドＪＯ〃１ｒＫ溶カシ、コレＫ ５０ｍｑノＮ−ヒｌＳ
ロキンサクシンイミド及び７０ ｍｙの水溶１″Ｉカル
ボジイミドを加えて室温で１時間反応させた。反１．己
後この溶液を前述のフィルター全体にｔン透妬せ、Ｖｉ
＜温で２ Ｅ１間放置した。次に、このソイルターを０
１Ｍ炭酸溶液で十分に洗浄して未成ｊ心のアミンヘキシ
ルつ′デニンフラビンジヌクレ測チ１゛を除去した。
（２） ６＋１１定
＋１１３ウィルス竹肝炎患者血清１． ＯＯ／Ｉｔに（
１，５１’Ｊ −ＮａＯＩ−１１００ｆｉｌを加えて室
温で１０分）；旧ηｉｌｌ拌した。
１，５１’Ｊ −ＮａＯＩ−１１００ｆｉｌを加えて室
温で１０分）；旧ηｉｌｌ拌した。
Ｈｌ：いて、０．５ Ｎ ＨＣＩ ｌ ００ ＩＬＬを
加え、さらにプロテイナーゼＫ ２００１Ｌｊ３を加え
た。７ Ｄ ’Ｃでｔ ｔｂ７間反尾・後飽和フェノー
ルークロ゛ロホルム溶液（１：１ ） ２００ ＩＬＬ
をＪノ１１え、分層した水層２００ノｈｔを１）ＩＪ記
のフィルター（１，Ｘ １ ｃｍ ）に滴下した。６０
℃で２時間反応後ｄ −ＤＮＡ制限酵素溶液（Ｈａｅ
Ｉｌｌ 。
加え、さらにプロテイナーゼＫ ２００１Ｌｊ３を加え
た。７ Ｄ ’Ｃでｔ ｔｂ７間反尾・後飽和フェノー
ルークロ゛ロホルム溶液（１：１ ） ２００ ＩＬＬ
をＪノ１１え、分層した水層２００ノｈｔを１）ＩＪ記
のフィルター（１，Ｘ １ ｃｍ ）に滴下した。６０
℃で２時間反応後ｄ −ＤＮＡ制限酵素溶液（Ｈａｅ
Ｉｌｌ 。
Ｈｉｎｃ Ｉｆ 、Ｘｂａ ｌ 、１３ｇ／−ＩＩ 、
Ｈａｍ Ｈｌ 、Ａｖａ ＩＩ 。
Ｈａｍ Ｈｌ 、Ａｖａ ＩＩ 。
Ａｔ、ｖ Ｉ 各 Ｌ Ｕ／ｌｎｅ、 ２（１ｍＭ ）
リ ス −１＋Ｃ４、７’ｍＭＭｇＣＡ２．７０ ＋
ｎｊＶＩ ＮａＣ／−、７ｍＭ ２−メルカゾトエタノ
ール、１旧７．５ ） 、１． （ｌ ｍｅを力１１え
て３７℃で１５分間反応させた。）・４応後、フィルタ
ーを除き、ア月？グルコースオキシクーゼ１０μｇを含
ｂ 基％ ’Ｍ 故２０ ｔ）ＩＬＬ（０，０２５チＡ
ｌ’３ＴＳ 、１．、８％β−ｄ−グルコース、７１ｔ
ｔ９７ｍ（Ｊ ＰＯＩ）、０１Ｍリン酸、ｐＨ６，０）
をＩＪＩＩえ、吸光度の噌ノＪｌｌを波長４２０ ｎｍ
でターＩ・アッセイした。
リ ス −１＋Ｃ４、７’ｍＭＭｇＣＡ２．７０ ＋
ｎｊＶＩ ＮａＣ／−、７ｍＭ ２−メルカゾトエタノ
ール、１旧７．５ ） 、１． （ｌ ｍｅを力１１え
て３７℃で１５分間反応させた。）・４応後、フィルタ
ーを除き、ア月？グルコースオキシクーゼ１０μｇを含
ｂ 基％ ’Ｍ 故２０ ｔ）ＩＬＬ（０，０２５チＡ
ｌ’３ＴＳ 、１．、８％β−ｄ−グルコース、７１ｔ
ｔ９７ｍ（Ｊ ＰＯＩ）、０１Ｍリン酸、ｐＨ６，０）
をＩＪＩＩえ、吸光度の噌ノＪｌｌを波長４２０ ｎｍ
でターＩ・アッセイした。
１１ｉ１１定１直を血／１１１（ｌ′ｉ釈率を１黄軸に
そして吸光度を枢ｉ１１＋にと９プロ、ｌ・した結果を
第２図に示す。
そして吸光度を枢ｉ１１＋にと９プロ、ｌ・した結果を
第２図に示す。
第１図及び第２図をよいずれも本発明法による測定結果
を示すものであり、第１図は血ｉ’ｉ￥希オノ〈率と同
相の放射線割数率との関係を、そして第２図は血清希釈
率と吸光度との関係をそれぞれ示してい第１１￥１ 胸Ｖｓ Ｖ４ Ｖ２ 斤未 負惰呼郭キ 第２１ン１ ０４１ＡにＩＡ埼表 ｔｈＬ５１卸訴キ 手続補ｉＥ書（自発） 昭オ［１５９年１１月２９「１ 特許庁長油 志 賀 学 殿 Ｊ事件の表示 特願昭５８−１ ’−４９７０２号 ２発明の名称 、Ｉ？リヌクレオチドの徂ｊ定方法 ：う補正をする者 １ｆ件との１３’、Ｉ係 特許出願人 名称 富士レビオ株式会社 ４代 理 人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三］ゴ］２１番３−
（ｉ ０７−号（ｉ補正の内容 （１）明細謁第５１′１第１゛う行に記載さＪｔだ「ア
ミン」を１−アミノｊと言ｉ’ ｉＦする。 （２） ’刀＃ｌｌｌ Ｈ！ｉ、′（”、ｔｉ 肉量
１２ ？了に記４戊された 「カルボン」を１カル、１
・−ルノ」と泪ｉＥずろ。 （３） 明細１１：第１ （１１，’ｊ第２０行に記載
さ７した「活４′１化」の後（Ｃ「−本領」を加入ずろ
。 （４）明細？１：第１０１ｒ、＋：没１・行の後に次の
記・１表を加入ずろ。 Ｅこの７２本４１’ＪＩＩ１３Ｖ−Ｉ）ＮＡ１ｍｇ （
ｌ ｍｅ ）とＩＩＢＶ−Ｉ）ＮＡを−１９人し／ｊ−
”Ａ”、ＦｌｌＩＭ ＋ ’、！ ７−ｙ ” １）Ｎ
Ａ ｒｉｌｌｌｑ（２＋Ｈｅ）に ホ ）ｌｉ ｌｚ
−Ｊ’ ミ ｌ’ ８ ｍｌ’ イ１：Ｊｎ 、ｔ 、
５ ／、）間 こ の 〆昆合計 をｔ邦と９させ１．
１゜（ンＣ（＋、：、これ（Ｉｃ ２ ｍｌ ］緩’６
Ｈ（’／Ｉ’／、 （＋＋、０７−］：／ｌ／ ／ １
トリス−１１ｃ／ｉ 、 ２モル／ ｌ ＮａＣＡ
＋ Ｉ ５ｍＭ ＥＤＴＡ １旧７５）イｌ−・ツバ１
え、５０℃で４１．１間そしてさらＫ （ｉ Ｑ℃で１
１１！＋間加ｉｌｌ シた。 この反応’ｌ（’ｔ、 ’、ｃ旧ｏ−Ｇｅ１ Ａ ５０
ｒｎでり゛ルミ−＋過し、ハイブリッドしｉ（ｌ １
）ＮＡと未反応のＩＪＮＡを／Ｊ′ｌ離した。 ＋１？イド分画の吐くに溶出さり、ろ爪切のピークを分
画し、これに０１ＭになるようにＮａＣＡ粉末を加えて
溶かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１
ｍｅに対し２倍の比率（２＋ｒ＋ｅ ）で力１１え、
−７０℃で２時間放置した。次に、１７（１００Ｘ、９
で１０分間遠心し、エタノール沈殿物Ｓｉ ５０ ｍ７
！の０、 、Ｉ Ｎ ＮａＣＨｒ 、 （１，２５ｍＭ
Ｅｌ）ＴΔ、０（ン０１％）ゎノールレッドで溶角イ
しブこ。プこだちにこ牙１．右１（ｉｏ Ｇ（！］ Ａ
５０ テ’ｉ’ルｂ”過し、目的ノー木鎖Ｈ１３Ｖ−１
）ＮＡ イ、： ？ｌ ／’、： 、Ｊ（５）明細岩第
１１頁第１０行と第１１１１の間に次の記載を仙人する
。 「このＨＢＶ−ＤＮＡも前記と同様の方法で一本鎖１１
Ｂ■−ＤＮＡに変えた。 」 （０） 明細１メ１第１１真第１５行に記１１＆されｌ
こ１−１国Ａリガーゼ」の前にｌ−ＡＴＩ）及び」を力
１１人−ｊ゛ろ。 Ｉ゛ノーＬ
を示すものであり、第１図は血ｉ’ｉ￥希オノ〈率と同
相の放射線割数率との関係を、そして第２図は血清希釈
率と吸光度との関係をそれぞれ示してい第１１￥１ 胸Ｖｓ Ｖ４ Ｖ２ 斤未 負惰呼郭キ 第２１ン１ ０４１ＡにＩＡ埼表 ｔｈＬ５１卸訴キ 手続補ｉＥ書（自発） 昭オ［１５９年１１月２９「１ 特許庁長油 志 賀 学 殿 Ｊ事件の表示 特願昭５８−１ ’−４９７０２号 ２発明の名称 、Ｉ？リヌクレオチドの徂ｊ定方法 ：う補正をする者 １ｆ件との１３’、Ｉ係 特許出願人 名称 富士レビオ株式会社 ４代 理 人 居所 〒１０４東京都中央区八丁堀三］ゴ］２１番３−
（ｉ ０７−号（ｉ補正の内容 （１）明細謁第５１′１第１゛う行に記載さＪｔだ「ア
ミン」を１−アミノｊと言ｉ’ ｉＦする。 （２） ’刀＃ｌｌｌ Ｈ！ｉ、′（”、ｔｉ 肉量
１２ ？了に記４戊された 「カルボン」を１カル、１
・−ルノ」と泪ｉＥずろ。 （３） 明細１１：第１ （１１，’ｊ第２０行に記載
さ７した「活４′１化」の後（Ｃ「−本領」を加入ずろ
。 （４）明細？１：第１０１ｒ、＋：没１・行の後に次の
記・１表を加入ずろ。 Ｅこの７２本４１’ＪＩＩ１３Ｖ−Ｉ）ＮＡ１ｍｇ （
ｌ ｍｅ ）とＩＩＢＶ−Ｉ）ＮＡを−１９人し／ｊ−
”Ａ”、ＦｌｌＩＭ ＋ ’、！ ７−ｙ ” １）Ｎ
Ａ ｒｉｌｌｌｑ（２＋Ｈｅ）に ホ ）ｌｉ ｌｚ
−Ｊ’ ミ ｌ’ ８ ｍｌ’ イ１：Ｊｎ 、ｔ 、
５ ／、）間 こ の 〆昆合計 をｔ邦と９させ１．
１゜（ンＣ（＋、：、これ（Ｉｃ ２ ｍｌ ］緩’６
Ｈ（’／Ｉ’／、 （＋＋、０７−］：／ｌ／ ／ １
トリス−１１ｃ／ｉ 、 ２モル／ ｌ ＮａＣＡ
＋ Ｉ ５ｍＭ ＥＤＴＡ １旧７５）イｌ−・ツバ１
え、５０℃で４１．１間そしてさらＫ （ｉ Ｑ℃で１
１１！＋間加ｉｌｌ シた。 この反応’ｌ（’ｔ、 ’、ｃ旧ｏ−Ｇｅ１ Ａ ５０
ｒｎでり゛ルミ−＋過し、ハイブリッドしｉ（ｌ １
）ＮＡと未反応のＩＪＮＡを／Ｊ′ｌ離した。 ＋１？イド分画の吐くに溶出さり、ろ爪切のピークを分
画し、これに０１ＭになるようにＮａＣＡ粉末を加えて
溶かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１
ｍｅに対し２倍の比率（２＋ｒ＋ｅ ）で力１１え、
−７０℃で２時間放置した。次に、１７（１００Ｘ、９
で１０分間遠心し、エタノール沈殿物Ｓｉ ５０ ｍ７
！の０、 、Ｉ Ｎ ＮａＣＨｒ 、 （１，２５ｍＭ
Ｅｌ）ＴΔ、０（ン０１％）ゎノールレッドで溶角イ
しブこ。プこだちにこ牙１．右１（ｉｏ Ｇ（！］ Ａ
５０ テ’ｉ’ルｂ”過し、目的ノー木鎖Ｈ１３Ｖ−１
）ＮＡ イ、： ？ｌ ／’、： 、Ｊ（５）明細岩第
１１頁第１０行と第１１１１の間に次の記載を仙人する
。 「このＨＢＶ−ＤＮＡも前記と同様の方法で一本鎖１１
Ｂ■−ＤＮＡに変えた。 」 （０） 明細１メ１第１１真第１５行に記１１＆されｌ
こ１−１国Ａリガーゼ」の前にｌ−ＡＴＩ）及び」を力
１１人−ｊ゛ろ。 Ｉ゛ノーＬ
Claims (1)
- 測定対象である一本鎖７１？リヌクレオチドを、標１織
物が結合されかつ該測定対象一本鎖、ｌ＝ ＩＪヌクレ
オチドと二本鎖、＋９リヌクレオチドを形成しうる一本
鎖ポリヌクレオチドを結合した同相と溶液中で接触させ
て二本鎖、＋？リヌクレオチドを形成させ、該二本鎖、
＋９リヌクレオチドに二本鎖；」？リヌクレオチド制限
酵素を作用させてこの二本鎖７１？リヌクレオチドをＩ
ＪＪＩ析し、溶液又は同相の標識物をｅ！’Ｉ 是する
ことを峙徴とするポリヌクレオチドの測定力法
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199702A JPS6091999A (ja) | 1983-10-25 | 1983-10-25 | ポリヌクレオチドの測定方法 |
| DE8484307289T DE3483777D1 (de) | 1983-10-25 | 1984-10-23 | Verfahren zur messung von polynukleotiden und reagenzsatz hierfuer zu gebrauchen. |
| EP19840307289 EP0142299B1 (en) | 1983-10-25 | 1984-10-23 | Method of measuring polynucleotide and reagent kit for use therein |
| ES537027A ES8507181A1 (es) | 1983-10-25 | 1984-10-24 | Un metodo para la determinacion de un polinucleotido |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58199702A JPS6091999A (ja) | 1983-10-25 | 1983-10-25 | ポリヌクレオチドの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6091999A true JPS6091999A (ja) | 1985-05-23 |
| JPH0378120B2 JPH0378120B2 (ja) | 1991-12-12 |
Family
ID=16412188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58199702A Granted JPS6091999A (ja) | 1983-10-25 | 1983-10-25 | ポリヌクレオチドの測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0142299B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6091999A (ja) |
| DE (1) | DE3483777D1 (ja) |
| ES (1) | ES8507181A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0292300A (ja) * | 1988-09-29 | 1990-04-03 | Chiron Corp | 選択可能な切断部位を用いたポリヌクレオチドの測定 |
| JPH07303498A (ja) * | 1987-10-15 | 1995-11-21 | Chiron Corp | 核酸マルチマーおよびそれを用いた増幅核酸ハイブリダイゼーション分析法 |
| WO2018066713A1 (ja) * | 2016-10-07 | 2018-04-12 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 核酸の検出方法及びそのためのキット |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683194A (en) * | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
| US5367066A (en) * | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
| US4820630A (en) * | 1984-11-23 | 1989-04-11 | Digene Diagnostics, Incorporated | Assay for nucleic acid sequences, particularly genetic lesions, using interactive labels |
| US4725537A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Allied Corporation | Assay, reagent and kit employing nucleic acid strand displacement and restriction endonuclease cleavage |
| FR2588383B1 (fr) * | 1985-10-04 | 1988-01-08 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de recuperation et de dosage de microquantites d'acide desoxyribonucleique dans un liquide biologique acellulaire |
| EP0219842A1 (en) * | 1985-10-23 | 1987-04-29 | Allied Corporation | Nucleic acid assay employing pair segment inhibition or competition |
| US4876187A (en) * | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| US5849478A (en) * | 1986-08-14 | 1998-12-15 | Cashman; Daniel P. | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit |
| EP0269764B1 (en) * | 1986-12-01 | 1991-08-28 | Molecular Biosystems, Inc. | Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
| DE3717212A1 (de) * | 1987-05-22 | 1988-12-08 | Viktor Dr Dr Med Balazs | Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen fluessigkeit auf zellulare onkogen-transkripte bzw. deren fragmente |
| DE3721400A1 (de) * | 1987-06-29 | 1989-01-12 | Viktor Dr Dr Med Balazs | Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen fluessigkeit auf zellulare onkogen-dna bzw. deren fragmente |
| US5273879A (en) * | 1987-07-23 | 1993-12-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| US4994368A (en) * | 1987-07-23 | 1991-02-19 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| GB8810400D0 (en) | 1988-05-03 | 1988-06-08 | Southern E | Analysing polynucleotide sequences |
| US6054270A (en) * | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
| US5700637A (en) * | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
| US7811751B2 (en) | 1988-05-03 | 2010-10-12 | Oxford Gene Technology Limited | Analysing polynucleotide sequences |
| ATE173508T1 (de) * | 1988-05-20 | 1998-12-15 | Hoffmann La Roche | Befestigung von sequenzspezifischen proben |
| US5109124A (en) * | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
| US5744101A (en) | 1989-06-07 | 1998-04-28 | Affymax Technologies N.V. | Photolabile nucleoside protecting groups |
| GB9009903D0 (en) * | 1990-05-02 | 1990-06-27 | Ici Plc | Assay for specific nucleic acid sequences |
| US5294534A (en) * | 1991-08-13 | 1994-03-15 | Miles, Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| FR2697851B1 (fr) * | 1992-11-10 | 1995-01-06 | Bio Merieux | Système et procédé de détection d'une séquence d'acide nucléique selon une méthode d'amplification par restriction enzymatique sur phase solide. |
| US7625697B2 (en) | 1994-06-17 | 2009-12-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for constructing subarrays and subarrays made thereby |
| US6974666B1 (en) * | 1994-10-21 | 2005-12-13 | Appymetric, Inc. | Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA |
| JP2001204463A (ja) * | 2000-01-27 | 2001-07-31 | Toyo Kohan Co Ltd | ヌクレオチド固定用担体 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4302204A (en) * | 1979-07-02 | 1981-11-24 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Transfer and detection of nucleic acids |
| US4351901A (en) * | 1980-03-24 | 1982-09-28 | Cetus Corporation | Method for single nucleotide alteration |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| CA1180647A (en) * | 1981-07-17 | 1985-01-08 | Cavit Akin | Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| GB8311018D0 (en) * | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
-
1983
- 1983-10-25 JP JP58199702A patent/JPS6091999A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-23 EP EP19840307289 patent/EP0142299B1/en not_active Expired
- 1984-10-23 DE DE8484307289T patent/DE3483777D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-10-24 ES ES537027A patent/ES8507181A1/es not_active Expired
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07303498A (ja) * | 1987-10-15 | 1995-11-21 | Chiron Corp | 核酸マルチマーおよびそれを用いた増幅核酸ハイブリダイゼーション分析法 |
| JPH0292300A (ja) * | 1988-09-29 | 1990-04-03 | Chiron Corp | 選択可能な切断部位を用いたポリヌクレオチドの測定 |
| WO2018066713A1 (ja) * | 2016-10-07 | 2018-04-12 | 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所 | 核酸の検出方法及びそのためのキット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0378120B2 (ja) | 1991-12-12 |
| EP0142299A3 (en) | 1988-02-24 |
| ES537027A0 (es) | 1985-08-16 |
| EP0142299B1 (en) | 1990-12-19 |
| ES8507181A1 (es) | 1985-08-16 |
| EP0142299A2 (en) | 1985-05-22 |
| DE3483777D1 (de) | 1991-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6091999A (ja) | ポリヌクレオチドの測定方法 | |
| DE69114023T2 (de) | Wasserunlösbares Reagenz, Nukleinsäure-Sonde, Testsatz und Verfahren zur Diagnose und Isolierung. | |
| Schloßmacher et al. | Silintaphin‐1–interaction with silicatein during structure‐guiding bio‐silica formation | |
| JP2009505641A (ja) | アプタマー使用測色センサー系 | |
| KR102310223B1 (ko) | 랩온페이퍼칩을 포함하는 구조물에 적용하기 위한 세포용해용 조성물 | |
| HU228343B1 (en) | Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine | |
| KR101964746B1 (ko) | dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법 | |
| CN112941078B (zh) | 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途 | |
| JPH0398586A (ja) | プライマー３′末端におけるプライマーと標的のミスマッチを克服する診断および増幅方法 | |
| US20210071165A1 (en) | Spontaneous Nucleic Acid Purification and Concentration In A Single Step | |
| CN110257482A (zh) | 一种基于核酸适体和端粒酶扩增的凝血酶检测方法 | |
| JP2015171385A (ja) | 核酸増幅のための方法および組成物 | |
| CN110468238A (zh) | 一种恒温扩增检测甲型和乙型流感病毒的引物探针组、试剂盒及应用 | |
| JP7030857B2 (ja) | モジュラー核酸アダプター | |
| EP0882985B1 (de) | Immunchemische Bestimmung von multivalenten Analyten | |
| EP4269619A1 (en) | Composition for diagnosing lyme disease and kit comprising same | |
| JP2009296948A (ja) | Ｐｃｒ用プライマー、標的核酸の検出方法及び標的生体分子の検出方法 | |
| US5807669A (en) | Process for the detection of reverse transcriptase | |
| US20230235312A1 (en) | Detection method using lateral-flow paper chip capable of multi-nucleic acid colorimetric detection with one-step | |
| US20230046974A1 (en) | Detection method using paper chip capable of multi-nucleic acid colorimetric detection with one-step | |
| Kekki | Microdetermination of Amino Nitrogen as Copper Complexes a Modification for Plasma and Urine | |
| CN106755505A (zh) | 用于检测血浆ctDNA中基因变异的试剂盒 | |
| JPS613063A (ja) | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 | |
| WO2024048599A1 (ja) | タンパク質－核酸複合体、これを用いた物質の検出キット及び検出方法 | |
| KR102719538B1 (ko) | 임질 진단용 조성물을 포함하는 가정용 랩온페이퍼 진단 칩 |